KR102275752B1 - 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭에 의해 수득된 dna 서열의 라이브러리의 게놈 무결성 및/또는 품질을 측정하기 위한 방법 및 키트 - Google Patents
결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭에 의해 수득된 dna 서열의 라이브러리의 게놈 무결성 및/또는 품질을 측정하기 위한 방법 및 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (a) DNA 서열의 라이브러리를 제공하는 단계; (b) 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 각기 제1, 제2 및 제3 염색체 팔 상에 위치하는 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 각각 하이브리드화하는, 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍, 하나의 제2 프라이머 쌍 및 하나의 제3 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 의해 DNA 서열의 라이브러리를 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭 단계가 각각 50 bp 내지 1000 bp인 각기 서로 다른 크기를 갖는 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물을 생성하는 것인 단계; (c) 상기 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물을 검출하는 단계; 및 (d) 상기 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물의 존재를 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리 품질과 연관시키는 단계를 포함하는, 샘플의 게놈 무결성 및/또는 상기 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 샘플, 특히 단일 세포의 게놈 무결성 (integrity) 및/또는 상기 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (deterministic restriction site whole genome amplification; DRS-WGA)에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
현재의 최신 기술
전체 게놈 증폭 (Whole Genome Amplification: WGA)으로 암환자의 단일 혈중 순환 종양 세포 (CTC)의 경우 또는 착상전 진단 (preimplantation diagnostics)에서와 같은 제한된 출발 물질의 DNA에 있어서의 체세포 돌연변이 및 복제 변형을 검출할 수 있다.
단일 세포 분석을 위한 WGA의 진단적 사용에 있어서, 관심 대상인 단일 세포 샘플의 게놈 DNA의 품질 (즉, 게놈 무결성)은 WGA 수행 후 성공적인 분자 검정에 있어서 주요한 역할을 한다.
특히, CTC는 사멸되는 경우가 빈번한 것으로 기술된 바 있다 [참조: Mehes, G., et al., Circulating breast cancer cells are frequently apoptotic. Am J Pathol, 2001. 159(1): p.17-20].
또한, 카스파제를 매개로 세포가 사멸되는 동안에는, 게놈 DNA가 180 bp 내지 200 bp 길이의 작은 조각들로 분절화된다 [참조: Wyllie, AH., Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature, 1980. 284(5756): p.555-6].
따라서, 세포 자체의 생물학적 상태와 연관될 수 있는 단일 세포의 게놈 무결성 상태를 평가하여 암환자의 전반적인 상태에 대한 임상적으로 관련된 정보를 제공하는 것은 중요하며, 이러한 정보는 단지 CTC를 계수함으로써 제공되는 정보를 넘어서서 이들 CTC의 분자적 특성을 보완할 수 있다.
게다가, DNA 가교결합 및/또는 분절화는 생검 후 필요한 샘플 보존을 위해 환자 유래의 세포 및 조직 상에 가한 화학적 처리 (예를 들어, 고정화)로 인해 발생한다.
이러한 샘플들로부터 생성된 데이터의 단일 세포 분석 및 평가를 위한 분자 검정의 이행을 예측하기 위해, 단일 세포의 게놈 무결성을 평가하는 것이 무엇보다 중요하다.
시판되는 단일 세포 WGA 키트는 WGA 생성물의 농도만을 측정함으로써 전체 게놈 증폭의 품질을 평가한다. 이러한 방법들을 위한 프로토콜이 단일 세포 DNA의 증폭 절차가 이루어지는 동안 적어도 하나의 무작위 단계를 포함하기 때문에, 투입 샘플 (일반적으로 단일 세포)의 게놈 무결성, 예컨대 세포 사멸 또는 세포 비사멸 상태를 평가하거나 WGA 생성물의 산출 품질, 예컨대 추가의 유전자 분석에 대한 적합성을 평가하기 위한 구체적인 검정들은 어렵다.
WGA의 한 종류는 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (이하, DRS-WGA로 지칭함)이다. EP1109938호에서 공지되고 실리콘 바이오시스템즈 에스피에이 (Silicon Biosystems Spa)에서 Ampli1™으로 시판되는 DRS-WGA는, MseI 부위 (TTAA)에서의 이중 가닥 DNA의 특정 제한 효소 절단 처리 및 증폭을 위한 범용 어댑터의 결찰에 기반한다.
DRS-WGA는 단일 세포 상에서 증폭하는 경우에 더 우수하며 (예를 들어: 문헌 [참조: Lee YS, et al.: Comparison of whole genome amplification methods for further quantitative anlaysis with microarray-based comparative genomic hybridization. Taiwan J Obstet Gynecol. 2008, 47(1): 32-41], 또한 고정제 처리로 인한 DNA 분해에 대해서도 더 강한 내성을 지니는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어: 문헌[참조: Stoecklein N.H. et al.: SCOMP is Superior to Degenerated Oligonucleotide Primed-PCR for Global amplification of Minute Amounts of DNA from Microdissected Archival Samples. American Journal of Pathology 2002, Vol. 161, No. 1]; [Arneson N. et al .: Comparison of Whole Genome Amplification methods for analysis of DNA extracted from microdissected early breast lesions in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. ISRN Oncol. 2012; 2012; 710692].
지금까지는 DRS-WGA 생성물로부터 투입 샘플에 대한 게놈 무결성 또는 수득된 DRS-WGA 생성물의 품질을 평가하기 위한 구체적인 검정이 존재하지 않았다.
