JP6603232B2 - 膀胱がんの監視、診断、およびスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、膀胱がんの予後予測、診断、及びスクリーニング方法に関する。本発明は、膀胱がんに罹患しているか、または、罹患していた患者の再発の監視および経過観察に非常に有用である。

膀胱がんは、全世界で診断されるがんで第５番目に最も一般的なものであり、毎年３３０，０００件より多くの新規症例と一年あたり１３０，０００件よりも多い死亡件数があり、その男女間の推定比は３．０：１．０である。膀胱がんは老人性疾患であり、診断される人の９０％より多くが、５５歳を超える患者である。通常ではないが、膀胱がんは若年者や子供にさえも起こる場合がある。任意の時点ではあるが、２百７十万人が膀胱がんの病歴を有する。新規に診断される膀胱がん症例の内、約７０％〜８０％が初期ステージであるが、それら症例の７０％が再発し、そして、１０％〜３０％が進行型疾患へと進展する。初期ステージ（「表在性」と呼ばれるもの）の疾患において非筋層浸潤性である患者の大多数に関しては、その管理には一般的に、内視鏡的切除術、膀胱内療法、および監視的膀胱鏡検査が含まれる。まとめると、本アプローチの目的は、再発および進行のリスクを最小化することである。一方、進行型（筋層浸潤性）疾患を有する患者に関しては、その対策は、一般的に集学的なものであり、局所的疾患を標的とするもの（根治的膀胱全摘術、放射線療法）および全身性疾患を標的とするもの（化学療法）の両方である。最近数十年では、膀胱がんの総発生頻度は上昇中であるように見え、このことはタバコ乱用と工業における発がん物質の潜伏効果に起因する可能性がある。

膀胱がんの症例では、正確で非侵襲性の膀胱腫瘍マーカーの開発が、侵襲性かつ比較的高価な現状の診断手順の使用回数を増加させることのないスクリーニング、初期診断、再発の監視、初期における進行の検出、および予後の予測に重要である可能性がある。膀胱がんスクリーニングプログラムは、初期発見を促進することに加えて、便利であることが期待される。しかしながら、総人口および＞５０歳の人における膀胱がんの有病率が低いこと（（０．００１％）および（０．６７％〜１．１３％））が理由で、全集団を膀胱がんに関してスクリーニングすることは、偽陽性が多くなりすぎる結果となる可能性が高まり、費用対効果が高くないものとなる可能性がある。膀胱がんスクリーニングは、このがんのリスクのより高い個人（喫煙者、芳香族アミンに職業的に暴露される人、住血吸虫病患者）間で費用対効果が高い場合がある。膀胱がんのリスクは、喫煙が他の既知の膀胱発がん物質または遺伝子多型と組み合わされるとさらに高くなる。

膀胱がんは、偶然診断される場合もあるし、または、症状があるので診断される場合もある。膀胱がんの主症状は、血尿である。尿細胞検査は検査室検査ではなく、尿管上皮細胞の形態学的特徴を病理学者が解釈するものである。尿検体は膀胱の代表的試料を必ずしも含むものではなく、腫瘍が存在する場合でさえも腫瘍細胞を含まない場合がある。尿細胞検査の感度と特異度は、低グレードの腫瘍を検出するためには低い。膀胱がんの臨床診断は、フレキシブル又は柔軟性のない膀胱鏡による検査により通常実施される。膀胱鏡検査は、膀胱がん診断のためのゴールドスタンダードとして考えられ、小さな病変の発見および切除する能力がある。しかし、膀胱鏡検査に付随するのは、コストが高く、患者が十分不快であり、そして、感度がまちまちであることである。

再発発生頻度が高いので、膀胱がん監視の標準的ケアは、腫瘍摘出後の定期的膀胱鏡検査からなる。血尿スクリーニングは、膀胱がんだけでなく、他の泌尿器学的悪性疾患をも検出することができる。そして、医学的配慮を必要とする良性疾患（良性前立腺肥大症）も初期に検出可能であり、そして、尿路に血液を出す他の多くの状態も検出可能である。

膀胱がんに関連する血尿はまた、腫瘍のグレードとは独立している。

現在、許容可能な効率で膀胱がんの診断と臨床的管理に使用することが推奨可能な腫瘍マーカー検査はない。膀胱がんの予後を推測し、複数のパラメータ（例、患者の腫瘍サイズ、腫瘍グレード、年齢）に関して適切な療法を患者に選択する利用可能な方法はほとんどない。

しかしながら、これらの診断／ステージ決定方法の予測精度は限定的なままである。というのも、これらの方法は、膀胱がんの発症と進行を進める分子的イベントの複雑さを反映しない場合があるからだ。

従って、膀胱がんを正確に診断する方法であって、良好な予後（転移の可能性が低いこと、遅れて疾患が進行すること、疾患再発が減少すること、または、患者の生存期間が増加すること）を伴う腫瘍を、その他の腫瘍から識別可能な方法に対する未だ実現されていない必要性がまだある。

そのような方法を使用して、医師は、患者の予後を正確に予想することができ、そして、療法の利益をほぼ確実に享受するか又はより徹底的な監視を必要とする患者を効果的に対象とすることができるであろう。

発明者らは、一方でＦＧＦＲ３の特異的変異の同定に基づくアッセイと、他方で特異的マーカーのメチル化度の測定に基づくアッセイの二つを組み合わせて測定することにより、膀胱がんの正確な予測および／または検出を提供可能であることを立証した。

従って、本発明が関連するのは、被験者の膀胱がん又は膀胱がん発症リスクの監視、診断、およびスクリーニング方法であって、前記方法は、
ａ）第一生体試料中で、ＦＧＦＲ３遺伝子の変異を検出する工程；ならびに
ｂ）前記被験者から得られる第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のメチル化度を測定する工程を含み、
前記工程ａ）は、
−配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２Ｃ→Ｔ、７４６Ｃ→Ｇ、１１１４Ｇ→Ｔ、および１１２４Ａ→Ｇからなる群より選択される変異を検出するか、または、
−配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓからなる群の変異を検出することにより実施される、方法である。

好ましくは、前記第一および第二生体試料は、尿サンプルである。典型的には、工程ａ）とｂ）の両方は同じ尿サンプルで実施される。

好ましくは、前記方法は、工程ｂ）の後に、工程ｂ）で測定されたメチル化度を閾値と比較する工程ｂ’）であって、前記閾値が、膀胱がんに罹患しているか又は発症リスクのある患者と膀胱がんに罹患していない患者とを識別する工程をさらに含む。

好ましくは、ＦＧＦＲ３遺伝子中の前記変異の存在とＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のメチル化度を閾値と比較することが、膀胱がん発症リスクまたは膀胱がんの指標となる。

好ましくは、本発明の方法の工程ａ）は、ＴＥＲＴ遺伝子中の変異を検出する工程をさらに含み、前記検出は、
−配列番号３２のヌクレオチド番号を参照して示される変異７７Ｃ→Ｔおよび９９Ｃ→Ｔからなる群より選択される変異を検出することにより実施される。

好ましくは、本発明の方法の工程ｂ）には、
−配列番号３に示されるＳＥＰＴＩＮ９断片のメチル化度を測定し；
−配列番号４に示されるＳＬＩＴ２断片のメチル化度を測定し；
−配列番号５に示されるＴＷＩＳＴ１断片のメチル化度を測定し；および
−配列番号６に示されるＨＳ３ＳＴ２断片のメチル化度を測定する工程が存在する。

好ましくは、本発明の方法の工程ｂ）は、ＤＤＲ１遺伝子およびその断片または変異体のメチル化度を測定する工程をさらに含む。好ましくは、前記断片は配列番号７に示されている。

好ましくは、前記第一および第二生体試料は尿である。

好ましくは、本発明の工程ａ）は、アレル特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）により実施される。典型的には、工程ａ）は、配列番号８〜１３に示されるプライマーを使用して実施される。

好ましくは、本発明の方法の工程ｂ）は、定量的リアルタイム多重メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑｍ−ＰＣＲ）により実施される。典型的には、前記工程ｂ）は、ハウスキーピング遺伝子のメチル化度を測定する工程であって、前記ハウスキーピング遺伝子がアルブミン、β−アクチン、およびβ−グロビン、好ましくはアルブミン遺伝子またはその断片もしくは変異体から典型的に選択される工程をさらに含む。

定量的リアルタイム多重メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＭ−ＭＳＰ）の実行の説明。 膀胱がんを有する患者（＋）におけるＳ２４９Ｃ変異の検出に対する変異Ｓ２４９Ｃを有しない個人（−）におけるその検出。 ＲＯＣ曲線を利用する本発明の方法の特異度および感度の決定。 競合的アレル特異的ＴａｑＭａｎＰＣＲ（Ｃａｓｔ−ＰＣＲ）の実行の説明。 ロック型核酸（ＬＮＡ）技術のプローブの実行の説明。 ロック型核酸（ＬＮＡ）技術のプローブを野生型アレルを抑制するＭＧＢオリゴヌクレオチドブロッカーと組み合わせて実行することの説明。 ＱＭ−ＭＳＰを、非メチル化アレルを抑制するＭＧＢオリゴヌクレオチドブロッカーと組み合わせて実行することの説明。

本発明者らは、二つのアッセイの組み合わせ、つまり、
−ＦＧＲＦ３の特異的変異の検出に基づくアッセイ；および
−標的遺伝子のメチル化度の定量化に基づくアッセイ
が、超高感度および特異度を有する有望な膀胱がん検出法を提供することを示した。

従って、本発明の第一の観点は、被験者の膀胱がんまたは膀胱がん発症リスクの監視、診断、およびスクリーニング方法であって、前記方法は、
ａ）第一生体試料中で、ＦＧＦＲ３遺伝子の変異を検出する工程；ならびに
ｂ）前記被験者から得られる第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のメチル化度を測定する工程を含み、
前記工程ａ）は、
−配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２Ｃ→Ｔ、７４６Ｃ→Ｇ、１１１４Ｇ→Ｔ、および１１２４Ａ→Ｇからなる群より選択される変異を検出するか、または、
−配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓからなる群の変異を検出することにより実施される、方法に関する。

好ましくは、前記方法は、工程ｂ）の後に、工程ｂ）で測定されたメチル化度を閾値と比較する工程ｂ’）であって、前記閾値が、膀胱がんに罹患しているか又は発症リスクのある患者と膀胱がんに罹患していない患者とを識別する工程をさらに含む。

本発明の方法は、従って、患者の膀胱がん予後を効率的に予測する方法となる。前記方法は、従って、膀胱がん管理と共に新薬の臨床試験において患者を割り振るために容易に適用可能である。実際、前記方法は、
−再発の監視（つまり、膀胱がんに罹患しているとして既に診断された患者の経過観察）、
−患者の膀胱がんの初期診断、
−スクリーニング（つまり、膀胱がんの発症リスクのある集団の同定）を可能にする。

本明細書中に使用される「膀胱がんの発症リスクのある集団」には、
−喫煙者、
−各種化学物質に暴露される個人（特に、精錬所の現場、または、石油およびガス工業における人々）、
−慢性尿路感染症に罹患する個人、
−永続的に膀胱感染症（例、住血吸虫病）に罹患する個人が含まれる。

医師が、補助療法（つまり、追加療法）を措置するため及び／又はその療法により患者が治療されるべきかどうかを決めるために適切な治療方針を決定する目的で、本方法はその医師に重要な情報を提供する。

定義
用語「ＦＧＲＦ３」は、繊維芽細胞増殖因子受容体３の遺伝子を指す。前記遺伝子は、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードし、そのアミノ酸配列は、メンバー間で多種に渡り高く保存されている。ＦＧＦＲファミリーメンバーは互いに、そのリガンド親和性および組織分布が異なっている。代表的な全長タンパク質は、細胞外領域（三つの免疫グロブリン様ドメインから構成されるもの）、単一の疎水性膜貫通部分、および細胞質チロシンキナーゼドメインからなっている。そのタンパク質の細胞外部分は、繊維芽細胞増殖因子と相互作用し、下流シグナルカスケードを始動させ、最終的には細胞分裂と分化に影響を及ぼす。この特定のファミリーメンバーは、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖ホルモンに結合し、そして、骨の発生と維持に役割を演じる。この遺伝子中の変異は、頭蓋骨癒合症と複数のタイプの骨格形成異常を導く。三種類のオルターナティブスプライシングされた転写物バリアント（互いに異なるタンパク質アイソフォームをコードするもの）が記載されている。

