CN110656179A - 免疫敏感性预测的生物标志组成物及用途、试剂盒设备存储介质 - Google Patents

免疫敏感性预测的生物标志组成物及用途、试剂盒设备存储介质 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种免疫敏感性预测的生物标志组成物及用途、试剂盒设备存储介质，其中的生物标志组成物至少包括：微卫星状态以及B2M基因的突变状态，其中，所述B2M基因的突变状态包括如说明书中的表3所示的8个突变位点中的一个或多个。

Description

免疫敏感性预测的生物标志组成物及用途、试剂盒设备存储 介质
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种免疫敏感性预测的生物标志组成物及用途、试剂盒设备存储介质，更具体地，涉及一种对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性进行预测的生物标志组成物相应的试剂盒以及相应的设备、系统和存储介质。
背景技术
正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤细胞，但肿瘤细胞能够采用不同策略使人体的免疫功能受到抑制，从而不能正常的杀伤肿瘤细胞，使肿瘤得以幸存。肿瘤免疫检查点抑制剂治疗是通过恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的治疗方法。
结直肠癌(CRC)是中国最常见的恶性肿瘤之一，仅在2015年就有37.6万新发病例和19.1万人死亡(Chen et al.,(2016)CA Cancer J Clin 66(2):115-132)。最近出现的免疫检查点抑制剂(ICI)疗法在未经选择的不同类型癌症的对象中实现中等的响应率(20-25％)，但在CRC中却没能实现(Topalian et al.,(2012)The New England journal ofmedicine 366(26):2443-2454；Brahmer et al.,(2010)J Clin Oncol 28(19):3167-3175)。
研究发现，中等比例的CRC对象与高度微卫星不稳定性(MSI-H)相关。微卫星不稳定性主要是由于DNA错配修复系统缺陷(dMMR)造成的重复序列中频繁发生的插入缺失(indel)。MSI-H在II期(～20％)和III期(～12％)CRC对象中比在IV期CRC对象(～4％)中更常见(Boland et al.,(2010)Gastroenterology 138(6):2073-2087)。随着在治疗决策中使用MSI-H/dMMR作为生物标志物，CRC对象对ICI的响应比例显著增加。由dMMR引起的TMB升高是引起显著免疫效应的关键。在预先选择的MSI-H/dMMR CRC队列中，大约30％至50％的对象在针对多种癌症的二线治疗的使用Nivolumab的临床试验和使用Pembrolizumab的篮式试验中实现研究者评估的客观响应。最近发布的长期随访数据显示，dMMR/MSI-H CRC对象的中位总生存期高于目前主流化疗方案和靶向表皮生长因子受体(EGFR)或血管内皮生长因子(VEGFR)的生物制剂治疗的对象(Le et al.,(2017)Science 357(6349):409-413；Overman et al.,(2017)The Lancet Oncology)。
然而，在选择出的MSI-H/dMMR CRC对象中，仍然有大约50％或以上的对象对ICI无响应，同时一些非MSI-H/dMMR CRC对象也报道为对ICI有响应。
这些研究说明仅仅通过MSI-H/dMMR来筛选CRC对象进行ICI治疗存在缺陷，并不满足精准治疗的需求，不能真正有效地避免耽误对象宝贵的治疗时间和金钱的浪费。与此同时，单抗药昂贵的价格给对象家庭带来了沉重的经济负担。如何选择获益人群从而提高药物经济学效能是当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种生物标志组成物，用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，其特征在于，至少包括：微卫星状态以及B2M基因的突变状态，其中，B2M基因的突变位点包括如表3所示的8个突变位点中的一个或多个。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：其中，突变位点为能导致氨基酸为L15Ffs*41和V69Wfs*34改变的突变位点。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：还包括：B2M蛋白。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：还包括：POLE基因的突变状态。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：其中，POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中任意一个或多个的突变位点。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：其中，POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中能导致对象的TMB>100muts/Mb的任意一个或多个突变位点。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：其中，微卫星状态、B2M基因的突变位点以及POLE基因的突变位点根据对来自对象的组织样本测序得到的测序结果中找出的变异信息得到，变异信息包括根据突变判断规则判断为真的点突变和判断为真的插入缺失突变，判断规则为：对于点突变，当满足下述第一条件时，判断该点突变为真：该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次，包含该点突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该点突变相对应的碱基质量值>21，包含有该点突变的读长的条数≥5条，包含有该点突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，质量合格的组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；当插入缺失突变的序列连续相同的碱基<5时，满足下述第二条件时，判断该插入缺失突变为真：该插入缺失突变所在位置的测序覆盖深度>600次，包含该插入缺失突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21，包含有该插入缺失突变的读长的条数≥5条，包含有该插入缺失突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥5且<7时，除了满足第二条件，且变异等位基因频率≥10％时，才判断该插入缺失突变为真；当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥7时，除了满足第二条件，且变异等位基因频率≥20％时，才判断该插入缺失突变为真。
