CN101974642A - 错配修复基因mlh1突变检测试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种MLH1基因突变检测试剂盒及其用途。试剂盒的主要成分包括:(1)MLH1基因PCR扩增与测序引物20对;(2)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物,可通过高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变,或者是进行限制性片段长度多态性分析。本试剂盒具有高效的MLH1基因突变检出与功能评估作用,用于错配修复基因MLH1突变检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种错配修复基因MLH1突变体检测试剂盒及其应用,特别涉及其在东亚胃癌高发人群的基因诊断及其突变后果评估。
背景技术
胃癌(gastric cancer,GC)在我国是位居第三的恶性肿瘤,年死亡率高达25/10万。其中可疑的遗传性病例大于20%,提示遗传因素在胃癌的发病中具有重要作用,但突变的检出率并不高。已经知道,MLH1基因编码在DNA复制过程的错配修复中起核心作用的蛋白。MLH1基因含有19个外显子,编码754个氨基酸。MLH1蛋白保守的氨基端被认为与ATP键合有关,而羧基端区域被认为是与PMS2蛋白相互作用区。MLH1基因突变影响DNA复制过程中的错配修复,从而导致肿瘤形成。MLH1基因突变类型与频率在东西方人群中存在较大差异。但是,由于缺乏针对东亚人群的有效的突变检测方法,在中国关于该基因突变的系统筛查与病例对照分析还未见报道。对于检出的错义突变或同义突变的功能后果也缺乏有效的评估手段。尤其从RNA剪切角度对于MLH1基因突变后果的评估还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种错配修复基因MLH1突变体检测试剂盒及其应用。
本检测试剂盒主要包括以下成分:
(1)MLH1基因启动子区及第1到第19外显子区PCR扩增与测序引物20对,各对引物序列见表1;
(2)常规PCR扩增试剂,如dNTP、Taq DNA聚合酶等。
表1MLH1基因第1-19外显子以及启动子区的PCR扩增与测序引物序列
本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用以下两种方式进行突变检测:一种方式是通过高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变;另一种方式是将PCR产物酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳条带进行分析。因此,上述试剂盒中还可以包括:限制性内切酶或者LC Green Plus+荧光染料。
所说的限制性内切酶是检测8种MLH1基因常见突变点的7种限制性内切酶:MLH1基因启动子区-93 G>A突变:Pvu II酶;MLH1基因启动子区-28A>G突变:Xba I酶;MLH1外显子5 c.394G>C(D132H)突变、MLH1外显子15 c.1721T>C(L574P)突变:Dde I酶;MLH1外显子10c.793C>T(R265C)突变:Mbo I酶。MLH1基因外显子13c.1455T>A(D485E)突变:Tfi I酶;MLH1基因外显子16c.1756G>C(A586P)突变:Mwo I酶;MLH1基因外显子18 c.2101C>A(Q701K)Cac8I。
在具有限制性内切酶的试剂盒中,还可以有琼脂糖凝胶。
本发明所说的试剂盒用于检测错配修复基因MLH1突变体。
本试剂盒的突变检测与功能评估步骤包括:
(1)提取样本外周血DNA.
(2)MLH1基因PCR扩增:
对于MLH1基因1-19外显子以及启动子区按照表1设计引物进行PCR扩增。反应体系为基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)0.8μl、10×PCR buffer(Mg2+free)1.0μl、MgCl2(25mM)1.0μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、二甲基亚砜(DMSO)0.4μl、ddH2O 5.32μl、Taq DNA聚合酶(5Unit/μl)0.08μl。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30sec,60℃(对应退火温度)复性30sec,72℃延伸40sec,40个循环;再72℃延伸7min,4℃保存。
(3)高分辨率溶解曲线法筛查基因微小突变:PCR扩增中混入LC Green染料,在LightScanner检测仪(美国Idaho公司)上进行熔解曲线扫描,利用Lightscanner软件分析曲线的形态差异,区分纯合子和杂合子;
或者是,限制性片段长度多态性分析:针对突变位点寻找特异的限制性内切酶,将PCR产物与内切酶反应体系混合,参照内切酶使用说明书在一定温度下反应一段时间,经琼脂糖凝胶电泳后,通过条带差异区分野生型、纯合突变或杂合突变。
本试剂盒具有高效的突变检测与后果评估作用。实施实例中报道,针对MLH1基因突变开展病例对照分析,涉及236例中国胃癌患者与240例正常对照的外周血DNA MLH1基因突变全面筛查。报道6种MLH1基因突变,及其这些突变在中国人群中的等位基因频率。病例对照分析提出MLH1 2101C>A(Q701K)突变在中国男性胃癌患者中的突变率显著高于正常男性,从而增加中国男性胃癌易感性。ESEfinder和BDGP分析指出该MLH1 2101C>A突变影响外显子剪接增强子角度,从而可能影响RNA正常剪接。综合以上结果MLH1 2101C>A突变对于中国男性胃癌患者具有病因学意义。本试剂盒在胃癌患者基因诊断与突变的病因学意义评估上具有重要作用。
