ES2270424T3 - Composiciones y procedimientos relativos a genes reparadores de discordancias de adn. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN SECUENCIAS GENOMICAS DE GENES DE REPARACION DE DESAPAREAMIENTOS DEL ADN HUMANO, ASI COMO METODOS DE DETECCION DE MUTACIONES Y/O POLIMORFISMOS EN DICHOS GENES. ASIMISMO, SE DESCRIBEN METODOS DE DIAGNOSTICO DE LA SUSCEPTIBILIDAD AL CANCER DE UN SUJETO, Y METODOS DE CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE TUMORES QUE PRESENTAN DEFECTOS DE REPARACION DE DESAPAREAMIENTOS DEL ADN. EN PARTICULAR, SE PROPORCIONAN METODOS RELACIONADOS CON HOMOLOGOS HUMANOS MUTL Y GENES HMLH1 Y HPMS1.

Description

Composiciones y procedimientos relativos a genes reparadores de discordancias del ADN.

Esta invención se realizó con ayuda del gobierno con el Contrato Nº GM 32741 y el Contrato Nº HG00395/
GM50006 concedido por el Instituto Nacional de la Salud en la División General de Ciencias. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a genes de reparación de errores de apareamiento de ADN. En particular, la invención se refiere a la identificación de mutaciones y polimorfismos en genes de reparación de errores de apareamiento de ADN, a la identificación y caracterización de tumores debidos a la deficiencia en la reparación de errores de apareamiento de ADN y a la detección de susceptibilidad genética al cáncer.

Antecedentes

En los últimos años, con el desarrollo de potentes técnicas de clonación y amplificación, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en combinación con la rápida acumulación de gran cantidad de información sobre la estructura y localización de numerosos genes y marcadores humanos, se ha convertido en práctico y conveniente recoger y analizar muestras de ADN o ARN de individuos que son miembros de familias identificadas por mostrar una alta frecuencia en ciertos trastornos transmitidos genéticamente. Por ejemplo, se usan de forma rutinaria procedimientos de análisis para seleccionar genes implicados en anemia de células falciformes, fibrosis quística, síndrome del cromosoma X frágil y esclerosis múltiple. En algunos tipos de trastornos, un diagnóstico más temprano puede mejorar mucho el pronóstico a largo plazo de la persona, por ejemplo, adoptando una rutina diagnóstica agresiva y/o haciendo un cambio en el estilo de vida si es apropiado para prevenir o prepararse para un problema anticipado.

Una vez que se identifica una mutación en un gen humano en particular y se asocia a una enfermedad, desarrollar procedimientos de análisis para identificar individuos de alto riesgo puede ser relativamente simple. Por ejemplo, una vez que se conoce la estructura y la función fenotípica anómala del gen mutante, es posible diseñar cebadores de uso en PCR para obtener cantidades amplificadas del gen a partir de los individuos para su análisis. Sin embargo, el descubrimiento inicial de un gen mutante, es decir, su estructura, localización y ligamiento con un problema de salud hereditario conocido, requiere un esfuerzo experimental sustancial y estrategias de investigación creativas.

Una aproximación para descubrir el papel de un gen mutante como causante de una enfermedad empieza con estudios clínicos de los individuos de familias que muestran una elevada frecuencia de la enfermedad. En estos estudios, la localización aproximada del locus causante de la enfermedad se determina indirectamente buscando un marcador cromosómico que tienda a segregar con el locus. Una limitación importante de esta aproximación es que, aunque puede determinarse la localización genómica aproximada del gen, generalmente esto no permite el aislamiento o secuenciación real del gen. Por ejemplo, Lindblom y col.^{3} describen los resultados del análisis de los estudios de ligamiento realizados con marcadores de SSLP (polimorfismo de longitud de secuencias discretas) en individuos de una familia que se sabe muestra una elevada incidencia de cáncer de colon hereditario no polimórfico (CCHNP). Lindblom y col. encontraron un "estrecho ligamiento" entre un marcador de polimorfismo en el brazo corto del cromosoma 3 humano (3p21-23) y un locus de la enfermedad aparentemente responsable del aumento del riesgo del individuo al desarrollo de cáncer de colon. Aunque 3p21-23 es una localización bastante específica en relación con el genoma completo, representa una amplia región de ADN en relación con el tamaño probable del gen mutante. El gen mutante podría estar separado de los marcadores que identifican el locus por millones de bases. En el mejor de los casos, estos estudios de ligamiento tienen sólo una utilidad limitada con fines de análisis ya que, para predecir el riesgo personal, el análisis genético debería realizarse en varios individuos relacionados de la familia usando marcadores genéticos estrechamente ligados. A menudo es imposible obtener esta información, especialmente si los miembros afectados de la familia han muerto. Además, puede que no existan marcadores indicativos en la familia en análisis. Sin conocer la estructura del gen, no es posible recoger muestras, amplificar, secuenciar y determinar directamente si un individuo es portador del gen mutante.

Otra aproximación para descubrir un gen mutante causante de una enfermedad se inicia con el diseño y ensayo de cebadores de PCR, basados en la información conocida sobre la enfermedad, por ejemplo, teorías sobre los mecanismos patológicos, estructuras y función de proteínas relacionadas, posibles genes análogos en humanos o en otras especies, etc. El objetivo es aislar y secuenciar genes normales candidatos que se cree que, algunas veces aparecen en formas mutantes, dando lugar a un individuo propenso a la enfermedad. Esta aproximación depende en gran medida de lo que se conoce sobre la enfermedad a nivel molecular y de la capacidad del investigador para diseñar estrategias y procedimientos para encontrar genes candidatos. La asociación de una mutación en un gen candidato con una enfermedad debería demostrarse en último extremo realizando ensayos a los miembros de una familia que muestra una elevada incidencia de la enfermedad. La manera más directa y definitiva de confirmar este ligamiento en estudios de familia es usar cebadores de PCR que se diseñan para amplificar porciones del gen candidato en muestras recogidas de los miembros de la familia. A continuación, los productos génicos amplificados se secuencian y comparan con la estructura génica normal con el fin de encontrar y caracterizar mutaciones. Una mutación dada está implicada en última instancia si se demuestra que los individuos afectados la tienen, mientras que los individuos no afectados no la tienen, y que la mutación causa un cambio en la función proteica que no es simplemente un polimorfismo.

Otra manera de demostrar una probabilidad elevada de ligamiento entre una mutación génica candidata y una enfermedad es determinar la localización cromosómica del gen comparando, a continuación, la localización en el mapa génico con regiones conocidas de loci ligados a la enfermedad tal como la identificada por Lindblom y col. La coincidencia en la localización del mapa de un gen candidato con la región de un locus ligado a una enfermedad identificada previamente puede implicar claramente una asociación entre una mutación en el gen candidato y la enfermedad.

Hay otras maneras de demostrar que las mutaciones en un gen candidato pueden estar ligadas a la enfermedad. Por ejemplo, pueden introducirse formas mutantes del gen producidas artificialmente en animales. A continuación, puede compararse la incidencia de la enfermedad en animales que llevan el gen mutante con la de animales con el genotipo normal. La incidencia significativamente elevada de la enfermedad en animales con el genotipo mutante, en relación con animales con el gen de tipo natural, puede apoyar la teoría de que las mutaciones en el gen candidato algunas veces son responsables de la aparición de la enfermedad.

Un tipo de enfermedad que recientemente ha recibido mucha atención debido al descubrimiento de mutaciones génicas ligadas a la enfermedad es el cáncer de colon hereditario no polipósico (CCHNP)^{1,2}. Los miembros de familias con CCHNP también muestran una susceptibilidad aumentada a otros cánceres, incluyendo endometrial, de ovario, gástrico y de mama. Se cree que aproximadamente el 10% de los cánceres colorrectales son CCHNP. Los tumores de pacientes con CCHNP muestran un defecto genético inusual en el que parece que secuencias de ADN cortas repetidas, tales como las secuencias de dinucleótidos repetidas encontradas en el ADN cromosómico humano ("ADN microsatélite"), son inestables. Esta inestabilidad genómica de secuencia de ADN cortas repetidas, denominada a veces fenotipo "RER+", también se observa en una proporción significativa de una amplia variedad de tumores esporádicos, lo que sugiere que muchos tumores esporádicos pueden tener mutaciones adquiridas que son similares (o idénticas) a mutaciones que son hereditarias en CCHNP.

Los estudios de ligamiento genético han identificado dos loci de CCHNP que se piensa son responsables de más del 90% de los CCHNP. Los loci mapean en los cromosomas humanos 2p15-16 (2p21) y 3p21-23. Estudios posteriores han identificado el gen humano de reparación de errores de apareamiento de ADN, hMSH2, como el gen del cromosoma 2p21, en el que las mutaciones son responsables de una fracción significativa de cánceres CCHNP^{1,2,12}. hMSH2 es uno de los diversos genes cuya función normal es identificar y corregir desapareamientos de ADN incluyendo aquellos que siguen a cada ronda de replicación cromosómica.

La ruta de reparación de errores de apareamiento mejor definida es la ruta de MutHLS de E. coli que promueve una reacción de reparación de escisión de parches largos (aproximadamente 3 Kb) que dependen de los productos génicos mutH, mutL, mutS y mutU (uvrD). La ruta de MutHLS parece ser la ruta de reparación de errores de apareamiento más activa en E. coli y se sabe que aumenta la fidelidad de replicación del ADN y actúa en intermedios de recombinación que contienen bases desapareadas. El sistema se ha reconstituido in vitro y requiere de las proteínas mutH, mutL, mutS y uvrD (helicasa II) junto con la holoenzima ADN polimerasa III, ADN ligasa, proteína de unión a ADN de hebra sencilla (SSB) y una de las exonucleasas de ADN de hebra sencilla, Exo I, Exo VII o RecJ. hMSH2 es homólogo al gen bacteriano mutS. Una ruta similar en levadura incluye el gen MSH2 de levadura y dos genes similares a mutL denominados como PMS1 y MLH1.

Con el conocimiento de que las mutaciones en un gen humano de tipo mutS (hMSH2) a veces causan cáncer y el descubrimiento de que los tumores CCHNP muestran inestabilidad en el ADN microsatélite, se ha intensificado el interés en otros genes de reparación de errores de apareamiento de ADN y de productos génicos y sus posibles funciones en el CCHNP y en otros cánceres. Se estima que 1 de cada 200 individuos llevan una mutación en el gen hMSH2 o en otros genes relacionados que codifican otras proteínas de la misma ruta de reparación de errores de apareamiento de ADN.

Un objetivo importante de nuestro trabajo ha sido identificar genes humanos que son útiles para analizar e identificar individuos que tienen un riesgo elevado de desarrollar cáncer. Otros objetivos son: determinar las secuencias de las estructuras de los exones e intrones flanqueantes en estos genes; usar la información estructural para diseñar procedimientos de análisis con el fin de encontrar y caracterizar mutaciones que den lugar a una ausencia o defecto de un producto génico que confiere susceptibilidad al cáncer y distinguir estas mutaciones de variaciones polimórficas "inofensivas". Otro objetivo es usar la información estructural relacionada con la secuencia del exón y del intrón flanqueante de un gen ligado al cáncer, diagnosticar tipos de tumores y prescribir la terapia apropiada. Otro objetivo es usar la información estructural relativa a un gen ligado al cáncer para identificar otros genes humanos candidatos relacionados para su estudio.

Resumen de la invención

Sobre la base de nuestro conocimiento sobre los mecanismos de reparación de errores de apareamiento de ADN en bacterias y levaduras que incluye la conservación de genes de reparación de errores de apareamiento, concluimos que deberían existir homólogos de reparación de errores de apareamiento de ADN humano y que mutaciones en estos homólogos que afecten a la función proteica, probablemente causarían inestabilidad genética, conduciendo posiblemente a un aumento en el riesgo de desarrollar ciertas forma de cáncer humano.

Hemos aislado y secuenciado dos genes humanos, hPMS1 y hMLH1 que codifican cada uno de ellos una proteína implicada en la reparación de errores de apareamiento de ADN. hPMS1 y hMLH1 son homólogos a los genes mutL encontrados en E. coli. Nuestros estudios apoyan claramente una asociación entre mutaciones en genes de reparación de errores de apareamiento de ADN y la susceptibilidad a CCHNP. De este modo, la información de la secuencia de genes de reparación de errores de apareamiento de ADN, a saber, estructuras de ADNc y genómicas relacionadas con hMLH1 y hPMS1, hace posible varios procedimientos útiles relacionados con la determinación del riesgo y el diagnóstico del cáncer. Para estos procedimientos son útiles un gran número de estructuras nucleotídicas y
proteicas.

Hemos mapeado la localización de hMLH1 en el cromosoma humano 3p21-23. Esta es una región del genoma humano que, sobre la base de estudios familiares, porta un locus que predispone a los individuos al CCHNP. Adicionalmente, hemos descubierto una mutación en una región conservada del ADNc de hMLH1 en individuos afectados de CCHNP de una familia sueca. La mutación no se encuentra en individuos no afectados de la misma familia, ni tampoco es un simple polimorfismo. También hemos descubierto que una mutación homóloga en levadura da lugar a una proteína reparadora de errores de apareamiento de ADN defectuosa. También hemos descubierto una mutación en fase en hMLH1 de individuos afectados de una familia inglesa. Nuestro descubrimiento de mutaciones en hMLH1 ligadas al cáncer, combinado con las posiciones en el mapa de los genes que coincide con un locus ligado a CCHNP identificado previamente, además del probable papel del gen hMLH1 en evitar mutaciones, hace del gen hMLH1 un candidato principal para ser la base de una forma de cáncer humano hereditario común y un candidato principal para analizar e identificar individuos que tienen un riesgo elevado de desarrollar cáncer.

hMLH1 tiene 19 exones y 18 intrones. Hemos determinado la localización de cada uno de los 18 intrones en relación con el ADNc de hMLH1. También hemos determinado la estructura de todas las regiones del límite intrón/exón de hMLH1. El conocimiento de las estructuras del límite intrón/exón hace posible regímenes de análisis eficaces para localizar mutaciones que afectan negativamente a la estructura y a la función de los productos génicos. Además, hemos diseñado grupos completos de pares de cebadores oligonucleotídicos que pueden usarse en PCR para amplificar exones completos individuales junto con estructuras que rodean el límite del intrón.

Hemos mapeado la localización de hPMS1 en el cromosoma 7 humano. Otros estudios posteriores^{39} han confirmado nuestra predicción de que las mutaciones en este gen están ligadas al CCHNP.

El uso más inmediato de la presente invención será en ensayos de selección en individuos humanos miembros de familias que muestran una frecuencia inusualmente elevada de cánceres de desarrollo temprano, por ejemplo, CCHNP. Por lo tanto, un aspecto de la invención comprende un procedimiento de diagnóstico de la susceptibilidad al cáncer de colon en un sujeto detectando una mutación en un ácido nucleico de hMLH1 como se muestra en la reivindicación 1 o un ácido nucleico de hPMS1 como se muestra en la reivindicación 3 en un tejido del sujeto, donde la mutación es indicativa de la susceptibilidad del sujeto al cáncer de colon.

El procedimiento de diagnóstico preferiblemente comprende las etapas de: 1) amplificar un segmento del gen o producto génico de reparación de errores de apareamiento de un ácido nucleico aislado; 2) comparar el segmento amplificado con un segmento análogo de un alelo de tipo natural del gen o producto génico de reparación de errores de apareamiento; y 3) detectar una diferencia entre el segmento amplificado y el segmento análogo, siendo indicativa la diferencia de una mutación en el gen o producto génico de reparación de errores de apareamiento que confiere susceptibilidad al cáncer de colon.

Un procedimiento puede comprender el determinar si la diferencia entre el segmento amplificado y el segmento análogo de tipo natural causa un fenotipo afectado, es decir, la alteración de la secuencia afecta a la capacidad del individuo para reparar los errores de apareamiento de ADN.

