JP6543253B2 - ゲノムの完全性及び/又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたdna配列のライブラリの質を判定する方法及びキット - Google Patents
ゲノムの完全性及び/又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたdna配列のライブラリの質を判定する方法及びキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6543253B2 JP6543253B2 JP2016536851A JP2016536851A JP6543253B2 JP 6543253 B2 JP6543253 B2 JP 6543253B2 JP 2016536851 A JP2016536851 A JP 2016536851A JP 2016536851 A JP2016536851 A JP 2016536851A JP 6543253 B2 JP6543253 B2 JP 6543253B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer pair
- library
- pcr product
- sample
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 title claims description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 62
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 16
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 claims description 13
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 claims description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 9
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 claims description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 3
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 16
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 13
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 11
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 9
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 8
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 8
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 8
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001094028 Homo sapiens Phosphatase and actin regulator 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100035266 Phosphatase and actin regulator 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 230000000970 DNA cross-linking effect Effects 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 210000003313 haploid nucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000026727 thymocyte apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000143 trophectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
- C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
- C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
- C12Q2545/101—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis with an internal standard/control
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
他に特に規定がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
1000bp〜5000bpの長さを有し、第1の染色体腕に位置する上記ゲノムの配列に対応する上記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第1のプライマー対と、
1000bp〜5000bpの長さを有し、上記第1の染色体腕以外の第2の染色体腕に位置する上記ゲノムの配列に対応する上記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のプライマー対と、
1000bp〜5000bpの長さを有し、上記第1の染色体腕及び上記第2の染色体腕以外の第3の染色体腕に位置する上記ゲノムの配列に対応する上記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第3のプライマー対と、
を備え、上記第1のプライマー対、上記第2のプライマー対、及び上記第3のプライマー対が、PCRによって増幅された場合に、互いに異なるサイズのPCR産物をもたらす、キットが提供される。
2つの選択的マーカー(alternative marker)の組合せは、癌細胞試料及び正常な核型を有する二倍体細胞の試料の両方に対するDRS−WGA(解析能(Resolution)10Mb〜20Mb)による単一細胞ゲノムDNAの増幅後の分裂中期比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)の成功を予測することを示した。
239bp〜1936bpのMseIフラグメント長に亘る8個の異なるMseIフラグメントに対するPCRを試験した(表1)。単一癌細胞におけるゲノムDNA喪失による陰性のアッセイ結果の可能性を最小化するため、7個の異なる染色体腕に位置する配列を選択した。
(10mM MgCl、
100mM Tris
