CN111004844A

CN111004844A - 原发性家族性脑钙化致病基因jam2及其应用

Info

Publication number: CN111004844A
Application number: CN201911203530.5A
Authority: CN
Inventors: 罗巍; 岑志栋; 杨德壕; 陈思; 王乐博; 陈欣辉; 王昊天
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN111004844B

Abstract

本发明提供了原发性家族性脑钙化致病基因JAM2及其应用。具体地，本发明提供了一种JAM2基因、或其蛋白或其检测试剂的用途，用于制备一检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性。本发明首次鉴定了JAM2基因为常染色体隐性遗传原发性家族性脑钙化的一个新的致病基因；并且，通过对JAM2基因或其蛋白的突变的检测能够诊断原发性家族性脑钙化患者和/或其易感性。

Description

原发性家族性脑钙化致病基因JAM2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及原发性家族性脑钙化致病基因JAM2及其应用。

背景技术

原发性家族性脑钙化(Primary familial brain calcification，PFBC)，既往被称为特发性基底节钙化(Idiopathic basal ganglia calcification，IBGC)，最早由Delacour在1850年报道，随后Fahr在1930年再次报道该病，后人习惯称其为Fahr病(Fahr’sdisease)。PFBC是一组以双侧对称性脑钙化(基底节区为主且必须累及，亦可累及小脑齿状核、半卵圆中心、皮质、中脑、脑桥等)为影像学特征，可有帕金森症、共济失调、构音障碍、手足徐动症、舞蹈症、肌张力障碍、癫痫发作、痴呆、头痛/偏头痛、精神情感症状等多种临床表现的神经系统遗传性疾病。

PFBC患者多数伴有明确的家族史，多为常染色体显性遗传，部分常染色体隐性遗传家系亦有报道。患者年幼时智力及运动发育正常，常在30-50岁之间出现临床症状，并逐渐缓慢进展，而无症状的脑钙化可早于临床症状10余年出现。

头颅CT是诊断该病的主要手段，但在老龄且无症状患者中，区别其脑钙化是生理性钙化还是病理性钙化仍是一大难题，而基因诊断可能是明确诊断的方法之一。该病具有高度遗传异质性，至今尚无有效的治疗方法，临床上主要根据患者症状对症治疗，病情往往逐渐加重，部分患者致残，对患者及其家庭造成重大影响。

随着基因测序技术进入临床应用，目前通过基因检测可明确PFBC的致病基因突变，提早明确诊断，不仅可减少不必要的就医和各种多余检查，还可以指导进行个性化治疗管理，有效干预控制患者的临床症状并延缓疾病进展。同时，明确致病基因突变，可为产前诊断提供依据，开展优生优育，减少疾病对个人、家庭及社会带来的负担。然而，现阶段对PFBC的致病基因的突变检测，还有诸多局限，其中最重要的环节之一就是仍有大量PFBC致病基因未被鉴定发现。

自2012年华中科技大学刘静宇教授团队鉴定发现第一个PFBC致病基因SLC20A2后，国内外又陆续鉴定了其他4个PFBC的致病基因(PDGFRB、PDGFB、XPR1和MYORG)。其中SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1主要以常染色体显性遗传方式致病，MYORG主要以常染色体隐性遗传致病。根据既往不同团队的报道，仅13.6％-27.5％的PFBC患者可在常染色体显性遗传PFBC致病基因中发现致病突变；同时目前唯一一个常染色体隐性遗传PFBC致病基因也仅能解释约46.2％符合常染色体隐性遗传模式的PFBC患者。由此可见，鉴定新的PFBC致病基因，无论对于疾病早期诊断、管理还是指导优生优育都具有重要意义。

因此，本领域迫切需要开发新的原发性家族性脑钙化致病基因和其相关的致病突变位点。

发明内容

本发明的目的就是提供新的原发性家族性脑钙化致病基因和其相关的致病突变位点。

具体地，本发明的主要目的在于鉴定PFBC新的致病基因JAM2，并提供其相关的突变位点及对应的编码蛋白序列、JAM2突变基因检测试剂盒、检测方法及突变型质粒。

在本发明的第一方面，提供了一种JAM2基因、或其蛋白或其检测试剂的用途，用于制备一检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性。

在另一优选例中，所述JAM2基因含有选自表A的一个或多个基因突变：

表A

其中，核苷酸位置编号基于如SEQ ID NO:1所示的野生型JAM2基因序列。

在另一优选例中，所述JAM2基因含有选自下组的一个或多个基因突变：

位点	突变形式
		1	A→G
140	碱基缺失
		68至394	碱基片段缺失
504	G→C

在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)针对JAM2基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述基因突变位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述基因突变位点的芯片；

