ES2295388T3 - Gen asociado al asma. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar si un sujeto tiene, o corre riesgo de desarrollar, una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial, que comprende determinar, en una muestra de células procedente del sujeto, (i) el nivel de expresión de un polinucleótido (A) que comprende la secuencia de nucleótidos Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6 o una secuencia que se hibrida a la misma bajo condiciones restrictivas, o el nivel de expresión de un polipéptido (B) que comprende la secuencia de aminoácidos Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8 o una de sus variantes que tiene equivalencia funcional de adhesión célula-célula, o el nivel de una bioactividad de dicho polipéptido (B) midiendo la adhesión célula-célula dependiente de calcio, y comparar el nivel de expresión de (A) o (B) o el nivel de bioactividad de (B) con el nivel respectivo de expresión de (A) o (B) o la bioactividad en un sujeto sano, o (ii) la presencia de una variante de dicho polinucleótido (A) asociado con la hipersensibilidad bronquial, teniendo dicha variante de polinucleótido (A) T en la posición correspondiente a la posición 6377 en el Nº ID SEC: 1 y/o C en la posición correspondiente a la posición 7390 en el Nº ID SEC: 1.

Description

Gen asociado al asma.

La presente invención se refiere al uso de un gen asociado al asma, denominado AAGA, a la molécula proteínica codifica por AAGA y a moléculas relacionadas en el rastreo de diagnóstico y pronóstico de poblaciones de pacientes, a polimorfismos en AAGA y al uso de la proteína codificada por AAGA o una de sus variantes como un agente terapéutico.

El asma es una enfermedad pulmonar muy común con las siguientes características:

obstrucción de las vías respiratorias - esta es habitualmente reversible pero a menudo progresiva

inflamación bronquial crónica - un estado caracterizado por infiltración y activación de células inflamatorias, liberación de mediadores bioquímicos y cambios estructurales (remodelación de las vías respiratorias)

hipersensibilidad bronquial (BHR) - una respuesta broncoconstrictora exagerada a una variedad de estímulos inmunológicos, bioquímicos y físicos.

El asma se caracteriza clínicamente por obstrucción crónica intermitente de las vías respiratorias con sibilación, tos y falta de aliento. Aunque el asma está típicamente asociada con un deterioro obstructivo que es reversible, ni este hallazgo ni ninguna otra prueba o medida simple es adecuado para diagnosticar el asma [Guidelines for the diagnosis and development of asthma, 1997, NIH Publication Nº 97-4051]. Muchas enfermedades están asociadas con este patrón de anormalidad. El patrón de síntomas del paciente (junto con otra información procedente del historial médico del paciente) y la exclusión de otros diagnósticos posibles también son necesarios para establecer un diagnóstico de asma. Se necesita un juicio clínico para efectuar la determinación del asma. Los pacientes con asma son heterogéneos y presentan signos y síntomas que varían ampliamente de paciente a paciente así como dentro de cada paciente a lo largo del tiempo.

Se han avanzado muchas hipótesis para explicar la patofisiología del asma, incluyendo problemas con el músculo liso de las vías respiratorias, el papel de la inflamación, la inervación nerviosa de las vías respiratorias y mecanismos relacionados con mediadores. Aunque todos estos factores pueden ser importantes, no está claro cuáles son los defectos primarios (es decir, causales) y cuáles son los efectos secundarios. Sin embargo, generalmente se está de acuerdo en que son importantes tanto el ambiente como la genética. Dada la naturaleza multifactorial del asma, un sistema para identificar los mecanismos fundamentales es descubrir genes de susceptibilidad al asma que predisponen a los individuos a desarrollar asma.

Un método que puede usarse para identificar genes de susceptibilidad al asma es la clonación posicional. En este método, los genes de susceptibilidad se localizan en una región específica de un cromosoma humano usando marcadores de DNA para seguir la herencia de los genes a través de familias. Los marcadores de DNA son fragmentos de DNA con una localización física definida en un cromosoma, cuya herencia puede verificarse. Cuanto más cerca esté un marcador de DNA de un gen de susceptibilidad, mayor será la probabilidad de que el marcador y el gen de susceptibilidad pasen conjuntamente de padre a hijo. Este fenómeno se denomina conexión genética. Una vez que se ha obtenido la conexión con una región cromosómica específica, el tamaño de la región se estrecha usando una combinación de mapeo físico y genético hasta que la región es suficientemente pequeña para que pueda someterse a secuenciación y pueda identificarse el gen de susceptibilidad. Después de la identificación del gen de susceptibilidad, pueden determinarse cualesquiera polimorfismos en este gen y realizarse un análisis para observar si estas mutaciones se producen con mayor preponderancia en asmáticos en comparación con no asmáticos. Las principales ventajas de la clonación posicional son que es posible identificar nuevos genes aun cuando los factores subyacentes que provocan la enfermedad sean desconocidos, y los genes identificados son de importancia patológica directa (es decir, defectos causales primarios) debido a que hacen a los portadores directamente susceptibles de desarrollar la
enfermedad.

En los últimos años, un número de grupos de investigación académicos ha proporcionado evidencia de la presencia de genes de importancia en la regulación de respuestas asmáticas y alérgicas en el cromosoma 5 humano. En particular, la evidencia de la presencia de genes de susceptibilidad para BHR y niveles de IgE elevados en suero en el cromosoma 5 en la subregión 5q31-5q33 [Meyers y otros, Genomics 23: 464-470; Postma y otros, N. Eng. J. Med. 333:894-900; y Bleecker y otros, Clin. Exp. Allergy 25:84-88] se obtuvo a partir del análisis de conexión genética de 92 familias asmáticas holandesas. Tal evidencia de la conexión genética entre marcador D5S436, niveles de IgE totales en suero [Meyers y otros, Genomics 23: 464-470; Postma y otros, N. Eng. J. Med. 333:894-900; y Bleecker y otros, Clin. Exp. Allergy 25:84-88] y BHR [Postma y otros, N. Eng. J. Med. 333:894-900; y Bleecker y otros, Clin. Exp. Allergy 25:84-88] se encontró en las familias holandesas.

No se ha identificado todavía ningún gen de susceptibilidad al asma, de modo que existe una necesidad en la técnica para la identificación de tales genes. La identificación de genes de susceptibilidad al asma proporcionaría una comprensión fundamental del proceso patológico a partir de la cual surgiría un número de aplicaciones clínicamente importantes. Los genes de susceptibilidad identificados pueden conducir al desarrollo de terapéuticas (fármacos de moléculas pequeñas, moléculas antisentido, moléculas de anticuerpo) directamente orientadas al gen o el producto proteínico del gen, o pueden orientar la ruta bioquímica de la que es parte el producto proteínico a una localización aguas arriba o aguas abajo si el desarrollo de tales fármacos es más fácil que orientar directamente el gen o su producto proteínico.

Secuencias polinucleotídicas que comprenden el gen, sus variantes de secuencia y sus productos proteínicos pueden usarse para desarrollar una prueba diagnóstica clínica para el asma y para la identificación de individuos con alto riesgo de desarrollo de asma. Los resultados de tales pruebas también pueden tener valor de pronóstico y pueden usarse para predecir pacientes que responden a y los que no responden a terapia farmacológica. Finalmente, la información acerca de las secuencias de DNA de genes de susceptibilidad al asma y las secuencias de aminoácidos codificadas por estos genes facilita la producción a gran escala de proteínas mediante técnicas recombinantes de identificación de los tejidos/las células que producen naturalmente las proteínas. Tal información de secuencia también permite la preparación de substancias de anticuerpo u otras nuevas moléculas de unión específicamente reactivas con las proteínas codificadas por los genes de susceptibilidad que pueden usarse al modular las reacciones de unión ligando natural/antiligando en las que las proteínas pueden estar implicadas y con propósitos diagnósticos.

Los términos usados en la presente memoria tienen los siguientes significados:

"Aislado" se refiere a material retirado de su ambiente original.

"Hibridación" o "hibrida" se refiere a cualquier procedimiento por el que una hebra de un polinucleótido se une a una hebra complementaria a través de apareamiento de bases.

"Condiciones restrictivas" se refiere a condiciones experimentales que permiten hasta 20% de desajuste de pares de bases, típicamente dos lavados de 15 minutos en 0,1 X SCC (NaCl 15 mM, citrato sódico 1,5 mM, pH 7,0) a 65ºC.

"Homología" u "homólogo" se refiere a un grado de similitud entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos, que puede ser parcial o, cuando las secuencias son idénticas, completa.

"Vector de expresión" se refiere a una molécula de DNA lineal o circular que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés conectado operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su transposición.

"Antisentido" se refiere a la inhibición selectiva de la síntesis de proteína a través de hibridación de un oligo- o poli-nucleótido a su secuencia complementaria en RNA mensajero (mRNA) de la proteína diana. El concepto de antisentido fue propuesto en primer lugar por Zamecnik y Stephenson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:280-284; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 285-288) y ha encontrado subsiguientemente amplia aplicación tanto como una herramienta experimental como un medio para generar moléculas terapéuticas putativas (Alama, A., Pharmacol. Res. 36:171-178; Dean, N.M., Biochem. Soc. Trans. 24: 623-629; Bennet, C.F., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:988-1000; Crooke, S.T., Antisense Research and Applications, Springer).

Se ha encontrado ahora mediante análisis de conexión genética y análisis bioinformático que AAGA, un gen del cromosoma 5 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8, secuencia de nucleótidos que tiene 100% de homología con secuencias de mRNA y ESTs correspondientes al gen de protocadherina-42, está asociado con la hipersensibilidad bronquial. La protocadherina-42 es un miembro de la superfamilia de las cadherinas. Las proteínas de esta superfamilia están implicadas en la adhesión célula-célula (intercelular), que representa un papel importante en una amplia gama de episodios in vivo y es crucial para el mantenimiento de la integridad tisular - véase M. Takeichi, Annu. Rev. Biochem (1990), 58, 237-52. Se ha encontrado que AAGA se expresa con un alto nivel en células epiteliales bronquiales humanas. También se ha encontrado que los polimorfismos en AAGA se presentan más predominantemente en pacientes asmáticos que en no asmáticos.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si un sujeto tiene, o corre riesgo de desarrollar, una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial, que comprende determinar, en una muestra de células procedente del sujeto, (i) el nivel de expresión de un polinucleótido (A) que comprende la secuencia de nucleótidos Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6 o una secuencia que se hibrida a la misma bajo condiciones restrictivas, o el nivel de expresión de un polipéptido (B) que comprende la secuencia de aminoácidos Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8 o una de sus variantes que tiene equivalencia funcional de adhesión célula-célula, o el nivel de una bioactividad de dicho polipéptido (B) midiendo la adhesión célula-célula dependiente de calcio, y comparar el nivel de expresión de (A) o (B) o el nivel de bioactividad de (B) con el nivel respecto de expresión de (A) o (B) o la bioactividad en un sujeto sano, o (ii) la presencia de una variante de dicho polinucleótido (A) asociado con la hipersensibilidad bronquial, teniendo dicha variante de polinucleótido (A) T en la posición correspondiente a la posición 6377 en el Nº ID SEC: 1 y/o C en la posición correspondiente a la posición 7390 en el Nº ID SEC: 1.

El término "variante", según se usa aquí, significa, en relación con secuencias de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos que está alterada en uno o más aminoácidos. Los cambios pueden implicar substitución, deleción o inserción de aminoácidos. En relación con las secuencias de nucleótidos, el término "variante", según se usa en la presente memoria, significa una secuencia de nucleótidos que está alterada en uno o más nucleótidos; los cambios pueden implicar substitución, deleción o inserción de nucleótidos. Una variante funcionalmente equivalente preferida de la secuencia de aminoácidos Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8 es una que tiene al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% y especialmente más de 95% de identidad de secuencias de aminoácidos con el Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8. En tales variantes funcionalmente equivalentes preferidas, las regiones de Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8 correspondientes al dominio extracelular habitualmente se conservan substancialmente.