따라서, 투입 샘플에 대한 게놈 무결성 및/또는 수득된 DRS-WGA 생성물의 품질을 측정하고, 단일 세포 분석 및 생성된 데이터의 평가에 있어서 DRS-WGA의 분자 검정 다운스트림의 성능을 예측할 수 있는 방법 및 키트에 대한 필요성이 대두되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DRS-WGA에 의해 수득된 DNA 서열의 품질을 측정하는 방법을 제공하고, 이로써 탄탄하고 믿을만한 결과를 제공하여 특히 샘플의 세포/세포들의 생물학적 상태를 평가할 수 있고/있거나 DRS-WGA의 분자 검정 다운스트림의 성능을 예측할 수 있다.
이러한 목적은 청구범위 제1항에 정의된 바와 같은 방법에 관한 본 발명에 의해 달성된다.
본 발명의 추가의 목적은 청구범위 제8항에 정의된 바와 같은 키트를 제공하는 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하고 있는 것과 같은 의미를 지닌다.
"샘플" 이라는 용어는 생물학적 독립체의 적어도 하나의 입자를 포함하는 샘플인 것으로 의도되고, 이때 상기 입자는 적어도 상기 생물학적 독립체의 게놈 또는 상기 게놈의 실질적인 하위 부류를 나타내는 DNA 서열을 포함한다. 비제한적인 예로서, 상기 독립체는 인간일 수 있고, 상기 적어도 하나의 입자는 5개 이하의 세포의 집합, 단일 세포, 또는 단일 세포 핵, 또는 반수체 생식 세포, 또는 염색체일 수 있다.
"게놈" 이라는 용어는 전체 게놈 또는 상기 게놈의 상기 실질적인 하위 부류인 것으로 의도된다.
게놈의 "무결성" 이라는 용어는 이중 가닥 절단, 또는 흠 (nick), 또는 상기 게놈의 복제 또는 그 통상적인 작용을 방해할 수 있는 이와 유사한 상황의 부재를 의미하는 것으로 의도된다.
DNA 서열의 라이브러리의 "품질" 이라는 용어는 비제한적인 예로서 점 돌연변이, 결실, 삽입, 복제수 변화의 존재와 같은 어떤 특성에 대해 유전자를 특징짓는데 사용되는 DNA 서열의 라이브러리의 적합성을 의미하는 것으로 의도된다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시양태에 따른 단일 마커 PCR, 및 4-다중 검정과 3-다중 검정에 대한 아가로스 겔 사진을 나타낸 것이고;
도 2는 PIK3CA 핫스팟 1과 핫스팟 2 상에서의 PCR의 아가로스 겔 사진 (M = 크기 마커, 01 = 유방13, 02 = 유방15, 03 = 유방17, 04 = 유방20, 05 = 전립선14, 06 = 전립선16, 07 = 전립선24, 08= 흑색종13 , 09 = 흑색종14 , 10 = 흑색종16)을 나타낸 것이며;
도 3은 도 1의 바람직한 4-다중 검정에 의해 시험된 8개의 샘플에 대한 아가로스 겔 사진을 나타낸 것이고;
도 4는 유방암 환자의 단일 혈중 순환 종양 세포 (CTC) 및 단일 백혈구 (WBC) 간의 게놈 무결성 지수 분포를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 PIK3CA 핫스팟 1과 핫스팟 2 상에서의 PCR의 아가로스 겔 사진 (M = 크기 마커, 01 = 유방13, 02 = 유방15, 03 = 유방17, 04 = 유방20, 05 = 전립선14, 06 = 전립선16, 07 = 전립선24, 08= 흑색종13 , 09 = 흑색종14 , 10 = 흑색종16)을 나타낸 것이며;
도 3은 도 1의 바람직한 4-다중 검정에 의해 시험된 8개의 샘플에 대한 아가로스 겔 사진을 나타낸 것이고;
도 4는 유방암 환자의 단일 혈중 순환 종양 세포 (CTC) 및 단일 백혈구 (WBC) 간의 게놈 무결성 지수 분포를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
샘플의 게놈 무결성 및/또는 상기 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (DRS-WGA)에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하기 위한 본 발명에 따른 방법은 단계 (a) 내지 (d)를 포함한다.
샘플의 게놈 무결성 및/또는 상기 샘플 내 게놈의 DRS-WGA에 의해 수득된 서열의 라이브러리의 품질을 측정하도록 함으로써, 상기 방법은 또한 샘플의 세포/세포들의 생물학적 상태를 평가할 수 있고/있거나 DNA 서열의 라이브러리에 대한 유전자 분석 검정의 성공률을 예측할 수 있게 해준다.
상기 샘플은 바람직하게는 5개 이하의 세포로 이루어지며, 보다 바람직하게는 샘플은 단일 세포이다. 상기 단일 세포는 바람직하게는 혈중 순환 종양 세포 (CTC), 혈중 순환 태아 세포, 혈중 순환 내피 세포 (CEC), 난모 세포, 난구 세포, 정자, 난할구, 또는 영양외배엽 세포이다.
단계 (a)에서, DNA 서열의 라이브러리를 제공한다.
단계 (b)에서, DNA 서열의 라이브러리를 1000 bp 내지 5000 bp, 바람직하게는 1000 bp 내지 2000 bp의 길이를 가지며 제1 염색체 팔 (arm) 상에 위치한 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍을 이용하는 PCR에 의해 증폭시키고, 상기 증폭 단계는 50 bp 내지 1000 bp의 제1 PCR 생성물을 생성한다.
바람직하게는, 제1 프라이머 쌍이 하이브리드화하는 라이브러리의 DNA 서열은 염색체 5q의 D5S2117 영역을 망라한다.
보다 바람직하게는, 제1 프라이머 쌍의 정방향 프라이머는 서열번호 4이고, 제1 프라이머 쌍의 역방향 프라이머는 서열번호 3이다.
