KR20180009828A

KR20180009828A - 태아 특이적 후성유전학적 바이오마커 dscr3 및 이를 포함하는 자간전증 진단용 조성물

Info

Publication number: KR20180009828A
Application number: KR1020160091145A
Authority: KR
Inventors: 류현미; 박소연; 김신영; 김현진
Original assignee: 의료법인 제일의료재단
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2018-01-30
Also published as: KR101879497B1

Abstract

본 발명은 임신부 혈장 내의 태아 특이적인 후성유전학적 마커, DSCR3(GenBank Accession No.: NG_009410.1) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 자간전증 진단용 조성물, 진단용 키트 및 상기 DSCR3 유전자를 이용한 자간전증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, DSCR3 유전자의 농도 변화를 측정하는 단계를 포함하는 자간전증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

태아 특이적 후성유전학적 바이오마커 DSCR3 및 이를 포함하는 자간전증 진단용 조성물 {Fetal specific epigenetic marker DSCR3 and Compositions for diagnosis of preeclampsia comprising the same}

자간전증(Preeclampsia, PE)은 심각한 임신 합병증 중 하나로 임신 20주 이후 고혈압, 부종, 단백뇨가 동반되는 경우로 정의된다. 임신부가 자간전증을 나타내는 경우, 태반 및 태아로의 혈류 공급에 장애가 발생하여 태아의 성장부전이 발생하고, 심한 경우 태아 사망의 원인이 되기도 한다.

자간전증은 연간 전 세계적으로 적어도 200,000명의 임신부 사망의 원인이 되고 있다. 자간전증의 증상은 전형적으로 임신 20주 이후에 나타나고 보통 산모의 혈압 또는 요(urine) 검사에 의해 검출된다. 조기 진단이 가능할 경우 적절한 치료만 행해진다면 대상체나 태어날 태아의 위험을 획기적으로 줄일 수 있는데, 기존의 모니터링(monitoring) 방법은 이러한 증상을 조기에 진단하는데 효과적이지 않다. 현재 분만 외에는 자간전증에 대한 치료 방법으로 알려져 있는 것은 없다. 자간전증은 가벼운 증상에서부터 생명을 위협하는 정도까지 질병의 경중도(severity)에 있어서 매우 다양하다. 하지만, 이러한 임상적 위험에도 불구하고, 자간전증의 발병 원인, 발병 기전을 알아내거나, 조기 진단 및 예측을 하기가 거의 불가능한 실정이다.

이에 따라, 처음부터 자간전증이 발병하더라도 초기에 치료받을 수 있도록 하기 위해 조기 진단이 필요할 뿐 아니라, 임신성 고혈압을 조기에 발견하여 자간전증으로의 이행을 억제하거나, 자간전증으로 이행하였더라도 초기에 치료받을 수 있도록 하기 위해 조기 진단 및 예측이 필요하다. 대한민국등록특허 제10-1535737호에서는 miRNA 발현을 측정하여 자간전증을 진단하는 방법에 대해 개시하고 있고, 대한민국등록특허 제10-1356894호에서는 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성을 측정하여 임신성 합병증을 진단하는 방법에 대해 개시하고 있으나, 임신 초기에 비침습적인 방법을 이용하여 높은 정확도로 자간전증 또는 임신성 고혈압을 진단해내기 위한 바이오마커의 추가 개발이 필요하다.

바이오마커의 개발에 있어서 현재, 자간전증 또는 자궁 내 성장부진(intrauterine growth restriction (IUGR))의 경우, 임신부 혈장 내의 세포-유리 태아 DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)의 농도가 증가되어 있다는 것이 보고된 바 있다. 기 보고된 유전자 중 하나인 SRY 유전자는 임신 16주에 모체 혈장 내에 증가되어 있는 것으로 관찰된 바 있고(Cotter, A.M. et. al., Increased fetal DNA in the maternal circulation in early pregnancy is associated with an increased risk of preeclampsia. Am. J. Obstet. Gynecol. 2004, 191, 515-520.), 자간전증 질환이 있는 임신부에서 RASSF1A 유전자의 수준이 정상 임신부와 차이가 있는 것으로 보고된 바 있으나(Papantoniou, N. et. Al., RASSF1A in maternal plasma as a molecular marker of preeclampsia. Prenat. Diagn. 2013, 33, 682-687), 이와 대조적으로 자간전증 또는 자궁 내 성장부진이 나타나는 임신부의 경우 20주 이전에는 SRY 유전자의 양이 정상 임신부와 차이가 없다는 보고도 존재하여(Crowley, A. et. Al., Free fetal DNA is not increased before 20 weeks in intrauterine growth restriction or pre-eclampsia. Prenat. Diagn. 2007, 27, 174-179), 바이오마커로서 활용가치가 있는지에 대해서는 명확히 밝혀지지 않아 추가적인 연구가 필요하다. 이에 본 발명자들은 자간전증을 조기에 진단해낼 수 있는 새로운 바이오마커를 발굴하였다.