本发明提供的生物标志组成物，还具有这样的特征：其中，免疫检查点抑制剂为派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、Avelumab以及Durvalumab中的任意一种或多种。
本发明还提供一种生物标志组成物在制备用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的产品中的用途，其特征在于：其中，生物标志组成物为上述的生物标志组成物。
本发明还提供一种用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的试剂盒，其特征在于：试剂盒用于检测用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性的生物标志组成物，其中，生物标志组成物为上述的生物标志组成物。
本发明提供的试剂盒，还具有这样的特征，包括：用于对ACTIN基因进行扩增来判断来自对象的组织样本质量是否合格的引物，引物包括引物F、R1和R2，各个引物的核苷酸序列分别为：
F，5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’；
R1，5’-CACGCTCGGTGAGGATCTTC-3’；
R2，5’-TCGAAGTCCAGGGCAACATAGC-3’；
R3，5’-AAGGCTGGAAGAGCGCCTCGGG-3’。
本发明还提供一种免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，其特征在于，包括：预测部，基于包括微卫星状态和B2M基因的突变状态的生物标志组成物的相应信息进行预测，其中，生物标志组成物为上述的生物标志组成物。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，还具有这样的特征：当对象的微卫星状态为MSI-H，且存在B2M基因的突变位点时，预测部预测对象对免疫检查点抑制剂一级不敏感。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，还具有这样的特征：生物标志组成物还包括B2M蛋白，同时，对象的B2M蛋白的表达状态为不表达时，预测部预测对象对免疫检查点抑制剂二级不敏感。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，还具有这样的特征：生物标志组成物还包括POLE基因的突变状态，当对象的微卫星状态为非MSI-H，且同时存在POLE基因的突变时，预测预测对象对免疫检查点抑制剂一级敏感。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，还具有这样的特征：当所述对象的所述微卫星状态为非MSI-H，同时存在所述POLE基因的突变，并且不存在B2M基因的突变时，预测对象预测对免疫检查点抑制剂二级敏感。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，还具有这样的特征：其中，POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中任意一个或多个的突变位点。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，还具有这样的特征：其中，所述POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中能导致对象的TMB>100muts/Mb的任意一个或多个的突变位点。
本发明还提供一种免疫检查点抑制剂敏感性系统，其特征在于，包括：相关信息获得设备，用于获得生物标志组成物的相关信息，免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，基于包括相关信息的生物标志组成物的相应信息预测对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，其中，免疫检查点抑制剂敏感性预测设备为上述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备。
本发明提供的免疫检查点抑制剂敏感性系统，还具有这样的特征：其中，相关信息获得设备根据对来自对象的组织样本测序得到的测序结果中找出的变异信息得到相关信息，变异信息包括根据突变判断规则判断为真的点突变和判断为真的插入缺失突变，判断规则为：对于点突变，当满足下述第一条件时，判断该点突变为真：该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次，包含该点突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该点突变相对应的碱基质量值>21，包含有该点突变的读长的条数≥5条，包含有该点突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，质量合格的组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；当插入缺失突变的序列连续相同的碱基<5时，满足下述第二条件时，判断该插入缺失突变为真：该插入缺失突变所在位置的测序覆盖深度>600次，包含该插入缺失突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21，包含有该插入缺失突变的读长的条数≥5条，包含有该插入缺失突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥5且<7时，除了满足第二条件，且变异等位基因频率≥10％时，才判断该插入缺失突变为真；当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥7时，除了满足第二条件，且变异等位基因频率≥20％时，才判断该插入缺失突变为真。
本发明还提供一种免疫检查点抑制剂敏感性的设备，其特征在于，包括：用于存储计算机程序指令的存储器；以及用于执行计算机程序指令的处理器，其中，当该计算机程序指令被该处理器执行时，基于包括微卫星状态和B2M基因的突变状态组成的生物标志组成物的相应信息使该设备执行对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂敏感性的预测步骤，其中，生物标志组成物为上述的生物标志组成物。
本发明还提供一种计算机可读介质，其特征在于：计算机可读介质存储有计算机程序，其中，计算机程序能被处理器执行以基于包括微卫星状态和B2M基因的突变状态组成的生物标志组成物的相应信息实现对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂敏感性的预测步骤，其中，生物标志组成物为上述的生物标志组成物。
发明作用与效果
本发明提供的免疫敏感性预测的生物标志组成物及用途、试剂盒设备存储介质，其中的预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性生物标志组成物，能通过将微卫星状态结合具有特定突变位点的B2M基因的突变状态对结直肠癌的对象是否接受免疫检查点抑制剂治疗的预测性标志物进行免疫治疗的经济性能的初步评估，相比仅以微卫星状态作为生物标志物的预测，对微卫星状态为高度微卫星不稳定状态(MSI-H)的结直肠癌对象，能初步使得其中45％的对象能节省宝贵的治疗时间和金钱，提供更加有效的经济性能参考指标。