단계 (c)에서, 제1 PCR 생성물을 검출한다. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 생성물을 분리하여 검출할 수 있으나, 당업계에 공지된 다른 방법들도 사용할 수 있다.
단계 (d)에서, 제1 PCR 생성물의 존재는 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리의 품질과 상관 관계가 있다.
유리하게는, 단계 (b)에서, 1000 bp 내지 5000 bp, 보다 바람직하게는 1000 bp 내지 2000 bp의 길이를 가지며 제1 염색체 팔이 아닌 제2 염색체 팔 상에 위치한 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하고, 상기 증폭 단계는 제1 PCR 생성물과는 다른 크기를 갖는 50 bp 내지 1000 bp의 제2 PCR 생성물을 생성한다.
제2 PCR 생성물도 단계 (c)에서 검출하며, 단계 (d)에서, 제2 PCR 생성물의 존재도 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리의 품질과 상관 관계가 있다.
바람직하게는, 제2 프라이머 쌍이 하이브리드화하는 라이브러리의 DNA 서열은 TRP53 유전자의 엑손 2와 3을 포함한다.
보다 바람직하게는, 제2 프라이머 쌍의 정방향 프라이머는 서열번호 6이고, 제2 프라이머 쌍의 역방향 프라이머는 서열번호 5이다.
유리하게는, 단계 (b)에서, 1000 bp 내지 5000 bp, 보다 바람직하게는 1000 bp 내지 2000 bp의 길이를 가지며 제1 및 제2 염색체 팔이 아닌 제3 염색체 팔 상에 위치한 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제3 프라이머 쌍을 사용하고, 상기 증폭 단계는 제1 및 제2 PCR 생성물과는 다른 크기를 갖는 50 bp 내지 1000 bp의 제3 PCR 생성물을 생성한다.
제3 PCR 생성물도 단계 (c)에서 검출하며, 단계 (d)에서, 제3 PCR 생성물의 존재도 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리의 품질과 상관 관계가 있다.
바람직하게는, 제3 프라이머 쌍이 하이브리드화하는 라이브러리의 DNA 서열은 KRT19 슈도유전자 1 (CK19로 축약하여 표시함)을 포함한다.
보다 바람직하게는, 제3 프라이머 쌍의 정방향 프라이머는 서열번호 8이고, 제3 프라이머 쌍의 역방향 프라이머는 서열번호 7이다.
보다 더 바람직하게는, 단계 (b)에서, 80 bp 내지 300 bp의 길이를 갖는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍을 사용하는데, 상기 증폭 단계는 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물과는 다른 크기를 갖는 50 bp 내지 200 bp의 제4 PCR 생성물을 생성한다.
단계 (b)에서 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍을 사용하는 경우, 상기 제4 PCR 생성물도 단계 (c)에서 검출하며, 단계 (d)에서, 제4 PCR 생성물의 존재도 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리의 품질과 상관 관계가 있다.
바람직하게는, 제4 프라이머 쌍이 하이브리드화하는 라이브러리의 DNA 서열은 KRAS 유전자의 코돈 12 및 13을 포함한다.
보다 더 바람직하게는, 제4 프라이머 쌍의 정방향 프라이머는 서열번호 17이고, 제4 프라이머 쌍의 역방향 프라이머는 서열번호 18이다.
본 발명에 따르면,
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 제1 염색체 팔 상에 위치한 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍,
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 제1 염색체 팔이 아닌 제2 염색체 팔 상에 위치한 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍, 및
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 제1 및 제2 염색체 팔이 아닌 제3 염색체 팔 상에 위치한 게놈의 서열에 상응하는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제3 프라이머 쌍
을 포함하고, 상기 제1, 제2 및 제3 프라이머 쌍은 PCR에 의해 증폭될 때 서로 다른 크기의 PCR 생성물을 생성하는 것인, 샘플의 게놈 무결성 및/또는 상기 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (DRS-WGA)에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하기 위한 키트를 또한 제공한다.
바람직하게는, 상기 키트는 80 bp 내지 300 bp의 길이를 갖는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍을 추가로 포함하고, 이때 제1, 제2, 제3 및 제4 프라이머 쌍은 PCR에 의해 증폭될 때 서로 다른 크기의 PCR 생성물을 생성한다.
보다 바람직하게는, 상기 키트는 제1, 제2, 제3 및 제4 프라이머 쌍을 포함한다.
상기 키트는 DRS-WGA에 의한 단일 세포 게놈 DNA의 증폭 이후에 유전자 분석 검정의 성공을 예측하는데 사용된다. 바람직하게는 유전자 분석 검정은 돌연변이 분석을 위한 생어 (Sanger) 서열분석법, 특이적인 복제수 변화 평가, 유전자 증폭을 위한 정량적 PCR, 중기 비교 유전체 보합법 (CGH), 또는 어레이 비교 유전체 보합법이다.
돌연변이 분석을 위한 생어 서열분석법과 같은 유전자 특이적 검정에서는, 4개의 PCR 생성물 중 적어도 1-2개를 갖는 샘플을 사용할 수 있다. 4개의 PCR 생성물 중 3개 이상에서 양성 결과가 나오는 것은 중기 CGH를 이용한 전장 게놈 분석의 성공을 의미하는 것이다. 어레이 CGH에서는, 4개의 양성 PCR 생성물 중에서 4개를 갖는 샘플을 사용하는 것이 좋다.
또한, 상기 키트를 샘플의 게놈 무결성을 측정하는데에도 사용함으로써 상기 샘플의 세포/세포들의 생물학적 상태를 측정할 수 있다. 샘플은 바람직하게는 5개 이하의 세포로 이루어지며, 보다 바람직하게는 샘플은 단일 세포이다.