본 발명의 목적은 임신부 혈장 내의 태아 특이적인 후성유전학적 마커, DSCR3(GenBank Accession No.: NG_009410.1) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 자간전증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 자간전증 진단용 조성물을 포함하는 자간전증 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자간전증이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 DSCR3 유전자의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 자간전증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자간전증 치료제 후보물질을 처리하기 전과 후의 DSCR3 유전자의 농도 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 자간전증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 구현예는 임신부 혈장 내의 태아 특이적인 후성유전학적 마커, DSCR3(GenBank Accession No.: NG_009410.1) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 자간전증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "태아 특이적 후성유전학적 마커"는 메틸화 유무에 따른 후성유전학적 특징에 의해 태아 유래 DNA를 임신부 유래 DNA로부터 특이적으로 구별하기 위해 이용될 수 있는, 유전자 상의 특정 부위를 의미한다. 태아 특이적 후성유전학적 마커는 비침습적 산전 검사에 유용하게 이용될 수 있다. 태아 특이적 후성유전학적 마커를 이용하여 임신부 혈액 중 태아 DNA를 검출하고 그의 존재 여부를 판단하여 태아의 염색체 이상을 검사할 수 있는 것은 물론, 임신부 혈장 내 존재량을 측정하는 것에 의해 임신부의 질환 유무를 검사할 수 있다.

본 발명에서, "DSCR3(Down syndrome critical region 3, GenBank Accession No.: NG_009410.1)"는 21번 염색체 상의 37257167-37257536 영역에 위치하며, GenBank Accession No.: NG_009410.1로 표시된다. 태아의 다운 증후군을 진단하기 위한 마커로서 알려진 바 있으나, 아직까지 자간전증을 진단할 수 있는 마커로서 알려진 바는 없다.

본 발명 일 실시예에서는 DSCR3 가 다른 기존 마커의 패턴과 유사하게 임신 주수에 따라 증가하고 기존 마커와 양의 상관관계를 나타냄에 따라, 태아 특이적인 후성유전학적 마커로서 활용될 수 있음을 확인하였다(도 9 및 도 10). 나아가, DSCR3 는 조기발생 자간전증(early-onset PE, EO-PE) 및 후기발생 자간전증(late-onset PE, LO-PE) 모두에서 정상 대조군에 비해 현저히 높은 농도를 나타내었는바, 자간전증을 진단해낼 수 있는 후성유전학적 마커임을 확인하였다(표 5).

특히, DSCR3 는 조기발생 자간전증 질환에 대해 그 증상이 나타나기 이전인 임신 24주부터 조기에 검출해낼 수 있음을 확인하였으며, 이미 알려진 마커인 RASSF1A 보다 더 높은 농도를 나타내어 더 쉽고 정확하게 자간전증을 검출 및/또는 진단해낼 수 있음을 확인하였다. 또한, 후기발생 자간전증에 대해서도 임신 33주 이후부터 검출해낼 수 있음을 확인하였다.

아울러, RASSF1A는 tumor suppressor 유전자로 암 병력이 있는 임신부에게는 적용 제한이 있다. 그러나, DSCR3 은 임신부가 암에 걸린 상태라도 이와 무관하게 자간전증을 조기에 진단해낼 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서, "유전자 농도"란, 특정 유전자가 그 자체로 존재하는 정도를 말한다. 본 발명에서는 태아 특이적인 후성유전학적 마커, DSCR3 유전자의 농도를 관찰함으로써 자간전증의 진단이 조기에 비침습적인 방법으로 용이하게 이루어질 수 있도록 하였다.

본 발명에서, "자간전증(preeclampsia, PE)"이란, 임신 20주 이후에 고혈압(140/90mmHg 이상)과 단백뇨(1일 뇨증 0.3g 이상 및/또는 dipstick testing 1+ 이상)가 발생한 것을 의미한다. 자간전증은 임신성 고혈압(gestational hypertension)과 달리 많은 융합영양막결절(syncytial knots), 높은 비율의 탈락막 맥관장애(decidual vasculopathy) 및 융모경색(villus infarction)을 나타낸다. 태반 허혈(ischemia) 역시 자간전증과 관련이 있다. 나아가, 자간전증의 경우, 내피기능이상(endothelial dysfunction) 및 혈관형성 촉진 요소(pro-angiogenic factor) 또는 항-혈관신생요소(anti-angiogenic factor)간의 불균형이 나타나, 태아 사망까지도 유도될 수 있는 위험성이 큰 질환이다.

자간전증은 발생 시기에 따라 34주 이전에 발생하는 조기발생 자간전증(또는 조기발병 자간전증, early-onset PE, EO-PE) 및 34주 이후에 발생하는 후기발생 자간전증(또는 후기발병 자간전증, late-onset PE, LO-PE)으로 구분될 수 있다.

조기발생 자간전증은 후기발생 자간전증과 비교하여 임신부의 임상적 특성은 큰 차이를 보이지 않으나, 산모 및 신생아의 합병증이 증가한 것으로 보고된 바 있다(정은정(Eun Jeong Jeong) 외, "조기발병과 후기발병 자간전증 산모와 신생아의 예후 비교", 대한주산의학회, <대한주산의학회잡지> 20권4호 (2009), pp.370-380).

구체적으로 상기 자간전증 진단용 조성물은 조기발생 자간전증(early-onset PE, EO-PE)을 진단하는 것일 수 있으며, 상기 조기발생 자간전증은 증상이 나타난 이후는 물론, 그 증상이 나타나기 이전인 임신 24주 이후부터 DSCR3 유전자의 농도를 측정함으로써 진단이 가능하다. 더욱 구체적으로는 임신 24주 이후 32주 이내의 기간에서 진단이 가능하다.