附图说明
图1为本发明实施例1中一个变异位点通过IGV显示的示意图；
图2为实施例1中对426个CRC对象基因组改变分析显示的几个重要基因突变与微卫星分布情况；
图3为对实施例1中的表2中的部分对象免疫组化分析B2M和HLAI-A,B,C蛋白表达状态的结果示意图；
图4为实施例1中426个CRC对象基因组改变分析显示的TMB值分布情况；
图5为本发明的实施例1中针对表4中的5个POLE突变样品进行免疫组化检测的结果；
图6为本发明的实施例3涉及的免疫检查点抑制剂敏感性系统；
图7为本发明的实施例3所涉及的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下为实施例中涉及的定义或术语：
1、微卫星(microsatellite,MS)
又称简单重复序列或短串联重复序列，是由遍布人类基因中(编码区和非编码区)的1-6个核苷酸的串联重复片段构成；
2、微卫星状态(MS)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)
微卫星易受到插入或缺失的影响，发生长度的改变。通过比较肿瘤对象的肿瘤组织和正常组织的位点突变状态可以判断微卫星状态。
微卫星不稳定性是指与正常组织相比，在肿瘤中微卫星由于插入或缺失而造成的微卫星长度改变的现象，主要是由人类DNA错配修复(MMR)功能缺陷引起的。
根据MSI被检出的频率将微卫星状态分为高度微卫星不稳定状态(MSI-H，即MSI出现的频率高于40％)、低度微卫星不稳定状态(MSI-L，即MSI出现的频率低于40％)以及微卫星稳定状态(MSS，无明显MSI出现)，以下实施例中，将MSS和MSI-L统称为非MSI-H。
3、肿瘤突变负荷(TMB)
被定义为每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。TMB一般以突变的总数量或每1Mb(1兆碱基)的突变数量来表示(muts/Mb)。然而，只有10％的突变可以产生与MHC高亲和力结合的突变肽段。而能够与MHC高亲和力结合的肽段又只有1％能够被肿瘤对象体内的T细胞识别。也就是说300个突变，最终可能只产生2-4个新抗原。理论上TMB越高，最后产生的能够被T细胞识别的新抗原也越多。
4、肿瘤免疫检查点抑制剂治疗(简称免疫治疗)
肿瘤免疫检查点抑制剂治疗就是通过恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的治疗方法。
正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤细胞，但肿瘤细胞能够采用不同策略使人体的免疫功能受到抑制，从而不能正常的杀伤肿瘤细胞，使肿瘤得以幸存。肿瘤细胞的上述特征被称为免疫逃逸。
抗肿瘤免疫分为以下七个环节：1、肿瘤抗原释放；2、肿瘤抗原呈递；3、启动和激活效应性T细胞；4、T细胞向肿瘤组织迁移；5、肿瘤组织T细胞浸润；6、T细胞识别肿瘤细胞；7、清除肿瘤细胞。任何环节出现异常均可能导致抗肿瘤免疫失效，出现免疫逃逸。肿瘤通过抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤，从而产生免疫逃逸。
5、抗PD-L1抗体
一种用于检测肿瘤细胞中PD-L1蛋白表达情况的单克隆抗体。
PD-L1是一种在肿瘤细胞、抗原提呈细胞中表达的标志物。它可以与T细胞上的PD-1结合，传导免疫抑制信号，抑制T细胞的活性。而PD-L1在肿瘤细胞表面的表达水平成为目前判断PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂有效率的重要参考因素之一。通过使用抗PD-L1抗体对组织样本进行免疫组化可以确定肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平。
6、抗CD3抗体
一种用于检测细胞中CD3蛋白表达情况的单克隆抗体。CD3分子是一种重要的白细胞分化抗原，存在于几乎所有T细胞的表面，与T细胞受体蛋白(TCR)非共价键连接，形成TCR-CD3复合物，参与其信号向细胞内的传达，诱导T细胞活化。一般的检测技术通过标记CD3分子来标记T淋巴细胞。
以下各个实施例中，涉及的样本与方法说明如下：
1、样本：组织样本均来自中国CRC对象的FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)，组织样本可以为肿瘤组织样本，肿瘤组织样本可以是手术切割的肿瘤组织或穿刺活检的肿瘤组织等，本实施例中的组织样本为手术切割的肿瘤组织样本。对照样本为同一对象配对的外周全血。所有对象均提供书面知情同意书。
2、全面的基因组分析：
进行靶向捕获的下一代测序(NGS)，涉及包含450个癌症相关基因的组合。该部分可以采用试剂盒完成样本中DNA提取和定量等，比如，以下实施例中，通过DNA FFPE TissueKit和DNA Mini试剂盒(QIAamp)分别从肿瘤含量不低于20％的全部未染色FFPE切片和外周全血中提取DNA，然后用dsDNA HS测定试剂盒(Qubit)定量。使用KAPA Hyper Prep Kit(KAPA Biosystems)将～250bp超声处理的DNA片段化构建文库，然后进行PCR扩增和定量。使用自定义组合进行杂交捕获，该组和覆盖了2.6Mb的人类基因组，靶向450个癌症相关基因和某些经常重排的内含子。将捕获后的文库混合、变性并稀释至1.5～1.8pM，随后按照制造商的方案在Illumina NextSeq 500上进行配对末端测序得到测序结果。
3、基因组改变分析
该部分，根据上述测序结果，对基因组改变进行分析得到变异信息，包括的变异信息为单碱基取代(SNV，点突变)和短和长插入缺失(插入缺失)，根据该部分得到的变异信息，分析计算得到用来进行本发明的各个实施例涉及的TMB，以及包括用于进行结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性预测的生物标志组成物的相关信息，该相关信息包括微卫星状态，B2M基因和POLE基因的突变状态包括的突变位点。
其中，使用Burrows-Wheeler Aligner进行原始读段与人类基因组参考序列(hg19)的比对，然后使用Picard的MarkDuplicates算法进行PCR去重。
读取深度小于30x，链偏好性(strand bias)大于10％或VAF<0.5％的变体被移除。定义为来自dbSNP数据库(版本147)的或频率超过外显子组测序项目6500(ESP6500)的1.5％的或超过1000基因组计划的1.5％的常见单核苷酸多态性(SNP)也被排除在外。
为了检测准确，本实施例中，变异信息包括的点突变和插入缺失突变为判断为真的点突变和插入缺失突变。本实施例中，根据IGV显示的结果根据判断规则进行判断。判断规则如下：
对于点突变，当满足下述第一条件时，判断该点突变为真：
1.该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次；
2.包含该点突变的每个读长质量值>40；
3.包含该点突变的每个读长上与该点突变相对应的碱基质量值>21；
4.包含有该点突变的读长的条数≥5条；