Por una secuencia de aminoácidos que tiene x% de identidad con una secuencia de referencia tal como Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8 se entiende una secuencia que es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que puede incluir hasta 100-x alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia. Por ejemplo, en una secuencia de aminoácidos en cuestión que tiene al menos 80% de identidad con una secuencia de referencia, hasta 20% de los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia pueden substituirse, someterse a deleción o insertarse con otro residuo de aminoácido. El porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos puede determinarse convencionalmente usando programas informáticos conocidos, por ejemplo el programa FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y otros (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245).

El nivel de expresión de un polinucleótido (A), según se define anteriormente en la presente memoria, o un polipéptido (B), según se define anteriormente en la presente memoria, puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Nothern, transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), hibridación in situ, inmunprecipitación, hibridación por transferencia Western o inmunohistoquímica. El nivel de (A), por ejemplo como mRNA, o el polipéptido (B), medido mediante una de las técnicas anteriores, en células procedentes del sujeto, puede compararse con el nivel de (A) o (B), respectivamente, en un sujeto sano. Es probable que un nivel anormal de polinucleótido (A) o polipéptido (B) sea indicativo de actividad de AAGA aberrante asociada con hipersensibilidad bronquial.

El nivel de una bioactividad del polipéptido (B) puede medirse, por ejemplo, midiendo la adhesión célula-célula dependiente del calcio, por ejemplo promoviendo la agregación y la adhesión dependientes de Ca^{2+} homotípicas en células L, por ejemplo según se describe por Sano y otros, EMBO J. 12: 2249-2256. La comparación de la actividad medida en células procedentes del sujeto con la actividad medida en células procedentes de un sujeto sano indica si un sujeto tiene actividad de AAGA anormal asociada con hipersensibilidad bronquial.

Una variante de polinucleótido (A) asociado con hipersensibilidad bronquial puede ser una variante que tiene una alteración que altera la secuencia de aminoácidos en el polipéptido codificado o que altera el nivel de expresión del polipéptido codificado, la estabilidad de un transcrito o el modo en el que se procesa un transcrito. Tales alteraciones pueden implicar al menos una de las siguientes: (i) una deleción de uno o más nucleótidos del polinucleótido (A), (ii) una adición de uno o más nucleótidos al polinucleótido (A), (iii) una substitución de uno o más nucleótidos del polinucleótido (A), (iv) una redisposición cromosómica a gran escala del polipéptido (A), (v) una alteración a gran escala en el nivel de un transcrito de RNA mensajero del polinucleótido (A), (vi) modificación aberrante del polinucleótido (A), tal como del patrón de metilación del DNA genómico, (vii) la presencia de un patrón de reparación no silvestre de un transcrito de RNA mensajero del polinucleótido (A), (viii) un nivel no silvestre de polipéptido (B), (ix) pérdida alélica de polinucleótido (A), y/o (x) modificación postraduccional inapropiada del polipéptido (B). Pueden usarse diversas técnicas de ensayo para detectar alteraciones en un gen AAGA (polinucleótido (A)). Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos que implican análisis de secuencia, hibridación por transferencia Southern, electroforesis en gel sensible a la conformación (CSGE), mapeo de sitios de enzimas restricción y métodos que implican la detección en ausencia de apareamiento de nucleótidos entre el ácido nucleico que ha de analizarse y una sonda.

De acuerdo con esto, en una modalidad, la variante del polinucleótido (A), es decir, una anormalidad genética, asociada con la hipersensibilidad bronquial en un sujeto se detecta incubando una muestra de DNA procedente del sujeto con una sonda polinucleotídica que comprende al menos 5, por ejemplo al menos 15 nucleótidos contiguos del polinucleótido (A), según se define anteriormente en la presente memoria, bajo condiciones en las que la sonda se hibrida a una secuencia polinucleotídica complementaria, para producir un primer producto de reacción, comparando el primer producto de reacción con un producto de reacción de control obtenido a partir de la sonda y DNA procedente de un sujeto sano. Si existe una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control que se correlaciona con la hipersensibilidad bronquial, por ejemplo en asmáticos, la diferencia indica una predisposición a desarrollar una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial. La sonda es generalmente un oligonucleótido sintético que tiene de 15 a 50 nucleótidos, y puede etiquetarse, por ejemplo, con un fluoróforo o nucleótido radiactivo, para proporcionar una señal detectable.

Mutaciones de AAGA que son particularmente propensas a provocar o contribuir al desarrollo de asma u otras enfermedades inflamatorios u obstructivas de las vías respiratorias caracterizadas por BHR son aquellas mutaciones que impactan negativamente en el funcionamiento normal (silvestre) de AAGA, en particular el dominio extracelular que está implicado en la asociación homotípica y de ese modo la adhesión célula-célula y el dominio intracelular que interactúa con proteínas estructurales o moléculas de señalización. Ejemplos de tales mutaciones incluyen: i) mutaciones que afectan al nivel de transcritos producidos; ii) mutaciones sin sentido que se producen dentro del dominio intracelular, de transmembrana o extracelular; y mutaciones que afectan al modo en el que se procesa el transcrito.

Enfermedades o trastornos específicos, por ejemplo enfermedades o trastornos genéticos, están asociados con variante alélicas específicas de regiones polimórficas de ciertos genes, que necesariamente no codifican una proteína mutada. Así, la presencia de una variante alélica específica de una región polimórfica de un gen, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido ("SNP"), en un sujeto puede hacer al sujeto susceptible de desarrollar una enfermedad o trastorno específico. Regiones polimórficas en genes, por ejemplo genes AAGA, pueden identificarse, determinando la secuencia de nucleótidos de genes en poblaciones de individuos. Si se identifica una región polimórfica, por ejemplo SNP o un haplotipo, es decir una combinación de SNPs, entonces la conexión con una enfermedad específica puede determinarse estudiando poblaciones específicas de individuos, por ejemplo individuos que desarrollan una enfermedad específica, tal como asma. Una región polimórfica puede estar situada en cualquier región de un gen, por ejemplo exones, en regiones codificantes o no codificantes de exones, intrones y regiones promotoras.

Se ha encontrado que los genes AAGA comprenden regiones polimórficas, cuyos alelos específicos están asociados con hipersensibilidad bronquial, particularmente en pacientes asmáticos. Así, determinar la presencia de una variante de un polinucleótido (A), según se define anteriormente en la presente memoria, puede comprender determinar un alelo o variante alélica de un polimorfismo de un polinucleótido (A) en un sujeto, para determinar de ese modo si el sujeto tiene una variante alélica específica de un polimorfismo que está asociado con hipersensibilidad bronquial.

Numerosos SNPs en el Nº ID SEC: 1 identificados en muestras de DNA procedentes de pacientes asmáticos se muestran en el Ejemplo 3. De estos, se ha mostrado que los polimorfismos en las posiciones 6377 (un cambio de C a T) y 7390 (un cambio de G a C) del Nº ID SEC: 1 están asociados con hipersensibilidad bronquial. De acuerdo con esto, en una modalidad preferida, determinar la presencia de una variante del polinucleótido (A) según se describe anteriormente en la presente memoria comprende determinar, en una muestra de células procedente del sujeto, la identidad de la base en una o ambas de las posiciones correspondientes a las posiciones 6377 y 7390 en el Nº ID SEC: 1. La presencia de T en la posición correspondiente a dicha posición 6377 y/o C en la posición correspondiente a dicha posición 7390 indica una variante del polinucleótido (A) asociada con la hipersensibilidad bronquial. Cuando se desea determinar la presencia de un haplotipo, es decir una combinación de SNPs, puede determinarse la identidad de la base en las posiciones correspondientes a ambas posiciones 6377 y 7390, o puede determinarse la identidad de la base en una o ambas de estas posiciones y la identidad de la base en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones 589, 1001, 1060, 2033, 2193, 2561, 5667, 5804 y 7531 en el Nº ID SEC: 1 y las posiciones 1212, 1216, 1964 y 2330 en el Nº ID SEC: 2. En una modalidad específicamente preferida, un ácido nucleico que comprende el Nº ID SEC: 1, o una de sus posiciones que comprende el nucleótido 6377 y/o el nucleótido 7390, se aísla de la muestra de células y se somete a secuenciación.

En una modalidad ejemplar, DNA de una célula de muestra procedente de un sujeto se hace accesible para la hibridación y se pone en contacto con una sonda de ácido nucleico que incluye una región de secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse a una secuencia de sentido o antisentido de un gen AAGA (polinucleótido (A)) o sus mutantes presentes en la naturaleza, por ejemplo una región polimórfica del gen tal como una región que incluye la posición 6377 y/o la posición 7390 del Nº ID SEC: 1, o secuencias de flanqueo 5' o 3' asociadas naturalmente con genes AAGA o sus mutantes presentes en la naturaleza y se detecta la hibridación de la sonda al DNA de muestra. Tales técnicas pueden usarse para detectar alteraciones o variantes alélicas a nivel bien genómico o bien de mRNA, incluyendo deleciones, substituciones, etc., así como para determinar niveles de transcritos de mRNA.

Otro método para identificar un alelo o variante alélica de una región polimórfica es la hibridación específica para el alelo usando sondas que se solapan a la mutación o el sitio polimórfico y que tienen de aproximadamente 5 a 30, por ejemplo 5, 10, 20, 25 ó 30 nucleótidos. En una modalidad preferida, varias sondas capaces de hibridarse específicamente a variantes alélicas, tales como polimorfismos de un solo nucleótido, se empalman a un soporte en fase sólida, por ejemplo un "chip". Los oligonucleótidos pueden unirse a un soporte sólido mediante una variedad de procedimientos, incluyendo litografía. Por ejemplo, un chip puede mantener hasta aproximadamente 250.000 oligonucleótidos. El análisis de detección de mutaciones usando estos chips que comprenden oligonucleótidos, también denominados "series de sondas de DNA", se describe, por ejemplo, en Cronin y otros (1996) Human Mutation 7:244. En una modalidad, un chip comprende todas las variantes alélicas de al menos una región polimórfica de un gen. El soporte en fase sólida se pone en contacto a continuación con un ácido nucleico de prueba y se detecta la hibridación a las sondas específicas. De acuerdo con esto, la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o más genes en una muestra de DNA procedente de un paciente puede identificarse en un experimento de hibridación simple.

De acuerdo con esto, la invención proporciona en otro aspecto una sonda oligonucleotídica específica de un alelo capaz de detectar un polimorfismo en el polinucleótido (A) según se describe anteriormente en la presente memoria en una o más de las posiciones 6377 y 7390 del Nº ID SEC: 1. La sonda específica para el alelo generalmente tiene aproximadamente 15-50 nucleótidos, más habitualmente aproximadamente 15-30 nucleótidos, y se solapa a dicha posición 6377 ó 7390. Convenientemente, una posición central de la sonda se alinea con dicha posición 6377 ó 7390. La secuencia de nucleótidos de tal sonda es generalmente 100% complementaria con la secuencia correspondiente en la región polimórfica del polinucleótido (A). La sonda puede etiquetarse, por ejemplo convencionalmente, por ejemplo con un fluoróforo o una etiqueta radiactiva, para proporcionar una señal detectable.

En ciertas modalidades, la detección de la alteración comprende utilizar la sonda/el cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR de anclaje o RACE PCR, o, alternativamente, en una reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véanse, por ejemplo, Landegran y otros (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa y otros (1994) PNAS 91:360-364), la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen AAGA (véase Abravaya y otros (1995) Nuc Acid Res 23:675-682). En una modalidad meramente ilustrativa, el método incluye las etapas de (i) recoger una muestra de células de un paciente, (ii) aislar ácido nucleico (por ejemplo, genómico, mRNA o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan específicamente a un gen AAGA bajo condiciones tales que se produce la hibridación y la amplificación del gen AAGA (si está presente), y (iv) detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se anticipa que la PCR, la LCR o cualquier otro procedimiento de amplificación (por ejemplo, replicación de secuencias autosostenida (Guatelli, J. C. y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), un sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D. Y. y otros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), o Q-Beta Replicase (Lizardi, P. M. y otros, 1988, Bio/Technology 6:1197)), puede usarse como una etapa preliminar para incrementar la cantidad de muestra sobre la que pueden realizarse cualesquiera de las técnicas para determinar mutaciones descritas en la presente memoria.

