CN105154549A - Hnpcc外周血mlh1基因表达的实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Hnpcc外周血mlh1基因表达的实时荧光定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法，包括：1)设计引物和探针：上游引物如SEQ？ID？NO.1所示或其互补链；下游引物如SEQ？ID？NO.2所示或其互补链；探针如SEQ？ID？NO.3所示或其互补链；2)提取HNPCC外周血总RNA，逆转录合成cDNA第一链；3)采用步骤1)设计的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测；4)将所得MLH1基因拷贝数与HBA2对照基因拷贝数相除来校正，得MLH1基因相对表达量。此外，本发明还公开了该方法的检测用引物和探针。本发明特异性强，灵敏度高，定量准确，检测成本低，可用于HNPCC初筛和辅助诊断。

Description

HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及基因分子检测领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测方法，尤其涉及一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
遗传性非息肉性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是消化系最常见的遗传性肿瘤，外显率达80％-90％，其发病与人类的错配修复基因(mismatchrepairgene，MMR)功能缺陷密切相关。尽管HNPCC有明显家族史，但确诊HNPCC患者或家系赖以检测出胚系MMR基因病理性突变。迄今，已经定位并克隆的人类MMR基因有7个，其中至少5个(MLH1、MSH2、MSH6、PMS1和PMS2)与HNPCC有关，但与HNPCC的发病关系最为密切的是MLH1和MSH2基因，遗传连锁分析和遗传学研究显示，约90％的HNPCC有MLH1和MSH2基因的胚系异常。
结直肠癌发病率日渐增高，而治疗效果不甚理想，总的10年生存率徘徊在50％左右。如何提高结直肠癌的治愈率，关键在于大肠癌的早期诊断与早期治疗。随着分子生物学技术的发展，人们对肿瘤病因及发病机制的认识越来越深入。从病因机制出发干预、阻断肿瘤的发生发展，是肿瘤防治的发展方向，这也成为我国结直肠癌防治研究面临的挑战与机遇。就发病机制而言，原发性结直肠癌包括散发性和遗传性两大类，后者即包括HNPCC。由于HNPCC和散发性结直肠癌的发病机制不同，两者在治疗方案的选择上、随访方案的制定上都不尽相同，将两者区分开来不仅具有实际的临床意义，而且还有利于遗传学咨询。
大量研究证实，HNPCC的发生与错配修复基因的功能缺陷有关，并肯定至少与5个错配修复基因有关(MLH1、MSH2、PMS1、PMS2、MSH6)。
错配修复基因是生物进化过程中的保守基因，在DNA的复制过程中起着修复DNA碱基错配的功能，使得DNA在遗传信息流动过程中保持着忠实性。1993年三个研究小组同时发现几乎所有的HNPCC都出现微卫星重复序列长度的改变，一些生物遗传学家立刻意识到这种突变子表型是错配修复基因功能缺陷引起的，对酵母和细菌的研究发现，错配修复系统功能缺陷时，会导致相似的基因组不稳定性[11]。为了将HNPCC和散发性结直肠癌区分开来，人们采用了很多手段，例如不同的临床筛选标准、微卫星不稳定性检测、错配修复蛋白表达的免疫组织化学检测、基因测序等等，然而，迄今还没有一种理想的手段和策略[LynchPM.ThehMSH2andhMLH1genesinhereditarynonpolyposiscolorectalcancer[J].SurgOncolClinNAm，2009，18(4):611-24]。
从相关的文献资料可以看出，人们多侧重突变、蛋白表达和微卫星不稳定性三方面的研究【LynchPM.ThehMSH2andhMLH1genesinhereditarynonpolyposiscolorectalcancer[J].SurgOncolClinNAm，2009，18(4):611-24.Coolbaugh-MurphyML，XuJP，RamagliLS，etal.MicrosatelliteinstabilityintheperipheralbloodleukocytesofHNPCCpatients.HumMutat，2010，31(3):317-324.】。然而，遗传信息的流动是靠复制、转录和翻译完成的，基因表达就是遗传信息通过mRNA的传递而翻译成专一的蛋白质或酶，从而使细胞的表型得以表现的过程。错配修复基因突变能引起微卫星不稳定性和修复蛋白的表达异常，如果错配修复基因没有突变而在转录水平上出现异常是否会引起错配修复蛋白的表达异常？错配修复基因突变后其相应的mRNA量如何改变？mRNA的定量分析能用于HNPCC家系的筛选吗？经PubMed网上查询尚未见报道。
