CN106030307B - 用于确定基因组完整性和/或通过确定性限制位点全基因组扩增获得的dna序列的文库质量的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定样品基因组的完整性和/或由样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增获得的DNA序列的文库的质量的方法，包括以下步骤：(a)提供DNA序列的文库：(b)使用至少一个第一引物对、一个第二引物对和一个第三引物对通过PCR扩增DNA序列的文库，引物对各自杂交至具有1000bp至5000bp长度并对应分别位于第一、第二和第三染色体臂上的基因组的序列的文库的DNA序列，扩增的步骤产生各自为50bp至1000bp并各自具有与其他不同的尺寸的第一、第二和第三PCR产物；(c)检测第一、第二和第三PCR产物；(d)将第一、第二和第三PCR产物的存在与样品的基因组的完整性和/或DNA序列的文库的质量相关联。

Description

用于确定基因组完整性和/或通过确定性限制位点全基因组 扩增获得的DNA序列的文库质量的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于确定样品，特别是单细胞的基因组完整性，和/或通过样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增(deterministic restriction site whole genomeamplification)(DRS-WGA)获得的DNA序列的文库质量的方法和试剂盒。
背景技术
全基因组扩增(WGA)允许在有限的初始材料的DNA中，如在癌症患者的单个循环肿瘤细胞(CTC)中或在植入前诊断中的情况下，探测体细胞突变和复制变化。
对于单细胞分析的WGA的诊断用途，感兴趣的单细胞样品的基因组DNA质量(即基因组完整性)对WGA之后的成功分子分析起重要的作用。
特别是，CTC已经被描述为是经常凋亡的(Mehes,G.,et al.,Circulating breastcancer cells are frequently apoptotic.Am J Pathol,2001.159(1):p.17-20)。
此外，在半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)介导的细胞凋亡过程中基因组DNA断裂为180bp至200bp长度的小块(Wyllie,AH.,Glucocorticoid-induced thymocyteapoptosis is associated with endogenous endonuclease activation.Nature,1980.284(5756):p.555-6)。
因此评估单细胞的基因组完整性状态是重要的，因为这可以关联到细胞本身的生物状态，并且给出关于癌症患者的总体状态的临床相关信息，这超过仅通过计数CTC所提供的信息并补充那些CTC的分子表征。
另外，伴随应用于源自患者的细胞和组织的化学处理(例如固定)(对于活组织检查之后需要的样品保藏)，会发生DNA交联和/或断裂(fragmentation)。
为了预测用于单细胞分析并评估源自这类样本得到的数据的分子检测的性能，评估单细胞的基因组完整性是最重要的。
可获得的单细胞WGA试剂盒通过仅测量WGA产物的浓度来评估全基因组扩增的质量。因为用于这些方法的实验方案(protocol)包括在单细胞DNA扩增程序过程中的至少一个随机步骤，用于评价输入样品(通常为单细胞)的基因组完整性如细胞凋亡或非细胞凋亡状态，或WGA产物的输出的质量，如用于进一步基因分析的适用性的特定检测是困难的。
具体种类的WGA是确定性限制位点全基因组扩增(以下称为DRS-WGA)。DRS-WGA由EP 1109938是已知的并且是由Silicon Biosystems Spa作为AmplilTM商业化的，是基于双链DNA在MseI位点(TTAA)的特异限制消化并连接用于扩增的通用适配子。