Un método preferido para determinar la presencia de una variante de un polinucleótido (A), según se define anteriormente en la presente memoria, donde la variante comprende un polimorfismo de un solo nucleótido, comprende determinar la variante alélica sometiendo a secuenciación una muestra de DNA procedente del sujeto. En otro método para identificar una variante alélica de un polimorfismo, fragmentos de DNA procedentes de una muestra de células se amplifican mediante PCR en presencia de un cebador específico para el aleo capaz de detectar un polimorfismo en el polinucleótido (A), particularmente en una o más de las posiciones 6377 y 7390 del Nº ID SEC: 1. Numerosos SNPs identificados con muestras de DNA procedentes de pacientes asmáticos se muestran en el Ejemplo 2. De estos, se ha mostrado que los polimorfismos en las posiciones 6377 y 7390 en el Nº ID SEC: 1 en ciertas poblaciones están asociados con hipersensibilidad bronquial.

La invención también proporciona un cebador específico para un alelo, por ejemplo para el uso de un procedimiento de detección de polimorfismo que incluyen una etapa de amplificación, capaces de detectar un polimorfismo en el polinucleótido (A), según se define anteriormente en la presente memoria, en una o más de las posiciones 6377 y 7390 en el Nº ID SEC: 1. Este cebador tiene generalmente de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos, más habitualmente aproximadamente 15-30 nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del cebador corresponde a la del alelo que ha de detectarse, aunque puede usarse una secuencia parcialmente correspondiente con de aproximadamente 5 a 10 de los nucleótidos en el extremo 3' del cebador correspondientes a los del alelo que ha de detectarse.

El cebador puede etiquetarse, por ejemplo, con un fluoróforo o una etiqueta radiactiva, para ayudar a su detección.

La invención proporciona además un estuche de diagnóstico o pronóstico que comprende una sonda oligonucleotídica específica para un alelo según se describe anteriormente en la presente memoria o un cebador específico para un alelo según se describe anteriormente en la presente memoria, opcionalmente junto con otros reactivos tales como reactivos de etiquietaje (para incorporar una etiqueta detectable en un producto hibridado), tampones y DNA polimerasas tales como polimerasa de Taq.

De acuerdo con esto, en otro aspecto la invención proporciona un polinucleótido aislado que es una variante del polinucleótido (A), según se define anteriormente en la presente memoria, asociado con hipersensibilidad bronquial, particularmente una variable del polinucleótido (A) que tiene una variante alélica específica de un polimorfismo de un solo nucleótido asociado con la hipersensibilidad bronquial, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido en la posición 6377 y/o la posición 7390 del Nº ID SEC: 1, especialmente T en dicha posición 6377 y/o C en dicha posición 7390. De forma correspondiente, en un aspecto adicional la invención proporciona un polipéptido mutante aislado asociado con hipersensibilidad bronquial que es codificado por la variante polinucleotídica del polinucleótido (A) asociado con hipersensibilidad bronquial según se describe anteriormente en la presente memoria, o un polipéptido aislado que es una variante del polipéptido (B), según se define anteriormente en la presente memoria, asociado con hipersensibilidad bronquial.

La información obtenida usando los ensayos diagnósticos descritos aquí (solos o junto con información sobre otro defecto genético, que contribuye a la misma enfermedad) es útil para pronosticar, diagnosticar o confirmar que un sujeto sintomático tiene un defecto genético (por ejemplo, en un gen AAGA o en un gen que regula la expresión de un gen AAGA), que provoca o contribuye a la enfermedad o el trastorno particular. Alternativamente, la información (sola o junto con información sobre otro defecto genético, que contribuye a la misma enfermedad) puede usarse a modo de pronóstico para predecir si un sujeto no sintomático es propenso a desarrollar una enfermedad o estado, que es provocado por o apoyado por un nivel de actividad o proteína de AAGA anormal en un sujeto. En particular, los ensayos permiten determinar una predilección del individuo para desarrollar hipersensibilidad bronquial asociada con una mutación o en asociación con AAGA, donde la mutación es un polimorfismo tal como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Basándose en la información de pronóstico, un doctor puede recomendar un régimen, por ejemplo un protocolo terapéutico útil para prevenir o retardar el comienzo del asma en el individuo.

El conocimiento de la alteración o las alteraciones particulares, que dan como resultado genes o proteínas AAGA defectuosos o deficientes en un individuo (el perfil genético de AAGA), solo o junto con la información sobre otros defectos genéticos que contribuyen a la misma enfermedad (el perfil genético de la enfermedad particular), permite una adaptación de la terapia para una enfermedad particular para el perfil genético del individuo, el objetivo de la "farmacogenómica". Por ejemplo, sujetos que tienen un alelo específico para un gen AAGA pueden o no exhibir síntomas de una enfermedad particular o estar predispuestos a desarrollar síntomas de una enfermedad particular. Además, si esos sujetos son sintomáticos, pueden o no responder a un cierto fármaco, por ejemplo, una terapéutica de AAGA específica, pero pueden responder a otro. Así, la generación de un perfil genético de AAGA (por ejemplo, la clasificación de alteraciones en genes AAGA que están asociados con el desarrollo de asma), a partir de una población de sujetos, que son sintomáticos para una enfermedad o un estado que está provocado por o apoyado por un gen y/o una proteína de AAGA defectuoso y/o deficiente (un perfil de población genético AAGA) y la comparación de un perfil AAGA de individuos con el perfil de la población permite la selección o el diseño de fármacos que se espera que sean seguros y eficaces para un paciente o una población de pacientes particular (es decir, un grupo de pacientes que tienen la misma alteración genética).

De acuerdo con esto, en otro aspecto, la invención proporciona un método para seleccionar farmacogenómicamente una terapia para administrar a un individuo que tiene asma, que comprende determinar un perfil genético AAGA de un individuo y comparar el perfil genético AAGA del individuo con un perfil de población genético AAGA, para seleccionar de ese modo una terapia para la administración al individuo.

Por ejemplo, un perfil de población AAGA puede realizarse determinando el perfil AAGA, por ejemplo, la identidad de genes AAGA, en una población de pacientes que tiene una enfermedad que está provocada por o apoyada por un gen AAGA defectuoso o deficiente. Opcionalmente, el perfil de población AAGA puede incluir además información relativa a la respuesta de la población a un agente terapéutico para AAGA, usando cualquiera de una variedad de métodos, incluyendo controlar: 1) la gravedad de los síntomas asociados con la enfermedad relacionada con AAGA, 2) el nivel de expresión del gen AAGA, 3) el nivel de mRNA de AAGA y/o 4) el nivel de proteína de AAGA y (iii) dividir o clasificar la población basándose en la alteración o las alteraciones genéticas particulares presentes en su gen AAGA o un gen de la ruta del AAGA. El perfil de población genético AAGA también puede, opcionalmente, indicar aquellas alteraciones particulares en las que el paciente bien era sensible o insensible a una terapia particular y esta información o perfil de población es útil a continuación para predecir qué individuos deben responder a fármacos particulares, basándose en su perfil de AAGA individual.

En una modalidad preferida, el perfil de AAGA es un perfil de nivel de transcripción o expresión y la etapa (i) está comprendida por determinar el nivel de expresión de proteína de AAGA, solo o junto con el nivel de expresión de otros genes, que se sabe que contribuyen a la misma enfermedad. El perfil de AAGA puede medirse en muchos pacientes en diversas fases de la enfermedad.

También pueden realizarse estudios farmacogenómicos usando animales transgénicos. Por ejemplo, pueden crearse ratones transgénicos que contienen una variante alélica específica de un gen AAGA, por ejemplo, reemplazando un gen AAGA silvestre con un alelo del gen AAGA humano. La respuesta de estos ratones a agentes terapéuticos para AAGA específicos puede determinarse a continuación.

El tratamiento de un individuo con un agente terapéutico para AAGA puede verificarse determinando las características de AAGA, tales como el nivel de proteína o la actividad de AAGA, el nivel de mRNA de AAGA y/o el nivel de transcripción de AAGA. Estas medidas indicarán si el tratamiento es eficaz o si debe ajustarse u optimizarse. Así, AAGA puede usarse como un marcador para la eficacia de un fármaco durante experimentos clínicos.

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para verificar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente farmacéutico (por ejemplo, un agonista, un antagonista, un peptidomimético, una proteína, un péptido, un ácido nucleico, una molécula pequeña u otro candidato a fármaco identificado por los ensayos de rastreo descritos en la presente memoria), que comprende las etapas de determinar el nivel de expresión de un polinucleótido (A), por ejemplo como mRNA o DNA genómico, o un polipéptido (B), o el nivel de una actividad de dicho polinucleótido (A) o polipéptido (B) en una muestra de DNA anterior a la administración procedente de un sujeto y en una muestra de DNA posterior a la administración procedente de un sujeto, comparar el nivel respectivo de expresión o actividad en la muestra anterior a la administración y la muestra posterior a la administración y, si se requiere, alterar la administración del agente farmacéutico al sujeto de acuerdo con esto. Por ejemplo, la administración incrementada del agente puede ser deseable para incrementar la expresión o la actividad de AAGA hasta niveles superiores a los detectados, es decir, para incrementar la eficacia del agente. Alternativamente, la administración disminuida del agente puede ser deseable para disminuir la expresión o la actividad de AAGA hasta niveles inferiores a los detectados, es decir, para disminuir la eficacia del agente.

También pueden obtenerse células de un sujeto antes y después de la administración de un agente terapéutico para AAGA para detectar el nivel de expresión de genes distintos de AAGA, para verificar que el agente terapéutico para AAGA no provoca un incremento o una disminución perjudiciales en la expresión de tales genes. Esto puede realizarse, por ejemplo, usando el método de perfilado transcripcional. Así, mRNA procedente de células expuestas in vivo a un agente terapéutico para AAGA y mRNA procedente del mismo tipo de células que no estaban expuestas al agente terapéutico para AAGA podía transcribirse inversamente e hibridarse a un chip que contenía DNA procedente de numerosos genes, para comparar de ese modo la expresión de los genes en células tratadas y no tratadas con un agente terapéutico para AAGA. Si, por ejemplo, un agente terapéutico para AAGA pone en marcha la expresión de un protooncogén en un individuo, el uso de este agente terapéutico para AAGA particular puede ser no deseable.

Un perfil genético de AAGA individual o el perfil genético del asma puede permitir: 1) la prescripción más eficaz de un fármaco que tratará la base molecular del asma; y 2) mejor determinación de la dosificación apropiada de un fármaco particular. La capacidad para dirigirse a poblaciones que se espera que muestren el beneficio clínico más alto, basándose en el perfil genético de AAGA o asma, puede permitir: 1) el reposicionamiento de fármacos comercializados con resultados comerciales desafortunados; 2) el rescate de candidatos a fármaco cuyo desarrollo clínico se ha interrumpido como resultado de limitaciones de seguridad o eficacia, que son específicos para subgrupos de pacientes; y 3) un desarrollo acelerado menos costoso de candidatos a fármaco y un etiquetaje de fármacos más óptimo (por ejemplo, debido a que el uso de AAGA como un marcador es útil para optimizar la dosis eficaz).

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un polinucleótido (A), según se describe anteriormente en la presente memoria, o un polipéptido (B), según se describe anteriormente en la presente memoria, o un anticuerpo (C) que es inmunorreactivo con dicho polipéptido (B) o una de sus variantes asociada con la enfermedad, o un oligonucleótido antisentido (D) que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la de dicho polinucleótido (A) o una de sus variantes asociada con la enfermedad.

El polinucleótido (A) puede ser cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos de Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6, un DNA genómico que comprende la secuencia de nucleótidos de Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o un DNA que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida al Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC:2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6 bajo condiciones restrictivas.

En otra aspecto de la invención, el polinucleótido (A) comprende una porción que tiene al menos 20, por ejemplo al menos 50, por ejemplo al menos 100, por ejemplo al menos 200, bases contiguas del Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6. En un aspecto adicional, el polinucleótido (A) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 10, por ejemplo al menos 50, por ejemplo al menos 100, por ejemplo al menos 200, aminoácidos contiguos del Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8.