5.包含有该点突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，质量合格的组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20。
对于插入缺失突变，则分三种情况：
第一情况，当插入缺失突变的序列连续相同的碱基小于5时，满足下述第二条件时，判断该插入缺失突变为真：
1.该插入缺失突变所在位置的测序覆盖深度>600次；
2.包含该插入缺失突变的每个读长质量值>40；
3.包含该点突变的每个读长上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；
4.包含有该插入缺失突变的读长的条数≥5条；
5.包含有该插入缺失突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6；
6.质量合格的组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20。
第二种情况，当插入缺失突变的序列连续相同的碱基大于等于5且小于7时，除了满足第二条件，且变异等位基因频率≥10％时，才判断该插入缺失突变为真；
当该插入缺失突变的序列连续相同的碱基大于等于7时，除了满足第二条件，且变异等位基因频率(VAF)≥20％时，才判断该插入缺失突变为真。经过上述判读，能更加准确地找出点突变或插入缺失突变，避免只是通过现有生信软件进行查找判断而将假阳性的点突变或插入缺失突变误当做阳性的，从而提高了后续分析的准确性，进而提高了免疫检查点抑制剂敏感性预测的准确性。
图1为本发明的实施例1中一个变异位点的通过IGV显示的示意图。
如图1，对于本实施例中的一个变异位点，该位点为具有连续相同的碱基区域的插入缺失突变，生信软件将其作为一个阳性变异信息检测出来，但是在通过IGV显示后，根据上述判读规则进行判读时可以看到，覆盖该位点的读长序列中，同时存在含有插入突变和缺失突变的读长序列，且含有插入突变的读长序列的占比和含有缺失突变的读长序列的占比相当，这种情况说明此位点很大可能为一个假阳性突变；同时，通过碱基计数，该位置的含有7个以上连续的A碱基，但统计含有此突变的读长序列时，其变异等位基因频率<20％，通过此两条标准可以判断该变异位点实际上为假阳性变异。
4、免疫组化分析蛋白表达状态
免疫组织化学(IHC)如下进行：先进行脱蜡、再水化和靶标回收，然后与针对B2M的单克隆抗体(Cell Signaling，克隆D8P1H)和抗HLA I类A、B和C的抗体(Abcam，ab70328)一起孵育。将载玻片与即用型显色试剂一起孵育，显色试剂由二抗分子和与葡聚糖聚合物主链偶联的辣根过氧化物酶(HRP)分子组成。随后加入发色团和增强剂进行的酶促转化导致可见反应产物在抗原位点沉淀。然后将样品用苏木精复染，在显微镜下观察B2M和HLAI类蛋白在肿瘤细胞中的表达状态，当检测结果为阴性(显微镜下观察，肿瘤细胞在细胞膜和细胞质的区域未出现染色)，说明该蛋白未表达。
另外，以下所有实施例中，几种预测结果的解释如下：
涉及的一级不敏感，指对虽然为MSI-H的结直肠癌对象，对肿瘤免疫检查点抑制剂治疗一般受益，一般仍不推荐肿瘤免疫检查点抑制剂治疗；
涉及的二级不敏感，指对虽然为MSI-H的结直肠癌对象，相对一级不敏感，对肿瘤免疫检查点抑制剂治疗受益更小，更加不推荐肿瘤免疫检查点抑制剂治疗；
涉及的一级敏感，指对虽然为非MSI-H的结直肠癌对象，对肿瘤免疫检查点抑制剂治疗一般受益，一般仍推荐肿瘤免疫检查点抑制剂治疗；
涉及的二级敏感，指指对虽然为非MSI-H的结直肠癌对象，相对于一级敏感，对肿瘤免疫检查点抑制剂治疗受益更大，更加推荐肿瘤免疫检查点抑制剂治疗。
实施例1
本实施例，通过具体的结直肠癌对象(CRC)分析，具体说明本发明的能用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性生物标志组成物。
本实施例总共针对426名CRC进行分析，对象信息见表1所示，其中，包括256名男性(中位年龄＝61)和170名女性(中位年龄＝59)，其FFPE肿瘤样本(组织样本)和匹配的全血样本(对照样本)用450基因组合(panel)进行如上的全基因组分析并进行基因组改变分析，其中，大多数CRC(50％)为IV期，24％为III期，20％为II期，6％为I期。通过PCR和基于变异信息确定MSI-H的发生率为9％(38/426)，而在MSI-H CRC对象中，只有18％(7/38)的MSI-HCRC对象处于晚期，而大多数(53％)的非MSI-H CRC对象表现出转移性病变(也即处于晚期)。
Figure BDA0002252212320000171
Figure BDA0002252212320000181
表1中，每列的百分比以表头的N为分母，且每个表格中的数字为分子计算得到。
图2为实施例1中对426个CRC对象基因组改变分析显示的几个重要基因突变与微卫星分布情况。
如图2所示：
(1)426个CRC样品显示典型的CRC基因组改变，其中前3位发生突变的基因是TP53(73％)、APC(70％)和KRAS(46％)，但：突变频率较高的TP53在为MSI-H的结直肠癌对象中的改变频率明显低于它们在为非MSI-H的结直肠癌的对象中的改变频率；另外两个在非MSI-H和MSI-H对象中分布较均匀，未显示出明显的分布差异；
(2)B2M基因和错配修复相关的基因(MSH6、MSH2、PMS2和MLH1，错配修复相关基因与导致MSI-H紧密相关)发生的突变频率(5-7％之间)虽然相比前3位发生突变的基因的突变频率较小，但在为MSI-H的结直肠对象中相比在为非MSI-H的结直肠癌对象中，呈现较频繁的突变频率。
由此可见，在结直肠癌对象中，相比其他发生突变的基因，B2M基因的突变更容易出现在MSI-H的对象中，也即证明B2M基因的突变与MSI-H密切相关。
Figure BDA0002252212320000191
Figure BDA0002252212320000201
表2中显示MSI-H的CRC对象中20个具有B2M基因的突变信息以及部分样本的蛋白检测结果。
从表2中可以看出，MSI-H的CRC对象中总共20个为B2M突变，B2M由于插入缺失引起氨基酸的移码突变的为17个，在MSI-H CRC对象中的发生率为45％(17/38)。而移码突变相比其他基因突变，更容易导致蛋白氨基酸序列改变，也就容易导致B2M蛋白不能正常表达。
而错配修复系统的缺陷，使得MSI-H CRC的特征之一是该队列中的TMB高达35至135muts/MB，并且，编码区中增加的突变产生高度免疫原性的新抗原(neoantigen)，而由B2M和HLA I类蛋白分子组成的MHC I复合物将新抗原呈递到癌细胞表面以引发细胞毒性T细胞应答。所以当B2M蛋白不能表达，也即B2M的沉默，将导致MHC I/肽复合物的不正确的构象和细胞表面展示受损，从而不能有效地将新抗原呈递给细胞溶解性T细胞，使癌细胞能够逃避免疫监视并获得对ICI治疗的抗性。
由此可见，当B2M基因的突变为能引起B2M基因的阅读框移码(移码突变)的插入缺失，对于为MSI-H的结直肠癌对象而言，将有约45％(17/38)的MSI-H的结直肠癌对象，虽然具有高TMB可能对免疫检查点抑制剂的不敏感，也即对ICI治疗不敏感。具体地，这样的突变位点，也即可能导致45％的MSI-H的结直肠癌对象对ICI不敏感的B2M基因的的包括的突变位点如表3所示。
Figure BDA0002252212320000211
表3所示的8个突变位点分别为：