已经表明DRS-WGA对于单细胞的扩增是更佳的(例如，见：Lee YS,et al:Comparison of whole genome amplification methods for further quantitativeanalysis with microarray-based comparative genomic hybridization.Taiwan JObstet Gynecol.2008,47(1):32-41)并且由于固定处理对于DNA降解是更加耐受的(例如，见：Stoecklein N.H.et al:SCOMP is Superior to Degenerated OligonucleotidePrimed-PCR for Global Amplification of Minute Amounts of DNA fromMicrodissected Archival Samples.American Journal of Pathology 2002,Vol.161,No.1；Arneson N.et al.:Comparison of Whole Genome Amplification methods foranalysis of DNA extracted from microdissected early breast lesions informalin-fixed paraffin-embedded tissue.ISRN Oncol.2012；2012；710692)。
至今不存在评价来自DRS-WGA产物的输入样品的基因组完整性或获得的DRS-WGA产物的质量的特定检测。
因此需求是开发允许确定输入样品的基因组完整性和/或获得的DRS-WGA产物的质量，并且允许预测用于单细胞分析的DRS-WGA下游的分子检测的性能并评价得到的数据的方法和试剂盒。
发明内容
因此本发明的目的是提供用于确定样品的基因组的完整性和/或由DRS-WGA获得的DNA序列的文库质量的方法，其提供坚实且可靠的结果并特别允许评估样品的细胞/多个细胞的生物状态和/或预测DRS-WGA下游的分子检测的性能。
该目的通过本发明实现的，因为其涉及如权利要求1中所定义的方法。
本发明进一步的目的是提供如权利要求8中限定的试剂盒。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域内的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
术语“样品”，是指包含至少一种生物实体(biological entity)的微粒(particle)的样品，所述微粒至少包含代表基因组或该生物实体的基因组的基本子集(substantial subset)的DNA序列。作为非限制性实例，所述实体可以是人类、所述至少一种微粒可以是5个细胞或更少的、单细胞，或单细胞核，或单倍生殖细胞，或染色体的组。
术语“基因组”，是指整个基因组或所述基因组的基本子集。
术语基因组的“完整性”，是指不存在可以阻碍基因组的复制或其正常功能的DNA损伤如双链断裂，或缺口(nick)或类似的情况。
术语DNA序列文库的“质量”，是指有待用于遗传表征某些特征如，作为非限制性实例，点突变、缺失、插入、拷贝数变化的存在的DNA序列文库，的适用性。
附图说明
图1示出了根据本发明的优选实施方式的单标记PCR，和4重检测以及3重检测的琼脂糖凝胶图。
图2示出了在PIK3CA热点1和热点2上的PCR的琼脂糖凝胶图(M＝尺寸标记、01＝乳腺13、02＝乳腺15、03＝乳腺17、04＝乳腺20、05＝前列腺14、06＝前列腺16、07＝前列腺24、08＝黑色素瘤13、09＝黑色素瘤14、10＝黑色素瘤16)；
图3示出了由图1的优选的4重检测测试的8个样品的琼脂糖凝胶图。
图4示出了来自乳腺癌患者的单个循环肿瘤细胞(single Circulating TumorCell)(CTC)和单个白细胞(WBC)之间的基因组完整性指数的分布的柱状图。
具体实施方式
根据本发明的用于确定样品基因组的完整性和/或由样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增(DRS-WGA)获得的DNA序列的文库质量的方法包括步骤(a)至(d)。
通过允许确定样品的基因组的完整性和/或由样品的基因组的DRS-WGA获得的序列的文库质量，该方法还允许评估样品的细胞/多个细胞的生物状态和/或预测对DNA序列文库的基因分析检测的成功率。
样品优选地由5个细胞或更少组成，更优选地样品是单个细胞。该单个细胞优选地是循环肿瘤细胞(CTC)、循环胎儿细胞(circulating fetal cell)、循环内皮细胞(CEC)、卵母细胞、卵丘细胞、精子、卵裂球或滋养外胚层细胞。
在步骤(a)中，提供DNA序列的文库。
在步骤(b)中，使用至少一个第一引物对通过PCR扩增DNA序列的文库，该第一引物对杂交至具有1000bp至5000bp，优选1000bp至2000bp的长度并且对应位于第一染色体臂的基因组的序列的文库的DNA序列，该扩增的步骤产生50bp至1000bp的第一PCR产物。
优选地，第一引物对杂交的文库的DNA序列包含染色体5q的D5S2117区域。
更优选地，第一引物对的正向引物是SEQ ID NO:4并且第一引物对的反向引物是SEQ ID NO:3。
在步骤(c)中检测第一PCR产物。可以使用琼脂糖凝胶电泳以及本领域中其他已知的方法分离并检测PCR产物。