El procedimiento de diagnóstico puede incluir las etapas de: 1) transcribir de forma inversa toda o una porción de una copia de ARN de un gen de reparación de errores de apareamiento de ADN y 2) amplificar un segmento del ADN producido por transcripción inversa. Una etapa de amplificación puede comprender: seleccionar un par de cebadores oligonucleotídicos capaces de hibridar con hebras opuestas del gen de reparación de errores de apareamiento, en una orientación opuesta, y realizar una reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores oligonucleotídicos de modo que se amplifique el ácido nucleico de la cadena de reparación de errores de apareamiento que queda entre los cebadores para dar lugar al segmento amplificado.

El gen de reparación de errores de apareamiento de ADN es hMLH1 o hPMS1. El segmento de ADN se corresponde con una porción única de una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 6-24. Los cebadores oligonucleotídicos de la "primera etapa" seleccionados entre el grupo constituido por las ID SEC Nº 44-82 se usan en PCR para amplificar el segmento de ADN. Pueden usarse cebadores anidados de la "segunda etapa" (ID SEC Nº 83-122) con los cebadores de la primera etapa para permitir una amplificación y conservación del ADN molde más específicas.

Un procedimiento para identificar y clasificar un tumor debido a la deficiencia en la reparación de errores de apareamiento de ADN puede comprender el detectar en el tumor una mutación en un gen o producto génico de reparación de errores de apareamiento, preferiblemente un homólogo de mutL (hMLH1 o hPMS1), siendo la mutación indicativa de un defecto en el sistema de reparación de errores de apareamiento del tumor.

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Una estructura nucleotídica o proteica aislada puede incluir un segmento que secuencialmente se corresponde con una porción única de un gen o producto génico humano homólogo a mutL, derivado preferiblemente de hMLH1 o hPMS1.

Pueden usarse cebadores oligonucleotídicos juntos en una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar específicamente un segmento único de un gen humano homólogo a mutL, preferiblemente hMLH1 o hPMS1.

Una sonda puede incluir una secuencia nucleotídica capaz de unirse específicamente mediante apareamiento de Watson/Crick a bases complementarias en una porción de un gen humano homólogo a mutL y un resto marcado unido a la secuencia, en el que el resto marcado tiene una propiedad seleccionada entre el grupo constituido por fluorescencia, radiactividad y quimioluminiscencia.

También hemos aislado y secuenciado los genes MLH1 (mMLH1) y PMS1 (mPMS1) de ratón. Hemos usado nuestro conocimiento sobre genes reparadores de errores de apareamiento del ratón para construir modelos animales para el estudio del cáncer. Los modelos serán útiles para identificar oncogenes adicionales y para estudiar efectos medioambientales sobre la mutagénesis.

Hemos producidos anticuerpos policlonales dirigidos frente a una porción de la proteína codificada por el ADNc de mPMS1. Los anticuerpos también reaccionan con la proteína hPMS1 y son útiles para detectar la presencia de la proteína codificada por un gen hPMS1 normal. También hemos producido anticuerpos monoclonales dirigidos frente a hMLH1 y hPMS1.

Además del uso diagnóstico y terapéutico de los genes, hemos usado nuestro conocimiento de hMLH1 y hPMS1 para buscar otros genes de función relacionada que son candidatos para jugar un papel en ciertas formas de cáncer humano.

Descripción de las Figuras

La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra una visión general de la secuencia de etapas experimentales que usamos para aislar, caracterizar y usar los genes PMS1 y MLH1 humanos y de ratón.

La Figura 2 es un alineamiento de secuencias de proteínas homólogas a mutL (ID SEC Nº 1-3) mostrando dos regiones muy conservadas (subrayadas) que usamos para crear oligonucleótidos degenerados para PCR para el aislamiento adicional de homólogos a mutL.

La Figura 3 muestra la secuencia completa de nucleótidos del ADNc (SEC ID Nº 4) del gen MLH1 humano, y la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha (ID SEC Nº 5) de la proteína MLH1 humana. Las secuencias de ADN subrayadas son las regiones del ADNc que se corresponden con los cebadores degenerados para PCR que usamos originalmente para amplificar una porción del gen MLH1 (nucleótidos 118-135 y 343-359).

La Figura 4A muestra las secuencias de nucleótidos de los 19 exones que se corresponden en conjunto con la estructura completa del ADNc de hMLH1. Los exones están flanqueados por estructuras limite con los intrones. Los sitios de los cebadores están subrayados. Los exones con sus estructuras que flanquean a los intrones se corresponden con las ID SEC Nº 6-24. Los exones mostrados con letras minúsculas sin subrayar se corresponden con las ID SEC Nº 25-43.

La Figura 4B muestra las secuencias nucleotídicas de los pares de cebadores que se han usado en PCR para amplificar los exones individuales. Los cebadores de amplificación de la "segunda etapa" (SEC ID Nº 83-122) son cebadores "anidados" que se usan para amplificar exones diana a partir de productos de amplificación obtenidos con los correspondientes cebadores de amplificación de la "primera etapa" (ID SEC Nº 44-82). Las estructuras de la Figura 4B se corresponden con las estructuras de las Tablas 2 y 3.

La Figura 5 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos predichas de las proteínas MLH1 de humano y de levadura (ID SEC Nº 5 y 123, respectivamente). Las identidades de aminoácidos se indican mediante recuadros y los huecos se indican mediante guiones.

La Figura 6 es un árbol filogenético de las proteínas relacionadas con MutL.

La Figura 7 es una fotografía con dos paneles. El primer panel (A) es una extensión en metafase que muestra la hibridación del gen hMLH1 del cromosoma 3. El segundo panel (B) es una composición del cromosoma 3 a partir de múltiples extensiones en metafase alineadas con un ideograma del cromosoma 3 humano. La región de hibridación está indicada en el ideograma con una barra vertical.

La Figura 8 es una comparación de los cromatogramas de secuencia de individuos afectados y no afectados que muestra la identificación de una mutación de transición de C a T que produce una sustitución de aminoácido no conservadora en la posición 44 de la proteína hMLH1.

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La Figura 9 es un alineamiento de la secuencia de aminoácidos (ID SEC Nº 124-131) de la región muy conservada de la familia de proteínas MLH que rodea al sitio de la sustitución de aminoácido predicha. En negrita se indica la posición de la sustitución del aminoácido serina por fenilalanina predicha en los individuos afectados. También se resaltan los restos de serina o alanina conservados en esta posición en las proteínas similares a MutL. Los puntos negros indican las posiciones de los aminoácidos más conservados. En la proteína MLH1, la línea punteada indica que no se ha obtenido la secuencia. Las secuencias se han alineados como se describe a continuación en referencia al árbol filogenético de la Figura 6.

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos completa de hPMS1 (ID SEC Nº 132).

La Figura 11 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos predichas de las proteínas PMS1 de humano y de levadura (ID SEC Nº 133 y 134, respectivamente). Las identidades de aminoácidos se indican mediante recuadros y los huecos se indican mediante guiones.

La Figura 12 es una secuencia de nucleótidos parcial del ADNc de MLH1 de ratón (mMLH1) (ID SEC Nº 135).

La Figura 13 es una comparación de la secuencia de aminoácidos predicha de las proteínas mMLH1 y hMLH1 (ID SEC Nº 136 y 5, respectivamente).

La Figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del PMS1 de ratón (mPMS1) (ID SEC Nº 137).

La Figura 15 es una comparación de las secuencias de aminoácidos predichas de las proteínas mPMS1 y hPMS1 (ID SEC Nº 138 y 133, respectivamente).

Definiciones

Gen - "Gen" significa una secuencia de nucleótidos que contiene una secuencia codificadora completa. Generalmente, "genes" también incluye secuencias de nucleótidos encontradas antes del extremo 5' (por ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras, etc.) o después del extremo 3' (por ejemplo, señales de parada de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) de la secuencia codificadora que afectan a la expresión del polipéptido codificado.

Producto génico - Un "producto génico" es una copia de ADN o ARN (ARNm) de una porción de un gen o una secuencia de aminoácidos correspondiente traducida a partir del ARNm.

Tipo natural - La expresión "tipo natural", cuando se aplica a ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención, significa una versión de un ácido nucleico o proteína que funciona de forma que no puede distinguirse de una versión normal natural de ese ácido nucleico o proteína (es decir, un ácido nucleico o proteína con actividad de tipo natural). Por ejemplo, un alelo de "tipo natural" de un gen de reparación de errores de apareamiento es capaz de reemplazar funcionalmente una copia endógena normal del mismo gen en una célula hospedadora sin alteración detectable de la reparación de errores de apareamiento en esta célula. Las diferentes versiones de tipo natural del mismo ácido nucleico o proteína pueden o no diferir estructuralmente entre sí.

De tipo no natural - La expresión "de tipo no natural", cuando se aplica a ácidos nucleicos y proteínas, significa una versión de un ácido nucleico o proteína que funciona de forma que puede distinguirse de una versión normal natural de este ácido nucleico o proteína. Los alelos de tipo no natural de un ácido nucleico de la invención pueden diferir estructuralmente de los alelos de tipo natural del mismo ácido nucleico en cualquiera de una diversidad de formas, incluyendo, pero sin limitaciones, diferencias en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado y/o diferencias en los niveles de expresión de un producto polipeptídico transcrito de un nucleótido codificador.

Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de un alelo de tipo no natural de un ácido nucleico de la invención puede diferir de la de un alelo de tipo natural en, por ejemplo, la adición, deleción, sustitución y/o reordenamiento de nucleótidos. De forma similar, la secuencia de aminoácidos de una proteína de reparación de errores de apareamiento de tipo no natural puede diferir de la de una proteína de reparación de errores de apareamiento de tipo natural en, por ejemplo, la adición, sustitución y/o reordenamiento de aminoácidos.

Los ácidos nucleicos o proteínas de tipo no natural en particular que, cuando se introducen en una célula hospedadora normal, interfieren con la ruta de reparación de errores de apareamiento endógeno, se denominan ácidos nucleicos o proteínas "dominantes negativos".

Homólogo - El término "homólogo" se refiere a ácidos nucleicos o polipéptidos que están muy relacionados a nivel de secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Los ácidos nucleicos o polipéptidos que son homólogos entre sí se denominan "homólogos".

El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre dos secuencias. Dos secuencias de nucleótidos se consideran homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos aproximadamente el 50-60% idénticos, preferiblemente aproximadamente el 70% idénticos, en al menos una extensión de 20 aminoácidos. Preferiblemente, las secuencias homólogas de nucleótidos también se caracterizan por la capacidad para codificar una extensión de al menos 4-5 aminoácidos especificados exclusivamente. Debe considerarse tanto la identidad como el espaciamiento aproximado de estos ácidos nucleicos entre sí para que las secuencias nucleotídicas se consideren homólogas. Para secuencias nucleotídicas de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad para codificar una extensión de al menos 4-5 aminoácidos exclusivamente especificados.

Antes del extremo 5'/después del extremo 3' - Las expresiones "antes del extremo 5' " y "después del extremo 3' " son expresiones conocidas en la técnica que se refieren a la posición de un elemento de la secuencia de nucleótidos. "Antes del extremo 5'" significa un elemento que están más hacia el extremo 5' que el elemento de referencia. "Después del extremo 3'" significa un elemento que están más hacia el extremo 3' que un elemento de referencia.

Intrón/exón - Los términos "exón" e "intrón" son términos conocidos en la técnica que se refieren a diversas porciones de secuencias genómicas del gen. Los "exones" son aquellas porciones de una secuencia genómica del gen que codifica una proteína. Los "intrones" son secuencias de nucleótidos que se encuentran entre los exones en las secuencias genómicas del gen.

Afectado - El término "afectado", según se usa en este documento, se refiere a aquellos miembros de una familia que han desarrollado un cáncer característico (por ejemplo, cáncer de colon en una genealogía de CCHNP) y/o se ha predicho, sobre la base de estudios genéticos, por ejemplo, que portan una mutación hereditaria que confiere susceptibilidad al cáncer.

Único - Un segmento, fragmento o porción "único" de un gen o proteína significa una porción de un gen o proteína que es secuencialmente diferente de cualquier otro segmento génico o proteico en el genoma de un individuo. A nivel práctico, un segmento o fragmento único de un gen normalmente será un nucleótido de al menos aproximadamente 13 bases de longitud y será suficientemente diferente de otros segmentos génicos de modo que puedan diseñarse los cebadores oligonucleotídicos y usarse para amplificar selectiva y específicamente el segmento. Un segmento único de una proteína, típicamente es una secuencia de aminoácidos que puede traducirse a partir de un segmento único de un gen.

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Las publicaciones siguientes se refieren en el texto de la solicitud por su número. Cada publicación se incorpora a este documento como referencia.

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Descripción de la invención

Hemos descubierto genes de mamíferos que están implicados en la reparación de errores de apareamiento de ADN. Uno de los genes, hPMS1, codifica una proteína que es homologa a la proteína de reparación de errores de apareamiento de ADN de levadura, PMS1. Hemos mapeado las localizaciones de hPMS1 en el cromosoma 7 humano y de PMS1 de ratón en la banda G del cromosoma 5 de ratón. Otro gen, hMLH1 (del ingles, MutL Homologous; homólogo de MutL) codifica una proteína que es homóloga a la proteína de reparación de errores de apareamiento del ADN de levadura, MLH1. Hemos mapeado las localizaciones de hMLH1 en el cromosoma 3p21.3-23 humano y en la banda E del cromosoma 9 de ratón.

Algunos estudios^{1,2} han demostrado la implicación de un homólogo del gen homólogo de reparación de errores de apareamiento de ADN humano hMSH2 en el cromosoma 2p en CCHNP. Sobre la base de los datos de ligamiento, se ha asignado un segundo locus de CCHNP al cromosoma 3p21-23^{3}. El examen del ADN tumoral de familias con ligamiento al cromosoma 3 reveló una inestabilidad de dinucleótidos repetidos similar a la observada en otros familiares con CCHNP^{6} y con varios tipos de tumores esporádicos^{7-10}. Puesto que la inestabilidad de dinucleótidos repetidos es característica de un defecto en la reparación de errores de apareamiento del ADN^{5,11,12}, dedujimos que el CCHNP ligado al cromosoma 3p21-23 podría ser el resultado de una mutación de un segundo gen de reparación de errores de apareamiento de ADN.

La reparación de error de apareamiento de ADN en Escherichia coli requiere varios genes que incluyen mutS, mutL y mutH; los defectos en uno cualquiera de estos dará lugar a tasas elevadas de mutación espontánea^{13}. El análisis genético de la levadura Saccharomyces cerevisiae ha identificado tres genes de reparación de errores de apareamiento de ADN: un homólogo de mutS, MsH2^{14} y dos homólogos de mutL, PMS1^{16} y MLH1^{4}. Cada uno de estos tres genes juega un papel indispensable en la fidelidad de replicación del ADN, incluyendo la estabilización de las repeticiones de dinucleótidos^{5}.

Creemos que hMLH1 es el gen del CCHNP ligado previamente al cromosoma 3p sobre la base de la similitud del producto génico de hMLH1 con la proteína de reparación de errores de apareamiento de ADN de levaduras, MLH1^{4}, la localización coincidente del gen hMLH1 y del locus de CCHNP en el cromosoma 3 y las mutaciones sin sentido de hMLH1 que hemos encontrado en individuos afectado de las familias con CCHNP ligado al cromosoma 3.

