特发性基底节钙化新的致病基因及其编码蛋白质和应用
技术领域
本发明涉及一种人体变异的基因,尤其涉及一种特发性基底节钙化新的隐性致病基因-ISG15基因。本发明还涉及突变的ISG15基因及其编码蛋白质和应用,包含突变的ISG15基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。
背景技术
特发性基底节钙化(idiopathic basal ganglia calcification,IBGC),是一种先天性神经系统锥体外系疾病,由Delacour在1850年首先报道,因Fahr于1930年首先描述了双侧对称性基底节钙化的典型临床和组织学特点,故早期多以Fahr病命名所有双侧基底节及其他部位脑组织钙化的疾病。特发性基底节钙化主要病理学改变为脑部非动脉性小血管钙化,微血管壁、小血管壁及血管间隙内有钙盐的沉积,还有磷、镁、酸性粘多糖沉积。特发性基底节钙化的发生部位主要为苍白球、尾状核、壳核、丘脑、额顶叶、齿状核、小脑皮质、脑干中央部和侧脑室周围等。常与甲状旁腺机能低下、结节性硬化和生理性钙化相混淆。随着CT的广泛应用,基底节钙化疾病的临床报道越来越多,基底节钙化常伴随偏头疼、癫痫发作、精神障碍、帕金森、脑梗和痴呆等锥体外系临床症状,使患者苦不堪言。
目前基底节钙化的病因不明,遗传因素是该病发生的一个重要因素,大多数IBGC家系表现为常染色体显性遗传方式,也有常染色体隐性遗传和性染色体连锁遗传的报道。IBGC基底节钙化病症也存在免疫因素。某些基底节钙化患者常伴发一些自身性免疫疾病,比如系统性红斑狼疮(参考Lupus.upus.Apr;5(2):123-8.Brain calcification in patients with cerebral lupus.)。不同的研究显示,在基底神经节钙化的病人样本中,检测到了高表达的干扰素-α,γ,揭示了干扰素的表达与基底神经节钙化密切相关(参考The Aicardi-Goutiouti syndrome(familial,early onset encephalopathy with calcifications of the basal ganglia and chronic cerebrospinal fluid lymphocytosis;Interferon-ismilial,early onset nigrostriatal degeneration and basal ganglia calcification)。
除了以上两大影响因素以外,基底节钙化其他可能的致病因素多与小血管内外局部理化因素异常和代谢紊乱有关,如血管通透性钙磷代谢异常,碱性磷酸酶活性紊乱,毒性物质作用,电解质紊乱等。其钙化多发生于小动脉和毛细血管周围,且易发生在终动脉或边缘带的脑血流灌注区,导致局部钙化区域血流量减少,小血管阻塞,使局部神经组织缺血,梗死。
外显子测序技术是一种无偏见的检测方法,已成功地应用于稀有致病突变的检测上,如Freeman-Sheldon综合征的MYH3基因,Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因以及严重大脑畸形的WDR62基因等。因此,本研究利用外显子组测序技术去寻找特发性基底节钙化的新的致病突变,以期丰富该疾病的临床基因检测范围。
发明内容
本发明的主要目的在于鉴别IBGC致病基因,定位出该疾病的基因突变位点。在此基础上,提供IBGC致病基因及其编码蛋白质和应用,包含IBGC致病基因的载体、宿主细胞以及试剂盒,以对特发性基底节钙化疾病进行分子诊断和患病风险评价,为进一步治疗该病提供设计药物的靶点,同时为阐明该病的致病机制提供理论基础。
因此,一方面,本发明提供了突变的ISG15基因,所述突变的ISG15基因序列与SEQ ID NO:1相比具有至少1个非沉默突变,且所述突变的ISG15基因导致特发性基底节钙化的发生;所述非沉默突变选自插入、缺失和置换中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中,所述非沉默突变为SEQ ID NO:1的第163位的C突变为T,其序列如SEQ ID NO:2所示。该突变使得ISG15基因编码的氨基酸序列第55位的谷氨酰胺突变为终止密码子,使蛋白质翻译中断。
第二方面,本发明还提供了SEQ ID NO:2序列编码的蛋白质,由于该序列在163位出现终止密码子,所述蛋白质只有54个氨基酸,其氨基酸序 列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的第三方面,提供了含有上述突变ISG15基因的载体。
在本发明的第四方面,提供了被上述载体转化或转导的宿主细胞或者被上述突变的ISG15基因直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第五方面,提供了上述的突变的ISG15基因在用作治疗特发性基底节钙化疾病的药物靶点或制备特发性基底节钙化疾病诊断试剂盒中的应用。
在本发明的第六方面,提供了一种用于诊断特发性基底节钙化疾病的试剂盒,所述试剂盒包含能够特异性扩增ISG15基因的引物,或能够特异性检测ISG15基因突变的探针。
在一个优选的实施方案中,所述引物或探针序列为SEQ ID NO:1或2所示的序列中第163位前后15~30bp长的序列。