El polinucleótido (A) puede aislarse mediante análisis bioinformático de secuencias de DNA procedentes de la subregión 5q31-5q33 en el cromosoma 5 determinada mediante secuenciación de cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas artificiales bacterianos (BACs) y/o cromosomas artificiales P1 (PACs) para identificar genes dentro de esa subregión, buscando una secuencia que tenga más de 95% de identidad con el exón predicho para un gen seleccionado y aislando cDNA de una biblioteca de cDNA pulmonar humano mediante PCR usando cebadores diseñados usando esa secuencia.

El polinucleótido (A), que tiene por ejemplo la secuencia Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6, puede prepararse a partir de los nucleótidos que comprende mediante síntesis química, por ejemplo síntesis en fase sólida automatizada usando procedimientos y aparatos conocidos.

En otro aspecto de la invención, el polipéptido (B) comprende una porción que tiene al menos 100, por ejemplo al menos 50, por ejemplo al menos 100, por ejemplo al menos 200 aminoácidos contiguos procedentes del Nº ID SEC: 7 o el Nº ID SEC: 8.

El polipéptido (B) o polipéptido mutante que se describe anteriormente en la presente memoria puede producirse clonando una secuencia polinucleotídica o una de sus variantes según se describe anteriormente en la presente memoria en un vector de expresión que contiene un promotor y otros elementos reguladores apropiados para la transcripción, transcribiendo en células huésped procarióticas o eucarióticas tales como en células bacterianas, de planta, de insecto, de levadura, animales o humanas, y cultivando las células huésped que contienen el vector de expresión recombinante bajo condiciones adecuadas. Técnicas para tal expresión recombinante de polipéptidos son bien conocidas y se describen, por ejemplo, en J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, 1990.

El polipéptido (B) o polipéptido mutante que se describe anteriormente en la presente memoria puede expresarse como una proteína de fusión recombinante con uno o más polipéptidos heterólogos, por ejemplo para facilitar la purificación. Por ejemplo, puede expresarse como una proteína de fusión recombinante con un polipéptido heterólogo tal como una polihistidina que contiene un sitio de segmentación situado entre la secuencia polinucleotídica de la invención y la secuencia polipeptídica heteróloga, de modo que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del Nº ID SEC: 7 o el Nº ID SEC: 8 o su variante asociada con la hipersensibilidad bronquial puede segmentarse y purificarse del resto heterólogo usando técnicas bien conocidas.

El polipéptido (B) o polipéptido mutante que se describe anteriormente en la presente memoria también puede sintetizarse, totalmente o en parte, a partir de los aminoácidos que comprende usando métodos químicos bien conocidos, por ejemplo técnicas en fase sólida automatizadas.

El polipéptido (B) o polipéptido mutante que se describe anteriormente en la presente memoria puede purificarse mediante procedimientos estándar bien conocidos.

El anticuerpo (C) puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. Tales anticuerpos pueden prepararse usando procedimientos convencionales. Métodos para la producción de anticuerpos policlonales contra un antígeno purificado están bien establecidos (cfr. Cooper y Paterson en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros Eds., John Wiley and Sons Inc., Capítulo 11). Típicamente, un animal huésped, tal como un conejo o un ratón, se inmuniza con un polipéptido purificado de la invención, o su porción inmunogénica, como antígeno y, después de un intervalo de tiempo apropiado, el suero del huésped se recoge y se prueba con respecto a anticuerpos específicos contra el polipéptido. Métodos para la producción de anticuerpos monoclonales contra un antígeno purificado están bien establecidos (cfr. el Capítulo 11, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros Eds., John Wiley and Sons Inc.). Para la producción de un anticuerpo policlonal, el suero puede tratarse con sulfato amónico saturado o DEAE-Sephadex. Para la producción de un anticuerpo monoclonal, el bazo o linfocitos del animal inmunizado se retiran y se inmortalizan o se usan para producir hibridomas mediante métodos conocidos. Los anticuerpos secretados por las células inmortalizadas se rastrean para determinar los clones que secretan anticuerpos de la especificidad deseada, por ejemplo usando análisis de transferencia Western. Pueden prepararse anticuerpos humanizados mediante procedimientos convencionales.

El oligonucleótido antisentido (D) comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la del mRNA de AAGA, en particular una secuencia de nucleótidos complementaria con el Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6 o complementaria con la de un polinucleótido que codifica una variante de un polipéptido (B) que tiene un polimorfismo correlacionado con la enfermedad, por ejemplo asma, en particular una secuencia de nucleótidos complementaria con tal variante polimórfica de Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6. El oligonucleótido antisentido puede ser DNA, un análogo de DNA, tal como un análogo de fosforotioato o metilfosfonato de DNA, RNA, un análogo de RNA o un ácido nucleico peptídico (PNA). Los oligonucleótidos antisentido pueden sintetizarse mediante métodos convencionales, por ejemplo usando técnicas en fase sólida automatizadas.

El papel del polipéptido (B) en el asma y otras enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias caracterizadas por hipersensibilidad bronquial puede determinarse usando modelos animales conducidos por alérgenos convencionales para hipersensibilidad bronquial, por ejemplo el modelo de ratón de BHR inducida por ovalbúmina (Tsuyuki y otros, J. Clin. Invest. 96:2924-2931) o el modelo de cobaya descrito posteriormente en la presente memoria.

Polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos u oligonucleótidos antisentido como los descritos anteriormente en la presente memoria, posteriormente en la presente memoria denominados alternativamente colectivamente agentes de la invención, pueden usarse en el tratamiento (profiláctico o sintomático) de enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias. Por ejemplo, un polipéptido (B) puede usarse para tratar a un mamífero, particularmente un ser humano, deficiente en o que necesite de otro modo ese polipéptido; un polinucleótido (A) puede usarse en terapia génica cuando se desee incrementar la actividad de AAGA, por ejemplo cuando un sujeto tiene un gen AAGA mutado o perdido; un oligonucleótido antisentido (D) puede usarse para inhibir actividad de AAGA o la actividad de variantes del gen AAGA que tienen un polimorfismo correlacionado con una enfermedad, por ejemplo asma, cuando esto se desee; y un anticuerpo (C) puede usarse para inhibir actividades de unión de ligando/antiligando de polipéptidos de AAGA.

"Terapia génica" se refiere a un sistema para el tratamiento de una enfermedad humana basado en la transferencia de material genético a células somáticas de un individuo. La transferencia génica puede alcanzarse directamente in vivo mediante la administración a la sangre o los tejidos de vectores virales o no virales que portan el gen, o indirectamente ex vivo a través de la introducción de material genético en células manipuladas en el laboratorio, seguido por aporte de las células que contienen gen de nuevo al individuo. Alterando el material genético dentro de una célula, la terapia génica puede corregir la patofisiología de la enfermedad subyacente. Vectores y procedimientos adecuados para el aporte génico a tejidos y sistemas orgánicos específicos en animales se describen en Dracopoli, N.C. y otros, Current Protocols in Human Genetics. John Wiley and Sons Inc., Capítulos 12 y 13, respectivamente. En relación con un polinucleótido (A) como el descrito anteriormente en la presente memoria, la terapia génica puede implicar el aporte de un vector de terapia génica viral o no viral que contiene un casete de expresión del gen AAGA bajo elementos de control adecuados a los pulmones de individuos enfermos (por ejemplo, asmáticos), de modo que la patofisiología de la enfermedad subyacente se corrija o alivie.

La eficacia de un agente de la invención para inhibir o invertir la hiperreactividad de las vías respiratorias puede demostrarse en un modelo de prueba en cobayas. La inyección aguda de complejo unitario preformado hace a las cobayas hiperreactivas a histamina. Dosis de histamina que provocan solo un pequeño grado de broncoconstricción antes de la administración de complejo inmunitario provocan un efecto mucho más fuerte posteriormente. Las cobayas (Dunkin-Hartley, macho, 400-600 g) se anestesian con fenobarbital (100 mg/kg i.p.) y pentobarbital (30 mg/kg i.p.) y se paralizan con galamina (10 mg/kg i.m.) y se ventilan con una mezcla de aire y oxígeno (45:55), v/v). Los animales se ventilan (8 ml/kg, 1 Hz) a través de una cánula traqueal. La ventilación se verifica mediante un transductor de flujo. Cuando se realizan medidas del flujo, los cambios de presión coincidentes en el tórax se verifican directamente a través de un trocar intratorácico, que permite la presentación de la presión diferencial con relación a la tráquea. A partir de esta información se calculan la resistencia y la aceptación en cada inspiración. Una reacción alérgica se inicia mediante inyección intravenosa de complejos inmunitarios preformados (preparados añadiendo 30 \mug de gammaglobulina bovina en 0,05 ml de solución salina a 0,05 ml de antisuero de anti-(gammaglobulina bovina) de cobaya) 3 veces a intervalos de 10 minutos. Se usan inyecciones intravenosas de histamina (1,0-3,2 \mug/kg a intervalos de 10 minutos) para definir la sensibilidad de las vías respiratorias antes y después de la última exposición al complejo inmunitario. La hiperreactividad de las vías respiratorias se expresa como la diferencia apareada para el valor máximo de resistencia pulmonar en respuesta a histamina antes y después de la inyección repetida de complejo inmunitario. Los agentes de la invención se administran intratraquealmente bien como soluciones o bien como suspensiones en tragacanto. Los valores de ED_{50-} para la inversión de la hiperreactividad de las vías respiratorias se determinan gráficamente a partir de las curvas de respuesta a la dosis y representan las dosis que provocan un 50% de reducción de la hiperreactividad de las vías respiratorias.

Enfermedades caracterizadas por hipersensibilidad bronquial a las que es aplicable la presente invención incluyen enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias, particularmente asma de cualquier tipo de génesis, incluyendo tanto asma intrínseca (no alérgica) como extrínseca (alérgica), asma suave, asma moderada, asma intensa, asma bronquítica, asma inducida por ejercicio, asma laboral y asma inducida después de una infección bacteriana. También se entiende que el tratamiento del asma abarca el tratamiento de sujetos, por ejemplo de menos de 4 ó 5 años de edad, que exhiben síntomas de sibilación y diagnosticados o diagnosticables como "niños sibilantes", una categoría de pacientes establecida de importancia médica principal e identificada ahora a menudo como asmáticos en fase inicial. (Por comodidad, este estado asmático particular se denomina "síndrome del niño sibilante").

La eficacia profiláctica en el tratamiento del asma se evidenciará por una frecuencia o intensidad reducida del ataque sintomático, por ejemplo de un ataque asmático o broncoconstrictor agudo, la mejora en la función pulmonar o hiperreactividad reducida de las vías respiratorias. También puede evidenciarse por un requerimiento reducido de otra terapia sintomática, es decir terapia para o destinada a restringir o suprimir el ataque sintomático cuando se produce, antiinflamatoria (por ejemplo, corticosteroide) o broncodilatadora. El beneficio profiláctico en el asma puede en particular ser evidente en sujetos tendentes a la "crisis matinal". La "crisis matinal" es un síndrome asmático reconocido, común en un porcentaje substancial de asmáticos y caracterizado por un ataque de asma, por ejemplo entre las horas de aproximadamente 4 a 6 am, es decir en un momento normalmente substancialmente distante de cualquier terapia sintomática para el asma previamente administrada.

Otras enfermedades y estados inflamatorios u obstructivos de las vías respiratorias a los que es aplicable la presente invención incluyen síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), enfermedad obstructiva crónica pulmonar, de las vías respiratorias o del pulmón (COPD, COAD o COLD), incluyendo bronquitis crónica o disnea asociada con ella, enfisema así como exacerbación de la hiperreactividad de las vías respiratorias como consecuencia de otra terapia farmacológica, en particular otra terapia farmacológica inhalada. La invención también es aplicable al tratamiento de la bronquitis de cualquier tipo de génesis, incluyendo, por ejemplo, bronquitis aguda, araquídica, catarral, cruposa, crónica o ftinoidea. Enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias adicionales a las que es aplicable la presente invención incluyen neumoconiosis (una enfermedad inflamatoria, comúnmente laboral, de los pulmones, frecuentemente acompañada por obstrucción de las vías respiratorias, ya sea crónica o aguda, y ocasionada por inhalación repetida de polvo) de cualquier tipo de génesis, incluyendo, por ejemplo, aluminosis, antracrosis, asbestosis, calicosis, ptilosis, siderosis, silicosis, tabacosis y bisinosis.