Nuestro conocimiento sobre las estructuras de los genes MLH1 y PMS1 humanos y de ratón tiene muchos usos importantes. La información de la secuencia génica puede usarse para analizar el riesgo de cáncer de los individuos. El conocimiento de las estructuras génicas hace posible diseñar fácilmente cebadores para PCR que pueden usarse para amplificar selectivamente porciones de los genes hMLH1 y hPMS1 para su posterior comparación con la secuencia normal y el análisis del riesgo de cáncer. Este tipo de ensayo también hace posible buscar y caracterizar mutaciones ligadas al cáncer de hMLH1 y hPMS1 con el propósito de dirigir finalmente los esfuerzos de análisis del cáncer hacia loci génicos específicos. La caracterización específica de mutaciones ligadas al cáncer en hMLH1 y hPMS1 hace posible la producción de otras herramientas diagnósticas valiosas, tales como sondas específicas de alelos que pueden usarse en ensayos de análisis para determinar la presencia o ausencia de mutaciones génicas específicas.

Adicionalmente, la información de la secuencia génica de hMLH1 y/o hPMS1 puede usarse, por ejemplo, en un sistema de doble híbrido, para buscar otros genes de función relacionada que son candidatos a estar implicados en el cáncer.

Las estructuras génicas de hMLH1 y hPMS1 son útiles para hacer proteínas que se usan para obtener anticuerpos dirigidos frente a porciones específicas o a las proteínas hMLH1 y hPMS1 completas. A continuación, estos anticuerpos pueden usarse para aislar la proteína correspondiente y proteínas posiblemente relacionados con fines de investigación y diagnóstico.

Las secuencias génicas MLH1 y PMS1 de ratón son útiles para producir ratones con mutaciones en el gen respectivo. El ratón mutante es útil para estudiar la función del gen, especialmente su relación con el cáncer.

Procedimientos para aislar y caracterizar los genes MLH1 y PMS1 de mamíferos

Hemos aislado y caracterizado cuatros genes de mamíferos, es decir, MLH1 humano (hMLH1), PMS1 humano (hPMS1), MLH1 de ratón (mPMS1) y PMS1 de ratón (mPMS1). Debido a la similitud estructural entre estos genes, los procedimientos que hemos empleado para aislarlos y caracterizarlos son en general los mismos. La Figura 1 muestra en términos generales, la aproximación experimental que hemos usado para aislar y caracterizar los cuatro genes. La siguiente descripción se refiere al procedimiento paso a paso que se muestra en la Figura 1.

Etapa 1

Diseño de grupos de oligonucleótidos degenerados para PCR

Publicaciones anteriores indicaban que porciones de las tres proteínas similares a MutL, dos de bacterias, MutL y HexB, y una de levadura, PMS1, estaban muy conservadas^{16,18,19}. Tras la inspección de las secuencias de aminoácidos de las proteínas HexB, MutL y PMS1, como se muestra en la Figura 2, diseñamos grupos de pares de oligonucleótidos degenerados que se correspondían con dos regiones muy conservadas, KELVEN y GFRGEA, de las proteínas similares a MutL. Las secuencias (ID SEC Nº 139 y 140, respectivamente) de los oligonucleótidos degenerados que usamos para aislar los cuatro genes son:

5'-CTTGATTCTAGAGC(T/C)TCNCCNC(T/G)(A/G)AANCC-3'

\hskip0.3cm

y

5'-AGGTCGGAGCTCAA(A/G)GA(A/G)(T/C)TNGTNGANAA-3'.

Las secuencias subrayadas en los cebadores son los sitios para las endonucleasas de restricción XbaI y SacI, respectivamente. Se introdujeron para facilitar la clonación de los fragmentos amplificados por PCR. En el diseño de los oligonucleótidos, tuvimos en cuenta el hecho de que un determinado aminoácido puede estar codificado por más de un triplete de ADN (codón). La degeneración en estas secuencias se indica mediante múltiples nucleótidos entre paréntesis o mediante una N, para la presencia de cualquier base en esta posición.

Etapa 2

Transcripción inversa y PCR de ARNm seleccionados por poliA+ aislados de células humanas

Hemos aislado el ARN mensajero (enriquecido en poli A+) a partir de células humanas cultivadas, sintetizado ADNc de doble hebra a partir del ARNm y realizado una PCR con los oligonucleótidos degenerados^{4}. Después de probar varias condiciones diferentes de PCR, por ejemplo, ajustando la temperatura de hibridación, logramos amplificar un ADN del tamaño predicho (\sim 210 pb) de una proteína similar a MutL.

Etapa 3

Clonación y secuenciación de fragmentos generados por PCR; identificación de fragmentos de dos genes que representan a PMS1 y MLH1 humanos

Aislamos el material amplificado por PCR (\sim 210 pb) a partir de un gel de agarosa y clonado este material en un plásmido (pUC19). Determinamos la secuencia de ADN de varios clones diferentes. La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de los dos clones mostraba gran similitud con otras proteínas similares a MutL conocidas^{4,16,18,19}. La secuencia de aminoácidos predicha de uno de los clones era más similar a la proteína PMS1 de levadura. Por tanto, la denominamos hPMS1, de PMS1 humano. Se encontró que el segundo clon codificaba un polipéptido que se parecía más a la proteína MLH1 de levadura y se denominó, hMLH1, de MLH1 humana.

Etapa 4

Aislamiento de clones de ADNc completos de PMS1 y MLH1 humanos y de ratón usando los fragmentos de PCR como sondas

Usamos los fragmentos generados por PCR de 210 pb de los ADNc de hMLH1 y hPMS1, como sondas para analizar tanto bibliotecas de ADNc humanas como de ratón (de Stratagene o como se describe en la referencia 30). Aislamos varios ADNc que se correspondían con estos dos genes. Muchos de los ADNc estaban truncados en el extremo 5'. Cuando fue necesario, usamos las técnicas de PCR^{31} para obtener el extremo 5' del gen además de análisis adicionales de las bibliotecas de ADNc. Se usaron secuencias compuestas de ADNc completas para predecir la secuencia de aminoácidos de las proteínas MLH1 y PMS1 humana o de ratón.

Etapa 5

Aislamiento de los clones genómicos de PMS1 y MLH1 humanos y de ratón

La información de la estructura genómica y del ADNc de los genes MLH1 y PMS1 humanos es necesaria para analizar a fondo las mutaciones en familias propensas al cáncer. Hemos usado secuencias del ADNc humano como sondas para aislar las secuencias genómicas de PMS1 y MLH1 humanos. Hemos aislados cuatro cósmidos y dos clones P1 de hPMS1, que probablemente en conjunto contienen la mayoría, sino toda, la secuencia del ADNc (exón). Hemos aislados cuatros clones de hMLH1 de fagos \lambda solapantes que contienen las secuencias genómicas del extremo 5' de MLH1 y cuatro clones P1 (dos clones de longitud completa y dos que incluyen el extremo 5' codificador más porciones de la región promotora) del clon P1. El análisis por PCR usando pares de oligonucleótidos específicos para los extremos 5' y 3' del ADNc de hMLH1, indican claramente que el clon P1 contiene la información completa del ADNc de hMLH1. De forma similar, se han aislados los clones genómicos de genes PMS1 y MLH1 de ratón y se han caracterizado parcialmente (descrito en la Etapa 8).

Etapa 6

Mapeo posicional cromosómico de los genes PMS1 y MLH1 humanos y de ratón mediante hibridación in situ con fluorescencia

Usamos clones genómicos aislados de PMS1 y MLH1 humanos y de ratón para la localización cromosómica mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH)^{20,21}. Mapeamos el gen MLH1 humano en el cromosoma 3p21.3-23, mostrado en la Figura 7 como se discute con más detalle a continuación. Mapeamos el gen MLH1 de ratón en la banda E del cromosoma 9, una región de sintenia entre ratón y humano^{22}. Además de las técnicas de FISH, usamos PCR con un par de oligonucleótidos específicos de hMLH1 para analizar el ADN de un panel de mapeo de una célula somática híbrida roedor/humano (Instituto Coriell de Investigación Médica, Camden, N.J.). Nuestros resultados de PCR con el panel indican claramente que hMLH1 mapea en el cromosoma 3. La posición 3p21.3-23 de hMLH1 coincide con una región conocida porque es portadora de un segundo locus para el CCHNP sobre la base de los datos de ligamiento.

Como se muestra en la Figura 12, mapeamos el gen hPMS1 en el brazo largo (q) del cromosoma 7 (en 7q11 o en 7q22) y el PMS1 de ratón en la banda G del cromosoma 5, dos regiones de sintenia entre humano y ratón^{22}. Realizamos una PCR usando oligonucleótidos específicos para hPMS1 en el ADN de un panel de células roedor/humano. De acuerdo con los datos de FISH, se confirmó que la localización de hPMS1 estaba en el cromosoma 7. Estas observaciones nos aseguraron que nuestra posición en el mapa humano de hPMS1 en el cromosoma 7 es correcta. La localización física de hPMS1 es útil con el objetivo de identificar familias que potencialmente pueden tener una mutación ligada al cáncer en hPMS1.

Etapa 7

Uso de las secuencias genómicas y de ADNc para identificar mutaciones en los genes hPMS1 y hMLH1 en familias con CCHNP

Hemos analizado muestras recogidas de individuos de familias con CCHNP con el fin de identificar mutaciones en el gen hPMS1 o en hMLH1. Nuestra estrategia es diseñar cebadores para PCR sobre la base de nuestro conocimiento de las estructuras de los genes, para obtener segmentos exón/intrón que podemos comparan con las secuencias normales conocidas. Nos referimos a esta estrategia como un "análisis de exones".

Usando la información de la secuencia del ADNc hemos diseñado y seguimos diseñando oligonucleótidos específicos de hPMS1 y hMLH1 para trazar los limites exón/intrón dentro de las secuencias genómicas. Los oligonucleótidos específicos de hPMS1 y hMLH1 se usaron como sonda para identificar los clones genómicos con exones que contienen esta secuencia. Como cebadores para secuenciar el ADN de los clones genómicos se usaron oligonucleótidos que hibridaban. Las uniones exón-intrón se identificaron comparando las secuencias genómicas con las del ADNc.

La amplificación de exones específicos a partir de ADN genómico por PCR y la secuenciación de los productos es un procedimiento para analizar las mutaciones en familias con CCHNP^{1,2}. Hemos identificado clones genómicos que contenían información del ADNc de hMLH1 y hemos determinado las estructuras de todas las regiones límite entre intrón/exón que flanquean los 19 exones de hMLH1.

Hemos usado la aproximación de análisis de exones para examinar el gen MLH1 de individuos de familias con CCHNP que mostraban ligamiento con el cromosoma 3^{3}. Como se describirá con más detalle a continuación, hemos identificado una mutación en el gen MLH1 de una de estas familias, que consistía en una sustitución de C por T. Predijimos que la mutación de C por T causa una sustitución de una serina por fenilalanina en una región muy conservada de la proteína. Estamos identificando continuamente familias con CCHNP a partir de las cuales podemos obtener muestras para encontrar mutaciones adicionales en los genes hMLH1 y hPMS1.

También hemos usado una segunda aproximación para identificar mutaciones en hPMS1 y en hMLH1. La aproximación es diseñar cebadores oligonucleotídicos específicos de hPMS1 o de hMLH1 para producir una primera hebra de ADNc mediante transcripción inversa a partir de ARN. La PCR usando cebadores específicos del gen nos permitirá amplificar regiones específicas de estos genes. La secuenciación del ADN de los fragmentos amplificados nos permitirá detectar mutaciones.

Etapa 8

Diseño de vectores dirigidos para interrumpir los genes PMS1 y MLH1 de ratón en células ES; estudio de ratones deficientes para la reparación de errores de apareamiento

Construimos un vector génico dirigido sobre la base de nuestro conocimiento de la estructura del ADN genómico de PMS1 de ratón. Usamos el vector para interrumpir el gen PMS1 en células madre embrionarias de ratón^{36}. Las células se inyectaron en blastocistos de ratón que se desarrollaron como ratones quiméricos (mezclas) para las células que llevan la mutación en PMS1.

Los animales quiméricos se usarán para criar ratones heterocigotos y homocigotos par la mutación en PMS1. Estos ratones serán útiles para estudiar el papel del gen PMS1 en el organismo completo.

MLH1 humano

La descripción siguiente es una explicación más detallada de nuestro trabajo experimental en relación con hMLH1. Como se mencionó anteriormente, para clonar los genes MLH de mamífero, usamos técnicas de PCR como las usadas para identificar los genes MSH1, MSH2 y MLH1 de levadura y el gen MSH2 humano^{1, 2, 4, 14}. Como molde en la PCR, usamos un ADNc de doble hebra sintetizado a partir de ARN enriquecido en poli (A+) preparado a partir de cultivos primarios de fibroblastos humanos. Los oligonucleótidos degenerados se dirigieron hacia las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal KELVEN y GFRGEA (véase la Figura 3), dos de las regiones más conservadas de la familia de proteínas MutL previamente descritas en bacterias y levaduras^{16,18,19}. Se identificaron dos productos de PCR del tamaño predicho, se clonaron y se demostró que codificaban una secuencia de aminoácidos predicha con homología con las proteínas similares a MutL. Estos dos fragmentos generados mediante PCR se usaron para aislar clones humanos de ADNc y de ADN genómico.

Los cebadores oligonucleotídicos que usamos para amplificar secuencias humanas relacionadas con MutL fueron 5'-CTTGATTCTAGAGC(T/C)TCNCCNC(T/G)(A/G)AANCC-3' (ID SEC Nº 139) y 5'-AGGTCGGAGCTCAA(A/G)GA(A/G)(T/C)TNGTNGANAA-3' (ID SEC Nº 140). La PCR se realizó en reacciones de 50 \mul que contenían ADNc molde, 1,0 \muM de cada cebador, 5 UI de Taq polimerasa (C), KCl 50 mM, tampón Tris 10 mM, pH 7,5 y MgCl 1,5 mM. La PCR se realizó durante 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 43ºC y 1,5 minutos a 62ºC. Los fragmentos del tamaño esperado, aproximadamente 212 pb, se clonaron en pUC19 y se secuenciaron. Los productos de PCR de MLH1 clonados se marcaron con un kit de marcaje con cebador aleatorio (RadPrime, Gibco BRL) y se usó para incubar bibliotecas de ADNc y cósmidos genómicos humanos mediante procedimientos convencionales. La secuenciación del ADN de los plásmidos de ADN de doble hebra se realizó como se describe previamente^{1}.

La secuencia de nucleótidos del ADNc de hMLH1, como se muestra en la Figura 3, codifica una fase de lectura abierta de 2.268 pb. También se muestra en la Figura 3 la secuencia de la proteína predicha codificada por el ADNc de hMLH1. Las secuencias de ADN subrayadas son las regiones del ADNc que se corresponden con los cebadores para PCR degenerados que originalmente se usaron para amplificar una porción del gen MLH1 (nucleótidos 118-135 y 343-359).

La Figura 4A muestra 19 secuencias de nucleótidos que se corresponden con porciones de hMLH1. Cada secuencia incluye uno de los 19 exones, en su totalidad, rodeado de secuencias intrón flanqueantes. Se subrayan los cebadores de PCR diana citados. A continuación se explican más detalles relacionados con la derivación y usos de las secuencias mostradas en la Figura 4.

Como se muestra en la Figura 5, la proteína hMLH1 está compuesta de 756 aminoácidos y comparte el 41% de identidad con el producto proteico del gen de reparación de errores de apareamiento del ADN de levaduras, MLH1^{4}. Las regiones de la proteína hMLH1 más similares a la MLH1 de levadura se corresponden con los aminoácidos 11 a 317, que muestran una identidad del 55% y los últimos 13 aminoácidos que son idénticos entre las dos proteínas. La Figura 5 muestra un alineamiento de las secuencias predichas de la proteína MLH1 humana y la MLH1 de S. cerevisiae. Las identidades de aminoácidos se indican mediante recuadros y los huecos se indican mediante guiones. El alineamiento por pares de las secuencias de proteínas se realizó con Enastar MedAlig usando el procedimiento clustal^{27}. Los parámetros de alineamiento por pares fueron un tamaño de palabra de 1, una penalización por hueco de 3, una ventana de 5 y diagonales de 5. Además, como se muestra en la Figura 13, las secuencias de aminoácidos predichas de las proteínas MLH1 humana y de ratón muestran al menos una identidad del 74%.