c.43_44del：B2M基因的第43和44号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第15号氨基酸位置的亮氨酸突变成苯丙氨酸，并造成结构移码，在41个氨基酸后截短。
c.41_44del：B2M基因的第41-44号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第14号氨基酸位置的丝氨酸突变成苯丙氨酸，并造成结构移码，在29个氨基酸后截短。
c.204del：B2M基因的第204号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第69号氨基酸位置的缬氨酸突变成色氨酸，并造成结构移码，在34个氨基酸后截短。
c.276dup：B2M基因的第276号位置上的碱基重复，从而会造成B2M蛋白质第93号氨基酸位置的苏氨酸变成组氨酸，并造成结构移码，在2个氨基酸后截短。
c.290_291del：B2M基因的第290和291号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第97号氨基酸位置的谷氨酸变成缬氨酸，并造成结构移码，在17个氨基酸后截短。
c.137_138del：B2M基因的第137和138号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第46号氨基酸位置的酪氨酸变成半胱氨酸，并造成结构移码，在10个氨基酸后截短。
c.45_48del：B2M基因的第45-48号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第16号氨基酸位置的丝氨酸变成丙氨酸，并造成结构移码，在27个氨基酸后截短。
c.125del：B2M基因的第125号位置上的碱基缺失，从而会造成B2M蛋白质第42号氨基酸位置的苯丙氨酸变成丝氨酸，并造成结构移码，在2个氨基酸后截短。
并且，根据表2可知，且在上述17个B2M由于插入缺失引起的氨基酸的移码突变中，三个频繁突变的B2M基因位点分别为c.37-44(9个缺失，17个中的发生率为53％)，c.200-204(7个缺失，17个中的发生率为41％)，以及c.272-276(3个插入，17个中的发生率为18％)。
由上可见，导致氨基酸为L15Ffs*41和V69Wfs*34改变的突变位点更能引起B2M蛋白不表达。
图3为对实施例1中的表2中的部分对象免疫组化分析B2M和HLAI-A,B,C蛋白表达状态的结果示意图。
另外，图3中的检测结果相应在表2中表示出，阴性表示免疫组化分析显示蛋白未表达。
如图3和表2所示，总共针对表2中列出的14个对象进行了蛋白检测(图3中还有1个为进行对照的野生型)，其中，对象3943和9104的B2M蛋白正常表达，说明单个碱基突变，并不能导致B2M蛋白不表达。
还是如图3和表2所示，在剩余的B2M基因是非单个碱基突变的14个对象中，有7个对象的B2M蛋白未检测到表达，考虑到还存在未检测到的对象，以及可能存在的假阳性，说明表2的B2M基因突变的MSI-H CRC对象中，至少7个由插入缺失引起的突变会导致实际的B2M蛋白缺失，也即在38个MSI-H CRC对象中，至少有18％(7/38)的存在如表3所示的突变位点的对象，确实引起B2M蛋白的缺失，并且，具有至少一个来自氨基酸L15改变的B2M蛋白的8个可用样品中的6个(6/8，75％)产生阴性IHC染色信号，而具有至少一个来自氨基酸V69的改变的8个样品中的4个(4/8，50％)产生阴性IHC染色信号。
并且，在该14个对象中，HLA I类的表达基本正常，也即无论B2M基因是否突变以及如何突变，几乎不会损害HLA I类的表达，从而说明B2M蛋白缺失，单方面导致MHC I/肽复合物的不正确的构象和细胞表面展示受损，从而不能有效地将新抗原呈递给细胞溶解性T细胞，使癌细胞能够逃避免疫监视并获得对ICI治疗的抗性，从侧面更证实，MSI-H的CRC对象中，B2M基因存在如表3的突变位点，特别是导致氨基酸为L15Ffs*41和V69Wfs*34改变的突变，更容易引起B2M蛋白不表达，从而能引起MSI-H的CRC对象对ICI的不敏感。
所以可见，存在使得B2M氨基酸截短的B2M突变，其B2M蛋白的膜表达的确容易受到严重影响，也即会引起B2M蛋白不表达的几率更高，所以对于对免疫检查点抑制剂敏感性进行预测得到的结果也会更准确。
因此：
(1)微卫星状态联合B2M基因的突变状态作为筛选免疫检查点抑制剂受益者的生物标志组成物，得到的预测结果作为评估对象是否接受免疫检查点抑制剂的指标时，可以初步预测免疫检查点抑制剂的敏感性，此时，对于MSI-HCRC对象中B2M基因的突变状态存在具有表3的突变位点的MSI-H CRC对象预测为不敏感的MSI-HCRC对象，为了叙述方便，本实施例中定为一级不敏感，能初步避免只用微卫星状态为免疫检查点抑制剂的敏感性预测的生物标志物进行预测时产生的错误的经济性能评价，从而能初步避免约45％的MSI-HCRC对象在单独以微卫星状态为生物标志进行预测时可能带来的经济损失、耽误宝贵的治疗时间以及承受不必要的副作用；
(2)而当进一步联合B2M蛋白作为筛选免疫检查点抑制剂的受益者的生物标志组成物进行免疫检查点抑制剂的敏感性预测，得到的预测结果作为评估对象是否接受免疫检查点抑制剂的指标时，此时，对于B2M蛋白也未表达的MSI-H CRC对象预测为不敏感时，本实施例中定为二级不敏感，从而可以进一步精确到避免至少18％的MSI-H对象不必要的经济损失、耽误宝贵的治疗时间以及承受不必要的副作用。
图4为实施例1中426个CRC对象基因组改变分析显示的TMB值分布情况。
如图4所示，虽然微卫星为MSI-H的所有结直肠癌的中位TMB值(75muts/Mb，以2为底取Log后值为6.23)明显高于所有为非MSI-H的结直肠癌对象的中位TMB(5muts/Mb，以2为底取Log后值为2.32)，但在为MSS或MSI-L，也即非MSI-H的结直肠癌对象中，POLE基因发生突变的对象具有极高的TMB值(范围从176到825muts/Mb，以2为底取对数后值为7.46到9.69，中位数TMB＝347muts/Mb，以2为底取对数后值为8.44,)。而众所周知地是，患有癌症的对象的TMB值越高，代表进行免疫疗法的经济性能越好，所以，对于患有结直肠癌的MSI-L或MSS对象，具有POLE基因突变可以预测到他们能够对免疫检查点抑制剂治疗起到较好的治疗响应。
Figure BDA0002252212320000261
表4显示非MSI-H CRC POLE基因的突变信息，如表4所示，非MSI-H(MSS或MSI-L)的9个结直肠癌对象，当具有POLE基因的突变，特别是外显子9-14区域的突变，会带有极高的TMB值，也即引入POLE基因的突变状态进行联合预测，特别是引入POLE基因的突变状态包括位于外显子9-14区域的任意一个或多个的突变位点，更优地是引入包括位于外显子9-14区域的能导致对象的TMB大于100muts/Mb的任意一个或多个突变位点进行免疫敏感性预测，对于MSS或MSS-L的结直肠癌对象，有约2.3％(9/388)的MSS或MSS-L的结直肠癌对象可初步预测为对免疫检查点抑制剂敏感，同样为了叙述方便，此时，对于非MSI-H中存在上述POLE基因的突变的对象，定为一级敏感，则相比只以微卫星状态为生物标志物进行免疫检查点抑制剂敏感性的预测来说，初步为患有结直肠癌的对象增加了一个预测指标，从而能提高对免疫治疗经济性能评估的准确性，进而初步增加了2.3％的对象能从免疫检查点抑制剂治疗中受益。