用語「変異体」および「変異」は、遺伝子材料（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）、または任意のプロセスもしくはメカニズムにおける任意の検出可能な変化、あるいはそのような変化の結果を意味する。この用語には、遺伝子変異（遺伝子の構造（例、ＤＮＡ配列）の変化）、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、および改変遺伝子またはＤＮＡ配列により発現される任意の発現産物（例、タンパク質もしくは酵素）が含まれる。一般的に、被験者における変異の同定は、前記被験者に発現される核酸またはポリペプチド配列を、コントロール集団中で発現される対応する核酸またはポリペプチドと比較することにより行われる。遺伝子材料中の変異はまた、「サイレント」（つまり、変異が発現産物のアミノ酸配列の変化を生じないもの）である場合もある。

この文脈での適用例では、ＦＧＦＲ３遺伝子に同定される変異を、ＤｕｎｎｅｎとＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓの命名法（２０００年）に従って名づける。ＤｕｎｎｅｎとＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓにより核酸レベルで定義される置換を、「→」と記載する。例えば、「１４６３Ｔ→Ｃ」は、参照配列のヌクレオチド１４６３番のＴがＣへと変化したことを示す。その全長ゲノム配列が既知の場合、変異はそのゲノムを参照して得られるヌクレオチド番号により最適には示される。

本明細書中に使用される表現「標的変異」は、ＦＧＦＲ３遺伝子上の特定の変異を指し、それらは以下に定義される：
−配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２Ｃ→Ｔ、７４６Ｃ→Ｇ、１１１４Ｇ→Ｔ、および１１２４Ａ→Ｇ；または、
−配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓ。

本明細書中に使用される用語「被験者」は、膀胱がんの症状を有する個体および／または膀胱がんを有すると疑われる個体を指す。

本明細書中で使用される用語「がん」または「腫瘍」は、がんを引き起こす細胞の典型的性質（例、制御不能な増殖、不死化、転移能、早い成長および増殖速度、ならびにある種の特徴のある形態的特徴）を有する細胞の存在を指す。好ましくは、がんは膀胱がんである。

本明細書中で使用される用語「患者」は、哺乳動物（例、齧歯類、ネコ科、イヌ科、および霊長目の動物）を示す。好ましくは、本発明に係る患者はヒトである。

本明細書中で使用される用語「補助療法」は、転移リスクのある及び／又は再発の可能性があるがんに罹患する患者において、通常、原発性腫瘍の外科切除後の追加的治療として与えられる任意のタイプのがん治療を指す。そのような補助治療の目的は、予後を改善することである。補助療法には、放射線治療および療法（好ましくは、全身性療法（例、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、およびモノクローナル抗体療法））が含まれる。

本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、特異的タンパク質を発現する核酸断片であって、コード配列の前（５’非コード配列）と後（３’非コード配列）に制御配列を含むものを指す。

本明細書中で使用される表現「目的遺伝子」は、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２遺伝子およびその断片または変異体を指す。

本明細書中で使用される用語「遺伝子発現レベル」または「遺伝子の発現レベル」は、転写産物（例、ｍＲＮＡ）の量または濃度、あるいは、翻訳産物（例、タンパク質またはポリペプチド）の量または濃度を指す。典型的には、ｍＲＮＡの発現レベルは、単位（例、細胞当たりの転写物数または組織１マイクログラム当たりのナノグラム）で表現可能である。ポリペプチドのレベルは、例えば、組織１マイクログラム当たりのナノグラムまたは培養培地１ミリリットル当たりのナノグラムとして表現可能である。また、相対単位を使用して発現レベルを記載することもできる。

本明細書中で使用される表現「ｍＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じるが、イントロンの無い産物であって、細胞によりポリペプチドへと翻訳可能なものを指す。

本明細書中で使用される用語「生体試料」は、インビトロでの評価目的で得られる任意の生体試料を指す。典型的には、前記生体試料は固形組織および腫瘍組織から取得可能である。追加的な試験サンプルの例には、尿、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、唾液、関節液、および脳脊髄液（ＣＲＬ）が含まれる。好ましくは、前記生体試料は尿である。典型的には、尿は、腫瘍に由来する材料（例、腫瘍細胞あるいは再発腫瘍由来のタンパク質および／または核酸）を含む場合がある。典型的には、前記第一および第二生体試料は同一または互いに異なる生体試料である。

本明細書中で使用される表現「遺伝子の発現レベルを測定する」は、転写産物（好ましくは、前記遺伝子の転写を通して得られるｍＲＮＡ）の量を測定する工程、および／または、翻訳産物（好ましくは、前記遺伝子の翻訳を通して得られるタンパク質）の量を測定する工程を含む。好ましくは、遺伝子の発現を測定する工程は、前記遺伝子の転写を通して得られるｍＲＮＡの量を測定する工程を指す。典型的には、前記遺伝子（複数可）の遺伝子発現レベルを測定する工程ａ）を、当業者に周知の日常的な技術に従って実施してもよい。

「膀胱がんをスクリーニングすること」は、膀胱がんを発症する素因の検出および被験者に既に存在する膀胱がんの検出を意味する。

「メチル化」は、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンの炭素５位上にメチル基を付加することを意味する。これらのジヌクレオチドは、ＣｐＧ「島」中を除いては、ＤＮＡ構造中に頻繁には起こらない。これらの島は、典型的には、遺伝子のプロモーター領域のレベルで意義がある。従って、我々が遺伝子のメチル化を議論する場合、我々は前記遺伝子のプロモーター領域のメチル化のことを言っている。正確な部位にメチル基が存在すると、遺伝子と転写因子との間の相互作用が阻害される。典型的には、メチル基は、転写因子が増幅部位およびプロモーターに結合するのを妨げ、そして、ＲＮＡポリメラーゼが開始部位に結合するのを阻止する。従って、プロモーター領域のメチル化はＤＮＡ転写の抑制を導く。

表現「遺伝子のメチル化」は、遺伝子のヌクレオチド配列のＣｐＧ島のメチル化を含み、また、前記表現が適用される遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列のメチル化も含む。

「遺伝子の断片」は、前記遺伝子の配列であって、その長さが少なくとも５０塩基対、好ましくは、その長さは６０〜１２０塩基対である。

ＦＧＦＲ３遺伝子中の特異的変異の検出
本発明の方法は、第一生体試料中で、ＦＧＦＲ３遺伝子の変異を検出する工程ａ）を含み、前記工程ａ）は、
−配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２Ｃ→Ｔ、７４６Ｃ→Ｇ、１１１４Ｇ→Ｔ、および１１２４Ａ→Ｇからなる群より選択される変異を検出するか、または、
−配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓからなる群の変異を検出することにより実施される、方法である。

好ましくは、前記工程ｂ）は、前記被験者から得られる第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも二つの遺伝子、好ましくは少なくとも三つの遺伝子のメチル化度を測定する工程である。

より好ましくは、前記工程ｂ）は、前記被験者から得られる第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体の全ての遺伝子のメチル化度を測定する工程である。

好ましくは、前記第一および生体試料は同一の生体試料である。好ましくは、工程ａ）は、配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される７４６Ｃ→Ｇ、１１１４Ｇ→Ｔ、および１１２４Ａ→Ｇからなる群より選択される変異、または、配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓを検出する工程である。

典型的には、標的変異の検出を、ＤＮＡ配列上、ｍＲＮＡ転写物上、またはタンパク質配列上で実施する場合がある。より好ましくは、標的変異の検出を、重亜硫酸塩で処理したＤＮＡ配列上で実施してもよい。

好ましくは、検出するＦＧＦＲ３変異は、
配列番号１（ＦＧＦＲ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指すもの）のヌクレオチド番号を参照して示される変異
−７４２Ｃ→Ｔ、
−７４６Ｃ→Ｇ、
−１１１４Ｇ→Ｔ、および
−１１２４Ａ→Ｇ
からなる群より選択される。配列番号１は、アクセション番号ＮＭ＿００１１６３２１３．１（ＮＣＢＩリファレンス配列）としてオンライン上で利用可能な配列の断片である。配列番号１は、配列番号２で記載されるアミノ酸配列をコードする。

配列番号１では、７４２位のヌクレオチドはシトシンである。変異７４２Ｃ→Ｔは、７４２位の前記シトシンがチミンにより置換されたものからなっている。前記変異は、配列番号１を参照して示される２４８位にアルギニンの代わりにシステインを含むタンパク質を導く。

配列番号１では、７４６位のヌクレオチドはシトシンである。変異７４６Ｃ→Ｇは、７４６位の前記シトシンがグアニンにより置換されたものからなっている。前記変異は、配列番号１を参照して示される２４８位にセリンの代わりにシステインを有するタンパク質を導く。

配列番号１では、１１１４位のヌクレオチドはグアニンである。変異１１１４Ｇ→Ｔは、前記グアニンがチミンにより置換されたものからなっている。前記変異は、配列番号１を参照して示される３７２位にグリシンの代わりにシステインを有するタンパク質を導く。

配列番号１では、１１２４位のヌクレオチドはアデニンである。変異１１２４Ａ→Ｇは、前記アデニンがグアニンにより置換されたものからなっている。前記変異は、配列番号１を参照して示される３７５位にチロシンの代わりにシステインを有するタンパク質を導く。

第一実施形態によると、前記変異を、ＦＧＦＲ３核酸分子を解析することにより検出する場合がある。

本発明の文脈では、「ＦＧＦＲ３核酸分子」には、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡが含まれる。ＦＧＦＲ３変異を、好ましくは増幅後のＲＮＡまたはＤＮＡサンプル中で検出してもよい。

ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖である場合がある。これらは、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーションおよび／または増幅による検出のために利用可能である。核酸サンプルは、任意の細胞供給源または組織生検材料から取得可能である。利用可能な細胞供給源の非限定例には、限定はされないが、血液細胞、口腔細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、または、生検により得られる組織中に存在する任意の細胞が含まれる。細胞はまた、体液（例、尿、血液、血漿、血清、リンパ液等）から取得可能でもある。好ましくは、細胞を尿サンプルから得る。

ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）に記載されるように、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して抽出して得てもよい。ＲＮＡは、例えば、組織生検材料から、当業者に周知の標準的方法（例、チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出）を使用して単離可能でもある。

単離したＲＮＡを、逆転写と増幅の組み合わせ（例、逆転写と、変異部位に特異的であるか、または、その変異部位を含む領域の増幅を可能にする特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅との組合せ）に供する場合がある。

典型的には、プライマーアニーリングの条件は、（適切な場合であるが）特異的な逆転写および増幅を保証するように選択可能である。従って、増幅産物の出現が特定のＦＧＦＲ３変異の存在の診断法となる。

一方、ＲＮＡを逆転写および増幅する場合がある。または、ＤＮＡを増幅してもよい。その後、変異部位は、適切なプローブを用いるハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンシング、または当該分野で既知の任意の他の適切な方法により、増幅した配列中に検出可能である。例えば、ＲＮＡから得たｃＤＮＡをクローニング、そして、配列決定して、ＦＧＦＲ３配列中の変異を同定してもよい。

遺伝子型解析用の多数の方法が利用可能である（Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓら、１９８９年；Ｃｏｏｐｅｒら、１９９１年；Ｇｒｏｍｐｅ、１９９３年）。手短に言うと、核酸分子を、制限酵素切断部位の存否に関して試験する場合がある。塩基置換変異が制限酵素の認識部位を創出または消滅させる場合、その変異に関するシンプルな直接的ＰＣＲ試験が可能になる。その他の方法には、限定はされないが、ダイレクトシークエンシング、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析；アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、適切にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で完全マッチする配列にのみハイブリダイズする短い合成プローブであるものとのハイブリダイゼーション；アレル特異的ＰＣＲ；変異原性プライマーを用いるＰＣＲ；リガーゼ−ＰＣＲ、ＨＯＴ切断；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）；温度変性勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）、および変性高速液体クロマトグラフィー（Ｋｕｋｌｉｎら、１９９７年）が含まれる。ダイレクトシークエンシングはまた、任意の方法（限定はされないが、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法を使用する化学的シークエンシング；Ｓａｎｇｅｒ法を使用する酵素的シークエンシング；質量分析法によるシークエンシング；チップ系技術を使用するシークエンシング；およびリアルタイム定量ＰＣＲを含むもの）により実現可能である。好ましくは、被験者からのＤＮＡを、特異的増幅プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、まず増幅にかける。

しかしながら、いくつかの他の方法（例、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ、または、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ））が利用可能で、ＰＣＲとは独立してＤＮＡを試験することを可能にする。ＯＬＡは、塩基置換変異を明らかにするために使用可能である。この方法によれば、変異位置に位置する連結部を有する、標的核酸中の隣接する配列にハイブリダイズする二つのオリゴヌクレオチドを構築する。ＤＮＡリガーゼは、それら二つのオリゴヌクレオチドが完全にハイブリダイズする場合にだけ、それら二つのオリゴヌクレオチドを共有的に連結する。

好ましくは、本発明の方法の工程ａ）は、アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳ−ＰＣＲ）により実施可能である。

