CN105296481B

CN105296481B - 一种基于基因测序法的hla‑b27基因分型的方法

Info

Publication number: CN105296481B
Application number: CN201510868927.1A
Authority: CN
Inventors: 冯振; 景叶松; 弭兆元
Original assignee: Jinan Ying Sheng Bioisystech Co Ltd
Current assignee: SHANDONG YING SHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-12-01
Also published as: CN105296481A

Abstract

本发明公开了一种基于基因测序法的HLA‑B27基因分型的方法，属于生物技术领域。本发明通过比对HLA‑B27基因的B27‑01、B27‑02、B27‑03、B27‑04、B27‑05、B27‑07、B27‑10、B27‑15亚型，找到其保守区域，设计了针对上述HLA‑B27基因亚型的测序引物及探针，通过荧光PCR结合测序的方法实现了HLA‑B27基因的分型。本发明所述方法操作简单、可具体分型、准确性高、过程可监控、结果快速，通量较高，而且无电泳过程，利于临床的推广及普及。

Description

一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的方法。

背景技术

近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病人大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。

HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有有核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊柱炎有高度相关性，超过90％的强直性脊柱炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10％的为阳性，而强直性脊柱炎由于症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在疾病的诊断中有着重要意义。

强直性脊柱炎(AS)是一种以骶髂关节和中轴关节慢性炎症为主的、原因不明的自身免疫性疾病，以侵犯脊柱为主，早期表现为滑膜炎和韧带附着点的病变，晚期由于韧带钙化造成脊柱强直，目前本病的发病原因和致病机制尚未完全明确。患者早期症状与腰椎间盘突出症、骶髂关节炎、腰背肌筋膜炎等相似，在X线片上没有骶髂关节炎的明确表现，因此在临床诊断上容易混淆而致误诊，延误病情早期治疗，失去最佳治疗时机，导致中、晚期不可逆症状出现，最终发生关节强直甚至致残。赖建铭等通过对AS家系调查发现，HLA-B27阳性的幼年AS患者中69％有脊柱关节病家族史，其中90％为一级亲属，显示AS有明显的家族聚集性，说明AS的危害性很大。因此，早期诊断对控制患者病情发展、减轻畸形、维持和改善功能，具有相当重要的意义。应尽可能地在肯定的放射学骶髂关节炎出现之前进行诊断。在脊柱性关节病这一类的疾病中除了强直性脊柱炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。

文献报道指出，①HLA-B27阴性和阳性患者男性发病率明显高于女性，阴性与同性别阳性患者平均发病年龄明显偏晚；②HLA-B27阴性患者以31～45岁为主，阳性患者以16～30岁为主；③HLA-B27阴性和阳性患者首发症状均以中轴关节炎和外周关节炎为主。阴性和阳性患者主要临床表现上均以出现下腰疼痛，髋部疼痛为主。阴性患者出现全身症状(包括发热、盗汗和乏力)明显少于阳性患者。总之，HLA-B27阴性患者比同性别阳性患者平均发病年龄明显偏晚，部分阴性患者病情相对较轻。HLA-B27阴性和阳性患者发病上的差异在对HLA-B27检测阴性的疑似患者诊断中应得到重视。

目前可用于检测HLA-B27的方法有流式细胞法、ELISA法、PCR-SSP法、测序法、荧光PCR法等，但这些方法都存在不同程度的缺点。流式细胞法要求标本新鲜，不能长期保存，因此不利于进行实验室间质量评价；且该方法原理基于抗原抗体结合反应，而HLA-B27的单克隆抗体会与其它HLA-B等位基因产物发生不同程度的交叉反应，出现假阳性结果。ELISA法成本低，结果数据客观，但操作复杂，影响反应因素较多，结果准确性差，且固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此每次测定均需作标准曲线。PCR-SSP法需要凝胶电泳，多用于科研无法在医院推广。测序法最为准确，通常检测分析周期稍长，分析样本较多时，若无前期筛选(阳性结果的初步筛选)，其工作量较大，且往往需要重复确认(当扩增不出结果时需要仔细分析确认扩增条件和扩增结果)；荧光PCR方法，采用荧光染料对扩增的特异片段产生信号，通常扩增片段较小，无法进一步对HLA-B27进行分型。

虽然上述方法在临床HLA-B27检测上扮演着重要角色，但却各有其缺陷，一种操作简便、快速、且准确度高的检测方法的开发将起到关键性临床作用。目前尚无文献报道利用荧光PCR结合基因测序技术检测HLA-B27不同基因亚型的方法。