Figure BDA0002252212320000271
表4的4个非MSI-H同时有B2M基因的突变，表5中针对该4个非MSI-H，列出具体的B2M突变信息，表5中显示这4个B2M基因的突变状态均能导致B2M氨基酸的截短，也即容易导致B2M蛋白不表达，并且，从上述可知，在B2M基因存在如表3所示的突变位点容易造成蛋白不表达，并且实际中，蛋白检测中会有部分的B2M蛋白仍然表达，所以表4中，对于B2M基因不存在如表3中的的突变位点时，可以预测为对免疫检查点抑制剂敏感的CRC对象，同样为了叙述方便，此时定为二级敏感。
可见，对于非MSI-H的CRC对象，在具有POLE基因突变的情况下，考虑同时具有B2M基因突变的情况，从而能进一步提高对免疫治疗经济性能评估的准确性，精确到至少1.3％(去除表5中的4个同时具有B2M基因突变的样品后，5/388)的MSS或MSS-L的结直肠癌对象能从免疫检查点抑制剂治疗中受益，当考虑到不同时具有如表3的B2M基因突变的情况下，能精确到2％(去除表5中1个具有表3的B2M基因的突变位点的样品2231后，8/388)的MSS或MSS-L的结直肠癌对象能从免疫检查点抑制剂治疗中受益。
图5为本发明的实施例1中针对表4中的5个POLE突变样品进行免疫组化检测的结果。
图5中，使用抗PD-L1的抗体(抗程序性死亡蛋白1)和抗CD3蛋白的抗体，对上述5个POLE突变样品进行免疫组化检测，观察这些突变样品的肿瘤细胞的PD-L1的表达情况和肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润情况。从图5中可以看出，这几个突变样品中肿瘤细胞的PD-L1染色为阳性，而肿瘤间质CD3染色也为阳性(CD3为T细胞表面特有的标志)，说明在这些POLE突变的样品中出现了高丰度的T淋巴细胞浸润，以及肿瘤细胞PD-L1的阳性表达，进而从另一个方面证实：对于这些在POLE基因的9-14外显子区域发生点突变的非MSI-H对象，特别是同时不存在B2M基因突变的，能评估出对于免疫治疗会有一个好的经济性能，能获得较好的免疫治疗效果。
总之，采用本实施例中提供的生物标志组成物，具体地，可以在以下方面作为一种经济参考指标：
1.可以同时作为高度微卫星不稳定状态和非高度微卫星不稳定状态的对象是否选择免疫检查点抑制剂的一种经济性能参考指标，以避免事实上不适宜免疫检查点抑制剂的MSI-H结直肠癌对象由于不适宜地使用免疫检查点抑制剂进行免疫治疗而引起的不必要的财务负担、耽误宝贵的治疗时间和不必要的副作用，并且可以有效防止不必要的医疗资源的浪费，而且可以避免一些事实上适宜免疫检查点抑制剂的非MSI-H的结直肠癌对象失去免疫治疗的机会；
2.作为结直肠癌的防治研究中选择研究对象的一种经济性能参考指标，促进结直肠癌防治研究更有效地选择研究对象进行免疫检查点抑制剂的免疫治疗的研究，从而得到科学合理地研究结果，更好地推动肿瘤防治的科学进步，并且避免了不必要的研究经费、人力以及物力的浪费，有效防止公共资源的浪费。
另外，本实施例中，免疫检查点抑制剂为PD-1/PD-L1检查点抑制剂类药物，例如为派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、Avelumab以及Durvalumab等。
实施例2
本实施例说明用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的试剂盒。
本实施例中，对于样本中DNA提取和定量等，均可以采用相应的试剂盒完成。
另外，为了能让后续预测更为准确，在对组织样本进行建库测序前，先对组织样本的质量进行判定，对判定合格的组织样本再进行测序等后续步骤，为此，本实施例提供用于检测用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性的生物标志组成物的试剂盒，包括用于对ACTIN基因进行扩增来判断来自对象的组织样本质量是否合格的引物，且当组织样本提取的DNA能被相应的预定引物特异性扩增到管家基因ACTIN基因时，判定该组织样本为质量合格，具体为：
其中，采用引物对F和R1、引物对F和R2、引物对F和R3分别特异性扩增ACTIN基因进行扩增。引物对F和R1用于扩增的目的片段的大小为100bp；引物对F和R2用于扩增的目的片段的大小为200bp；引物对F和R分用于扩增的目的片段的大小为300bp。当它们均扩增到目的片段时判定组织样本质量合格，
各个引物的核苷酸序列分别为：
F，5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’；
R1，5’-CACGCTCGGTGAGGATCTTC-3’；
R2，5’-TCGAAGTCCAGGGCAACATAGC-3’；
R3，5’-AAGGCTGGAAGAGCGCCTCGGG-3’。
其中，进行PCR扩增的体系为：25μL，包含1ng DNA模板，4pmol各条引物，12.5uL 2×Premix Taq(包含0.625U Taq酶，各0.4mM dNTP mix，3mM Mg2+离子)。
通过本步骤对组织样本进行质量判断，将质量合格的组织样本进行后续的检测计算等步骤，这样能避免因组织样品质量差引起的变异信息漏检，从而提高免疫检查点抑制剂敏感性预测的准确性。
实施例3
本实施例说明用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的相关设备。
图6为本发明的实施例3涉及的免疫检查点抑制剂敏感性系统。
如图6所示，本实施例提供了一种免疫检查点抑制剂敏感性预测系统100，包括通过通信网络30通信连接的相应信息获得设备10和免疫检查点抑制剂敏感性预测设备20。
相关信息获得设备10用于获得用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性的生物标志组成物的变异信息，为此，该相关信息获得设备10采用现有的测序方式，完成上述测序得到测序结果，并基于该测序结果，进行上述的基因组改变分析得到变异信息，从而得到包括微卫星状态，B2M基因和POLE基因的突变位点的相关信息。
另外，根据上述，为了检测准确，变异信息包括的点突变和插入缺失突变为判断为真的点突变和插入缺失突变。为此，本实施例中，相应信息获得设备10根据判断规则进行点突变和插入缺失突变的判断，具体判断规则已经前述，这里不再赘述。
图7为本发明的实施例3所涉及的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备。
如图7所示，免疫检查点抑制剂敏感性预测设备20基于生物标志组成物的相应信息预测对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，其中，生物标志组成物为实施例的生物标志组成物。免疫检查点抑制剂敏感性预测设备20包括预测侧通信部21、预测部22、预测侧暂存部23以及预测侧控制部24。
预测侧通信部10通过通信网络30，从相关信息获得设备10接收上述得到的生物组成标志物的相关信息作为预测对象对免疫检查点抑制剂的敏感性的相应信息。
预测部22基于上述相应信息，进行如下的预测：