在步骤(d)中将第一PCR产物的存在与样品的基因组的完整性和/或DNA序列的文库质量相关联。
有利地，在步骤(b)中使用至少一个第二引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp，更优选1000bp至2000bp的长度并且对应位于第二染色体臂而非第一染色体臂的基因组的序列的文库的DNA序列，该扩增的步骤产生50bp至1000bp的第二PCR产物(具有不同于第一PCR产物的尺寸)。
也在步骤(c)中检测第二PCR产物并且在步骤(d)中也将第二PCR产物的存在与样品的基因组的完整性和/或DNA序列的文库质量相关联。
优选地，第二引物对杂交的文库的DNA序列包含TRP 53基因的外显子2和3。
更优选地，第二引物对的正向引物是SEQ ID NO:6并且第二引物对的反向引物是SEQ ID NO:5。
有利地，在步骤(b)中使用至少一个第三引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp，更优选1000bp至2000bp的长度并且对应位于第三染色体臂而非第一和第二染色体臂的基因组的序列的文库的DNA序列，该扩增的步骤产生50bp至1000bp第三PCR产物(具有不同于第一和第二PCR产物的尺寸)。
也在步骤(c)中检测第三PCR产物并且在步骤(d)中也将第三PCR产物的存在与样品的基因组的完整性和/或DNA序列的文库质量相关联。
优选地，第三引物对杂交的文库的DNA序列包含KRT19伪基因1(KRT19pseudo-gene1)(简略表示为CK19)。
更优选地，第三引物对的正向引物是SEQ ID NO:8并且第三引物对的反向引物是SEQ ID NO:7。
更加优选地，在步骤(b)中使用至少一个第四引物对，其杂交至具有80bp至300bp的长度的文库的DNA序列，该扩增的步骤产生50bp至200bp的第四PCR产物(具有不同于第一、第二和第三PCR产物的尺寸)。
当步骤(b)使用至少一个第四引物对时，也在步骤(c)中检测第四PCR产物并且在步骤(d)中也将第四PCR产物的存在与样品的基因组的完整性和/或DNA序列的文库的质量相关联。
优选地，第四引物对杂交的文库的DNA序列包含KRAS基因的密码子12和13。
更优选地，第四引物对的正向引物是SEQ ID NO:17并且第四引物对的反向引物是SEQ ID NO:18。
根据本发明，还提供用于确定样品基因组的完整性和/或通过样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增(DRS-WGA)获得的DNA序列的文库质量的试剂盒，包括：
-至少一个第一引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且对应位于第一染色体臂的基因组的序列的文库的DNA序列，
-至少一个第二引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且对应位于第二染色体臂而非第一染色体臂的基因组的序列的文库的DNA序列，
-至少一个第三引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且对应位于第三染色体臂而非第一和第二染色体臂的基因组的序列的文库的DNA序列，其中当通过PCR扩增时，第一、第二和第三引物对产生具有彼此不同尺寸的PCR产物。
优选地，试剂盒进一步包含至少一个第四引物对，其杂交至具有80bp至300bp的长度的文库的DNA序列，其中当通过PCR扩增时，第一、第二、第三和第四引物对产生具有彼此不同尺寸的PCR产物。
更优选地，试剂盒包含第一、第二、第三和第四引物对。
试剂盒可以用于预测在通过DRS-WGA扩增单细胞基因组DNA之后的基因分析检测的成功。优选地，基因分析检测是用于突变分析的Sanger测序、特定拷贝数变化的评估、用于基因扩增的定量PCR、中期比较基因组杂交(metaphase Comparative GenomicHybridisation)(CGH)或阵列比较基因组杂交(array Comparative GenomicHybridisation)(CGH)。
对于基因特异性检测，如用于突变分析的Sanger测序，可以使用4个PCR产物中的至少1-2个样品。4个PCR产物中的至少3个阳性是使用中期CGH的成功全基因组分析(genome-wide analysis)的预测。对于阵列CGH，建议使用具有4个中4个阳性PCR产物的样品。
还可以使用试剂盒以确定样品的基因组的完整性从而确定样品的单元/多个细胞的生物状态。样品优选地由5个细胞或更少组成，更优选地样品是单个细胞。
事实上，即使样品的细胞的DNA是高度断裂的，如果样品中存在大量的细胞，总体上会存在对于第一、第二、第三(和可选的第四)引物对的足够的模板拷贝以分别扩增第一、第二、第三(和可选的第四)PCR产物。结果是所述方法的区别能力的损失。