사실상, 샘플 내에 다수의 세포들이 존재하는 경우에는, 샘플 세포의 DNA가 크게 분절화된 경우라 하더라도 제1, 제2, 제3 (및 경우에 따라 제4) PCR 생성물을 각각 증폭시키기 위한 제1, 제2, 제3 (및 경우에 따라 제4) 프라이머 쌍에 대해 전반적으로 충분한 주형 복제물이 존재할 것이다. 결과적으로 상기 방법은 변별력을 상실하게 된다.
반면에, 매우 손상된 DNA 세포 샘플의 경우에서조차도, 5개의 세포는 상기 방법에 신뢰할 만한 결과를 주는 양, 즉 초과량의 주형 복제물이 생성되지 않으면서 단계 (d)의 PCR 생성물을 수득하게 해주는 양인 것으로 실험적으로 측정된 바 있다.
또한, 매우 손상된 DNA 세포 샘플 (증폭하지 않고 PCR 생성물을 생성할 수 있는 단일 세포)의 분석에 있어서는, 하나 이상인 다수의 세포, 즉 2개 내지 5개의 세포를 이용하여 게놈 무결성을 정량함으로써 상기 방법의 해상도를 높일 수 있다.
실시예
요약하면, 서로 다른 염색체 위치상에 자리하며 다양한 단편 길이를 갖는 MseI 단편에 대해 디자인된 수개의 프라이머 쌍을 시험하였다. 높은 특이성과 민감성을 갖는 단일 세포 생성물의 성공적인 전체 게놈 분석을 예측하는 3개의 프라이머 쌍을 선택하였다 (실시예 1). 더 짧은 MseI 단편에 대한 제4 프라이머 쌍을 추가하여 낮은 품질의 세포, 예컨대 세포 사멸 CTC의 성공적인 DRS-WGA를 보여주었다 (실시예 2). 실시예에서, PCR 생성물을 "마커"로 칭하기도 하며, 수개의 프라이머 쌍을 포함하는 PCR 증폭 반응을 "다중 검정"이라 칭하기도 한다. 특히, 샘플의 게놈 무결성 및/또는 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (DRS-WGA)에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하기 위해 디자인된 수개의 프라이머 쌍을 포함하는 PCR 증폭 반응을 "품질 관리 검정" 또는 "QC 검정"이라 일컫기도 한다.
실시예
1
2개의 대안적인 마커 조합이 암세포 샘플 및 정상적인 핵형을 갖는 2배체 세포의 샘플 모두에 대해 DRS-WGA (해상도 10-20 Mb)를 이용한 단일 세포 게놈 DNA의 증폭 후 중기 비교 유전체 보합법 (CGH)의 성공을 예측하는 것으로 나타났다.
A. 8개의
시험된
PCR
마커의
특성
239-1936 bp의 MseI 단편 길이를 포함하는 8개의 서로 다른 MseI-단편들에 대한 PCR을 시험하였다 (표 1). 단일 암세포 내에서의 게놈 DNA 손상으로 인한 부정적인 검정 결과의 가능성을 최소화하기 위해 7개의 서로 다른 염색체 팔들 상에 위치한 서열을 선택하였다.
파이펫팅 설계 1.0 ㎕ 버퍼 + dNTP
(1×) [10mM MgCl, 100mM Tris (pH 8.5),
500 mM KCl, 1mM dNTP]
0.5 ㎕ 프라이머 3' (8 μΜ)
0.5 ㎕ 프라이머 5' (8 μΜ)
0.25 ㎕ BSA (분자생물학용)
7.25 ㎕ PCR-H20
0.1 ㎕ Taq 폴리머라아제 (5U/㎕)
0.5 ㎕ Ampli1 생성물 (시험 샘플)
열적 프로파일
단계 1 94.0℃ 2분
단계 2 어닐링 온도 30초
단계 3 72.0℃ 2분
단계 4 94.0℃ 15초
단계 5 어닐링 온도 30초
단계 6 72.0℃ 20초
14번의 추가의 사이클 (단계 4-6)
단계 7 94.0℃ 15초
단계 8 어닐링 온도 30초
단계 9 72.0℃ 30초
24번의 추가의 사이클 (단계 7-9)
단계 10 72.0℃ 2 분
단계 11 4℃ 오랜 시간 계속
* 이 프라이머 쌍은 미소부수체 (microsatellite) 서열을 증폭시킨다. 따라서, 실제 단편 길이는 한 환자에 있어서의 대립유전자들 간과 서로 다른 환자들 간에 있어서 조금씩 다를 수 있다.
B.
QC
검정을 위한
PCR
마커의
선택
PCR 마커에 대한 가능한 최선의 조합을 선택하기 위하여, 서로 다른 유형의 인간의 암 [24개의 유방 파종성 암세포 (DCC), 24개의 전립선 DCC, 24개의 흑색종 DCC]으로부터 72개의 단일 세포 게놈들을 재증폭시켰다. 상기 각 세 그룹에 있어서, 상기 CGH 실험에서 성공적인 중기 하이브리드화법을 유도한 12개의 세포와 상기 CGH 실험에서 실패한 중기 하이브리드화법을 유도한 12개의 세포를 포함시켰다. 선택된 모든 마커들에 대한 특이적 PCR을 수행하고, 중기 CGH의 결과를 예측함에 있어서 정확도에 대해 검정 평가하였다.
단일 마커로서, 긴 MseI 단편인 D5S2117, TRP53-Ex2/3 및 KRT19 슈도유전자 1 (이하, CK19로도 칭함)에 대한 PCR은 성공적인 중기 CGH 및 실패한 CGH를 이용하여 증폭된 게놈들 간에 최상의 분리를 유도하였다. 이들 세 단편들의 검정은 중기 CGH의 성공을 예측하는데 있어서 높은 검정 정확도를 나타내었다. 가장 짧은 MseI 단편인 PHACTR2에 대한 PCR의 부가 수행은 72개의 DCC 게놈 군집에 있어서 검정 정확도를 조금 증가시켰다.