La Figura 6 muestra un árbol filogenético de las proteínas relacionadas con MutL. El árbol filogenético se construyó usando las secuencias de aminoácidos predichas de 7 proteínas relacionadas con MutL: MLH1 humana; MLH1 de ratón; MLH1 de S. cerevisiae; PMS1 de S. cerevisiae; MutL de E. coli; MutL de S. typhimurium y HexB de S. pneumoniae. Las secuencias necesarias se obtuvieron del GenBank versión 7.3. El árbol filogenético se generó con el programa PILEUP del software del Genetics Computer Group usando una penalización por hueco de 3 y una longitud de la penalización de 0,1. Las secuencias registradas de ADN de hMLH1 y hPMS1 se enviaron a GenBank.

Localización de intrones de hMLht1 y de las estructuras límite entre intrón/exón

En nuestra solicitud previa de Patente de EE.UU. Nº 08/209.521, describíamos la secuencia de nucleótidos de un clon de ADN complementario (ADNc) de un gen humano, hMLH1. La secuencia de ADNc de hMLH1 (ID SEC Nº 4) se presenta en esta solicitud en la Figura 3. Apreciamos que puede haber cierta variabilidad entre las estructuras de los ADNc independientes de hMLH1, resultado de polimorfismos en la población humana y de la degeneración del código genético.

En la presente solicitud, recogemos los resultados de nuestros estudios genómicos de secuenciación. Específicamente, hemos clonados la región genómica humana que incluye el gen hMLH1, con atención específica en los exones individuales y en las estructuras que rodean al límite entre intrón/exón. Con el objetivo final de diseñar una aproximación exhaustiva y eficaz para identificar y caracterizar mutaciones que confieran susceptibilidad al cáncer, creemos que es importante conocer las secuencias de tipo natural de las estructuras de los intrones que flanquean a los exones del gen hMLH1. Una ventaja de conocer la secuencia de los intrones próxima a los límites del exón es que esto hace posible diseñar pares de cebadores para amplificar selectivamente exones individuales. Lo que es más importante, también es posible que una mutación en una región intrón que, por ejemplo, puede causar un error de empalme del ARNm, pueda dar lugar a un producto génico defectuoso, es decir, susceptibilidad al cáncer, sin mostrar ninguna anomalía en una región exón del gen. Creemos que una aproximación de análisis exhaustivo requiere la búsqueda de mutaciones, no sólo en el exón o en el ADNc, sino también en las estructuras del intrón que flanquean los límites del exón.

Hemos clonado la región genómica humana que incluye hMLH1 usando aproximaciones conocidas en la técnica, y podrían haberse usado otras aproximaciones conocidas. Usamos la PCR para analizar una biblioteca genómica humana de P1 para el gen hMLH1. Obtuvimos cuatro clones, dos que contenían el gen completo y dos que carecían del extremo C-terminal. Caracterizamos uno de los clones de longitud completa mediante un ciclo de secuenciación, que dio lugar a la delimitación de todas las secuencias de unión entre intrón/exón a ambos lados de los 19 exones de hMLH1. A continuación diseñamos grupos múltiples de cebadores de PCR para amplificar cada exón individual (cebadores de la primera etapa) y verificamos la secuencia de cada exón y de la secuencia del intrón flanqueante mediante la amplificación de varias muestras de ADN genómico diferente y secuenciación de los fragmentos resultante usando un secuenciador ABI 373. Además, hemos determinado los tamaños de cada exón de hMLH1 usando procedimientos de PCR. Finalmente, ideamos un grupo de cebadores anidados de PCR (cebadores de la segunda etapa) para la reamplificación de exones individuales. Hemos usados los cebadores de la segunda etapa en un procedimiento múltiples para analizar mutaciones de hMLH1 en familias con CCHNP y en tumores. Generalmente, en la aproximación de cebador de PCR anidada, realizamos una primera amplificación múltiple con cuatro a ocho grupos de cebadores de la "primera etapa", dirigido cada uno a un exón diferente. A continuación reamplificamos exones individuales a partir del producto de la primera etapa de amplificación, usando un único grupo de cebadores de la segunda etapa. A continuación, se muestran ejemplos y detalles adicionales relacionados con nuestro uso de los cebadores de la primera y segunda etapa.

A lo largo de nuestros estudios de secuenciación genómica, hemos identificado los diecinueve exones del gen hMLH1, y hemos mapeado los límites intrón/exón.

La Tabla 1 presenta las coordenadas de nucleótidos (es decir, el punto de inserción de cada intrón en la región codificadora del gen) de los exones de hMLH1 (ID SEC Nº 25-43). Las coordenadas presentadas se basan en la secuencia del ADNc de hMLH1, asignado la posición "1" a la "A" del inicio "ATG" (donde A es el nucleótido 1 en la ID SEC Nº 4).

TABLA 1

Número de intrón	Coordenadas de secuencia del ADNc
intrón 1	116 y 117
intrón 2	207 y 208
intrón 3	306 y 307
intrón 4	380 y 381
intrón 5	453 y 454
intrón 6	545 y 546
intrón 7	592 y 593
intrón 8	677 y 678

TABLA 1 (continuación)

Número de intrón	Coordenadas de secuencia del ADNc
intrón 9	790 y 791
intrón 10	884 y 885
intrón 11	1.038 y 1.039
intrón 12	1.409 y 1.410
intrón 13	1.558 y 1.559
intrón 14	1.667 y 1.668
intrón 15	1.731 y 1.732
intrón 16	1.896 y 1.897
intrón 17	1.989 y 1.990
intrón 18	2.103 y 2.104

\vskip1.000000\baselineskip

También hemos determinado la secuencia de nucleótidos de las regiones intrón que flanquean los exones del gen hMLH1. Las ID SEC Nº 6-24 son secuencias de exones individuales unidas por sus respectivas secuencias intrón antes del extremo 5' y después del extremo 3'. Las mismas estructuras de nucleótidos se muestran en la Figura 4A, donde los exones se numeran desde el extremo N-terminal al C-terminal con respecto al locus cromosómico. Los números de 5 dígitos indican los cebadores usados para amplificar el exón. Todas las secuencias se numeran asumiendo que la A del codón ATG es el nucleótido 1. Los números entre ( ) son las coordenadas nucleotídicas de la secuencia codificadora encontradas en el exón indicado. Las mayúsculas son los intrones. Las minúsculas son las secuencias de los exones o no traducidas encontradas en los clones de ARNm/ADNc. Las secuencias en minúsculas y subrayadas se corresponden con cebadores. El codón de parada en 2.269-2.2271 está en cursiva y subrayado.

La tabla 2 presenta las secuencias de parejas de cebadores (cebadores de la "primera etapa") que hemos usado para amplificar exones individuales con estructuras de intrones flanqueantes:

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

3

4

Adicionalmente, hemos diseñado un grupo de cebadores de amplificación de la "segunda etapa", cuyas estructuras se muestran a continuación en la Tabla 3. Usamos los cebadores de la segunda etapa junto con los cebadores de la primera etapa en un protocolo de amplificación anidada, como se describe a continuación.

TABLA 3

5

6

En la tabla 3, un asterisco (*) indica que el nucleótido 5' está biotilinado. Los exones 1-7, 10, 13 y 16-19 puede amplificarse específicamente en reacciones de PCR que contienen MgCl_{2} 1,5 mM o 3 mM. Los exones 11 y 14 sólo pueden amplificarse específicamente en reacciones de PCR que contiene MgCl_{2} 1,5 mM y los exones 8, 9, 12 y 15 sólo pueden amplificarse específicamente en reacciones de PCR que contiene MgCl_{2} 3 mM. Con respecto al exón 12, los cebadores de la segunda etapa de amplificación se han diseñado de modo que el exón 12 se reamplifica en dos mitades. El conjunto de cebadores 20.546 y 20.002 amplifica la mitad del extremo N-terminal. El conjunto de cebadores 19.829 y 19.835 amplifica la mitad del extremo C terminal. Un cebador alternativo al 18.178 es el 19.070.

La información de la secuencia de hMLH1 proporcionada por nuestros estudios y descrita en esta solicitud y en las solicitudes relacionadas anteriores, puede usarse para diseñar un gran número de cebadores oligonucleotídicos diferentes para su uso en la identificación de mutaciones de hMLH1 que se correlacionan con la susceptibilidad al cáncer y/o con el desarrollo de tumores en un individuo, incluyendo cebadores que amplificarán más de un exón (y/o las secuencias intrón flanqueantes) en una banda de producto.

Un experto en la materia estará familiarizado con consideraciones importantes sobre el diseño de cebadores de PCR usados para amplificar el fragmento o gen deseado^{37}. Estas consideraciones pueden ser similares, si bien no necesariamente idénticas, a aquellas implicadas en el diseño de cebadores para secuenciación, como se discute anteriormente. Generalmente, es importante que los cebadores hibriden de forma relativamente específica (es decir, tienen una temperatura T_{m} mayor de aproximadamente 55 grados ºC, y preferiblemente, de aproximadamente 60 grados ºC). En la mayoría de los casos, funcionan bien cebadores de entre 17 y 25 nucleótidos de longitud. Pueden usarse cebadores más largos para amplificar fragmentos más largos. En todos los casos, es deseable evitar el uso de cebadores que sean complementarios con más de una secuencia en el genoma humano, de modo que cada par de cebadores para PCR amplifica sólo un fragmento único y correcto. Sin embargo, sólo es absolutamente necesario que la banda correcta se distinga de otras bandas de producto de la reacción de PCR.

Las condiciones exactas de la PCR (por ejemplo, concentración de sal, número de ciclos, tipo de ADN polimerasa, etc.) pueden variarse, como se conoce en la técnica, para mejorar, por ejemplo, el rendimiento o especificidad de la reacción. En particular, hemos descubierto que es valioso usar cebadores anidados en las reacciones de PCR para reducir la cantidad de sustrato de ADN necesario y para mejorar la especificidad de la amplificación.

A continuación hay dos ejemplos. El primer ejemplo ilustra el uso de un par de cebadores de la primera etapa (ID SEC Nº 69 y 70) para amplificar un segmento intrón/exón (SECID Nº 18). El segundo ejemplo ilustra el uso de cebadores de la segunda etapa para amplificar un segmento intrón/exón diana a partir del producto de una primera etapa de amplificación por PCR empleando cebadores de la primera etapa.

Ejemplo 1 Amplificación de clones genómicos de hMLH1 a partir de una biblioteca de fagos P1

Se usaron 25 ng de ADN genómico (o puede usarse 1 ng de un fago P1) en reacciones de PCR que incluían:

dNTP 0,05 mM

KCl 50 mM

Mg 3 mM

Tris-HCl 10 mM, pH 8,5

gelatina al 0,01%

cebadores 5 \muM

Las reacciones se realizaron en un termociclador de Perkin-Elmer Cetus modelo 9600. Las reacciones se incubaron a 95 grados ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos (30 ciclos para un fago P1) de:

94 grados ºC durante 30 segundos

55 grados ºC durante 30 segundos

72 grados ºC durante 1 minuto.

A continuación se realizó una reacción final de extensión de 7 minutos a 72 grados ºC. Los clones P1 deseables eran aquellos que producían una banda de producto de aproximadamente las pb.

Ejemplo 2 Amplificación de las secuencias de hMLH1 a partir de ADN genómico usando cebadores anidados de PCR

Realizamos una amplificación por PCR en dos etapas de secuencias de hMLH1 a partir de ADN genómico como sigue. Típicamente, la primera amplificación se realizó en una reacción de 25 microlitos que incluía:

25 ng de ADN cromosómico

Tampón II para PCR de Perkin-Elmer (puede usarse cualquier tampón adecuado).

MgCl_{2} 3 mM

50 \muM de cada dNTP

ADN polimerasa Taq

cebadores 5 \muM (ID SEC Nº 69 y 70)

y se incubó a 95 grados ºC durante 5 minutos, seguido de 20 ciclos de:

94 grados ºC durante 30 segundos

55 grados ºC durante 30 segundos

Típicamente, la banda de producto era suficientemente pequeña (menos de aproximadamente 500 pb) como para que no se realizaran etapas de extensión independientes como parte de cada ciclo. Por el contrario, se realizó una única etapa de extensión a 72 grados ºC durante 7 minutos, después se completaron los 20 ciclos. Los productos de reacción se conservaron a 4 grados ºC.

La segunda reacción de amplificación, normalmente en un volumen de 25 ó 50 microlitros, incluía:

1 ó 2 microlitros (dependiendo del volumen de la reacción) del producto de reacción de la primera amplificación.

Tampón II para PCR de Perkin-Elmer (podría usarse cualquier tampón adecuado)

MgCl_{2} 3 mM

50 \muM de cada dNTP.

ADN polimerasa Taq

cebadores anidados 5 \muM (ID SEC Nº 109 y 110)

y se incubó a 95 grados ºC durante 5 minutos, seguido de 20-25 ciclos de:

94 grados ºC durante 30 segundos

55 grados ºC durante 30 segundos

se realizó una única etapa de extensión, a 72 grados ºC durante 7 minutos, después de que se completaran los ciclos. Los productos de reacción se conservaron a 4 grados ºC.

Puede usarse cualquier conjunto de cebadores capaces de amplificar una secuencia diana de hMLH1 en la primera reacción de amplificación. Hemos usado cada uno de los conjuntos de cebadores que aparecen en la Tabla 2 para amplificar un exón individual de hMLH1 en la primera reacción de amplificación. También hemos usado combinaciones de esos conjuntos de cebadores, amplificando de este modo múltiples exones individuales de hMLH1 en la primera reacción de amplificación.

Los cebadores anidados usados en la primera fase de amplificación se diseñaron en relación con los cebadores usados en la primera reacción de amplificación. Es decir, cuando se usa un único conjunto de cebadores en la primera reacción de amplificación, los cebadores usados en la segunda reacción de amplificación debería ser idénticos a los cebadores usados en la primera reacción excepto porque los cebadores usados en la segunda reacción no deberían incluir los nucleótidos más en el extremo 5' de los cebadores de la primera reacción de la amplificación, y deberían extenderse suficientemente más allá del extremo 3', de modo que la T_{m} de los cebadores de la segunda amplificación es aproximadamente la misma que la T_{m} de los cebadores de la primera reacción de amplificación. Típicamente, nuestros cebadores de la segunda reacción carecían de los 3 nucleótidos más en el extremo 5' de los cebadores de la primera reacción de amplificación y se extendían aproximadamente 3-6 nucleótidos más allá del extremo 3'. Las ID SEC Nº 109 y 110 son ejemplos de pares de cebadores anidados que podrían usarse en una segunda reacción de amplificación cuando se usen las SECID Nº 69 y 70 en la primera reacción de amplificación.

También hemos descubierto que puede valorarse la inclusión de una secuencia convencional en el extremo 5' de uno de los cebadores de la segunda reacción de amplificación para cebar las reacciones de secuenciación. Adicionalmente, hemos descubierto que es útil biotinilar esté último nucleótido de uno o de ambos cebadores de la segunda reacción de amplificación, de modo que la banda del producto puede purificarse fácilmente usando perlas magnéticas^{40} y, a continuación, pueden realizarse reacciones de secuenciación directamente sobre los productos asociados a las perlas^{41-45}.

Para una descripción más detallada de los procedimientos de amplificación múltiple y de secuenciación, véanse las referencias de Zu y col. y Espelund y col^{46, 47}.