상기 DSCR3 유전자의 농도는 자간전증이 의심되는 환자의 태반 또는 모체 혈액 시료로부터 측정할 수 있으나, 세포 유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 검출해낼 수 있는 시료이면 충분하고, 상기 시료에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 DSCR3유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 자간전증 진단용 조성물은 조기발생 자간전증, 후기발생 자간전증을 모두 진단해낼 수 있으며, 나아가 중증 정도에 따라 구분되는 경증 자간전증, 중증 자간전증 역시 자간전증에 포함되는바, 모두 진단 가능하며, 특히 조기발생 자간전증의 경우 증상이 나타나기 이전부터 진단해낼 수 있다는 장점이 존재하는 것이다.

또한 구체적으로, 본 발명에서 유전자의 농도를 측정하는 제제는 DSCR3에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

더욱 구체적으로 상기 프라이머는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 DSCR3의 농도를 측정하였으며, 본 발명의 자간전증 및/또는 조기발생 자간전증 진단용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 위한 완충액, dNTP 혼합물, 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응은 표적 핵산의 증폭과 측정을 동시에 진행한다. 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 산물로부터 발생하는 신호, 예를 들면, 형광의 강도를 실시간으로 측정하므로, 전통적인 중합효소연쇄반응에 비해 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있다.

본 발명에서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 상기 DSCR3에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 qPCR 증폭을 실시하여 농도를 확인함으로써 자간전증 및/또는 조기발생 자간전증 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다. 본 발명 일 실시예에서, 프로브는 5' 말단에는 형광물질이 부착되고, 3' 말단에는 소광물질이 부착되어 있다.

상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 소광물질은 6-TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX(carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 본 발명의 일 구현예는 상기 자간전증 진단용 조성물을 포함하는 자간전증 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 환자 시료 내 DSCR3 유전자의 농도를 측정할 수 있는 제제 뿐 아니라, 농도 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 유전자의 검출을 위한 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 프로브, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

또 다른 본 발명의 일 구현예는 a) 자간전증이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 DSCR3 유전자의 농도를 측정하는 단계; b) 상기 DSCR3 유전자의 농도를 정상 대조군의 시료와 비교하는 단계; 및 c) 측정된 DSCR3 유전자의 농도가 정상 대조군 보다 높은 경우 자간전증으로 진단하는 단계를 포함하는, 자간전증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 자간전증이 의심되는 환자의 생물학적 시료는 환자의 태반 또는 모체 혈액 시료로부터 측정할 수 있으나, 세포 유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 검출해낼 수 있는 시료이면 충분하고, 상기 시료에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 자간전증 환자의 경우 정상 대조군에 비해 DSCR3 유전자의 농도가 현저히 증가되어 있음을 확인하였는바(표 5), 측정된 DSCR3 유전자의 농도가 정상 대조군 보다 높은 경우 자간전증으로 진단할 수 있다.

특히, DSCR3 유전자의 농도는 조기발생 자간전증의 증상이 나타나기 이전인 임신 24주부터 증가되어 있어(표 5), 조기발생 자간전증을 비침습적인 방법으로 조기에 진단해내어 적절한 치료가 행해지도록 할 수 있다.

또 다른 본 발명의 일 구현예는 a) 자간전증 환자의 생물학적 시료에 자간전증 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 상기 시료에서 상기 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 DSCR3 유전자의 농도 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 자간전증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명 일 실시예에서는 자간전증 환자의 경우 정상 대조군에 비해 DSCR3 농도가 현저히 증가되어 있음을 확인하였는바(표 5), 상기 질환의 치료 후보물질을 처리한 후 증가되어 있던 DSCR3 유전자의 농도가 감소된 경우 자간전증을 치료할 수 있는 물질인 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 임신부 혈액 시료로부터 태아 특이적인 DSCR3 유전자의 농도를 측정함으로써 비침습적인 방법을 통해 자간전증을 진단하는데 활용될 수 있다. 특히, 자간전증의 증상이 나타나기 이전에 상기 질환을 진단해낼 수 있으며, 특히 조기발생 자간전증까지 증상이 나타나기 이전에 비침습적인 방법으로 조기에 진단함으로써 임신중독증의 위험으로부터 벗어날 수 있도록 한다.