Habiendo tenido en cuenta su actividad antiinflamatoria, en particular en relación con la inhibición de la activación de eosinófilos, los agentes de la invención también son útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con eosinófilos, por ejemplo eosinofilia, en particular trastornos de las vías respiratorias relacionados con eosinófilos (por ejemplo, que implican infiltración eosinofílica mórbida de tejidos pulmonares), incluyendo hipereosinofilia cuando afecta a las vías respiratorias y/o los pulmones, así como, por ejemplo, trastornos relacionados con eosinófilos de las vías respiratorias consecuentes o concomitantes con el síndrome de Löffler, neumonía eosinofílica, infestación parasitaria (en particular metazoaria) (incluyendo eosinofilia tropical), aspergilosis broncopulmonar, poliarteritis nodosa (incluyendo síndrome de Churg-Strauss), granuloma eosinofílico y trastornos relacionados con eosinófilos que afectan a las vías respiratorias ocasionados por reacción a fármacos.

Los agentes de la invención pueden administrarse mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo oralmente, por ejemplo en la forma de una tableta o cápsula; parenteralmente, por ejemplo intravenosamente; tópicamente, por ejemplo en una pomada o crema; transdérmicamente, por ejemplo en un parche; mediante inhalación o intranasalmente.

Composiciones farmacéuticas que contienen agentes de la invención pueden prepararse usando diluyentes o excipientes convencionales y técnicas conocidas en la especialidad galénica. Así, formas de dosificación orales pueden incluir tabletas y cápsulas y las composiciones para inhalación pueden comprender formulaciones en aerosol u otras atomizables o formulaciones en polvo seco.

La invención incluye (A) un agente de la invención en forma inhalable, por ejemplo en una composición de aerosol u otra atomizable o en un material inhalable en partículas, por ejemplo una forma micronizada, (B) un medicamento inhalable que comprende un agente de la invención en forma inhalable; (C) un producto farmacéutico que comprende tal agente de la invención en forma inhalable en asociación con un dispositivo de inhalación; y (D) un dispositivo de inhalación que contiene un agente de la invención en forma inhalable.

Las dosificaciones de agentes de la invención empleadas al poner en práctica la presente invención variarán, por supuesto, dependiendo, por ejemplo, del estado particular que ha de tratarse, el efecto deseado y el modo de administración. En general, dosis diarias adecuadas para administración mediante inhalación son del orden de 1 \mug a 10 mg/kg, mientras que para la administración oral dosis diarias adecuados son del orden de 0,1 mg a 100 mg/kg.

Un polipéptido (B) como el descrito anteriormente en la presente memoria o un polipéptido mutante como el descrito anteriormente en la presente memoria asociado con hipersensibilidad bronquial, por ejemplo un polipéptido codificado por una variante de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8, variante que contiene un polimorfismo de secuencia, puede usarse para identificar potenciadores (agonistas) o inhibidores (antagonistas) de su actividad, es decir, para identificar compuestos útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias, particularmente asma. Los potenciadores o inhibidores pueden ser, por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos o compuestos de bajo peso molecular. De acuerdo con esto, la invención también proporciona un método para identificar una substancia que modula la actividad de un polipéptido (B) o una de sus variantes asociada con hipersensibilidad bronquial, particularmente una substancia útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias tales como asma, que comprende combinar una posible substancia con dicho polipéptido (B) o dicha variante del mismo y medir el efecto de la posible substancia sobre dicha actividad. La actividad del polipéptido (B) o la variante puede medirse, por ejemplo, mediante promoción de agregación y adhesión dependiente de Ca^{2+} homotípicas en células L, por ejemplo según se describe por Sano y otros, EMBO J. 12:2249-2256. La invención también incluye un método para identificar una substancia que se une a un polipéptido (B) o una de sus variantes según se describe anteriormente aquí, particularmente una substancia útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias u obstructivas de las vías respiratorias, tales como asma, que comprende mezclar una posible substancia con dicho polipéptido (B) o dicha variante y determinar si se ha producido la unión.

En otro aspecto la invención proporciona un método para identificar una substancia que se une a, o modula una actividad de, un polipéptido mutante codificado por una variante del polinucleótido (A), según se describe anteriormente en la presente memoria, particularmente una substancia adecuada en el uso del tratamiento de una enfermedad inflamatoria u obstructiva de las vías respiratorias, tal como asma, que comprende mezclar una posible substancia con dicho polipéptido mutante y (i) determinar si se ha producido la unión y/o (ii) medir el efecto de la posible substancia sobre dicha actividad.

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La invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos. Las abreviaturas usadas en los Ejemplos tienen los siguientes significados:

AEBSF:

fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo

BAC:

cromosoma artificial bacteriano

BAP:

1,4-bis(acriloil)piperazina

BHR:

hipersensibilidad bronquial

BLAST:

herramienta de búsqueda de alineamiento local básico

BSA:

albúmina de suero bovino

CSGE:

electroforesis en gel sensible a la conformación

dNTP:

trifosfato de desoxinucleótido

DTT:

ditiotreitol

EIA:

inmunoensayo enzimático

EST:

rótulo de secuencia expresado

FAM:

6-carboxifluoresceína

FCS:

suero de ternero fetal

HBEC:

célula epitelial bronquial humana

LBNL:

Lawrence Berkley National Laboratory

LOD:

logaritmo de verosimilitudes

MTN:

Northern tisular múltiple

ORF:

marco de lectura abierto

PAC:

cromosoma artificial P1

PCR:

reacción en cadena de la polimerasa

PBS:

solución salina tamponada con fosfato

PEG:

polietilenglicol

PMSF:

fluoruro de fenilmetilsulfonilo

SDS-PAGE:

electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico

SNP:

polimorfismo de un solo nucleótido

STS:

sitio rotulado de la secuencia

TAMRA:

6-carboxiltetrametilrodamina

TDT:

prueba de desequilibrio de transmisión

TET:

tetracloro-6-carboxifluoresceína

TTE:

Tris 44 mM, taurina 14,5 mM, EDTA 0,1 mM, pH 9,0

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Ejemplo 1

Se seleccionan individuos asmáticos y no asmáticos de un estudio familiar sobre la genética del asma en los Países Bajos ([Panhuysen y otros, Clin. Exp. Allergy 25 (supl. 2): 35-38]; the Medical Ethics Committee of the University Hospital of Groningen and the University of Maryland aprueban este estudio y se obtienen consentimientos informados escritos de todos los participantes). Entre 1962 y 1975, los pacientes con asma se evalúan con respecto al diagnóstico del asma y la utilización de su tratamiento en Beatrixoord, Haren, Países Bajos. Para la inclusión en este estudio, a partir de esta primera evaluación los pacientes tienen que cumplir tres criterios: (1) síntomas de acuerdo con el asma; (2) edad \leq 45 años; (3) hipersensibilidad bronquial a histamina (PC_{20} \leq 32 mg/ml usando el método de inhalación de 32 segundos de Vries; [de Vries y otros, Int. Arch. Allergy 20:93-101]). La evaluación clínica incluye la realización de pruebas de piel intracutáneas con aeroalérgenos comunes, prueba de la función pulmonar con un espirómetro hermético al agua (Lode Spirograph, Groningen, Países Bajos) y prueba para la hipersensibilidad bronquial con histamina, usando el protocolo de inhalación de 30 segundos [de Vries y otros, Int. Arch. Allergy 20:93-101]. Se toman muestras de sangre para el aislamiento de DNA e IgE total, IgE específica y medidas de eosinófilos.

De 1990 en adelante, estos sujetos de prueba se reestudian junto con sus esposas, un mínimo de dos niños y, si es posible, nietos. En total, se estudian 200 familias de segunda y tercera generación. En esta segunda evaluación (1990-1998), las medidas tomadas en la primera evaluación (1962-1975) se repiten en los sujetos de prueba y también se realizan en los parientes. La reversibilidad se prueba repitiendo la espirometría 20 minutos después de la administración de 800 \mug de salbutamol (albuterol). Se solicita a todos los participantes que detengan la medicación pulmonar antes de la prueba clínica, si es posible: los corticosteroides inhalados se detienen durante 14 días, los beta-miméticos y las antihistaminas orales de acción prolongada inhalados, 48 horas, los beta-miméticos y los anticolinérgicos de acción corta inhalados, 8 horas. Los pacientes con asma no tenían una exacerbación del asma ni requerían un régimen de prednisona oral en las 6 semanas anteriores al estudio.

Esta evaluación incluye además una versión modificada del cuestionario de the British Medical Council con preguntas adicionales sobre síntomas y terapia del asma y la alergia [Panhuysen y otros, Clin. Exp. Allergy 25 (supl. 2): 35-38]. Por definición, está presente un diagnóstico médico de asma en los sujetos de prueba. En las esposas, está presente si el sujeto da cuenta de (1) estar bajo tratamiento regular actual para el asma, (2) ha visitado alguna vez a un médico general o especialista para el asma o (3) ha usado alguna vez medicación para el asma. La rinitis alérgica se define como una respuesta positiva a una de las siguientes preguntas: ¿la nariz le moquea o se obstruye cuando está en los alrededores de (1) animales (por ejemplo, perros, gatos, caballos), plumas (por ejemplo, en almohadas) o en una parte de la casa con polvo; o (2) árboles, gramíneas y flores?. La fiebre del heno se define como una respuesta positiva a la pregunta: ¿ha tenido alguna vez fiebre del heno?.

La IgE total en suero se mide en las primeras 92 familias mediante inmunoensayo en fase sólida [Panhuysen y otros, Clin. Exp. Allergy 25 (supl. 2): 35-38]. En el segundo grupo de 108 familias, los niveles de IgE en suero se miden mediante un ensayo fluorescente con enzimas ligadas (Mini Vidas, Biomerieux Vitek Inc., Marcy, Francia). La prueba de la piel se realiza mediante una prueba de piel intracutánea con 16 aeroalérgenos comunes, un control positivo y uno negativo. Se prueban los siguientes alérgenos: pólenes de gramíneas mezclados, dos pólenes de árboles mezclados, malas hierbas mezcladas, ácaro del polvo doméstico, ácaro de los almacenes, caspa de gato, perro, caballo, conejo/cobaya, mezcla de plumas y cinco mohos (Aspergillus fumigatus, Alternaria alternata, Cladosporium herbaraum, Penicillum notatum, Botrytis Cineria). (ALK-Abelló, Nieuwegein, Países Bajos). Se considera que está presente una prueba de piel positiva si el diámetro mayor de la roncha es 5 \geq mm.

La evidencia de la conexión de niveles de IgE en suero totales [Meyers y otros, Genomics 23:464-470], hipersensibilidad bronquial [Postma y otros, New Eng J. Med. 333: 894-900] y asma [Panhuysen y otros, J. Invest. Med. 43: 281A; Bleecker y otros, Am. J. Hum. Genet. 59:A213] con el cromosoma 5q humano se ha encontrado previamente en la familias holandesas usando un sistema de posibles genes. Sin embargo, como se ha encontrado en otras enfermedades complejas, la región de conexión es amplia (>40 cM, que abarca la región desde el aglomerado de citoquinas hasta el adrenorreceptor \beta_{2}). Para refinar la región de conexión, se extrajo DNA de muestras de DNA sanguíneo usando protocolos estándar (Puregene kit, Gentra Systems Inc., Minneapolis, MN). Se usa una colección de 37 marcadores que consisten en repeticiones tri- y tetra-nucleotídicas que abarcan la región 5q31-q33 del cromosoma para genotipificar las muestras de DNA. Se realiza PCR múltiple usando cebadores marcados fluorescentemente y los fragmentos amplificados resultantes se separan sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Los fragmentos etiquetados se detectan usando la máquina de secuenciación ABI377 y los genotipos se puntúan usando software GENOTYPER [Applied Biosystems, EE.UU. de A.] usando técnicas convencionales. Se usa una versión modificada del programa Linkage Designer [Van Camp y otros, Trends Genet. 13:82] para agrupar alelos y verificar la herencia. El resultado de Linkage Designer se analiza a continuación con respecto a cualesquiera incongruencias usando software LINKAGE versión 5.1 [Lathrop y Lalouel, en Handbook of Statistics, Vol. 8., Rao y Chakraborty (eds), pp. 81-123. Elsevier Science Publishers BV, Ámsterdam.] sin información de la enfermedad. Como una verificación final de los datos, se usa CRIMAP [Lander y Green, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2363-2367] para determinar el orden y la longitud del mapa cromosómico y para detectar recombinantes dobles. En familias conectadas, este análisis identifica una región de conexión para BHR con una puntuación de LOD por encima de 7,0: La puntuación de LOD máxima se define mediante marcadores de microsatélite D5S2011 y D5S2017.