Ligamiento de hMLH1 con el cáncer

Como primera etapa para determinar si hMLH1 era un candidato para el locus CCHNP en el cromosoma humana 3p21-23^{3}, mapeamos hMLH1 mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH)^{20,21}. Usamos dos fragmentos genómicos independientes (datos no mostrados) del gen hMLH1 en el análisis por FISH. El examen de distintas extensiones de cromosomas en metafase, localizaron hMLH1 en el cromosoma 3p21.3.23.

El panel A de la Figura 7 muestra la hibridación de sondas de hMLH1 en una extensión en metafase. Las sondas genómicas biotiniladas de hMLH1 se hibridaron en cromosomas humanos en metafase bandeados como se describe previamente^{20,21}. La detección se realizó con avidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (señal verde); los cromosomas, que se muestra en azul, se contrastaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las imágenes se obtuvieron con una cámara CCD enfriada, se potenciaron, se seudocolorearon y se integraron con los siguientes programas: CCD Image Capture, NIH Image 1.4; Photoshop de Adobe y Genejoin Maxpix, respectivamente. El Panel B de la Figura 7 muestra una composición del cromosoma 3 a partir de extensiones múltiples de metafases alineadas con el ideograma del cromosoma 3 humano. La región de hibridación (posición distal del 3p21.3-23) se indica en el ideograma mediante una barra vertical.

Como confirmación independiente de la localización del hMLH1 en el cromosoma 3, usamos tanto PCR con un par de oligonucleótidos específicos de hMLH1 como transferencia genómica con una sonda específica de hMLH1 para analizar el ADN del panel de células roedor/humano NIGMS2 (Coriell Inst. for Med. Res., Camden, N.J. EE.UU.). Los resultados de ambas técnicas indicaban un ligamiento al cromosoma 3. También mapeamos el gen MHL1 de ratón mediante FISH en la banda E del cromosoma 9. Esta es una posición de sintenia con el cromosoma 3p humano^{22}. Por tanto, el gen hMLH1 se localiza en 3p21.3-23, dentro de la región genómica implicada en las familias con CCHNP^{3} ligado al cromosoma 3.

A continuación, analizamos mutaciones en el cromosoma 3 en muestras de sangre de individuos afectados y no afectados de dos familias candidatas con CCHNP^{3}. Una familia, la Familia 1, mostraba un ligamiento significativo (valor de lod = 3,01 a una fracción de recombinación de 0) entre CCHNP y un marcador en 3p. Para la segunda familia, la Familia 2, el valor de lod indicado (1,02) estaba por debajo del nivel de significación normalmente aceptado y, de este modo, sugería sólo ligamiento con el mismo marcador en 3p. El análisis de ligamiento posterior de la Familia 2 con el marcador de microsatélite D3S1298 en 3p21.3 dio un valor de lod más significativo de 1,88 a una fracción de recombinación de 0. Inicialmente, analizamos mutaciones en dos exones amplificados por PCR del gen hMLH1 mediante secuenciación directa de ADN (Figura 4). Examinamos estos dos exones en tres individuos afectados de la Familia 1 y no detectamos ninguna diferencia con respecto a la secuencia esperada. En la Familia 2, observamos que cuatro individuos afectados de cáncer de colon eran heterocigotos para la sustitución de C por T en un exón que codifica los aminoácidos 41-69, que se corresponden con una región muy conservada de la proteína (Figura 9). En un individuo afectado, analizamos diferencias adicionales en la secuencia del ADNc amplificado por PCR. La información combinada de la secuencia obtenida de los dos exones y del ADNc de este individuo afectado representa el 95% (es decir, todo excepto las primeras 116 pb) de la fase de lectura abierta. No observamos cambios de nucleótidos que no fueran la sustitución de C por T. Además, encontramos que cuatro individuos de la Familia 2, que se predijo eran portadores sobre la base de los datos de ligamiento y que todavía no estaban afectados de cáncer de colon, eran heterocigotos para la misma sustitución de C por T. Dos de estos portadores predichos están por debajo y dos están por encima de la media de edad de inicio (50 años) en esta familia en particular. Dos individuos no afectados examinados de esta misma familia, ambos predichos como no portadores por los datos de ligamiento, mostraron la secuencia normal esperada en esta posición. Los análisis de ligamiento que incluyen la sustitución de C por T en la Familia 2 daban un valor de lod de 2,23 a una fracción de recombinación de 0. Usando criterios de diagnóstico de cáncer de baja rigurosidad, calculamos un valor de lod de 2,53. Estos datos indican que la sustitución de C por T muestra un ligamiento significativo con el CCHNP en la Familia 2.

La Figura 8 muestra cromatogramas de secuencia que indican una mutación de transición de C a T que produce una sustitución de aminoácido no conservadora en la posición 44 de la proteína hMLH1. Se presenta el análisis de secuencia de un individuo no afectado (paneles superiores, hebras menos y más) y un individuo afectado (paneles inferiores, hebras menos y más). La posición del nucleótido heterocigoto se indica con una flecha. El análisis de los cromatogramas de secuencia indica que hay suficiente señal de T en el pico de C y suficiente señal de A en el pico de G de los individuos afectados para ser heterocigotos en este sitio.

Para determinar si esta sustitución de C por T era un polimorfismo, secuenciamos este mismo exón amplificado a partir del ADN genómico de 48 individuos no relacionados y observamos sólo la secuencia normal. Hemos examinado 26 individuos más no relacionados usando el análisis de hibridación de oligonucleótido específico de alelo (ASO)^{33}. Las secuencias ASO (ID SEC Nº 141 y 142, respectivamente) que usamos fueron:

5'-ACTTGTGGATTTTGC-3'

\hskip0.3cm

y

5'-ACTTGTGAATTTTGC-3'.

Sobre la base de la secuenciación directa del ADN y al análisis ASO, ninguno de estos 74 individuos no relacionados lleva la sustitución de C por T. Por tanto, la sustitución de C por T observada en los individuos de la Familia 2 probablemente no es un polimorfismo. Como se mencionó anteriormente, no detectamos esta misma sustitución de C por T en individuos afectados de una segunda familia ligada al cromosoma 3, la Familia 1^{3}. Hemos seguido estudiando mutaciones en hMLH1 en individuos de la Familia 1.

La Tabla 4, a continuación, resume nuestros análisis experimentales de muestras de sangre de individuos afectados y no afectados de la Familia 2 e individuos no relacionados.

TABLA 4

7

Sobre la base de varios criterios, sugerimos que la sustitución de C por T observada en la región codificadora de hMLH1 representa la mutación que es la base para el CCHNP en la Familia 2^{3}. En primer lugar, la secuencia de ADN y el análisis por ASO no detectaban la sustitución de C por T en 74 individuos no relacionados. De este modo, la sustitución de C por T no es simplemente un polimorfismo. En segundo lugar, se espera que la sustitución de C por T observada produzca un cambio de serina por fenilalanina en la posición 44 (véase la Figura 9). Esta sustitución de aminoácido es un cambio no conservador en una región conservada de la proteína (Figura 3 y 9). Las predicciones de estructura secundaria usando los parámetros de Chou y Fasman sugieren una estructura hélice-giro-lámina beta con la posición 44 localizada en el giro. La sustitución observada de Ser por Phe, en la posición 44 reduce considerablemente la predicción de este giro, lo que sugiere que la sustitución de aminoácido predicha altera la conformación de la proteína hMLH1. La sugerencia de que la sustitución de Ser por Phe es una mutación que confiere susceptibilidad al cáncer está apoyada además por nuestros experimentos que muestran que una sustitución análoga (alanina por fenilanalina) en un gen MLH1 de levadura da lugar a una proteína de reparación de errores de apareamiento no funcional. En bacterias y levaduras, una mutación que afecta a la reparación de errores de apareamiento de ADN causa un aumento comparable en la frecuencia de mutación espontánea, incluyendo adiciones y deleciones en las repeticiones de
dinucleótidos ^{4,5,11,13,14,15,16}. En humanos, la mutación de hMSH2 es la base de los CCHNP del cromosoma 2^{1,2}, tumores que muestran inestabilidad del microsatélite y un defecto aparente en la reparación de errores de apareamiento^{12}. El CCHNP ligado al cromosoma 3 también se asocia con inestabilidad en las repeticiones de dinucleótidos^{3}. En combinación con estas observaciones, el alto grado de conservación entre la proteína MLH1 humana y la proteína de reparación de errores de apareamiento de ADN de levaduras, MLH1, sugiere que hMLH1 probablemente trabaja en la reparación de errores de apareamiento de ADN. Durante el aislamiento del gen hMLH1, identificamos el gen hPMS1. Esta observación sugiere que la reparación de errores de apareamiento de ADN en mamíferos, como en levaduras^{4}, puede requerir al menos dos proteínas similares a MutL.

Debe apreciarse que parece que las diferentes familias con CCHNP muestran diferentes mutaciones en el gen MLH1. Como se explica a continuación, los individuos afectados de la Familia 1 muestran un "estrecho ligamiento" entre el CCHNP y un locus en la región de 3p21-23. Sin embargo, los individuos afectados de la Familia 1 no tienen la mutación de C por T encontrada en la Familia 2. Parece que los individuos afectados de la Familia 1 tienen una mutación diferente en su gen MLH1. Además, usamos la información de la estructura y procedimientos descritos en esta solicitud para encontrar y caracterizar otra mutación de hMLH1 que aparentemente confiere susceptibilidad al cáncer en portadores heterocigotos del gen mutante en una gran familia inglesa con CCHNP. La mutación de hMLH1 en la familia inglesa es un cambio de fase +1 T que se prevé conduce a la síntesis de una proteína hMLH1 truncada. A diferencia, por ejemplo, de la anemia de células falciformes, en la que esencialmente todos los individuos afectados conocidos tienen la misma mutación, se han descubierto múltiples mutaciones en hMLH1 y ligadas al cáncer. Por tanto, el conocimiento de la secuencia completa del ADNc de hMLH1 (y probablemente de hPMS1), así como de las secuencias genómicas, especialmente aquellas que rodean a los exones, será útil e importante para caracterizar las mutaciones en familias identificadas por mostrar una elevada frecuencia de cáncer.

Posteriormente a nuestro descubrimiento de una mutación en hMLH1 que confiere cáncer, otros estudios han dado como resultado la caracterización de al menos 5 mutaciones adicionales en hMLH1, cada una de las cuales parece conferir susceptibilidad al cáncer a individuos de al menos una familia con CCHNP. Por ejemplo, Papadopoulos y col. identificaron una mutación como esta, caracterizada por una deleción en fase del par de bases 165 entre los codones 578 a 632. En otra familia, Papadopoulos y col. observaron una mutación en hMLH1 caracterizada por un cambio de fase y una sustitución de nuevos aminoácidos, en concreto, una deleción de 4 pares de bases entre los codones 727 y 728. Papadopoulos y col. también describen una mutación ligada al cáncer en hMLH1, caracterizada por una extensión del extremo COOH terminal, en concentro, una inserción de 4 pares de bases entre los codones 755 y 756^{38}.

En resumen, hemos demostrado que el gen de reparación de errores de apareamiento de ADN, hMLH1, probablemente es el gen del cáncer de colon hereditario no polipósico previamente localizado por análisis de ligamiento en el cromosoma 3p21-23^{3}. La disponibilidad de la secuencia del gen hMLH1 facilitará el análisis de mutaciones ligadas al cáncer en familias con CCHNP. Además, aunque la pérdida de heterocigosis (LOH) de marcadores ligados no es una características de las formas 2p o 3p del CCHNP^{3,6}, se ha observado la LOH que implica a la región 3p21.3-23 en varios cánceres humanos^{24-26}. Esto sugiere la posibilidad de que la mutación en hMHL1 puede jugar cierto papel en estos tumores.

PMS1 humana

La PMS1 humana se aisló usando los procedimientos descritos con referencia a la Figura 1. La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos completa del ADNc de hPMS1. La Figura 11 muestra un alineamiento de las secuencias predichas de las proteínas PMS1 humana y de levadura. Determinamos mediante análisis por FISH que la PMS1 humana se localiza en el cromosoma 7. Posteriormente a nuestro descubrimiento de hPMS1, otros han identificado mutaciones en el gen que parecen conferir susceptibilidad a CCHNP^{39}.

MLH1 de ratón

Usando el procedimiento explicado anteriormente en referencia a la Figura 1, hemos determinado una secuencia parcial de nucleótidos del ADNc de MLH1 de ratón, como se muestra en la Figura 12 (ID SEC Nº 135). La Figura 13 muestra la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha para la proteína mMLH1 (ID SEC Nº 136) en comparación con la secuencia predicha de la proteína hMLH1 (ID SEC N 5). La comparación de las proteínas MLH1 de ratón y humana así como la comparación de las proteínas hMLH1 con la MLH1 de levadura, como se muestra en la Figura 9, indica un elevado grado de conservación.

PMS1 de ratón

Usando los procedimientos descritos anteriormente en referencia a la Figura 1, aislamos y secuenciamos el gen PMS1 de ratón, como se muestra en la Figura 14 (ID SEC Nº 137). Esta secuencia de ADNc codifica una proteína predicha de 864 aminoácidos (ID SEC Nº 138), como se muestra en la Figura 15, donde se compara con la secuencia de aminoácidos predicha para hPMS1 (ID SEC Nº 133). El grado de identidad entre las proteínas PMS1 predichas de ratón y humana es alto, como podría esperarse entre dos mamíferos. De forma similar, como se apuntó anteriormente, existe una gran similitud entre la proteína PMS1 humana y la proteína reparadora de errores de apareamiento de ADN de levadura, PMS1, como se muestra en la Figura 11. El hecho de que PMS1 y MLH1 funcionen en levaduras en la reparación de errores de apareamiento de ADN, sugiere claramente que las PMS1 y MLH1 humanas y de ratón también son proteínas de reparación de errores de apareamiento.

Uso de MLH1 y PMS1 de ratón

Creemos que nuestro aislamiento y caracterización de los genes mMLH1 y mPMS1 tendrán muchas aplicaciones en investigación. Por ejemplo, como ya se ha descrito anteriormente, hemos aprovechado nuestro conocimiento del gen mPMS1 para producir anticuerpos que reaccionan específicamente con hPMS1. Ya hemos explicado que los anticuerpos dirigidos frente a proteínas humanas, MLH1 o PMS1, se pueden usar tanto con propósitos de investigación como con fines diagnósticos.

También creemos que nuestro conocimiento de mPMS1 y mMLH1 será útil para construir modelos en ratón con el fin de estudiar las consecuencias de los defectos en la reparación de errores de apareamiento de ADN. Esperamos que los ratones defectivos en mPMS1 o mMLH1 sean muy propensos al cáncer porque cada uno de los cromosomas 2p y 3p asociados con el CCHNP son debidos a un defecto en un gen de reparación de errores de apareamiento^{1,2}. Como se señala anteriormente, ya hemos producido ratones quiméricos que portan un gen mPMS1 defectuoso. Actualmente estamos construyendo ratones heterocigotos para la mutación mPMS1 o mMLH1. Estos ratones heterocigotos deberían proporcionar modelos animales útiles para el estudio del cáncer en humanos, en especial CCHNP. Los ratones serán útiles para el análisis tanto de factores intrínsecos como extrínsecos que determinan el riesgo y la progresión del cáncer. Además, los cánceres asociados con la deficiencia en la reparación de errores de apareamiento pueden responder de forma distinta a la terapia convencional en comparación con otros cánceres. Estos modelos animales serían útiles para determinar si existen diferencias y permitir el desarrollo de regímenes para el tratamiento eficaz de estos tipos de tumores. Estos modelos animales pueden usarse también para estudiar la relación entre factores hereditarios frente a factores de la dieta en la carcinogénesis.