在本发明的第七方面,提供了一种抗体,所述抗体与上述SEQ ID NO:2序列编码的蛋特异性结合,且不作用于正常的ISG15基因所编码的蛋白质。
在本发明的第八方面,提供了特发性基底节钙化治疗剂,所述治疗剂包含上述抗体。
本发明通过外显子组测序技术首次发现了ISG15基因突变可以导致IBGC的发病。一方面,通过检测受试者是否携带有ISG15基因致病突变,可以早期筛查基底节钙化致病突变基因携带者,提供优生优育指导;也可为基底节钙化患者提供分子诊断依据。特别地,本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断IBGC。另一方面,本发明为IBGC的发病机制研究奠定了重要基础,为IBGC患者的治疗提供全新的理论依据。特别地,由于一些IBGC患者伴有高表达的干扰素-α,γ,本发明所确定的致病基因可以经干扰素诱导后高水平表达,这对于病理生理过程较为复杂的IBGC的研究提供新的思路。第三方面,本发明可以为治疗特发性基底节钙化疾病提供可能的药物靶点。
附图说明
图1是某四代常染色体隐性遗传基底节钙化家系图,其中正方形表示男性,圆圈表示女性;带斜线为死亡,实心为患病个体,空心为正常个体;WT/Gln55*表示野生型,Gln55*/Gln55*表示纯合突变型。
图2是P1、P2病人头部CT扫描图,双侧基底节对称性钙化,丘脑及大脑灰白质交界处多处钙化,颅内的白色部分为钙化区域。
图3为突变序列SEQ ID NO:2与正常序列SEQ ID NO:1在突变位点的对比示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述,但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明,并不对本发明的保护范围进行任何的限制,本发明的保护范围以权利要求书限定的范围为准。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中,“ISG15基因”为干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene15),它所编码的氨基酸序列包含165个氨基酸残基,称为ISG15蛋白质,属于类泛素蛋白质(ubiquitin like protein,Ubls)。类泛素蛋白质是一类小分子蛋白质,它们不仅在结构上与泛素相似,而且也可以共价连接到其他的蛋白质上对其进行共价修饰。ISG15可以与泛素的抗体发生交叉反应,因此也被称为泛素交叉反应蛋白质(ubiquitin cross-reaction protein,UCRP),通过蛋白质序列分析,发现ISG15含有2个功能域,即N端功能域与C端功能域。
在本发明中,术语“外显子”是指在成熟mRNA中被保留下的部分,即成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分,在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的, 编码的部分为外显子,不编码的为内含子,内含子没有遗传效应。
在本发明中,术语“外显子捕获”与“芯片杂交”可互换使用,指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。DNA分子正常情况下是双链,因此捕获之前,DNA分子必须变为单链,一般是通过加热使其变性而达到解链目的,解链的DNA分子被迅速冷却,即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地,芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后,通过变性等方法收集捕获的序列并纯化,得到来自捕获后的序列混合物。
在本发明中,“高通量测序”是指采用三种第二代测序平台进行高通量测序:454FLX(Roche公司)、Solexa Genome Analyzer(Illumina公司)和Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量,相对于传统测序的96道毛细管测序,高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列,根据平台的不同,读取长度从25bp到450bp不等,因此不同的测序平台在一次实验中,可以读取1G到14G不等的碱基数。
在本发明中,术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断,获得一组具有一定大小的DNA片段混合物。DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知。在一个优选例中,还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
在本发明中,术语“突变”是指野生型的ISG15多核苷酸序列发生改变,成为变异体,变异体可以是天然发生的或非天然发生的。变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。在本发明中,某一种变异体可以通过多种方式实现,例如,要得到野生型基因编码不完全的变异体,可以通过在野生型基因序列中插入终止密码子,使某个密码子变为终止密码子,或者直接缺失部分序列的方式实现。在本发明中,术语“非沉默突变”是指除了沉默突变以外的基因突变,包括但不限于错义突变、无义突变和移码突变等。