(pH8.5)、500mM
KCl、1mM dNTP)
0.5μl プライマー3’(8μM)
0.5μl プライマー5’(8μM)
0.25μl BSA(分子生物学用)
7.25μl PCR−H2O
0.1μl Taqポリメラーゼ(5U/μl)
0.5μl Ampli1産物(試験試料)
工程1 94.0℃ 2分
工程2 アニーリング温度 30秒
工程3 72.0℃ 2分
工程4 94.0℃ 15秒
工程5 アニーリング温度 30秒
工程6 72.0℃ 20秒
14の追加サイクル(工程4〜6)
工程7 94.0℃ 15秒
工程8 アニーリング温度 30秒
工程9 72.0℃ 30秒
24の追加サイクル(工程7〜9)
工程10 72.0℃ 2分
工程11 4℃ 常時
PCRマーカーの実現し得る最良の組合せを選択するため、異なる種類のヒト癌に由来する72の単一細胞ゲノム(24の乳房の播種性癌細胞(DCC)、24の前立腺DCC、24の黒色腫DCC)を再度増幅した。上記3群の各々に対して、先のCGH実験において分裂中期ハイブリダイゼーションに成功した12の細胞、及び先のCGH実験において分裂中期ハイブリダイゼーションに失敗した12の細胞を含めた。選択した全てのマーカーに対して特異的PCRを行い、分裂中期CGHの結果の予測における精度について上記アッセイを評価した。
選択1:3つのマーカー(D5S2117、TRP53−Ex2/3、及びCK19)によるQCアッセイ
選択2:4つのマーカー(D5S2117、TRP53−Ex2/3、CK19、及びPHACTR2)によるQCアッセイ
QCアッセイに対するPCRマーカーセットを更に試験するため、正常な核型を有する二倍体細胞に由来する100の単一細胞ゲノムを再度増幅した。全ての試料を8つの異なるPCRマーカーについて試験した。さらに、予測された質の良好な22のゲノム、及び予測された質の良くない10のゲノムについて分裂中期CGHの成功を確認した。アッセイ精度の統計学的評価の結果を表3に示す。
B及びCで試験した試料は既存の単一細胞ゲノムの既存のバイオバンクから採取されたことから、それらの試料を関連する研究室のDRS−WGAに合わせた試薬(異なる供給元によって提供される)によって増幅した。Ampli1キット(Silicon Biosystemsによって供給される)によって増幅された試料を用いて提案されたQCアッセイの性能を確認するため、健康なドナーの単一の単核PBL及び細胞プール、並びに乳癌細胞株SKBR3の単一の細胞及び細胞プールを単離した。QCアッセイに対してB及びCで提案されたマーカーを使用して増幅したゲノムの質を予測した。その後、二倍体血液細胞、またSKBR3細胞について、一組の試料(5つの単一細胞、1つの細胞プール及び1つのAmpli1陰性対照)に対し分裂中期CGH実験を行い、QCアッセイの予測精度を確認した。
SKBR:10/11の単一細胞及び両細胞プールは4/4の陽性バンドマーカーPCRを示した。
1/11の細胞は試験した全てのマーカーについて陰性であった。
陰性対照は全ての試験したPCRにおいてクリーン(clean)。
PBL:11/11の単一細胞及び両細胞プールは4/4の陽性バンドマーカーPCRを示した。
陰性対照は全ての試験したPCRにおいてクリーン。
他の下流の解析、例えば特定のフラグメントに対するサンガーシークエンシングは単一細胞のDNAの定量的及び定性的に非常に高い増幅に依存しないため、第4のフラグメントを含めた。この配列の増幅の成功だけで同等のMseフラグメント(ここでは、PIK3CAのホットスポット1及びホットスポット2)のサンガーシークエンシングの成功を予測するのに十分であるかどうかを試験するため実験を行った。
既に確立された3マルチプレックスアッセイとの適合性を備えるため、コドン12及びコドン13をコードする頻繁に変異が導入されるヌクレオチドを包含するKRAS Mseフラグメントに対して新たなプライマーを設計した。これらのプライマーは、他の3つのバンド(D5S2117、CK19及びTP53−Exon2/3、図1を参照されたい)と明確に区別することができる91bp長のPCRフラグメントを増幅する。
KRAS91bp-F ATAAGGCCTGCTGAAAATGAC(配列番号17)
KRAS91bp-R CTGAATTAGCTGTATCGTCAAGG(配列番号18)
(20mM MgCl2を含む)
0.2μl dNTP(10mM)
1.0μl プライマーミックス
(8つのプライマー、各々4μM)
0.2μl BSA(20mg/ml)
6.5μl PCR−H2O
0.1μl Ampli1(商標)Taqポリメラーゼ
(5U/μl)
1.0μl Ampli1(商標)産物(試験試料)
工程1 95.0℃ 4分
工程2 95.0℃ 30秒
工程3 58.0℃ 30秒
工程4 72.0℃ 90秒
32のサイクル(工程2〜4)
工程5 72.0℃ 7分
工程6 4.0℃ 常時
ホモ接合の場合があり、記載される範囲(108〜166)に含まれるbpの1つのバンドを示し、
ヘテロ接合の場合があり、記載される範囲(108〜166)に含まれる異なるbpの2つのバンドを示す。
実施例1の3マルチプレックスアッセイによって既に試験された乳房、前立腺、及び黒色腫のDCCの72のDRS−WGAライブラリを選択した。残念ながら、乳房01の試料は反応チューブの亀裂により失われた。他の71のDRS−WGA産物を全てKRAS 91bpの単一PCR及び新たな4マルチプレックスアッセイにより更に試験した。要約すると、53/71の試料が単一マーカーPCRにおいて91bpに予想されたバンドを示し、1つ(乳房24)以外の全ての試料が4マルチプレックスアッセイにおいて同じバンドを示した。D5S2117、CK19、及びTP53−Exon2/3に対する他の全てのバンドが3マルチプレックスアッセイによるものと同じ試料において検出された。さらに、ここで使用された3マルチプレックスで1又は複数のバンドを示した38の全ての試料において、KRAS 91bpアンプリコンを検出した。さらに、15の試料が、D5S2117、CK19、及びTP53−Exon2/3に対して陰性であったが、KRAS 91bpのみに対して陽性であったと同定された。最後に、18の試料は試験した4つ全てのアンプリコンに対して陰性であった。
KRAS 91bpアンプリコンのみを示した15の試料のうち10の試料をPIK3CAシークエンシング解析に選択した(4の乳房DCC試料、3の前立腺DCC試料、及び3の黒色腫DCC試料)。Ampli1(商標) PIK3CA Seqキット(イタリアのSilicon Biosystems SpA)を使用し、製造業者の指示書に従ってHS1及びHS2のフラグメントに対してPIK3CAのPCRを行った。PCRの後、全ての試料を1.5%アガロースゲルに充填し、電気泳動の後アンプリコンを可視化した。4つのDCC試料(前立腺DCC16、黒色腫DCC13、14及び16)においてHS1に対してのみ、5つのDCC試料(前立腺DCC14及び16、黒色腫DCC13、14及び16)においてHS2に対してのみ強いバンドが得られた。また、更に2つの試料(乳房DCC13、前立腺DCC24)及び3つの試料(乳房DCC13及び15、前立腺DCC24)に対して、それぞれ弱いものの明らかなバンドが検出された(図2)。1つの試料(黒色腫DCC16)は、この試料の先の全てのゲルでも明らかであった1kb以上のDNAフラグメントに対する強いスメアを示した。しかしながら、全ての試料に対してPCRアンプリコンを精製し、配列決定をした。