HNPCC家系错配修复基因mRNA在量的表达上是否有异常，迄今尚未见报道。就HNPCC的发病机制而言，从mRNA水平的研究是对其的补充和完善。在我们先前的研究中，利用基于外周血mRNA测序分析技术，对符合AmsterdamⅡ标准HNPCC临床家系各成员的MLH1和MSH2突变进行了检测，探讨了符合AmsterdamⅡ标准HNPCC临床家系的MLH1与MSH2突变类型和谱系，检出2个未见报道的MLH1错义突变和3个未见报道的MSH2错义突变【WangCF，ZhouXY，ZhangTM，etal.DetectionofgermlinemutationsofhMLH1andhMSH2basedoncDNAsequencinginchina[J].WorldJGastroenterol，2005，11(42):6620-6623.[14]WangCF，ZhouXY，ZhangTM，etal.TwonovelgermlinemutationsofMLH1andinvestigationoftheirpathobiologyinhereditarynon-polyposiscolorectalcancerfamiliesinchina[J].WorldJGastroenterol，2007，13(46):6254-6258.】。
本发明从探索新方法入手，应用实时荧光定量PCR技术基于外周血mRNA异常筛选HNPCC家系。本发明利用实时荧光定量PCR技术对符合AmsterdamⅡ临床标准的HNPCC家系及MLH1突变阳性和MLH1突变阴性的患者MLH1基因表达量进行定量分析。其主要目的是：(1)探索外周血MLH1基因在符合AmsterdamⅡ标准的HNPCC家系中健康人与患者中的表达情况。(2)建立一种基于外周血新的初步筛选HNPCC方法。
HNPCC外周血MLH1基因表达量是否有异常，迄今尚未见报道。在本发明之前，还没有出现涉及HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法，该方法特异性强，灵敏度高，定量准确，闭管检测不需PCR后处理，使劳动强度减轻，也避免扩增产物污染而导致假阳性的可能性。为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供的是一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)设计引物和探针；
该引物的序列为：
MLH1上游引物：5′-GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA-3′，如SEQIDNO.1所示或其互补链；
MLH1下游引物：5′-TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTTG-3′，如SEQIDNO.2所示或其互补链；
该探针的序列为：
MLH1TaqMan探针：F-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-P，如SEQIDNO.3所示或其互补链；
(2)提取HNPCC家系外周血总RNA，逆转录合成cDNA第一链；
(3)采用步骤(1)设计的MLH1引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，以保守基因HBA2作为对照；
(4)将每一标本所得MLH1基因拷贝数与其相对应的HBA2基因拷贝数相除来校正不同标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异，得出MLH1基因相对表达量；在符合AmsterdamⅡ标准家系间，比较健康人与患者之间外周血MLH1基因表达水平差异。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中所述提取HNPCC家系外周血总RNA为收集符合AmsterdamⅡ标准家系19个共46个家系成员的外周血标本，提取各成员的总RNA。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中所述提取HNPCC家系外周血总RNA具体为：抽取HNPCC患者或家庭成员外周血，放入离心管中离心；弃去上层血浆，混匀中层有核细胞和下层红细胞；加入低渗液，充分混匀后常温下放置45～60min；离心，弃去上层溶解的红细胞，用低渗液洗去溶解的红细胞；用手指弹开管底沉淀的有核细胞后，加入Trizol，充分混匀，4℃放置10min；加入氯仿，充分混匀，4℃放置5min；低温离心机离心10min；汲取上清液于另一无菌管中，加入等量的异丙醇，混匀后4℃放置10min；4℃离心15min；RNA沉淀于管底，弃去上清液，加入80％冷乙醇轻洗2次，弃去乙醇，倒扣离心管于洁净处，待RNA干燥后加入DEPC水溶解，置-70℃冰箱中备用。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，所述逆转录合成cDNA第一链具体为利用耐热性逆转录酶和随机引物，逆转录各成员的RNA。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括Master混合液10μL，步骤(1)设计的MLH1上下游引物各1μL，MLH1TaqMan探针1μL，cDNA模板2μL，去离子水5μL。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应条件为：预变性94℃5min；然后94℃45s，58℃45s，72℃45s，共44次循环。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测HNPCC外周血MLH1基因表达的引物，其序列为：