本发明还涉及与所述的ISG15核苷酸杂交且两个序列之间具有至少 80%,较佳地至少90%,更佳地至少95%,至少99%同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
本发明野生型或突变型ISG15核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中,“载体”包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中,所述载体是例如质粒,粘粒,噬菌体,柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中,所述载体是商购可得的。在一个优选的实施方案中,所述载体包含与上述突变的ISG15基因可操作地连接的表达控制序列,例如但不限于启动子,增强子和终止子。在一个优选的实施方案中,所述载体任选地还包含选择标记。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。
本发明还涉及到ISG15突变蛋白质,由于在SEQ ID NO:l所示核苷酸序列中第163位核苷酸发生了C>T置换(图3),导致谷氨酰胺密码子突变为终止密码子,本发明的ISG15突变蛋白质具有SEQ ID NO:3所示的序列,与野生型ISG15氨基酸序列的不同之处为:只有54个氨基酸,缺失了后部分111个氨基酸,因此不具有ISG15蛋白质正常的类泛素化修饰功能。本发明的ISG15突变蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质,优选重组蛋白质,即使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
在本发明中,ISG15突变蛋白质还涉及具有与ISG15突变蛋白质相同 功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。变异形式包括:同源序列、保守性变异体、诱导突变体等。发明还涉及ISG15突变蛋白质类似物。这些类似物肤与ISG15突变蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。
本领域技术人员公知,致病基因具有多方面的用途。因此,本发明提供的突变ISG15基因的用途包括但不限于:用作治疗特发性基底节钙化疾病的药物靶点;制备特发性基底节钙化疾病诊断试剂盒中;用于产生疾病动物模型;为治疗IBGC提供新的药物作用途径。
本发明所述的“试剂盒”是指本领域技术人员以ISG15野生型或突变型核苷酸为基因探针,根据基因杂交的原理,可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸序列,因此使用这种试剂盒可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。试剂盒一般包括:引物、探针、核酸芯片、说明书等,还可能包括与活性成分相容的缓冲液、载体或媒介等。
在本发明中,“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段,其通常为寡核苷酸,例如含有至少5个碱基,例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补,只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的,术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因,而不扩增其他基因。例如,特异性扩增ISG15基因是指,在PCR反应中引物只扩增ISG15基因,而不扩增其他基因,此类引物的设计是本领域技术人员公知的。
在本发明中,术语“特异性检测ISG15基因突变的探针”是指探针能够区分出含有突变的ISG15基因基因与不含有突变的ISG15基因。一般而言,可以通过控制杂交条件的严紧性,使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如,在高度严紧条件下,与ISG15基因精确互补的探针可以与不含有突变的ISG15基因基因杂交,而不与甚至只包含一个点突变的突变的ISG15基因杂交,从而将二者区分开。同样,还可以设计与突变的ISG15基因基因精确互补的探针,从而其在高度严紧条件下与突变 的ISG15基因杂交,而不与不含有突变的ISG15基因杂交。在分子生物学领域中,探针的设计和杂交技术是熟知的。