요약하면, Ampli1을 위한 QC 키트에 대해 2개의 대안적인 QC 검정을 개발하였다 (표 2).
대안 1 : 3개의 마커 (D5S2117, TRP53-Ex2/3 및 CK19)를 사용한 QC 검정.
대안 2 : 4개의 마커 (D5S2117, TRP53-EX2/3, CK19 및 PHACTR2)를 사용한 QC 검정.
가능하다면, 가장 품질이 좋으며, 선택된 모든 마커 (대안 검정 모두에 대해서 100% 특이성)에 대해 양성인 샘플들만을 사용해야 한다. 그러나, 품질 관리에 이러한 높은 기준을 적용하게 되면 이로 인한 높은 가음성 (false negative)률을 감수해야 한다 (7/36 = 19.4%). 가장 높은 품질 기준을 갖는 시험 샘플의 수가 한정된 경우, 2/3 또는 3/4 양성 PCR을 이용하여 DRS-WGA 증폭된 게놈은 여전히 중기 CGH에 대하여 높은 성공률을 예측하였다 (각 경우, 3개의 마커를 이용한 검정에 대해서는 특이성 0.94 및 4개의 마커를 이용한 검정에 대해서는 특이성 0.97).
C. 정상적인 핵형을 가진
2배체
세포 100개 세트에 대한
PCR
마커의
시험
QC 검정에 대한 PCR 마커의 세트를 추가로 시험하기 위해, 정상적인 핵형을 갖는 2배체 세포로부터 100개의 단일 세포 게놈을 재증폭시켰다. 모든 샘플들은 8개의 서로 다른 PCR 마커에 대해 시험하였다. 추가로, 중기 CGH 성공은 우수한 품질을 갖는 것으로 예측된 22개의 게놈과 나쁜 품질을 갖는 것으로 예측된 10개의 게놈에 대해 확인하였다. 검정 정확도에 대한 통계적 평가 결과를 표 3에 나타내었다.
D.
DRS
-
WGA
증폭된 샘플에 대한 선택된
QC
마커의
추가의 검증
B와 C에서 시험된 샘플들을 기존의 단일 세포 게놈의 바이오뱅크로부터 수취하였기 때문에, 이들은 관련 실헐심의 DRS-WGA 맞춤형 시약 (서로 다른 공급업체로부터 제공됨)을 사용하여 증폭하였다. Ampli1 키트 (실리콘 바이오시스템즈에서 제공됨)로 증폭된 샘플을 사용한 제안된 QC 검정의 성능을 검증하기 위해, 건강한 기증자의 단일 단핵 PBL과 세포군 (cell pool) 및 유방암 세포주 SKBR3의 단일 세포와 세포군을 단리하였다. QC 검정을 위해 B와 C에서 제안된 마커들을 사용하여 상기 증폭된 게놈의 품질을 예측하였다. 이후, 2배체 혈액 세포 및 SKBR3 세포에 있어 샘플 세트 (5개의 단일 세포, 1개의 세포군 및 1개의 Ampli1 음성 대조군)에 대한 중기 CGH 실험을 수행하여 QC 검정의 예측 정확도를 검증하였다.
SKBR: 10/11개의 단일 세포 및 양 세포군은 4/4 양성 밴드 마커 PCR을 나타내었고,
1/11개의 세포는 시험된 모든 마커들에 대해 음성이었으며,
시험된 모든 PCR에 있어서 음성 대조군은 깨끗하였다.
PBL: 11/11개의 단일 세포 및 양 세포군은 4/4 양성 밴드 마커 PCR을 나타내었으며,
시험된 모든 PCR에 있어서 음성 대조군은 깨끗하였다.
실시예
2
다른 다운스트림 분석법, 예를 들어, 특정 단편을 위한 생어 서열분석법은 단일 세포 DNA의 정량적 및 정성적으로 매우 높은 증폭에 의존하지 않기 때문에, 제4 단편을 포함시켰다. 이 서열의 성공적인 증폭만이 비슷한 MseI 단편들 (본원에서는 PIK3CA 핫스팟 1과 2)의 생어 서열분석법의 성공을 예측하는데 충분한지의 여부를 시험하기 위하여 실험을 수행하였다.
A. 4-다중 검정을 위한 프로토콜
이미 확립된 3-다중 검정과의 호환성을 지니기 위해, 빈번하게 돌연변이를 일으키는 코돈 12와 13을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 KRAS MseI 단편에 대하여 새로운 프라이머들을 디자인하였다. 이들 프라이머들은 다른 3개의 밴드 (D5S2117, CK19 및 TP53-엑손2/3, 도 1 참조)와 명백히 구별되는 91 bp 길이의 PCR 단편을 증폭시킨다.
프라이머 혼합물에 4 μΜ의 농도의 하기 KRAS 프라이머를 추가한 하기의 파이펫팅 설계 및 열적 프로파일을 사용하였다.