发明内容

为解决现有技术针对HLA-B27基因进行检测分型中存在的技术问题，本发明提供一种能够快速、灵敏、特异的对HLA-B27基因进行分型的方法。

HLA-B27基因型种类繁多，包括：B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、B27-06、B27-07、B27-08、B27-09、B27-10、B27-11、B27-12、B27-13、B27-14、B27-15、B27-16、B27-17、B27-18、B27-19、B27-20、B27-21、B27-24、B27-27、B27-30、B27-32、B27-33、B27-34、B27-35、B27-36、B27-41、B27-42等。HLA-B27各亚型的分布在不同地区、种群中存在差异，发明人通过研读文献，尤其近几年文献中所提到的中国人群中出现的HLA-B27基因的特定亚型，选定中国人人群中目前常见的HLA-B27基因型：B27-01、B27-02、B27-03、B27-04、B27-05、B27-07、B27-10、B27-15(尤其是B27-04、B27-05基因型在中国人群中出现的比例最高)，进行分析。本发明通过比对上述分型，找到其保守区域，设计了针对上述HLA-B27基因亚型的测序引物及探针，通过荧光PCR结合测序的方法实现了HLA-B27基因的分型。

通过本方法可以区分8种基因亚型及35种次亚型。各种分型的特异序列如下：

表1 8种基因亚型及35种次亚型的特异序列

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

首先，本发明提供了一组用于HLA-B27基因型分型的引物及探针；

具体的，HLA-B27荧光PCR及测序用引物的序列如下：

HLA-B27F：5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'(SEQ ID NO:1)

HLA-B27R：5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(SEQ ID NO:2)

荧光PCR探针的序列为：

HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3'(SEQ ID NO:3)

所述HLA-B27探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

需要说明的是，本发明所述引物既要用于荧光PCR反应又要用于阳性结果的测序的亚型及次亚型分型。本发明中引物的设计除了通常引物设计所要考虑的退火温度、GC含量、引物特异性等方面，更要考虑两个重要因素：(1)本发明由于采用荧光PCR法，而荧光PCR扩增产物通常不太长，否则影响扩增效率，Taqman探针为基础的Real-time PCR以引物和探针序列决定反应的特异性，而通过荧光强度判断探针降解程度，从而推断模板量，通常扩增产物越短，探针和上下游引物之间的距离越近，扩增过程中探针5端的发光基团可以高效的切除下去，保证扩增和荧光信号的增长同步进行，荧光PCR扩增片段通常在75-200bp；(2)本发明需要利用测序法具体分型，因此扩增产物要包含所有亚型及次亚型的特异区域，且尽量一个测序反应即可完成，扩增片段较短无法有效包含亚型及次亚型的特异序列区域，也不利于测序分析。

本发明通过比对HLA-B27各分型序列，设计多对引物，经实验反复验证后确定本发明所列出的测序引物为最佳引物，能够兼顾荧光PCR和常规测序扩增PCR的需要，其他引物对较难实现荧光PCR反应的准确率和测序(发明人曾设计荧光PCR引物对照组进行过试验，包括对照组1:HLA-B27-F1：GGCTACGTGGACGACACGCTGT，HLA-B27-R1：GCAGGCTCTCTCGGTCAGTCTGTGCC；对照组2：HLA-B27-F2：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT，HLA-B27-R2：CGGCGGTCCAGGAGCT，虽可以有效进行荧光PCR反应，但均无法覆盖上述中国人群中出现的HLA-B27基因的特定亚型及次亚型测序分析)。

本发明引物在保证PCR扩增准确率的前提下，扩增产物既要使荧光PCR有效，又要使其包含所有分型的特异区域便于测序分型，扩增片段长度达600bp以上，仍能有效的保证荧光PCR的特异性和扩增效率。

进一步的，为了检测扩增模板的有效性，本发明还设计了一对内参引物及探针，内参为β-Actin。具体的，β-Actin内参引物的序列如下：

β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'(SEQ ID NO:4)

β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'(SEQ ID NO:5)

内参探针的序列为：

β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'(SEQ ID NO:6)

所述内参探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

其次，本发明提供了一种用于HLA-B27基因分型的试剂盒，包括内参体系反应液A、检测体系反应液B、酶解试剂、测序引物、测序试剂、阴性对照和阳性对照，

内参体系反应液A包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、扩增内参基因的引物及探针，荧光PCR反应酶系；

检测体系反应液B包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、引物及探针，荧光PCR反应酶系，检测体系反应液B中的引物序列如下：

HLA-B27F：5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'(SEQ ID NO:1)