本发明涉及对突变的ISG15蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于突变的ISG15蛋白质。较佳地,指那些能与突变的ISG15蛋白质产物或片段结合但不识别和结合于野生型的ISG15蛋白质相关抗原分子的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab,或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明的突变的ISG15蛋白质抗体可以用来鉴定突变的ISG15蛋白质。例如,可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记突变的ISG15蛋白质特异抗体,然后让突变的ISG15蛋白质特异抗体与样品接触,再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与突变的ISG15蛋白质特异抗体结合的样品,从而为预测或诊断患者是否存在特发性基底节钙化症提供依据和指导。
本发明的突变的ISG15蛋白质抗体还可以用来中和突变的ISG15蛋白质。如果有足够的数据表明某个体的IBGC与本发明突变ISG15蛋白质的存在相关,可以考虑用突变的ISG15蛋白质特异性抗体中和这些致病突变ISG15蛋白质分子,从而缓解患者的病症。
实施例1:样本获取
发明人发现并鉴定了一个常染色体隐性遗传的基底节钙化家系(图1)。患者的父母为姑表近亲结婚,父母表型正常,患病的三个姐妹(图1中P1、P2、P3)均表现为基底神经节钙化,经初步临床症断为特发性基底神经节钙化。患者P35岁死于癫痫发作。其他两位患者(P1和P2),年龄分别为13岁和10岁,伴有间歇性癫痫。经头部CT扫描发现,P1和P2双侧基底节区均呈对称性钙化灶,伴有丘脑、小脑齿状核或大脑灰白质交界区多发钙化(图2),家系患者智力正常,体形匀称,掌骨无畸形,且血清钙磷、甲状腺素、甲状旁腺素正常,既往无感染、中毒及代谢性疾病史。
发明人在家系中选取2位患者(P1和P2)作为研究样本,母亲作为正常 样本对照,采集每位研究对象的外周血5ml作为研究样品。根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求,所有被采血的家系成员均签署了患者知情同意书。
实施例2:样本DNA制备
采集两例基底节钙化患者及其母亲外周血,采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA,提取步骤如下:
(1)取2ml全血样本,加入150ul OB Protease,2.1ml Buffer BL和20ul RNase A,最大速度漩涡1分钟,彻底混匀。
(2)65摄氏度水浴15-20分钟,并在水浴过程中漩涡5次。
(3)加入2.2ml无水乙醇,最大速度漩涡30秒,彻底混匀。
(4)将3.5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(6)加入3ml HB Buffer,洗涤过滤柱,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(7)加入3ml DNA Wash Buffer,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(8)再次加入3ml DNA Wash Buffer,4000转离心5分钟,取出过滤柱,倒掉过滤液体,放回过滤柱。
(9)4000转离心15分钟,甩干过滤柱。
(10)将过滤柱移至新的15ml离心管,加入500ul70摄氏度的Elution Buffer,室温静置5分钟,4000转离心5分钟,收集含有DNA的过滤液。
(11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管,加入500ul70摄氏度的Elution Buffer,室温静置5分钟,4000转离心5分钟,收集含有DNA的过滤液。
(12)利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度,所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7~2.0之间,浓度不少于200ng/ul,总量不少于30μg。
实施例3:外显子捕获与测序
发明人用Agilent SureSelect人全外显子捕获试剂盒(Agilent SureSelect Human All Exon Kit)结合Solexa高通量测序技术对选取的实施例1的三个样本的外显子组序列进行了测序,具体如下:
1)将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段,随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。
2)文库经纯化后经过连接介导PCR(ligation-mediated PCR(LM-PCR))的线性扩增与SureSelect Biotiny lated RNA Library(BAITS)进行杂交富集,再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq2000,读取长度为90bp,每个样本的平均测序深度最少为50×。