Ejemplo 2

Clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que abarcan la región cromosómica entre los marcadores D5S2011 y D5S2017 identificados usando la información de mapas físicos para cromosoma 5q31-q33 humano disponible públicamente en el sitio web de the Lawrence Berkley National Laboratory Genome Centre (LBNL; www-hgc.lbl.gov/biology/bacmap/2.gif) obtenidos como los números de clones de BAC BAC h164 (22f14), c5 (50g20), h187 (35k5), h167 (8e5) y h177 (32d16) de Research Genetics (Huntsville, Alabama, EE.UU. de A.) y un cromosoma artificial P1 (PAC) aislado mediante PCR usando cebadores con Nº ID SEC: 9 a 12 para los marcadores de STS bac51107T (extremo 5' de BAC 50g20) y bac51330T (extremo 3' de BAC 22f14) disponibles en el sitio web de LBNL (www-hgc.lbl.gov/sts.html) por Genome Systems Inc. (St. Louis, Missouri, EE.UU. de A.), cubriendo los BACs y PAC juntos una subregión de la región cromosómica humana 5q31-5q33, se someten a secuenciación usando técnicas convencionales para una secuencia ABI 377 (http://www.pebio.com/ab/about/dna/377/). La secuencia de DNA genómico resultante se analiza usando los programas de búsqueda de genes GENSCAN (Burge y Karlin, J. Mol. Biol. 268:78-94) y GENEMARK versión 2.4 (Borodovsky y McIninch, Comp. Chem. 17:123-133) y las búsquedas de homología BLAST (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410) frente a bases de datos de EST y DNA públicas de proteínas (SWISSPROT, SWISSPROTPLUS, GenBank, actualizaciones de Genbank, EMBL, GENEMBLPLUS, GenBank EST, EMBL EST, GenBank STS, EMBL STS), cuyos resultados se analizan en una versión específica para cromosoma 5 humano de ACeDb (A C. elegans Database; http://www.sanger.ac.uk/Software/Acedb/) para la presentación gráfica. A partir de esta representación gráfica se identifican regiones significativas (es decir, genes) mediante exones predichos y aciertos de EST/proteína alineados. Un gen AAGA se identifica inicialmente en la representación gráfica como un gen predicho por GENSCAN que cubre al menos 22,5 kb de DNA genómico y que comprende 5 exones que varían en tamaño de 153-2196 pb extendidos sobre dos islas de secuencia de DNA separadas por un tramo de DNA no sometido a secuenciación:

1

Las secuencias de DNA en los exones predichos por GENSCAN codifican una proteína que tiene homologías con moléculas de tipo cadherina en una gama de organismos, incluyendo seres humanos, lo que se sugiere que es un miembro de la familia de proteínas cadherinas. Una homología de 100% se detecta con las secuencias de mRNA y ESTs correspondientes al gen de protocadherina 42 (números de registro de GENBANK L11370, L11369 y AA481656). El alineamiento de la secuencias de mRNA y EST identifica tres variantes de reparación (Nº ID SEC: 4, 5 y 6), dos de las cuales se han identificado previamente (Sano y otros, EMBO J. 12: 2249-2256), y una (Nº ID SEC: 6) es nueva. El análisis de los Nº ID SEC: 4, 5 y 6 para el marco de lectura abierto (ORF) más largo usando el módulo EditSeq del software Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU. de A.) revela ORFs de 3198 nucleótidos (Nº ID SEC: 4, posición 377-3574) y 3729 nucleótidos (Nº ID SEC: 5 y 6, posición 377-4105). Se apunta que el ORF para el Nº ID SEC: 4 es 118 nucleótidos más largo que el presentado previamente (posición 494-3574; Sano y otros, EMBO J. 12:2249-2256 y Nº de registro GenBank L11370), traduciéndose para dar una proteína (Nº ID SEC: 7) 39 aminoácidos más larga que la predicha por el Nº de registro GenBank L11370 (1065 aminoácidos frente a 1026 aminoácidos). El ORF para los Nº ID SEC: 5 y 6 se traduce en una proteína de 1242 aminoácidos (Nº ID SEC: 8).

\global\parskip1.000000\baselineskip

Usando un fragmento de PCR de 441 pb correspondiente al exón 2 y generado a partir de DNA genómico humano usando los cebadores que tienen los Nº ID SEC: 13 y 14, se sonda una transferencia Northern de mRNA procedente de un número de tejidos humanos (transferencia MTN del carril 12 de ser humano; Clontech Laboratories UK Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) para examinar el patrón de expresión de AAGA. Bandas correspondientes a las variantes de reparación se detectan en cerebro, corazón, músculo esquelético, colon, riñón, hígado, intestino delgado, páncreas y pulmón. No se detecta hibridación para el timo, el bazo y linfocitos de sangre periférica. El análisis por PCR de cDNAs de primera hebra derivados de diversas líneas celulares usando cebadores que tienen Nº ID SEC: 13 y 14 muestra que AAGA se expresa en un alto nivel en células epiteliales bronquiales humanas (HBECs) activadas e inactivadas, con un nivel medio en fibroblastos y un nivel bajo en neutrófilos y macrófagos.

Ejemplo 3

En este ejemplo, se usa electroforesis en gel sensible a la conformación (CSGE: Ganguly y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10325-10329; Ganguly y Williams, Hum. Mut. 9:339-343) para detectar cambios de secuencia potenciales en fragmentos de DNA amplificados por PCR procedentes de DNA sanguíneo aislado de pacientes asmáticos. Se detectan desajustes de una sola base en heterodúplex de DNA mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de disolventes suavemente desnaturalizantes que amplifican la tendencia de los desajustes a producir cambios de conformación y dan como resultado migración diferencial de homodúplex y heterodúplex. Para generar heterodúplex, los productos de PCR amplificados se desnaturalizan térmicamente, se reasocian y a continuación se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los fragmentos de DNA se visualizan mediante dilución con bromuro de etidio. Los fragmentos de DNA que muestran patrones de migración electroforética diferenciales se someten a secuenciación entonces para confirmar la presencia de un cambio en la secuencia polinucleotídica y la naturaleza exacta de este cambio.

Los Nº ID SEC: 4, 5 y 6 se alinean manualmente con los Nº ID SEC: 1 y 2 usando el módulo EditSeq del software Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU. de A.). Este análisis indica que un segmento de 470 pb de la secuencia de DNA en el extremo 5' de los Nº ID SEC: 4, 5 y 6 no se alinea con el Nº ID SEC: 1 ó 2. Una búsqueda BLAST de la base de datos GENBANK se lleva a cabo usando estos 470 pb de secuencia de mRNA para identificar la secuencia genómica perdida. Esto identifica una secuencia de DNA genómico de 2717 pb (Nº ID SEC: 3) en el Nº de registro de GENBANK ACO13643 (secuencia de bosquejo de 154594 pb de 13 trozos desordenados de clon RP11-16P20 humano). El análisis de alineamiento revela que los tres transcritos alternativos se derivan de 7 exones que abarcan al menos 21 kb de DNA genómico:

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

Se diseñan grupos de cebadores de PCR correspondientes a AAGA usando los Nº ID SEC: 1 y 2 y Primer Express^{TM} (versión 1.0; Perkin Elmer, P/N 604313). Estos grupos de cebadores (Nº ID SEC: 15-94) son:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\newpage

(Continuación)

6

Usando los grupos de cebadores anteriores, 40 polinucleótidos se amplifican a partir de muestras de DNA de sangre procedentes de 16 pacientes asmáticos. Se llevan a cabo reacciones de PCR en un volumen de reacción de 10 \mul que contiene 1 x GeneAmp®, 10 x tampón de PCR (Perkin Elmer P/N N808-9240), 13 ng de DNA de plantilla, 400 \muM de cada dNTP (Amersham Life Science Nucleix Plus^{TM} 25 mM dNTP mix; Nº Prod. US77119), 30 ng de cada cebador, MgCl_{2} 2 mM y 0,5 u de polimerasa AmpliTaq Gold^{TM} (Perkin-Elmer P/N N808-0242).

Condiciones de ciclación térmica típicas usando un ciclador Biometra UNO II (Part No. 050-603; Anachem Ltd., Luton, UK) son como sigue, repitiéndose 36 veces la secuencia Etapa 2-Etapa 3-Etapa 4:

Etapa 1

95ºC 10 min

Etapa 2

92ºC 1 min

Etapa 3

60ºC 1 min

Etapa 4

72ºC 2 min

Etapa 5

72ºC 10 min

Par generar heterodúplex, 2 \mul de producto de PCR se desnaturalizan a 95ºC durante 10 minutos y se reasocian a 68ºC durante 30 minutos usando un ciclador térmico (por ejemplo, Biometra UNOII). 2 \mul de 2 x tampón de carga (etilenglicol al 20%, formamida al 30%, xilenocianol al 0,025%, azul de bromofenol al 0,025%) se añaden a cada muestra antes del análisis del gel.

Un aparato de secuenciación de DNA estándar (Owl Scientific S3S; Autogen Bioclear UK Ltd.) se usa con un peine de 60 muestras (Owl Scientific S2S-60A; Autogen Bioclear UK Ltd.) y suministro de polvo estándar (Biorad, Nº Cat 165-5057) equipado con una sonda de temperatura (Biorad, Nº Cat 165-5058). Un gel de poliacrilamida al 15% de 0,4 mm de grosor se prepara usando una relación 99:1 de acril-amida a reticulador de BAP, etilenglicol al 10% y formamida al 15% en 0,5 x TTE. Los geles son atravesados previamente durante una hora a 30 vatios, limitando la temperatura hasta un máximo de 250ºC (usando un ventilador eléctrico para mantener la temperatura baja, si es necesario, por ejemplo Jencons, Nº Cat 292-004). Después del recorrido previo, los pocillos se barren con una pipeta y las muestras se cargan en los pocillos. A continuación, el gel se somete a electroforesis a 12 vatios durante la noche (15 horas) a 25ºC. Los fragmentos mayores de 350 pb permanecen sobre el gel.

Después de la electroforesis, las placas de gel se separan, el gel se tiñe poniendo el gel en 0,5 x TTE que contiene 1 \mug/ml de bromuro de etidio (Biorad, Nº Cat 161-0433) durante 10 minutos, seguido por decoloración en 0,5 x TTE durante 10 minutos. El gel se fotografía a continuación en un transiluminador UV (por ejemplo UVP GDS 7500).

Se detectan cambios de nucleótidos potenciales mediante CSGE en uno o más de los 16 pacientes para 15 de los 40 fragmentos de PCR. Para cada uno de estos cambios potenciales, el fragmento de PCR procedente de los 16 pacientes se somete a secuenciación de DNA de doble hebra en un secuenciador automatizado ABI377 usando métodos estándar (http://www.pebio.com/ab/about/dna/377/) y la secuencia de DNA resultante se analiza usando el software CONSED (Gordon y otros, Genome Res. 8:195-202) para confirmar la presencia de un cambio de secuencia y para identificar el cambio de bases exacto. Se confirman los 15 cambios potenciales detectados por CSGE. El número de pacientes que exhiben cambios polimórficos se muestra en la tabla posterior:

7

Dos de los cambios de polinucleótidos detectados alteran la secuencia de aminoácidos (cambio no sinónimo) de la proteína codificada por AAGA, 2 son sinónimos (sin cambio de residuo debido a degeneración del código genético) y 11 se presentan en regiones no codificantes del gen.