MLH1上游引物：5′-GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA-3′，如SEQIDNO.1所示或其互补链；
MLH1下游引物：5′-TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTTG-3′，如SEQIDNO.2所示或其互补链。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测HNPCC外周血MLH1基因表达的探针，其序列为：MLH1TaqMan探针：F-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-P，如SEQIDNO.3所示或其互补链。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法，其主要目的是：(1)探索外周血MLH1基因在符合AmsterdamⅡ标准的HNPCC家系中健康人与患者之间的表达情况。(2)建立一种基于外周血新的初步筛选HNPCC的方法。该方法具有如下优点：(1)定量准确。传统的定量方法是终点检测，依靠PCR结束后电泳条带光密度扫描，受到PCR平台期限制而影响结果的精确性。实时荧光定量PCR技术有效地解决了这一局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号，并记录在电脑软件之中，计算每个样品的Ct值，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此有很好的重现性。(2)特异性强。采用特异性荧光标记探针，只有当引物和探针均与模板完全配对并结合时，才能实现PCR扩增和探针的水解。只有当与探针配对的模板被扩增时才能产生荧光信号，因此非特异性的扩增将不被检测。(3)灵敏度高。我们建立的荧光定量RT-PCR法可以检测10拷贝的mRNA表达。(4)闭管检测不需PCR后处理，使劳动强度减轻，也避免扩增产物污染而导致假阳性的可能性。传统的Northern杂交方法研究基因mRNA表达灵敏度较低，需要较多的RNA样品；实验操作复杂，检测速度慢，自动化程度低，对实验室条件要求高，不易于在临床常规工作中开展。经实验验证，本发明方法最低能检测到101拷贝的标准模板，故其灵敏度约为10拷贝。(5)相比传统基因突变检测的成本高达几千元，本发明大大降低了检测成本(本发明检测成本仅需100元左右)，性价比明显更高。相比传统的病理诊断，例如肠镜检测等(不仅检测成本高，大约几千元，且肠镜检测是有创的，多数人不愿意做)，本发明大大降低了检测成本，且检测过程是无创的(仅需验血即可)，检测过程简单方便，更容易推广并实施。本发明实验对符合AmsterdamⅡ标准临床家系共46名家系成员进行了MLH1基因mRNA的表达检测，结果显示以最佳临界值0.511作为诊断HNPCC的阈值，其敏感性和特异性分别为81.3％和86.7％，可见MLH1表达量在诊断HNPCC中具有良好的应用前景和价值。实验证明，健康人和患者之间，外周血MLH1基因表达量存在着显著性差异。基于TaqMan实时荧光定量PCR技术的MLH1基因mRNA定量检测可用于HNPCC初筛和辅助诊断，该检测方法的直接目的不是获得诊断结果，而是对已经脱离人体的体液进行检测以获取作为中间结果的信息的方法，该检测方法得到的检测结果不能直接得出疾病的诊断结果，只能作为初筛和辅助诊断。
附图说明
图1是本发明实施例1中质粒标准品扩增的标准曲线。其中，图1A是Real-timePCR检测MLH1基因的标准曲线，其中从左至右依次为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝MLH1标准品；图1B是HBA2基因Real-timePCR标准曲线，其中从左至右依次为107～101拷贝HBA2标准品。
图2是本发明实施例1中MLH1基因Real-timePCR产物凝胶电泳结果示意图，其中，M为DNA分子质量标志，泳道1～8为108～101拷贝MLH1标准品。
图3是本发明实施例1中家系成员MLH1基因表达量示意图。
图4是本发明实施例1中MLH1表达量ROC曲线分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
实施例1
一、材料和方法
(一)家系及材料：采用AmsterdamⅡ标准[8]筛选家系，即(1)家系中至少3人患有相关肿瘤(如结直肠癌、子宫内膜癌、小肠癌、输尿管癌或肾盂癌)，并除外家族性腺瘤性息肉病。(2)至少连续2代人患相关疾病。(3)至少1人在50岁之前发病。整理自1998年8月～2012年3月复旦大学附属肿瘤医院病理科资料库内可用的HNPCC临床家系外周血标本及其临床资料，获得符合上述临床标准的19个家系(参加的家庭成员共46人)，知情同意后，抽取外周血。