(d)用于检测一种或多种所述基因突变位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述试剂盒中包括：用于扩增JAM2基因部分片断的引物对。

在另一优选例中，所述引物对包括一种或多种选自下组的引物对：引物对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19；其中，所述引物对1-19分别对应于表A中的基因突变序号为1-19的基因突变。

在另一优选例中，所述的所述引物对的扩增产物含有选自下组表A中的基因突变序号为1-19的基因突变位点。

在另一优选例中，所述的基因突变位点包括：位于基因组DNA上的所述基因突变位点、cDNA上的所述基因突变位点、或其组合。

在另一优选例中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ IDNO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22，或SEQ ID NO:23和24所示。

在另一优选例中，所述的蛋白包括JAM2蛋白的全长或JAM2蛋白片段。

在另一优选例中，所述的JAM2基因、或其蛋白来源于哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。

在另一优选例中，所述检测为外周血、羊水、脑脊液和皮肤组织检测。

在另一优选例中，所述的JAM2蛋白偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述JAM2蛋白还包括野生型JAM2蛋白的衍生物。

在另一优选例中，所述JAM2蛋白的衍生物包括经修饰的JAM2蛋白、氨基酸序列与野生型JAM2蛋白同源且具有野生型JAM2蛋白活性的蛋白分子、含有野生型JAM2蛋白氨基酸序列的融合蛋白。

在另一优选例中，所述野生型JAM2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然JAM2蛋白同源且具有天然JAM2蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与JAM2蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有野生型JAM2蛋白活性的蛋白分子。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的含突变位点的多核苷酸、或其蛋白、或其检测试剂的用途，用于制备一检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性，其中，所述的突变位点选自表A。

在另一优选例中，所述多核苷酸长度为8-5000bp，较佳地10-3000bp，更佳地15-1000bp，最佳地18-500bp。

在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：引物、探针、抗体、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体结合于突变型JAM2蛋白，但不结合于野生型JAM2蛋白，其中所述的突变型JAM2蛋白含有对应于表A的基因突变位点的突变氨基酸或所述突变型JAM2蛋白是表A的基因突变位点所导致的截断型JAM2突变蛋白。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的突变型JAM2多肽，所述突变型JAM2多肽具有W168C的氨基酸残基突变；其中，氨基酸序列的编号基于如SEQ ID NO:2所示的野生型JAM2蛋白序列。

在另一优选例中，所述的突变型JAM2多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2且第168位为C(W168C)。

在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码如本发明第三方面所述的突变型JAM2多肽。

在另一优选例中，所述多核苷酸(即突变型JAM2的编码序列)在第504位具有从G到C的基因突变位点；其中，核苷酸位置编号基于如SEQ ID NO:1所示的野生型JAM2基因序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA、RNA、或其组合。

在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID No.:1所示，并且在第504位具有从G到C的突变。

在本发明的第五方面，提供了一种检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性的试剂盒，所述试剂盒包括检测JAM2基因或其编码蛋白的检测试剂。

在另一优选例中，所述JAM2基因具有选自表A的一个或多个基因突变位点。

在另一优选例中，所述JAM2蛋白具有W168C的氨基酸残基突变；其中，氨基酸序列的编号基于如SEQ ID NO:2所示的野生型JAM2蛋白序列。

在另一优选例中，所述试剂盒包括：

(a)JAM2基因和/或其编码蛋白；和/或

(b)特异性扩增JAM2基因组DNA、mRNA或cDNA的引物或引物对；

以及(c)标签或说明书；

其中，所述的组分(a)、(b)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容器中。

在另一优选例中，所述组分(a)可作为对照品或参照品。

在另一优选例中，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于：检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性。