附图说明
图1是MLH1基因Exon 12的HRM分析图:曲线1代表杂合子,曲线2代表纯合子。
图2是MLH1基因Exon 12测序图,箭头示MLH1 c.1151T>A杂合突变。
图3是携带MLH1 c.1151T>A杂合突变的DNA片段序列。图中下划线处示MLH1 c.1151T>A杂合突变。
图4是MLH1基因Exon 18 RFLP后电泳图,图中第1泳道为Marker,左起第3泳道可见230、189和41bp条带,提示为MLH1 2101C>A杂合突变。
图5是MLH1基因Exon 18测序图,箭头示MLH1 2101C>A杂合突变。
图6是携带MLH1 c.2101C>A杂合突变的DNA片段序列。图中下划线处示MLH1 c.2101C>A杂合突变。
具体实施方式
实施例1:
MLH1基因外显子12 c.1151T>A(V384D)突变的筛查与后果评估:选择236例中国江苏、安徽及浙江地区胃癌患者,,以及240例正常对照,抽取外周血,提取DNA。对于MLH1基因第12外显子按照表1引物进行PCR扩增及HRM分析。反应体系为:基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)0.8μl、10×PCR buffer(Mg2+free)1.0μl、MgCl2(25mM)1.0μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、二甲基亚砜(DMSO)0.4μl、ddH2O4.32μl、LC Green染料1.0μl、Taq DNA聚合酶(5Unit/μl)0.08μl。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30sec,60℃复性30sec,72℃延伸40sec,40个循环;再72℃延伸7min,4℃保存。HRM仪器LightScanner 96(美国Idaho公司)检测:打开Lightscanner软件,设置曝光时间80ms,扫描温度范围70-95℃进行扫描。扫描完成后使用Scanning程序进行熔解曲线分析,自动基因分型(图1)。杂合子的解链温度较纯合子低,其熔解曲线的下降段比纯合子的熔解曲线提前,因此图中曲线1代表杂合子,而曲线2代表纯合子。初步筛查为突变阳性的样本,采用BigDye Terminator V3.1试剂盒,在ABI 3130基因分析仪(美国ABI公司)上测序确认突变。图2示Exon 12筛查阳性者的测序结果,箭头所示为同一位置出现T和A的双峰,表明此处为c.1151T>A(V384D)杂合突变。携带有该突变的基因序列见图3,图中下划线处示MLH1 c.1151T>A杂合突变。本实验未检出纯合突变,共检出8例杂合突变。采用Mantel-Haenszelχ2等统计分析方法比较c.1151T>A(V384D)突变在患者与正常人中的携带率。该突变在胃癌患者于正常人间未见显著差异(表2)。
表2MLH1基因突变检测与病例对照分析结果
a基因型分布或等位基因频率的双侧卡方检验
bMantel-Haenszel卡方检验
c费谢尔确切概率检验。
SIFT分析错义突变对蛋白功能的影响:利用SIFT(http://sift.jcvi.org/)分析错义突变造成的单氨基酸改变对MLH1蛋白功能的影响。SIFT给定的评分阈值为0.5,即认为<0.5者很可能影响蛋白质的功能,而≥0.5者则是可容忍的。SIFT分析MLH1基因错义突变的后果见表3。SIFT分析显示检出的MLH1 V384D突变计分为0.00,可能影响MLH1蛋白功能,从而对错配修复功能产生影响。
表3SIFT分析MLH1基因错义突变的后果
实施例2:
MLH1基因外显子18c.2101C>A(Q701K)突变的筛查与后果评估:选择236例中国江苏、安徽及浙江地区胃癌患者,以及240例正常对照,抽取外周血,提取DNA。对于MLH1基因第18外显子按照表1设计引物进行PCR扩增及RFLP分析。反应体系为:基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)0.8μl、10×PCR buffer(Mg2+free)1.0μl、MgCl2(25mM)1.0μl、上游引物(10μM)0.2μl、下游引物(10μM)0.2μl、二甲基亚砜(DMSO)0.4μl、ddH2O 5.32μl、Taq DNA聚合酶(5Unit/μl)0.08μl。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30sec,56℃复性30sec,72℃延伸40sec,40个循环;再72℃延伸7min,4℃保存。限制性片段长度多态性(RFLP)分析:针对突变位点寻找特异的限制性内切酶Cac8I。该酶的识别位点为GCNNGC,当发生c.2101C>A突变时(下划线示),该内切酶不能发挥作用。具体操作:PCR产物5μl、Cac8I内切酶0.125μl、10×NEBuffer 0.5μl,37℃反应1小时后,2%琼脂糖凝胶电泳,在紫外下观察实验结果。PCR扩增片段全长230bp,电泳图上出现条带可能的几种情况:①野生型(CC):189bp+41bp;②杂合突变(CA):189bp+41bp+230bp;③纯合突变(AA):230bp。