Diferenciación entre mutaciones y polimorfismos

Para estudios de susceptibilidad al cáncer y para la identificación y caracterización de tumores, es importante distinguir "mutaciones" de "polimorfismos". Una "mutación" produce un "alelo de tipo no natural" de un gen. Un alelo de tipo no natural de un gen produce una transcripción y/o un producto proteico que no funciona de forma normal en la célula. Las "mutaciones" pueden ser cualquier alteración en la secuencia de nucleótidos, incluyendo inserciones, deleciones, sustituciones y reordenamientos.

Los "polimorfismos", por otro lado, son diferencias en la secuencia que se encuentran dentro de la población de genes que funcionan normalmente (es decir, de "tipo natural"). Algunos polimorfismos son el resultado de la degeneración del código de ácidos nucleicos. Es decir, dado que la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón triplete, muchas secuencias nucleotídicas diferentes pueden codificar el mismo polipéptido. Otros polimorfismos son simplemente diferencias en la secuencia que no tienen un efecto significativo sobre la función del gen o del polipéptido codificado. Por ejemplo, los polipéptidos pueden tolerar a menudo pequeñas inserciones o deleciones, o sustituciones "conservadoras" en su secuencia de aminoácidos sin que se altere significativamente la función del polipéptido.

Las sustituciones "conservadoras" son aquellas en las que un aminoácido en particular se sustituye por otro aminoácido de características químicas similares. Por ejemplo, los aminoácidos a menudo se caracterizan como "no polares (hidrófobos)", que incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; "polares neutros", que incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina; "cargados positivamente (básicos)", que incluyen arginina, lisina e histidina; y "cargados negativamente (ácidos)", que incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido del mismo grupo se considera generalmente que es "conservadora", especialmente si los grupos laterales de los dos aminoácidos relevantes son de tamaño similar.

La primera etapa en la identificación de una mutación o polimorfismo en la secuencia de un gen de reparación de errores de apareamiento implica la identificación, usando técnicas disponibles que incluyen aquellas descritas en este documento, de una secuencia de un gen (o fragmento génico) de reparación de errores de apareamiento que difiera de una secuencia conocida normal (por ejemplo, de tipo natural) del mismo gen (o fragmento génico) de reparación de errores de apareamiento. Por ejemplo, podría identificarse una secuencia del gen (o fragmento génico) hMLH1 que difiera en al menos una posición nucleotídica de una secuencia hMLH1 normal conocida (por ejemplo, de tipo natural), como cualquiera de las ID SEC Nº 6-24.

Pueden diferenciarse las mutaciones de los polimorfismos usando cualquiera de los diversos procedimientos, el más directo de los cuales es quizás la recogida de datos y la correlación con el desarrollo del tumor. Es decir, por ejemplo, podría identificarse un sujeto cuya secuencia del gen hMLH1 difiera de las secuencias recogidas en las ID SEC Nº 6-24, pero que no tenga cáncer y que no tenga antecedentes familiares de cáncer. Especialmente si otros miembros de la familia de este sujeto, preferiblemente mayores, tienen secuencias del gen hMLH1 que difieran de las ID SEC Nº 6-24 de la misma forma (o formas), es probable que la secuencia del gen hMLH1 del sujeto pueda caracterizarse como un "polimorfismo". Si se identifican otros individuos no relacionados con la misma secuencia del gen hMLH1 y sin antecedentes familiares de cáncer, puede confirmarse la categorización.

Pueden identificarse las mutaciones que son responsables de conferir susceptibilidad génica al cáncer porque, entre otras cosas, estas mutaciones están presentes probablemente en todos los tejidos de un individuo afectado y en la línea germinal de al menos uno de los progenitores del individuo y no es probable que se encuentre en familias no relacionadas sin antecedentes de cáncer.

Cuando se distinguen mutaciones de polimorfismos, a veces puede ser valioso evaluar una diferencia de la secuencia en particular en presencia de al menos una mutación conocida del gen de reparación de errores de apareamiento. En algunos casos, un cambio en una secuencia en particular no tendrá un efecto detectable (es decir, parecerá que es un polimorfismo) cuando se analice individualmente, pero aumentará, por ejemplo, la penetrancia de una mutación conocida, de modo que los individuos que portan tanto la diferencia de polimorfismo aparente como una mutación conocida tendrán mayor probabilidad de desarrollar cáncer que los individuos que portan sólo la mutación. Las diferencias en la secuencia que tienen tal efecto se considera que son mutaciones propiamente, aunque débiles.

Como se describe anterior y previamente (solicitudes de patentes de EE.UU. con Nº 08/168.877 y 08/209.521), las mutaciones en los genes o productos génicos de reparación de errores de apareamiento producían versiones de tipo no natural de esos genes o productos génicos. Algunas mutaciones pueden, por tanto, distinguirse de los polimorfismos por sus características funcionales en ensayos de reparación de errores de apareamiento in vivo o in vitro. Puede usarse cualquier ensayo de reparación de errores de apareamiento disponible para analizar estas características^{49-63}. Generalmente, es deseable utilizar más de un ensayo de reparación de errores de apareamiento antes de clasificar un cambio de secuencia como un polimorfismo, ya que algunas mutaciones tendrán efectos que no se observarán en todos los ensayos.

Por ejemplo, no es de esperar que un gen de reparación de errores de apareamiento que contenga una mutación sea capaz de sustituir a una copia endógena del mismo gen en una célula hospedadora sin que se vea afectada de forma detectable la reparación de errores de apareamiento en esa célula, mientras que podría esperarse que un gen de reparación de errores de apareamiento que contenga un polimorfismo de secuencia fuera capaz de sustituir a una copia endógena del mismo gen en una célula hospedadora sin afectar de forma detectable a la reparación de errores de apareamiento en esa célula. Apreciamos que para estos estudios de "sustitución" generalmente es deseable introducir el gen que se va a analizar en una célula hospedadora de la misma especie (o al menos muy relacionada) a la de la célula de la que deriva el gen de ensayo, para evitar complicaciones debidas a, por ejemplo, la incapacidad de un producto génico de una especie para interaccionar con otros productos de genes de reparación de errores de apareamiento de otra especie. De forma similar, no cabría esperar que una proteína mutante de reparación de errores de apareamiento funcionara en un sistema de reparación de errores de apareamiento in vitro (preferiblemente de un organismo relacionado); mientras que se esperaría que una proteína polimórfica de reparación de errores de apareamiento funcionara normalmente.

Los procedimientos descritos en este documento y previamente permiten la identificación de clases diferentes de mutaciones de genes de reparación de errores de apareamiento. Los siguientes ejemplos ilustran protocolos para distinguir mutaciones de polimorfismos en genes de reparación de errores de apareamiento de ADN.

Ejemplo 3

Hemos desarrollado un sistema para analizar en la levadura S. cerevisiae el significado funcional de mutaciones encontradas en los genes hMLH1 o hPMS1. El sistema se describe en esta solicitud usando como ejemplo la mutación que causa el cambio de serina (SER) a fenilalanina (PHE) en hMLH1 que se encuentra en una familia con CCHNP, como se describe anteriormente. Hemos derivado una cepa de levadura en la que esencialmente se ha delecionado su gen MLH1 y, por tanto, es un potente mutador, es decir, 1.000 veces por encima de la frecuencia normal en un simple ensayo de marcador genético que implica la reversión del crecimiento dependiente de un aminoácido determinado en independiente (reversión del alelo hom3-10, Prolla, Christie y Liskay, Mol Cell Biol, 14:407-415, 1994). Cuando colocamos el gen normal MLH1 de levadura (completo, con todas las regiones de control conocidas) en un plasma de levadura que se mantiene estable como una copia única en la cepa con MLH1 delecionado, el fenotipo mutador se corrige completamente usando el ensayo de reversión a independencia del aminoácido. Sin embargo, si introducimos una copia delecionada del MLH1 de levadura, no se corrige. A continuación analizamos la mutación que causa en la familia con CCHNP la alteración de SER a PHE. Encontramos que la proteína mutante de levadura resultante no puede corregir el fenotipo mutador, lo que sugiere claramente que la alteración de la secuencia génica de tipo natural probablemente confiere susceptibilidad al cáncer y se clasifica, por tanto, como una mutación, no como un polimorfismo. Posteriormente analizamos proteínas manipuladas genéticamente para contener otros aminoácidos en la posición "serina" y encontramos que la mayoría de los cambios dan lugar a un mutante completo o al menos a un fenotipo parcialmente mutante.

Como se han encontrado otras mutaciones "puntuales" en los genes MLH1 y PMS1 en familias con cáncer, el gen homólogo apropiado de levadura puede manipularse genéticamente para contenerlas y estudiar sus consecuencias sobre la función de la proteína. Además, hemos identificado varios aminoácidos muy conservados en ambos genes, MLH1 y PMS1. También tenemos evidencias de que hMLH1 interacciona con PMS1 de levadura. Este hallazgo aumenta la posibilidad de que las mutaciones observadas en el gen hMLH1 puedan analizarse más directamente en el sistema de levadura. Planeamos hacer sistemáticamente mutaciones que alterarán el aminoácido de estas posiciones conservadas y determinar qué sustituciones de aminoácidos se toleran y cuáles no. Recogiendo la información de mutaciones relacionadas con hMLH1 y hPMS1, determinando y documentando las mutaciones exactas encontradas en las familias con CCHNP y sintetizando artificialmente mutantes para analizarlos en sistemas experimentales, puede ser posible, finalmente, practicar un protocolo de ensayo de susceptibilidad al cáncer que, una vez determinada la estructura de hMLH1 o hPMS1 de los individuos, sólo requiera la comparación de esta estructura con los datos conocidos de mutaciones frente a los de polimorfismo.

Ejemplo 4

También puede usarse otro procedimiento, que hemos empleado para estudiar las interacciones físicas entre hMLH1 y hPMS1 para estudiar si una alteración en particular en un producto génico tiene como resultado un cambio en el grado de interacción proteína-proteína. La información relacionada con cambios en la interacción proteína-proteína puede demostrar o confirmar si una variación genómica en particular es una mutación o un polimorfismo. Después de nuestros hallazgos en el laboratorio sobre la interacción entre las proteínas MLH1 y PMS1 de levadura in vitro e in vivo (solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/168.877), se analizaron las interacciones entre los equivalentes humanos de estas dos proteínas de reparación de errores de apareamiento de ADN. La interacción in vitro entre las proteínas MLH1 y PMS1 humanas se analizó usando cromatografía de afinidad con proteína de unión a maltosa (MBP). La proteína hMLH1 se preparó como una proteína de fusión a MBP, se inmovilizó en una columna de resina de amilosa a través de la MBP y se analizó la unión a hPMS1 sintetizado in vitro. La proteína hPMS1 se unía a la matriz de MBP-hMLH1, mientras que las proteínas control no mostraban afinidad por la matriz. Cuando la proteína hMLH1, traducida in vitro, se pasó por una matriz con la proteína de fusión MBP-hPMS1, la proteína hMLH1 se unía a la matriz de MBP-hPMS1, mientras que las proteínas control no.

Las posibles interacciones in vivo entre hMLH1 y hPMS1 se analizaron usando el sistema de "doble híbrido" en levadura^{28}. Nuestros resultados iniciales indican que hMLH1 y hPMS1 interaccionan in vivo en levadura. Puede usarse el mismo sistema para detectar cambios en la interacción proteína-proteína como resultado de los cambios en la estructura del gen o producto génico y que aún tienen que ser clasificados como polimorfismo o como mutación que confiere susceptibilidad al cáncer.

Detección de familias con CCHNP y sus mutaciones

Se ha estimado que en los Estados Unidos aproximadamente 1.000.000 de individuos portan (son heterocigotos) un gen mutante del CCHNP^{29}. Además, las estimaciones sugieren que el 50-60% de las familias con CCHNP segregan mutaciones en el gen MSH2 que reside en el cromosoma 2p^{1,2}. Otra fracción significativa parece estar asociada con el gen CCHNP que mapea en el cromosoma 3p21-22, debido, presumiblemente, a mutaciones en hMLH1, tales como la transición de C a T descrita anteriormente. La identificación de familias que segregan alelos mutantes del gen hMSH2 o hMLH1, y la determinación de qué individuos en estas familias tienen realmente la mutación, será de gran utilidad en la intervención temprana de la enfermedad. Esta intervención temprana incluirá probablemente la detección temprana a través del análisis y tratamiento complementario agresivo de los individuos afectados. Además, la determinación de las bases genéticas, tanto para los tumores familiares como esporádicos, podría dirigir el procedimiento de terapia en el tumor primario o en las recurrencias.

Inicialmente, las familias candidatas con CCHNP se diagnosticarán en parte por medio del estudio del historial familiar, más probablemente a nivel local, por ejemplo, por oncólogos del hospital. Un criterio para CCHNP es la observación de la inestabilidad de microsatélites en los tumores del individuo^{3,6}. En el paciente que lo presente, se analizarían las mutaciones en hMSH2, hMLH1, hPMS1 y en otros genes implicados en la reparación de errores de apareamiento de ADN cuando se identifiquen. Esto se realiza con mayor facilidad tomando muestras de sangre del individuo. También sería muy útil tejido tumoral congelado en fresco. Es importante destacar para el procedimiento de selección, que los individuos afectados son heterocigotos para la mutación causal en sus tejidos normales.

Se consiguen los tejidos disponibles, por ejemplo, sangre y tumor, para el análisis de mutaciones por PCR usando uno o ambos procedimientos siguientes:

1) Análisis de ligamiento con un marcador microsatélite estrechamente ligado al gen hMLH1

Una aproximación para identificar familias propensas al cáncer con una mutación en hMLH1 es realizar análisis de ligamiento con un marcador muy polimórfico localizado en hMLH1 o estrechamente ligado a hMLH1. Los microsatélites son muy polimórficos y, por tanto, son muy útiles como marcadores en el análisis de ligamiento. Puesto que tenemos el gen hMLH1 en un único fragmento genómico grande en un clon del fago P1 (\sim 100 kpb), es muy probable que existan en el gen hMLH1 o muy cerca de él uno o más microsatélites, por ejemplo, extensiones de repeticiones de dinucleótidos. Se ha descrito al menos uno de estos microsatélites^{38}. Una vez identificados estos marcadores, se diseñarán cebadores para PCR para amplificar los tramos de ADN que contengan los microsatélites. Se analizará el ADN de los individuos afectados y no afectados de una familia con elevada frecuencia de cáncer para determinar la segregación de los marcadores de MLH1 y la presencia de cáncer. Los datos resultantes pueden utilizarse para calcular un valor de lod y, por tanto, determinar la probabilidad de ligamiento entre hMLH1 y la aparición de cáncer. Una vez establecido el ligamiento en una familia dada, se puede usar el mismo marcador polimórfico para analizar la probabilidad de que otros miembros de la familia porten la mutación de hMLH1.

2) Secuenciación del ADNc resultado de la transcripción inversa

a) El ARN de individuos afectados, no afectados y de individuos no emparentados se somete a transcripción inversa (RTd), seguido por una PCR para amplificar el ADNc en 4-5 porciones solapantes^{34,37}. Debe apreciarse que para la PCR pueden usarse potencialmente muchas secuencias de pares de cebadores oligonucleotídicos diferentes para amplificar las porciones relevantes de un gen hMLH1 o hPMS1 del individuo para el análisis genético. Con el conocimiento de las estructuras de ADNc de los genes, es un ejercicio sencillo construir los pares de cebadores que probablemente son eficaces para amplificar específicamente porciones seleccionadas del gen. Mientras que las secuencias de los cebadores tienen normalmente de 20 a 30 bases de longitud, puede ser posible usar cebadores más cortos, potencialmente tan pequeños como aproximadamente 13 bases, para amplificar específicamente segmentos génicos seleccionados. La principal limitación sobre lo pequeño que puede ser una secuencia de cebador es que debe ser suficientemente largo como para hibridar específicamente con el segmento génico diana. La especificidad de la PCR mejora generalmente con el alargamiento de los cebadores y/o el empleo de pares de cebadores anidados.