本明細書中で使用される「アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応」（ＡＳ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の特定の実施形態であって、エチジウムブロマイドで染色したアガロースまたはポリアクリルアミドゲル中でＰＣＲ産物を解析することにより、ヒトＤＮＡの任意の点変異を直接検出可能にするものを指す。ＡＳ−ＰＣＲが作動する理由は、ＤＮＡ鋳型と３’ミスマッチを形成するオリゴヌクレオチドプライマーが、テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長ができないからだ。従って、全ての既知のアレルに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを合成および使用して、ゲノム型が不明のＤＮＡ中のアレルを検出することができる。

基本的に、ＡＳ−ＰＣＲ技術の基礎となる一般的原理は、従って、特異的変異アレルを優先的に増幅させる変異特異的プライマーの設計をすることである。

ＡＳ−ＰＣＲ法の実施のため、以下に定義されるプライマーを使用してもよい。
−特異的蛍光色素（例、６ＦＡＭ、ＨＥＸ、およびＴＥＴ）で５’にタグを付けたフォワードプライマー（配列番号８および１１）を一つ、ならびに、
−ロック型核酸技術で３’を修飾したヌクレオチドが存在するリバースプライマー（配列番号９、１０、１２、および１３）一つ。

本明細書中で使用される表現「ロック型核酸技術により修飾されたヌクレオチド」または「ＬＮＡにより修飾されたヌクレオチド」は、短いか又は非常に類似する配列を試験する場合に理想的であるオリゴヌクレオチドを指す。ＬＮＡオリゴヌクレオチドはその相補配列へのアフィニティーが高いので、古典的なＤＮＡオリゴヌクレオチドに比較すると、特異性が劇的に改善する。そして、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、単一のヌクレオチドが異なる配列間を識別するのに使用され、そのことは多くの実験の成功に重要となる場合がある。実際、標準的塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）と共に使用する場合、ＬＮＡを使用して合成されるプローブの温度安定性は従来のＤＮＡまたはＲＮＡよりも高く、従って、そのプローブはその相補配列とより強い結合を形成する。

典型的には、ＦＧＦＲ３変異を検出する場合、表１に開示するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用することができる。

表１中のアスタリスクで注記したヌクレオチドは、ＬＮＡ技術により修飾されている。表１に示すように、添付した配列リストに示される配列番号８〜１３は、特異的蛍光色素（例、６ＦＡＭ、ＨＥＸ、およびＴＥＴ）で５’にタグを付けられているか、または、ロック型核酸技術により３’が修飾されたヌクレオチドが存在する。

典型的には、本発明の方法の工程ａ）においてＡＳ−ＰＣＲを実行する場合、内部コントロール（例、ハウスキーピング遺伝子）を使用してもよい。

好ましくは、前記ハウスキーピング遺伝子は、アルブミン、β−アクチン、およびβ−グロビンまたはその断片および変異体からなる群より選択される。好ましくは、前記ハウスキーピング遺伝子は、β−グロビンまたはその断片および変異体である。より好ましくは、内部コントロールは、ハウスキーピング遺伝子の断片、さらに好ましくはβ−グロビンの断片である。典型的には、前記断片は配列番号３１に示されるヌクレオチド配列である。

この目的のため、以下のプライマーを使用することもできる。
−フォワードＦＧＬＯ：５’ＨＥＸ−ＣＣＴ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＴＧ Ａ３’（配列番号１４）；および
−リバースＲＧＬＯ：５’ＧＴＴＧＴＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＴ３’（配列番号１５）。

好ましくは、本発明の工程ａ）は、以下の二つのＰＣＲを使用するアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳ−ＰＣＲ）により実施可能である。
−配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２Ｃ→Ｔおよび１１１４Ｇ→Ｔとβ−グロビンを検出するＰＣＲ１；
−配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２２Ｃ→Ｇおよび１１２４Ａ→Ｇとβ−グロビンを検出するＰＣＲ２。

第二実施形態によれば、ＦＧＦＲ３遺伝子中の前記変異をタンパク質レベルで検出する場合がある。従って、本発明に係るＦＧＦＲ変異は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓからなる群より選択される。前記変異は、当該技術分野で既知の適切な方法に従って検出可能である。特に、被験者から得られる試料（例、組織生検材料）を、ＦＧＦＲ３の変異型に特異的な抗体（つまり、ＦＧＦＲ３の変異型と野生型タンパク質（または任意の他のタンパク質）とを識別することができる抗体）と接触させて、その抗体により特定されるＦＧＦＲ３の存否を決定してもよい。特異的に変異型ＦＧＦＲ３を認識する抗体はまた、本発明の一部を成す。その抗体は変異型ＦＧＦＲ３に特異的である、つまり、野生型ＦＧＦＲ３とは交差反応しない。

本発明の抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、単鎖抗体もしくは二本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、免疫グロブリン分子の部分（当該技術分野で、抗原結合断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ｖ）として知られるこれら部分を含むもの）であってもよい。それらはまた、例えば、毒素と免疫結合体をなしてもよいし、または標識抗体である場合がある。

ポリクローナル抗体を使用する場合もあるが、モノクローナル抗体が好ましい。というのも、モノクローナル抗体はより長く再生産できるからだ。「ポリクローナル抗体」の作製手順もまた、周知である。ポリクローナル抗体は、適切な抗原（例えば、当業者が周知の標準的方法にしたがって遺伝子工学により作製可能なもの）を免疫した動物の血清から得ることができる。典型的には、そのような抗体は、ウサギ（ニュージーランドホワイト）に変異型ＦＧＦＲ３を皮下投与することにより作製可能であり、そのウサギは、最初に血液を採取して免疫前血清を得ておく。抗原を、異なる６箇所に１箇所当たり総容量１００μｌで注射する場合がある。各注射物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質またはポリペプチドを含む粉末化したアクリルアミドゲルと共に又はそれ無しにアジュバントを含んでもよい。ウサギは、その後、第一回目の注射後２週間で採血し、そして、６週間ごとに３回、同じ抗原で周期的にブーストする。血清サンプルを、その後、各ブースト後１０日目に回収する。ポリクローナル抗体を、その後、対応する抗原を使用して抗体を捕獲するアフィニティークロマトグラフィーにより、血清から回収する。ポリクローナル抗体作製のこの手順および他の手順は、Ｈａｒｌｏｗら（１９８８年）に開示されており、本明細書中では参考資料として取り込まれる。

標準的語法の各種形態での「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープと免疫反応することができる抗体組合せ部位のたった一つの種を含む抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体は、従って、典型的には免疫反応する任意のエピトープへの単一の結合親和性を呈する。モノクローナル抗体は、従って、複数の抗体組合せ部位（各部位は、異なるエピトープに対して免疫学的に特異的である）を有する抗体（例、二重特異性モノクローナル抗体）を含む場合がある。歴史的には、モノクローナル抗体はクローンとして純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の不死化により生産されてきたが、モノクローン的に純粋な抗体分子集団はまた、本発明の方法でも調製可能である。モノクローナル抗体調製の実験室的方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗら（１９８８年）を参照されたい）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ヒト等の哺乳動物）に精製変異型ＦＧＦＲ３を免疫することにより調製してもよい。免疫した哺乳動物中の抗体生産細胞を単離して、そして、ミエローマ細胞またはヘテロミエローマ細胞と融合させて、ハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）を作製する。モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を、所望のモノクローナル抗体の供給源として活用する。ハイブリドーマ培養のこの標準的方法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）に記載されている。

ｍＡｂはハイブリドーマの培養により生産可能であるが、本発明はそのようなものに限定されることはない。また、考えられるのは、本発明のハイブリドーマからクローニングされる核酸を発現させることにより生産されるｍＡｂを使用することである。つまり、本発明のハイブリドーマにより分泌される抗体分子を発現する核酸を、別の細胞株へと移して、形質転換体を作製してもよい。形質転換体は、元のハイブリドーマとは遺伝子型が異なるが、本発明の抗体分子（ハイブリドーマにより分泌される抗体分子に対応する抗体分子全体の中の免疫学的に活性のある断片を含む）を生産することができる。例えば、Ｒｅａｄｉｎｇの米国特許第４，６４２，３３４号；ＰＣＴ公開番号；Ｗｉｎｔｅｒらのヨーロッパ特許公開第０２３９４００号、Ｃａｂｉｌｌｙらの第０１２５０２３号を参照されたい。

免疫処置に関与しない抗体生成技術として考えらえる例には、また、ファージディスプレイ技術を使用して、（非免疫処置動物由来の）ナイーブライブラリを検証することなどがある。Ｂａｒｂａｓら（１９９２年）およびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３年）を参照されたい。

変異型ＦＧＦＲ３に対して作製された抗体は、野生型ＦＧＦＲ３と交差反応する場合もある。従って、変異型ＦＧＦＲ３に対して特異的な抗体を選抜することが必要だ。このことは、例えば、野生型ＦＧＦＲ３に対するアフィニティークロマトグラフィーに作製した抗体を掛けることにより、野生型ＦＧＦＲ３と反応性のあるものを抗体のプールから枯渇させることにより実現可能である。

また、抗体以外の結合剤を、本発明の目的のために使用してもよい。これらの結合剤には、例えば、アプタマー（分子認識に関して抗体の代替手段となる分子クラス）がある。アプタマーは、ほぼ任意のクラスの標的分子を高親和性および特異性で認識する能力のあるオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、Ｔｕｅｒｋ ＣとＧｏｌｄ Ｌ．（１９９０年）に記載されるように、ランダム配列ライブラリからＳＥＬＥＸ法により単離可能である。ランダム配列ライブラリは、ＤＮＡをコンビナトリアルケミストリー的に合成することにより取得可能である。このライブラリでは、各メンバーはユニークな配列の直線的オリゴマーであり、最終的には化学修飾される。このクラスの分子の可能な修飾、用途、および利点については、Ｊａｙａｓｅｎａ Ｓ．Ｄ．（１９９９年）によるレビューが出版されている。基礎となるタンパク質（例、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）チオレドキシンＡ）により提示される立体構造的に折りたたまれた抗体可変領域からなるペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリから選択される（Ｃｏｌａｓら（１９９６年））。

本発明のプローブ、プライマー、アプタマー、または抗体を、検出可能な分子または物質（例、蛍光分子、放射性分子、または当該技術分野で既知の任意の他の標識）で標識する場合がある。一般的にシグナルを（直接的または間接的のいずれかで）提供する標識は、当該技術分野で公知である。本発明のプローブ、プライマー、アプタマー、または抗体に関する用語「標識される」は、本発明のプローブ、プライマー、アプタマー、または抗体に検出可能な物質を連結（つまり、物理的にリンク）することにより、本発明のプローブ、プライマー、アプタマー、または抗体を直接的に標識すること、ならびに、直接標識されている別の試薬と反応させることにより本発明のプローブ、プライマー、アプタマー、または抗体を間接的に標識することを含むことを意図している。検出可能な物質の他の例には、限定はされないが、放射性剤またはフルオロフォア（例、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、またはインドシアニン（Ｃｙ５））が含まれる。間接的に標識することの例には、蛍光標識二次抗体を使用して一次抗体を検出すること、および、ＤＮＡプローブの末端をビオチンで標識して蛍光標識ストレプトアビジンで検出可能にするようにすることが含まれる。本発明の抗体またはアプタマーを、当該技術分野で既知の任意の方法により放射性分子で標識する場合がある。例えば、放射性分子には、限定はされないが、シンチグラフィー試験用の放射性原子（例、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８）が挙げられる。

好ましくは、本発明の方法の工程ａ）は、ＴＥＲＴ遺伝子中の変異を検出する工程をさらに含み、前記検出は、
−配列番号３２のヌクレオチド番号を参照して示される変異７７Ｃ→Ｔおよび９９Ｃ→Ｔからなる群より選択される変異を検出することにより実施される。

前記変異は、Ｙｖｅｓ Ａｌｌｏｒｙらの刊行物「Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ：Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ａｃｒｏｓｓ Ｓｔａｇｅｓ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ，ａｎｄ Ｌａｃｋ ｏｆ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｕｔｃｏｍｅ（膀胱がんにおける逆転写酵素テロメラーゼのプロモーター変異：ステージを通して高頻度で起こること、尿中での検出、および治療成績との関連性の欠如）」、ヨーロッパ泌尿器学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｌｏｇｙ）に開示されてる。

用語「ＴＥＲＴ」は、逆転写酵素テロメラーゼ遺伝子を指す。その配列は、アクセション番号ＮＣ＿０００００５．９として利用可能である。

本発明の文脈では、明確にするためにではあるが、特異的変異を、配列番号３２で示されるＴＥＲＴの特異的断片を参照して定義する。前記断片は、アクセション番号ＮＣ＿０００００５．９として利用可能な配列の１，２９５，３０１〜１，２９５，１５２位に対して相補的なリバース配列に対応する。