도 1은 타일링 어레이를 통해 확인된 메틸화 부위 7부위를 나타낸 것이다. 붉은 색은 높은 발현, 검은색은 비-발현을 상대적으로 나타낸 것이다(P: 태반(placenta), M: 모체 혈액 세포(maternal blood cells), N: 비임신 여성 혈액세포(non-pregnant women blood cells).
도 2는 DSCR3(A), SOD1(B), C2CD2(C), UMODL1(D) 및 ENST00000433952:-7924~-7988(E) 및 RASSF1A(F) 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 검은색 막대는 정상 임신부의 모체 혈액 세포 시료, 흰색 막대는 자간전증 환자(PE)의 모체 혈액 세포 시료, 회색 막대는 정상 임신부의 태반 조직 시료, 빗금 막대는 자간전증 환자의 태반 조직 시료로부터 유래한 결과를 나타낸다.
도 3은 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 DSCR3 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 별표(*)는 CpG 사이트를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. 어레이 상의 프로브 위치는 밑줄로 표시하였다. 노란 음영은 PCR 반응이 일어난 부위를 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 사이트는 서열 내에 굵은 글씨로 표시하였다.
도 4는 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 SOD1 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 별표(*)는 CpG 사이트를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. 어레이 상의 프로브 위치는 밑줄로 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 사이트는 서열 내에 굵은 글씨로 표시하였다. SOD1 의 서열결정은 역방향 3'에서 5'방향으로 이루어졌다.
도 5는 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 C2CD2 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 별표(*)는 CpG 사이트를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. 어레이 상의 프로브 위치는 밑줄로 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 사이트는 서열 내에 굵은 글씨로 표시하였다.
도 6은 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 UMODL1 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 별표(*)는 CpG 사이트를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. 어레이 상의 프로브 위치는 밑줄로 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 사이트는 서열 내에 굵은 글씨로 표시하였다. UMODL1 의 서열결정은 역방향 3'에서 5'방향으로 이루어졌다.
도 7은 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 ENST00000433952:-7924~-7988 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 별표(*)는 CpG 사이트를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. 어레이 상의 프로브 위치는 밑줄로 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 사이트는 서열 내에 굵은 글씨로 표시하였다.
도 8은 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 RASSF1A 내의 각 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 별표(*)는 CpG 사이트를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. 노란 음영은 PCR 반응이 일어난 부위를 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 사이트는 서열 내에 굵은 글씨로 표시하였다.
도 9는 정상 대조군 내에서의 임신 주수와 마커의 농도와의 관계를 나타낸 것이다(DSCR3: dashes, RASSF1A: dash-dots, SRY: solid, GAPDH: dots).
도 10은 정상 대조군 내에서의 DSCR3 및 SRY(A), DSCR3 및 RASSF1A(B) 및RASSF1A 및 SRY(C)의 관계를 나타낸 것이다. Loess regression을 통해 가장 적절한 선형을 검은색 선으로 나타내었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연구 대상의 선정

2010년 8월부터 2014년 8월까지 제일병원 산부인과를 내원한 임신부를 대상으로 본 연구의 목적을 설명하고 동의를 얻어 환자-대조군 연구(nested case-control study)를 수행하였다. 본 연구는 제일병원 의학연구심의위원회(IRB)의 승인을 받아 진행하였다(#CGH-IRB-2013-54). 6-41주의 모든 임신부를 대상으로부터 혈액 10ml를 채취하였으며, 임신 3분기의 모체 혈액 및 태반 샘플을 채취하였다.

정상 임신부 188명, 고혈압 장애가 있는 임신부 92명(조기발생 자간전증(EO-PE) 16명, 후기발생 자간전증(LO-PE) 47명 및 임신성 고혈압(GH) 29명 포함) 총 280명을 대상으로 하였으며, 정상 대조군은 의학적 또는 산과적 합병증이 없는 임신부를 포함하였다.

자간전증(Preeclampsia,PE)은 임신 20주 이후에 고혈압(140/90mmHg 이상)과 단백뇨(1일 뇨증 0.3g 이상 또는 dipstick testing 1+ 이상)가 발생한 경우로 정의하였다. 자간전증은 34주 이전에 발생하는 조기발생 자간전증(early-onset PE, EO-PE) 및 34주 이후에 발생하는 후기발생 자간전증(late-onset PE, LO-PE)으로 구분하였다. 임신성 고혈압(Gestational hypertension, GH)은 임신 20주 이후 단백뇨 없이 고혈압 증상을 가지는 임신부에게 진단되었다.

다태임신, 만성 고혈압, 당뇨병, 자간전증, 간질환, 만성 신장 질환의 기왕력(history)이 있는 경우 연구 대상에서 제외하였다. 각 연구 그룹(대조군, EO-PE, LO-PE 및 임신성 고혈압)의 특징은 하기 표 1에 나타내었다. 각 그룹 간의 임신부 나이, 초산(nulliparity), 시료 채취 시의 임신 주기, 태아 성별, 음주 및 흡연여부에 대해서는 큰 차이가 없었다(p>0.05).

그러나, 대조군에 비해 모든 환자군에서 체중 및 혈압이 높은 반면, 분만시 임신 주수 및 신생아 체중이 낮은 것을 알 수 있었다(p<0.05).

실시예 2. DNA 추출

모체 혈액 10ml를 채취한 후 EDTA 튜브에 넣고 4℃ 1,600 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상층액을 4℃ 16,000 g에서 10분 동안 재원심분리한 후 DNA 추출을 위해 1 mL씩 분주(aliquot)하였다. 모체 혈액 및 태반 조직으로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 순환 세포-유리 DNA(circulating cell-free DNA)는 상기 분주된 1 mL 시료로부터 QIAamp DSP Virus Kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 설명서에 기재된 방법대로 추출하였다.

실시예 3. 타일링 어레이(Tiling Array)

태아 특이적인 과메틸화 부위(hypermethylated region)을 확인하기 위하여, 논문, 「Lim, J.H.; Lee, D.E.; Park, S.Y.; Kim, D.J.; Ahn, H.K.; Han, Y.J.; Kim, M.Y.; Ryu, H.M. Disease specific characteristics of fetal epigenetic markers for non-invasive prenatal testing of trisomy 21. BMC Med. Genom. (2014. 7. 1)」에 기재된 방법에 따라 수행한 타일링 어레이의 결과를 분석하였다. 정상 비임신 여성(n = 2)으로부터의 혈액 시료, 임신 1분기의 임신부(n = 4)로부터 추출한 태반 시료 및 모체의 혈액 시료를 분석하였다.