KRAS91bp-F ATAAGGCCTGCTGAAAATGAC (서열번호 17)
KRAS91bp-R CTGAATTAGCTGTATCGTCAAGG (서열번호 18)
파이펫팅 설계 1.0 ㎕ Ampli1™ PCR 반응 버퍼
(1×) (20mM MgCl2 포함)
0.2 ㎕ dNTP (10mM)
1.0 ㎕ 프라이머 혼합물
(8개의 프라이머, 각각 4 μΜ)
0.2 ㎕ BSA (20 mg/㎖)
6.5 ㎕ PCR-H20
0.1 ㎕ Ampli1™ Taq 폴리머라아제 (5U/㎕)
1.0 ㎕ Ampli1™ 생성물 (시험 샘플)
열적 프로파일
단계 1 95.0℃ 4분
단계 2 95.0℃ 30초
단계 3 58.0℃ 30초
단계 4 72.0℃ 90초
32번의 사이클 (단계 2-4)
단계 5 72.0℃ 7분
단계 6 4.0℃ 오랜 시간 계속
5 ㎕의 각 PCR 생성물을 1.2%의 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 표 4에 나타낸 것과 같이, 수득된 앰플리콘의 bp 길이를 예측한 것과 비교하여 결과를 확인하였다.
위에서 이미 주지한 바와 같이, 마커 B는 다형성 영역에 위치하고 있으므로, 상기 PCR 생성물은:
동형접합성일 수 있고, 상기 기술한 범위 (108-166) 내에 포함되는 bp의 하나의 밴드를 나타내며;
이형접합성일 수 있고, 상기 기술한 범위 (108-166) 내에 포함되는 bp의 서로 다른 2개의 밴드를 나타낸다.
도 3은 상기 개시된 4-다중 검정을 사용하는, 서로 다른 샘플로부터 수득된 PCR 생성물의 아가로스 겔 전기영동의 예를 나타낸 것이다.
예를 들어, 도 3에서 샘플 1은 3/4 양성 마커를 나타내고 있다. 마커 B의 이형접합성 또는 동형접합성 (1개 또는 2개의 밴드)은 마커 B에 대한 양성 특성의 평가에 있어서는 하나로 계수되어야 한다. 예를 들어, 샘플 2와 8은 4/4 양성 마커를 나타내고 있다.
B. 단일 단편
PCR
반응의 결과를 이용하는 4-다중 검정과 확립된 3-다중 검정의 비교
실시예 1의 3-다중 검정에 의해 이미 시험된 유방, 전립선 및 흑색종 DCC의 72개의 DRS-WGA 라이브러리를 선택하였다. 불행하게도 샘플 유방 01은 반응 튜브에서의 균열로 인해 손실되었다. 다른 71개의 모든 DRS-WGA 생성물을 KRAS 91bp 단일 PCR 및 신규한 4-다중 검정을 이용하여 추가로 시험하였다. 요약하면, 53/71개의 샘플이 단일 마커 PCR의 91bp에서 예측한 밴드를 나타내었고, 하나 (유방 24)를 제외한 나머지 모두가 4-다중 검정에서 동일한 밴드를 나타내었다. D5S2117, CK19 및 TP53-엑손2/3에 있어서 다른 밴드들도 모두 3-다중 검정에서와 동일한 샘플에서 검출되었다. 또한, 현재 사용되는 3-다중 검정에서 하나 이상의 밴드를 나타냈던 38개의 모든 샘플에서 KRAS 91bp 앰플리콘이 검출되었다. 추가로, D5S2117, CK19 및 TP53-엑손2/3에 대해서는 음성이지만 KRAS91bp에 대해서만은 양성인 15개의 샘플을 확인하였다. 마지막으로, 18개의 샘플들은 시험된 4개의 모든 앰플리콘에 대해 음성이었다.
C. 10개의 선택된 샘플들의
PIK3CA
서열분석
KRAS 91bp 앰플리콘만을 나타냈던 15개의 샘플들 중에서, PIK3CA 서열 분석을 위해 10개의 샘플을 선택하였다 (4개의 유방 DCC 샘플, 3개의 전립선 DCC 샘플 및 3개의 흑색종 DCC 샘플). 제조업자의 지침에 따라 Ampli1™ PIK3CA Seq 키트 (이탈리아 소재의 실리콘 바이오시스템즈)를 사용하여 HS1 및 HS2 단편에 대해 PIK3CA PCR을 수행하였다. PCR 후 모든 샘플들을 1.5%의 아가로스 겔 상에 로딩하고, 전기영동 후 앰플리콘을 시각화하였다. 4개의 DCC 샘플들 (전립선 DCC 16, 흑색종 DCC 13, 14 및 16) 중에서 HS1에 대해서, 그리고 5개의 DCC 샘플들 (전립선 DCC 14와 16, 흑색종 DCC 13, 14 및 16) 중에서 HS2에 대해서만 강한 밴드가 수득되었다. 추가로, 약하지만 가시적인 밴드가 2개의 추가 샘플 (유방 DCC 13, 전립선 DCC 24) 및 3개의 추가 샘플 (유방 DCC 13과 15, 전립선 DCC 24)에 대해서 각각 검출되었다 (도 2). 한 샘플 (흑색종 DCC 16)은 >1kb의 DNA 단편에 대해서 강한 얼룩을 나타내었는데, 이는 상기 샘플의 상기 모든 겔에 있어서도 보였다. 그러나, 모든 샘플에 대해 PCR 앰플리콘을 정제하여 서열을 분석하였다.
PIK3CA 돌연변이성 핫스팟에 대한 생어 서열분석으로, 샘플 흑색종 DCC 16을 비롯하여 겔 전기영동에서 강한 증폭을 나타내는 샘플들 (도 2 참조)에 있어서 매우 강하고 깨끗한 서열들을 유도하였다. 더 낮은 앰플리콘 농도를 갖는 대부분의 다른 샘플들은 높은 백그라운드 노이즈를 나타내었으나, 서열들은 HS1에 대한 2개의 추가 샘플 (유방 DCC 13, 전립선 DCC 24) 및 HS2에 대한 4개의 추가 샘플 (유방 DCC 13, 15와 20, 전립선 DCC 24)에 대해서 용이하게 편집될 수 있었다. 나머지 샘플들에 있어서, 완전한 서열 (HS1에 있어서는 유방 DCC 15, 17과 20, 전립선 DCC 14; HS2에 있어서는 유방 DCC 15)의 확실한 편집을 위해서는 백그라운드 신호가 너무 높았다.