上記ＴＥＲＴ遺伝子を参照して示される変異１，２９５，２２８Ｃ→Ｔは、配列番号３２を参照して示される変異７７Ｃ→Ｔに対応する。

上記ＴＥＲＴ遺伝子を参照して示される変異１，２９５，２５０Ｃ→Ｔは、配列番号３２を参照して示される変異９９Ｃ→Ｔに対応する。

これらの変異は、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモーターに存在する。より正確には、変異１，２９５，２２８Ｃ→Ｔおよび１，２９５，２５０Ｃ→Ｔは、ＴＥＲＴ遺伝子プロモーターの翻訳開始部位から−１２４位および−１４６位上の特異的変異に対応する。

典型的には、ＴＥＲＴ変異を検出する場合、一つのケースでは、以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用する。
フォワードＴＥＲＴ：５’ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ３’（配列番号３３）
リバースＴＥＲＴ：５’ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＡＣ ＴＣＧ３’（配列番号３４）

有用なプローブは、相補的なオリゴである。ＴＥＲＴ遺伝子中の前記特異的変異を検出するための適切な配列を、以下の表にまとめる。

目的遺伝子のメチル化度の測定
本発明の方法は、前記被験者から得られる生体試料中の第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のメチル化度を測定する工程ｂ）をさらに含む。

本発明者らは、１８種類の遺伝子のメチル化とがん形成（特に膀胱がん）でのその役割を調べた。本発明者らは、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２のメチル化が、膀胱がんの診断に非常に有望であることを見出した。ＦＧＦＲ３の特異的変異を検出するアッセイと、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２遺伝子のメチル化を測定するアッセイとの両方の使用が、前記診断方法の特異度および感度に関して予想外の結果を提供する。

「ＳＥＰＴＩＮ９」または「ＳＥＰＴ９」は、セプチンと呼ばれるタンパク質群の一部である。セプチンは細胞質分裂（細胞内の液（サイトプラズム）が分裂して二つの別々の細胞を形成する際の細胞分裂工程）と呼ばれるプロセスに関与する。セプチン−９タンパク質はまた、がん抑制遺伝子として作用するように見える（その意味は、セプチン−９が細胞増殖を制御し、そして細胞が早く分裂しすぎないようにするか、または、制御不能な様式で分裂しないようにすることである）。ヒトＳＥＰＴ９遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセション番号ＥＮＳＧ０００００１８４６４０としてオンライン上で利用可能である。本発明のある状況では、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号３で示されるＳＥＰＴＩＮ９断片のメチル化を検出する工程からなっている。代替的には、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号３との同一性パーセンテージが少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のＳＥＰＴＩＮ９変異体のメチル化を検出する工程からなっている。

「ＳＬＩＴ２」は、スリットホモログ２をコードする。ヒトＳＬＩＴ２遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセション番号ＥＮＳＧ０００００１４５１４７としてオンライン上で利用可能である。本発明のある状況では、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号４で示されるＳＬＩＴ２断片のメチル化を検出する工程からなっている。代替的には、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号４との同一性パーセンテージが少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のＳＬＩＴ２変異体のメチル化を検出する工程からなっている。

「ＴＷＩＳＴ１」は、ツイスト ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子１をコードする。ヒトＴＷＩＳＴ１遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセション番号ＥＮＳＧ０００００１２２６９１としてオンライン上で利用可能である。本発明のある状況では、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号５で示されるＴＷＩＳＴ１断片のメチル化を検出する工程からなっている。代替的には、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号５との同一性パーセンテージが少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のＴＷＩＳＴ１変異体のメチル化を検出する工程からなっている。

「ＨＳ３ＳＴ２」は、ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ２をコードする。ヒトＨＳ３ＳＴ２遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセション番号ＥＮＳＧ０００００１２２２５４としてオンライン上で利用可能である。本発明のある状況では、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号６で示されるＨＳ３ＳＴ２断片のメチル化を検出する工程からなっている。代替的には、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号６との同一性パーセンテージが少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のＨＳ３ＳＴ２変異体のメチル化を検出する工程からなっている。

「ＤＤＲ１」は、ジスコイジンドメイン受容体型チロシンキナーゼ１をコードする。ヒトＤＤＲ１遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセション番号ＥＮＳＧ０００００２０４５８０としてオンライン上で利用可能である。本発明のある状況では、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号７で示されるＤＤＲ１断片のメチル化を検出する工程からなっている。代替的には、本発明の方法の工程ｂ）は、配列番号７との同一性パーセンテージが少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のＤＤＲ１変異体のメチル化を検出する工程からなっている。

試料中での目的遺伝子のメチル化度の測定は様々な手段により実行可能である。本発明に係るメチル化度の測定に適する方法の非限定例には：
−メチル化特異的ＰＣＲ；
−リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ；
−ピロシーケンス；
−メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパクを使用するＰＣＲ、定量ＰＣＲ、およびＤＮＡチップアッセイ；
−メチル化の差異の検出−メチル化感受性制限酵素；
−メチル化の差異の検出−重硫酸塩を用いる配列決定法；
−メチル化感受性一本鎖立体構造解析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）；
−高分解能溶融解析（ＨＲＭ）；
−メチル化感受性一塩基プライマー伸長（ＭＳ−ＳｎｕＰＥ）；
−塩基特異的切断；および
−マイクロアレイベースの方法、がある。

一つの実施形態では、工程ｂ）をメチル化特異的ＰＣＲにより実行する。重亜硫酸塩で処理したゲノムＤＮＡでメチル化特異的ＰＣＲするという特異的方法を使用する場合、もしメチル化されている場合は５’−ＣｐＧ’−３’領域はインタクトのままであるが、メチル化されていない場合はそのシトシンはウラシルへと変化する。従って、重亜硫酸塩処理後に変換された塩基配列に基づいて、５’−ＣｐＧ−３’塩基配列を有する領域に対応するＰＣＲプライマーセットを構築する。本明細書中では、構築されるプライマーセットは、二種類のプライマーセット（メチル化塩基配列に対応するプライマーセットと非メチル化塩基配列に対応するプライマーセット）である。ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩を用いて変換し、その後、上記二種類のプライマーセットを使用するＰＣＲにより増幅する場合、ゲノムＤＮＡがメチル化されていた場合は、メチル化塩基配列に対応するプライマーを使用するＰＣＲ混合物中に、ＰＣＲ産物が検出される。しかし、もしゲノムＤＮＡがメチル化されていなかった場合、非メチル化のものに対応するプライマーを使用するＰＣＲ混合物中にそのゲノムＤＮＡが検出される。このメチル化は、アガロースゲル電気泳動により定量解析可能である。

一つの実施形態では、工程ｂ）をリアルタイムメチル化特異的ＰＣＲにより実行する。リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲは、メチル化特異的ＰＣＲ法を改変したリアルタイム測定法であり、重亜硫酸塩でゲノムＤＮＡを処理する工程、メチル化塩基配列に対応するＰＣＲプライマーを設計する工程、およびそのプライマーを使用してリアルタイムＰＣＲを実行する工程を含む。ゲノムＤＮＡのメチル化を検出する方法には、二つの方法が含まれる：増幅塩基配列に相補的なＴａｎＭａｎプローブを使用する検出方法；およびＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎを使用する検出方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲでは、メチル化ＤＮＡの選択的定量解析が可能である。本明細書中では、インビトロでメチル化したＤＮＡサンプルを使用して検量線をプロットし、塩基配列中に５’−ＣｐＧ−３’配列を含まない遺伝子を標準化のためのネガティブコントロールとして増幅に掛けて、メチル化度の定量解析を行うこともある。

一つの実施形態では、工程ｂ）をピロシーケンスにより実行する。ピロシーケンス法は、重亜硫酸塩を用いる配列決定法を改変した定量的リアルタイム配列決定法である。重亜硫酸塩を用いる配列決定法と類似して、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩処理により変換し、その後、５’−ＣｐＧ−３’塩基配列を含まない領域に対応するＰＣＲプライマーを構築する。具体的には、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩で処理し、ＰＣＲプライマーを使用して増幅し、その後、配列決定用プライマーを使用してリアルタイム塩基配列解析に掛ける。メチル化度を、５’−ＣｐＧ−３’領域中のシトシンとチミンの量を解析することによりメチル化インデックスとして表す。

一つの実施形態では、工程ｂ）を、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパクを使用するＰＣＲ、定量ＰＣＲ、およびＤＮＡチップアッセイにより実行する。メチル化ＤＮＡにのみ特異的に結合するタンパク質をＤＮＡと混合する場合、そのタンパク質はメチル化ＤＮＡにのみ特異的に結合する。従って、メチル化特異的結合タンパクを使用するＰＣＲ、または、ＤＮＡチップアッセイのいずれかは、メチル化ＤＮＡだけを選択的に単離することを可能にする。ゲノムＤＮＡをメチル化特異的結合タンパク質と混合し、その後、メチル化ＤＮＡだけを選択的に単離した。単離ＤＮＡをプロモーター領域に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し、その後、ＤＮＡのメチル化をアガロースゲル電気泳動により測定する。

また、ＤＮＡのメチル化はまた、定量ＰＣＲ法により測定可能である。そして、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いて単離したメチル化ＤＮＡは蛍光プローブで標識可能であり、相補的プローブを含むＤＮＡチップにハイブリダイズさせて、それによりＤＮＡのメチル化を測定することもできる。本明細書中では、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質は、限定はされないが、ＭｃｒＢｔである場合がある。

一つの実施形態では、工程ｂ）をメチル化感受性制限酵素により実行する。メチル化差異の検出は、核酸サンプルをメチル化感受性制限酵素（非メチル化ＣｐＧ部位のみを切断するもの）と接触させることにより実現可能である。別反応で、そのサンプルをさらに、メチル化および非メチル化ＣｐＧ部位の両方を切断するメチル化感受性制限酵素アイソシゾマーと接触させて、それによりメチル化核酸を切断する。

特異的プライマーをその核酸サンプルに加えて、そして、その核酸を従来法により増幅する。メチル化感受性制限酵素で処理したサンプル中で増幅産物が存在するが、メチル化感受性制限酵素アイソシゾマーで処理したサンプル中で増幅産物が存在しないことは、メチル化が試験した核酸領域で起こっていたことを示す。しかしながら、メチル化感受性制限酵素で処理したサンプル中で増幅産物が存在せず、メチル化感受性制限酵素アイソシゾマーで処理したサンプル中でも増幅産物が存在しないことは、メチル化が試験した核酸領域で起こっていなかったことを示す。本明細書中で使用する用語「メチル化感受性制限酵素」は、ＣＧをその認識部位の一部として含み、および、Ｃがメチル化されていない場合に比べＣがメチル化されている場合に活性がある制限酵素（例、ＳｍａＩ）を指す。メチル化感受性制限酵素の非限定例には、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、およびＮｏｔＩが含まれる。そのような酵素は単独または組み合わせて使用可能である。他のメチル化感受性制限酵素の例には、限定はされないが、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩが含まれる。

メチル化感受性制限酵素アイソシゾマーは、メチル化感受性制限酵素と同じ認識部位を認識するが、メチル化ＣＧおよび非メチル化ＣＧの両方を切断する制限酵素である。その例には、ＭｓｐＩが含まれる。

一つの実施形態では、工程ｂ）を、重硫酸塩を用いる配列決定法により実行する。この方法でのメチル化ＣｐＧ含有核酸検出は、核酸含有サンプルを、非メチル化シトシンを修飾する薬剤と接触させる工程；および、そのサンプル中のＣｐＧ含有核酸を、ＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する工程を含み、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、修飾後メチル化核酸と非メチル化核酸とを識別し、そして、メチル化核酸を検出する。増幅工程はオプションであるが望ましい、しかし、必要不可欠ではない。この方法はＰＣＲ反応に依存して、修飾後（例、化学修飾後）のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを識別する。そのような方法は、メチル化核酸検出用の重亜硫酸塩を用いる配列決定法に関連する米国特許第５，７８６，１４６号に記載されている。

改良型診断方法
好ましくは、工程ａ）と工程ｂ）の両方を、同じ生体試料上で実施する。より好ましくは、前記工程ａ）と工程ｂ）を、同じ核酸材料、好ましくは同じＤＮＡ上で実施する。さらに好ましくは、前記ＤＮＡは、重亜硫酸塩処理済みＤＮＡである。従って、より好ましい実施形態では、前記工程ａ）と工程ｂ）を、患者の同一ＤＮＡ（事前に重亜硫酸塩で処理したもの）上で実施する。典型的には、工程ａ）と工程ｂ）を、同時に実施する。