정규화된 log₂ 값은 각 프로브에 대한 백그라운드를 제거하여 계산된, MBD(methyl-CpG binding domain)에 의해 회수된 메틸화 DNA:총 인풋 DNA 시그널의 비율이며, 각 좌(locus)에서 메틸화 DNA 양의 상대적 척도를 나타낸다.

본 발명자들은 과메틸화(hypermethylation)를 정규화 log₂ 값 > 0.5, 저메틸화(hypomethylation)를 0.001 < log₂ 값 < 0.499로 정의하고, 완전한 비메틸화를 정규화 log₂ 값 = 0으로 정의하였다.

태반 내 과메틸화 및 모체 혈액 세포 내 저메틸화 된 부위를 잠재적인 태아 DNA 마커로 선별하였다. 선별기준은 i) 태반 및 모체 DNA 사이의 log₂ 비율은 2.0 이상이고, ii) 평균 기준(모체 DNA) log₂ 비율은 0.001 이하로 하였다. 상기와 같은 기준으로 비교하였을 때, 태반 내에서 모체 혈액 세포와 다르게 메틸화된 7개의 유전자 부위를 선별하였다. (표 2 및 도 1)

하기 표 2는 조직 유형에 따라 선별된 지역(region)의 메틸화 수준을 나타낸 것이다.

실시예 4. 바이설파이트 직접 염기서열결정( Bisulfite direct sequencing)

임신 1분기 때의 MBD 어레이 결과를 확인하고, 조직 특이적인 메틸화 수준의 일관성 유지를 확인하기 위하여 임신 3분기 때 채취된 시료들에 대해 바이설파이트 직접 염기서열 시퀀싱을 진행하였다. 정상 임신부로부터 채취된 태아 태반 및 모체 혈액 8쌍의 시료 및 자간전증이 있는 임신부로부터 채취된 태아 태반 및 모체 혈액 8쌍의 시료를 사용하였다. 주로 짧은 DNA 조각 형태인 혈장 내의 세포-유리 DNA를 검출하기 위하여, 짧은 DNA(250bp) 내 여러 개의 서로 다른 메틸화된 CpG 사이트 및 근접한 CpG 사이트를 포함하는 프로브 위치를 찾았다. ENST00000433952:-7924 및 ENST00000433952:-7988 부위는 서로 매우 가까이에 위치하므로 동일한 프로브 서열을 사용하였으며, ENST00000450830:-4439 부위는 매우 많은 poly T 부위를 포함하여 시퀀싱이 되지 않아 배제하였다.

DNA 시료 1 ug을 EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)를 이용하여 바이설파이트-전환시켰다. 그 후 바이설파이트-전환된 DNA를 PCR 반응시켰다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타난 바와 같다.

이후 제조사의 설명서에 따라 PCR 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR 산물을 정제하고, PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 서열을 결정하였다.

서열결정 산물은 ABI 3130XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 분석하고, Genescan 소프트웨어 버전 5.3(Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 전기영동도 기록(electropherogram trace)을 해석하였다.

타겟 부위 [GenBank ID]	서열		서열번호
SOD1 [NG_008689.1]	정방향 프라이머	5'- GTAATTTGTTTGTTTTTTTTTTTGTG -3'	1
SOD1 [NG_008689.1]	역방향 프라이머	5'- CAACAACATCTTATATACAAAAACC -3'	2
DSCR3 [NG_009410.1]	정방향 프라이머	5'- GTAAATATATGTAAAAATAGGAAGTG -3'	3
DSCR3 [NG_009410.1]	역방향 프라이머	5'- CTTTTACTACATATAACTACACCCCC -3'	4
C2CD2 [AP001745.1]	정방향 프라이머	5'- GAGGACGATAAAAGGAATTAGTTTTT -3'	5
C2CD2 [AP001745.1]	역방향 프라이머	5'- ATTTTTATCTTATTTTTCTCAATTACAC -3'	6
UMODL1 [AP001745.1]	정방향 프라이머	5'- GATTTTTTGGAGGAATTTTTTTT -3'	7
UMODL1 [AP001745.1]	역방향 프라이머	5'- CAAAAATAAATAATTTACTCTACTCC -3'	8
ENST000004339 52:-7924-7988 [AL163278.2]	정방향 프라이머	5'- GAATTGTTTAAGAGGTTTAAGTTTGG -3'	9
ENST000004339 52:-7924-7988 [AL163278.2]	역방향 프라이머	5'- CCTATAATTAAATTACATATAAAACAACC -3'	10
RASSF1A [NG_023270.1]	정방향 프라이머	5'- TAGTTTGGATTTTGGGGGAGG -3'	11
RASSF1A [NG_023270.1]	역방향 프라이머	5'- CCCCAAATAAAATCGCCAC -3'	12

상기와 같은 바이설파이트 직접 염기서열결정을 이용하여 ENST00000450830:-4439 부위를 제외하고, DSCR3 , SOD1 , C2CD2 , UMODL1 및 ENST00000433952:-7924~-7988 총 5개 지역의 각 CpG 사이트에서의 메틸화 수준을 확인하였다. 상기 5개 지역의 메틸화 수준은 모체 혈액 세포에서보다 태반에서 현저히 증가되어 있음을 알 수 있었다(모든 CpG 사이트에서 p<0.001). 그러나, 임신성 고혈압과 정상 태반 사이에서는 메틸화 수준의 차이가 나타나지 않았다(모든 CpG 사이트에서p>0.05).