另一方面，已经实验确定，即使在非常受损的DNA细胞样品的情况下，5个细胞是用所述方法允许可靠的结果，即允许获得步骤(d)的PCR产物而它们不是过量的模板拷贝的结果的量。
此外，对于非常受损的DNA细胞样品的分析(对于其单个细胞可以导致PCR产物不会扩增)，使用大于一，即二至五的细胞数目使得可以量化基因组完整性从而增加所述方法的分辨能力。
实施例
简言之，测试在位于不同的染色体位置并且具有不同的片段长度的MseI片段上设计的一些引物对。选择以高特异性和灵敏度成功预测单细胞产物的全基因组分析的三种引物对(实施例1)。加入较短的MseI片段的第四引物对以表示低质量细胞，例如细胞凋亡的CTC的成功的DRS-WGA(实施例2)。在实施例中，PCR产物也称作“标记(marker)”并且包括一些引物对的PCR扩增反应也称作“多重检测(multiplex assay)”。具体地，包括设计成确定样品基因组的完整性和/或由样品基因组的确定性限制位点全基因组扩增(deterministicrestriction site whole genome amplification)(DRS-WGA)获得的DNA序列文库的质量的一些引物对的PCR扩增反应也称作“质量控制检测(quality control assay)”或“QC检测”。
实施例1
在癌细胞样品和具有正常核型(karyotype)的二倍体细胞(diploid cell)的样品上用DRS-WGA(分辩率10-20Mb)扩增单细胞基因组DNA之后，两种替代标记组合示出会预测成功地进行中期比较基因组杂交(metaphase comparative genomic hybridization)(CGH)。
A.8种测试的PCR标记的特性
测试在8种不同的MseI片段(其覆盖了239-1936bp的MseI片段长度)上的PCR(表1)。选择位于7种不同的染色体臂上的序列以最小化由于单个癌细胞中的基因组DNA损失导致的负检测结果的可能性。
热曲线
表1.测试QC检测以评定DRS-WGA质量的8种选定的PCR引物对的特征
*该引物对扩增微卫星序列。因此实际的片段长度可以在患者的等位基因之间和不同患者之间略微变化。
B.用于QC检测的PCR标记的选择
为了选择最佳可能的PCR标记的组合，将72个来自不同类型的人类癌症的单细胞基因组(24种乳腺扩散癌细胞(DCC)、24种前列腺DCC、24种黑色素瘤DCC)再扩增。对于三组中的每一种，包括12个在先前的CGH实验中导致成功的中期杂交的细胞和12个在先前的CGH实验中导致失败的中期杂交的细胞。对所有选择的标记进行特异性PCR并且对该检测评估预测中期CGH的结果的准确度。
作为单个标记，长Mse片段D5S2117、TRP53-Ex2/3和KRT19伪基因1(在下文中也称作CK19)上的PCR提供具有成功和失败的中期CGH的扩增的基因组之间最佳的分离。这三种片段的检测在预测成功地进行中期CGH上示出了较高的检测准确度。对最短的Mse片段PHACTR2添加PCR略微增加了72个DCC基因组的集合的检测准确度。
总之，开发了两种用于Amplil的QC试剂盒的替代QC检测(表2)。
替代1：使用3种标记(D5S2117、TRP53-Ex2/3和CK19)的QC检测。
替代2：使用4种标记(D5S2117、TRP53-Ex2/3、CK19和PHACTR2)的QC检测。
表2.两种用于QC检测的替代标记组合的检测准确度(72个DCC样品)
如可能，应仅使用具有最高质量并且对于所有选择的标记(对两种替代检测100％的特异性)为阳性的样品。然而，应用这种高标准的质量控制的权衡(trade-off)是较高的假阴性率(7/36＝19.4％)。如果限制具有最高质量标准的测试样品的数目，具有2/3或3/4阳性PCR的DRS-WGA扩增的基因组仍然会预测高成功率的中期CGH(对使用3种标记的检测和使用4种标记的检测特异性分别为0.94和0.97)。C.在100个具有正常核型的二倍体细胞的组上测试PCR标记
为了进一步测试用于QC检测的PCR标记的组，将100个来自具有正常核型的二倍体细胞的单细胞基因组再扩增。对所有样品测试8种不同的PCR标记。此外，对22种具有预测的良好质量的基因组和10种具有预测的不良质量的基因组检查中期CGH成功。检测准确度的统计评估的结果在表3中示出。
表3.两种用于Amplil QC试剂盒的替代标记组合的检测准确度(32种正常样品)
D.选择的QC标记在DRS-WGA扩增样品上的进一步验证