在本发明的第六方面，提供了一种检测JAM2基因突变的方法，包括步骤：

(a)提供一待测样本；

(b)对上述待测样本中的核酸进行检测，并与野生型JAM2的核酸序列进行比对，从而确定所述待测样本中的JAM2基因是否存在选自表A的一个或多个基因突变位点。

在另一优选例中，所述的待测样本为人的样本。

在另一优选例中，所述的检测包括对样本进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测。

在另一优选例中，所述的“对扩增产物进行检测”包括探针杂交、测序、实时荧光PCR。

在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。

在本发明的第七方面，提供了一种JAM2基因或其编码蛋白或其调节剂的用途，用于制备一药物，所述药物能够预防和/或治疗原发性家族性脑钙化。

在另一优选例中，所述的JAM2基因编码野生型JAM2蛋白，或所述的编码蛋白具有野生型JAM2的功能。

在另一优选例中，所述的JAM2蛋白为野生型JAM2蛋白。

在另一优选例中，所述调节剂包括激活剂。

在另一优选例中，所述激活剂促进所述基因的表达或提高所述基因表达产物(蛋白)的活性。

在另一优选例中，所述调节剂包括：抗体、小分子化合物、核酸、多肽、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物包括活性成分I，所述活性成分I能够使所述预防和/或治疗的受试对象中的JAM2基因中的一个或多个选自表A的突变位点进行回复突变，形成野生型JAM2的核酸序列。

在另一优选例中，所述活性成分I包括：具有Cas9基因编辑功能的基因编辑酶和sgRNA。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了3个患者的家系图及胶图。

其中，(A)显示了A家系的家系图；(B)显示了c.140delT突变纯合子、杂合子携带者以及正常对照者中相应序列的测序峰图；(C)显示了B家系的家系图；(D)显示了c.1A>G突变纯合子、杂合子携带者以及正常对照者中相应序列的测序峰图；(E)显示了C家系的家系图；(F)显示了JAM2基因第168位氨基酸在各个物种高度保守性；(G)显示了PCR扩增JAM2基因cDNA 2-4号外显子情况，在C家系F3-II:1患者中发现两条带(长和短)，而在C家系F3-I:2和三个对照中仅发现一条长的条带；(H)显示了较长和较短条带的测序峰图，证实C家系F3-II:1患者的2-4号外显子缺失；(I)显示了JAM2蛋白的结构域的示意图(橙色段：32-127氨基酸，Ig样V型结构域；棕色段：134-238氨基酸，Ig样C2型结构域；绿色框：PDZ基序)和四种突变的预测效果示意图。灰色线，预测截短的氨基酸序列。

图2显示了患者头颅CT检测结果。

其中，(A)显示了A家系F1-II:2患者的头颅CT结果；(B)显示了A家系F1-II:3患者的头颅CT结果；(C)显示了B家系F2-II:1患者的头颅CT结果；(D)显示了C家系F3-II:1患者的头颅CT结果。

图3显示了质粒构建的突变JAM2基因蛋白表达情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地发现一类在原发性家族性脑钙化患者体内特异的突变基因，即具有特定突变形式的JAM2基因。实验结果表明，JAM2基因或其蛋白的突变与原发性家族性脑钙化的易感性存在极其密切相关性。具体地，本发明人通过纯合子定位、全基因组测序、大样本基因突变筛查(包括gDNA和cDNA的Sanger测序)等技术方法，在来自3个不同家系的4个患者中发现了JAM2基因4种不同类型(移码突变、起始密码子突变、外显子缺失、错义突变)的突变，并通过构建突变型细胞模型证实这些突变可引起该基因的蛋白功能缺失，首次鉴定了JAM2基因为常染色体隐性遗传PFBC的一个新的致病基因。此外，本发明人还发现，通过对JAM2基因或其蛋白的突变的检测能够诊断原发性家族性脑钙化患者和/或其易感性。在此基础上完成了本发明。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者(或对象)特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。

基因突变

基因突变(DNA序列变异，gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变。

基因上发生基因突变的位点即为本文中的突变位点，在突变位点上可以发生碱基的增添、缺失或替换。

如“c.140delT”表示cDNA在第140位的T缺失。

如“c.638_639del”表示cDNA的第638位到第639位的碱基片段缺失。

如“c.1A>G”表示cDNA在第1位的A突变为了G。

如“c.395-1dup”表示cDNA第5号外显子上游第一位内含子重复1次。

如“c.643_644insGGGGT”表示在cDNA的第643位与第644位的碱基之间插入了碱基片段GGGGT。

如“c.(67+1_68-1)_(394+1_395-1)del”表示cDNA水平2-4号外显子缺失导致的第68位到第394位的碱基片段缺失。

含突变位点的多核苷酸

本发明还提供了含本发明所述突变位点的多核苷酸。在本发明的一个优选的实施方式中，本发明还提供了含有所述多核苷酸的载体、宿主细胞。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多态式。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，包括单链、双链和三螺旋分子结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。如以下非限制性实施例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针、引物。多核苷酸也可以包括经修饰的核酸分子，如甲基化核酸分子和核酸分子类似物。

