CN102337334A

CN102337334A - 一种检测人白细胞抗原hla-b27基因的专用引物及试剂盒

Info

Publication number: CN102337334A
Application number: CN2011102816167A
Authority: CN
Inventors: 方国伟; 陈巧妙; 李文静; 宋坤
Original assignee: FUZHOU AIDIKANG MEDICAL INSPECTION CO LTD
Current assignee: FUZHOU AIDIKANG MEDICAL INSPECTION CO LTD
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明公开了一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括：（1）用于检测目的基因的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe，其中，B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT；B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT；B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC–TAMRA；（2）用于检测内参基因GAPDH的上下游引物Gapdh-1、Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，Gapdh-1:CAGGTGGAGCGAGGCTAG；Gapdh-2:CTACCCATGACTCAGCTTCTCC；Gapdh–probe:HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。本发明还提供了一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试剂盒。采用“一管双检”替代了原有的双管检测的方法，增加了一次上机所能检测的样本量，很大程度的提高了检测效率。

Description

一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物及试剂盒

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物及试剂盒，采用“一管双检”荧光定量PCR技术，可以有效的节约检测时间，提高检测效率。

背景技术

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性、进行性,中轴关节受累的关节病变,其中以骶髂关节和脊柱关节受累为主要临床表现。该病早期进展较慢,但后期发展较快,很短时间内形成驼背畸形,髋、膝等关节强直。诊断主要建立在影像学检查基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难，容易漏诊或误诊，使很多患者丧失了早期治疗控制病情的时机，更有部分患者因错误或不正规的用药而出现了各种并发症，甚至造成了残疾。故早期诊断显得尤为重要，是争取其良好预后的关键。

HLA-B27是一种主要组织相容性复合物Ⅰ类分子，表达于大多数人类有核细胞和血小板表面。HLA-B27基因定位于人类第6 号染色体短臂上,由8个外显子和7个内含子组成。自1973年Brewerton等率先报道, HLA-B27抗原与AS密切相关以来,世界范围内对HLA与疾病的相关性研究与探讨一直不断。不同种族、不同地区人群的研究结果显示, HLA-B27抗原与AS的相关性是迄今已知HLA与疾病相关中最强和最典型的,超过90%的AS患者其HLA-B27抗原的表达为阳性,普通人群中仅5% ～10%的为阳性。对疑似AS患者进行HLA-B27检测有助于提高早期诊断AS的可能性,为此类患者的诊断和鉴别诊断提供线索,可弥补X线不能早期诊断AS的不足。HLA-B27检测还可预测幼年特发性关节炎患儿的转归,如患者HLA2B27 阳性,则发展为AS的可能性大。同时HLA-B27 抗原检测对AS的预防亦具有一定意义,如HLA-B27阳性患者的一级亲属可检测B27,对AS进行早期诊断,及早进行干预治疗。

目前常用的HLA-B27的检测方法有微量淋巴细胞毒法、流式细胞术（FCM）、PCR-SSP和实时荧光定量PCR等方法。其中淋巴细胞毒法操作繁琐，相较而言，流式细胞仪以其快速灵敏、多参数特点在临床检测HLA-B27中得到广泛地应用，但由于存在标本不易存放，仪器昂贵等问题，促使我们探索以其他方法进行HLA—B27检测的探索。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性, 而且能对PCR 进行实时在线检测, 节约了大量的检测时间, 避免了遗留污染的发生。2000 年有学者开始采用实时荧光PCR 对HLA-B27 进行基因分型, 它在不增加仪器投入的前提下，较淋巴细胞毒法增加了检测效率，较FCM法则降低了对于样本的要求。常见的方法有SYBR Green I 染料法, 双探针杂交法以及Taqman技术等。