Doscientos tríos (tanto padres como un niño afectado) de las familias holandesas se genotipificaron con respecto a SNPs en las posiciones 1060, 2561, 6377, 7390 en el Nº ID SEC: 1 y la posición 2330 en el Nº ID SEC: 2 mediante ensayo de discriminación alélica usando la tecnología TaqMan^{TM} en el ABI PRISM^{TM} 7700 Sequence Detector (PE-Applied Biosystems, Warrington, UK). Se diseñan dos sondas fluorogénicas TaqMan^{TM}, una específica para el alelo no SNP y una específica para el alelo SNP, para hibridarse al sitio del SNP en la secuencia diana amplificada por PCR:

8

Las sondas TaqMan^{TM} consisten en un oligonucleótido con un colorante informador fluorescente (FAM o TET) y un colorante extinguidor (TAMRA) conectados covalentemente a los extremos 5' y 3', respectivamente. La proximidad del colorante informador al colorante extinguidor da como resultado la supresión de la fluorescencia del informador en las sondas intactas. Durante la amplificación de la secuencia diana, la sonda se segmenta durante la etapa de extensión de la PCR. Esto elimina la influencia del colorante extinguidor y permite que el colorante informador produzca fluorescencia. Como las sondas SNP y no SNP tienen diferentes colorantes informadores, el nivel de fluorescencia de cada colorante es proporcional a la cantidad de secuencia diana SNP o no SNP en la muestra.

La prueba de desequilibrio de transmisión [Spielman y otros, Am. J. Hum. Genet. 52: 506-516] se usa para probar una asociación genética entre los 5 SNPs genotipificados y asma/subfenotipos de asma. En esta prueba, un alelo transmitido por un padre a un hijo afectado se ajusta al otro alelo no transmitido procedente del mismo padre; la prueba de cuadrados chi de McNemar de discordancia se aplica a continuación a los pares resultantes [Terwilliger y Ott, Hum. Hered. 42, 337-346]. El análisis de TDT de los datos genotípicos obtenidos de las 200 familias asmáticas holandesas revela una fuerte asociación genética entre los SNPs en las posiciones 6377 (p=0,00017) y 7390 (p=0,00049) en el Nº ID SEC: 1 e hipersensibilidad bronquial e indican que AAGA es un gen susceptible para el asma y que los individuos que portan los dos SNPs tienen un riesgo incrementado de desarrollar hipersensibilidad bronquial. Además, se obtienen p=0,01 y p=0,001 para los SNPs en las posiciones 6377 y 7390, respectivamente, usando la prueba de asociación basada en familias [FBAT; Horvath, Xu y Laird, Eur. J. Hum. Genet. 9, 301-306].

Ejemplo 4

Este Ejemplo se refiere a la expresión de AAGA de longitud completa con una etiqueta de 6 histidinas en el extremo C usando el sistema baculoviral en células Hi5 de T. ni y a la purificación del polipéptido resultante.

1. Construcción de un Baculovirus de AAGA Recombinante

Un sitio EcoRI único se incorpora 5' al codón de iniciación de AAGA (posición 377 en los Nº ID SEC: 4, 5 y 6) mediante amplificación por PCR usando el siguiente cebador:

5ST

5'-GAAGATCTTCG GAATTC CATC ATG GTGATGGGGAGCCCTTTGGAG3'

Se usa otro cebador para introducir residuos de 6 histidinas inmediatamente antes de codón de parada de AAGA (posición 3574 en el Nº ID SEC: 4 para 3ST1 y posición 4105 en los Nº ID SEC: 5 y 6 para 3ST2). Este cebador también incorpora un sitio KpnI 3' con respecto al codón de parada de AAGA.

3ST1 (Variante de reparación 1)

5'-AAGATCTTC GGTACC TCAATGGTGATGGTGATGGTGCTCCCACACCTCGGTCCAG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

3ST2 (Variantes de reparación 2 y 3)

5'-AAGATCTTC GGTACCTC AATGGTGATGGTGATGGTGCAGGTAGATCTCGCGCTTG-3'

\vskip1.000000\baselineskip

La versión "etiquetada con His" recombinante de la variante de reparación 1 de AAGA se liga como un fragmento EcoRI/KpnI de 3208 pb en vector de transferencia de baculovirus pFastbac1 (Life Sciences) digerido con EcoRI/KpnI. La versión "etiquetada con His" recombinante de las variantes de reparación 2 y 3 de AAGA se liga como un fragmento EcoRI/KpnI de 3739 pb en pFastbac1 digerido con EcoRI/KpnI. Las secuencias de AAGA recombinantes se transponen en DNA bacmídico portado por células DH10Bac (Life Sciences; sistema de expresión baculoviral Bac a Bac). Se aíslan bácmidos recombinantes de AAGA de células DH10Bac y se transfectan en células de Sf9 usando protocolos publicados (manual del sistema de expresión baculoviral Bac a Bac; Life Sciences).

2. Amplificación de reservas de Baculovirus recombinantes

El baculovirus recombinante se amplifica infectando células de Sf9 (mantenidas en medio SFMII SF900; Life Sciences) a una densidad celular de 0,5x10^{6} células/ml y una multiplicidad de infección (moi) de 0,01 durante 96 horas. Las células de Sf9 se centrifugan a continuación a 1000 x g durante 5 minutos. Los sobrenadantes que contienen virus de alta concentración se almacenan a 4ºC.

3. Expresión de AAGA recombinante en Células Hi5

Células Hi5 (Invitrogen), mantenidas a densidades de entre 3x10^{5} y 3x10^{6} células/ml en medio Excell 401 (JRH Biosciences; distribuido por AMS Biotechnology bien en matraces agitadores (que giran a 90 rpm) o bien en matraces centrifugadores (que giran a 75 rpm), se infectan con el baculovirus recombinante amplificado a una densidad celular de 2,0x10^{6} a una moi de 2,0 durante 60 horas. Después de la infección, las células Hi5 se centrifugan a 1000 x g durante 5 minutos, los sobrenadantes se vierten y las pellas celulares se congelan a -80ºC.

4. Preparación de lisado en bruto

Las células (1x10^{9}) se suspenden en 100 ml de tampón de lisis (Hepes 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, glicerol al 5%, \beta-mercaptoetanol 2 mM, imidazol 0,5 mM, Nonidet P-40 al 0,1%, 40 \mug/ml de AEBSF, 0,5 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de aprotinina y 0,7 \mug/ml de pepstatina A). Las células se incuban sobre hielo durante 15 min y a continuación se centrifugan a 39.000 x g durante 30 min a 4ºC. La muestra se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum inmediatamente antes del uso.

5. Cromatografía de afinidad con quelatos metálicos

La cromatografía de afinidad con quelatos metálicos se lleva a cabo a temperatura ambiente con una columna empalmada a una estación de trabajo cromatográfica BioCAD. Una columna Poros MC/M (16 mmDx100 mmL) de 20 ml se carga con Ni^{2+} antes del uso y después de cada purificación. Para cargar con Ni^{2+}, la columna se lava con 10 volúmenes de columna (CV) de EDTA 50 mM, pH 8, NaCl 1 M, seguido por 10 CV de agua. La columna se carga con 500 ml de NiSO_{4} 0,1 M, pH 4,5-5, se lava con 10 CV de agua, y a continuación cualquier Ni^{2+} no unido se retira lavando con 5 CV de NaCl 0,3 M. Todas las etapas se realizan con un caudal de 20 ml/min. La columna MC/M cargada se satura con 5 CV de Tampón B (Hepes 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, \beta-mercaptoetanol 2 mM, PMSF 1 mM, imidazol 250 mM) seguido por equilibración con 10 CV de Tampón A (como el Tampón B, excepto que imidazol 0,5 mM). 90-95 ml del lisado en bruto se cargan a la columna por recorrido a un caudal de 20 ml/min. Se llevan a cabo etapas subsiguientes con un caudal de 30 ml/min. Cualquier material no unido se retira lavando con 12 CV de tampón A y el AAGA se eluye aplicando un gradiente de Tampón B al 0-100% durante 10 CV. Las fracciones (8 ml) se recogen sobre el gradiente. Fracciones que contienen AAGA se combinan y se añaden inhibidores de proteasa a las concentraciones finales descritas para el tampón de lisis anterior. También se añade DTT hasta una concentración final de 1 mM. Las fracciones combinadas se dializan durante la noche frente a 4 litros de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, PMSF 0,2 mM a 4ºC.

6. Cromatografía de Intercambio Iónico (Intercambio Aniónico)

Se lleva a cabo cromatografía Resource^{TM} Q a 4ºC con una columna empalmada a una estación de trabajo de FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). Una columna Resource^{TM} Q (16 mm de D x 30 mm de L) de 6 ml se equilibra con 10 CV de Tampón C (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, DTT 1 mM) a un caudal de 2 ml/min. El eluato de quelato metálico dializado se aplica a la columna y se lava con 10 CV de Tampón C. La proteína se eluye aplicando un gradiente de Tampón D al 0-100% (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, NaCl 1 M) durante 10 CV. Las fracciones (3 ml) se recogen al eluir la columna.

7. Filtración en Gel

Se lleva a cabo cromatografía de filtración en gel a 4ºC con una columna empalmada a una estación de trabajo de cromatografía BioCAD SPRINT (PE Biosystems). Una columna Superdex 200 HR de 24 ml (10 mm de D x 300 mm de L) (Amersham Pharmacia Biotech) se equilibra con 10 CV de Tampón E (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, NaCl 150 mM) a un caudal de 0,5 ml/min. El eluato de intercambio iónico se aplica a la columna y se eluye con Tampón E. Las fracciones (1 ml) a lo largo del desarrollo de la purificación se recogen y se analizan.

8. Concentración de Muestra

Las muestras se concentran aproximadamente 10 veces usando un dispositivo de centrifugación Millipore Ultrafree-15 (separación de PM 50 kDa) a 4ºC. El dispositivo se preenjuaga con agua antes de usar. El tampón de almacenamiento final usado para el almacenamiento a largo a plazo a -80ºC es Hepes 20 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, glicerol al 5%. El glicerol puede omitirse de la muestra para el almacenamiento a 4ºC.

\newpage

Ejemplo 5

Este ejemplo se refiere a la producción de anticuerpos policlonales contra proteína de AAGA purificada como se describe en el Ejemplo 4.

Inmunización de Conejos

Se inmunizan conejos holandeses (Harlen-Olac) en 4 zonas subcutáneas con 500 \mug de proteína de AAGA purificada en PBS de acuerdo con el siguiente esquema:

9

Se toman sangrados de muestra (500 \mul) y el suero se determina con respecto a la concentración de anticuerpo. El suero se recoge cuando se alcanza una concentración máxima. Esto se realiza recogiendo sangre (10 ml) y dejando que coagule durante 2 horas a 4ºC. La sangre se centrifuga a 1000 x g durante 5 minutos para separar el suero. El suero se retira y se almacena a -20ºC hasta que se ensaya.

Rastreo de ELISA

Placas de 96 pocillos Nunc-Immuno Plate Maxisorp (Nunc, Fisher Scientific UK, Loughborough, UK) se usan como un soporte sólido y se revisten con la proteína de AAGA purificada (100 ng/pocillo) durante la noche a 4ºC. Las placas se bloquean durante 3 horas a 37ºC con PBS que contiene BSA (Sigma) al 2% y NaN_{3} (Sigma) al 0,02%. Después del bloqueo, las placas se incuban durante la noche a temperatura ambiente con suero en diferentes diluciones de PBS. La presencia de anticuerpos policlonales se verifica tanto con anticuerpos de IgG etiquetados con biotina para conejo (antisuero anti-(IgG de conejo) caprino, dilución 1:25.000), con un tiempo de incubación de 40 min. Estreptavidina conjugada a fosfatasa alcalina (Immununo Research, Dianova, CH) se añade a continuación con una dilución de 1:10.000. El desarrollo de la reacción se lleva a cabo añadiendo un substrato de fosfatasa alcalina (Sigma, f.c. 1 mg/ml) disuelto en dietanolamina. Después de 45 min, se lee la absorbancia a 405 nm con una referencia de 490 nm con un lector de placas de ELISA (Bio-rad laboratories Ltd., Hemel Hempstead, UK).