本实验未检出纯合突变,共检出11例杂合突变。图4是MLH1基因Exon 18RFLP后电泳图,左起第3泳道可见230、189和41bp条带,提示为MLH1 2101C>A杂合突变。初步筛查为突变阳性的样本,采用BigDye Terminator V3.1试剂盒,在ABI 3130基因分析仪(美国ABI公司)上测序确认突变。图5示Exon 18突变筛查阳性者的测序结果,箭头所示为同一位置出现C和A的双峰,表明此处为c.2101C>A(Q701K)杂合突变。携带有该突变的基因序列见图6。其中下划线所示即为c.2101C>A突变点。采用Mantel-Haenszelχ2等统计分析方法比较突变在患者与正常人中的携带率。提出MLH1 2101C>A(Q701K)突变在中国男性胃癌患者中的突变率显著高于正常男性,从而增加中国男性胃癌易感性(表4)。ESEfinder与BDGP预测突变对RNA剪切的影响:利用ESEfinder(http://exon.cshl.edu/ESE/)和BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice-instrucs.html)预测MLH1基因内含子、外显子交界区域错义突变对RNA前体外显子剪切的影响。ESEfinder通过分析目前已知ESE与剪接调控蛋白SR protein的相互作用,从外显子序列中寻找对应的信息,预测序列中存在的潜在的ESE。BDGP则侧重评估突变对外显子剪接效率的影响。ESEfinder显示突变对剪接产生较大的影响,如序列上原来存在的SF2/ASF结合位点的丢失,突变使序列上新增了SRp40的结合位点,另外还改变了原来存在的SF2/ASF、SC35结合位点的结合能力。而BDGP显示了突变使剪接效率轻微下降(表5)。因此该MLH1 2101C>A突变通过影响外显子剪接增强子角度,从而影响RNA正常剪接。综合以上结果MLH1 2101C>A突变对于中国男性胃癌患者具有病因学意义。
表4MLH1基因2101C>A突变按年龄与性别的分层分析结果
aMantel-Haenszel卡方检验。
表5MLH1基因Exon 18 c.2101C>A突变对于RNA剪切的分析
Claims (5)
1.一种MLH1基因突变检测试剂盒,其特征在于包括以下成分:
(1)MLH1基因PCR扩增与测序引物20对,(2)PCR扩增用试剂;
所说的20对引物序列如下:
第1对:F: 5'-gaacactgaggtgattggc-3’, R: 5'-cattttggcagaagagccaag-3’
第2对:F: 5'-aggcactgaggtgattggc-3’,R: 5'-tcgtagcccttaagtgagc-3’
第3对:F: 5'-aatatgtacattagagtagttg-3’, R: 5'-cagagaaaggtcctgactc-3’
第4对:F: 5'-agagatttggaaaatgagtaac-3’, R: 5'-acaatgtcatcacaggagg-3’
第5对:F: 5'-aacctttccctttggtgagg-3’, R: 5'-gattactctgagacctaggc-3’
第6对:F: 5'-gattttctcttttccccttggg-3’, R: 5'-caaacaaagcttcaacaatttac-3’
第7对:F:5'-gggttttattttcaagtacttc-3’, R: 5'-gctcagcaactgttcaatgtatg-3’
第8对:F: 5'-ctagtgtgtgtttttggc-3’, R: 5'-cataaccttatctccacc-3’
第9对:F: 5'-ctcagccatgagacaataaatcc-3’,R: 5'-ggttccaaaataatgtgatgg-3’
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第15对:F: 5'-tggtgtctctagttctgg-3’, R: 5'-cattgttgtagtagctctgc-3’
第16对:F: 5'-cccattttgtcccaactgg-3’, R: 5'-cgatcagttgaaatttcag-3’
第17对:F: 5'-catttggatgctccgttaaag-3’, R: 5'-cacccggctggaaattttatttg-3’
第18对:F: 5'-ggaaagcactggagaaat-3’R: 5'-ccctccagcacacatgcatgta-3’
第19对:F: 5'- taagtagtctgtgatctccg-3’, R: 5'-ctagtcctggggtgccagtgtg-3’
第20对:F: 5'-gacaccagtgtatgttgg-3’, R: 5'-agagaaagaagaacacatccc-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括7种限制性内切酶:PvuⅡ、XbaⅠ、DdeⅠ、MboⅠ、Tfi I、Dde I、Mwo I和Cac8I。
3.根权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,还有琼脂糖凝胶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括LC Green Plus+荧光染料。
5.权利要求1所说的试剂盒用于检测错配修复基因MLH1突变体。
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