3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software1.7进行处理,经过过滤去污染、使用SOAPaligner2.20#比对参考基因组Hg19(snp132)(参考Li R,Li Y,KristiansenK,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008,24(5):713-714;Li R,Yu C,Li Y,et al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967,通过参考的方式将其全文并入本文),以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAP snp(可参见:Li R,Li Y,Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res2009,19(6):1124-1132,通过参考的方式将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。Indel(insertion-deletion,插入/缺失标记)采用BWA(通过Burrows-Wheeler变换比对)(version0.5.9-r16)比对到参考基因组Hg19(snp132),然后利用GATK(Genome Analysis Toolkit)(version v1.0.4705)确定indel的类型。(可参见Li H,Durbin R.Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics2010;26(5):589-595;McKenna,A,Hanna M,Banks E,et al.The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.Genome Research2010;20(9):1297-1303)。
结果显示,在患者P1中发现有97165个单核苷酸多态性(SNPs)和7342处的插入/缺失(Indel),患者P2中发现有94399个SNPs和7193处的Indels,正常样本中发现有97952个SNPs和7438个Indels。随后通过dbSNP数据库,(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi),千人基因组数据库(www.1000genomes.org/)、HapMap数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)等公共数据库的过滤,去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。通过比对正常样本,去掉所有已知变异,同义突变以及非编码区的变异,并利用SIFT软件进行SNP功能预测,最终得到6个可能具有致病意义的基因突变(3个SNPs和3个Indels)。
实施例4:Sanger法测序验证
由于外显子组测序存在一定程度的假阳性,因此我们进一步利用Sanger测序法,对上述6个可能具有致病意义的基因突变位点进行验证。具体方法步骤如下:
1.DNA提取
分别采取两名患者、两名正常家属以及600例无血缘关系的正常对照的外周血按照实施例2的方法提取基因组DNA。
2.引物设计及PCR反应
引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3,具体见下。
引物序列:
上游引物 5'CGGGCAACGAATTCCAGGTGT3'
下游引物 5'CCGGCCCTTGATCCTGCTCG3'
反应体系:
反应条件:
3.DNA测序
将获得的PCR扩增产物用QIAquick PCR扩增试剂盒(Qiagen公司)进行纯化,然后进行DNA测序。
Sanger测序进一步验证结果显示,上述6个基因上的侯选突变位点仅有两个SNPs位点在家系中共分离,即ISG15基因的c.163C>T纯合突变(Q55*),该突变导致氨基酸序列发生p.Glin55无义突变(参见图3)。
ISG15基因是一种类泛素修饰蛋白质,可以经干扰素诱导后,高水平表达,从而在免疫系统中发挥重要作用。发明人在研究基底节钙化样本中发现,突变的ISG15基因可能与高表达的干扰素密切相关。
因此,综上所述,发明人认为本发明找到的ISG15基因上的突变是特发性基底节钙化的致病突变位点,与该类疾病的发生紧密相关。
实施例5:体外检测IBGC患者的ISG15基因的试剂盒
为了检测其它IBGC家系该基因的致病突变,可以设计该基因编码区 所有外显子和外显子与内含子交界处的引物序列。在该实施例中,试剂盒引物和扩增测序条件如实施例4。
1、试剂盒组成:
引物:如实施例4所示;
Taq酶
缓冲液
dNTP
从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)
2、使用方法:
(1)基因组DNA提取:使用美国Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。
(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP等进行PCR扩增反应;
(3)对PCR扩增产物进行纯化;
(4)对纯化的PCR产物进行BigDye反应;
(5)对BiyDye反应产物纯化;
(6)对BiyDye反应产物测序,测序序列与正常序列相比较。