HLA-B27R：5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(SEQ ID NO:2)

探针的序列为：

HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3'(SEQ ID NO:3)

所述HLA-B27探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1；

测序引物为HLA-B27F：5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'(SEQ ID NO:1)

HLA-B27R：5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'(SEQ ID NO:2)。

优选的，内参体系反应液A包括：10×PCR缓冲液、MgCl₂2.0～5.0mM、dNTPs0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，所述引物为β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'，β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'，探针的序列为：β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'，所述探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

其中所述酶解试剂优选为10×CIAP缓冲液、CIAP酶、ExoI酶和水，体积比为10:1:2:12。

其中所述测序试剂为测序Buffer和BigDye，体积比为1:1。

优选，阴性对照为水；阳性对照为含有HLA-B27基因的人类基因组DNA溶液。

此外，本发明还提供了基于上述检测引物和/试剂盒的进行HLA-B27等位基因检测和/分型的方法。

本发明的方法如下：首先使用Chelex-100煮沸法或DNA提取试剂盒提取基因组DNA作为模板，分别使用反应液A和反应液B进行荧光PCR扩增，对于反应液A有效扩增的模板进行下一步操作。A管有效扩增，B管无效扩增的样本视为阴性；反之视为阳性。将阳性样本反应液B扩增产物进行酶解，取酶解产物做测序反应，采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，然后在PCR仪上进行热变性，冰上快速降温后，进行测序。将测序结果与NCBI数据库进行序列比对，确认被检测者HLA-B27阳性，然后根据上述提供的特异序列，得出其基因亚型甚至次亚型。

本发明具有如下优点和效果：

1)本发明所选择的8种基因亚型是近几年文献中所提到的中国人群中出现的HLA-B27基因的特定亚型，亚洲人与B2705、B2704、B2706、B2707相关，尤其是B27-04、B27-05分型在中国人群中出现的比例最高，更切合于中国人群分析，涵盖范围更准确，且通过测序法进行更进一步的次亚型分析，使信息更精确，对于中国人群HLA-B27各亚型的地区分布、种族差异分析及后期的个性化治疗都可以提供重要的数据支持。

2)本发明在保证PCR扩增准确率的前提下，扩增产物既要使荧光PCR有效，又要使其包含所有分型的特异区域便于测序分型，扩增片段长度达600bp以上，仍能有效的保证荧光PCR的特异性和扩增效率。

3)本发明采用荧光PCR结合测序方法来进行HLA-B27基因亚型及次亚型的分型，首先采用荧光PCR法检测样本，可以根据扩增曲线的有无判读样本的阴阳性，如果样本为阴性，可以直接判读结果，无需进行后续实验，避免继续测序导致的浪费，从而节省时间和试剂；如果样本为阳性，则继续实验，通过测序法分析被测样本的具体分型，得出比单纯荧光PCR更详细的信息，利于临床治疗。因此，荧光PCR+测序的组合检测方法既节省了人力物力，又可以更精确的得知被检测样本信息，是非常有效的检测手段。

4)操作简单：对于荧光PCR结果，可直接判断被检测样本阴阳性，简单快速，避免后续阴性样本的无效操作；可具体分型：对于荧光PCR阳性患者，使用测序技术可进行具体分型，给治疗提供依据；准确性高：使用荧光PCR技术，灵敏性强，且阳性患者会进行测序验证，并得出具体分型，不会产生假阳性或假阴性，特异性高，判断准确；过程可监控：本发明有内参参与整个过程，保证在DNA模板有效提取的前提下继续进行检测，避免实验试剂和时间的浪费及假阴性的误判。阴阳性对照的参与确保反应液的有效性。

5)整个操作过程可以在12-14h完成，结果快速，通量较高；无电泳过程，利于临床的推广及普及。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

检测10例强直性脊柱炎患者外周血样品中HLA-B27基因阴阳性及其具体分型。

本发明提供一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的方法，所述方法主要包括以下步骤：

(1)模板DNA提取

取200μL全血或直径为3mm的干血斑，使用Chelex-100煮沸法或者DNA提取试剂盒提取模板DNA。

(2)PCR扩增

分装23μL反应液A于PCR反应管内，分装管数＝n+2(注：n为待测样本数，2为用于阴性对照、阳性对照的管数)；分别加入2μL待测DNA模板、阴性、阳性对照，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应；反应程序为50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光。

分装23μL反应液B于PCR反应管，分装管数＝n+2(注：n为待测样本数，2为用于阴性对照、阳性对照的管数，A、B管样本顺序一致)；分别加入2μL待测DNA，荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应；反应程序为50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光。