この特異的実施形態では、工程ａ）は：
−重亜硫酸塩処理済みの配列番号１に示される配列の７４６位のグアニン（Ｇ）；
−重亜硫酸塩処理済みの配列番号１に示される配列の１１１４位のチミン（Ｔ）；および／または
−重亜硫酸塩処理済みの配列番号１に示される配列の１１２４位のグアニン（Ｇ）の存在を決定する工程である。

前記変異は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓに対応する。

従って、一つの好ましい実施形態では、工程ａ）は、配列番号１に示される配列の重亜硫酸塩処理済みＤＮＡバージョン上のＦＧＦＲ３遺伝子変異を検出する工程である。

本明細書中に使用される表現「配列番号１に示される配列の重亜硫酸塩処理済みＤＮＡバージョン」は、重亜硫酸塩処理済みのＦＧＦＲ３遺伝子配列を指す。重亜硫酸塩を用いるＤＮＡの処理により、シトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は影響を受けない。従って、重亜硫酸塩処理は、ＤＮＡ配列の特異的変化であって、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存するものを導入し、ＤＮＡ部分のメチル化状態に関する単一ヌクレオチド分解能の情報を与える。

従って、配列番号１に示される配列の重亜硫酸塩処理済みＤＮＡバージョンは、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化シトシンを除く全てのシトシンがウラシルで置換された配列である。

この特異的実施形態では、工程ａ）は、配列番号１に示される配列であって重硫酸塩処理後のものの
７４６位のグアニン（Ｇ）の存在；
１１１４位のチミン（Ｔ）の存在；および／または
１１２４位のグアニン（Ｇ）の存在を決定する工程からなる。

最も好ましい実施形態では、工程ａ）および工程ｂ）を、単一の生体試料から得られる同一の重亜硫酸塩処理済みＤＮＡで実施する。従って、本発明は、被験者の膀胱がん又は膀胱がん発症リスクの監視、診断、およびスクリーニング方法であって、効率的、迅速、および費用対効果の高い方法を提供する。

この特異的実施形態では、工程ａ）は、以下のようなＦＲＧＦ３遺伝子変異の検出工程である。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、工程ｂ）の後に、工程ｂ）で測定されたメチル化度を閾値と比較する工程ｂ’）であって、前記閾値が、膀胱がんに罹患しているか又は発症リスクのある患者と膀胱がんに罹患していない患者とを識別する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも一つのシトシンのメチル化度をコントロール遺伝子座のメチル化度と比較する。いくつかの実施形態では、コントロール遺伝子座は内在性のコントロールである。いくつかの実施形態では、コントロール遺伝子座は外在性のコントロールである。典型的には、前記コントロール遺伝子座はハウスキーピング遺伝子中に見いだされる。

本明細書中に使用される「膀胱がんに罹患しているか又は発症リスクのある患者と膀胱がんに罹患していない患者とを識別する閾値」は、膀胱がんを有する個人由来のサンプルと膀胱がんの無いサンプルとを識別するために使用可能な特定の測定値またはその値の範囲を指す。理想的には、その二つの群間を絶対的に識別する閾値（複数可）がある（つまり、疾患群由来の値が必ず閾値の一方の側（例、高い方）にあり、そして、健常、非疾患群由来の値がその閾値の別の側（例、低い方）にある）。典型的には、前記閾値は経験的に得られる。

好ましくは、工程ｂ）は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を多重モード（ＭＳＰＭ）で実行する。ＭＳＰＭは、単一（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）モードと比べて、必要とされるＰＣＲ回数が減るという主要な利点を有している。従って、多重モードは時間を節約することができ（単一のものを数回するよりも迅速であるので）、経済的に有利である。

「多重ＰＣＲ」は、ＰＣＲの一形態であって、一般的には定量ＰＣＲであり、一又は複数の特異的プライマーを使用して、単一工程で目的遺伝子のいくつかを同時に増幅することを可能にする。この技術は、いくつかのマーカーの欠失、変異、多型、または過剰メチル化の存在を決定するのに非常に有利である。

一方、表現「単一ＰＣＲ」は、ＰＣＲの一形態であって、一般的には定量ＰＣＲであり、単一目的標的の増幅を可能にするものを指す。

「メチル化特異的ＰＣＲ」または「ＭＳＰ」は、遺伝子のメチル化度を測定する技術を指す。この技術は、定量ＰＣＲの原理に基づいている。典型的には、この技術は、重亜硫酸ナトリウムを用いて検討されるＤＮＡサンプルを処理することに基づいている。この処理は、処理済みＤＮＡ中の各非メチル化シトシンを、ウラシルに変換することを可能にする。そのように処理したサンプルは、次に、被処理遺伝子に特異的なプライマーを用いるＰＣＲを経ることになる。特異的プライマーの性状の決定は、増幅されるヌクレオチド配列に依存している。本発明の文脈では、メチル化特異的ＰＣＲは、好ましくは、多重モードにおいて採用され、従って、多重モードのメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＭ）と呼ばれる。

標的遺伝子のメチル化度をＭＳＰにより測定するために、本発明者らは、ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）によるか、または、Ｅｐｉｔｅｃｔ重亜硫酸塩キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを修飾した。その結果、ＤＮＡはＱＭ−ＭＳＰを達成するのに適したものとなる。

より具体的には、本発明者らはＴａｑＭａｎ技術をＱＭ−ＭＳＰのために使用した。その方法が本発明の目的に相応しい（ａｄａｐａｔｅｄ）のは、その方法が一回のＰＣＲで各遺伝子標的のメチル化されているコピーのパーセンテージを正確に決定することができるからだ。

典型的には、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブは、
−５’末端のフルオロフォア（例、６ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＮＥＤ）および
−３’末端の非蛍光分子ＭＧＢ（副溝結合体）連結消光剤を含む。

ＭＧＢは、その分子自身をＤＮＡ二重らせんの内側に挿入して、ハイブリダイゼーションの特異性を向上することができる。典型的には、プライマーとＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブとを、重亜硫酸ナトリウム処理によりＤＮＡを修飾することを考慮して作製する。ＣｐＧ部位を含む標的遺伝子のプライマーとプローブを、メチル化アレルのみを増幅するように設計する必要がある。

典型的には、ハウスキーピング遺伝子（アルブミン、β−アクチン、β−グロビン）を使用して、ＣｐＧ部位を含有しないプライマー／プローブセットを使用することによりＤＮＡ量を標準化する。

典型的には、増幅用標的配列のサイズは約１００塩基である。

メチル化度を、当業者に周知の定量技術により計算する。この定量化は、絶対値または相対値であってもよい。好ましくは、いわゆるΔΔＣｔ技術により計算する。この方法は、参照遺伝子で標準化することにより、標的遺伝子のメチル化度を表す演算式を用いる。第一に、標的遺伝子と参照遺伝子のＣｔ値間の差分ΔＣｔを、被解析サンプルおよび標準ＤＮＡに関して決定する。標準ＤＮＡは、典型的には、ＤＮＡ全体がメチル化されたものである。この標準ＤＮＡにより、遺伝子のメチル化度の標準化を可能にする。この種のＤＮＡは、例えば、商品番号Ｄ５０１１としてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から販売されている。適切なキット（例、市販キットＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（番号Ｄ５００２、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社））を使用して修飾した後、この標準ＤＮＡを参照として使用する。

ΔＣｔ_サンプル＝Ｃｔ（標的_サンプル）−Ｃｔ（参照_サンプル）
ΔＣｔ_標準＝Ｃｔ（標的_標準）−Ｃｔ（参照_標準）

そして、標準とサンプル間のΔΔＣｔを計算する：
ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ_標準−ΔＣｔ_サンプル

ΔΔＣｔ値の計算方法は、２つの遺伝子のＰＣＲ増幅効率が１００％に等しいと仮定する。従って、言い換えれば、この計算方法は、産物の濃度がＰＣＲの指数関数的増加期にある各サイクルで二倍となることを仮定している。従って、このことより推定されることは、標的遺伝子の標準化メチル化度は、以下の式により決定されることである。
２^{−ΔΔＣｔ}＝２^{（Ｃｔ遺伝子−Ｃｔ参照）標準−（Ｃｔ遺伝子−Ｃｔ参照）サンプル}

この方法により、使用するポジティブコントロール（標準ＤＮＡ）の関数として相対的メチル化度を得る。さらにまた、この方法は使用する参照遺伝子のコピー数の変化も考慮する。これらの変化は、ＰＣＲの実施に使用されたＤＮＡ量の変化に必然的に起因する。従って、得られる結果は、参照遺伝子の性状によりゆがめられない。好ましくは、参照遺伝子はハウスキーピング遺伝子である。より好ましくは、参照遺伝子はアルブミン遺伝子またはその断片である。

好ましくは、本発明の方法の工程ｂ）は、複数のメチル化度：
−ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、およびアルブミン遺伝子またはその断片のメチル化度
−ＳＥＰＴＩＮ、ＳＬＩＴ２、またはその断片のメチル化度
−ＳＥＰＴＩＮ９およびアルブミン遺伝子またはその断片のメチル化度
−ＳＬＩＴ２およびアルブミン遺伝子またはその断片のメチル化度
−ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびアルブミン遺伝子またはその断片のメチル化度
−ＴＷＩＳＴ１およびＨＳ３ＳＴ２遺伝子またはその断片のメチル化度
−ＴＷＩＳＴ１およびアルブミン遺伝子またはその断片のメチル化度
−ＨＳ３ＳＴ２およびアルブミン遺伝子またはその断片のメチル化度を同時に測定する工程を含む。

より好ましくは、本発明の方法の工程ｂ）は、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、およびＨＳ３ＳＴ２遺伝子またはその断片の全てのもののメチル化度を同時に測定する工程を含む。より好ましくは、前記断片は、配列番号３、４、５、および６である。

典型的には、メチル化度の決定のために、以下に定義されるフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブが使用可能である。メチル化部位に下線を引き太字で示す。

本発明の方法は、膀胱がん診断方法の感度と特異度に関して予想外の結果を示す。

本明細書中に使用される表現「真陽性率」または「ＴＰ」は、標的疾患に罹患する患者で試験結果が陽性であるものを指す。

本明細書中に使用される表現「偽陽性率」または「ＦＰ」は、標的疾患に罹患しない患者であるが、試験結果が陽性であるものを指す。

本明細書中に使用される表現「真陰性率」または「ＴＮ」は、標的疾患に罹患する患者であるが、試験結果が陰性であるものを指す。

本明細書中に使用される表現「偽陰性率」または「ＦＮ」は、標的疾患に罹患する患者であるが、試験結果が陰性であるものを指す。

標的疾患の診断方法の効率を評価する場合、試験の感度と特異度を決定する。

定量試験の感度と特異度は、試験が陽性である上下のカットオフ値に依存する。

本明細書中で使用される用語「感度」は、診断方法が標的疾患に罹患する患者を正しく同定する能力を指す。

診断方法の感度を以下のように決定する。
感度 ＝ ＴＰ ／ （ＴＰ ＋ ＦＮ）

本明細書中で使用される用語「特異度」は、診断方法が標的疾患に罹患しない患者を正しく同定する能力を指す。

診断方法の特異度を以下のように決定する。
特異度 ＝ ＴＮ ／ （ＴＮ ＋ ＦＰ）

いくつかの実施形態では、閾値は膀胱がんの検出に関する特定の感度と特異度を提供する。典型的には、閾値は、被験者の膀胱がんの検出に関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％の感度と特異度を実現する。

本発明者らは、二つのアッセイの組み合わせ、つまり、
−一方で、ＦＧＦＲ３の特異的変異を同定することを目的とするもの、および
−他方で、目的の特異的遺伝子のメチル化度を測定することを目的とするものが、
高特異度と共に高感度を示す、膀胱がんの正確な診断方法を提供する。

特定の感度と特異度の選択は、選ばれた閾値に依存している。

典型的には、閾値は累積メチル化インデックス（ＣＭＩ）（各テストサンプルの一つ、二つ、三つ、および四つのメチル化値の合計）として表される。

典型的には、前記閾値は、四つの上記遺伝子のメチル化値を足し算して得られる（累積メチル化インデックスまたはＣＭＩ）。そして、変異が存在する場合か、または、変異は存在しないが、ＣＭＩ値が所定の閾値よりも高い場合に、患者を陽性と宣するアルゴリズム中で使用される。従って、感度／特異度／ＣＭＩ閾値の値の所望の組合せを得ることがきる。この組合せを表５に開示する。

典型的には、閾値は１〜５４（ＣＭＩ）の間にあり、好ましくは、前記閾値を以下の表５から選択する。

上記表は、選択される閾値に依存して、本発明の試験の特異度と感度に関する貴重な情報を与える。

当業者は、適用対象（例、スクリーニングまたは監視および診断）に依存して、閾値を選択するやり方を知っている。

遺伝子発現レベルの測定
一つの実施形態では、本発明の方法は、ＢＣＬＡ−４、ＢＣＡＲ−１からなる群より選択される遺伝子の発現レベルを測定する工程ｃ）をさらに含む。好ましくは、その方法は、前記発現レベルを、健常者または膀胱がんを克服した被験者で得られる発現レベルと比較する工程ｃ’）をさらに含む。