在另一优选例中，所述的多核苷酸本身还可以包括检测所述多核苷酸的检测试剂，包括引物、探针、扩增产物、或质粒。

如本文所用，术语“基本分离的”或“分离的”多核苷酸是指基本没有天然的相关序列的多核苷酸。基本上没有是指至少50％、较优地至少70％、更优地至少80％或最优地至少90％不含其它天然相关物质。“分离的多核苷酸”还包括重组的多核苷酸。

如本文所用，术语“在严格条件下杂交”意在描述杂交条件，在该条件下，彼此至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％相同的核苷酸序列典型地彼此保持杂交。这些严格的条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y(1989)中找到。严格杂交的一个非限制性实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在0.2xSSC，0.1％SDS中在50-65℃下一次或多次洗涤。

如本文所用，术语“引物”是指在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

如本文所用，术语“载体”是指可以携带插入的DNA并且可以为维持在宿主细胞中的DNA分子。载体也可以为克隆载体，克隆媒介物等。术语“载体”包括主要功能为将核酸分子插入到细胞中的载体，主要功能在于复制核酸的复制载体，和用于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体，还包括提供多余一种上述功能的载体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是载体或核酸分子和/或蛋白质整合的接受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且由于天然的、随机的或有意突变，所述子代可能未必与亲代完全相同(在形态上或在总DNA互补序列上)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸转染的细胞。“分离的宿主细胞”是指已经与它来源的生物在物理上分离的宿主细胞。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

JAM2基因及其突变形式

JAM2基因编码连接粘附分子2型(Junction adhere molecular 2)蛋白，其在脑组织有广泛的表达，主要在内皮细胞和星形胶质细胞表达。值得注意的是，脑部的内皮细胞、星形胶质细胞，是组成神经血管单元(Neurovascular Unit,NVU)的重要细胞类型，而且越来越多的研究表明，NVU相关细胞的异常，是PFBC致病基因致病的主要病理生理机制。

在本发明中，JAM2基因被鉴定为一新的PFBC致病基因，在临床上为PFBC致病基因突变检测提供了新的候选基因，更为进一步从NVU角度揭示PFBC发病机制提供了重要依据，为未来寻找PFBC治疗靶点提供了方向。

应理解，术语“JAM2基因”还包括各种天然存在的JAM2基因的变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的JAM2蛋白的核苷酸序列，编码野生型JAM2蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于小鼠之外的其他哺乳动物时，该术语指JAM2基因在该哺乳动物中的同系物。

在本发明中，提供了人类JAM2基因的4种致病突变形式。杂合的或纯合突变或复合杂合形式突变序列的个体，其患PFBC的可能性显著高于正常群体。具体地，参照SEQ ID NO:1序列(正常人的JAM2野生型基因核苷酸序列)，4种突变形式如下：

突变1：在JAM2基因突变序列在第1位点，由野生型基因的A碱基突变为G碱基，即发生c.1A>G起始密码子突变。

突变2：在JAM2基因突变序列在第140位点，出现1个碱基T的缺失，即发生c.140delT移码突变。

突变3：JAM2基因突变序列的第68到394位点出现327个碱基的缺失，即发生c.(67+1_68-1)_(394+1_395-1)del外显子缺失突变。

突变4：JAM2基因突变序列在第504位点，由野生型基因的G碱基突变为C碱基，即发生c.504G>C错义突变。

并且，本发明提供了上述JAM2基因的4种突变方式相对应的编码蛋白序列。如SEQID NO:1所示的野生型JAM2基因编码序列，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。以SEQID NO:2所示蛋白序列为参照，4种突变形式如下：

突变1：因蛋白翻译的起始密码子突变，导致基因无法进行翻译。

突变2：该突变蛋白第48位点的亮氨酸突变为终止密码子，即发生p.L48*突变。

突变3：该突变蛋白第23位点的酪氨酸到131位点的亮氨酸全部缺失，同时第132位的缬氨基酸突变为亮氨酸，即发生p.Y23_V131delinsL突变。

突变4：该突变蛋白第168位点的色氨酸突变为半胱氨酸，即发生p.W168C突变。

SEQ ID NO:2序列所示的JAM2野生型基因编码蛋白的缺失，或者上述任一种或一种以上的JAM2突变基因编码蛋白的出现，均揭示了原发性家族性脑钙化的发生。

除上述4种突变类型之外，本发明人还通过生物信息学方法，筛选出了15个明确功能缺失的JAM2基因突变(表4)和99个可能导致JAM2基因功能缺失的突变(表5)。其中，15个明确功能缺失的JAM2基因突变可用于原发性家族性脑钙化的诊断；99个可能导致JAM2基因功能缺失的突变可作为原发性家族性脑钙化的诊断的候选位点。