由于B和C中测试的样品取自现有的单细胞基因组的生物库，将它们用相关实验室的DRS-WGA定制试剂(由不同的供应商提供)扩增。为了用由Amplil试剂盒(如由SiliconBiosystems提供)扩增的样品验证提出的QC检测的性能，将健康供体的单个单核PBL和细胞群体(cell pool)与乳腺癌细胞系SKBR3的单个细胞和细胞群体分离。将在B和C中提出用于QC检测的标记用于预测扩增的基因组的质量。然后，对二倍体血细胞的样品的组(5个单细胞、1个细胞群体和1个Amplil阴性对照)和SKBR3细胞进行中期CGH实验以验证QC检测的预测准确度。
SKBR：10/11的单细胞和两个细胞群体示出了4/4的阳性带标记PCR
对于所有测试的标记1/11的细胞是阴性的
在所有测试的PCR中阴性对照纯净
PBL：11/11的单细胞和两个细胞群体示出了4/4的阳性带标记PCR
在所有测试的PCR中阴性对照纯净
实施例2
由于其他下游分析，例如特定片段的Sanger测序不依赖于单细胞DNA在定性和定量的非常高的扩增，包括第四片段。进行实验以测试仅该序列的成功扩增是否足以预测相当的Mse片段(此处PIK3CA热点1和2)的Sanger测序的成功。
A.4重检测的实验方案
为了与已经建立的3重检测具有相容性，针对包含编码密码子12和13的频繁突变的核苷酸的KRAS Mse片段设计新的引物。这些引物扩增可清楚地与另外三种带(D5S2117、CK19和TP53-外显子2/3，见图1)区分的91bp长度的PCR片段。
使用下列移液方案和热曲线，将以下KRAS引物以4μΜ的浓度加入引物混合物。
热曲线
将5μl的每种PCR产物加载在1.2％琼脂糖凝胶上。通过比较获得的扩增子bp长度与预期的长度来检查结果，如表4中所示。
表4
如上文已经指出的，标记B图在多态区域上，因此PCR产物可以是：
纯合的，并且示出包括在所描述的范围(108-166)中的bp的一个带；
杂合的，并且示出包括在所描述的范围(108-166)中的不同bp的两个带，
图3示出了通过使用以上公开的4重检测获得自不同样品的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的实例。
例如图3中的样品1显示3/4的阳性标记。在标记B的阳性的评估中标记B的杂合性或纯合性(一条或两条带)必须计数为一个。例如样品2和8显示4/4的阳性标记。
B.具有单片段PCR反应的结果的4重检测与已建立的3重检测的比较
选择已经通过实施例1的3重检测测试的乳腺、前列腺和黑色素瘤DCC的72个DRS-WGA文库。不幸的是样品乳腺01由于反应管中的裂口而失去。用KRAS91bp单PCR和新的4重检测另外测试所有其他的71种DRS-WGA产物。总起来说，53/71的样品在单标记PCR的91bp处示出了预期的带，并且除一个外(乳腺24)它们全部在4重检测中示出了相同带。相比用3重检测，在同样的样品中检测到针对D5S2117、CK19和TP53-外显子2/3的全部的其他的带。此外，在全部38个样品(在目前使用的3重检测中示出一个或多个带)中检测到KRAS 91bp扩增子。另外，确定15个样品对于D5S2117、CK19和TP53-外显子2/3是阴性而仅对于KRAS91bp是阳性的。最终18个样品对于全部四种测试的扩增子是阴性的。
C.十个选择的样品的PIK3CA测序
在仅示出了KRAS 91bp扩增子的15个样品中选择十个样品用于PIK3CA序列分析(4个乳腺DCC样品、3个前列腺DCC样品和3个黑色素瘤DCC样品)。使用AplilTM PIK3CA Seq Kit(Silicon Biosystems SpA，意大利)，根据制造商说明书对HS1和HS2片段进行PIK3CA PCR。在PCR之后将所有的样品加载在1.5％的琼脂糖凝胶上以及在电泳之后可视化扩增子。在四个DCC样品(前列腺DCC 16、黑色素瘤DCC 13、14和16)中仅对于HS1和在五个DCC样品(前列腺DCC 14和16、黑色素瘤DCC13、14和16)中仅对于HS2获得了较强的带。另外，分别地对于另外的两个(乳腺DCC 13、前列腺DCC 24)和三个样品(乳腺DCC 13和15、前列腺DCC 24)检测到较弱但可见的带(图2)。一个样品(黑色素瘤DCC16)示出了≥1kb的DNA片段的较强的模糊(smear)，其在该样品的所有先前的凝胶中也是可见的。尽管如此，对所有样品纯化PCR扩增子并测序。
对PIK3CA突变热点的Sanger测序结果是样品的非常强和纯净的序列，在凝胶电泳中示出较强的扩增(见图2)，包括样品黑色素瘤DCC 16。虽然可以容易地对HS1的两个另外的样品(乳腺DCC 13、前列腺DCC 24)和HS2的四个另外的样品(乳腺DCC 13、15和20、前列腺DCC 24)编辑序列，大部分其他的具有较低扩增子浓度的样品示出了较高的背景噪声。对于剩余的样品背景信号对于全序列(对于HS1的乳腺DCC 15、17和20、前列腺DCC 14；对于HS2的乳腺DCC 15)的安全编辑是过高的。