Claims (15)
- 試料のゲノムの完全性及び/又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅(DRS−WGA)によって得られたDNA配列ライブラリの質を判定する方法であって、
(a)前記DNA配列ライブラリを提供する工程と、
(b)前記DNA配列のライブラリを、
1000bp〜5000bpの長さを有し、染色体5qのD5S2117領域を包含する前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第1のプライマー対、
1000bp〜5000bpの長さを有し、TRP53遺伝子のエクソン2及びエクソン3を包含する前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のプライマー対、及び、
1000bp〜5000bpの長さを有し、KRT19偽遺伝子1を包含する前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第3のプライマー対、
を使用するPCRによって増幅する工程であって、
該増幅工程が、50bp〜1000bpの第1のPCR産物、前記第1のPCR産物以外のサイズを有する50bp〜1000bpの第2のPCR産物、並びに前記第1のPCR産物及び第2のPCR産物以外のサイズを有する50bp〜1000bpの第3のPCR産物をもたらす工程と、
(c)前記第1のPCR産物、前記第2のPCR産物、及び前記第3のPCR産物を検出する工程と、
(d)前記第1のPCR産物、前記第2のPCR産物、及び前記第3のPCR産物の存在を、前記試料のゲノムの完全性及び/又はDNA配列のライブラリの質と関連付ける工程と、
を含む、方法。 - 前記少なくとも1つの第1のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号4であり、前記少なくとも1つの第1のプライマー対のリバースプライマーが配列番号3である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第2のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号6であり、前記少なくとも1つの第2のプライマー対のリバースプライマーが配列番号5である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第3のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号8であり、前記少なくとも1つの第3のプライマー対のリバースプライマーが配列番号7である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)にて、80bp〜300bpの長さを有する、前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第4のプライマー対を更に使用し、前記増幅工程が前記第1のPCR産物、前記第2のPCR産物、及び前記第3のPCR産物以外のサイズを有する50bp〜200bpの第4のPCR産物をもたらし、
工程(c)が前記第4のPCR産物を検出することを更に含み、
工程(d)が前記第4のPCR産物の存在を前記試料のゲノムの完全性及び/又は前記DNA配列のライブラリの質と関連付けることを更に含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの第4のプライマー対がハイブリダイズする前記ライブラリのDNA配列がKRAS遺伝子のコドン12及び13を包含する、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第4のプライマー対のフォワードプライマーが配列番号17であり、前記少なくとも1つの第1のプライマー対のリバースプライマーが配列番号18である、請求項6に記載の方法。
- 試料のゲノムの完全性及び/又は試料のゲノムの確定的制限酵素部位全ゲノム増幅(DRS−WGA)によって得られたDNA配列ライブラリの質の判定のために用いられるキットであって、
1000bp〜5000bpの長さを有し、染色体5qのD5S2117領域を包含する前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第1のプライマー対と、
1000bp〜5000bpの長さを有し、TRP53遺伝子のエクソン2及びエクソン3を包含する前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のプライマー対と、
1000bp〜5000bpの長さを有し、KRT19偽遺伝子1を包含する前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第3のプライマー対と、
を備え、前記第1のプライマー対、前記第2のプライマー対、及び前記第3のプライマー対が、PCRによって増幅された場合に、互いに異なるサイズのPCR産物をもたらす、キット。 - 前記キットは、80bp〜300bpの長さを有する、前記ライブラリのDNA配列にハイブリダイズする少なくとも1つの第4のプライマー対を更に備え、
前記第1のプライマー対、前記第2のプライマー対、前記第3のプライマー対、及び前記第4のプライマー対が、PCRによって増幅された場合に、互いに異なるサイズを有するPCR産物をもたらす、請求項8に記載のキット。 - DRS−WGAによる単一細胞のゲノムDNAの増幅後の遺伝子解析アッセイの成功の予測における請求項8又は9に記載のキットの使用。
- 前記遺伝子解析アッセイが、突然変異解析に対するサンガーシークエンシング、特定のコピー数の変化の判断、遺伝子増幅に対する定量的PCR、分裂中期比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)からなる群から選択される、請求項10に記載の使用。
- 試料のゲノムの完全性の判定のために用いられる請求項8又は9に記載のキット。
- 前記試料が5個以下の細胞からなる、請求項12に記載のキット。
- 前記試料が単一の細胞である、請求項13に記載のキット。
- 前記試料のゲノムの完全性の判定が、前記試料の細胞(単数/複数)の生物学的状態を判定することを可能とする、請求項13又は14に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13195770.6A EP2881739B1 (en) | 2013-12-04 | 2013-12-04 | Method and kit for determining the genome integrity and/or the quality of a library of dna sequences obtained by deterministic restriction site whole genome amplification |
EP13195770.6 | 2013-12-04 | ||