试剂盒及其应用

本发明还包括可用于检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性扩增含突变位点的扩增产物的引物。更优选的，它还含有选自下组的试剂：(a)与突变位点结合的探针；(b)识别突变位点的限制性内切酶。

应理解，在本发明首次揭示了本发明JAM2基因以及本发明突变位点与原发性家族性脑钙化的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含所述突变位点的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在这些突变位点。

通常，引物的长度为15-30bp，较佳地为18-22bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明突变位点的对应位置。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。

典型地，本发明的试剂盒包括：用于扩增JAM2基因部分片段的引物对。

优选地，所述引物对包括一种或多种选自下组的引物对：引物对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19；其中，所述引物对1-19分别对应于表A中的基因突变序号为1-19的基因突变。优选地，所述的所述引物对的扩增产物含有选自下组表A中的基因突变序号为1-19的基因突变位点。在另一优选例中，所述的基因突变位点包括：位于基因组DNA上的所述基因突变位点、cDNA上的所述基因突变位点、或其组合。在一个优选的实施方式中，所述引物对1的序列如SEQ ID NO:3和4所示。此外，一对或多对引物对也可包装在一起，并且一起使用。

在本发明中，典型的检测步骤和诊断标准如下：

(1)采集待检测者的外周血样本，利用酚氯仿法提取样本的基因组DNA；

(2)采用上述所说的试剂盒引物进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行sanger测序分析，确定样品中JAM2基因的突变信息。

若待测对象外周血中DNA的JAM2基因全长或其部分片段序列与JAM2基因野生型全长序列或对应部分片段序列不完全一致(尤其是含有表A的突变)，则待测对象为或候选为JAM2基因突变型；若待测对象外周血中JAM2基因全长或其部分片段序列与所述JAM2基因野生型全长序列或对应部分片段序列完全一致，则待测对象为或候选为JAM2基因野生型。

本发明的试剂盒可用于辅助检测待测原发性家族性脑钙化患者的亲属是否易患原发性家族性脑钙化或易感性。

本发明的试剂盒还可用于辅助检测(或辅助筛查)待测一般对象是否是原发性家族性脑钙化易感人群。

本发明的主要优点包括：

1)本发明鉴定了PFBC新的致病基因JAM2，并提供已明确致病的4种致病突变及其对应的编码蛋白序列，用来PFBC诊断方法和药物靶点的开发。

2)本发明结合GnomAD v3数据库及已明确的JAM2致病突变类型，提供114个人群中存在的候选致病突变。

3)针对JAM2基因突变序列，开发了相应的检测试剂盒和检测方法，可以简便有效地对JAM2基因突变进行检测。

4)在本发明中，PFBC基因的明确，为PFBC的病因、发病机制及临床诊治和药物靶点开发提供理论依据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：对PFBC家系A的致病基因筛选

本发明人收集到一个PFBC家系A，根据详细的家族史、疾病史、神经系统查体以及相关辅助检查，判断该家系是常染色体隐性遗传的PFBC家系。该家系中的2个PFBC患者(F1-II:2，F1-II:3)，均表现为基底节、丘脑、小脑齿状核、小脑蚓部、大脑皮层、皮质下白质和中脑大面积钙化灶，临床上有帕金森症和构音障碍的表现，其父母为近亲结婚，父母头颅CT均为阴性。

通过对5个已知基因(SLC20A2、PDGFRB、PDGFB、XPR1和MYORG)相关突变的检测，未发现有相关突变，提示可能有新的PFBC致病基因。

在本实施例中，对该家系A进行了致病基因及其致病突变的筛选，具体如下。

1.1纯合子定位分析

主要流程为：

(i)采集待检测者的外周血样本，利用酚氯仿法提取样本的基因组DNA。

(ii)采用美国illumina公司的Human Omni ZhongHua-8 Beadchip(覆盖中国人特有的常见和稀有变异)对样本的全基因组DNA进行SNP分型。

(iii)使用GenomeStudio软件(美国illumina公司)对Human Omni ZhongHua-8Beadchip的结果进行拷贝数变异(Copy Number Variations,CNV)分析，并对其中最小纯合子区域(Minimum Homozygous Region Size,MHRS)大于1M(mega byte)的区域进行定位，以此定义为纯合子区域。