在用来自富含(Jannsen Diagnostics LLC)的乳腺癌患者外周血的用DEPArrayTM(Silicon Biosystems SpA)收获的CTC和白细胞(WBC)的集合体(collective)上，通过分析根据本发明的AmplilTM WGA产物的质量来评估基因组完整性(genomeintegrity)。如图4中所示，发现在多重PCR反应后检测的PCR产物的所得数值(基因组完整性指数或GII)相对于收集自经受相同的富集筛选和AmplilTM WGA过程的相同患者的正常WBC，是显著向CTC中GII的较低值偏斜的。
作为说明，具有0的值的GII对应其中第一、第二、第三或第四PCR产物均未被扩增的情况，具有1的值的GII对应其中仅第四PCR产物被扩增的情况，具有2的值的GII对应其中第一、第二和第三PCR产物中的一个和第四PCR产物被扩增的情况，具有3的值的GII对于其中第一、第二和第三PCR产物中的两个和第四PCR产物被扩增的情况，并且具有4的值的GII对于其中第一、第二、第三和第四PCR产物被扩增的情况。
将GII进一步用于评估对于PIK3CA外显子9和外显子20突变热点的靶向Sanger测序、用于确定ERBB2基因的扩增的定制qPCR检测，以及阵列CGH的成功率。表5示出了结果的概要。
表5
以上实施例示出根据本发明的方法允许以坚实且可靠的结果确定样品的基因组的完整性和由样品的基因组的DRS-WGA获得的DNA序列的文库的质量，并且具体地允许预测DRS-WGA下游的分子检测，如中期和阵列比较基因组杂交(CGH)、Sanger测序和qPCR的性能。
通过对本发明所述方法和试剂盒的特性的分析，所得到的优点是显而易见的。
具体地，由于DRS-WGA是基于双链DNA在MseI位点(TTAA)的特异限制消化和连接一个用于扩增的通用适配子的事实，原则上在扩增过程中生成的所有代表WGA文库的片段是已知的。因此，通过在单细胞WGA文库中识别具有>1000bp长度的特定MseI片段，可以测量分离的细胞的DNA的基因组完整性，从而确定用于不同种类成功的分子分析的样品的质量。
由于已经在对应DRS-WGA DNA消化酶的长扩增子的基因组的目标区域中具体地选定了第一、第二和第三引物对(在DNA断裂的情况下它们是更难以扩增的)，它们的扩增是在给定的样品上DRS-WGA的良好的总体成功的指示。
另外，由于第一、第二和第三引物对是设计在不同的染色体臂上的事实，所述方法允许评估样品的基因组的完整性和/或在基因组的最宽区域上获得的DNA序列的文库的质量。
另外，由于第一、第二、第三和第四PCR产物具有不同尺寸的事实，可以在多重反应中共同使用第一、第二、第三和第四引物对。
此外，由于第四引物对杂交至具有80bp至300bp长度的文库的DNA序列的事实，也可以对低质量的细胞，例如细胞凋亡的CTC预测DRS-WGA下游的分子检测的性能。事实上对于其即使该第四PCR产物不扩增的细胞在例如PIK3CA外显子9(30％)和外显子20(34％)的靶向Sanger测序或用于Her2CNV分析(25％)qPCR的成功率和对于其至少这是可扩增的那些细胞(对其成功率大约加倍(分别为56％、72％、50％))之间存在显著的性能差异，。当仅使用杂交至DRS-WGA的长扩增子的3种引物对时，这两种群体另外会是不能区分的。
最后，显而易见的是，可以做出本发明公开和所示的方法和试剂盒的修改和变体，而不会因为这偏离了所附权利要求的保护范围。
具体地，通过使用不干扰使用第一、第二、第三和可能的第四引物的PCR扩增的另外的引物对，所述方法可以是多重的(multiplex)。

Claims (15)

1.一种用于确定样品基因组的完整性和/或由样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增获得的DNA序列的文库的质量的方法，包括以下步骤：
(a)提供由所述样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增获得的所述DNA序列的文库：
(b)通过使用以下各项的PCR扩增所述DNA序列的文库：
-至少一个第一引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且包含所述基因组的染色体5q的D5S2117区域的文库的DNA序列，
-至少一个第二引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且包含所述基因组的TRP53基因的外显子2和3的文库的DNA序列，以及
-至少一个第三引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且包含所述基因组的KRT19伪基因1的文库的DNA序列，