모체 혈액 세포와 비교하였을 때, 이러한 5개 지역 중에서 DSCR3 에 있는 모든 CpG 사이트가 태반에서 메틸화되어 있고, 나아가, DSCR3 는 메틸화 된 DNA의 MBD 포획(capture)을 촉진할 수 있는 가장 많은 수의 CpG 사이트를 포함하고 있음에 따라 태아-특이적인 후성유전학적 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다(도 2(A) 및 도 3).

아울러, 세포-유리 태아 DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA) 마커로도 알려져 있는 RASSF1A 역시 태반 내에서 모든 CpG 사이트가 과메틸화 되어 있는 것을 확인하였다(도 2(F) 및 도 8).

실시예 5. 바이설파이트 직접 염기서열결정 결과의 메틸화 정도( Methylation Quantification) 분석

Chromas program(Version 2.32, Technelysium)에 의해 추출된 서열에서 각 CpG 사이트의 메틸화 비율을 C 피크 높이/ C+T 피크높이로 계산하였다. CpG 사이트의 단일 C는 100% 메틸화된 것으로, 단일 T는 0% 메틸화된 것으로, C 및 T가 겹쳐서 나타나는 것은 부분적으로 메틸화된 것으로 판단하였다.

실시예 6. 메틸화 DNA의 농축(Enrichment)

MethylMiner^TM 메틸화 DNA 추출 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여, 임신부 혈장으로부터 추출된 세포-유리 DNA로부터 메틸화된 세포-유리태아 DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)를 추출하였다. MBD-비오틴 단백질(3.5 ㎍)을 10 ㎕ Dynabeads M-280 Streptavidin에 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후, MBD-자성 비드 컨쥬게이트를 3회 세척하고 1 부피(volume)의 1X Bind/Wash 완충액에 재현탁시켰다. 회전 믹서 상에서 30 ㎕의 추출된 순환(circulating) DNA를 MBD-자성 비드에 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 포획(capture) 반응을 수행하였다. 그 후, 비드를 1X Bind/Wash 완충액으로 3회 세척하고, 결합된 메틸화 DNA를 용리 완충액 중 증가되는 NaCl 농도[600 mM, 1,000 mM, and 2,000 mM NaCl]를 이용하여 메틸화 DNA를 단계적으로 추출하였다. 추출된 메틸화 DNA는 DNA 농축키트(Zymo research corp., Irvine, Ca, USA)를 이용하여 농축시키고, 30 ㎕의 최종 부피로 용해시켰다. 키트에 포함된 대조군 DNA(메틸화 DNA 및 비메틸화 DNA)를 이용하여 메틸화 DNA의 추출을 확인하였다.

실시예 7. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응 (Quantitative Real-time PCR , qPCR)

모체 혈장 내의 세포-유리 DNA로부터 메틸화된 DSCR3 및 RASSF1A 유전자의 메틸화 정도를 확인하였다. 또한, 남아를 임신한 92명의 임신부 중의 54개 혈장 시료로부터 추출한 세포-유리 DNA의 SRY 및 GAPDH의 농도도 측정하였다.

qPCR 은 ABI 7500 system(Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA)을 이용하여 수행하였다. 5 ㎕의 4X NEXpro^TM Dia PCR Master Mix(Geneslabs, Seongnam, Korea), 6 ㎕의 MBD에 의해 포획된 메틸화 혈장 DNA를 포함하는 20㎕ 부피의 반응액을 통해 듀플렉스(duplex) PCR 반응을 수행하였다. DSCR3 , RASSF1A , SRY 및 GAPDH의 프라이머 및 프로브는 각각 최종 250nM 의 농도로 사용되었다.

DSCR3 및 RASSF1A 에 특이적인 앰플리콘(Bioneer, Daejeon, Korea)을 연속 희석하여 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다. SRY 및 GAPDH의 표준 곡선은 상업적으로 판매하는 남성의 게놈 DNA(genomic DNA)를 구매하여(Promega, Madison, WI, USA) 순차적으로 10배 희석하여 표준 곡선을 작성하였다.

모든 시료는 3회 증폭시키고 최종 결과는 평균을 반영하였다. 농축 계수(factor concentration)는 카피/mL로 표현하고, 전술된 바와 같이, 데이터를 카피수로 전환시키기 위해, 6.6 pg의 표준 계수(standard factor)를 사용하였다(Am J Hum Genet 1998; 62:768-75).

상기 사용한 프라이머, 프로브, 및 표적 영역의 앰플리콘의 서열은 하기 표 4에 나타난 바와 같다.