本发明申请人于2010年在中国专利申请201019146024.7中公开一种用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，采用实时荧光PCR技术结合Allglo探针应用于HLA-B27基因检测，即采用Allglo探针检测目的基因B27，而检测内参基因的探针是Taqman探针，由于两种探针的类型不同，采用的是双管检测，即一管检测目的基因B27，一管检测内参基因。一台96孔的荧光PCR仪只可同时检测45份样品，检测效率不高。

发明内容

鉴于现有技术中检测HLA-B27方法的不足，在目前已有的 “双管”荧光定量PCR检测HLA-B27基因的方法基础上，本发明设计了用于检测内参基因GAPDH的上下游引物、探针序列，未改变检测目的基因所用引物及探针序列，但替代原有的Allglo探针，采用同检测内参基因相同类型的Tapman探针,用“一管双检”荧光定量PCR技术检测HLA-B27基因。采用两条不同通道的荧光基团标记的Tapman探针加入一个PCR反应体系中，通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，实现“一管双检”的要求，开发了一种新型的HLA-B27基因检测试剂盒。

一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括：

（1）用于检测目的基因的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe，其中，

B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT

B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT

B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC –TAMRA；

（2）用于检测内参基因GAPDH的上下游引物Gapdh-1、Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，

Gapdh-1: CAGGTGGAGCGAGGCTAG

Gapdh-2: CTACCCATGACTCAGCTTCTCC

Gapdh –probe: HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。

本发明还提供了一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试剂盒，其特征在于，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述PCR反应液包括PCR缓冲液；d NTP；Mg²⁺；检测目的基因用的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe；以及检测内参基因GAPDH用的上下游引物Gapdh-1,Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，

B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT

B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT

B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC –TAMRA；

Gapdh-1: CAGGTGGAGCGAGGCTAG

Gapdh-2: CTACCCATGACTCAGCTTCTCC

Gapdh –probe: HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。

进一步地，所述阳性对照品为含有HLA-B27基因组的溶液；所述阴性对照品为无HLA-B27基因组的溶液。

由于HLA-B27各个亚型的序列差异，通过本发明设计的上下游引物及探针的特异性，可检测到的亚型为：B2701、B2702、B2703、B2704、B2705、B2708、B2709、B2710、B2712、B2713、B2715、B2716、B2717、B2718、B2722、B2723、B2725、B2726、B2728、B2729、B2731、B2737、B2738、B2739、B2740、B2742。与AS相关的B2704、B2705（中国人群中最为多见）、B2701、B2702、B2703、B2708、B2710、B2714、B2715亚型都可以检测到。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用两条不同通道的荧光基团标记的Tapman探针，实现采用一个PCR反应体系进行目的基因HLA-B27基因检测和内参基因GAPDH检测，是一种新型的用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒。由于采用“一管双检”替代了原有的双管检测的方法，不但能对与强直性脊柱炎相关的HLA-B27基因亚型进行检测，具有特异性好，灵敏度高，操作简单、等优点，同时降低了检测成本，节约了检测时间，增加了一次上机所能检测的最大样本量，很大程度的提高了检测效率。可用于辅助临床上强直性脊柱炎的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。

附图说明

图1是使用本发明试剂盒检测样品1的结果图。

图2是使用本发明试剂盒检测样品2的结果图。

具体实施方式

实施例1

本发明的检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试剂盒，包括：

红细胞裂解液；

DNA提取液：TIANGEN组织/血液/细胞基因组DNA抽提试剂盒；

PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（2×）(TOYOBO,QPS-101)、B27-1/B27-2各0.3uM、B27-probe（探针）0.2 uM；Gapdh-1/Gapdh-2各0.2uM、Gapdh-probe（探针）0.1uM；其中B27-1为：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT；B27-2为：CGGCGGTCCAGGAGCT；B27-probe为FAM-TACCACCAGGACGCCTAC-TAMRA；Gapdh-1为： CAGGTGGAGCGA GGCTAG；Gapdh-2为CTACCCATGACTCAGCTTCTCC； Gapdh-probe: HEX-ACCATGCCA CAGCCACCACACCTC-BHQ1；