A continuación, se secuencian los productos de PCR que representan, en total, el ADNc completo y se comparan con secuencias de tipo natural conocidas. En la mayoría de los casos se observará una mutación en el individuo afectado. Idealmente, la naturaleza de la mutación indicará que es probable inactivar el producto génico. De otro modo, debe determinarse la posibilidad de que la alteración no sea simplemente un polimorfismo.

b) Ciertas mutaciones, por ejemplo, aquellas que afectan al empalme o que dan lugar a codones de parada de la transcripción, pueden desestabilizar el ARN mensajero producido a partir del gen mutante y, por tanto, comprometer el procedimiento normal de detección de mutaciones basado en RT. Otra técnica recientemente descrita puede evitar este problema analizando si el ADNc mutante puede dirigir la síntesis de la proteína de longitud normal en un sistema de transcripción/traducción acoplado in vitro^{32}.

3) Secuenciación directa del ADN genómico

Una segunda forma de detectar mutaciones depende del examen de exones y de los límites intrón/exón mediante secuenciación directa por ciclos de PCR de un molde de ADN^{1,2}. Este procedimiento requiere del uso de pares de oligonucleótidos, tales como los descritos en las Tablas 2 y 3 anteriores, que amplifican exones individuales para la secuenciación directa por ciclos de PCR. El procedimiento depende de la información de la secuencia de ADN genómico en cada límite intrón/exón (50 pb o mayor, para cada límite). La ventaja de la técnica es doble. Primero, porque el ADN es más estable que el ARN, el estado del material usado para la PCR no es tan importante como lo es para los protocolos basados en ARN. Segundo, se detectarán la mayoría de las mutaciones en la verdadera región transcrita del gen, incluyendo aquellas que están en un intrón afectado por el empalme.

Para cada gen candidato, la detección de mutaciones puede requerir el conocimiento tanto de la estructura del ADNc completo, como todos los límites intrón/exón de la estructura genómica. Con esta información, puede determinarse el tipo de mutación causal en una familia en particular. A su vez, puede adaptarse un esquema de detección de mutaciones más específico y eficaz para la familia en particular. El análisis de la enfermedad (CCHNP) es complejo porque tiene una base genéticamente heterogénea en el sentido de que está implicado más de un gen y para cada gen están implicados múltiples tipos de mutaciones^{2}. Es muy probable que cualquier familia determinada segregue una mutación en particular. Sin embargo, cuando se determine la naturaleza de la mutación en muchas familias, se determinará el espectro de la mayoría de mutaciones predominantes en la población. En general, la determinación de las mutaciones más frecuentes dirigirá y perfilará la detección de mutaciones.

Puesto que CCHNP es tan predominante en la población humana, la detección del portador al nacer podría llegar a ser parte de las pruebas neonatales convencionales. Pueden identificarse las familias de riesgo y pueden analizarse todos los miembros que no han sido analizados previamente. Finalmente, pueden determinarse todos los familiares afectados.

Modo de selección y ensayo de mutaciones Ensayo basado en ADN

El ensayo inicial, que incluye la identificación de las probables familias con CCHNP mediante diagnóstico convencional y el estudio del historial familiar, se hará probablemente en laboratorios de diagnóstico de ADN locales y más pequeños. Sin embargo, el ensayo a gran escala de múltiples miembros de la familia, y ciertamente el ensayo amplio de poblaciones, finalmente requerirá grandes instalaciones comerciales centralizadas eficaces.

Los ensayos se desarrollarán sobre la base de la determinación de las mutaciones más frecuentes en los genes principales subyacentes al CCHNP, que incluyen al menos el gen hMSH2 en el cromosoma 2p y el gen MLH1 en el cromosoma 3p. Probablemente se tienen que desarrollar diversos ensayos. Por ejemplo, una posibilidad es un grupo de ensayos que emplean hibridaciones de oligonucleótidos que distingan entre los alelos normales y los mutantes^{33}. Como ya se ha destacado, nuestro conocimiento de las estructuras nucleotídicas de los genes hMLH1, hPMS1 y hMSH2 hace posible el diseño de numerosos pares de cebadores oligonucleotídicos que pueden utilizarse para amplificar porciones específicas de un gen de reparación de errores de apareamiento de un individuo para la selección genética y el análisis del riesgo de cáncer. Nuestro conocimiento de la estructura de los genes también hace posible el diseño de sondas marcadas que pueden usarse para determinar rápidamente la presencia o ausencia de todo o una porción de uno de los genes de reparación de errores de apareamiento de ADN. Por ejemplo, pueden diseñarse sondas de oligómeros específicas de alelos (ASO) para diferenciar entre alelos. Los ASO son segmentos cortos de ADN que son idénticos en secuencia, excepto por una diferencia en una única base que refleja la diferencia entre alelos normales y mutantes. En las condiciones apropiadas de hibridación de ADN, estas sondas pueden reconocer una única diferencia entre dos secuencias de ADN que de lo contrario serían idénticas. Las sondas pueden marcarse radiactivamente o con varias moléculas indicadoras no radioactivas, por ejemplo, restos fluorescentes o quimioluminiscentes. Las sondas marcadas se usan entonces para analizar la presencia de alelos causantes de enfermedades en la muestra de PCR. La presencia o ausencia de varios genes diferentes causantes de enfermedad puede determinarse fácilmente en una única muestra. La longitud de la sonda debe ser suficiente como para evitar la unión inespecífica a secuencias nucleotídicas que no sean la diana. Todos los ensayos dependen finalmente de la información estructural completa y precisa relacionada con hMLH1, hMSH2, hPMS1 y otros genes de reparación de errores de apareamiento de ADN implicados en el CCHNP.

Detección selectiva basada en la detección de la proteína

También pueden usarse ensayos basados en la funcionalidad del producto proteico per se. Los ensayos para examinar la proteína utilizarán con más probabilidad anticuerpos específicos frente a las proteínas hMLH1, hPMS1 y hMSH2 o, cuando se identifiquen, otros productos génicos relacionados con el "cáncer".

Por ejemplo, una muestra congelada de tumor puede cortarse y prepararse para la tinción con anticuerpo usando técnicas indirectas de fluorescencia. Se espera que ciertas mutaciones génicas alteren o desestabilicen suficientemente la estructura proteica como para dar una señal alterada o reducida después de la tinción con anticuerpo. Probablemente estos ensayos se realizarán en casos en los que la implicación génica en un cáncer familiar esté aún por establecer. Estamos en el proceso de desarrollo de anticuerpos monoclonales diagnósticos frente a las proteínas MLH1 y PMS1 humanas. Estamos sobreexpresando las proteínas MLH1 y PMS1 humanas en bacterias. Purificaremos las proteínas, las inyectaremos en ratones y obtendremos anticuerpos monoclonales específicos de las proteínas que se puedan usar con fines de diagnóstico y de investigación.

Identificación y caracterización de tumores relacionados con la reparación de errores de apareamiento de ADN

Además de su utilidad en el diagnóstico de la susceptibilidad al cáncer en un sujeto, las secuencias nucleotídicas que son homólogas a un gen bacteriano de reparación de errores de apareamiento pueden ser valiosas para, entre otras cosas, usarlas en la identificación y caracterización de tumores defectuosos en la reparación de errores de apareamiento. Esta identificación y caracterización es valiosa porque los tumores defectuosos en la reparación de errores de apareamiento pueden responder mejor a regímenes de terapia especiales. Por ejemplo, los tumores defectuosos para la reparación de errores de apareamiento pueden ser sensibles a agentes que dañan el ADN, especialmente cuando se administran en combinación con otros agentes terapéuticos.

Los defectos en los genes de reparación de errores necesitan estar presentes en todos los tejidos del individuo para contribuir a la formación del tumor en ese individuo. La mutación espontánea de un gen de reparación de errores de apareamiento en una célula o tejido en particular puede contribuir a la formación del tumor en ese tejido. De hecho, al menos en algunos casos, una única mutación en un gen de reparación de errores no es suficiente para desarrollar un tumor. En estos casos, un individuo con una única mutación en un gen de reparación de errores de apareamiento es susceptible al cáncer, pero no desarrollará un tumor hasta que no se produzca una segunda mutación. Adicionalmente, en algunos casos, la misma mutación en el gen de reparación de errores de apareamiento que está estrictamente asociada al tumor en un individuo será responsable de conferir susceptibilidad al cáncer en una familia con una predisposición hereditaria al desarrollo del cáncer.

La información de secuencia que hemos proporcionado puede usarse con procedimientos conocidos en la técnica para analizar tumores (o líneas celulares tumorales) y para identificar mutaciones asociadas a tumores en los genes de reparación de errores de apareamiento. Preferiblemente, es posible demostrar que estas mutaciones asociadas a tumores no están presentes en tejidos no tumorales del mismo individuo. La información descrita en esta solicitud es especialmente útil para la identificación de mutaciones en genes de reparación de errores de apareamiento en tumores (o líneas celulares tumorales) que muestran inestabilidad genómica de elementos cortos de ADN repetidos.

La información de secuencia y los protocolos de ensayo pueden usarse también para determinar si dos tumores están relacionados, es decir, si un segundo tumor es el resultado de la metástasis de un primer tumor encontrado anteriormente que muestra una mutación en especial de un gen de reparación de errores de apareamiento de ADN.

Aislamiento de genes adicionales de función relacionada

Las proteínas que interaccionan físicamente con hMLH1 y/o hPMS1, probablemente están implicadas en la reparación de errores de apareamiento de ADN. Por analogía con hMLH1 y hMSH2, las mutaciones en los genes que codifican estas proteínas serían firmes candidatos para un potencial ligamiento al cáncer. Una poderosa aproximación de genética molecular usando levaduras, denominada "sistema de doble híbrido", permite la detección y aislamiento relativamente rápidos de genes que codifican proteínas que interaccionan con un producto génico de interés, por ejemplo, hMLH1^{28}.

El sistema de doble híbrido implica a dos vectores plasmídicos, cada uno de ellos destinados a codificar una proteína de fusión. Cada uno de los vectores contiene una porción, o dominio, de un activador de la transcripción. La célula de levadura usada en el esquema de detección contiene un gen "indicador". El activador solo no puede activar la transcripción. Sin embargo, si los dos dominios se colocan muy próximos, entonces puede producirse la transcripción. El ADNc de la proteína de interés, por ejemplo, de hMLH1 se inserta en una fase de lectura en uno de lo vectores. Esto se denomina "cebo". Una biblioteca de ADNc humanos, insertada en un segundo vector plasmídico para hacer fusiones con el otro dominio del activador transcripcional, se introduce en las células de levadura que portan el vector "cebo". Si una célula de levadura en particular recibe un miembro de la biblioteca que contiene un ADNc humano que codifica una proteína que interacciona con la proteína hMLH1, esta interacción pondrá a los dos dominios del activador transcripcional muy próximos, activará la transcripción del gen indicador y la célula de levadura se volverá azul. A continuación, se secuencia la inserción para determinar si está relacionada con cualquier secuencia de la base de datos. Puede usarse el mismo procedimiento para identificar proteínas de levadura en la reparación de errores de apareamiento de ADN o en un proceso relacionado. La realización de "búsquedas" en levaduras y en humano en paralelo tiene ciertas ventajas. La función de nuevos homólogos de levadura puede determinarse rápidamente en levaduras mediante interrupción génica y el posterior examen de las consecuencias génicas de ser defectuoso en el nuevo gen descubierto. Estos estudios en levaduras ayudarán a guiar el análisis de nuevas proteínas que "interaccionan con hMLH1 o hPMS1" humana en más o menos la misma forma que los estudios en levaduras sobre PMS1 y MLH1 han influenciado en nuestros estudios de los genes MLH1 y PMS1 humanos.

Producción de anticuerpos

Usando nuestro conocimiento de las secuencias de ADN de hMLH1 y hPMS1, podemos sintetizar las estructuras proteicas predichas completas, o porciones de las mismas, con el propósito de producir anticuerpos. Un uso importante para los anticuerpos dirigidos frente a las proteínas hMLH1 y hPMS1 será la captura de otras proteínas que pueden estar implicadas en la reparación de errores de apareamiento de ADN. Por ejemplo, empleando técnicas de inmunoprecipitación conjunta, los anticuerpos dirigidos frente a hMLH1 o hPMS1 pueden precipitar junto con otras proteínas asociadas que estén funcional y/o físicamente relacionadas. Otro uso importante para los anticuerpos será con el fin de aislar las proteínas hMLH1 y hPMS1 a partir de tejido tumoral. A continuación, las proteínas hMLH1 y hPMS1 de tumores pueden caracterizarse con el fin de determinar estrategias de tratamiento apropiadas.

Estamos en el proceso de desarrollar anticuerpos monoclonales dirigidos frente a las proteínas hMLH1 y hPMS1.

Ejemplo 5

También hemos usado el siguiente procedimiento para producir anticuerpos policlonales dirigidos frente a las formas humana y de ratón de la proteína PMS1.

Insertamos un fragmento 3' del ADNc de PMS1 de ratón en el vector plasmídico de expresión bacteriano, pET (Novagen, Madison, WI). La porción expresada esperada de la proteína PMS1 de ratón se corresponde con una región de aproximadamente 200 aminoácidos en el extremo de la proteína PMS1. Esta porción de la mPMS1 está conservada con respecto a la PMS1 de levadura, pero no está conservada con respecto a las proteínas MLH1 humana o de ratón. Una razón por la que seleccionamos esta porción de la proteína PMS1 para producir anticuerpos es que no queríamos que los anticuerpos resultantes tuvieran reacción cruzada con MLH1. El fragmento de la proteína PMS1 de ratón se expresó a niveles elevados en E. coli, se purificó de un gel de poliacrilamida y, a continuación, se preparó la proteína eluída para inyección en animales. Aproximadamente 2 mg del fragmento de la proteína PMS1 se envió a la granja de conejos Pocono (PA) para inyectársela a conejos. Los sueros de los conejos se valoraron múltiples veces frente al antígeno PMS1 usando técnicas convencionales de ELISA. Los anticuerpos de conejo específicos de la proteína PMS1 de ratón se purificaron por afinidad usando columnas que contenían la proteína PMS1 de ratón inmovilizada. La preparación del anticuerpo policlonal purificado por afinidad se analizó adicionalmente usando inmunotransferencia y transferencia en puntos. Encontramos que los anticuerpos policlonales reconocían no sólo a la proteína PMS1 de ratón, sino también a la proteína PMS1 humana que es muy similar. Sobre la base de las inmunotransferencias, no hay indicaciones de que otras proteínas sean reconocidas claramente por nuestro anticuerpo, incluyendo las proteínas MLH1 humanas o de ratón.

Ratones defectuosos en la reparación de errores de apareamiento de ADN Ejemplo 6

Con el fin de crear un sistema de modelo experimental para estudiar defectos en la reparación de errores de apareamiento de ADN y el cáncer resultante en un sistema animal completo, hemos obtenido un ratón defectuoso en la reparación de errores de apareamiento de ADN usando la tecnología de células madre embrionarias (ES). Usando ADN genómico que contiene una porción del gen mPMS1, construimos un vector que tras la recombinación homóloga causa la interrupción del gen mPMS1 cromosómico. Se confirmó que las células ES de ratón de la cepa de ratón 129 contenían un alelo mPMS1 interrumpido. Las células ES se inyectaron en blastocitos hospedadores C57/BL6 para producir animales que eran quiméricos o una mezcla de células 129 y C57/BL6. La incorporación de las células ES se determinó mediante la presencia de manchas de color agouti en el pelaje (indicativo de la contribución de células ES). Todas las quimeras macho se cruzaron con ratones C57/BL6 hembra.