Purificación

5 ml de proteína A-agarosa se vierten en una columna cromatográfica y se lavan con 6 volúmenes de columna de tampón de tris(hidroximetil)metilamina (Tris) 0,1 M, pH 7,5. El suero de conejo que contiene anticuerpos anti-AAGA se diluye (1/2) con tampón de Tris y se añade a la proteína A-agarosa. Las proteínas no unidas se retiran lavando la columna con 6 volúmenes de tampón de Tris. La IgG se eluye de la columna con 3 volúmenes de columna de tampón de glicina 0,1 M, pH 3,0, y se recoge como fracciones de 1 ml en tubos que contienen 28 \mul de Tris 1 M. Las fracciones que son positivas con respecto al contenido de proteína se verifican con respecto a la pureza mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Se visualizan dos bandas a 50 y 25 Kd correspondientes a las cadenas pesada y ligera de una molécula de inmunoglobulina. Las fracciones que contienen solo inmunoglobulina se reúnen, se verifican de nuevo con respecto a la concentración de proteína y se almacenan a -20ºC.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe la preparación de anticuerpos monoclonales contra proteína de AAGA purificada como se describe en el Ejemplo 4.

Inmunización de Ratones

Ratones Balb/c hembra se inmuniza intraperitonealmente con 100 \mug de proteína de AAGA en PBS de acuerdo con el esquema dado posteriormente:

10

El suero se determina con respecto a la concentración de anticuerpo mediante ELISA (Ejemplo 5) después de que el animal se sacrifique para la preparación de células de bazo para fusión. Si la concentración de anticuerpo es suficiente, (de 1/1.000 a 1/100.000), los hibridomas se rastrean, de otro modo se descartan.

Preparación de Células de Mieloma

Células de mieloma múrido Sp2/0 (Nº ATCC CRL 1581; mantenidas en el medio de cultivo que contiene 20 \mug/ml de 8-azaguanina) se cultivan durante una semana antes de la fusión en RMPI 1640 (no se incluye 8-azaguanina), FCS al 10% (v/v) y penicilina-estreptomicina (50 UI/ml y 50 \mug/ml, respectivamente) al 1%. Las células se recogen mediante centrifugación (200 x g durante 5 min) y se lavan tres veces en RMPI 1640 frío. Se usan aproximadamente 2,5x10^{6} células por placa de microvaloración de 96 pocillos.

Preparación de Suspensión de Células de Bazo

El ratón se sacrifica mediante una sobredosis de anestésico (Forene), el bazo se diseca y se prensa a través de un estirador de células (estirador de células de malla de 70 \mum; Becton & Dickinson, Oxford, UK, Nº Cat. 2350). La suspensión celular se lava tres veces en RPMI 1640 (como anteriormente) y se cuenta: son necesarias 5x10^{6} células/placa de 96 pocillos.

Fusión de Células de Mieloma y Células de Bazo

Las células de bazo y de mieloma se mezclan (2:1), se centrifugan (200 x g durante 5 min) y la pella se calienta en un baño de agua a 37ºC. Se añade polietilenglicol 4000 precalentado (1 ml por 10^{8} células) lentamente a lo largo de un minuto y a continuación 20 ml de medio de lavado precalentado durante dos minutos. Después de la centrifugación, la pella se resuspende cuidadosamente en medio de selección (RPMI 1640, FCS al 10%, penicilina-estreptomicina al 1%, H1 condimentado con BM al 10% (substitución de células alimentadoras de Boehringer Mannheim, Lewes, UK; Nº Cat. 1 088 947), suplemento de medio HAT al 10% (hipoxantina, aminopterina y timidina para seleccionar contra células de mieloma no fusionadas; Boehringer Mannheim, Lewes, UK; Nº Cat. 644 579) y se cultivó en placas, 200 \mul/pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos. Después de cinco días, pueden identificarse aglomeraciones de células híbridas examinando el fondo de los pocillos de microvaloración con un microscopio invertido. Después de 10-14 días, el sobrenadante de cultivo se prueba con respecto a la presencia de anticuerpos mediante ELISA (ejemplo 4). Los clones positivos se expanden en una placa de ensayo de 24 pocillos y se prueban de nuevo.

Clonación de Hibridomas Positivos

Los clones expandidos que todavía son positivos se clonan mediante dilución limitante. Las células se diluyen en serie en cuatro etapas de dilución en una placa de microvaloración de 96 pocillos; 5, 2, 1 y 0,5 células/pocillo. Suplemento de medio HAT se reemplaza por suplemento de medio HT (Boehringer Mannheim, Lewes, UK; Nº Cat. 623 091). Después de aproximadamente una semana las células se rastrean mediante ELISA (Ejemplo 4). Las células de aquellos pocillos que contienen un solo clon positivo se expanden.

Producción de Sobrenadante de Anticuerpo Monoclonal

Las células se hacen crecer en matraces de cultivo en medio estándar (RMPI 1640, FCS al 10% (v/v) y penicilina-estreptomicina al 1%) hasta que los hibridomas sobrecrecen y mueren. El residuo se retira mediante centrifugación y el sobrenadante que contiene los anticuerpos se valora usando ELISA (Ejemplo 4) antes de almacenar bajo condiciones estériles a 4ºC, -20ºC o -70ºC.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Novartis AG y otros

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Gen Asociado con Enfermedad

\vskip0.400000\baselineskip

<130> Caso 4-32067A/HO 41

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 94

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 19761

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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11

12

13

14

15

16

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<210> 2

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<211> 2828

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 2717

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 4069

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 4649

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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21

22

23

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 4684

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1065

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgccttag gcttatctcc ctt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctcggaat gtcagctact tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcatctgg tgcctttgg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagcctaac aatgctctcc tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgtacaag gtgccggagg aa

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctcatagg atgccacacc gt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacactacc cgagtggcgt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcctactg gctcctccag c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctggcccc catactcacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtccactgg ctctctctcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccgcccat ggaaca

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacttggcat ctcagaacaa agag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccccacat gcatggtagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatgctctg gggcatgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctcttttt ctgacaatca ccc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggacaggc cagggcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctggcagt ttttccccta ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctatttg ggctgcaggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaagcacgg tgacacgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccccggct gctaga

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggaccagc atcacgg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagccgacta tggttttcca g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaggga tcaccaggg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgcagcct tcctgattct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgacacca atgacaacgc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagaggttc ccccagctt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagtgagacc ccttctcccc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttgtcagg aagaggcaaa atg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtgagctg agttggaaca aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagctgcc tagtgcctg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atacatgcct cctcccctag g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactttggct tgaggaccca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagccccagc tcctttcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggcccggt ttctcat

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtacaat ggcgaggtct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtctactcc aaacctaggt ctctatgtca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggacccag ccccag

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacacggat taggctgagt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctaccaccc ccaaccca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcagtact ccgactacag ctacc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcccccaa cacgg

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccccgcatc cacctg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatgtgtttg caggtggcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggccaaa agtggttaaa c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatcctcgt cctccactgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcacagcct tggtccatc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgccacgct gcttggag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcttggtga gacggtcagc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggcgccgc tcaatct

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacggtgac tttgttatcc agaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctgagcg aggtggga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagctatg agttgaaggt ggtg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcatgtt ctccatcact gag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaacgcacc tgtcttcact cag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatggtgaa gaggccctta gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggtgatg tgcccttcc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagttagtg ctggagagtg gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagagtgcc cgtgccc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctcctctg ccacatcctc tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgatcta aaccatctct gttctc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtccatgc gaagaagacg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtcccatct ccaatagttg cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caatacatag atgattcgtt taaggcct

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggtggtgg gccctgt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacactgcat gaccagcagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgggctcc ttcccttgac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgcttca gggctaaaat t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaatggcc cattccag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatggaaatg aggggagagg ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaccaaaac ggccccc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtggctgc gggtgg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctccctc ctacagacct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgttttggt gttccggtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcctgtgag ttcagcggt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccctggcg ctgcg

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgattaat accagtgcgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccaaccca ggcatcc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaggcgctg tcctctcca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttagttctg gcccctgcct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacaaacat ttcctgagcc cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagaattt ccggctcaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacccttcc taaacctgag gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctcaccct tcactgtggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttgctgct ttcggagaga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagaccgag gctgagacct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctgacgcg ttctgaggat

\hfill

20

Claims (8)

1. Un método para determinar si un sujeto tiene, o corre riesgo de desarrollar, una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial, que comprende determinar, en una muestra de células procedente del sujeto, (i) el nivel de expresión de un polinucleótido (A) que comprende la secuencia de nucleótidos Nº ID SEC: 1 o Nº ID SEC: 2 o Nº ID SEC: 3 o Nº ID SEC: 4 o Nº ID SEC: 5 o Nº ID SEC: 6 o una secuencia que se hibrida a la misma bajo condiciones restrictivas, o el nivel de expresión de un polipéptido (B) que comprende la secuencia de aminoácidos Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8 o una de sus variantes que tiene equivalencia funcional de adhesión célula-célula, o el nivel de una bioactividad de dicho polipéptido (B) midiendo la adhesión célula-célula dependiente de calcio, y comparar el nivel de expresión de (A) o (B) o el nivel de bioactividad de (B) con el nivel respectivo de expresión de (A) o (B) o la bioactividad en un sujeto sano, o (ii) la presencia de una variante de dicho polinucleótido (A) asociado con la hipersensibilidad bronquial, teniendo dicha variante de polinucleótido (A) T en la posición correspondiente a la posición 6377 en el Nº ID SEC: 1 y/o C en la posición correspondiente a la posición 7390 en el Nº ID SEC: 1.

2. Una sonda oligonucleotídica específica de un alelo, o un cebador específico para un alelo, capaz de detectar un polimorfismo en el polinucleótido (A) según se define en la reivindicación 1 (i) o (ii) en la posición 6377 ó 7390 del Nº ID SEC: 1, donde la sonda específica de un alelo tiene aproximadamente 15-50 nucleótidos y se solapa con dicha posición 6377 ó 7390 del Nº ID SEC: 1, y donde el cebador tiene de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos y la secuencia de nucleótidos del cebador corresponde al alelo que ha de detectarse o corresponde parcialmente a de aproximadamente 5 a 10 de los nucleótidos en el extremo 3' del cebador correspondientes a los del alelo que ha de detectarse.

3. Un polinucleótido aislado que es una variante del polinucleótido (A) según se define en la reivindicación 1 (i), que tiene T en la posición 6377 del Nº ID SEC: 1 y/o C en la posición 7390 del Nº ID SEC: 1.

4. Uso de un polinucleótido (A) de acuerdo con la reivindicación 1 (i) o una de sus porciones que tiene al menos 20 bases contiguas, que comprende el nucleótido 6377 y/o el nucleótido 7390 del Nº ID SEC: 1, para la preparación de un agente para el diagnóstico o el pronóstico de una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial.

5. Uso de un polinucleótido (A) de acuerdo con la reivindicación 1 (i), un polipéptido (B) de acuerdo con la reivindicación 1, un anticuerpo (C) que es inmunorreactivo con dicho polipéptido (B), o un oligonucleótido (D) que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la de dicho polinucleótido (A) de acuerdo con la reivindicación 1 (i) o (ii) o una de sus variantes asociada con la hipersensibilidad bronquial, teniendo dicha variante del polinucleótido (A) T en la posición correspondiente a la posición 6377 en el Nº ID SEC: 1 y/o C en la posición correspondiente a la posición 7390 en el Nº ID SEC: 1, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por hipersensibilidad bronquial.

6. Un método para verificar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente farmacéutico, que comprende las etapas de determinar el nivel de expresión o actividad, midiendo la adhesión célula-célula dependiente de calcio, del polinucleótido (A) o el polipéptido (B) según se definen en la reivindicación 1 (i) o (ii) en una muestra de DNA anterior a la administración procedente del sujeto y en una muestra de DNA posterior a la administración procedente del sujeto, comparando el nivel respectivo de expresión o actividad, midiendo la adhesión célula-célula dependiente del calcio, en la muestra anterior a la administración y en la muestra posterior a la administración, y determinando si se requiere una alteración de la administración del agente farmacéutico al sujeto.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enfermedad es asma.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que la enfermedad es asma.