阳性对照品：含HLA-B27基因组溶液；

阴性对照品：不含HLA-B27基因组溶液。

实施例2

本发明试剂盒的使用方法：

（1）人基因组DNA提取：抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀。参考TIANGEN 组织/血液/细胞基因组DNA抽提试剂盒说明书，提取样本DNA。

（2）试剂配置：按检测人份数配置PCR反应液各X ul，每人份18ul分装：

X=18ul 反应液×（n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）。

（3）加样：加入PCR反应液中2ulDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。

（4）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500（美国Applied Biosystems公司）等。反应条件：95℃预变性1min；95℃ 15s，60℃ 1min 40个循环，荧光信号于60℃ 1min时采集。

（5）结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统自动计算出CT值。

1）内参阳性时，检测结果才认为有效；

2）阳性判断标准：，Ct <36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。

实施例3：采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本

取临床PCR组已检测过HLA-B27基因（采用双管荧光定量PCR技术）的全血标本250例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份标本加入PCR反应液2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测90份样品，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。

实验结果与PCR组的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表：

Sample	本次试验结果	PCR检测结果	Sample	本次试验结果	PCR检测结果
						03/25			30	27.04	30.85
8	33.23	33.47	36	26.14	30.64
						10	33.81	34.63	37	27.39	31.77
21	29.45	30.85	42	29.50	32.69
						22	29.98	30.74	43	29.73	34.26
25	32.30	32.76	46	26.96	31.89
						31	30.49	32.30	53	29.61	33.33
32	29.14	29.76	03/27
						34	30.56	30.64	1	29.09	31.41
37	31.00	31.48	10	29.70	32.13
						43	30.09	30.84	15	27.61	28.88
46	29.47	30.01	17	27.37	31.02
						50	30.68	33.13	18	29.17	31.82
60	30.40	33.13	27	27.86	29.43
						61	30.88	31.57	30	28.42	30.00
03/26			03/28
						1	27.79	32.85	3	27.43	30.81
8	29.36	33.72	10	29.69	32.59
						9	30.24	34.46	12	29.79	30.52
10	28.11	32.67	15	28.25	32.73
						16	28.54	32.60	21	30.30	34.04
23	27.17	32.56	24	29.11	30.99
						25	27.68	31.33	7	25.50	——

上表为本次实验结果和PCR实验室结果的对比。

从上表可以看出，250例样本中有247例与PCR的检测结果相符，符合率达到98.8%。说明本发明核酸检测试剂盒与双管荧光定量PCR法相比，不但检测结果准确性高，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。

实施例4 临床样品检测

取待检的临床样品1和样品2，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份样品加入PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。

样品1的检测结果如图1所示，内参基因GAPDH的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的CT值<36之前有扩增信号，所以样品1为阳性。

样品2的检测结果如图2所示，内参基因GAPDH的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的CT值>38之后无扩增信号，所以样品2为阴性。

序列表

<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司

<120> 一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物及试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggtctcaca ccctccagaa t 21

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggcggtcca ggagct 16

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taccaccagg acgcctac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggtggagc gaggctag 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctacccatga ctcagcttct cc 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accatgccac agccaccaca cctc 24

Claims

1.一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括：

B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT

B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT

B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC –TAMRA；

Gapdh-1: CAGGTGGAGCGAGGCTAG

Gapdh-2: CTACCCATGACTCAGCTTCTCC

Gapdh –probe: HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。

2.一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试剂盒，其特征在于，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述PCR反应液包括PCR缓冲液；d NTP；Mg²⁺；检测目的基因用的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe；以及检测内参基因GAPDH用的上下游引物Gapdh-1,Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，

B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT

B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT

B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC –TAMRA；

Gapdh-1: CAGGTGGAGCGAGGCTAG

Gapdh-2: CTACCCATGACTCAGCTTCTCC

Gapdh –probe: HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有HLA-B27基因组的溶液；所述阴性对照品为无HLA-B27基因组的溶液。