Posteriormente, nacieron doce crías (F_{2}) en las que se detectó el color agouti del pelaje que indicaba la transmisión en la línea germinal del material genético de las células ES. El análisis del ADN extraído de la punta de la cola de las doce crías indicó que seis de los animales eran heterocigotos (contenían un alelo de tipo salvaje y otro mutante) para la mutación mPMS1. De los seis animales heterocigotos, tres eran hembras (animales F_{2}-8, F_{2}-11 y F_{2}-12) y tres eran machos (F_{2}, F_{2}-10 y F_{2}-13). Se establecieron cuatro jaulas de cría para obtener ratones que fueran homocigotos para la mutación mPMS1 y más ratones heterocigotos. La jaula de cría Nº 1 que contenía los animales F_{2}-11 y F_{2}-10, dio un total de trece ratones en tres camadas, cuatro de los cuales se han genotipado. La jaula Nº 2 (animales F_{2}-8 y F_{2}-13) dio veintidós animales y tres camadas, tres de los cuales se han genotipado. De los siete animales genotipados, se han identificado tres animales homocigóticos hembra. Un animal murió a las seis semanas de edad por causas desconocidas. Las restantes hembras homocigotas están vivas y sanas a las doce semanas de edad. Los resultados indican que los ratones homocigotos defectuosos para mPMS1 son viables.

Las jaulas de cría Nº 3 y 4 se usaron para retrocruzar la mutación de mPMS1 con el fondo genético de C57/BL6. La jaula de cría Nº 3 (animal F_{2}-12 cruzado con un ratón C57/BL6) produjo veintiún animales en dos camadas, nueve de los cuales se han genotipado. La jaula de cría Nº 4 (animal F_{2}-6 cruzado con un ratón C57/BL6) dio ocho ratones. Además, el macho quimera original (jaula de cría Nº 5) produjo treinta y una crías adicionales.

Para genotipar a los animales, se desarrollaron una serie de cebadores para PCR que se usaron para identificar genes de mPMS1 mutantes y de tipo natural. Estos son: (ID SEC Nº 143-148, respectivamente)

Cebador 1:

5'TTCGGTGACAGATTTGTAAATG-3'

Cebador 2:

5'TTTACGGAGCCCTGGC-3'

Cebador 3:

5'TCACCATAAAAATAGTTTCCCG-3'

Cebador 4:

5'TCCTGGATCATATTTTCTGAGC-3'

Cebador 5:

5'TTTCAGGTATGTCCTGTTACCC-3'

Cebador 6:

5'TGAGGCAGCTTTTAAGAAACTC-3'

Cebadores 1 + 2 (marcado en 5')

Cebadores 1 + 3 (no marcado en 5')

Cebadores 4 + 5 (marcado en 3')

Cebadores 4 + 6 (no marcado en 3')

Los ratones que hemos desarrollado proporcionan un sistema de modelo animal para estudiar las consecuencias de defectos en la reparación de errores de apareamiento y en el CCHNP resultante. Se determinará la supervivencia a largo plazo de los ratones homocigotos y heterocigotos para la mutación en mPMS1 y los tipos y el momento de aparición de tumores en estos ratones. Se analizará diariamente en los ratones cualquier indicio de aparición de cáncer que venga indicado por una apariencia abultada en combinación con un estado de deterioro del pelaje. Estos ratones que portan la mutación en mPMS1 se usarán para analizar los efectos de otros factores, ambientales y genéticos, sobre la formación de tumores. Por ejemplo, el efecto de la dieta sobre los tumores de colon y otros tipos de tumores puede compararse entre ratones normales y aquellos que portan la mutación en mPMS1 en el genotipo heterocigoto y homocigoto. Además, la mutación en mPMS1 puede ponerse en diferentes fondos genéticos para aprender sobre las interacciones entre genes de la ruta de reparación de errores de apareamiento y otros genes implicados en el cáncer humano, por ejemplo, p53. Los ratones que portan las mutaciones en mPMS1 también serán útiles para analizar la eficacia de la terapia génica somática sobre los cánceres que aparecen en ratones, por ejemplo, los cánceres de colon esperados. Adicionalmente, pueden establecerse líneas celulares isogénicas de fibroblastos a partir de ratones homocigotos y heterocigotos para mPMS1 para su uso en diversos estudios celulares, incluyendo la determinación de frecuencias de mutación espontáneas.

Actualmente estamos construyendo un vector para interrumpir el gen mMLH1 de ratón para obtener ratones que porten una mutación en mMLH1. Compararemos ratones que porten defectos en mPMS1 con ratones que porten defectos en mMLH1. Además, obtendremos ratones que porten mutaciones en ambos genes para ver si hay un efecto sinérgico por tener mutaciones en dos genes asociados con CCHNP. Otros estudios sobre los ratones mutantes para mMLH1 serán como los descritos anteriormente para los ratones mutantes en mPMS1.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Liskay, Robert M.

\hskip4.1cm

Bronner, C. Eric

\hskip4.1cm

Baker, Sean M.

\hskip4.1cm

Bollag, Roni J.

\hskip4.1cm

Kolodner, Richard D.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS CON GENES DE REPARACIÓN DE ERRORES DE APAREAMIENTO DE ADN

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 148

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Kolisch, Hartwell, Dickinson, McCormack y Heuser

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(B)

CALLE: 520 S.W. Yamhill Street, Suite 200

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(C)

CIUDAD: Portland

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(D)

ESTADO: Oregón

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 97204

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(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM compatible con PC

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Van Ryseelberghe, Pierre C..

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.557

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: OHSU 306B

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (503) 224-6655

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (503) 295-6679

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 360619

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 361 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 538 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 607 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.484 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 756 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 397 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 393 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 352 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 287 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 336 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 275 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 389 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 381 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 526 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 434 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 458 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 618 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 478 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 377 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 325 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 341 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 260 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 340 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 563 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 137 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 99 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 30:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTCAGTA CACAATGCAG GCATTAGTTT CTCAGTTAAA AAA

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 89 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 32:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 33:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 34:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 154 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 35:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 371 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 36:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 149 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 37:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 109 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 38:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 39:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 165 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 40:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 41:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 42:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 360 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 43:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCACTGAG GTGATTGGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTAGCCCT TAAGTGAGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATATGTACA TTAGAGTAGT TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAGAAAGG TCCTGACTC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGATTTGG AAAATGAGTA AC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAATGTCAT CACAGGAGG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCTTTCCC TTTGGTGAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTACTCTG AGACCTAGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTTCTCT TTTCCCCTTG GG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAACAAAGC TTCAACAATT TAC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTTTTATT TTCAAGTACT TCTATG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCAGCAAC TGTTCAATGT ATGAGC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTGTGTG TTTTTGGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATAACCTTA TCTCCACC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAGCCATG AGACAATAAA TCC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTCCCAA TAATGTGATG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAAGCTTC AGAATCTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGGGTGT TTCCTGTGAG TGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGACTTTG TGTGAATGTA CACC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGAGAGCC TGATAGAACA TCTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCTTTTTC TCCCCCTCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAATCTGGG CTCTCACG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTATACCT CATACTAGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTATTAC AGAATAAAGG AGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCCAAGT TAGAAGGCA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCAACCCAC AAAATTTGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTCTCCAT TTCCAAAACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTGTCTCT AGTTCTGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTGTTGTA GTAGCTCTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCATTTGTC CCAACTGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTCAGTTG AAATGTCAG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTTGGATG CTCCGTTAAA GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCCFFCTG GAAATTTAT TTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAAGGCAC TGGAGAAATG GG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTCCAGCA CACATGCATG TACCG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGTAGTCT GTGATCTCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTATGAGG TCCTGTCC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACACCAGTG TATGTTGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAAAGAAG AACACATCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTCA CTGAGGTGAT TGGCTGAA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGCCCTTAA GTGAGCCCG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTA CATTAGAGTA GTTGCAGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCCTGAC TCTTCCATG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTT GGAAAATGAG TAACATGATT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTCATCACA GGAGGATAT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTCT TTCCCTTTGG TGAGGTGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACTCTGAGA CCTAGGCCCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTC TCTTTTCCCC TTGGGATTAG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAAAGCTTC AACAATTTAC TCT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTGT TTTATTTTCA AGTACTTCTA TGAATT

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCAACTGT TCAATGTATG AGCACT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTGT GTGTGTTTT GGAAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCTTATCT CCACCAGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTAG CCATGAGACA ATAAATCCTTG

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCAAATAA TGTGATGGAA TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTAA GCTTCAGAAT CTCTTTT

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGTGTTTC CTGTGAGTGG ATT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CCGCCAGTAC TTTGTGTGAA TGTACACCTG TG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGCCTGA TAGAACATCT GTTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTCT TTTTCTCCCC CTCCCACTA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGGCTCT CACGTCT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTATTCTGA GTCTCTCC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTGT TTGCTCAGAG GCTGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 107:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGSTTCGT ACAGATTCCC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 108:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTT ATTACAGAAT AAAGGAGGTA G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 109:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTAA CCCACAAAAT TTGGCTAAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 110:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCCATTTC CAAAACCTTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 111:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTCTCTAGT TCTGGTGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 112:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTG TTGTAGTAGC TCTGCTTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 113:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTGTCCCA ACTGGTTGTA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 114:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTC AGTTGAAATG TCAGAAGTG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 115:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 116:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGCTGGAA ATTTTATTTG GAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 117:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTAG GCACTGGAGA AATGGGATTT G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 118:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCAGCACAC ATGCATGTAC CGAAAT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 119:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGTCTGTG ATCTCCGTTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 120:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTTA TGAGGTCCTG TCCTAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 121:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCAGTGTAT GTTGGGATG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_característica

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "cebadores dirigidos hacia un intrón de ADN genómico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 122:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAACGA CGGCCAGTGA AAGAAGAACA CATCCCACA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 770 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 123:

54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 124:

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 125:

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 126:

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 127:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 128:

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 129:

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 130:

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 131:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 131:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 132:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.687 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN EN EL MAPA: 7q

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 132:

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 133:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 862 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 133:

\vskip1.000000\baselineskip

67

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 134:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 903 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 134:

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 135:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.577 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 135:

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 136:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 728 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 136:

\vskip1.000000\baselineskip

76

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 137:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3.065 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 137:

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 138:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 864 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 138:

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 139:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 139:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGATTCTA GAGCYTCNCC NCKRAANCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 140:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 140:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCGGAGC TCAARGARYT NGTNGANAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 141:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 141:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTGTGGAT TTTGC

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 142:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 142:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTGTGAAT TTTGC

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 143:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 143:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGGTGACA GATTTGTAAA TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 144:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 144:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACGGAGC CCTGGC

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 145:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 145:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACCATAAA AATAGTTTCC CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 146:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 146:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGGATCA TATTTTCTGA GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 147:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 147:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCAGGTAT GTCCTGTTAC CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 148:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 148:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGGCAGCT TTTAAGAAAC TC

\hfill

22

Claims (17)

1. Un procedimiento para diagnosticar la susceptibilidad al cáncer de colon de un sujeto que comprende:

detectar la presencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico de hMLH1 que puede obtenerse:

(i)

preparando un primer cebador degenerado que se corresponde con la secuencia de aminoácidos GFRGEA y un segundo cebador degenerado que tiene la secuencia de la ID SEC Nº 140.

(ii)

realizando una PCR usando dichos cebadores con el ADNc obtenido a partir de un cultivo primario de fibroblastos humanos para generar un producto de PCR, y;

(iii)

aislando la secuencia completa de hMLh1 a partir de una biblioteca de ADNc humano usando dicho producto como sonda,

en el que dicha mutación se detecta comparando una secuencia de hMLH1 aislada a partir de un tejido del sujeto con una secuencia de hMLH1 de tipo natural, siendo la presencia de una mutación indicativa de la susceptibilidad del sujeto al cáncer de colon, y en el que la mutación se caracteriza por una mutación de transición de C a T que produce una sustitución de aminoácido no conservadora en la posición 44 de la proteína hMLH1 (ID SEC Nº 5).

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que la secuencia de ácido nucleico de hMLH1 tiene la secuencia de ID SEC Nº 4.

3. Un procedimiento para diagnosticar la suceptibilidad al cáncer de colon de un sujeto que comprende:

detectar la presencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico de hPMS1 que tiene la secuencia de ID SEC Nº 132,

en el que dicha mutación se detecta comparando una secuencia de ácido nucleico de hPMS1 aislado a partir de un tejido del sujeto con una secuencia hPMS1 de tipo natural, respectivamente, siendo la presencia de una mutación indicativa de la susceptibilidad del sujeto al cáncer de colon.

4. Un procedimiento para diagnosticar la susceptibilidad al cáncer de colon de un sujeto que comprende:

detectar la unión de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de hMLH1 que tiene la secuencia de la ID SEC Nº 5 o un polipéptido hPMS1 que tiene la secuencia de la ID SEC Nº 133 con una muestra obtenida del sujeto,

siendo la cantidad de unión de dicho anticuerpo indicativa de la susceptibilidad del sujeto al cáncer de colon.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 en el que la etapa de detección comprende;

amplificar un segmento de la secuencia hMLH1 aislada;

comparar el segmento amplificado con un segmento análogo de la secuencia hMLH1 de tipo natural; y

detectar una diferencia entre el segmento amplificado y el segmento análogo, siendo la diferencia indicativa de la mutación de transición de C a T en la secuencia hMLH1.

6. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que la etapa de detección comprende;

amplificar un segmento de la secuencia de hPMS1 aislada;

comparar el segmento amplificado con un segmento análogo de la secuencia de hPMS1 de tipo natural; y

detectar una diferencia entre el segmento amplificado y el segmento análogo, siendo la diferencia indicativa de una mutación en la secuencia de hPMS1.

7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que la diferencia en la secuencia de nucleotidos se selecciona entre el grupo constituido por delecciones de al menos un nucleótido, inserciones de al menos un nucleotido, sustituciones de al menos un nucleótido y reordenamiento de nucleótidos.

8. El procedimiento de la reivindicación 5 y de la reivindicación 6 en el que la etapa de amplificación comprende:

transcribir de forma inversa un producto génico de ARN completo, o una porción de éste, a ADN; y

amplificar un segmento del ADN producido mediante transcripción inversa.

9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que la etapa de amplificación comprende:

seleccionar un par de cebadores oligonucleotídicos capaces de hibridar con hebras opuestas del segmento de ADN y en orientación opuesta; y

realizar una reacción en cadena de la polimerasa utilizando los cebadores oligonucleotídicos de modo que se amplifica el ácido nucleico que está entre los cebadores para dar lugar al segmento amplificado.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la etapa de detección de una mutación comprende determinar si la diferencia entre el segmento amplificado y el segmento análogo da lugar a un fenotipo afectado.

11. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína de reparación de errores de apareamiento de ADN y comprende la secuencia de la ID SEC Nº 132.

12. Un polipéptido de reparación de errores de apareamiento de ADN aislado codificado por el polinucleótido aislado de la reivindicación 11.

13. Un polipéptido de reparación de errores de apareamiento aislado de ADN que tiene la secuencia de la ID SEC Nº 133.

14. Un anticuerpo purificado que se une específicamente a un polipéptido según la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

15. Un anticuerpo según la reivindicación 14 en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

16. Una sonda que comprende:

una secuencia de nucleótidos de menos de 500 pb capaz de unirse específicamente mediante apareamiento de Watson y Crick con una Tm mayor de 55ºC a bases complementarias de la ID SEC Nº 4; y

un resto marcado unido a la secuencia;

en la que el resto marcado tiene una propiedad seleccionada entre el grupo constituido por fluorescencia, radioactividad y quimioluminiscencia.

17. Una sonda que comprende:

una secuencia de nucleótidos capaz de unirse específicamente mediante apareamiento de Watson y Crick con una Tm mayor de 55ºC a bases complementarias de la ID SEC Nº 132; y

un resto marcado unido a la secuencia, en el que el resto marcado tiene una propiedad seleccionada entre el grupo constituido por fluorescencia, radiactividad y quimioluminiscencia.