타겟 부위 [GenBank ID]	서열		서열번호
DSCR3 [NG_009410.1]	정방향 프라이머	5'- CGTAGCGGCTTCTCGTG -3'	13
	역방향 프라이머	5'- GTTAGCCATCGGCTAGGTGG -3'	14
	프로브	5'- FAM-CCGAAGCGTCTGGCCTGTGTGCTCT-BHQ1 -3'	15
	앰플리콘(125bp)	5'- CGTAGCGGCTTCTCGTGGGCGAGTCCCTGTTCGCAGGTGACGTGTGGACCACGCTCTTCCGAAGCGTCTGGCCTGTGTGCTCTCGGGGAGGGGACGCAGGTCAGCCCACCTAGCCGATGGCTAAC -3'	16
RASSF1A [NG_02370.1]	정방향 프라이머	5'- GAGCCTGAGCTCATTGAGCTG -3'	17
	역방향 프라이머	5'- ACCAGCTGCCGTGTGG -3'	18
	프로브	5'- HEX -CACCCGCTGGGCGCGC-BHQ1 -3'	19
	앰플리콘(131bp)	5'- GAGCCTGAGCTCATTGAGCTGCGGGAGCTGGCACCCGCTGGGCGCGCTGGGAAGGGCCGCACCCGGCTGGAGCGTGCCAACGCGCTGCGCATCGCGCGGGGCACCGCGTGCAACCCCACACGGCAGCTGGT -3'	20
SRY [NG_011751.1]	정방향 프라이머	5'- AGATCAGCAGGGCAAGTAGT -3'	21
	역방향 프라이머	5'- TGAAACTTGCATTTCTCCGC -3'	22
	프로브	5'- FAM-CAGGGTACTAGGGGGTAGGCTGGTTG-BHQ1 -3'	23
GAPDH [NG_007073.2]	정방향 프라이머	5'- CCCCACACACATGCACTTACC -3'	24
	역방향 프라이머	5'- GTGGGAAGAGGGGAAGCTG -3'	25
	프로브	5'- HEX-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ1 -3'	26

**FAM: 6-carboxyfluorescein, BHQ1: Black Hole Quencher-1, HEX: hexacholoro-6-carboxyfluorescein

본 실험은 MIQE(minimum information for publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) 가이드라인에 따라 수행하였으며, 하나의 타겟에 대해 3번 이상 반복 수행하여 정확도를 높였다.

임신 6-41주의 단순 단태아 임신부 188명을 대상으로 qPCR을 수행하여 모체 태반에서의 DSCR3 검출 가능성 및 DSCR3의 후성유전학적 마커로서의 활용 가능성을 조사하였다.

그 결과, MBD 포획 후 DSCR3 및 RASSF1A 모두 실패 없이 모든 임신부의 모체 혈장에서 검출된 것을 확인하였다. 또한, SRY 및 GAPDH 는 모든 남성 태아를 임신하고 있는 임신부에게서 검출되었다. 특히, 상기 모든 마커들의 농도는 시료 채취 당시의 임신 주수와 관련이 있음을 알 수 있었다(DSCR3: r = 0.695; RASSF1A: r = 0.452; SRY: r = 0.522; GAPDH: r = 0.609, p < 0.001)(도 9).

상기와 같은 결과로부터 DSCR3 역시 다른 기존 마커의 패턴과 유사하게 임신 주수에 따라 증가하는 양상을 나타냄에 따라, 태아 특이적인 후성유전학적 마커로서 활용될 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 기존의 다른 마커에 비해 더욱 높은 농도를 나타내어 보다 효과적인 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 8. 통계적 분석( Stastical Analysis)

범주형 변수(categorical variables)에 대한 카이제곱검정(chi-square test) 또는 피셔의 정확도 검정(Fisher's exact test)을 이용하여 분석하였고, 연속 변수(continuous variables)에 대한 비모수검정의 사후검정(post-hoc Bonferroni correction)을 포함하는 만-위트니 유 검증(Mann-Whitney U test)을 이용하여 분석하였다. 유연하고 적절한 선형을 얻기 위해 국부 가중치 회귀(locally weighted(Loess) regression)를 이용하였다. 또한, 사후 쌍체 분석(pairwise analysis)와 함께 The Kruskal-Wallis 검정을 이용하여 여러 그룹 간의 양적 변수(quantitative variable)를 비교하였다. 스피어먼의 순위 상관(Spearman's rank correlation)을 이용하여 상관계수(correlation coefficients)를 계산하였다. 모든 데이터 분석은 SPSS software 12.0을 이용하였으며, 통계적 유의성은 모든 검사에서 P<0.05로 설정하였다.

남자 태아(male fetus)를 임신한 임신부의 혈장에서 검출되는 Y 염색체에 특이적인 마커인 SRY 및 후성유전학적 마커로 기보고된 바 있는 RASSF1A와의 관계를 분석한 결과, RASSF1A 및 SRY(r = 0.326, p = 0.015), DSCR3 및 RASSF1A(r = 0.673, p < 0.001)뿐 아니라 DSCR3 및 SRY(r = 0.471, p < 0.001)의 관계 역시 강한 양성적 관계가 있음을 알 수 있었다(도 10).

또한, 본 발명자들은 정상 대조군 및 임신 중 고혈압성 장애 (Hypertensive disorders of pregnancy, HDP)인 조기발생 자간전증(EO-PE), 후기발생 자간전증(LO-PE), 임신성 고혈압(GH)을 가진 환자군 사이의 모체 혈장 내의 DSCR3 및 RASSF1A의 농도를 비교하였다. 농도가 증가하는 지점을 확인하기 위하여, 임신 주수 6주 내지 41주 사이에서 9주 이내 간격으로 모체 혈장 내의 DSCR3 및 RASSF1A의 평균 농도를 측정하였다.