(二)主要试剂及仪器：Trizol裂解液(GibcoBRL公司)，MMLV逆转录酶、随机引物、RNA酶抑制剂Rnasin、TaqDNA聚合酶(Promega公司)，脱氧核苷酸(dNTPs)(上海生工生物工程公司)，凝胶DNA提取试剂盒(E.Z.N.A公司)，HotstarTaqDNA聚合酶(Qiagen公司)，MLH1TaqMan探针(上海基康生物技术有限公司)，HBA2TaqMan探针(上海申有生物技术有限公司)，寡聚脱氧核苷酸引物由上海博亚生物技术有限公司合成。荧光定量PCR仪(MJresearch公司DNAEngineerOpticon)，9700PCR(美国ABI公司)，紫外分光光度计(Beckman公司DU640型)，低温高速离心机(德国Hettich公司Universal16R型)。
(三)引物的设计与合成：根据genebank提供的保守基因HBA2mRNA及MLH1mRNA序列设计引物。上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列如下(表1)。
表1MLH1与HBA2TaqMan探针和扩增引物
(四)Real-timeRT-PCR检测MLH1基因mRNA表达
1.总RNA的提取：
抽取患者或家庭成员外周血约7ml，放入含0.5mol/LEDTA200μl无菌10ml离心管中，3000r/min离心10min；弃去上层血浆，混匀中层有核细胞和下层红细胞；加入低渗液8ml，充分混匀后常温下放置45～60min；3000r/min离心2min；弃去上层溶解的红细胞，用低渗液小心地尽量洗去溶解的红细胞；用手指弹开管底沉淀的有核细胞后，加入1mlTrizol，充分混匀，4℃放置10min；加入200μl氯仿，充分混匀，4℃放置5min；低温离心机4℃12000r/min离心10min；汲取上清液于另一无菌管中，加入等量的异丙醇，混匀后4℃放置10min；4℃12000r/min离心15min；RNA沉淀于管底，弃去上清液，加入015ml80％冷乙醇轻洗2次，小心弃去乙醇，倒扣离心管于洁净处30min，待RNA干燥后加入30～100μlDEPC水溶解，置-70℃冰箱中备用。
2.逆转录(RT)合成cDNA第一链
随机引物1μl，RNAlμg，加DEPC水至13.0μl，在9700PCR仪上65℃孵育10min，迅速置冰上冷却至少2min后，加入表2中的试剂：
表2逆转录反应体系
将加有上述反应液的PCR反应管充分混匀后，放入9700PCR仪内55℃孵育45min。cDNA第一链合成完毕，-20℃保存待用。
3.MLH1标准品的制备及Real-timePCR
按下述反应体系(表3)进行Real-timePCR；以去离子水代替模板作为阴性对照。反应条件为：预变性94℃5min；然后94℃45s，58℃45s，72℃45s，共44次循环。读板1次/循环。HBA2Real-timePCR运行程序同MLH1扩增。紫外分光光度计测量标准品的DNA浓度。
表3Real-timePCR反应体系
4.结果分析
荧光定量检测结果采用optionmonitor1.07软件进行分析。
(五)统计学分析
采用SPSS11.5软件进行统计学分析。用非参数检验，P<0.05定为有差异显著性。
二、结果
(一)标准曲线的制备及线性范围的确定
将标准品1:10倍比稀释得到不同浓度的标准模板，与样本一起进行实时荧光定量PCR反应，通过Ct值(cyclethreshold，即每个反应管荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数)与定量模板的对数作图，即得到标准曲线。图1A是MLH1基因荧光定量PCR的标准曲线，从中可见标准曲线的线性相关性好，相关系数为0.996。MLH1基因最高检测上限为108拷贝，最低检测下限为101拷贝。图1B是HBA2基因荧光定量PCR的标准曲线，相关系数为0.996，最高检测上限107拷贝，最低检测下限为102拷贝。
(二)特异性及灵敏度检测
将拷贝数为108～101的MLH1标准品的PCR扩增产物，经2％琼脂糖凝胶电泳(图2)以检验该方法的特异性及灵敏度。电泳图(图2)显示，在100-200bp之间有预期大小的MLH1特异性条带出现，条带亮度依次减弱。该方法最低能检测到101拷贝的标准模板，故其灵敏度约为10拷贝。
(三)HNPCC临床家系成员MLH1mRNA表达
对符合AmsterdamⅡ标准临床家系共46名家系成员进行了MLH1基因mRNA的表达检测，将每一标本所得MLH1基因拷贝数与其相对应的HBA2基因拷贝数相除来校正不同标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异，得出MLH1基因相对表达量，结果用MLH1/HBA2×105表示。MLH1mRNA在符合AmsterdamⅡ标准的家系中相对表达量为2.98×10-6～64.32，平均值为10.91。HNPCC临床家系各成员MLH1mRNA表达量见表4。图3为家系成员MLH1基因表达量，从图3可见，野生型成员表达量显著高于突变型。因此，外周血MLH2基因表达量检测可用于HNPCC初筛或辅助诊断。
表4符合AmsterdamⅡ标准临床家系成员MLH1mRNA相对表达量
注：NR：没有结果NA：标本缺如
构建ROC曲线确定MLH1表达量在诊断HNPCC中的价值。ROC分析显示，定MLH1表达量的AUC为0.858(95％CI：0.714-1.003)(见图4)。以最佳临界值0.511作为诊断HNPCC的阈值，其敏感性和特异性分别为81.3％和86.7％。
三、结果分析及讨论