对该家系2名PFBC患者(F1-II:2，F1-II:3)和未患病的姐姐(F1-II:1)进行纯合子定位分析的结果，提示有5个可疑致病位点chr21:21636712-33987509(12.3Mb),chr13:30780602-36246233(5.4Mb),chr5:44831722-46400935(1.6Mb),chr5:41560079-42918296(1.4Mb)和chr12:110278812-111293326(1.0Mb)。

1.2全基因组测序分析及致病基因筛选

主要流程为：

(ii)采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国凯杰公司)从中提取基因组DNA，在HISeq X二代测序仪(美国Illumina公司)上进行了全基因组测序，对比人类参考基因组GRCh37获取基因突变信息。

测序结果显示平均测序深度为31.83X，超过90.62％的靶标目的区域被覆盖且平均覆盖深度至少为20X。使用基因组分析工具包和VarScan软件对单核苷酸变异和插入/缺失进行分析；使用SpeedSeq软件对结构变异和拷贝数变异进行分析。

通过对其中一个PFBC患者(F1-II:2)进行全基因组测序分析，发现在纯合子定位的5个可疑位点中只有在JAM2基因中有一个致病突变c.140delT(p.L48*)。其基因序列如SEQ ID NO:3所示。JAM2基因野生型序列参见NCBI Gene58494的NM_021219序列，编码序列如SEQ ID NO:1所示。

1.3 Sanger测序验证该PFBC家系的JAM2致病基因突变

使用试剂盒对PFBC的A家系所有成员的突变所在基因片段进行扩增，运用Sanger测序对该PFBC家庭对5个成员(PFBC患者：F1-II:2、F1-II:3；非PFBC患者：F1-I:1、F1-I:2和F1-II:1)进行JAM2基因突变检测和验证。

结果显示，PFBC患者(F1-II:2，F1-II:3)确实存在含有JAM2基因的c.140delT(p.L48*)纯合突变；而其余正常人在该位点未检测到相同的纯合突变。这说明JAM2基因突变在该家系中与疾病表型共分离。

其突变类型如SEQ ID NO:3所示基因序列的JAM2突变基因其突变发生在野生型基因的第140位点，具体为野生型基因此处的1个碱基T缺失即发生c.140delT突变，具体是JAM2野生型基因编码蛋白第48位点的亮氨酸突变为终止密码子，即发生p.L48*突变。

实施例2：在其他家系中筛查JAM2致病基因突变

由于JAM2基因是在家系中唯一分析的致病基因，在本实施例中，进一步扩大了家系样本验证，对398个PFBC家系的先证者进行JAM2全编码区的突变筛查。

根据JAM2的野生型基因编码序列SEQ ID NO:1，设计引物对(见表1)扩增全编码区序列，并进行Sanger测序。表2显示了引物对扩增体系和条件。

表1 JAM2 DNA引物序列

表2引物对扩增体系和条件

编号	组份	添加量/μL
			1	10×PCR buffer(Mg2+)	5
2	dNTP Mixture(2.5mM each)	8
			3	Primer F(10μM)	0.25
4	Primer R(10μM)	0.25
			5	LA Taq DNA聚合酶	0.5
6	基因组DNA模板(100ng/μL)	1.0
			7	灭菌ddH2O	补足至50

其中B、C两个家系的先证者均含有JAM2基因纯合突变或复合杂合突变。

其中，在家系B发现一个纯合突变，所示编码序列的JAM2基因其突变发生在野生型基因的第1位点，具体为野生型基因的A碱基突变为G碱基即发生c.1A>G突变，其因蛋白翻译的起始密码子突变导致基因无法进行翻译。在C家系中发现两个复合杂合突变，其一是突变发生在野生型的第68到394位点，具体为野生型基因此处的327个碱基发生缺失即发生c.(67+1_68-1)_(394+1_395-1)del突变，使得编码蛋白第23位点的酪氨酸到131位点的亮氨酸全部缺失，同时第132位的缬氨基酸突变为亮氨酸，即发生p.Y23_V131delinsL突变；其二突变发生在野生型基因的第504位点，具体为野生型基因的G碱基突变为C碱基即发生c.504G>C突变，使得编码蛋白第168位点的色氨酸突变为半胱氨酸，即发生p.W168C突变。因此共有3个PFBC家系(家系A-C)样本中检测出4种JAM2基因突变(参见表3)。

表3 JAM2基因4种突变(GRCh37)