所述扩增的步骤产生50bp至1000bp的第一PCR产物，具有与所述第一PCR产物不同尺寸的50bp至1000bp的第二PCR产物，以及具有与所述第一PCR产物和第二PCR产物不同尺寸的50bp至1000bp的第三PCR产物；
(c)检测所述第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物；
(d)将所述第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物的存在与所述样品的基因组的完整性和/或所述DNA序列的文库的质量相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个第一引物对的正向引物是SEQ IDNO:4并且所述至少一个第一引物对的反向引物是SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个第二引物对的正向引物是SEQ IDNO:6并且所述至少一个第二引物对的反向引物是SEQ ID NO:5。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个第三引物对的正向引物是SEQ IDNO:8并且所述至少一个第三引物对的反向引物是SEQ ID NO:7。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(b)进一步使用至少一个第四引物对，其杂交至具有80bp至300bp长度的文库的DNA序列，所述扩增的步骤产生具有与所述第一PCR产物、第二PCR产物和第三PCR产物不同尺寸的50bp至200bp的第四PCR产物；
-步骤(c)进一步包括检测所述第四PCR产物；
-步骤(d)进一步包括将所述第四PCR产物的存在与所述样品的基因组的完整性和/或所述DNA序列的文库的质量相关联。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述至少一个第四引物对杂交的所述文库的DNA序列包含KRAS基因的密码子12/13。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述至少一个第四引物对的正向引物是SEQ IDNO:17并且至少一个所述第四引物对的反向引物是SEQ ID NO:18。
8.一种用于确定样品基因组的完整性和/或由样品的基因组的确定性限制位点全基因组扩增获得的DNA序列的文库的质量的试剂盒，包括：
-至少一个第一引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp长度并且包含所述基因组的染色体5q的D5S2117区域的文库的DNA序列，
-至少一个第二引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且包含所述基因组的TRP53基因的外显子2和3的文库的DNA序列，以及
-至少一个第三引物对，其杂交至具有1000bp至5000bp的长度并且包含所述基因组的KRT19伪基因1的文库的DNA序列，
其中，当通过PCR扩增时，所述第一引物对、第二引物对和第三引物对产生具有彼此不同尺寸的PCR产物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，进一步包括至少一个第四引物对，其杂交至具有80bp至300bp长度的文库的DNA序列，
其中，当通过PCR扩增时，所述第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对产生具有彼此不同尺寸的PCR产物。
10.根据权利要求8所述的试剂盒在预测通过确定性限制位点全基因组扩增扩增单细胞基因组DNA之后的基因分析检测的成功性的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述基因分析检测选自由用于突变分析的Sanger测序、特定拷贝数变化的评定、用于基因扩增的定量PCR、中期比较基因组杂交和阵列比较基因组杂交组成的组。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，用于确定样品基因组的完整性。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述样品由5个或更少细胞组成。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述样品是单个细胞。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，确定所述样品基因组的完整性允许确定所述样品的一个细胞/多个细胞的生物状态。
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