ＢＬＣＡ−４は、刊行物（Ｖａｎ Ｌｅら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｒｋｅｒ，ＢＬＣＡ−４、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１０、１３８４−１３９１、２００４年２月１５日）に開示されている。

ＢＣＡＲ−１は、膀胱がん抗エストロゲン耐性タンパク質１の遺伝子を指す。前記タンパク質のいくつかのアイソフォームが利用可能である。本明細書中で使用されるＢＣＡＲ−１は、以下のタンパク質のいずれか一つを指す。
−アイソフォーム１：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１８５．１として利用可能；
−アイソフォーム２：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１８６．１として利用可能；
−アイソフォーム３：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１８７．１として利用可能；
−アイソフォーム４：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１８８．１として利用可能；
−アイソフォーム５：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１８９．１として利用可能；
−アイソフォーム６：アクセション番号ＮＰ＿０５５３８２．２として利用可能；
−アイソフォーム７：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１９０．１として利用可能；
−アイソフォーム８：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１９１．１として利用可能；および
−アイソフォーム９：アクセション番号ＮＰ＿００１１６４１９２．１として利用可能。

一つの実施形態では、前記遺伝子（複数可）の発現レベルを測定する工程ｃ）は、前記遺伝子（複数可）の翻訳産物（好ましくは、タンパク質）の発現レベルを測定する工程である。

生体試料中のタンパク質量を測定する方法は、標準的免疫診断的技術（免疫アッセイ（例、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイ）を含むもの）を使用して測定可能なものである。そのような実施形態では、がん細胞を単離生体試料から精製する。そのようなアッセイには、限定はされないが、凝集検査；酵素標識および酵素媒介免疫アッセイ（例、ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈降法が含まれる。

反応は、一般的に、標識（例、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、もしくは色素分子）を明らかにする工程、または、抗原と抗体との複合体形成を検出するか、もしくは、相互に反応する抗体を検出する他の方法を含む。

より好ましくは、ＥＬＩＳＡ法が使用可能である。ＥＬＩＳＡ法では、マイクロタイタープレートのウエルを、本発明の標的タンパク質に対する抗体セットでコーティングする。標的タンパク質を含むと思われる生体試料のがん細胞を、その後、コーティングされたウエルへと加える。抗体−抗原複合体形成をさせるのに十分なインキュベーション期間後、プレート（複数可）を洗浄して非結合体および検出可能に標識された二次結合分子（添加したもの）を除去する場合がある。二次結合分子を任意の捕獲済みサンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、そして、その二次結合分子の存在を当該技術分野で周知の方法を使用して検出する。

ヒトＢＬＣＡ−４のＥＬＩＳＡキットは市販されていて、ＣＵＳＡＢＩＯ社から販売されている。従って、ＢＬＡＣ−４の発現レベルを測定する工程ｃ）は、ＥＬＩＳＡにより、より好ましくはＣＵＳＡＢＩＯのキットにより実施可能である。好ましくは、前記遺伝子（複数可）の発現レベルを測定する工程ｃ）は、ＢＣＬＡ−４、ＢＣＡＲ−１からなる群より選択される遺伝子の翻訳産物の発現レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定する工程である。

特定の実施形態では、本発明の方法は、生体試料のがん細胞を、生体試料に存在するＢＣＬＡ−４、ＢＣＡＲ−１の中から選択される遺伝子の一つによりコードされる少なくとも一つのタンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させる工程を含む。結合パートナーは、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルな抗体である場合がある。別の実施形態では、結合パートナーはアプタマーであってもよい。

好ましい実施形態では、本発明の方法は、工程ｃ）にさらに加えて、工程ｃ）で得られた発現プロフィールをカットオフ値（複数可）と比較する工程ｃ’）をさらに含む。

代替的には、本発明の方法は、工程ｃ）にさらに加えて、工程ｃ）で得られた発現プロフィールを、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールからなる群より選択される少なくとも一つのコントロール用に得られる前記遺伝子（複数可）の発現プロフィールと比較する工程ｃ’’）をさらに含む。

工程ｃ）で得られる発現プロフィールをカットオフ値またはコントロールの発現プロフィールと比較するこの工程は、膀胱がんを呈する被験者の同定に有用である。

本明細書中で使用される用語「発現プロフィール」は、サンプル中の一又は複数の遺伝子の定量的および定性的発現を指す。単一遺伝子の発現プロフィールは、前記遺伝子の発現レベルに対応する。発現プロフィールは、様々な遺伝子の発現レベル（その単位は任意のものが選択される）を比較するために使用可能な発現レベルデータのレポジトリである。用語「プロフィール」はまた、細胞、組織、または個体由来の発現レベルデータの操作を含むように意図している。例えば、一旦、相対的発現レベルが所定の遺伝子セットに関して決定されると、当該細胞、組織、または個体に関する相対的発現レベルを、標準と比較して、発現レベルがその標準における同じ遺伝子に比較して高いか低いかどうかを決定する場合がある。標準には、当業者により比較に適切であると考えられる任意のデータ（例、所定の閾値またはポジティブおよび／またはネガティブコントロールの発現プロフィール）を含んでもよい。

本明細書中で使用される表現「発現プロフィールを比較する」（あらゆる文法的形態におけるもの）は、遺伝子の発現の定量的および／または定性的差異の評価を指す。典型的には、当業者は遺伝子発現レベルをカットオフ値と比較する場合がある。

典型的には、「カットオフ値」は、実験的、経験的、または理論的に決定可能である。閾値を、当業者により認識され得る既存の実験的条件および／または臨床状態に基づいて任意に選択する場合もある。好ましくは、当業者は、本発明に係る所定遺伝子の発現プロフィールを、前記遺伝子用のカットオフ値と比較してもよい。カットオフ値と比較することになる各遺伝子に関して、当業者は、前記遺伝子の発現レベルをカットオフ値と比較することができる。

別の実施形態では、工程ｃ’’）は、工程ｃ）で得られた発現プロフィールを、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールからなる群より選択される少なくとも一つのコントロールの発現プロフィールと比較する工程である。

この特定の実施形態では、前記ポジティブコントロールは膀胱がんに罹患している被験者または膀胱がんのために死亡した被験者の発現プロフィールである。

好ましくは、前記ネガティブコントロールは健常者または膀胱がんを克服した被験者の発現プロフィールである。

本発明に係る目的遺伝子（複数可）の発現プロフィールを、前記ポジティブおよびネガティブコントロールに関して設定する。当業者は、従って、前記被験者の生体試料中の目的遺伝子（複数可）の発現プロフィールを、ポジティブおよび／またはネガティブコントロールの発現プロフィールと比較することができる。そのような比較により、その後、当業者は、被験者の予後を推定することになる。

本発明に係る治療方法
本発明は、膀胱がんに罹患している患者の治療方法であって、
１）被験者の予後を予測する工程であって、
ａ）配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異（ＮＭ＿００１１６３２１３．１）からなる群より選択される変異を検出することによるか；または、配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓからなる群の変異を検出することにより、第一生体試料中のＦＧＦＲ３遺伝子の変異を検出する工程、ならびに
ｂ）前記被験者から得られる第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のメチル化度を測定する工程を含み、その後、
２）前記工程１）ａ）が変異の存在を示し、および、前記工程１）ｂ）が前記遺伝子の一つのメチル化を示す場合、本発明の方法が前記患者に適切な療法を提供する工程３）を含む、方法に関する。

上記に開示される全ての技術的特徴は適用可能である。

本発明の文脈では、本明細書中で使用される用語「治療すること」または「治療」は、そのような用語が適用される疾患もしくは状態を予防するか、またはその進行を逆転、緩和、阻害するか、あるいは、そのような用語が適用される疾患もしくは状態の一若しくは複数の症状を予防するか、またはその進行を逆転、緩和、阻害することを意味する。

本発明に係るキット
本発明はまた、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓの中から選択されるＦＧＦＲ３遺伝子変異を検出するために適切な少なくとも一つのプライマー；ならびに
（ｉｉ）ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびその断片または変異体からなる群より選択される遺伝子のメチル化度を測定するための少なくとも一つのプライマーと少なくとも一つのプローブを含むキットに関する。

本発明はまた、
（ａ）配列番号８〜１３からなる群より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号１６〜３０からなる群より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。

さらなる実施形態では、本発明のキットは、
（ｃ）配列番号３３〜３６からなる群より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドをさらに含む。

前記キットは、膀胱がん診断用である。

上記に開示される全ての技術的特徴は適用可能である。

実施例１：先行技術の診断方法およびキットの感度と感受性の評価
現在、いくつかのＦＤＡ承認膀胱がん診断テストが市販されている。その承認済みテストには、
−膀胱がん抗原ＢＴＡ−ＴＲＡＫテスト（Ｐｏｌｙｍｅｄｃｏ、Ｃｏｒｔｌａｎｄｔ Ｍａｎｏｒ、ＮＹ、米国）、
−核マトリクスタンパク質（ＮＭＰ）２２およびＮＭＰ２２ ＢｌａｄｄｅｒＣｈｅｋアッセイ（Ｍａｔｒｉｔｅｃｈ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ、米国）、
−ＩｍｍｕｎｏＣｙｔテスト（Ｄｉａｇｎｏｃｕｒｅ社、Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）、および
−蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析（Ｕｒｏｖｙｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｙｓｉｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、米国）［１６］が挙げられる。

ＢＴＡ−ＴＲＡＫは、標準的ＥＬＩＳＡであって、尿中の補体因子Ｈ関連タンパク質と補体因子Ｈの量を定量的に測定するものである。ＢＴＡ−ＴＲＡＫは、膀胱がん管理を補助するものとして、膀胱鏡検査と組み合わせて使用される。

ＮＭＰ−２２テストは、マイクロタイター用の定量的サンドウィッチＥＬＩＳＡであって、各抗体が核分裂装置の異なるエピトープを認識する二つの抗体を使用するものである。ＦＤＡは、膀胱がんのリスクのある患者または症状を有する患者の診断の補助としての使用に関して、このテストを承認した。

ＣＹＦＲＡ ２１−１は、サイトケラチン１９の可溶性断片であって、固相サンドウィッチ免疫放射定量測定法（Ｃｉｓ−Ｂｉｏ社）または電気化学発光免疫測定法（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）のいずれかにより測定されるものである。

テロメアは染色体の末端をキャップする反復配列である。テロメアは染色体末端を保護し、それによりゲノム安定性を維持する。テロメラーゼ活性をＴＲＡＰ（インビトロのテロメラーゼ反応産物をＰＣＲで増幅することに関与するもの）により測定する。テロメラーゼはがんグレードに感度があるわけではなかったし、偽陽性の結果が慢性または重度膀胱炎症の症例で得られた。それは、リンパ球が存在したからである。

ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ（免疫細胞学）は、尿管上皮がん細胞中の腫瘍関連抗原を、モノクローナル抗体を使用して可視化することに基づいている。ＩｍｍｕｎｏＣｙｔは市販の免疫細胞学的アッセイであって、硫酸ムチン糖タンパク質に対するフルオレセイン標識モノクローナル抗体Ｍ３４４およびＬＤＱ１０、ならびに、高分子量癌胎児性抗原の糖鎖付加型に対するテキサスレッド連結モノクローナル抗体１９Ａ２１１を使用して膀胱がん細胞を検出するアッセイである。時間を掛けて顕微鏡下でスライドを検証するのが欠点として残っていて、そして、アッセイの再現性は細胞学者に依存している。

ＵｒｏＶｙｓｉｏｎテストまたは多標的型マルチカラーＦＩＳＨアッセイという細胞遺伝学的検査は、多くの染色体において頻繁に起こる変化を明らかにする。染色体異常はＦＩＳＨにより検出可能である。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎテストは、多標的型マルチカラーＦＩＳＨアッセイであって、染色体３番、７番、１７番用のセントロメア蛍光変性染色体列挙プローブと９ｐ２１用遺伝子座特異的同定プローブを用いて、尿サンプル由来剥離細胞を染色し、そして、蛍光顕微鏡下でその細胞を観察することに関与するアッセイである。症例コントロールおよびコホート試験に基づくＵｒｏＶｙｓｉｏｎテストは、膀胱がん検出用の有力なテストとなるように思われる。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎテストは、膀胱がん再発を、臨床医が検出する前に検出する能力を有する場合がある。しかしながら、このテストは、また、低いグレードの膀胱腫瘍を検出する感度が低い。