셀서치(CellSearch)® (얀센 다이어그노스틱스 엘엘씨: Jannsen Diagnostics LLC)로 강화된 유방암 환자의 말초 혈액으로부터 DEP어레이™ (실리콘 바이오시스템즈 에스피에이)를 사용하여 수확한 CTC 및 백혈구 세포 (WBC)의 군집에 대하여, 본 발명에 따른 Ampli1™ WGA 생성물의 품질을 분석함으로써 게놈 무결성을 평가하였다. 다중 PCR 반응 후 검출된 qPCR 생성물의 수 (게놈 무결성 지수 또는 GII)는 도 4에 나타난 것과 같이, 강화 분류 및 Ampli1™ WGA의 동일한 절차를 거친 동일한 환자로부터 수집된 정상적인 WBC에 비하여 CTC에서 GII 수치가 더 현저히 낮게 나타나는 것으로 밝혀졌다.
설명하면, 0의 값을 갖는 GII는 제1, 제2, 제3 또는 제4 PCR 생성물 그 어느 것도 증폭되지 않은 상황에 해당되고, 1의 값을 갖는 GII는 제4 PCR 생성물만 증폭된 상황에 해당되며, 2의 값을 갖는 GII는 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물 중 하나와 제4 PCR 생성물이 증폭된 상황에 해당되고, 3의 값을 갖는 GII는 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물 중 2개와 제4 PCR 생성물이 증폭된 상황에 해당되며, 4의 값을 갖는 GII는 제1, 제2, 제3 및 제4 PCR 생성물이 증폭된 상황에 해당된다.
PIK3CA 엑손 9 및 엑손 20의 돌연변이 핫스팟에 대해 표적화된 생어 서열분석법, ERBB2 유전자의 증폭을 측정하는 맞춤형 PCR 검정 및 어레이 CGH의 성공률을 평가하기 위하여 GII를 추가로 사용하였다. 표 5는 그 결과의 개괄적으로 나타낸 것이다.
상기 실시예들은, 본 발명에 따른 방법으로 샘플의 게놈 무결성 및 상기 샘플 내 게놈의 DRS-WGA에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리 품질을 탄탄하고 신뢰할 만한 결과로 측정할 수 있고, 특히 분자 검정, 예컨대 중기 및 어레이 비교 유전체 보합법 (CGH), 생어 서열분석법 및 qPCR, DRS-WGA의 다운스트림의 성능을 예측할 수 있다는 점을 보여주고 있다.
본 발명의 방법 및 키트의 특징에 대한 분석으로부터, 결과적으로 나타나는 이점들은 명백하다.
특히, DRS-WGA는 MseI 부위 (TTAA)에서의 이중 가닥 DNA의 특정 제한 효소 절단 처리 및 증폭을 위한 하나의 범용 어댑터의 결찰에 기반하고 있기 때문에, WGA 라이브러리를 나타내는 증폭하는 동안에 생성된 모든 단편들은 원칙적으로는 공지되어 있다. 따라서, 단일 세포 WGA 라이브러리 중에서 > 1000 bp의 길이를 갖는 특정 MseI 단편을 확인함으로써, 단리된 세포의 DNA의 게놈 무결성을 측정할 수 있고, 이에 따라 서로 다른 종류의 성공적인 분자 검정에 있어서 샘플의 품질을 측정할 수 있다.
제1, 제2 및 제3 프라이머 쌍이, DNA 분절화의 경우에 더욱 증폭시키기 어려운 DRS-WGA DNA 절단 처리 효소인 MseI의 긴 앰플리콘에 해당하는 게놈의 표적 영역 내에서 특이적으로 선택되었기 때문에, 이들의 증폭은 주어진 샘플 상에서 DRS-WGA가 전반적으로 양호한 성공을 거두었다는 것을 시사하는 것이다.
또한, 제1, 제2 및 제3 프라이머 쌍이 서로 다른 염색체 팔들 상에서 디자인되었기 때문에, 상기 방법으로 샘플의 게놈 무결성 및/또는 게놈의 가장 광범위한 영역에 걸쳐 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 평가할 수 있다.
게다가, 제1, 제2, 제3 및 제4 PCR 생성물이 서로 다른 크기를 가지고 있기 때문에, 하나의 다중 반응에서 제1, 제2, 제3 및 제4 프라이머 쌍을 함께 사용하는 것이 가능하다.
더욱이, 제4 프라이머 쌍이 80 bp 내지 300 bp의 길이를 갖는 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하기 때문에, 낮은 품질의 세포, 예컨대 세포 사멸 CTC에 대해서도 DRS-WGA의 분자 검정 다운스트림의 성능을 예측하는 것이 가능하다. 실제로, 예를 들어 PIK3CA 엑손 9 (30%) 및 엑손 20 (34%)의 표적화 생어 서열분석법 또는 이 제4 PCR 생성물조차 증폭되지 않은 세포 및 적어도 이것이 증폭가능한 세포들의 Her2 CNV 분석을 위한 qPCR (25%)에 있어서는, 그 성공률이 대략 2배가 되므로 (각각 56%, 72%, 50%) 성능면에서 현저한 차이가 있는 것이다. 그렇지 않고 DRS-WGA의 긴 앰플리콘에 하이브리드화하는 3개의 프라이머 쌍만을 사용하는 경우에는, 두 군집은 구분될 수 없을 것이다.