(1)当微卫星状态为MSI-H，且存在B2M基因的突变，并且其中，突变包括如实施例1中表3所示的8种突变位点中的任意一个或多个时，优先地为能导致氨基酸为L15Ffs*41和V69Wfs*34改变的突变位点，则预测对象对免疫检查点抑制剂对免疫检查点抑制剂为前述的一级不敏感；此时，为了更加精确，可以继续联合结直肠癌对象的B2M蛋白的表达状态作为进行预测的相应信息，当同时B2M蛋白的表达状态为不表达时，则预测对象对免疫检查点抑制剂对免疫检查点抑制剂为前述的二级不敏感。
(2)而当微卫星状态为非MSI-H，也即为MSS或MSI-L，且同时存在POLE基因的突变，特别是POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中任意一个或多个的突变时，预测对象对免疫检查点抑制剂对免疫检查点抑制剂一级敏感；此时，为了更加精确，也同时考虑是否不存在B2M基因的突变，并且其中，B2M基因的突变状态要求包括如实施例1中表3所示的8种突变位点中的任意一个或多个时，优先地为能导致氨基酸为L15Ffs*41和V69Wfs*34改变的突变，若不存在上述的B2M基因的突变时，则预测对象对免疫检查点抑制剂对免疫检查点抑制剂二级敏感。
预测侧暂存部23对免疫检查点抑制剂敏感性预测设备20运行产生的相关数据或参数进行暂时存储。
预测侧控制部24包含控制预测侧通信部21、预测部22以及预测侧暂存部23运行的计算机程序。
实施例作用与效果
实施例1提供的生物标志组成物，使得实施例3中的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，能通过将微卫星状态结合B2M基因的突变状态的生物标志组成物作为结直肠癌的对象是否接受免疫检查点抑制剂治疗的预测性标志物进行免疫治疗的经济性能的初步评估，相比仅以微卫星状态作为生物标志物的预测，对微卫星状态为高度微卫星不稳定状态的对象，能初步使得其中45％的对象能节省宝贵的治疗时间和金钱；
进一步结合B2M蛋白生物标志组成物时，可以进一步精确到避免至少18％的MSI-H对象不必要的经济损失、耽误宝贵的治疗时间以及承受不必要的副作用。
进一步结合POLE基因的突变状态，而对于中国的患有结直肠癌的对象，更是可能初步增加2.3％的微卫星状态为非高度微卫星不稳定状态的受益对象，使得这些对象能针对性地治疗，提高了金钱的利用效率，并争取了大量的有效治疗时间，如果考虑同时具有B2M基因突变的情况，则能进一步提高对免疫治疗经济性能评估的准确性，精确到至少1.3％的非MSI-H的结直肠癌对象能从免疫检查点抑制剂治疗中受益，当考虑到不同时具有如表3的突变位点的B2M基因突变的情况下，能精确到2％的非MSI-H的结直肠癌对象能从免疫检查点抑制剂治疗中受益。
进一步地，实施例2中的提供的试剂盒能用于对于样本中DNA提取和定量等，还可以包括对特定基因的扩增的引物，以对组织样本的质量进行判定，而让后续预测更为准确。
另外，相应的，本发明还公开了一种免疫检查点抑制剂敏感性的设备，包括：用于存储计算机程序指令的存储器；以及用于执行计算机程序指令的处理器，其中，当该计算机程序指令被该处理器执行时，基于实施例1的生物标志组成物的相应信息使该设备执行对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂敏感性的预测步骤，具体执行如实施例2中的预测步骤。
相应的，本发明还公开了一种计算机可读存储介质，计算机可读存储介质上存储有计算机程序，计算机程序能被处理器执行以基于实施例1的生物标志组成物的相应信息实现对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂敏感性的预测步骤，预测步骤为实施例3中的预测步骤。
另外，根据各个实施例可以看出，本发明提供的上述生物标志组成物，还具有这样的用途：在制备用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的产品中的用途。其中该产品可以是例如上述的用来检测该生物标志组成物的试剂盒、利用该生物标志物的检测结果进行另外，根据各个实施例可以看出，本发明提供的上述生物标志组成物，还具有这样的用途预测的各种设备、系统或计算机可读存储介质。

Claims (22)

1.一种生物标志组成物，用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，其特征在于，至少包括：
微卫星状态以及B2M基因的突变状态，
其中，所述B2M基因的突变状态包括如表3所示的8个突变位点中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的生物标志组成物，其特征在于：
其中，所述突变位点为能导致氨基酸为L15Ffs*41和V69Wfs*34改变的突变位点。
3.根据权利要求1所述的生物标志组成物，其特征在于，还包括：
B2M蛋白。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的生物标志组成物，其特征在于，还包括：
POLE基因的突变状态。
5.根据权利要求4所述的生物标志组成物，其特征在于：
其中，所述POLE基因的突变状态包括位于外显子9-14中任意一个或多个的突变位点。
6.根据权利要求5所述的生物标志组成物，其特征在于：
其中，所述POLE基因的突变状态包括位于外显子9-14中能导致对象的TMB>100muts/Mb的任意一个或多个突变位点。
7.根据权利要求5所述的生物标志组成物，其特征在于：
其中，所述微卫星状态、B2M基因的突变状态以及POLE基因的突变状态根据对来自所述对象的组织样本测序得到的测序结果中找出的变异信息得到，
所述变异信息包括根据突变判断规则判断为真的点突变和判断为真的插入缺失突变，
所述判断规则为：
对于点突变，当满足下述第一条件时，判断该点突变为真：
该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次，包含该点突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该点突变相对应的碱基质量值>21，包含有该点突变的读长的条数≥5条，包含有该点突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，质量合格的组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；
当插入缺失突变的序列连续相同的碱基<5时，满足下述第二条件时，判断该插入缺失突变为真：
该插入缺失突变所在位置的测序覆盖深度>600次，包含该插入缺失突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21，包含有该插入缺失突变的读长的条数≥5条，包含有该插入缺失突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，所述组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；
当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥5且<7时，除了满足所述第二条件，且变异等位基因频率≥10％时，才判断该插入缺失突变为真；
当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥7时，除了满足所述第二条件，且变异等位基因频率≥20％时，才判断该插入缺失突变为真。
8.根据权利要求1所述的生物标志组成物，其特征在于：