实施例3：对JAM2基因突变的更多筛选

根据前述实施例中明确的致病突变形式及突变功能的研究，提示双等位基因功能缺失突变是JAM2基因导致PFBC的主要突变类型。

因此，在本实施例中，在GnomAD v3数据库中进行了进一步的JAM2基因突变的筛查。筛查条件为：(i)明确功能缺失的突变(移码突变、无义突变、剪切位点突变)及可能导致功能缺失的突变(错义突变、框内缺失/插入突变)；(ii)正常人群中不存在纯合状态；(iii)正常人群杂合携带评率小于0.01。

最终，筛选出15个明确功能缺失的JAM2基因突变(表4)和99个可能导致JAM2基因功能缺失的突变(表4)。其中，15个明确功能缺失的JAM2基因突变可用于原发性家族性脑钙化的诊断；99个可能导致JAM2基因功能缺失的突变可作为原发性家族性脑钙化的诊断的候选位点。

表4 JAM2基因的15种功能缺失突变(GRCh38)

表5 JAM2基因的99种功能缺失候选突变(GRCh38)

实施例4对4种突变的JAM2基因质粒载体构建

在本实施例中，构建了实施例1和2中的4种致病突变型的质粒载体。

具体地，本发明人将c.140delT、c.1A>G、c.(67+1_68-1)_(394+1_395-1)del、c.504G>C突变的JAM2基因片段进行扩增或合成，并将突变基因片段导入到质粒中获得包含突变基因片段的重组质粒载体，进一步的可以将重组质粒载体导入到细胞中获得包含重组载体的细胞，进行功能分析(见图3)。

讨论

不同的家系A-C的患者均已出现明确的PFBC相关临床症状，如帕金森症、癫痫等。家系B的某患者，因头晕就诊，意外发现了广泛的颅内钙化(图2C)。该患者目前年龄37岁，仍有很大可能在未来出现PFBC相关临床症状。

据此，本发明所提供的JAM2基因在检测原发性家族性脑钙化方面的用途，不仅包括对于已经表现出PFBC症状的患者的诊断，还可运用于还未表现出PFBC症状的患者的PFBC易感性的检测。

本发明首次发现了JAM2基因为PFBC的新致病基因，在将来可为这类症状前患者提供早期临床诊断，甚至在其未出现临床症状前，就予以相关治疗干预，进行疾病的精准管控，提高患者的生活质量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 原发性家族性脑钙化致病基因JAM2及其应用

<130> P2019-1902

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggcgagga ggagccgcca ccgcctcctc ctgctgctgc tgcgctacct ggtggtcgcc 60

ctgggctatc ataaggccta tgggttttct gccccaaaag accaacaagt agtcacagca 120

gtagagtacc aagaggctat tttagcctgc aaaaccccaa agaagactgt ttcctccaga 180

ttagagtgga agaaactggg tcggagtgtc tcctttgtct actatcaaca gactcttcaa 240

ggtgatttta aaaatcgagc tgagatgata gatttcaata tccggatcaa aaatgtgaca 300

agaagtgatg cggggaaata tcgttgtgaa gttagtgccc catctgagca aggccaaaac 360

ctggaagagg atacagtcac tctggaagta ttagtggctc cagcagttcc atcatgtgaa 420

gtaccctctt ctgctctgag tggaactgtg gtagagctac gatgtcaaga caaagaaggg 480

aatccagctc ctgaatacac atggtttaag gatggcatcc gtttgctaga aaatcccaga 540

cttggctccc aaagcaccaa cagctcatac acaatgaata caaaaactgg aactctgcaa 600

tttaatactg tttccaaact ggacactgga gaatattcct gtgaagcccg caattctgtt 660

ggatatcgca ggtgtcctgg gaaacgaatg caagtagatg atctcaacat aagtggcatc 720

atagcagccg tagtagttgt ggccttagtg atttccgttt gtggccttgg tgtatgctat 780

gctcagagga aaggctactt ttcaaaagaa acctccttcc agaagagtaa ttcttcatct 840

aaagccacga caatgagtga aaatgatttc aagcacacaa aatcctttat aatttaa 897

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Arg Arg Ser Arg His Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Tyr