마지막으로, 첨부되는 특허청구범위의 보호범위를 벗어나지 않으면서 본원에 개시되어 보여진 방법 및 키트에 대한 수정 및 변형을 가할 수 있다는 점은 명백하다.
특히, 상기 방법은 제1, 제2, 제3 및 가능하게는 제4 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 방해하지 않는 추가의 프라이머 쌍을 사용함으로써 다각화될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Silicon Biosystems S.p.A.
Fraunhofer-Gesellschaft zur Foerderung der angewandten Forschung e.V.
<120> METHOD AND KIT FOR DETERMINING THE GENOME INTEGRITY AND/OR THE QUALITY OF A LIBRARY
OF DNA SEQUENCES OBTAINED BY DETERMINISTIC RESTRICTION SITE WHOLE GENOME AMPLIFICATION
<130> IPA160692-IT
<150> EP 13195770.6
<151> 2013-12-04
<160> 18
<170> BiSSAP 1.0
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Claims (15)
- 샘플의 게놈 무결성 (integrity) 및/또는 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (deterministic restriction site whole genome amplification; DRS-WGA)에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하는 방법으로서,
(a) DNA 서열의 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) - 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 게놈의 염색체 5q의 D5S2117 영역을 포함하는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍,
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 게놈의 TRP53 유전자의 엑손 2 및 엑손 3을 포함하는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍, 및
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 게놈의 KRT19 슈도유전자 1을 포함하는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제3 프라이머 쌍
을 사용한 PCR에 의해 DNA 서열의 라이브러리를 증폭시키는 단계로서,
상기 증폭시키는 단계가 50 bp 내지 1000 bp의 제1 PCR 생성물, 제1 PCR 생성물과는 다른 크기를 갖는 50 bp 내지 1000 bp의 제2 PCR 생성물, 및 제1 및 제2 PCR 생성물과는 다른 크기를 갖는 50 bp 내지 1000 bp의 제3 PCR 생성물을 생성하는 것인 단계;
(c) 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물을 검출하는 단계; 및
(d) 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물의 존재를 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리의 품질과 연관시키는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍의 정방향 프라이머가 서열번호 4이고, 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍의 역방향 프라이머가 서열번호 3인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍의 정방향 프라이머가 서열번호 6이고, 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍의 역방향 프라이머가 서열번호 5인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제3 프라이머 쌍의 정방향 프라이머가 서열번호 8이고, 적어도 하나의 제3 프라이머 쌍의 역방향 프라이머가 서열번호 7인 것인, 방법.
- 제2항에 있어서,
- 단계 (b)가 80 bp 내지 300 bp의 길이를 갖는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍을 추가로 사용하고, 상기 증폭시키는 단계가 제1, 제2 및 제3 PCR 생성물과는 다른 크기를 갖는 50 bp 내지 200 bp의 제4 PCR 생성물을 생성하며;
- 단계 (c)가 제4 PCR 생성물을 검출하는 단계를 추가로 포함하고;
- 단계 (d)가 제4 PCR 생성물의 존재를 샘플의 게놈 무결성 및/또는 DNA 서열의 라이브러리의 품질과 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제5항에 있어서, 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍이 하이브리드화하는 라이브러리의 DNA 서열이 KRAS 유전자의 코돈 12 및 코돈 13을 포함하는 것인, 방법.
- 제6항에 있어서, 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍의 정방향 프라이머가 서열번호 17이고, 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍의 역방향 프라이머가 서열번호 18인 것인, 방법.
- 샘플의 게놈 무결성 및/또는 샘플 내 게놈의 결정적 제한 부위 전체 게놈 증폭 (deterministic restriction site whole genome amplification; DRS-WGA)에 의해 수득된 DNA 서열의 라이브러리의 품질을 측정하기 위한 키트로서,
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 게놈의 염색체 5q의 D5S2117 영역을 포함하는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍,
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 게놈의 TRP53 유전자의 엑손 2 및 엑손 3을 포함하는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍, 및
- 1000 bp 내지 5000 bp의 길이를 가지며 게놈의 KRT19 슈도유전자 1을 포함하는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제3 프라이머 쌍
을 포함하고,
제1, 제2 및 제3 프라이머 쌍은, PCR에 의해 증폭될 때, 서로 다른 크기의 PCR 생성물을 생성하는 것인, 키트. - 제8항에 있어서, 80 bp 내지 300 bp의 길이를 갖는, 라이브러리의 DNA 서열에 하이브리드화하는 적어도 하나의 제4 프라이머 쌍을 추가로 포함하며,
제1, 제2, 제3 및 제4 프라이머 쌍이 PCR에 의해 증폭될 때 서로 다른 크기의 PCR 생성물을 생성하는 것인, 키트. - 제8항에 있어서, DRS-WGA에 의해 단일 세포 게놈 DNA의 증폭 후 유전자 분석 검정의 성공을 예측하기 위한 것인, 키트.
- 제10항에 있어서, 상기 유전자 분석 검정이 돌연변이 분석을 위한 생어 (Sanger) 서열분석법, 특이적인 복제수 변화 평가, 유전자 증폭을 위한 정량적 PCR, 중기 (metaphase) 비교 유전체 보합법 (Comparative Genomic Hybridisation; CGH) 및 어레이 비교 유전체 보합법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 키트.
- 제8항에 있어서, 샘플의 게놈 무결성을 측정하는데 사용하기 위한 것인, 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 샘플이 5개 이하의 세포로 이루어진 것인, 키트.
- 제13항에 있어서, 상기 샘플이 단일 세포인 것인, 키트.
- 제13항에 있어서, 샘플의 게놈 무결성을 측정함으로써 샘플의 세포/세포들의 생물학적 상태를 측정할 수 있는 것인, 키트.
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