(3)质量控制

①反应液A阴性对照无S型扩增曲线或CT值>38，且阳性对照有S型扩增曲线且CT值<35视为PCR有效，否则整体无效。

②在A管PCR有效前提下，查看每个待测样本，若有S型扩增曲线且CT值小于35，则模板提取有效，否则重新提取模板进行检测。

③反应液B阴性对照无S型扩增曲线或CT值>38，且阳性对照有S型扩增曲线且CT值<35视为PCR有效，否则整体无效。

④在B管PCR有效前提下，查看模板提取有效样本的B管PCR结果，若样本无S型扩增曲线或CT值>38，则视为HLA-B27阴性样本；若有S型扩增曲线且CT值小于35，视为HLA-B27阳性，进行后续实验操作，以检测具体分型。

(4)酶解

分装2.5μL酶解试剂于PCR反应管；分别加入5μL反应液B扩增产物为模板，混匀后置于普通PCR仪进行酶解；反应程序为37℃60min；80℃15min。

(4)测序反应

分装1μL测序试剂和2μL测序引物HLA-B27F(浓度为3.2μM)于PCR反应管；分别加入3μL上述酶解产物，混匀后置于普通PCR仪进行反应；反应程序为96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后若不立即进行下一步则置于4℃冰箱。

(5)纯化与测序

采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，按照ABI 3130测序仪使用说明进行测序。

(6)数据收集处理和分析

将测序得到的序列在NCBI数据库进行比对，首先确认HLA-B27是否为阳性，然后根据本方法给出的特异序列，对阳性样本具体分析亚型及次亚型。

(7)结果

样本	HLA-B27阴阳性	HLA-B27分型
			患者1	+	B27-04-02
患者2	+	B27-04-01/04
			患者3	+	B27-04-01/04
患者4	+	B27-04-03
			患者5	+	B27-04-01/04
患者6	+	B27-05-26
			患者7	-	-
患者8	+	B27-05-17
			患者9	+	B27-04-03
患者10	+	B27-04-01/04

(8)与PCR-SSP法对比

将该10例样本用PCR-SSP法进行检测，对比结果如下：

可以看出，基因测序法除去可以具体分型的优势外，比PCR-SSP法灵敏性更强，准确性更强，且无需电泳，非常适合临床推广及使用。

Claims

1.用于HLA-B27基因型分型检测的引物及探针，其特征在于，HLA-B27荧光PCR及测序用引物的序列为：

HLA-B27F：5'-ACGTGGACGACACGCTGTTCG-3'

HLA-B27R：5'-GCAGCGTCTCCTTCCCGTTCT-3'

HLA-B27探针的序列为：

HLA-B27P：5'-GTTCGTGAGGTTCGACAGCGAC-3'

所述HLA-B27探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1，

所检测和/分型的HLA-B27基因型为B27-01、B27-02-01、B27-02-02、B27-03、B27-04-01/04、B27-04-02、B27-04-03、B27-04-05、B27-05-03、B27-05-05、B27-05-06、B27-05-07、B27-05-08、B27-05-09、B27-05-10、B27-05-11、B27-05-12、B27-05-13、B27-05-14、B27-05-15、B27-05-16、B27-05-17、B27-05-18、B27-05-19、B27-05-20、B27-05-21、B27-05-22、B27-05-23、B27-05-24、B27-05-25、B27-05-26、B27-05-27、B27-05-28、B27-05-29、B27-05-30、B27-07-03、B27-07-04、B27-10、B27-15。

2.一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的试剂盒，其特征在于，包括内参体系反应液A、检测体系反应液B、酶解试剂、测序引物、测序试剂、阴性对照和阳性对照，

检测体系反应液B包括：PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、权利要求1所述引物及探针，荧光PCR反应酶系；

测序引物为权利要求1所述引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，

内参体系反应液A包括：10×PCR缓冲液、MgCl₂ 2.0～5.0mM、dNTPs0.5～1.5mM、扩增内参基因的引物0.2～2.0μM、扩增内参基因的探针0.1～1.0μM、荧光PCR反应酶系Taq酶2.0～4.0U和UNG酶0.5～1.0U，所述扩增内参基因的引物为β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'，β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'，扩增内参基因的探针的序列为：β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'，所述探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。

4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述酶解试剂为10×CIAP缓冲液、CIAP酶、ExoI酶和水，体积比为10:1:2:12。

5.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，测序试剂为测序Buffer和BigDye，体积比为1:1。

6.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，阴性对照为水；阳性对照为含有HLA-B27基因的人类基因组DNA溶液。