结果分析：
1.各成员MLH1基因的mRNA的相对表达量用MLH1/HBA2×105表示。在符合AmsterdamⅡ标准的家系中MLH1基因的mRNA相对表达量为2.98×10-6～64.32，平均值为10.91。
2.在符合Amsterdam标准的临床家系，有突变和无突变成员的MLH1基因mRNA相对表达量有显著性差异(P＜0.001)。
结论：
1.在健康人和HNPCC患者之间，外周血MLH1基因表达量存在着显著性差异。
2.TaqMan实时荧光定量PCR技术能用于MLH1基因表达定量分析。
本发明进一步观察了符合AmsterdamⅡ标准的HNPCC临床家系外周血MLH1基因表达情况，结果发现，在符合AmsterdamⅡ的HNPCC临床家系里，健康人和HNPCC成员间的外周血MLH1基因表达量有显著性差异。因此，应用基于实时荧光定量PCR技术检测外周血MLH1基因表达量的方法特异性强，灵敏度高，定量准确，检测成本低，可用于HNPCC初筛和辅助诊断。

Claims (8)

1.一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计引物和探针；
该引物的序列为：
MLH1上游引物：5′-GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA-3′，如SEQIDNO.1所示或其互补链；
MLH1下游引物：5′-TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTTG-3′，如SEQIDNO.2所示或其互补链；
该探针的序列为：
MLH1TaqMan探针：F-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-P，如SEQIDNO.3所示或其互补链；
(2)提取HNPCC家系外周血总RNA，逆转录合成cDNA第一链；
(3)采用步骤(1)设计的MLH1引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，以保守基因HBA2作为对照；
(4)将每一标本所得MLH1基因拷贝数与其相对应的HBA2基因拷贝数相除来校正不同标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异，得出MLH1基因相对表达量；在符合AmsterdamⅡ标准家系间，比较健康人与患者之间外周血MLH1基因表达水平差异。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取HNPCC家系外周血总RNA为收集符合AmsterdamⅡ标准家系19个共46个家系成员的外周血标本，提取各成员的总RNA。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取HNPCC家系外周血总RNA的具体步骤为：抽取HNPCC患者或家庭成员外周血，放入离心管中离心；弃去上层血浆，混匀中层有核细胞和下层红细胞；加入低渗液，充分混匀后常温下放置45～60min；离心，弃去上层溶解的红细胞，用低渗液洗去溶解的红细胞；用手指弹开管底沉淀的有核细胞后，加入Trizol，充分混匀，4℃放置10min；加入氯仿，充分混匀，4℃放置5min；低温离心机离心10min；汲取上清液于另一无菌管中，加入等量的异丙醇，混匀后4℃放置10min；4℃离心15min；RNA沉淀于管底，弃去上清液，加入80％冷乙醇轻洗2次，弃去乙醇，倒扣离心管于洁净处，待RNA干燥后加入DEPC水溶解，置-70℃冰箱中备用。
4.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述逆转录合成cDNA第一链具体为利用耐热性逆转录酶和随机引物，逆转录各成员的RNA。
5.如权利要求1所述的R检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括Master混合液10μL，步骤(1)设计的MLH1上下游引物各1μL，MLH1TaqMan探针1μL，cDNA模板2μL，去离子水5μL。
6.如权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应条件为：预变性94℃5min；然后94℃45s，58℃45s，72℃45s，共44次循环。
7.一种用于检测HNPCC外周血MLH1基因表达的引物，其特征在于，其序列为：
MLH1上游引物：5′-GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA-3′，如SEQIDNO.1所示或其互补链；
MLH1下游引物：5′-TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTTG-3′，如SEQIDNO.2所示或其互补链。
8.一种用于检测HNPCC外周血MLH1基因表达的探针，其特征在于，其序列为：MLH1TaqMan探针：F-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-P，如SEQIDNO.3所示或其互补链。
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