PCT/IB2014/066602 WO2015083121A1 (en) | 2013-12-04 | 2014-12-04 | Method and kit for determining the genome integrity and/or the quality of a library of dna sequences obtained by deterministic restriction site whole genome amplification |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016538872A JP2016538872A (ja) | 2016-12-15 |
JP6543253B2 true JP6543253B2 (ja) | 2019-07-10 |
Family
ID=49680939
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016536851A Active JP6543253B2 (ja) | 2013-12-04 | 2014-12-04 | ゲノムの完全性及び/又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたdna配列のライブラリの質を判定する方法及びキット |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10392657B2 (ja) |
EP (1) | EP2881739B1 (ja) |
JP (1) | JP6543253B2 (ja) |
KR (1) | KR102275752B1 (ja) |
CN (1) | CN106030307B (ja) |
CA (1) | CA2932524C (ja) |
DK (1) | DK2881739T3 (ja) |
ES (1) | ES2637385T3 (ja) |
PT (1) | PT2881739T (ja) |
WO (1) | WO2015083121A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ITTO20120962A1 (it) * | 2012-10-31 | 2014-05-01 | Silicon Biosystems Spa | Metodo e kit per rivelare una sequenza di dna bersaglio wild-type e/o mutata |
ITUA20162640A1 (it) | 2016-04-15 | 2017-10-15 | Menarini Silicon Biosystems Spa | Metodo e kit per la generazione di librerie di dna per sequenziamento massivo parallelo |
EP3431611A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-23 | Menarini Silicon Biosystems S.p.A. | Improved method and kit for the generation of dna libraries for massively parallel sequencing |
IT201900002777A1 (it) * | 2019-02-26 | 2020-08-26 | Menarini Silicon Biosystems Spa | Metodo e sistema microfluidico per l'isolamento di particelle |
CN112662748B (zh) * | 2019-10-15 | 2023-02-17 | 骏实生物科技(上海)有限公司 | 用于单细胞dna测序文库质量鉴定的引物对组合、方法和试剂盒 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL141749A0 (en) | 1998-09-18 | 2002-03-10 | Micromet Ag | Dna amplification of a single cell |
WO2009051842A2 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | The Johns Hopkins University | Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna |
JP2012517238A (ja) * | 2009-02-11 | 2012-08-02 | カリス エムピーアイ インコーポレイテッド | 腫瘍の分子プロファイリング法 |
CN102533960B (zh) * | 2010-12-31 | 2014-04-30 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种单细胞基因组分析方法及试剂盒 |
-
2013
- 2013-12-04 ES ES13195770.6T patent/ES2637385T3/es active Active
- 2013-12-04 EP EP13195770.6A patent/EP2881739B1/en active Active
- 2013-12-04 PT PT131957706T patent/PT2881739T/pt unknown
- 2013-12-04 DK DK13195770.6T patent/DK2881739T3/en active
-
2014
- 2014-12-04 US US15/101,299 patent/US10392657B2/en active Active
- 2014-12-04 CA CA2932524A patent/CA2932524C/en active Active
- 2014-12-04 KR KR1020167017659A patent/KR102275752B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-04 WO PCT/IB2014/066602 patent/WO2015083121A1/en active Application Filing
- 2014-12-04 JP JP2016536851A patent/JP6543253B2/ja active Active
- 2014-12-04 CN CN201480074845.3A patent/CN106030307B/zh active Active
-
2019
- 2019-06-27 US US16/455,470 patent/US20190316194A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK2881739T3 (en) | 2017-08-21 |
US20180187254A1 (en) | 2018-07-05 |
JP2016538872A (ja) | 2016-12-15 |
CA2932524C (en) | 2022-12-13 |