하기 표 5에 나타난 바와 같이, 6-23주에서는 모든 환자군의 DSCR3 및 RASSF1A의 평균 농도는 정상 대조군과 큰 차이를 나타내지 않았다. 24-32주에서는 EO-PE 그룹의 환자군에서만 DSCR3 및 RASSF1A의 농도가 현저히 높게 나타났으며, 33-41 주에서는 EO-PE 그룹 뿐 아니라 LO-PE 그룹에서도 DSCR3 및 RASSF1A의 농도가 현저히 높게 나타났다. 그러나, 임신성 고혈압(GH) 환자군 및 정상 대조군에서는 DSCR3 및 RASSF1A의 농도 차이가 나타나지 않았다(p>0.05).

상기와 같은 결과로부터, DSCR3는 RASSF1A와 마찬가지로 태아 특이적인 후성유전학적 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 나아가, DSCR3 및 RASSF1A의 농도는 EO-PE 그룹에서 그 증상이 나타나기 이전인 24-32주부터 현저히 증가하고, LO-PE 그룹에서도 정상 대조군에 비해 농도가 높은 것을 확인함에 따라, EO-PE를 증상이 나타나기 이전, 조기에 진단해낼 수 있는 마커로 활용될 수 있음을 확인하였다.

특히, 자간전증의 증상이 나타나기 이전인 24-32주부터 농도가 증가한 태아 특이적인 후성유전학적 마커, DSCR3 및 RASSF1A의 농도를 비교하였을 때, EO-PE에서 DSCR3의 농도가 RASSF1A의 농도보다 눈에 띄게 높아, EO-PE를 조기에 진단함에 있어 RASSF1A 보다 한눈에 구분해 낼 수 있는 마커로서의 효용성이 높음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CHEIL GENERAL HOSPITAL & WOMEN'S HEALTHCARE CENTER <120> Fetal specific epigenetic marker DSCR3 and Compositions for diagnosis of preeclampsia comprising the same <130> KPN-16195 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD1 forward primer <400> 1 gtaatttgtt tgtttttttt tttgtg 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD1 reverse primer <400> 2 caacaacatc ttatatacaa aaacc 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 forward primer <400> 3 gtaaatatat gtaaaaatag gaagtg 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 reverse primer <400> 4 cttttactac atataactac accccc 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2CD2 forward primer <400> 5 gaggacgata aaaggaatta gttttt 26 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2CD2 reverse primer <400> 6 atttttatct tatttttctc aattacac 28 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UMODL1 forward primer <400> 7 gattttttgg aggaattttt ttt 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UMODL1 reverse primer <400> 8 caaaaataaa taatttactc tactcc 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENST00000433952 forward primer <400> 9 gaattgttta agaggtttaa gtttgg 26 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ENST00000433952 reverse primer <400> 10 cctataatta aattacatat aaaacaacc 29 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A forward primer <400> 11 tagtttggat tttgggggag g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A reverse primer <400> 12 ccccaaataa aatcgccac 19 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 forward primer(qPCR) <400> 13 cgtagcggct tctcgtg 17 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 reverse primer(qPCR) <400> 14 gttagccatc ggctaggtgg 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 probe <400> 15 ccgaagcgtc tggcctgtgt gctct 25 <210> 16 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 amplicon <400> 16 cgtagcggct tctcgtgggc gagtccctgt tcgcaggtga cgtgtggacc acgctcttcc 60 gaagcgtctg gcctgtgtgc tctcggggag gggacgcagg tcagcccacc tagccgatgg 120 ctaac 125 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A forward primer(qPCR) <400> 17 gagcctgagc tcattgagct g 21 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A reverse primer(qPCR) <400> 18 accagctgcc gtgtgg 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A probe <400> 19 cacccgctgg gcgcgc 16 <210> 20 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A amplicon <400> 20 gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg ggcgcgctgg gaagggccgc 60 acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg gcaccgcgtg caaccccaca 120 cggcagctgg t 131 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY forward primer(qPCR) <400> 21 agatcagcag ggcaagtagt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY reverse primer(qPCR) <400> 22 tgaaacttgc atttctccgc 20 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRY probe <400> 23 cagggtacta gggggtaggc tggttg 26 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer(qPCR) <400> 24 ccccacacac atgcacttac c 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer(qPCR) <400> 25 gtgggaagag gggaagctg 19 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe <400> 26 aaagagctag gaaggacagg caacttggc 29

Claims

임신부 혈장 내의 태아 특이적인 후성유전학적 마커, DSCR3(GenBank Accession No.: NG_009410.1) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 자간전증 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자간전증은 조기발생 자간전증(early-onset PE, EO-PE)인 것인, 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조기발생 자간전증은 임신 24주 이후 DSCR3 유전자의 농도를 측정하여 진단하는 것인, 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 DSCR3 유전자의 농도는 자간전증이 의심되는 환자의 태반 또는 모체 혈액 시료로부터 측정하는 것인, 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 유전자의 농도를 측정하는 제제는 DSCR3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머쌍인, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 자간전증 진단용 키트.
a) 자간전증이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 DSCR3 유전자의 농도를 측정하는 단계;
b) 상기 DSCR3 유전자의 농도를 정상 대조군의 시료와 비교하는 단계; 및
c) 측정된 DSCR3 유전자의 농도가 정상 대조군보다 높은 경우 자간전증으로 진단하는 단계를 포함하는, 자간전증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 자간전증이 의심되는 환자의 생물학적 시료는 모체혈액 또는 태반인 것인, 방법.
a) 자간전증 환자의 생물학적 시료에 자간전증 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 시료에서 상기 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 DSCR3 유전자의 농도 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 자간전증 치료제의 스크리닝 방법.