1 5 10 15

Leu Val Val Ala Leu Gly Tyr His Lys Ala Tyr Gly Phe Ser Ala Pro

20 25 30

Lys Asp Gln Gln Val Val Thr Ala Val Glu Tyr Gln Glu Ala Ile Leu

35 40 45

Ala Cys Lys Thr Pro Lys Lys Thr Val Ser Ser Arg Leu Glu Trp Lys

50 55 60

Lys Leu Gly Arg Ser Val Ser Phe Val Tyr Tyr Gln Gln Thr Leu Gln

65 70 75 80

Gly Asp Phe Lys Asn Arg Ala Glu Met Ile Asp Phe Asn Ile Arg Ile

85 90 95

Lys Asn Val Thr Arg Ser Asp Ala Gly Lys Tyr Arg Cys Glu Val Ser

100 105 110

Ala Pro Ser Glu Gln Gly Gln Asn Leu Glu Glu Asp Thr Val Thr Leu

115 120 125

Glu Val Leu Val Ala Pro Ala Val Pro Ser Cys Glu Val Pro Ser Ser

130 135 140

Ala Leu Ser Gly Thr Val Val Glu Leu Arg Cys Gln Asp Lys Glu Gly

145 150 155 160

Asn Pro Ala Pro Glu Tyr Thr Trp Phe Lys Asp Gly Ile Arg Leu Leu

165 170 175

Glu Asn Pro Arg Leu Gly Ser Gln Ser Thr Asn Ser Ser Tyr Thr Met

180 185 190

Asn Thr Lys Thr Gly Thr Leu Gln Phe Asn Thr Val Ser Lys Leu Asp

195 200 205

Thr Gly Glu Tyr Ser Cys Glu Ala Arg Asn Ser Val Gly Tyr Arg Arg

210 215 220

Cys Pro Gly Lys Arg Met Gln Val Asp Asp Leu Asn Ile Ser Gly Ile

225 230 235 240

Ile Ala Ala Val Val Val Val Ala Leu Val Ile Ser Val Cys Gly Leu

245 250 255

Gly Val Cys Tyr Ala Gln Arg Lys Gly Tyr Phe Ser Lys Glu Thr Ser

260 265 270

Phe Gln Lys Ser Asn Ser Ser Ser Lys Ala Thr Thr Met Ser Glu Asn

275 280 285

Asp Phe Lys His Thr Lys Ser Phe Ile Ile

290 295

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagccgtccc tcctcttc 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagcccagg acattacaaa g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgacatccca tctagagccg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agacgcaatt cacaagaaac cc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggggtggg gtccaaatag a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accttctttg cacatccggt c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtccaagcct gtgtgctttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcttcacct ccctctgttc 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagggaaata aatgctttgg ttact 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccaatgagga gagggggaga 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcacacctc tttacctggc t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agtgctgcca tctttcctgg 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaaacactca ttgccttcct aacag 25

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tggcttattt gggagatggc tta 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agttgaacag gcttcacaat cg 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tggaatgtgc aactaggcag t 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aaggtataaa cgtcagcaag tga 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acctacacaa ataacccaac ttctc 25

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttacgtgcac aaggcttcac a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcttggtcaa gctacaggga a 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agcttcagag taccttgtct gc 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcagagtatt tgttggaccc cc 22

Claims

1.一种JAM2基因、或其蛋白或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述JAM2基因含有选自表A的一个或多个基因突变：

表A

基因突变的序号位点突变形式 1 1 A→G 2 140 碱基缺失 3 68至394 碱基片段缺失 4 504 G→C 5 55 碱基缺失 6 188 G→A 7 189 G→A 8 395-1 插入碱基G 9 413 C→G 10 460 C→T 11 504 G→A 12 638至639 碱基片段缺失 13 643至644 插入碱基片段GGGGT 14 656至657 插入碱基片段AA 15 666至670 碱基片段缺失 16 685 C→T 17 803 C→A 18 757-1 G→T 19 785-789 碱基片段缺失

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述JAM2基因含有选自下组的一个或多个基因突变：

位点突变形式 1 A→G 140 碱基缺失 68至394 碱基片段缺失 504 G→C

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中包括：用于扩增JAM2基因部分片断的引物对，其中，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12、SEQ ID NO:13和14、SEQ ID NO:15和16、SEQ IDNO:17和18、SEQ ID NO:19和20、SEQ ID NO:21和22，或SEQ ID NO:23和24所示。

5.一种分离的含突变位点的多核苷酸、或其蛋白、或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒用于检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性，其中，所述的突变位点选自表A。

6.一种分离的突变型JAM2多肽，其特征在于，所述突变型JAM2多肽具有W168C的氨基酸残基突变；其中，氨基酸序列的编号基于如SEQ ID NO:2所示的野生型JAM2蛋白序列。

7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求6所述的突变型JAM2多肽。

8.一种检测原发性家族性脑钙化和/或其易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测JAM2基因或其编码蛋白的检测试剂。

9.一种检测JAM2基因突变的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一待测样本；

10.一种JAM2基因或其编码蛋白或其调节剂的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物能够预防和/或治疗原发性家族性脑钙化。