ＣｅｒｔＮＤｘ（商標）膀胱がんアッセイを手段とするＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、膀胱がん再発に関して尿サンプルを解析する監視解決策を提供する。このテストは、ＤＮＡバイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーの組合せを活用する。

まとめると、これらのテストは、表６に示されるように、膀胱がん診断におけるマーカーの正確性を欠く（感度／特異度の比が低い）ので、偽陽性および偽陰性が多すぎるのを避けることができない。この結果は、従って、別の正確なバイオマーカーに対する実現されていない必要性があることを確認する。従って、非侵襲性かつ正確な膀胱がん検出用診断バイオマーカーの開発が、膀胱がんの予後、診断、およびスクリーニングを改善するために緊急かつ重要である。

実施例２：遺伝学的アッセイおよびエピジェネティックアッセイの両者を組み合わせる分子的アプローチの尿ベーステストの開発
試験設計
前検証段階中では、１０７人のコントロールと初期表在性膀胱腫瘍（組織学的ステージｐＴａおよびｐＴ１）を有する４８人の患者を含む総数１５３個の尿を選択した。分子解析用に尿を回収するのと同時に、膀胱鏡検査を実施した。経尿道的切除術を、膀胱がんの各患者に対して実施した。全ての患者からは、書面でインフォームドコンセントを得た。

尿採取とＤＮＡ抽出
出し立ての尿（１００ｍｌ）を膀胱鏡検査の前に回収し、ＤＮＡ調製まで４℃で保管した。１，５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞をペレット化した。細胞ペレットを１０ｍＬのＰＢＳで二度洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、微小管（エッペンドルフ）に移し、そして、１，５００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。上清を捨てて、そして、細胞ペレットをＤＮＡ単離まで−２０℃で保管した。

製造元のプロトコルに従って、ＱｉＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）またはＺＲ ＤＮＡ Ｕｒｉｎｅキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度を、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ定量試薬（Ｂｉｏｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社）を用いて、蛍光定量的に測定した。

ＦＧＦＲ３変異解析
膀胱がんにおいては、１０種類の異なるＦＧＦＲ３変異が記載されているが、そのうちの４つ（Ｓ２４９Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、およびＲ２４８Ｃ）が症例の９５％を占める。

これらの変異は、従って、点変異を特異的に検出することに依存するアッセイ（例、アレル特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ））の優れた標的となる。

ＰＣＲを、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施した。

好ましくは、５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１×ＰＣＲバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔａｑポリメラーゼバッファー）、２００μＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．９μＬのジメチルスルホキシド、２．５Ｕのｇｏｌｄ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、および（フォワードおよびリバース）プライマー（各２００ｎＭの濃度のもの）を含む最終容量１０μＬ中でＰＣＲを実施した。

各多重ＰＣＲでは、各ペアは、
−５’に特異的蛍光色素（６ＦＡＭ、ＨＥＸ、およびＴＥＴ）でタグを付けたフォワードプライマー一つ、および
−ロック型核酸技術（ＬＮＡ）で３’を修飾したヌクレオチドが存在するリバースプライマー一つを含んでいる。

両ＰＣＲ（ＰＣＲ１、ＰＣＲ２）では、β−グロビン遺伝子を内部コントロールとして含ませた。各プライマーペアに関しては、蛍光プライマーを使用してＰＣＲ産物を標識した。全てのプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した。ＰＣＲ産物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０キャピラリーＤＮＡシークエンサー上でＧｅｎｓｃａｎソフトウエアを用いて解析した。

・ＰＣＲ１は、Ｒ２４８Ｃ、Ｇ３７２Ｃ変異、およびβ−グロビンを検出する。使用するプライマーは以下のものである：
−変異Ｒ２４８Ｃの検出用にはフォワードＦ１／リバースＲ２、
−変異Ｇ３７２Ｃの検出用にはフォワードＦ２／リバースＲ３、
−および、β−グロビン検出用にはフォワードＦＧＬＯ／リバースＲＧＬＯ。

・ＰＣＲ２は、Ｒ２４９Ｃ、Ｙ３７５Ｃ変異、およびβ−グロビンを検出する。使用するプライマーは以下のものである：
−変異Ｒ２４９Ｃの検出用にはフォワードＦ１／リバースＲ１、
−変異Ｙ３７５Ｃの検出用にはフォワードＦ２／リバースＲ４、
−および、β−グロビン検出用にはフォワードＦＧＬＯ／リバースＲＧＬＯ。

サイクル条件は以下のものである。

定量的リアルタイム多重メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＭ−ＭＳＰ）
本発明者らは、がん形成、おそらく膀胱がんに重要な１８種類の遺伝子（ＣＯＬ１Ａ２、ＤＤＲ１、ＤＩＲＡＳ３、ＤＮＡＳＥ１Ｌ１、ＥＹＡ４、ＦＡＳＴＫ、ＨＳ３ＳＴ２、ＮＰＹ、ＮＴＲＫ３、ＰＥＮＫ、ＳＥＭＡ３Ｂ、ＳＥＰＴＩＮ５、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＳＹＮＥ１、ＴＧＦＢ、ＴＷＩＳＴ１、およびＷＩＦ１遺伝子）のプロモーターのメチル化を評価した。

ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）によるか、または、Ｅｐｉｔｅｃｔ重亜硫酸塩キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを修飾した。その結果、ＤＮＡはＱＭ−ＭＳＰを達成するのに適したものとなる。

本発明者らはＴａｑＭａｎ技術をＱＭ−ＭＳＰのために使用した。ＱＭ−ＭＳＰは、一回のＰＣＲで、各遺伝子ターゲットのメチル化されたコピーの割合を正確に測定することができる。ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブは、
−５’末端に、例えば、フルオロフォア、６ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＮＥＤ、および
−３’末端に非蛍光分子ＭＧＢ（副溝結合体）連結消光剤を含む。

ＭＧＢは、その分子自身をＤＮＡ二重らせんの内側に挿入して、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることができる。

プライマーとＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブとを、重亜硫酸ナトリウム処理によりＤＮＡを修飾することを考慮して作製した。ＣｐＧ部位を含む標的遺伝子のプライマーとプローブを、メチル化アレルのみを増幅するように設計した。ＱＭ−ＭＳＰの概略を図１に記す。ハウスキーピング遺伝子（アルブミン、β−アクチン、β−グロビン）を、ＣｐＧ部位を含有しないプライマー／プローブセットを使用することによりＤＮＡ量を標準化するために検討した。

増幅用標的配列のサイズは約１００塩基である。プライマーの終濃度は、１００ｎＭおよび９００ｎＭとなることが期待される。プローブの濃度は、１００ｎＭ〜３００ｎＭの間であることが期待される。好ましくは、修飾済みＤＮＡ溶液を、終濃度４００ｎｍｏｌの各（フォワードおよびリバース）プライマーおよび終濃度２５０ｎｍｏｌのＴａｑＭａｎプローブ−ＭＧＢならびに１×ＰＣＲ溶液（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−Ｑｉａｇｅｎ社またはＫａｐａ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に加える。反応容量は２０μＬである。

熱サイクルのプロフィール：
・Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用する場合：

・Ｋａｐａ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用する場合：

配列＆オリゴヌクレオチド
１．ＦＧＦＲ３変異
赤太字で示したヌクレオチドは変異塩基である。

アステリスクで示したヌクレオチドはＬＮＡ技術（ロック型核酸）により修飾される。

・Ｓ２４９Ｃ変異（ＴＣＣ→ＴＧＣ）に関して
使用するプライマーは：
−フォワードＦ１：５’に６ＦＡＭでタグを付けた配列番号８；
−リバースＲ１：１９位のグアニンをＬＮＡ技術で修飾した配列番号１０、である。

・Ｒ２４８Ｃ変異（ＣＧＣ→ＴＧＣ）
使用するプライマーは：
−フォワードＦ１：５’に６ＦＡＭでタグを付けた配列番号８；
−リバースＲ２：１９位のシトシンをＬＮＡ技術で修飾した配列番号９、である。

・Ｇ３７２Ｃ変異（ＧＧＣ→ＴＧＣ）
使用するプライマーは：
−フォワードＦ２：５’にＨＥＸでタグを付けた配列番号１１；
−リバースＲ３：２７位のシトシンをＬＮＡ技術で修飾した配列番号１２、である。

・Ｙ３７５Ｃ変異（ＴＡＴ→ＴＧＴ）
使用するプライマーは：
−フォワードＦ２：５’にＨＥＸでタグを付けた配列番号１１；
−リバースＲ４：２５位のシトシンをＬＮＡ技術で修飾した配列番号１３、である。

２．ＴＥＲＴ変異
ＴＥＲＴ遺伝子の特異的変異を検出するために、以下のプライマーが使用可能である。
−フォワードＴＥＲＴ：５’ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ３’５（配列番号３３）
−リバースＴＥＲＴ：５’ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＡＣ ＴＣＧ３’（配列番号３４）

配列番号３２を参照して示される変異７７Ｃ→Ｔを検出するために、以下のプローブが使用可能である：
５’ＦＡＭ／ＶＩＣ−ＣＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴ−ＭＧＢ３’。

配列番号３２を参照して示される変異９９Ｃ→Ｔを検出するために、以下のプローブが使用可能である：
５’ＦＡＭ／ＶＩＣ−ＣＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＴＣ−ＭＧＢ３’。

３．ヘモグロビンβサブユニット＝ハウスキーピング遺伝子
ヘモグロビンβサブユニットの断片を、配列番号３１に示す。

以下のプライマーを使用することもできる。
−フォワードＦＧＬＯ：配列番号１４；および
−リバースＲＧＬＯ：配列番号１５。

定量的多重−メチル化特異的ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡを、重亜硫酸塩処理により変換する。

６ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、またはＮＥＤが５’末端に取り込まれるフルオロフォア（ＦＬ）となり、ＭＧＢ分子が３’末端に取り込まれるように、プローブを設計する。

メチル化されているＣｐＧジヌクレオチドのシトシンを、太字で下線を引いて示す。

・ＳＥＰＴＩＮ９：配列番号３
５’ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＧＣＧＣＧＡＴＴＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＧＴＣＧＧＡＴＴＴＣＧＣＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＴＡＧＴＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＴＣＧＧＡＴ３’

本発明者らは、配列番号１６、１７、および１８を、それぞれ、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブとして使用した。

・ＳＬＩＴ２：配列番号４
５’ＴＡＧＴＴＴＣＧＴＣＧＧＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＧＧＡＧＴＡＧＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＧＴＧＴＣＧＧＣＧＡ３’

本発明者らは、配列番号１９、２０、および２１を、それぞれ、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブとして使用した。

・ＴＷＩＳＴ１：配列番号５
５’ＧＡＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＧＴＡＴＡＴＴＴＣＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＡＧＴ３’

本発明者らは、配列番号２２、２３、および２４を、それぞれ、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブとして使用した。

・ＨＳ３ＳＴ２：配列番号６
５’ＧＣＧＣＧＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＴＴＧ３’

本発明者らは、配列番号２５、２６、および２７を、それぞれ、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブとして使用した。

・ＤＤＲ１：配列番号７
５’ＡＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＣＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧ３’

本発明者らは、配列番号２８、２９、および３０を、それぞれ、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブとして使用した。

結果
膀胱がんの患者を同定するための、ＡＳ−ＰＣＲ技術を使用するＦＧＦＲ３変異検出
ＦＧＦＲ３の変異を検出すると、特異的ピークが存在するようになる。増幅産物をキャピラリー電気泳動により解析した。

図２に結果を示す：膀胱がんを有する患者（＋）におけるＳ２４９Ｃ変異の検出に対する変異Ｓ２４９Ｃを有しない個人（−）の調査。

以下の表はその結果をまとめたものである。

膀胱がんの患者４８人の４２％（感度）が少なくとも一つの変異を有することが見て取れる。コントロール被験者（ｎ＝１０７）は誰も変異を示さなかった（特異度１００％）。

定量的多重−メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭ−ＭＳＰ）の効率と特異性
本発明者らは、前もって選択された１８種類の遺伝子のメチル化レベルを定量するために、ＱＭ−ＭＳＰの性能を評価した。リアルタイムで三種類のメチル化特異的ＤＮＡターゲットを共に（三重）増幅するために、我々はＦａｍ、Ｖｉｃ、およびＮｅｄフルオロフォアプローブの組合せを使用した。というのも、各プローブは吸収スペクトルが限定的にしか重ならない強い個々のスペクトル強度を示すからだ。我々は、三重モード（ＧＣ１＋ＧＣ２＋ＧＣ３）のＱＭ−ＭＳＰが非常に高い増幅効率（勾配＝〜３，３２を有するほぼ１００％）で３つの遺伝子を共増幅可能とすることを実証した。プライマーペアの特異性を、アンプリコンの配列決定することにより評価した（データは示さない）。これにより、アンプリコンのサイズと遺伝子の同定を確認する。

膀胱がんの検出のための、尿での定量的多重−メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭ−ＭＳＰ）の検証
本発明者らは、前もって選択した１８種類の各遺伝子を評価した。約１０ｎｇの量のＤＮＡを、ＱＭ−ＭＳＰ用の鋳型として使用した。

本発明者らは、メチル化度の高い以下の４つの遺伝子（最も高い感度と特異度を示すもの）を、膀胱がん検出のために選択した：ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、およびＨＳ３ＳＴ２。

−ＱＭ−ＭＳＰ１は、同時にＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、およびＡｌｂｕｍｉｎ（３つの遺伝子）、ＳＥＰＴＩＮ９およびＳＬＩＴ２（２つの遺伝子）、ＳＥＰＴＩＮ９およびアルブミン（２つの遺伝子）、またはＳＬＩＴ２およびアルブミン（２つの遺伝子）のメチル化度を定量する。

−ＱＭ−ＭＳＰ２は、同時にＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、およびＡｌｂｕｍｉｎ（３つの遺伝子）、ＴＷＩＳＴ１およびＨＳ３ＳＴ２（２つの遺伝子）、ＴＷＩＳＴ１およびアルブミン（２つの遺伝子）、またはＨＳ３ＳＴ２およびアルブミン（２つの遺伝子）のメチル化度を定量する。

本発明者らは、さらに、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、およびＨＳ３ＳＴ２を組み合わせた。この目的のために、本発明者らは、各サンプルに関して１、２、３、および４つのメチル化値の合計となる累積メチル化インデックスを計算して、そして、そのインデックスをＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を作成するための可変閾値として使用した。特異度と感度を、表８（１つの遺伝子）、表９（２つの遺伝子の組合せ）、表１０（３つの遺伝子の組合せ）、および表１１（４つの遺伝子の組合せ）に示す。

多重アッセイ：メチル化とＦＧＦＲ３変異の検出
最も感度と特異度の高いテストを開発する目的で、本発明者らはＦＧＦＲ３変異の検出と共にＭＳＰを行う妥当性を評価した。テスト成績を、各適用例（診断、再発の監視、および標的型スクリーニング）に従って得る。特異度と感度を、表１２（１つの遺伝子）、表１３（２つの遺伝子の組合せ）、表１４（３つの遺伝子の組合せ）、および表１５（４つの遺伝子の組合せ）に示す。

例えば、再発の監視（経過観察）に関しては、感度は９８％である。そして、症状（血尿、尿疾患）のある被験者の初期診断に関しては、特異度は６４％と良い。（リスクのある集団の）スクリーニングに関しては、特異度は９７％であり、感度は８３％と高い（図３）。

本発明者らは、この両アッセイ（ＦＧＦＲ３の変異検出と標的遺伝子のメチル化度の定量に基づくもの）の組合せを提供して、膀胱がん検出に対する感度と特異度に関して最も高い正確性を得ることを実証した（表１６）。

実施例３：閾値と感度および特異度との間の相関
本発明者らは、本発明の方法が、
−再発の監視（つまり、膀胱がんに罹患していると既に診断された患者の経過観察）、
−患者の膀胱がんの初期診断、
−スクリーニング（つまり、膀胱がんの発症リスクのある集団の同定）に有用であることを示した。

本発明の方法の使用目的に依存して、感度と特異度を調整しなければならない。

前記調整は、選択される特異的な閾値に実際依存している。

本発明者らは、従って、閾値を変えることによって、本発明の方法の感度と特異度が変化することを示した。

これを表１７にまとめる。

実施例４：代替的技術
本発明者らは、代替法が利用可能で、本発明の方法の実施に効率的であることをさらに示した。

１．競合的アレル特異的ＴａｑＭａｎＰＣＲ（ＣａｓｔＰＣＲ）技術
競合的アレル特異的ＴａｑＭａｎＰＣＲ（ＣａｓｔＰＣＲ）技術は、変異を高い感度と特異度で検出するために最初は開発された。本発明者らは、Ｃａｓｔ−ＰＣＲ法の実施を可能にする、メチル化測定用プライマーペアおよびプローブを設計した。この方法は、大量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、変異検出用の粗製ｇＤＮＡ、またはメチル化測定のために重亜硫酸塩処理により修飾されたｇＤＮＡを含むサンプル中の稀な変異およびメチル化アレルを検出および定量する高特異度および高感度な方法である。

ＣａｓｔＰＣＲ技術は、野生型アレル（変異がないもの、メチル化されていないもの）からの非特異的増幅を抑制するために、アレル特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲとアレル特異的ＭＧＢブロッカーを組み合わせる。１０ｎｇのｇＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用する。増幅産物のサイズは約１００塩基である。オリゴブロッカーとプライマーの終濃度は、１００ｎＭ〜９００ｎＭの間となることが期待される。プローブの濃度は、１００ｎＭ〜３００ｎＭの間であることが期待される。使用されるＰＣＲ溶液は、好ましくは、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）である。反応容量は２０μＬである。Ｃａｓｔ−ＰＣＲの概略を図４に記す。

熱サイクルプロフィールは以下のものである。

２．ＬＮＡ（ロック型核酸）プローブアッセイ
ＬＮＡ（ロック型核酸）プローブアッセイは、Ｅｘｉｑｏｎ（登録商標）（Ｖｅｄｂａｅｋ、デンマーク）により開発された。ＬＮＡ（登録商標）は、らせんの立体構造を変化させ、その二本鎖の安定性を増加させる。ＬＮＡ塩基を二色素（６ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ）オリゴヌクレオチドプローブに組み込むと、できるだけ特異的な高親和性プローブを必要とする技術（変異またはメチル化検出用の様なもの）を改良する素晴らしい機会を開く。１０ｎｇのｇＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用する。増幅産物のサイズは約１００塩基である。プライマーの終濃度は、１００ｎＭ〜９００ｎＭの間となることが期待される。プローブの濃度は、１００ｎＭ〜３００ｎＭの間であることが期待される。使用されるＰＣＲ溶液は、好ましくは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ社）またはＫａｐａ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）である。反応容量は２０μＬである。ＬＮＡプローブの概略を図５に記す。

３．マイクロアレイ技術
マイクロアレイ技術は、遺伝子研究と臨床用の強力なツールである。手短に言うと、マイクロアレイ技術は、核酸ハイブリダイゼーション技術とコンピューター技術の進歩とを活用する。マイクロアレイは、位置を特定可能な基盤に集積された捕獲用固定配列（明確なもの）（オリゴヌクレオチド）を含むコンパクトな装置（つまり、Ａｇｉｌｅｎｔ社、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のもの）である。オリゴヌクレオチドは、ガラスまたはプラスチック表面に付着している。マイクロアレイ（ＯｎｃｏＤｉａｇにより設計されたもの）を使用して、そのマイクロアレイ上の配列と標識プローブ（目的サンプル）との間でハイブリダイゼーションさせることにより、ＦＧＦＲ３およびＴＥＲＴ遺伝子の点変異ならびに各標的遺伝子（ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＬＩＴ２、ＴＷＩＳＴ１、ＨＳ３ＳＴ２、ＤＤＲ１）のメチル化されたシトシンを有するＣｐＧを同時に同定する。

４．他の方法
他のデザインとしては、上記技術の組合せを提案する。例えば、６種類の変型（Ａ−Ｆ）を表１４に記す。特に、本発明者らは、変型ＣおよびＦを実施することにより、新規で魅力的なアプローチを提案する。同時に、それら変型は、重亜硫酸塩により変換されたＤＮＡから一本のチューブの中で変異を検出およびメチル化度を測定することを可能にする。

Claims (19)

1. 被験者の膀胱がんまたは膀胱がん発症リスクの監視、診断、およびスクリーニングするためのデータを提供する方法であって、前記方法は、
   ａ）第一生体試料中で、ＦＧＦＲ３遺伝子の変異を検出する工程；ならびに
   ｂ）前記被験者から得られる第二生体試料中で、ＳＥＰＴＩＮ９遺伝子、ＳＬＩＴ２遺伝子、ＴＷＩＳＴ１遺伝子、ＨＳ３ＳＴ２遺伝子、およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも二つのバイオマーカーのメチル化度を測定する工程を含み、
   前記第一および第二生体試料は同一の生体試料であり；且つ
   前記工程ａ）は、
   配列番号１のヌクレオチド番号を参照して示される変異７４２Ｃ→Ｔ、７４６Ｃ→Ｇ、１１１４Ｇ→Ｔ、および１１２４Ａ→Ｇからなる群より選択される変異を検出するか、または、
   配列番号２のアミノ酸番号を参照して示される変異Ａｒｇ２４８Ｃｙｓ、Ｓｅｒ２４９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ３７２Ｃｙｓ、およびＴｙｒ３７５Ｃｙｓからなる群の変異を検出することにより実施される、方法。
2. 前記工程ａ）および工程ｂ）を、単一の生体試料から得られる同一の重亜硫酸塩処理済みＤＮＡで実施し、ならびに、前記工程ａ）が、
   重亜硫酸塩処理済みの配列番号１に示される配列の７４６位のグアニン（Ｇ）；
   重亜硫酸塩処理済みの配列番号１に示される配列の１１１４位のチミン（Ｔ）；および／または
   重亜硫酸塩処理済みの配列番号１に示される配列の１１２４位のグアニン（Ｇ）の存在を決定する工程である、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、前記工程ｂ）の後に、前記工程ｂ）で測定されたメチル化度を閾値と比較する工程ｂ’）をさらに含み、前記閾値が、膀胱がんに罹患しているか又は発症リスクのある患者と膀胱がんに罹患していない患者とを識別する、請求項１または２に記載の方法。
4. ＦＧＦＲ３遺伝子中の前記変異が存在すること、ならびに
   ＳＥＰＴＩＮ９遺伝子、ＳＬＩＴ２遺伝子、ＴＷＩＳＴ１遺伝子、ＨＳ３ＳＴ２遺伝子およびその断片または変異体からなる群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーの前記メチル化度を前記閾値と比較して膀胱がんに罹患しているか又は発症リスクのある患者と膀胱がんに罹患していない患者とを識別することにより、膀胱がんまたは膀胱がんの発症リスクを予測および／または検出する、請求項３に記載の方法。
5. 本発明の方法の前記工程ａ）が、ＴＥＲＴ遺伝子中の変異を検出する工程をさらに含み、前記検出が、
   配列番号３２のヌクレオチド番号を参照して示される変異７７Ｃ→Ｔおよび９９Ｃ→Ｔからなる群より選択される変異を検出することにより実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記工程ｂ）に、
   配列番号３に示されるＳＥＰＴＩＮ９の断片のメチル化度を測定し；
   配列番号４に示されるＳＬＩＴ２の断片のメチル化度を測定し；
   配列番号５に示されるＴＷＩＳＴ１の断片のメチル化度を測定し；および
   配列番号６に示されるＨＳ３ＳＴ２の断片のメチル化度を測定する工程が存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記工程ｂ）が、ＤＤＲ１遺伝子またはその断片もしくは変異体の一つのメチル化度を測定する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記断片が配列番号７に示される、請求項７に記載の方法。
9. 前記第一および第二生体試料が尿である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記工程ａ）がアレル特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）により実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記工程ａ）が、配列番号８〜１３に示される全てのプライマーを使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記工程ｂ）が定量的リアルタイム多重メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑｍ−ＰＣＲ）により実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記工程ｂ）が、配列番号１６〜３０に示されるプライマーおよびプローブを使用して実施される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記方法がハウスキーピング遺伝子のメチル化度を測定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記ハウスキーピング遺伝子が、アルブミン、β−アクチン、およびβ−グロビン、好ましくは、アルブミン遺伝子またはその断片もしくは変異体の中から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記閾値が累積メチル化インデックスで表される、請求項３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記方法が、ＢＣＬＡ−４およびＢＣＡＲ−１からなる群より選択される遺伝子の発現レベルを測定する工程ｃ）をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記工程ｃ）が、前記発現レベルを、健常者または膀胱がんを克服した被験者で得られる発現レベルと比較する工程ｃ’）をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 下記（ａ）及び（ｂ）を含むキットの使用。
    （ａ）配列番号８と９との対、配列番号８と１０との対、配列番号１１と１２との対及び配列番号１１と１３との対からなる群より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの対；並びに
    （ｂ）配列番号１６と１７との対、配列番号１９と２０との対、配列番号２２と２３との対、配列番号２５と２６との対及び配列番号２８と２９との対からなる群より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの対、及び／又は配列番号１８、２１、２４、２７及び３０からなる群より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド