CN102888406A - 人类特发性基底节钙化致病基因及其编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组变异的人类SLC20A2基因，并揭示了该变异的人类SLC20A2基因为特发性脑基底节钙化疾病的致病基因。利用该变异的人类SLC20A2基因，可以对特发性基底节钙化疾病进行诊断和患病风险评价。本发明还提供了由所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质，该蛋白质可作为治疗该类基底节钙化的药物靶点。此外，本发明还提供了用于特发性基底节钙化疾病诊断的试剂盒，以及变异的人类SLC20A2基因在制备人类特发性基底节钙化疾病基因诊断芯片中的应用。

Description

人类特发性基底节钙化致病基因及其编码蛋白

技术领域

本发明涉及一种人体变异的基因，即人类特发性基底节钙化(IBGC)致病基因SLC20A2。本发明还涉及这种变异基因及其编码的蛋白在检测和作为治疗IBGC疾病的药物靶点中的作用和意义。

背景技术

特发性脑基底节钙化(Idiopathic Basal Ganglia Calcification，IBGC)俗称Fahr病，是一种先天性神经系统锥体外系疾病，大脑X-射线电子计算机断层扫描(CT)发现率为1-2％^[1-2]。大多数IBGC家系表现为常染色体显性遗传方式，也有常染色体隐性遗传和性染色体连锁遗传的报道。IBGC症在CT上表现为大脑双侧对称性基底节钙化。常见钙化部位的发生顺序是苍白球、尾状核、壳核、丘脑、额顶叶脑回底部、齿状核、小脑皮层、脑干中央部及侧脑室周围，在CT上可表现为卵圆形和或八字形高密度影，常为对称性。患者运动能力逐渐受损或丧失，智力和意识表现痴呆、癫痫、精神障碍等，目前尚未有针对性药物治疗该病。其发病机制不清楚，对其进行分子遗传学研究有望克隆其致病基因，为寻找药靶、开发相关药物及治疗该病奠定基础。目前该病定位3个致病位点14q13(IBGC1)、2q37(IBGC2)和8p21.1-q11.23(IBGC3)，其中IBGC3位点是我们定位的。该病的致病基因尚未克隆，因此对IBGC致病基因进行系统研究，将对大脑基底节钙化的诊断、开发针对性的药物及治疗具有十分重要理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的在于提供IBGC致病基因，定位出该疾病的基因突变位点，以及利用该疾病的基因突变位点检测人体中是否存在该基因突变的方法。同时提供IBGC致病基因编码的蛋白质序列及其突变导致的细胞磷吸收下降，为阐明该病的致病机制提供了基础，为进一步治疗该病提供了设计药物的靶点。

本发明真对收集并鉴定的一个IBGC大家系进行微卫星标记的连锁分析，排除了与IBGC1和IBGC2的连锁关系，但将该家系的致病基因定位于IBGC3位点，进一步连锁缩短了IBGC3位点即将8p21.1-q11.23(25Mb物理图距，12.29cM遗传图距)缩短在8p12-q11.23(19.5Mb物理图距，6.40cM遗传图距)染色体区段。

本发明对定位于8p12-q11.23区域内特发性基底节钙化的41个候选基因进行双向测序，在第一个家系中发现SLC20A2基因一个点突变；在第二、三个家系中，发现该基因三个新点突变，第二个家系先征者存在两个点突变，一个突变来自父亲，第二个突变来自母亲。随后在巴西和西班牙IBGC家系中发现该基因四个新的突变包括两个缺失突变和两个点突变。上述的八个突变分别在各自家系中所有患者的DNA样品上均得到验证，在家系正常成员、508例正常汉族人群和96例欧洲人群中不存在上述突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性。同时发现这些突变造成所编码的氨基酸缺失、移码和改变，由此，

本发明提供了8种如SEQ ID NO：2-9所示的变异的人类SLC20A2基因，其特征分别在于，所述SLC20A2基因编码区第124-126缺失3个碱基(鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤即GTG)、第362位胞嘧啶被鸟嘌呤替换(C＞G)、1409位胞嘧啶碱基缺失(delC)、1492位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G＞A)、第1723位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G＞A)、第1784位胞嘧啶碱基被胸腺嘧啶替换(C＞T)、第1802位胞嘧啶碱基被鸟嘌呤或胸腺嘧啶替换(C＞G/T)。正常的人类SLC20A2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了8种如SEQ ID NO：45-52所示的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质序列，其特征分别在于，SLC20A2蛋白的氨基酸序列分别是第42位Val缺失(p.V42del)、第121位的Ser变为Cys(p.S121C)、从470位的Pro移码(p.P470LfsX37)37个氨基酸终止、第498的Gly突变为Arg(p.G498R)、第575位Glu突变为Lys(p.E575K)、第595位的Thr突变为Met(p.T595M)及第601位的Ser突变为Trp或Leu(p.S601W/L)。正常的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示。

本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，其步骤：

(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；

(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物；

(3)对所述PCR产物进行核苷酸序列测定，与SEQ ID NO：1序列比对，以确定所述生物样本中是否含有SLC20A2基因突变。

优选地，所述生物样本为体液，该体液包括但不限于：血液、血浆、羊水、淋巴液等。

优选地，所述体液为血液。

优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为：SEQ ID NO：10和11；12和13；22和23；26和27；28和29。本领域技术人员还可以使用SEQ ID NO：14和15；16和17；18和19；20和21；24和25的引物对扩增相应核苷酸序列。

本发明还提供了检测来源人体的生物样本中是否存在上述八种突变的方法，其步骤包括：

(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；

(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物；

(3)对所述PCR产物进行限制性内切酶酶切；

(4)对所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察和拍照电泳图，与表2相关酶切产物大小比对，以确定所述生物样本中是否含有SLC20A2基因上述八种突变。

优选地，所述体液为血液或羊水。

优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为：SEQ ID NO：30和31；32和33；34和35；36和37；38和39；40和41；42和43。

优选地，上述PCR产物中使用的6种限制性内切酶Hpa I、EcoR I、Bam HI、Hind III、Sph I和Sac I。

本发明还提供了变异的人类SLC20A2基因功能改变，如附图6所示，该基因编码的蛋白是分布在细胞膜上钠磷共转体，对细胞维持磷的内稳态非常重要，SLC20A2基因突变导致该共转体功能下降，从而导致细胞对磷的吸收下降(见实施例4)，打破了这种内稳态，使细胞外积累大量的无机磷以至于与基质中钙结合形成磷酸钙颗粒，长期积累而导致基底节钙化。因此人类SLC20A2变异基因可以作为药物的靶点，开发相关药物治疗人类大脑基底节钙化提供了科学依据。

根据发明人提供的SLC20A2基因序列变异的位点，应用本发明提供的检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，对七个特发性基底节钙化家系所有个体进行突变检测。结果发现八个突变包括两个缺失突变和六个点突变，而家系正常成员、508例正常汉族个体和96例欧洲个体中不存在上述突变。证明本发明提供的方法能够精确诊断由SLC20A2基因突变导致的IBGC疾病。同时对该基因突变所编码的蛋白质进行功能分析，发现SLC20A2突变会导致细胞对磷的吸收下降，从而导致人的基底节钙化。一方面为颅内钙化患者是否是该基因突变导致的提供病因诊断依据；另一方面在无临床表现人群中进行该基因突变筛查，提供优生优育指导；第三，为治疗该类基底节钙化疾病提供药物靶点。

附图说明

以下将通过实施例和附图对本发明作进一步的说明。

图1为家系2中IBGC先证者(a和b)和先证者父亲(c)及母亲(d)的脑CT图，a-b表明先证者的颅内广泛钙化-双侧大脑半球(额叶、顶叶、颞叶和枕叶)皮质、基底节、丘脑下部和双侧小脑；其父亲(c)双侧豆状核、尾状核和丘脑下部钙化；而其母亲(d)仅仅左侧苍白球轻度钙化。

图2为IBGC家系1(a)和家系2(b)的系谱，箭头代表先证者。

图3为IBGC家系1和2致病基因在8号染色体的定位区域。

图4为SLC20A2基因8个突变序列SEQ ID NO：2-9与正常序列SEQ ID NO：1在突变位点的对比示意图，箭头表示突变发生开始位置或突变位置：a，突变发生在编码区第124-126缺失3个碱基(鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤即GTG)；b，突变发生在第362位胞嘧啶被鸟嘌呤替换；c，突变发生在1409位胞嘧啶碱基缺失(delC)；d，突变发生在第1492位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G＞A)；e，突变发生在第1723位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G＞A)；f，突变发生在第1784位胞嘧啶碱基被胸腺嘧啶替换(C＞T)；g，h，突变发生在第1802位胞嘧啶碱基被鸟嘌呤或胸腺嘧啶替换(C＞G/T)。

图5为家系1(图a)和家系2(图b)突变验证图。示相关突变与该家系疾病共分离。

图6发明人发现IBGC致病基因的8个突变转染CHO细胞对磷吸收的影响图。示这些突变体与野生型(³²磷吸收设为100)相比³²磷吸收值。

图7为具体实施方式中的PCR反应程序(a)和单链扩增PCR反应程序(b)。

具体实施方式

实施例1：IBGC3致病位点的精细定位

1、家系收集与鉴定：发明人通过对先征者及其家庭进行医学检查和临床诊断，采集了第二个常染色体显性IBGC家系(四代8名患者，先证者的脑CT如图1，对称性基底节钙盐沉积，血清中生化检查各项指标正常，符合IBGC的临床特征。系谱图如图2b)的外周血样本。

2、基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

3、IBGC致病位点连锁分析：首先对已报道的3个IBGC定位位点区域的微卫星标记进行连锁分析，排除了该家系致病基因与IBGC1和IBGC2区域的连锁。初步将第二个IBGC家系的致病基因定位在IBGC3位点，对连锁位点的染色体上下游区域，从LMS V2.5-MD5和Genethon连锁图谱(Dib等1996)微卫星标记中，选用含较高信息量的微卫星标记，由上海基康生物技术公司合成引物并加荧光标记，对致病基因所在位点进行精细定位，根据交换发生的位置，确定致病基因在染色体上的精确位置。进一步的精细定位将IBGC3位点即8p21.1-q11.23(25Mb物理图距，12.29cM遗传图距)缩短在8p12-q11.23(18.5Mb物理图距，6.40cM遗传图距)染色体区段(图3)。

基因的染色体定位技术在分子遗传学领域对于本领域的研究人员而言是已知的技术，本发明是利用该技术发现可能导致人类疾病的变异基因。

实施例2：IBGC致病基因的克隆

1、候选基因的筛选

发明人根据基底节钙化的病理机制和基因结构与功能特点，优先选择大脑表达以及与神经系统异常相关的基因作为候选基因，发明人在已定位的IBGC区段(8p12-q11.23)内选择41个候选基因UNC5D，ZNF703，KCNU1，ERLIN2，PROSC，RAB11FIP1，EIF4EBP1，ASH2L，LSM1，BAG4，DDHD2，PPAPDC1B，WHSC1L1，LETM2，ADAM9，ADAM2，ZMAT4，GOLGA7，AGPAT6，NKX6-3，ANK1，PLAT，IKBKB，DKK4，UDAC3，SLC20A2，CHRNB3，CHRNA6，POLB，THAP1，SGK196，HGSNAT，MCM4，EFCAB1，SNAI2，CEBPD，UBE2V2，SNTG1，PXDWL，PCMTD1和ST18。

2、基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

3、对候选基因进行测序

发明人根据外显子特异的PCR扩增引物用Primer5软件设计(如表1所示)，并由上海桑尼生物有限公司合成这些引物，对样本目标片段进行PCR体外扩增，扩增片段包含了SLC20A2基因编码区所有外显子、外显子-内含子交界处序列，序列来源为Ensemble GenomeBrowser，扩增片段大小如表1所示。测序选择家系先征者以及一名正常个体同时进行，使用ABI公司商品化的试剂盒，在全自动测序仪上完成，所有扩增片段的都会进行双向测序，测序结果与Ensemble Genome Browser数据库中SLC20A2基因的正常序列比对分析。成功地克隆了IBGC致病基因SLC20A2，正是由于该基因发生了突变导致了IBGC疾病的发生。第一个家系中，突变发生在第8外显子编码区(c.1492G＞A/p.G498R)(图4d)；第二、三个家系中，突变发生在第11个外显子编码区(同一个位的碱基发生不同的突变)(c.1802C＞G/p.S601W；c.1802C＞T/p.S601L)(图4g和h)；第二个家系先征者存在两个突变，一个突变来自父亲(c.1802C＞G/p.S601W)，第二个突变来自母亲(c.362C＞G/p.S121C，图4b)。随后在巴西和西班牙IBGC家系中发现该基因四个突变分别是c.124-126delGTG/p.V42del(图4a)，c.1409delC/p.470Lfs37X(图4c)，c.1723G＞A/p.E575K(图4e)，c.1784C＞T/p.T595M(图4f)。上述的八个突变分别在各自家系中所有患者的DNA样品上均得到验证，在508例正常汉族人群和96例欧洲人群中不存在上述突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性。八个突变序列和正常人的序列比对示意图如图4所示。

表1 IBGC家系SLC20A2基因编码区所有外显子测序引物

发明人通过PCR扩增、产物纯化、测序等方法获得SLC20A2基因编码区所有外显子和外显子与内含子交界处序列，具体方法如下：

(1)PCR反应体系成分：dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR buffer由北京天根生化科技有限公司提供；引物由上海桑尼生物有限公司合成。

(2)PCR反应总体系为40μl：10×PCR buffer 4.0μl，dNTPs 1.0μl，超纯水31.1μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，引物1.0μl+1.0μl，DNA1.5μl。

(3)PCR扩增程序如图7a所示。

(4)PCR产物电泳检测

PCR反应结束后，取3μlPCR产物加1μl的6×Loading buffer混匀，用1.5％的琼脂糖胶检查紫外灯下观察，电泳结果用佳能相机(Canon PowerShot A490)采集。

(5)PCR扩增产物的回收

采用上海生工生物工程技术服务有限公司的胶回收试剂盒进行PCR产物回收。

①将普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切割含有目的PCR片段琼脂糖块，放入1.5mL离心管。

②按每100毫克琼脂糖胶加入300μl溶胶液的比例加入溶胶液(Solution S1)，置于EppendorfThermo Stat plus恒温干浴锅(50℃)中10分钟，中间可颠倒混匀若干次，使琼脂糖块完全融化。如果琼脂糖块的重量小于100毫克，用ddH₂O补充至100毫克，以确保体系总量基本恒定。对于高浓度的琼脂糖胶块(＞2％)，按照100毫克琼脂糖加入100μL ddH₂O和500μl溶胶液的比例加入S1。

③当DNA片断小于500bp时，应加入1/3 S1体积的异丙醇，混匀，以促进DNA的析出。50℃温浴10分钟(当DNA片断大于500bp时可省略此步骤，直接进行下一步)。

④将溶化后的琼脂糖液转移至回收柱中，9000rpm离心45秒。倒掉收集管中的液体，将回收柱放回同一收集管中。

⑤在回收柱中加入500μl洗涤液(W1液，Washing Buffer)(W1液在使用前应加入规定量的无水乙醇)，静置2分钟，然后9000rpm离心60秒。倒掉收集管中的液体，将回收柱放回同一收集管中。

⑥重复上一步，在回收柱中加入500μl W1液，静置2分钟，然后9000rpm离心60秒。倒掉收集管中的液体，将回收柱放入同一收集管中。

⑦12000rpm离心2分钟。

⑧将回收柱放入一个干净的1.5ml的EP管中，室温放置10分钟左右，使酒精挥发干净。

⑨在吸附膜中央加入35μl洗脱液(T1液)，室温放置5分钟后，12000rpm离心1分钟。将产物置于4℃冰箱保存。

(6)BigDye末端标记反应(单链扩增PCR)10μl体系：PCR胶回收产物2.0μl，BigDye0.25μl，BigDye buffer 1.875μl，引物0.2μl，超纯水5.675μl。

单链扩增PCR的反应程序见图7b。

(7)BigDye反应产物的纯化

①离心，将BigDye反应产物收集至管底。

②将BigDye反应产物转移至1.5ml EP管中。

③加入15μl 42mM的EDTA和75μl无水乙醇，振荡混匀。

④室温避光静置30-60分钟。

⑤在4℃下132,000rpm离心30分钟。

⑥抽滤吸掉上清后，加入500μl 70％的乙醇溶液清洗。

⑦在4℃下132,000rpm离心15分钟。

⑧抽滤去掉上清后，在42℃下用Eppendorf Concentrator 5301旋转真空干燥仪干燥2分钟。

⑨加入10μl Hi-Di formamide，充分振荡促进溶解。

(8)测序

将Hi-Di formamide溶解的样品，95℃变性5分钟，然后置于冰水混合物上迅速冷却，保持单链状态。使用ABI 3100 Genetic Analyzer进行毛细管电泳，用ABI

3100 DataCollection Version 2.0收集数据，用Sequence Analysis V5.1.1对测序结果进行分析。

实施例3：IBGC致病基因突变检测

为了验证本发明的突变，我们对收集的IBGC家系成员进行详细的临床检查，包括大脑CT、血清中钙、磷、甲状腺素、维生素D、尿酸、碱性磷酸酶及其血浆中甲状旁腺激素等检查，确定家系中患者和正常人员，同时收集了604例家系外正常人。所有参加调查和被采集血样的家系成员都了解本研究的目的和意义并知情同意。

1、基因组DNA提取，同前所述。

2、利用错配引物创造酶切位点法检测SLC20A2基因突变

发明人在常染色体显性遗传IBGC家系中发现SLC20A2基因的6个错义突变和2个碱基缺失突变，均不能改变限制性内切酶位点或产生新的限制性内切酶位点，发明人利用错配碱基(CRS)产生酶切位点的方法对患者和正常对照对应的外显子PCR扩增再进行酶切，发现正常对照的样本对应的外显子PCR扩增产物大小和酶切后片段大小如表2所示，小片段(如14bp、19bp、20bp和21bp)在琼脂糖电泳中均跑出胶外，因此正常对照样本的扩增产物中分别仅看到1条带，而患者扩增产物可以看到两条带(如图5所示)。

第1个IBGC家系患者的第8外显子PCR扩增产物被切成165bp、146bp和19bp三个片段，19bp跑出胶外，因此在胶图上看到165bp和146bp两个片段(图5a)。第二、三个IBGC家系患者的第11个外显子PCR扩增产物被切成117bp、96bp和21bp三个片段，21bp跑出胶外，因此在胶图上看到117bp和96bp两个片段(见图5b)。

在第二个家系中先证者和其妹妹颅内钙化非常严重，钙化部位涉及非常广泛如图1a和b所示，钙化涉及双侧大脑半球(额叶、顶叶、颞叶和枕叶)皮质、基底节、丘脑下部和双侧小脑等部位，临床表现自幼反复癫痫发作、发育迟缓、智力障碍、肌张力障碍等症状，其妹妹除了上述症状外，还有小脑共济失调症状。现发现这两位患者携带两个突变(p.S121C和p.S601W)，分别来自其母亲(家系4IBGC成员)p.S121C突变和父亲(家系2IBGC成员)p.S601W突变。其父亲颅内钙化涉及双侧豆状核、尾状核和丘脑下部钙化(见图1c)，而其母亲仅仅左侧苍白球轻度钙化(见图1d)，均无临床症状。因此该发明一方面为颅内钙化患者是否是该基因突变导致的提供病因诊断依据，另一方面在无临床表现人群中进行该基因突变筛查，提供优生优育指导。

利用错配引物创造酶切位点方法检测本发明SLC20A2基因的8个突变，详细如下：

(1)组成：错配引物序列(表2)、Taq酶、缓冲液、dNTP、DNA样本(25ng/μl)和6种限制性内切酶Hpa I、EcoR I、Bam HI、Hind III、Sph I和Sac I。

表2 8个SLC20A2基因突变的错配引物、限制性内切酶、PCR产物和酶切产物大小

(2)方法：

A.先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应(程序如图7a)；

B.取上述PCR产物10μl，加入相关的限制性内切酶0.3μl，双蒸水7.7μl，缓冲液2.0μl在37℃条件下酶切7-12小时；

C.配置4％的琼脂糖凝胶，对上述酶切产物进行电泳，结果与参照表2相关突变的酶切片段大小比较。

实施例4SLC20A2基因突变体载体构建及其功能分析

1、SLC20A2基因突变体载体构建

发明人将正常该基因的cDNA进行定点突变得到8个突变体：设计引物，加酶切位点及保护碱基，将正常该基因的cDNA克隆进pEGFP-C1载体中。之后再设计定点突变引物，依照pEGFP-C1-hSLC20A2-WT载体用搭桥法构建V42del、S121C、P470LfsX37、G498R、E575K、T595M、S601W和S601L突变型载体pEGFP-C1-hSLC20A2-V42del、pEGFP-C1-hSLC20A2-S121C、pEGFP-C1-hSLC20A2-P470fs、pEGFP-C1-hSLC20A2-G498R、pEGFP-C1-hSLC20A2-E575K、pEGFP-C1-hSLC20A2-T595M、pEGFP-C1-hSLC20A2-S601W和pEGFP-C1-hSLC20A2-S601L，为后续功能研究做准备。

2、转染中国仓鼠卵(CHO)细胞和细胞对无机磷吸收的影响

分别将野生型(WT)和各类突变体质粒分别转染CHO细胞，24个小时后弃去培养基，用无磷缓冲液冲洗2-3次，用无磷培养基37℃培养1小时，去除无磷培养基，然后用含1mM放射性磷标记的培养基室温培养2-3分钟，弃去培养基，用无磷缓冲液冲洗2-3次，加入裂解液裂解细胞，测定磷的放射性量。

结果CHO细胞本底磷的吸收值为107.75cpm/μg蛋白，而野生型和p.S121C、p.V42del、p.P470fs、p.G498R、p.E575K、p.T595M、p.S601W、p.S601L突变体的磷吸收分别是191.25、189.14、160.39、156.35、156.89、164.73、155.63、151.00和152.19cpm/μg蛋白。减去CHO细胞本底磷的吸收值后，野生型和p.S121C、p.V42del、p.P470fs、p.G498R、p.E575K、p.T595M、p.S601W、p.S601L突变体的磷吸收分别是84、81、53、49、49、57、48、43、44cpm/μg蛋白。以WT的放射性磷吸收设为100，其它突变型p.S121C、p.V42del、p.P470fs、p.G498R、p.E575K、p.T595M、p.S601W和p.S601L与其相比较的磷吸收值分别为96、63、57、58、68、57、51和52如图6所示，它们的磷吸收值分别下降4、37、43、42、32、43、49和48。SLC20A2是一个钠和无机磷共转体，它的不同突变均造成不同程度磷吸收下降，这样会导致基底节(大量表达SLC20A2)等处神经元胞外基质中磷的积累，积累的无机磷和基质中钙结合形成磷酸钙颗粒，附着在周围的微血管外围，长期积累而导致基底节处的血管周围和血管钙化。不同突变造成的基底节钙化的程度不同，如p.S121C突变仅仅导致轻微的磷吸收下降，因此导致的基底节钙化的程度很微弱如图1d所示。其它突变如p.G498R、p.S601W等造成磷吸收大幅度下降，这种情况会导致基底节严重钙化(图1c)。而携带两个杂合突变(p.S121C和p.S601W)个体如先征者和其妹妹，可能导致磷吸收严重下降，因此会造成颅内广泛钙化如图1a和1b。

实施例5：体外检测IBGC患者SLC20A2基因突变的试剂盒

为了检测其它IBGC家系该基因的致病突变，本发明设计了该基因编码区所有外显子和外显子与内含子交界处的引物序列，如表1所示。扩增测序条件同实施例2。

1、试剂盒组成：

引物：IBGC致病基因引物共10对20条，每条引物两个OD值，其序列如表1所示；

Taq酶

缓冲液

dNTP

从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应；

(3)对每对引物的PCR扩增产物进行纯化；

(4)对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

(5)对BiyDye反应产物纯化；

(6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

实施例6：体外检测IBGC患者中本发明提供的SLC20A2基因8个突变体试剂盒

1、试剂盒组成：

引物：检测8个突变体错配引物序列如表2所示

Taq酶

缓冲液

dNTP

从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)

6种限制性内切酶Hpa I、EcoR I、Bam HI、Hind III、Sph I和Sac I。

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应；

(3)取上述PCR产物10μl，加入相关的限制性内切酶0.3μl，双蒸水7.7μl，缓冲液H2.0μl在37℃条件下酶切7-12小时；

(4)配置4％的琼脂糖凝胶，对上述酶切产物进行电泳，结果与参照表2相关突变的酶切片段大小比较。

实施例7：基因芯片法检测IBGC患者中SLC20A2基因突变

实施过程如下：

1、基因有限公司制备SLC20A2基因的寡核苷酸DNA微阵列芯片；

2、提取正常对照和IBGC患者的外周血基因组DNA，方法同前所述；

3、利用实施例2中SLC20A2基因测序引物，分别PCR扩增正常对照和IBGC患者SLC20A2基因相应外显子序列；

4、用Cy3荧光标记正常对照SLC20A2基因上述扩增产物--正常对照SLC20A2基因探针；

5、用FITC荧光标记IBGC患者SLC20A2基因上述扩增产物--IBGC患者SLC20A2基因探针；

6、将上述两类探针与SLC20A2基因的寡核苷酸DNA微阵列芯片杂交；

7、将诊断芯片用荧光扫描仪扫描，扫描结果显示检测监控系统中荧光信号，判断检测IBGC患者中SLC20A2基因是否有突变。

以下为本发明涉及的核苷酸序列和氨基酸序列表，其中

序列1至9依次为：正常人SLC20A2基因核苷酸序列(1959bp)；本发明提供的SLC20A2基因突变体1核苷酸序列(1956bp，与正常序列比较124、125、126位的GTG缺失，即c.124-126delGTG)；本发明提供的SLC20A2基因突变体2核苷酸序列(1959bp，与正常序列相比第362位的C突变为G，即c.362C＞G)；本发明提供的SLC20A2基因突变体3核苷酸序列(1958bp，与正常序列相比第1409位的C缺失，即c.1409delC)；本发明提供的SLC20A2基因突变体4核苷酸序列(1959bp，与正常序列相比第1492位的G突变为A，即c.1492G＞A)；本发明提供的SLC20A2基因突变体5核苷酸碱基序列(1959bp，与正常序列相比第1723位的G突变为A，即c.1723G＞A)；本发明提供的SLC20A2基因突变体6核苷酸序列(1959bp，与正常序列相比第1784位的C突变为T，即c.1784C＞T)；本发明提供的SLC20A2基因突变体7核苷酸序列(1959bp，与正常序列相比第1802位的C突变为G，即c.1802C＞G)；本发明提供的SLC20A2基因突变体8核苷酸序列(1959bp，与正常序列相比第1802位的C突变为T，即c.1802C＞T)。

序列10至43为本专利申请说明书中表1和表2中的引物序列。

序列44至52依次为：正常人SLC20A2基因所编码的蛋白质序列(652个氨基酸)；SLC20A2基因突变体1所编码的蛋白质序列(651个氨基酸，和正常相比第42位Val缺失，即p.V42del)；SLC20A2基因突变体2所编码的蛋白质序列(652个氨基酸，与正常相比第121位的Ser变为Cys，即p.S121C)；SLC20A2基因突变体3所编码的蛋白质序列(506个氨基酸，与正常相比从470位的Pro突变为Leu移码37个氨基酸终止，即p.P470Lfs37X)；SLC20A2基因突变体4所编码的蛋白质序列(652个氨基酸，与正常相比第498位Gly突变为Arg即p.G498R)；SLC20A2基因突变体5所编码的蛋白质序列(652个氨基酸，与正常相比第575位的Glu突变为Lys，即p.E575K)；SLC20A2基因突变体6所编码的蛋白质序列(652个氨基酸，与正常相比第595位的Thr突变为Met，即p.T595M)；SLC20A2基因突变体7所编码的蛋白质序列(652个氨基酸，与正常相比第601位的Ser突变为Trp，即p.S601W)；SLC20A2基因突变体8所编码的蛋白质序列(652个氨基酸，与正常相比第601位的Ser突变为Leu，即p.S601L)。

Claims (9)

1.一种变异的人类SLC20A2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2至9中任一序列所示。

2.权利要求1所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQID NO：45至52中任一序列所示。

3.权利要求1所述的变异的人类SLC20A2基因在制备人类特发性基底节钙化疾病基因诊断芯片中的应用。

4.权利要求2所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质作为治疗人类特发性基底节钙化疾病的药物靶点。

5.一种体外检测SLC20A2基因突变的试剂盒，含有以下10对引物中的一对或几对或全部：

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有Taq酶、缓冲液和dNTP。

7.一种体外检测SLC20A2基因突变的试剂盒，含有以下7对引物中的一对或几对或全部：

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还含有Taq酶、缓冲液和dNTP。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，还含有限制性内切酶Hpa I、EcoRI、Bam HI、Hind III、Sph I和Sac I。

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