其中，免疫检查点抑制剂为派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、Avelumab以及Durvalumab中的任意一种或多种。
9.一种生物标志组成物在制备用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的产品中的用途，其特征在于：
其中，所述生物标志组成物为权利要求1-8任意一项所述的生物标志组成物。
10.一种用于免疫检查点抑制剂敏感性预测的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒用于检测用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性的生物标志组成物，
其中，所述生物标志组成物为权利要求1-8任意一项所述的生物标志组成物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，包括：
用于对ACTIN基因进行扩增来判断来自所述对象的组织样本质量是否合格的引物，
所述引物包括引物F、R1和R2，各个引物的核苷酸序列分别为：
F，5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’；
R1，5’-CACGCTCGGTGAGGATCTTC-3’；
R2，5’-TCGAAGTCCAGGGCAACATAGC-3’；
R3，5’-AAGGCTGGAAGAGCGCCTCGGG-3’。
12.一种免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，用于预测结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，其特征在于，包括：
预测部，基于包括微卫星状态和B2M基因的突变状态的生物标志组成物的相应信息进行所述预测，
其中，所述生物标志组成物为权利要求1-8任意一项所述的生物标志组成物。
13.根据权利要求12所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，其特征在于：
当所述对象的所述微卫星状态为MSI-H，且存在所述B2M基因的突变位点时，所述预测部预测所述对象对所述免疫检查点抑制剂对所述免疫检查点抑制剂一级不敏感。
14.根据权利要求13所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，其特征在于：
所述生物标志组成物还包括B2M蛋白，
同时，所述对象的所述B2M蛋白的表达状态为不表达时，所述预测部预测所述对象对所述免疫检查点抑制剂二级不敏感。
15.根据权利要求12-14任意一项所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，其特征在于：
所述生物标志组成物还包括POLE基因的突变状态，
当所述对象的所述微卫星状态为非MSI-H，且同时存在所述POLE基因的突变时，预测所述对象对所述免疫检查点抑制剂一级敏感。
16.根据权利要求15所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，其特征在于：
当所述对象的所述微卫星状态为非MSI-H，同时存在所述POLE基因的突变，并且不存在所述B2M基因的突变时，预测所述对象对所述免疫检查点抑制剂二级敏感。
17.根据权利要求13所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，其特征在于：
其中，所述POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中任意一个或多个的突变位点。
18.根据权利要求17所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，其特征在于：
其中，所述POLE基因的突变位点包括位于外显子9-14中能导致对象的TMB>100muts/Mb的任意一个或多个的突变位点。
19.一种免疫检查点抑制剂敏感性系统，其特征在于，包括：
相关信息获得设备，用于获得生物标志组成物的相关信息，
免疫检查点抑制剂敏感性预测设备，基于包括所述相关信息的所述生物标志组成物的相应信息预测所述对象对免疫检查点抑制剂的敏感性，
其中，所述免疫检查点抑制剂敏感性预测设备为权利要求12-18任意一项所述的免疫检查点抑制剂敏感性预测设备。
20.根据权利要求19所述的免疫检查点抑制剂敏感性系统，其特征在于：
其中，所述相关信息获得设备根据对来自所述对象的组织样本测序得到的测序结果中找出的变异信息得到所述相关信息，
所述变异信息包括根据突变判断规则判断为真的点突变和判断为真的插入缺失突变，
所述判断规则为：
对于点突变，当满足下述第一条件时，判断该点突变为真：
该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次，包含该点突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该点突变相对应的碱基质量值>21，包含有该点突变的读长的条数≥5条，包含有该点突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，质量合格的组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；
当插入缺失突变的序列连续相同的碱基<5时，满足下述第二条件时，判断该插入缺失突变为真：
该插入缺失突变所在位置的测序覆盖深度>600次，包含该插入缺失突变的每个读长质量值>40，包含该点突变的每个读长上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21，包含有该插入缺失突变的读长的条数≥5条，包含有该插入缺失突变的所有读长中正向的读长与反向的读长比例<1/6，所述组织样本的变异等位基因频率/对照样本的变异等位基因频率≥20；
当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥5且<7时，除了满足所述第二条件，且变异等位基因频率≥10％时，才判断该插入缺失突变为真；
当插入缺失突变的序列连续相同的碱基≥7时，除了满足所述第二条件，且变异等位基因频率≥20％时，才判断该插入缺失突变为真。
21.一种免疫检查点抑制剂敏感性的设备，其特征在于，包括：
用于存储计算机程序指令的存储器；以及
用于执行计算机程序指令的处理器，
其中，当该计算机程序指令被该处理器执行时，基于包括微卫星状态和B2M基因的突变状态组成的生物标志组成物的相应信息使该设备执行对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂敏感性的预测步骤，
其中，所述生物标志组成物为权利要求1-8任意一项所述的生物标志组成物。
22.一种计算机可读介质，其特征在于：
所述计算机可读介质存储有计算机程序，
其中，所述计算机程序能被处理器执行以基于包括微卫星状态和B2M基因的突变状态组成的生物标志组成物的相应信息实现对结直肠癌的对象对免疫检查点抑制剂敏感性的预测步骤，
其中，所述生物标志组成物为权利要求1-8任意一项所述的生物标志组成物。
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