WO2015083121A1 (en) | 2015-06-11 |
EP2881739A1 (en) | 2015-06-10 |
US20190316194A1 (en) | 2019-10-17 |
US10392657B2 (en) | 2019-08-27 |
PT2881739T (pt) | 2017-08-11 |
KR20160115913A (ko) | 2016-10-06 |
EP2881739B1 (en) | 2017-05-17 |
ES2637385T3 (es) | 2017-10-13 |
CA2932524A1 (en) | 2015-06-11 |
CN106030307A (zh) | 2016-10-12 |
CN106030307B (zh) | 2018-06-01 |
KR102275752B1 (ko) | 2021-07-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210324468A1 (en) | Compositions and methods for screening mutations in thyroid cancer | |
US11015213B2 (en) | Method of preparing cell free nucleic acid molecules by in situ amplification | |
US20190316194A1 (en) | Method and kit for determining the genome integrity and/or the quality of a library of dna sequences obtained by deterministic restriction site whole genome amplification | |
KR20180100713A (ko) | 핵산 서열 불균형의 결정 | |
WO2016097120A1 (en) | Method for the prognosis of hepatocellular carcinoma | |
Stigt et al. | Pyrosequencing analysis of EGFR and KRAS mutations in EUS and EBUS-derived cytologic samples of adenocarcinomas of the lung | |
Moens et al. | HaloPlex targeted resequencing for mutation detection in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded tumor samples | |
WO2022157764A1 (en) | Non-invasive cancer detection based on dna methylation changes | |
US20090186360A1 (en) | Detection of GSTP1 hypermethylation in prostate cancer | |
JP7301848B2 (ja) | 癌関連変異を検出するためのキットおよび方法 | |
Kašubová et al. | Next Generation Sequencing in Molecular Diagnosis of Lynch Syndrome–a Pilot Study Using New Stratification Criteria | |
WO2018186687A1 (ko) | 생물학적 시료의 핵산 품질을 결정하는 방법 | |
US20090181397A1 (en) | Predictive and diagnostic methods for cancer | |
Walsh et al. | Molecular pathology in lung cancer: a guide to the techniques used in clinical practice | |
US20080213781A1 (en) | Methods of detecting methylation patterns within a CpG island | |
WO2008005559A2 (en) | A strategy for detecting low abundance mutations | |
Ip et al. | Molecular Techniques in the Diagnosis and Monitoring of Acute and Chronic Leukaemias | |
JP2016198027A (ja) | 卵巣癌の診断方法。 | |
JP2024537810A (ja) | マイクロサテライトマーカー | |
Bergfors | Evaluation of Microsatellite Instability Analysis as a Diagnostic Tool to Identify Lynch Syndrome in Endometrial Cancer Patients | |
Csernák et al. | Application of Targeted Next-generation Sequencing, TruSeq Custom Amplicon Assay for Molecular Pathology Diagnostics on Formalin-fixed and Paraffin-embedded Samples. | |
WO2023147445A2 (en) | Cell-free rna biomarkers for the detection of cancer or predisposition to cancer | |
EP4399329A1 (en) | Method of detecting and quantifying genomic and gene expression alterations using rna | |
CN113684266A (zh) | 用于单细胞全基因组dna扩增产物质量评价的核酸组合物及方法 | |
Rodriguez et al. | Special Techniques |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171024 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181002 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181228 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190521 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190614 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6543253 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |