JP2005505272A - 双極性障害と関連する脳で発現されるｃａｐ−２遺伝子およびタンパク質 - Google Patents
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Abstract
我々は以前に双極性（ＢＰ）障害の候補領域として１８ｑ２１．３３−ｑ２３を同定し、そして酵母人工染色体（ＹＡＣ）コンティグ地図を構築した。次の段階として、我々はこの領域から全てのＣＡＧ／ＣＴＧ反復を単離しそして解析し、それらをＢＰ障害への関与から除外した。今回、該領域から全てのＣＣＧ／ＣＧＧ反復を同定する過程において、我々はセルピンをコードする６個の遺伝子のクラスターを見出した。それらのうちの一つ、１８ｑ２１．３に位置するＣＡＰ２に関して、突然変異解析を行った。このようにして同定された一塩基多型（全部で６種）の解析によりＢＰ障害とＳＮＰ ｃ．９４２Ｇ＞Ｔとの統計的に有意な関連が示された。従って、個体からのサンプルにおいて、個体のＣＡＰ２遺伝子における一塩基多型を決定すること、およびＣＡＰ２遺伝子における多型を参照することにより個体の状態を決定することを含んでなる個体におけるＢＰもしくはＢＰに対する感受性を診断する方法を提供することは本発明の目的である。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広範には精神医学的健康と関連する遺伝因子の決定に関する。さらに特に、本発明は、罹患個体およびそれらの家系における気分障害もしくは関連疾患に関係があるヒト遺伝子に関する。特に、本発明は、細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）をコードする遺伝子に関する。該遺伝子は第１８染色体上に位置し、そして脳組織において発現され、そして双極性障害の診断マーカーとして用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
薬理遺伝学背景：
あらゆる個体は、それらの遺伝子および環境の相互作用の産物である。薬理遺伝学は、遺伝的な違いが薬剤に対する患者応答の変動にどのように影響を及ぼすかという研究である。薬理遺伝学の使用によって、我々はまもなく特定の医薬に対する応答を予測するために個体のＤＮＡ間の変異の概略を提示することができる。ヒトにおける臨床徴候の忍容性に優れ且つ有効な医薬を予測する標的検証は広く認められている問題であるが；真の難題は標的選択である。高処理量スクリーニングが現在可能である、受容体および酵素を包含する、限られた数の分子標的ファミリーが同定されている。優れた標的は、有効な分子（ヒット）を同定するためにそれに対して多数の化合物を迅速にスクリーニングすることができるものである。これらのヒットは、忍容性に優れ且つ有効な医薬の性質を有する最適化分子（リード（ｌｅａｄ））に発展させることができる。疾病もしくは臨床徴候について検証することができる標的の選択は、製薬産業が直面する主要な問題である。最もよく検証された標的は、ヒトにおける忍容性に優れ且つ有効な医薬をすでに産み出しているもの（先例標的）である。多数の標的が科学的仮説に基づいて選択され、そして最初の仮説がたいていその後に反証されるので有効な医薬につながらない。
【０００３】
高処理量標的としての用途に遺伝子を同定しそしてそれらのタンパク質生成物を発現するために２つの幅広い戦略が用いられている。ゲノム学および遺伝学のこれらの方法は技術を共有するが、異なる科学的戦略および投資を意味する。発見ゲノム学は、疾病に遺伝学的に関連することが知られていない扱いやすいもしくはスクロール可能な標的の遺伝子および遺伝子のファミリーを同定するためにＤＮＡ配列情報の増加する数のデータベースを用いる。
【０００４】
患者から得られる疾病感受性遺伝子に関する情報の利点は、定義により、これらの遺伝子が疾病への患者の遺伝的寄与に関係があることである。しかしながら、大部分の感受性遺伝子は、扱いやすい標的ではないかもしくは有効な化合物を同定するための高処理量スクリーニング方法が容易にできない。
【０００５】
関連する遺伝子変異体に関する差次的代謝は、疾病の発症もしくは進行の機構を発見するために集中的な機能性ゲノムおよびプロテオーム技術において研究することができる。
【０００６】
改変された代謝と関連する受容体の重要な酵素は、標的として用いることができる。適切な細胞代謝に対する特定の感受性遺伝子変異体の役割に焦点を合わせる遺伝子→機能→標的（ｇｅｎｅ−ｔｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ）戦略は重要になる。
【０００７】
強力な生物情報学手段でのヒトゲノムプロジェクトおよび同様のプログラムからの配列のデータ採掘は、同様の配列を有するドメインを位置づけることにより遺伝子ファミリーを同定することを可能にしている。これらのゲノム戦略により同定される遺伝子は、一般に、ある種の機能的検証もしくは疾病プロセスとの関連性を必要とする。遺伝子と疾病との間の関連性を示すために差次的遺伝子発現、トランスジェニック動物モデル、プロテオミクス、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学のような技術が用いられる。
【０００８】
ゲノム方法と遺伝的方法との間の主要な違いは標的選択であり、それは疾病プロセスに関与することがすでに既知である遺伝子および変異体特異的標的を遺伝学的に特定した。疾病との関連性の探求における各遺伝子での非特異的な大規模な遺伝子同定のための発見ゲノム学の最近の流行は、医薬の開発の大きな機会を生み出す。
【０００９】
薬剤開発の中核となる問題は乏しい標的選択であると認識することもまた重要である。疾病関連検証を示すための実証されていない技術のスクリーニング使用、およびヒトにおける概念の実証へ各選択遺伝子を進めるのに必要な莫大な投資は、「検証」という言葉の実証されていないそして無頓着な使用に基づく。各失敗は、損失時間および金銭において非常に高くつく。例えば、差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）およびプロテオミクスは、標的検証に広く用いられるスクリーニング技術である。これらは、組織における遺伝子およびタンパク質発現の異なるレベルおよび／もしくはパターンを検出し、その組織を冒す疾病との関連性を示すためにそれらを用いることができる。
気分障害背景：
気分障害もしくは関連疾患には、精神障害の診断および統計マニュアル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、バージョン４（ＤＳＭ−ＩＶ）分類学ＤＳＭ−ＩＶコードを括弧に入れて）において特定されるような以下の疾患：気分障害（２９６．ＸＸ，３００．４，３１１，３０１．１３，２９５．７０）、統合失調症および関連疾患（２９５．ＸＸ，２９７．１，２９８．８，２９７．３，２９８．９）、不安障害（３００．ＸＸ，３０９．８１，３０８．３）、適応障害（３０９．ＸＸ）および人格障害（コード３０１．ＸＸ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明は、特に、双極性（ＢＰ）スペクトル障害として知られている気分障害の家系と関連する遺伝因子に関する。双極性障害（ＢＰ）は、高揚感の極度の状態（躁病）から抑うつの重い状態（鬱病）までにおよぶ気分の障害を特徴とする重度の精神医学症状である。２つのタイプの双極性障害が記述されている：Ｉ型ＢＰ障害（ＢＰＩ）は、躁病の相と交互に起こる大鬱病エピソードを特徴とし、そしてＩＩ型ＢＰ障害（ＢＰＩＩ）は、軽躁の相と交互に起こる大鬱病エピソードを特徴とする。ＢＰ発端者の親族は、ＢＰ、単極性障害（鬱病エピソードを経験するだけの患者；ＵＰ）、循環気質（小鬱病および軽躁エピソード；ｃｙ）、並びに躁病（ＳＡｍ）および鬱病（ＳＡｄ）タイプの統合失調性感情障害の増大した危険性を有する。これらの結果に基づいて、ＢＰ、ｃＹ、ＵＰおよびＳＡはＢＰスペクトル障害と分類される。
【００１１】
ＢＰスペクトル障害の病因への遺伝因子の関与は、家系、双子および養子縁組研究により示唆された（非特許文献１）。しかしながら、伝達の正確なパターンは不明である。いくつかの研究において、複雑な分離解析によりＢＰの単一の主要な遺伝子座の存在が裏付けられる（非特許文献２）。他の研究者等は、罹患性閾値モデルを提示し、ここで、疾病を発症する罹患性は、多数の遺伝および環境作用の加法的組み合わせに起因する（非特許文献３）。
【００１２】
遺伝の複雑な形式のために、ＢＰ障害がメンデルの法則のように伝達されると思われる家系においてパラメーターおよび非パラメーター連鎖戦略が適用される。染色体１１ｐ１５（非特許文献４）およびＸｑ２７−ｑ２８（非特許文献５；非特許文献６）上の初期の連鎖結果は議論の余地があり、そして最初は再現することができなかった（非特許文献７；非特許文献８）。高度に多型のマーカーで飽和したヒト遺伝子地図の開発およびデータ解析技術の絶え間ない発展とともに、多数の新しい連鎖検索が行われた。いくつかの研究において、第４、１２、１８、２１およびＸ染色体上の特定の領域への連鎖の証拠もしくは示唆的証拠が見出された（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１３）。報告された連鎖結果の正当性を試験するために、これらの結果は他の独立した研究において再現されなければならない。
【００１３】
最近、第１８染色体上のセントロメア周囲（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）領域への双極性障害の連鎖が報告された（非特許文献１１）。１８ｐｔｅｒ−ｐ１１および１８ｑ２３−ｑｔｅｒで切断点および欠失領域を有する環状第１８染色体もまた、ＢＰ障害もしくは関連症候群にかかっている３人の関係のない患者において報告された（非特許文献１０）。染色体１８ｐ連鎖はＳｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１４）によって再現され、彼らはまた、同じ研究において１８ｑ２１．２−ｑ２１．３２上の遺伝子座の示唆的証拠も報告した。
【００１４】
興味深いことに、Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．は親由来効果（ｐａｒｅｎｔ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ ｅｆｆｅｃｔ）を認め：連鎖の証拠は父方の家系において最も強く、ここで、発端者の父もしくは発端者の父の兄弟姉妹の一人が罹患している。いくつかの研究は、ＢＰ障害を伝達する家系における表現促進を記述し（非特許文献１５、非特許文献１６）、ＣＡＧ／ＣＴＧ、ＣＣＧ／ＣＧＧもしくはＧＡＡ／ＴＴＣ反復の増加によって引き起こされる多数の疾病が表現促進を示すこと（非特許文献１７により概説される）を考慮して、トリヌクレオチド反復増加（ＴＲＥ）の関与を示唆する。潜在的に増加した反復を見出そうとする以前の取り組みは、ＣＣＧ／ＣＧＧ反復の検索が増えているが、主としてＣＡＧ／ＣＴＧ反復に集中している（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。以前に、我々は三塩基反復の領域特異的単離の新規な方法：三塩基反復ＹＡＣ断片化に関して報告した（非特許文献２２）。これはＣＡＧ／ＣＴＧ反復の単離の有効な方法であると判明し、そしてこの方法を用いて、我々は１８ｑ２１．３３−ｑ２３の範囲内から双極性障害へのＣＡＧ／ＣＴＧ反復の関与を除外した（非特許文献２３）。本発明はＣＣＧ／ＣＧＧ反復の領域特異的単離の方法を適応させ、そしてそれを染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３ ＢＰ候補領域に適用した。
【非特許文献１】
Ｔｓｕａｎｇ ａｎｄ Ｆａｒａｏｎｅ（１９９０），ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｏｏｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）
【非特許文献２】
Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．）ＱＱ ｐｐ３７０−３７６
【非特許文献３】
ＭｕＧｕｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ；Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ ｐｐ１１０−１２７
【非特許文献４】
Ｅｇｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ 〜 ｐｐ７８３−７８７
【非特許文献５】
Ｍｅｎｄｌｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７，ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １ ｐｐ１２３０−１２３２）
【非特許文献６】
Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ １２＆ｐｐ２８９−２９２
【非特許文献７】
Ｋｅｌｓｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ 〜 ｐｐ２３８−２４３
【非特許文献８】
Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ 〜 ｐｐ４９−５５
【非特許文献９】
Ｂｌａｃｋ ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 〜 ｐｐ４２７−４３０
【非特許文献１０】
Ｃｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒｉｔ Ｊ．ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ 〜 ｐｐ３５５−３５８
【非特許文献１１】
Ｂｅｒｒｅｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 〜 ｐｐ５９１８−５９２１
【非特許文献１２】
Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 〜 ｐｐ２９１−２９６
【非特許文献１３】
Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２ ｐｐ１０５−１１５
【非特許文献１４】
Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２２ ｐｐ１３８４−１３９４
【非特許文献１５】
ＭｃＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ １９９３
【非特許文献１６】
Ｎｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ １９９４
【非特許文献１７】
Ｍａｒｇｏｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９
【非特許文献１８】
Ｋｌｅｉｄｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９８
【非特許文献１９】
Ｍａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ １９９８
【非特許文献２０】
Ｅｉｃｈｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ １９９８
【非特許文献２１】
Ｋａｕｓｈｉｋ ｅｔ ａｌ ２０００
【非特許文献２２】
Ｄｅｌ Ｆａｖｅｒｏ ｅｔ ａｌ １９９９
【非特許文献２３】
Ｇｏｏｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ ２０００
【発明の開示】
【００１５】
［発明の要約］
本発明は、新規な単離された核酸配列および単離された核酸配列によりコードされる細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）タンパク質に関する。
【００１６】
新規な単離された核酸配列は、１８ｑ２１．３３−ｑ２３でＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間にある８．９ｃＭ染色体領域に位置する。酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Ｖｅｒｈｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ １９９９）を用いて物理的地図を構築した。
【００１７】
以前に記述した方法をＣＣＧ／ＣＧＧ反復の領域特異的単離に適応させ、そして染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３ ＢＰ候補領域に適用した。ＹＡＣコンティグ地図により、セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）をコードする６個の遺伝子のクラスターのＢＰ候補領域内の局在が裏付けられた。セルピンは、α１−プロテイナーゼインヒビターに高い全体的な相同性を有するタンパク質分解タンパク質のスーパーファミリーである。６個のセルピンは全て、典型的なアミノ末端の切断可能なシグナルペプチドを欠きそして細胞内もしくは両方であることができるセルピンのオボアルブミンファミリーに属する。ＣＡＰ２もしくは１８ｑ２１．３３に位置するＰ１８は、その５’ＵＴＲ領域に組み合わされたＣＡＧ−ＣＧＧ三塩基反復配列を含有し、そして脳において発現される。この研究において、我々はＣＡＰ２のゲノム構成およびエキソン／イントロン境界を決定し、そして配列変異体の一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析および変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）により該遺伝子を調べた。シーケンス、ＲＦＬＰ−ＰＣＲもしくはパイロシーケンスによる６種の一塩基多型（ＳＮＰ）の解析を７５人の症例および７５人の一致するコントロールのサンプルにおいて行った。
［発明の詳細な記述］
本発明は、第１８染色体の１８ｑ染色体候補領域に位置する遺伝子を含んでなる新規な単離された核酸配列に関する。
【００１８】
該遺伝子は、双極性スペクトル障害のような気分障害と関連する染色体領域に位置し、従って、双極性スペクトル障害の診断マーカーとして有用である。問題の領域はまた、ヒトゲノムの全体から取り除いた場合に、精神医学的健康および気分に影響を与える他の遺伝子を位置づけ、単離しそしてシーケンスするために用いることもできる。
【００１９】
特に、ＢＰ候補領域は、多数の細胞内および細胞外機能に関与する脳で発現されるセルピン、細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）をコードする遺伝子を含有する。本研究において、我々はＣＡＰ２のゲノム構成を決定し、そして全てのイントロン／エキソン境界を特定した。ＣＡＰ２は、概算される１７ｋｂのゲノム領域内に７個のエキソンを含んでなる。
【００２０】
ＣＡＰ２の突然変異解析により、３種の非同義一塩基多型（ＳＮＰ）：ｃ．２０３Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ６９Ｇｌｎ）、ｃ．９１０Ａ＞Ｇ（Ｔｈｒ３０４Ａｌａ）およびｃ．１０７６Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３５９Ｈｉｓ）；２種の同義ＳＮＰ ｃ．４７７＞Ｇおよびｃ．９４２＞Ｔならびに１種のイントロンＳＮＰ ＩＶＳ４＋９８Ａ＞Ｇが同定された。関係のないＢＰ症例および一致するコントロールにおけるＣＡＰ２多型の解析により、対立遺伝子および遺伝子型頻度においてＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞Ｔで統計的に有意な差が示された（ｐ＝０．０３）。
新規な遺伝子の単離および同定：
関連する遺伝子を同定しそして特性化する過程において、同定されたＹＡＣクローンにそして適用できる場合には本明細書において特定するような気分障害に苦しむ個体からのＤＮＡに、当業者に周知である標準的方法を適用した。例えば、本発明者等は、ヒト第１８染色体上の対象の領域中の候補遺伝子を同定する目的で、選択したＹＡＣクローンにおけるＴＲＥについてスクリーニングするために、ヒトゲノム内のトリヌクレオチド反復増加（ＴＲＥ）と気分障害における表現促進の現象との間の以前に同定された明白な関連（Ｌｉｎｄｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ２．ｐｐ５５−６２およびＯ’Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １Ｑ ｐｐ３８０−３８１）を利用することができる。様々な他の既知の方法もまた、以下に説明するように候補遺伝子を同定するために該ＹＡＣクローンに適用することができる。
【００２１】
従って、第一の態様として、本発明は、上記に特定するような気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定するための多型マーカーＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に配置されるヒト染色体１８ｑの８．９ｃＭ領域もしくはその断片の使用を含んでなる。以下に記述するように、本発明者等は、Ｄ１８Ｓ５１とＤ１８Ｓ６１との間に以前に位置づけられた１２のＳＴＲ多型マーカーと家系ＭＡＤ３１における双極性障害との共分離の解析およびその後の対立遺伝子共有解析により、そのような遺伝子の染色体１８ｑのこの候補領域を同定している。
【００２２】
本発明に従って用いることができる候補領域を含む特定のＹＡＣは、９６１．ｈ−９、９４２−ｃ．３、７６６−ｆ−１２、７３１−ｃ−７、９０７．ｅ．１、７５２−ｇ−８および７１７−ｄ−３であり、好ましいものは９６１ｈ−９、７６６．ｆ．１２および９０７−ｅ．１であり、これらは、候補領域にわたる最小のタイリング経路（ｔｉｌｉｎｇ ｐａｔｈ）を有するからである。使用のために適当なＹＡＣクローンは、Ｄ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間の絞り込んだ候補領域にわたる人工染色体を有するものである。
【００２３】
気分障害もしくは関連疾患と関連する１個もしくは複数の候補遺伝子を同定するために、ＹＡＣに存在するかどうかを問わず、上記に特定するような染色体１８ｑの候補領域に適用することができる多数の方法がある。例えば、上記のように、ヒトゲノムにおけるトリヌクレオチド反復増加（ＴＲＥ）の程度と気分障害の存在との間には明白な関連がある。
【００２４】
従って、第三の態様として、本発明は、多型マーカーＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に配置されるヒト染色体１８ｑの領域におけるヌクレオチド三塩基反復を検出することを含んでなる本明細書において特定するような気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定する方法を含んでなる。
【００２５】
該遺伝子もしくは複数の遺伝子を同定する代わりの方法は、多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間に配置されるヒト染色体１８ｑの部分を含んでなるＹＡＣクローン、例えば７個の上記のＹＡＣクローンの一つもしくはそれ以上を断片化すること、および該断片における任意のヌクレオチド三塩基反復、特にＣＡＧもしくはＣＴＧの反復を検出することを含んでなる。少なくとも５個そして好ましくは少なくとも１０個のＣＴＧおよび／もしくはＣＡＧ三塩基反復を含んでなる核酸プローブは、適切に標識した場合に検出の適当な手段である。トリヌクレオチド反復はまた、既知のＲＥＤ（反復増加検出）系（Ｓｈａｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 〜 ｐｐ１３５−１３９）を用いて決定することもできる。
【００２６】
第四の態様として、本発明は、気分障害もしくは関連疾患と関連しそして多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間のヒト染色体１８ｑの領域にわたるＹＡＣクローンに存在する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つの遺伝子を同定する方法を含んでなり、該方法は、少なくとも８個であるが好ましくは少なくとも１２個の連続したグルタミン残基の列を含んでなるアミノ酸配列を有するタンパク質を認識することができる抗体の使用によりヌクレオチド三塩基反復を含む遺伝子の発現生成物を検出するという工程を含んでなる。そのような方法は、ヒトＤＮＡ発現ライブラリーに、例えば７個の上記のＹＡＣクローンから、ＹＡＣ ＤＮＡをサブクローニングすることにより実施することができる。関連する発現生成物を検出する好ましい手段はモノクローナル抗体、特にｍＡＢ１Ｃ２の使用により、その製造および特性は国際特許出願公開第ＷＯ ９７／１７４４５号に記述されている。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、ＢＡＣ（細菌人工染色体）もしくはＰＡＣ（Ｐ１もしくはファージ人工染色体）のようなベクターまたはエキソン−トラップ（ｅｘｏｎ−ｔｒａｐ）コスミドベクターのようなコスミドベクターへの上記に特定するような（ＹＡＣ）ＤＮＡの（サブ）クローニングを含む関連する遺伝子もしくは複数の遺伝子を同定する方法に関する。そのような方法の出発点は、多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間のヒト染色体１８ｑの領域のコンティグ地図の構築である。この目的のために、本発明者等は、７個の上記のＹＡＣクローンの各々におけるヒトＤＮＡの断片の末端領域をシーケンスし、そしてこれらの配列を本明細書に開示する。上記のような他のベクターへのＹＡＣ ＤＮＡのサブクローニングの後、該サブクローンとコンティグ地図との間の重複部分を検出することができるように、本明細書に示すＹＡＣクローンコンティグに記述するような、この領域における任意の既知の配列標識部位（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）と一緒に、これらの末端配列もしくはその一部、特に本明細書において図１〜１１に示す配列を含んでなるプローブを構築することができる。現在のＹＡＣコンティグにおける既知の配列もまた、コンティグ地図サブクローンの作製に用いることができる。
【００２８】
気分障害もしくは関連疾患と関連する１個もしくは複数の遺伝子を同定することができる一つの手段は、エキソントラッピング（ｅｘｏｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ）の既知の技術の使用による。これは、特殊化したエキソン−トラップコスミドベクターの現在のプロトコルにおいてほとんどの場合利用する人工ＲＮＡスプライシングアッセイである。該ベクターは、複製起点および強力なプロモーター配列を含有するＳＶ４０ゲノムの断片、多数のクローニング部位を含有するイントロンで隔てられた２個のスプライシング能力を有するエキソンならびにＳＶ４０ポリアデニル化部位からなる人工ミニ遺伝子を含有する。
【００２９】
ＹＡＣ ＤＮＡをエキソン−トラップベクターにサブクローニングし、そして組換えＤＮＡを哺乳動物細胞の株にトランスフェクションする。ＳＶ４０プロモーターからの転写はＲＮＡ転写産物をもたらし、それは、通常、ミニ遺伝子の２個のエキソンを含むようにスプライシングする。クローニングしたＤＮＡ自体が機能性のエキソンを含有する場合、それはベクターのミニ遺伝子に存在するエキソンにスプライシングされることができる。逆転写酵素を用いてｃＤＮＡコピーを作ることができ、そして特定のＰＣＲプライマーを用いて、インサートＤＮＡのエキソンに関するスプライシング事象を同定することができる。そのような方法は、関連する遺伝子を同定するために気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体からのＤＮＡの同等領域と比較することができるＹＡＣ ＤＮＡにおけるコーディング領域を同定することができる。
【００３０】
従って、第五の態様として、本発明は、
（１）上記のように調製しそしてマッピングしたエキソントラップコスミドベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクションすること；
（２）該哺乳動物細胞を適切な培地において培養すること；
（３）ＳＶ４０プロモーターから発現されるＲＮＡ転写産物を単離すること；
（４）該ＲＮＡ転写産物からｃＤＮＡを調製すること；
（５）該サブクローニングしたＤＮＡにおけるコーディング領域の部分を解明するために該エキソントラップコスミドベクターにサブクローニングしたＤＮＡのエキソンに関するスプライシング事象を同定すること；
（６）該コーディング領域と該気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体のＤＮＡにおける同等領域との間の違いを検出すること；および
（７）該気分障害もしくは関連疾患と関連する該遺伝子またはその突然変異したもしくは多型の変異体を同定すること、
の工程を含んでなる気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異した変異体および多型を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定する方法を含んでなる。
【００３１】
エキソントラッピングの代わりの方法として、ＹＡＣ ＤＮＡをＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドもしくは他のベクターにサブクローニングし、そして上記のようにコンティグ地図を構築することができる。以下のように、サブクローニングしたＤＮＡ上の関連する遺伝子の位置を定めることができる利用可能な様々な既知の方法がある：
（ａ）ｃＤＮＡ選択もしくは捕獲（直接選択およびｃＤＮＡ選択とも呼ばれる）：この方法は、特定の（例えば脳）ｃＤＮＡライブラリーからの全てのｃＤＮＡクローンのインサートのようなｃＤＮＡの複雑な混合物に、クローニングしたＤＮＡ（例えばＹＡＣ ＤＮＡのインサート）をハイブリダイズさせることによるゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖の形成を含む。関連する配列はハイブリダイズし、そしてビオチン−ストレプトアビジン捕獲およびＰＣＲ（もしくは関連技術）を用いて次の工程において濃縮することができる；
（ｂ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション：ゲノムクローン（例えば、特定のコスミドのインサート）を培養細胞系のパネルからのｍＲＮＡのノーザンブロットにもしくは適切な（例えば脳）ｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイズさせることができる。陽性シグナルは、クローニングした断片内の遺伝子の存在を示すことができる；
（ｃ）ＣｐＧアイランド同定：ＣｐＧもしくはＨＴＦアイランドは、遺伝子の５’末端に存在することが多い短い（約１ｋｂ）低メチル化ＧＣリッチ（＞６０％）配列である。ＣｐＧアイランドは、いくつかのまれにしか切断しない制限酵素の制限部位を有することが多い。まれにしか切断しない制限部位のクラスター化は、ＣｐＧアイランド、従って可能性がある遺伝子を示す。ＣｐＧアイランドは、まれにしか切断しない酵素で消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットへのＤＮＡクローンのハイブリダイゼーションにより、もしくはアイランド−レスキューＰＣＲ（アイランドと隣接するＡｌｕ反復との間の配列を増幅することによるＹＡＣからのＣｐＧアイランドの単離）により検出することができる。
（ｄ）ズー・ブロッティング：ＤＮＡクローン（例えば、特定のコスミドのインサート）を様々な動物種からのゲノムＤＮＡサンプルのサザンブロットに対して減少したストリンジェンシーでハイブリダイズさせること。ハイブリダイゼーションシグナルの検出は保存配列を示唆し、可能性がある遺伝子を示すことができる。従って、第六の態様として、本発明は、
（１）上記のようなＹＡＣ ＤＮＡをコスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣもしくは他のベクターにサブクローニングすること；
（２）サブクローン間の重複部分を検出しそしてその地図を構築するために、本明細書に記述するＹＡＣクローンコンティグにおけるようなこの領域におけるヌクレオチド配列もしくは任意の他の配列標識部位（ＳＴＳ）、または１４個以上の連続した塩基からなるその一部もしくはその相補物を用いること；
（３）ＣｐＧアイランド同定、ズー・ブロッティング、ｃＤＮＡライブラリーもしくは培養細胞系のパネルからのｍＲＮＡのノーザンブロットへのサブクローニングしたＤＮＡのハイブリダイゼーションの一つもしくはそれ以上によりサブクローニングしたＤＮＡ内の遺伝子の位置を同定すること；
（４）該遺伝子と気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体のＤＮＡの同等領域との間の違いを検出すること；および
（５）該気分障害もしくは関連疾患と関連する該遺伝子を同定すること、
の工程を含んでなる気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定する方法を含んでなる。
【００３２】
クローニングしたＹＡＣ ＤＮＡをシーケンスする場合、関連する遺伝子の存在を確立するためにコンピューター解析を用いることができる。相同性検索およびエキソン予測のような技術を適用することができる。
【００３３】
本発明の方法に従っていったん候補遺伝子が単離されると、正常な個体からの遺伝子と双極性スペクトル障害のような気分障害に苦しむ個体からのものとの間でさらに詳細な比較を行うことができる。例えば、ＤＮＡ配列における突然変異もしくは多型を同定することができる、「突然変異試験」と記述されている２つの方法がある。第一のものとして、ＤＮＡサンプルを一つの特定の突然変異の有無に関して試験することができるが、これは、突然変異が何であるかもしれないかという知識を必要とする。第二のものとして、ＤＮＡのサンプルを標準（正常）ＤＮＡからの任意の偏差に関してスクリーニングする。この後者の方法は、突然変異が前もって同定されない場合に候補遺伝子を同定するのにいっそう有用である。さらに、正常なもしくは健康な個体からの遺伝子と気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体からのものとの間の違いを同定するために上記の方法により同定される遺伝子に以下の技術をさらに適用することができる：
（ａ）サザンブロッティング技術：患者および健康な個体の異なる制限酵素で消化したゲノムＤＮＡを含有するナイロン膜にクローンをハイブリダイズさせる。患者と健康な個体との間の大きな違いは、放射性ラベリングプロトコルを用いて視覚化することができる；
（ｂ）ポリアクリルアミドゲルにおけるヘテロ二本鎖移動度：この技術は、非変性ポリアクリルアミドゲルにおけるヘテロ二本鎖の移動度がホモ二本鎖の移動度より小さいということに基づく。これは２００ｂｐ未満の断片に最も有効である；
（ｃ）一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰもしくはＳＳＣＡ）：一本鎖ＤＮＡは、弱い分子内結合により安定化される複雑な構造を形成するように折り畳まる。
【００３４】
非変性ポリアクリルアミドゲル上のこれらの構造の電気泳動移動度は、それらの鎖長およびそれらの高次構造により決まる；
（ｄ）ミスマッチ化学切断法（ＣＣＭ）：放射性標識したプローブを試験ＤＮＡにハイブリダイズさせ、そしてミスマッチの部位でＤＮＡの一方の鎖を切断する一連の化学反応によりミスマッチを検出する。これは非常に高感度の方法であり、そしてキロ塩基長のサンプルに適用することができる；
（ｅ）ミスマッチ酵素切断法：該アッセイはＣＣＭと同様であるが、ある種のバクテリオファージもしくは真核生物の酵素により切断を行う；
（ｆ）変性勾配ゲル電気泳動：この技術では、変性剤（化学物質もしくは温度）の増加する量の勾配がある電気泳動ゲルを通してＤＮＡ二本鎖を移動させる。鎖が融解しそして分離するゲル上の位置にＤＮＡ二本鎖が達するまで移動は続き、その後、変性したＤＮＡはさらに移動しない。正常および突然変異体ＤＮＡ二本鎖の間の単一塩基対の違いは、それらをゲルの異なる位置に移動させるのに十分である。
（ｇ）ダイレクトＤＮＡシーケンス。
【００３５】
これらの適当なアッセイ技術のさらに詳細な説明を以下に提供する。
遺伝子型判定 本明細書において用いる場合、「遺伝子型判定」という用語は、ＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドが位置９４２でチミジン（Ｔ）を含むかどうかを決定することを意味する。「遺伝子型判定」という用語は、「遺伝子検査」、「遺伝子スクリーニング」、「対立遺伝子もしくは多型を決定することもしくは同定すること」、「分子診断」のような用語または任意の他の同様の語句と同義である。
【００３６】
適切なサンプルＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの違いを識別することができる任意の方法もまた用いることができる。実際、多数の既知の異なる方法が、本発明のＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドの遺伝子型判定（すなわち、遺伝子型を決定すること）における使用に適している。これらの方法には、ダイレクトシーケンス、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎＴＭ、分子ビーコン、ＤＮＡチップおよびアレイ上のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、単一ヌクレオチドプライマー伸長ならびにオリゴライゲーションアッセイが包含されるがこれらに限定されるものではない。
遺伝子型スクリーニング 一つの態様として、本発明は、個体からのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸の遺伝子型スクリーニングの方法を提供する。個体からのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸の遺伝子型スクリーニングの方法は、その個体からの標的サンプルからの核酸の増幅を必要とし得る。
標的サンプル 本発明の標的サンプルは、解析する個体からのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドを含んでなる任意の標的核酸であることができる。そのような核酸のアッセイには、実質的に任意の生物学的サンプル（真正（ｐｕｒｅ）赤血球以外）が適当である。例えば、都合の良い標的サンプルには、全血、白血球、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、皮膚および毛髪が包含されるがこれらに限定されるものではない。ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡのアッセイには、標的サンプルは、典型的に、標的核酸が発現される細胞もしくは器官から得られる。
遺伝子型判定ＳＮＰ 多数の異なる方法がＳＮＰの遺伝子型を決定することにおける使用に適している。これらの方法には、ダイレクトシーケンス、ＰＣＲ− ＲＦＬＰ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎＴＭ、分子ビーコン、ＤＮＡチップおよびアレイ上のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、単一ヌクレオチドプライマー伸長ならびにオリゴライゲーションアッセイが包含されるがこれらに限定されるものではない。適切なＤＮＡ配列における単一ヌクレオチドの違いを識別することができる任意の方法もまた用いることができる。
増幅 本明細書において用いる場合、「増幅」という用語は、鋳型特異性を伴う核酸複製を意味する。鋳型特異性は、「標的サンプル」もしくは「標的配列」特異性に関する。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることが求められるという意味で「標的」である。その結果として、増幅技術は、主としてこれを選別するために設計されている。増幅方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特定の対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＡＳＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自律配列複製および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
ＴＡＱＭＡＮ 遺伝子型を決定するのに適当な手段は、ＴａｑｍａｎＴＭ技術に基づくことができる。ＴａｑｍａｎＴＭ技術は、以下の米国特許４，６８３，２０２；４，６８３，１９５および４，９６５，１８８に開示されている。ＴａｑｍａｎＴＭ対立遺伝子識別アッセイに含まれるウラシルＮ−グリコシラーゼの使用は、米国特許５，０３５，９９６に開示されている。
ＰＣＲ ＰＣＲ技術は当該技術分野において周知である（例えば、ＥＰ−Ａ−０２００３６２およびＥＰ−Ａ−０２０１１８４ならびに米国特許第４ ６８３ １９５号および第４ ６８３ ２０２号を参照）。標的配列を増幅する工程は、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを導入することおよびその後のＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な一連の温度サイクリングからなる。ＰＣＲでは、例えばゲノムＤＮＡにおける特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法論（標識したプローブでのハイブリダイゼーション、ビオチン化したプライマーの導入およびその後のアビジン−酵素結合体検出、ならびに増幅配列へのｄＣＴＰもしくはｄＡＴＰのような３２ｐで標識したデオキシヌクレオチド三リン酸の導入のような）による検出可能なレベルに増幅することが可能である。あるいはまた、差次的に標識し、従って各々検出することができるプライマーで異なる多型部位（マーカー）を増幅することが可能である。多数のマーカーを解析する一つの手段は、各マーカーを異なる蛍光プローブで標識することを含む。次にＰＣＲ生成物を蛍光に基づく自動シーケンサーで解析する。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列をプライマー分子の適切な組で増幅することができる。特に、ＰＣＲ工程自体によって生じる増幅断片は、それら自体が次のＰＣＲ増幅の効率のよい鋳型である。例として、ＰＣＲはまた、ヒトにおけるもしくはヒトからのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドの適当な部分を増幅するプライマーを同定するために用いることもできる。
プライマー 本発明はまた、一連の有用なプライマーも提供する。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「プライマー」という用語は、適切なバッファーにおいてそして適当な温度で適切な条件下で（すなわち、４種の異なるヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合のための因子の存在下で）鋳型指示ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドをさす。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される用途により決まるが、典型的には１５〜３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにいっそう冷たい温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。
【００３８】
「プライマー部位」という用語は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域をさす。
【００３９】
「プライマー対」という用語は、増幅するＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流プライマーおよび増幅する配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’下流プライマーを含む一組のプライマーを意味する。
【００４０】
本発明のプライマーはＤＮＡもしくはＲＮＡ、および一本鎖もしくは二本鎖であることができる。あるいはまた、プライマーは、天然に存在するかもしくは合成であることができるが、典型的には合成手段により製造される。
プライマーハイブリダイゼーション条件 本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合をさす。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子により影響を受ける。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う、温度、イオン強度および有機溶媒のような他の化合物の存在の条件に関して用いる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、典型的に、ストリンジェントな条件下で、例えば、１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で行う。例えば、５Ｘ ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５−３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プライマーハイブリダイゼーションに適している。
対立遺伝子特異的プライマー 対立遺伝子特異的プライマーは、多型に重なる標的ＤＮＡ上の部位にハイブリダイズし、そしてプライマーが完全な相補性を示す対立遺伝子型の増幅のみをプライミングする（Ｇｉｂｂｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，２４２７−２４４８（１９８９）を参照）。このプライマーは、遠位部位でハイブリダイズする第二のプライマーとともに用いることができる。増幅はこれら２個のプライマーから進行し、特定の対立遺伝子型が存在することを示す検出可能な生成物をもたらす。コントロールは、一方が多型部位で単一塩基ミスマッチを示しそしてもう一方が遠位部位に完全な相補性を示すもう一対のプライマーで行うことができる。単一塩基ミスマッチは増幅を妨げ、そして検出可能な生成物は形成されない。多型と一列に並ぶオリゴヌクレオチドの最も３’の位置は、プライマーからの伸長に最も不安定であるので、この位置にミスマッチが含まれる場合に該方法は最もうまくいく（例えばＷＯ ９３／２２４５６を参照）。
【００４３】
単一塩基ミスマッチを検出するために特異的ハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーションプローブは、当該技術分野において既知でありそしてＭａｎｉａｔａｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒに記述されている方法に従って設計することができる。
【００４４】
（ｉ）ＰＣＲプライマー 好ましくは、スクリーニングは、ヌクレオチド９４２を含むヒトのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）の部分を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いて実施する。
【００４５】
そのようなＰＣＲプライマーの例を配列番号９および１０として示す。
増幅した標的配列における多型の検出 増幅した核酸配列は、対立遺伝子特異的プローブ、タイリングアレイ、ダイレクトシーケンス、変性勾配ゲル電気泳動および一本鎖高次構造多型（ＳＣＣＰ）解析が包含されるがこれらに限定されるものではない方法を用いて検出することができる。
対立遺伝子特異的プローブ 二人の個体からのそれぞれの断片における異なる多型の型の存在のために一方の個体からの標的ＤＮＡの断片にハイブリダイズするがもう一方の個体からの対応する断片にハイブリダイズしない対立遺伝子特異的プローブを設計することができる。
【００４６】
本明細書において用いる場合、「プローブ」という用語は、精製された制限消化産物におけるように天然に存在しようともしくは合成で製造しようと、対象の別のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をさす。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、典型的に、核酸の相補鎖に塩基特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドである。
【００４７】
本発明のプローブは、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光、放射性および発光系が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の検出系においてそれが検出可能であるように任意の「レポーター分子」で標識することができる。対象の標的配列（すなわち、検出される配列）もまた、レポーター分子で標識することができる。本発明は、任意の特定の検出系もしくは標識に限定されない。
【００４８】
本発明のプローブに選択するハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な差、好ましくは本質的に２値の応答（ｂｉｎａｒｙ ｒｅｓｐｏｓｅ）があり、それによりプローブが対立遺伝子の一方のみにハイブリダイズするように十分にストリンジェントである。典型的なハイブリダイゼーション条件は、１塩基対ミスマッチを決定することができるように本発明の対立遺伝子特異的プライマーに上記に示したようなストリンジェントな条件である。
タイリングアレイ 本発明の多型はまた、核酸アレイへのハイブリダイゼーションにより同定することもでき、そのいくつかの例はＷＯ ９５／１１９９５に記述されている。「タイリング」という用語は、一般に、解析する配列（「標的配列」）に相補的な配列ならびにその配列のあらかじめ選択したバリエーションで構成されている特定の一組のオリゴヌクレオチドプローブの合成を意味する。これらのバリエーションには、通常、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドでの１個もしくはそれ以上の塩基位置での置換が含まれる。
ダイレクトシーケンス 本発明の多型の配列の直接解析は、ジデオキシ連鎖停止法もしくはマクサム・ギルバート法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．，ＣＳＨＰ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９を参照）のいずれかを用いて、または例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡシーケンサーで解析するＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンス化学を用いる標準的なＡＢＩシーケンス技術を用いて実施することができる。好ましくは、本発明のアッセイに用いる多型は、同定された配列のＰｓｔＩ制限解析で生じる断片の有無により同定する。
１．５変性勾配ゲル電気泳動 ＰＣＲを用いて生成される本発明の増幅生成物はまた、変性勾配ゲル電気泳動の使用により解析することもできる。異なる対立遺伝子は、溶液中のＤＮＡの異なる配列依存的融解特性および電気泳動移動度に基づいて同定することができる。Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２），第７章。
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析 本発明の標的配列の対立遺伝子はまた、Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２７６６−２７７０（１９８９）に記述されているように、一本鎖ＰＣＲ生成物の電気泳動移動度の変化により塩基の違いを同定する一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析を用いて識別することもできる。増幅ＰＣＲ生成物を上記のように生成せしめ、そして加熱するかもしくはそうでなければ変性させて、一本鎖増幅生成物を生成せしめることができる。一本鎖核酸は、塩基配列に部分的に依存する二次構造を再生するかもしくは形成することができる。一本鎖増幅生成物の異なる電気泳動移動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の違いに関係することができる。
試験配列とコントロール配列との間の違いを同定すること 増幅された核酸配列のこれらの検出方法は、基準核酸配列と試験核酸配列との間の変異の１つもしくはそれ以上の点の違いを同定するためにまたは２人もしくはそれ以上の個体からのＣＡＰ２遺伝子の異なる多型の型を比較するために用いることができる。
基準核酸配列 本明細書において用いる場合、「基準核酸配列」は、そのアッセイにおいて試験する対立遺伝子の各々のホモ接合体である一人もしくはそれ以上の個体に相当するコントロールＤＮＡ配列のようなコントロール核酸配列を意味する。例として、コントロールＤＮＡ配列には：（ｉ）ホモ接合体の個体からのゲノムＤＮＡ；（ｉｉ）ホモ接合体の個体から増幅される関連したＳＮＰを含有するＰＣＲ生成物；または（ｉｉｉ）プラスミドもしくは他の適当なベクターにクローニングされている関連したＳＮＰを含有するＤＮＡ配列を包含することができるがこれらに限定されるものではない。コントロールサンプルはまた、対立遺伝子の既知の組からの複数の対立遺伝子を含んでなる対立遺伝子ラダーであることもできる。各々異なる対立遺伝子もしくは対立遺伝子の組を含有する複数のコントロールサンプルがあることができる。他の基準／コントロールサンプルには、典型的に、図表示、文書表示、鋳型またはＰＣＲ生成物もしくは核酸の他の断片における多型の存在を同定するのに適当な任意の他の手段が包含される。「基準核酸配列」、基準サンプルおよびコントロールサンプルという用語は、本文の全体にわたって互換的に用いる。
Ｈ．治療用途 本発明の一つの態様は、双極性気分障害にかかりやすい素因に関して個体をスクリーニングすること、およびポリヌクレオチド素因が同定される場合に、双極性気分障害を遅らせるかもしくは軽減するかもしくは防ぐためにその個体を処置することを提供する。
【００４９】
本発明のこの態様の実施形態として、双極性気分障害にかかりやすい個体の素因は、上記に説明する検出の方法を用いて個体がヌクレオチド９４２がチミジン（Ｔ）であるＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドのホモ接合体であるか、位置９４２のグアノシン（Ｇ）がチミジン（Ｔ）で置換されるＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドのヘテロ接合体であるか、もしくはヌクレオチド９４２がグアノシン（Ｇ）であるＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドのホモ接合体であるかを決定することにより評価する。
【００５０】
従って、該多型に関して、位置９４２でＴ／Ｔホモ接合体である個体は、危険性が最も高いと分類される。Ｇ／Ｔヘテロ接合体である個体は、中程度の危険を有すると分類される。Ｇ／Ｇホモ接合体である個体は、最も低い危険性のカテゴリーにあると分類される。
【００５１】
場合により、個体の危険因子の評価は、ＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチド多型の存在並びに既知のポリヌクレオチド指標もしくは生理学的指標もしくは他の指標の両方を参照することにより計算される。このように本発明は、個体の危険性の測定が基づくことができるさらなる情報を提供する。
一般的な方法論参考文献 一般に、本明細書に記述する技術は当該技術分野において周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照することができる。
【００５２】
本明細書に記述する方法に関して、ＹＡＣからのコーディング領域と気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体のＤＮＡとの間の違いを検出する工程において、該個体はその疾患にかかっている誰でもあることができ、そして必ずしも家系ＭＡＤ３１の一員であるとは限らないと理解される。
【００５３】
さらなる態様によれば、本発明は、気分障害もしくは関連疾患と関連しそして上記の方法のいずれかにより得ることができる単離されたヒト遺伝子およびその変異体、該遺伝子によりコードされる単離されたヒトタンパク質ならびに該タンパク質をコードするｃＤＮＡを提供する。
【００５４】
いったん遺伝子が同定されると、コードされるタンパク質の機能を決定するために多数の方法が利用可能である。これらの方法は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．１５，Ｊｕｎｅ ２０００）により記述されており、そして引用することにより本明細書に組み込まれる。一つの方法は、ゲノム配列から機能連鎖を示す算定法を含み、そして遺伝子近接法（ｇｅｎｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる。いくつかのゲノムにおいて、２個のタンパク質をコードする遺伝子が染色体上で近接する場合、これらのタンパク質は機能的に関連している傾向がある。この方法は、オペロンが一般的である原核生物における機能連鎖を明らかにすることにおいて有効であることができるが、真核生物における相互作用するタンパク質を解析することにも効果を発揮する。
ＣＡＰ−２遺伝子
１７．１ｋｂのゲノムにわたる５’ＵＴＲおよび６個のコーディングエキソンを含有する細胞質アンチプロテイナーゼ２遺伝子（ＣＡＰ２）の完全なイントロン−エキソン構造を本明細書に開示する。イントロンのサイズを測るために、ＣＡＰ２ ｃＤＮＡ配列にわたるプライマーの異なる組み合わせを用いる。このようにして、５個のイントロンのサイズおよびエキソン−イントロン境界配列を得た。スプライス連結部の５’供与および３’受容部位は、共通配列と相関関係があった（表１）。第一の５’ＵＴＲエキソンは非常に小さく（７３ｂｐ）、そして多型であるがＭＡＤ３１ベルギー人家系においても罹患およびコントロール集団においても増加していないと判明した（ＣＡＧ）２（ＣＧＧ）６（ＣＡＧ）６配列を含有する。
【００５５】
ＣＡＰ２から得られるアミノ酸配列は、胎盤トロンビンインヒビターもしくはＰＩ６（６８％の同一性）およびプロテイナーゼインヒビター９ ＰＩ９（６３％）を包含する細胞質セルピンのオボアルブミンファミリーの他のヒトメンバーに高度の同一性を示す。５種のエキソン多型が同定され、これらから３種はアミノ酸変化をもたらす。ＰＩ６およびＰＩ９のアミノ酸配列とＣＡＰ２の推定一次構造との整列により、アミノ酸位置６８で、ＣＡＰ２はＡｒｇもしくはＧｌｎのいずれかであることができ、そしてＰＩ６ではＧｌｎであることが示された。同様に、アミノ酸位置３５９で、ＣＡＰ２はＡｒｇもしくはＨｉｓのいずれかを示し、そしてＰＩ６はＨｉｓを示す１５。さらに、アミノ酸位置３０４で、ＣＡＰ２はＴｈｒもしくはＡｌａのいずれかを示し、そしてＰＩ９はＡｌａを示す。逆に、アミノ酸位置３１４で、ＣＡＰ２はＡｌａを示し、一方、ＩＰ６およびＩＰ９はＶａｌを示す。
【００５６】
ＤＨＰＬＣにより検出されるこれらの変異体のうち２種（ｃ．９１０Ａ＞Ｇおよびｃ．９４２Ｃ＞Ｔ）は、ＳＳＣＰ解析により以前に同定されなかった。
【００５７】
ベルギー系の７５／７５症例−コントロールサンプルにおける関連解析を適用した。症例およびコントロールは、民族性、性別、年齢に関して厳密に一致させた。６種のＳＮＰの対立遺伝子および遺伝子型頻度の比較により、６種のＳＮＰのうち５種で患者とコントロールとの間に有意な関連は示されなかった。エキソン７におけるＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞Ｔ置換の頻度は、ＢＰ患者とコントロールとの間で有意に異なり：ＢＰ患者は、コントロールと比較した場合にＴ対立遺伝子の頻度が高かった（ｐ＝０．０３）。６種のＳＮＰは同じ遺伝子内に位置するが、これらのうち４種は連鎖不平衡になかった。ＳＮＰ ｃ．２０３Ｇ＞ＡとＳＮＰ ＩＶＳ４＋９８Ａ＞Ｇとの間に非常に強いＬＤがあったが、コントロールにおいてのみであった。ＢＰ症例では、これら２種のＳＮＰ間のＬＤは弱かった。さらに、ＣＡＰ２−ＣＡＧ−ＣＧＧ反復とＣＡＰ２ ＳＮＰとの間でＬＤは見出されなかった。ＢＰ障害およびＣＡＰ２ ＳＮＰで関連の強い証拠が見出されなかったことは、我々の集団における有意なＬＤ結果の欠如と一緒に、ＣＡＰ２がＢＰ障害の病因において主要な役割を果たしていないかもしれないことを示唆する。
【００５８】
家系ＭＡＤ３１の１人の罹患個体において、Ｄ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９６９との間で近位組換えが起こった１１。ＣＡＰ２遺伝子はこれらの２種のマーカーの間に位置する。ＣＡＰ２−ＳＮＰは、この近位組換えが遺伝子の下流で起こったことを示した。
【実施例１】
【００５９】
Ａ．家系、患者およびコントロール被験体
ＢＰＩＩ発端者を有するベルギー人家系、ＭＡＤ３１における家系および臨床診断は他の所で詳細に記述された１０。簡潔に言えば、家系ＭＡＤ３１における異なる臨床診断は以下のとおりである：１ ＢＰＩ、２ ＢＰＩＩ、２ ＵＰ、４ 大鬱病性障害（ＭＤＤ）、１ 統合失調性躁病（ＳＡｍ）および１ 統合失調性鬱病（ＳＡｄ）。
【００６０】
症例−コントロールサンプルは、ブリュッセルのＥｒａｓｍｅ病院で確かめられたベルギー系の７５人の関係のない患者、ならびに病院における告示によって募集された７５人の年齢、性別および民族性の一致するコントロール被験体からなった。全てのコントロール個体は、精神医学症状を除くために面接した。患者は、ＢＰ障害の研究診断基準（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）１６を満たした。
Ｂ．ＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、ＣＡＰ２ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ４０３７７）１５にわたる６つの重複するプライマー組を用いて増幅した。約５０ｎｇのゲノムＤＮＡもしくは１ｎｇのｃＤＮＡおよび１０ｐｇの各プライマーを標準的なＰＣＲ反応において使用した。増幅条件は以下のとおりであった：９４℃で４分間の最初の変性工程、続いて１分間９４℃、１分間５５℃、２分間７２℃で３５サイクル、および７２℃で１０分間の最後の伸長期間。
Ｃ．サザンブロット解析
家系ＭＡＤ３１の３人の罹患メンバーおよび２人の非罹患メンバーからのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで別個に消化し、そして１％アガロースゲル上で泳動した。サザンブロッティングは、標準プロトコル１７に従って実施した。
【００６１】
５０ｎｇのＣＡＰ２ ｃＤＮＡをランダムプライムラベリング（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションは、６５℃でＣｈｕｒｃｈバッファーにおいて一晩実施した。次に、膜を６５℃で１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて１回、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて１回、そして０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて２回洗浄し、続いてＫｏｄａｋ Ｘ線フィルムに−７０℃で７２時間露出した。
Ｄ．ＳＳＣＰおよびＤＨＰＬＣ解析
ＰＣＲ増幅したＤＮＡは、あらかじめ成形されたすぐに使用できるゲルおよびＨｙｄｒｏｌｉｎｋ ５％グリセロールゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でＤＮＡ解析システムを用いてＳＳＣＰにより解析した。
【００６２】
変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）は、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した自動機器で実施した。粗ＰＣＲ生成物をＤＮＡＳｅｐカラム上に載せ、そして０．９ｍｌ／分の一定の流速で、０．１Ｍトリエチルアミンアセテートバッファー（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７におけるアセトニトリル勾配を用いてカラムから溶出した。勾配は、溶離剤ＡおよびＢを混合することにより作製した。溶離剤Ａは０．１Ｍ ＴＥＡＡ、０．１Ｍ Ｎａ４ＥＤＴＡであった。溶離剤Ｂは０．１Ｍ ＴＥＡＡ中２５％のアセトニトリルであった。ヘテロ二本鎖分子の成功した分離に必要な勾配および温度は、Ｗａｖｅｍａｋｅｒバージョン３．４．４により予測した。
Ｅ．ＤＮＡシーケンス
シーケンスは、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７７自動シーケンサーおよびＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＥ）を用いてプラスミドＤＮＡもしくはゲル精製したＰＣＲ鋳型に行った。ＰＣＲ断片は最初にアガロースゲル上で視覚化し、そして次にＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてゲル精製した。
Ｆ．パイロシーケンス
ビオチン化したＰＣＲ生成物をストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上に固定した。ｓｓＤＮＡは、固定したＰＣＲ生成物を５０μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨにおいて５分間インキュベーションし、続いて１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート ｐＨ７．６において２回連続して洗浄することにより得た。プライマー エキソン７−１０２５（５’−ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＣ−３’）は、エキソン７におけるＳＮＰ ｃ．９４２の検出のためのパイロシーケンスプライマーとして用いた。プライマーアニーリングは、７２℃で２分間そして次に室温で５分間のインキュベーションにより行った。パイロシーケンスは、ＰＳＱ９６パイロシーケンサー（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。
Ｇ．統計解析
ＢＰ症例およびコントロールの全対立遺伝子および遺伝子型分布を比較し、そしてＧｅｎｅｐｏｐ１８を用いてハーディー・ワインバーグ平衡を試験した。対立遺伝子および遺伝子型特異的比較は、カイ二乗解析もしくは必要に応じてフィッシャーの直接確率検定を用いて行った。遺伝子型判定した全てのＳＮＰのデータを合わせる複数点関連解析にはＤｉｓｍｕｌｔプログラム１９を用いた。連鎖不平衡（ＬＤ）は、ＧｅｎｅｐｏｐのＬｉｎｋｄｏｓを用いて計算した。患者およびコンロトールにおけるハプロタイプ頻度を概算するために、最尤法に基づくＡｒｌｅｑｕｉｎアルゴリズムを適用した２０。
Ｈ．ＣＡＰ２遺伝子のゲノム構造
我々は、ＣＡＰ２遺伝子のゲノム構造を決定した。第一に、家系ＭＡＤ３１の５人の選択したメンバー（３人の罹患および２人の非罹患）からのＨｉｎｄＩＩＩでそしてＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡを含有する２枚の異なるサザンブロットに対してＰＣＲで得られたＣＡＰ２ ｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせることによりＣＡＰ２遺伝子をゲノム再編成に関して解析した。観察されるハイブリダイズしたバンドに基づき、２５ｋｂの最小ゲノムサイズが概算された。罹患および非罹患個体のハイブリダイゼーションパターンの間で違いは認められなかった。
【００６３】
ｃＤＮＡプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲからイントロンの位置およびサイズが得られた。シーケンスの後、ｃＤＮＡおよびゲノム配列の比較により正確なエキソン−イントロン境界を決定した（表１）。これらのゲノム配列からイントロンプライマーを設計した（表４）。
【００６４】
【表１】
【００６５】
この解析により、ＣＡＰ２は７３ｂｐ（エキソン１）〜４０５ｂｐ（エキソン７）におよぶサイズを有する１個の非コーディングエキソンおよび６個のコーディングエキソンを含有することが示された（図１および表１）。イントロン２〜６のサイズはＰＣＲにより決定し、そして１．３Ｋｂ（イントロン２）〜１．８Ｋｂ（イントロン３）であった（図１）。これらの実験が進行中であった間に、ＣＡＰ２遺伝子を含有するＢＡＣ ７９３Ｊ２の完全な配列が利用できるようになった（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００９８０２）。エキソン−イントロン境界配列、イントロンおよびエキソンサイズを確かめ、そしてイントロン１のサイズを８．１ｋｂと決定した。全体で、ＣＡＰ２遺伝子は１７．１ｋｂのゲノム領域にわたる。
【００６６】
ＣＡＰ２遺伝子の方向を定めるために、ＣＡＰ２−ＣＡＧ断片化ＹＡＣ２１をＬ４０３７７（ＣＡＰ２エキソン７）を含む遺伝子に対してセントロメアおよびテロメアのＳＴＳマーカーの存在に関して解析した。ＰＣＲ解析により、ＣＡＰ２に対してセントロメアのマーカーでの陽性ヒットおよび遺伝子に対してテロメアのマーカーでの増幅の欠如が示され、ＣＡＰ２の転写方向がセントロメアからテロメアへであることが示された。
【００６７】
【表２】
【００６８】
突然変異検出および解析
２４人のＢＰ患者のＤＮＡから全てのエキソンをＰＣＲ増幅するためにイントロンプライマーを設計した。ＳＳＣＰ解析を用いてＰＣＲ生成物を突然変異に関してスクリーニングした。２種の非同義ＳＮＰがｃ．２０３Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ６８Ｇｌｎ）およびｃ．１０７６Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３５９Ｈｉｓ）で同定された。Ｌｅｕをコードする１種の同義ＳＮＰがｃ．４７７Ａ＞Ｇ（コドン１５９）で同定された。さらに、１種のＳＮＰがイントロン４、ＩＶＳ４＋９８Ａ＞Ｇにおいて検出された。これらの結果はＤＨＰＬＣ解析により確かめられ、そしてｃ．９１０Ａ＞Ｇ（Ｔｈｒ３０４Ａｌａ）およびＡｌａをコードするｃ．９４２Ｃ＞Ｔ（Ａｌａ３１４Ａｌａ）におけるものの、エキソン７における２種の追加のＳＮＰの同定をもたらした（表２）。
【００６９】
【表３】
【００７０】
７５人の関係のない双極性患者および７５人の一致するコントロールにおけるＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析をこれらの変異体のうち３種について行った：ＳＮＰ ＩＶＳ４＋９８Ａ＞ＧにはＲｓａＩ−ＲＦＬＰアッセイを適用した。ＳＮＰ ｃ．９１０Ａ＞ＧにはＰｖｕＩＩ−ＲＦＬＰ解析を適用した。ＳＮＰ ｃ．１０７６Ｇ＞ＡにはＨｈａＩ−ＲＦＬＰ解析を適用した。ＳＮＰ ｃ．４７７Ａ＞Ｇおよびｃ．２０３Ｇ＞Ａは、ゲノムＤＮＡから作製したＰＣＲ断片のダイレクトシーケンスにより解析した。ＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞Ｔを解析するためにはパイロシーケンスを用いた。
【００７１】
これらのＳＮＰのうち５種において対立遺伝子頻度もしくは遺伝子型分布におけるＢＰ患者とコントロールとの間の有意な差はなかった。しかしながら、ＳＮＰ ｃ．２０３Ｇ＞Ａ（ｐ＝０．０５）およびｃ．４７７Ａ＞Ｇ（ｐ＝０．０３）のハーディー・ワインバーグ平衡のわずかな偏差が、両方ともＢＰにおいてあり、これは過剰のヘテロ接合体によってもたらされる（ｅｘ３ではｐ＝０．０３；ｅｘ５ではｐ＝０．０２）。さらに、コントロールにおいてＳＮＰ ｃ．２０３Ｇ＞Ａのわずかに過剰のヘテロ接合体がある（ｐ＝０．０４）
ＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞ＴのＴ対立遺伝子は、コントロール（１％）におけるよりＢＰ症例（６％）において有意に高い頻度を有した（χ２＝４．８３；ｐ＝０．０３）。遺伝子型を比較する場合、２／７５（３％）のコントロールと比較して９／７３（１２％）が１個のＴ対立遺伝子を有した（χ２＝５．０２；ｐ＝０．０３）。興味深いことに、性別の層化後にデータを解析した場合、有意な差が認められた。男性では、Ｔ対立遺伝子はＢＰ患者において８％の頻度を有し、一方、コントロールにおいてそれは認められなかった（フィッシャーの直接確率検定、ｐ＝０．０３）。女性では、対立遺伝子もしくは遺伝子型分布における違いは症例とコントロールとの間で認められなかった。
【００７２】
これらの結果を確かめるために、関係のない患者および一致するコントロール群を拡張し、そして１１３人のＢＰ患者および１６３人の年齢、性別および民族性の一致するコントロールにおいて最終的な遺伝子型判定関連解析を行った。表３は、患者およびコントロール集団におけるこれらの多型の対立遺伝子および遺伝子型頻度を示す。
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】１８ｑ２１．３３−ｑ２３ ＢＰ候補領域（Ｖｅｒｈｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ １９９９）の最小のＹＡＣタイリング経路。ＹＡＣを実線で、ＣＣＧ／ＣＧＧ断片化生成物を点線で表す。括弧の間のＹＡＣサイズは、ＰＦＧＥ解析により概算される。詰まった丸は、陽性のＳＴＳ／ＳＴＲヒットを示す。斜線付きボックスは、ＹＡＣ断片化により単離されたＣＣＧ／ＣＧＧ反復および３つのＣｐＧアイランドを強調する。
【図２】細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）遺伝子のゲノム構造。黒色のボックスはエキソンを表し、そしてｂｐ単位のそれらのサイズをボックスの上に示す。イントロンサイズはｋｂ単位である。組み合わされたＣＡＧ−ＣＧＧ反復を示す。転写開始および終始コドンを示す。
【０００１】
本発明は、広範には精神医学的健康と関連する遺伝因子の決定に関する。さらに特に、本発明は、罹患個体およびそれらの家系における気分障害もしくは関連疾患に関係があるヒト遺伝子に関する。特に、本発明は、細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）をコードする遺伝子に関する。該遺伝子は第１８染色体上に位置し、そして脳組織において発現され、そして双極性障害の診断マーカーとして用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
薬理遺伝学背景：
あらゆる個体は、それらの遺伝子および環境の相互作用の産物である。薬理遺伝学は、遺伝的な違いが薬剤に対する患者応答の変動にどのように影響を及ぼすかという研究である。薬理遺伝学の使用によって、我々はまもなく特定の医薬に対する応答を予測するために個体のＤＮＡ間の変異の概略を提示することができる。ヒトにおける臨床徴候の忍容性に優れ且つ有効な医薬を予測する標的検証は広く認められている問題であるが；真の難題は標的選択である。高処理量スクリーニングが現在可能である、受容体および酵素を包含する、限られた数の分子標的ファミリーが同定されている。優れた標的は、有効な分子（ヒット）を同定するためにそれに対して多数の化合物を迅速にスクリーニングすることができるものである。これらのヒットは、忍容性に優れ且つ有効な医薬の性質を有する最適化分子（リード（ｌｅａｄ））に発展させることができる。疾病もしくは臨床徴候について検証することができる標的の選択は、製薬産業が直面する主要な問題である。最もよく検証された標的は、ヒトにおける忍容性に優れ且つ有効な医薬をすでに産み出しているもの（先例標的）である。多数の標的が科学的仮説に基づいて選択され、そして最初の仮説がたいていその後に反証されるので有効な医薬につながらない。
【０００３】
高処理量標的としての用途に遺伝子を同定しそしてそれらのタンパク質生成物を発現するために２つの幅広い戦略が用いられている。ゲノム学および遺伝学のこれらの方法は技術を共有するが、異なる科学的戦略および投資を意味する。発見ゲノム学は、疾病に遺伝学的に関連することが知られていない扱いやすいもしくはスクロール可能な標的の遺伝子および遺伝子のファミリーを同定するためにＤＮＡ配列情報の増加する数のデータベースを用いる。
【０００４】
患者から得られる疾病感受性遺伝子に関する情報の利点は、定義により、これらの遺伝子が疾病への患者の遺伝的寄与に関係があることである。しかしながら、大部分の感受性遺伝子は、扱いやすい標的ではないかもしくは有効な化合物を同定するための高処理量スクリーニング方法が容易にできない。
【０００５】
関連する遺伝子変異体に関する差次的代謝は、疾病の発症もしくは進行の機構を発見するために集中的な機能性ゲノムおよびプロテオーム技術において研究することができる。
【０００６】
改変された代謝と関連する受容体の重要な酵素は、標的として用いることができる。適切な細胞代謝に対する特定の感受性遺伝子変異体の役割に焦点を合わせる遺伝子→機能→標的（ｇｅｎｅ−ｔｏ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ）戦略は重要になる。
【０００７】
強力な生物情報学手段でのヒトゲノムプロジェクトおよび同様のプログラムからの配列のデータ採掘は、同様の配列を有するドメインを位置づけることにより遺伝子ファミリーを同定することを可能にしている。これらのゲノム戦略により同定される遺伝子は、一般に、ある種の機能的検証もしくは疾病プロセスとの関連性を必要とする。遺伝子と疾病との間の関連性を示すために差次的遺伝子発現、トランスジェニック動物モデル、プロテオミクス、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学のような技術が用いられる。
【０００８】
ゲノム方法と遺伝的方法との間の主要な違いは標的選択であり、それは疾病プロセスに関与することがすでに既知である遺伝子および変異体特異的標的を遺伝学的に特定した。疾病との関連性の探求における各遺伝子での非特異的な大規模な遺伝子同定のための発見ゲノム学の最近の流行は、医薬の開発の大きな機会を生み出す。
【０００９】
薬剤開発の中核となる問題は乏しい標的選択であると認識することもまた重要である。疾病関連検証を示すための実証されていない技術のスクリーニング使用、およびヒトにおける概念の実証へ各選択遺伝子を進めるのに必要な莫大な投資は、「検証」という言葉の実証されていないそして無頓着な使用に基づく。各失敗は、損失時間および金銭において非常に高くつく。例えば、差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）およびプロテオミクスは、標的検証に広く用いられるスクリーニング技術である。これらは、組織における遺伝子およびタンパク質発現の異なるレベルおよび／もしくはパターンを検出し、その組織を冒す疾病との関連性を示すためにそれらを用いることができる。
気分障害背景：
気分障害もしくは関連疾患には、精神障害の診断および統計マニュアル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、バージョン４（ＤＳＭ−ＩＶ）分類学ＤＳＭ−ＩＶコードを括弧に入れて）において特定されるような以下の疾患：気分障害（２９６．ＸＸ，３００．４，３１１，３０１．１３，２９５．７０）、統合失調症および関連疾患（２９５．ＸＸ，２９７．１，２９８．８，２９７．３，２９８．９）、不安障害（３００．ＸＸ，３０９．８１，３０８．３）、適応障害（３０９．ＸＸ）および人格障害（コード３０１．ＸＸ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明は、特に、双極性（ＢＰ）スペクトル障害として知られている気分障害の家系と関連する遺伝因子に関する。双極性障害（ＢＰ）は、高揚感の極度の状態（躁病）から抑うつの重い状態（鬱病）までにおよぶ気分の障害を特徴とする重度の精神医学症状である。２つのタイプの双極性障害が記述されている：Ｉ型ＢＰ障害（ＢＰＩ）は、躁病の相と交互に起こる大鬱病エピソードを特徴とし、そしてＩＩ型ＢＰ障害（ＢＰＩＩ）は、軽躁の相と交互に起こる大鬱病エピソードを特徴とする。ＢＰ発端者の親族は、ＢＰ、単極性障害（鬱病エピソードを経験するだけの患者；ＵＰ）、循環気質（小鬱病および軽躁エピソード；ｃｙ）、並びに躁病（ＳＡｍ）および鬱病（ＳＡｄ）タイプの統合失調性感情障害の増大した危険性を有する。これらの結果に基づいて、ＢＰ、ｃＹ、ＵＰおよびＳＡはＢＰスペクトル障害と分類される。
【００１１】
ＢＰスペクトル障害の病因への遺伝因子の関与は、家系、双子および養子縁組研究により示唆された（非特許文献１）。しかしながら、伝達の正確なパターンは不明である。いくつかの研究において、複雑な分離解析によりＢＰの単一の主要な遺伝子座の存在が裏付けられる（非特許文献２）。他の研究者等は、罹患性閾値モデルを提示し、ここで、疾病を発症する罹患性は、多数の遺伝および環境作用の加法的組み合わせに起因する（非特許文献３）。
【００１２】
遺伝の複雑な形式のために、ＢＰ障害がメンデルの法則のように伝達されると思われる家系においてパラメーターおよび非パラメーター連鎖戦略が適用される。染色体１１ｐ１５（非特許文献４）およびＸｑ２７−ｑ２８（非特許文献５；非特許文献６）上の初期の連鎖結果は議論の余地があり、そして最初は再現することができなかった（非特許文献７；非特許文献８）。高度に多型のマーカーで飽和したヒト遺伝子地図の開発およびデータ解析技術の絶え間ない発展とともに、多数の新しい連鎖検索が行われた。いくつかの研究において、第４、１２、１８、２１およびＸ染色体上の特定の領域への連鎖の証拠もしくは示唆的証拠が見出された（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１３）。報告された連鎖結果の正当性を試験するために、これらの結果は他の独立した研究において再現されなければならない。
【００１３】
最近、第１８染色体上のセントロメア周囲（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）領域への双極性障害の連鎖が報告された（非特許文献１１）。１８ｐｔｅｒ−ｐ１１および１８ｑ２３−ｑｔｅｒで切断点および欠失領域を有する環状第１８染色体もまた、ＢＰ障害もしくは関連症候群にかかっている３人の関係のない患者において報告された（非特許文献１０）。染色体１８ｐ連鎖はＳｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１４）によって再現され、彼らはまた、同じ研究において１８ｑ２１．２−ｑ２１．３２上の遺伝子座の示唆的証拠も報告した。
【００１４】
興味深いことに、Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．は親由来効果（ｐａｒｅｎｔ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ ｅｆｆｅｃｔ）を認め：連鎖の証拠は父方の家系において最も強く、ここで、発端者の父もしくは発端者の父の兄弟姉妹の一人が罹患している。いくつかの研究は、ＢＰ障害を伝達する家系における表現促進を記述し（非特許文献１５、非特許文献１６）、ＣＡＧ／ＣＴＧ、ＣＣＧ／ＣＧＧもしくはＧＡＡ／ＴＴＣ反復の増加によって引き起こされる多数の疾病が表現促進を示すこと（非特許文献１７により概説される）を考慮して、トリヌクレオチド反復増加（ＴＲＥ）の関与を示唆する。潜在的に増加した反復を見出そうとする以前の取り組みは、ＣＣＧ／ＣＧＧ反復の検索が増えているが、主としてＣＡＧ／ＣＴＧ反復に集中している（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。以前に、我々は三塩基反復の領域特異的単離の新規な方法：三塩基反復ＹＡＣ断片化に関して報告した（非特許文献２２）。これはＣＡＧ／ＣＴＧ反復の単離の有効な方法であると判明し、そしてこの方法を用いて、我々は１８ｑ２１．３３−ｑ２３の範囲内から双極性障害へのＣＡＧ／ＣＴＧ反復の関与を除外した（非特許文献２３）。本発明はＣＣＧ／ＣＧＧ反復の領域特異的単離の方法を適応させ、そしてそれを染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３ ＢＰ候補領域に適用した。
【非特許文献１】
Ｔｓｕａｎｇ ａｎｄ Ｆａｒａｏｎｅ（１９９０），ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｏｏｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）
【非特許文献２】
Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．）ＱＱ ｐｐ３７０−３７６
【非特許文献３】
ＭｕＧｕｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ；Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ ｐｐ１１０−１２７
【非特許文献４】
Ｅｇｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ 〜 ｐｐ７８３−７８７
【非特許文献５】
Ｍｅｎｄｌｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７，ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ １ ｐｐ１２３０−１２３２）
【非特許文献６】
Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ １２＆ｐｐ２８９−２９２
【非特許文献７】
Ｋｅｌｓｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ 〜 ｐｐ２３８−２４３
【非特許文献８】
Ｂａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ 〜 ｐｐ４９−５５
【非特許文献９】
Ｂｌａｃｋ ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 〜 ｐｐ４２７−４３０
【非特許文献１０】
Ｃｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒｉｔ Ｊ．ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ 〜 ｐｐ３５５−３５８
【非特許文献１１】
Ｂｅｒｒｅｔｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 〜 ｐｐ５９１８−５９２１
【非特許文献１２】
Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 〜 ｐｐ２９１−２９６
【非特許文献１３】
Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２ ｐｐ１０５−１１５
【非特許文献１４】
Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２２ ｐｐ１３８４−１３９４
【非特許文献１５】
ＭｃＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ １９９３
【非特許文献１６】
Ｎｙｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ １９９４
【非特許文献１７】
Ｍａｒｇｏｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９
【非特許文献１８】
Ｋｌｅｉｄｅｒｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９８
【非特許文献１９】
Ｍａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ １９９８
【非特許文献２０】
Ｅｉｃｈｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ １９９８
【非特許文献２１】
Ｋａｕｓｈｉｋ ｅｔ ａｌ ２０００
【非特許文献２２】
Ｄｅｌ Ｆａｖｅｒｏ ｅｔ ａｌ １９９９
【非特許文献２３】
Ｇｏｏｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ ２０００
【発明の開示】
【００１５】
［発明の要約］
本発明は、新規な単離された核酸配列および単離された核酸配列によりコードされる細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）タンパク質に関する。
【００１６】
新規な単離された核酸配列は、１８ｑ２１．３３−ｑ２３でＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間にある８．９ｃＭ染色体領域に位置する。酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Ｖｅｒｈｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ １９９９）を用いて物理的地図を構築した。
【００１７】
以前に記述した方法をＣＣＧ／ＣＧＧ反復の領域特異的単離に適応させ、そして染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３ ＢＰ候補領域に適用した。ＹＡＣコンティグ地図により、セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）をコードする６個の遺伝子のクラスターのＢＰ候補領域内の局在が裏付けられた。セルピンは、α１−プロテイナーゼインヒビターに高い全体的な相同性を有するタンパク質分解タンパク質のスーパーファミリーである。６個のセルピンは全て、典型的なアミノ末端の切断可能なシグナルペプチドを欠きそして細胞内もしくは両方であることができるセルピンのオボアルブミンファミリーに属する。ＣＡＰ２もしくは１８ｑ２１．３３に位置するＰ１８は、その５’ＵＴＲ領域に組み合わされたＣＡＧ−ＣＧＧ三塩基反復配列を含有し、そして脳において発現される。この研究において、我々はＣＡＰ２のゲノム構成およびエキソン／イントロン境界を決定し、そして配列変異体の一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析および変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）により該遺伝子を調べた。シーケンス、ＲＦＬＰ−ＰＣＲもしくはパイロシーケンスによる６種の一塩基多型（ＳＮＰ）の解析を７５人の症例および７５人の一致するコントロールのサンプルにおいて行った。
［発明の詳細な記述］
本発明は、第１８染色体の１８ｑ染色体候補領域に位置する遺伝子を含んでなる新規な単離された核酸配列に関する。
【００１８】
該遺伝子は、双極性スペクトル障害のような気分障害と関連する染色体領域に位置し、従って、双極性スペクトル障害の診断マーカーとして有用である。問題の領域はまた、ヒトゲノムの全体から取り除いた場合に、精神医学的健康および気分に影響を与える他の遺伝子を位置づけ、単離しそしてシーケンスするために用いることもできる。
【００１９】
特に、ＢＰ候補領域は、多数の細胞内および細胞外機能に関与する脳で発現されるセルピン、細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）をコードする遺伝子を含有する。本研究において、我々はＣＡＰ２のゲノム構成を決定し、そして全てのイントロン／エキソン境界を特定した。ＣＡＰ２は、概算される１７ｋｂのゲノム領域内に７個のエキソンを含んでなる。
【００２０】
ＣＡＰ２の突然変異解析により、３種の非同義一塩基多型（ＳＮＰ）：ｃ．２０３Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ６９Ｇｌｎ）、ｃ．９１０Ａ＞Ｇ（Ｔｈｒ３０４Ａｌａ）およびｃ．１０７６Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３５９Ｈｉｓ）；２種の同義ＳＮＰ ｃ．４７７＞Ｇおよびｃ．９４２＞Ｔならびに１種のイントロンＳＮＰ ＩＶＳ４＋９８Ａ＞Ｇが同定された。関係のないＢＰ症例および一致するコントロールにおけるＣＡＰ２多型の解析により、対立遺伝子および遺伝子型頻度においてＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞Ｔで統計的に有意な差が示された（ｐ＝０．０３）。
新規な遺伝子の単離および同定：
関連する遺伝子を同定しそして特性化する過程において、同定されたＹＡＣクローンにそして適用できる場合には本明細書において特定するような気分障害に苦しむ個体からのＤＮＡに、当業者に周知である標準的方法を適用した。例えば、本発明者等は、ヒト第１８染色体上の対象の領域中の候補遺伝子を同定する目的で、選択したＹＡＣクローンにおけるＴＲＥについてスクリーニングするために、ヒトゲノム内のトリヌクレオチド反復増加（ＴＲＥ）と気分障害における表現促進の現象との間の以前に同定された明白な関連（Ｌｉｎｄｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ２．ｐｐ５５−６２およびＯ’Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １Ｑ ｐｐ３８０−３８１）を利用することができる。様々な他の既知の方法もまた、以下に説明するように候補遺伝子を同定するために該ＹＡＣクローンに適用することができる。
【００２１】
従って、第一の態様として、本発明は、上記に特定するような気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定するための多型マーカーＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に配置されるヒト染色体１８ｑの８．９ｃＭ領域もしくはその断片の使用を含んでなる。以下に記述するように、本発明者等は、Ｄ１８Ｓ５１とＤ１８Ｓ６１との間に以前に位置づけられた１２のＳＴＲ多型マーカーと家系ＭＡＤ３１における双極性障害との共分離の解析およびその後の対立遺伝子共有解析により、そのような遺伝子の染色体１８ｑのこの候補領域を同定している。
【００２２】
本発明に従って用いることができる候補領域を含む特定のＹＡＣは、９６１．ｈ−９、９４２−ｃ．３、７６６−ｆ−１２、７３１−ｃ−７、９０７．ｅ．１、７５２−ｇ−８および７１７−ｄ−３であり、好ましいものは９６１ｈ−９、７６６．ｆ．１２および９０７−ｅ．１であり、これらは、候補領域にわたる最小のタイリング経路（ｔｉｌｉｎｇ ｐａｔｈ）を有するからである。使用のために適当なＹＡＣクローンは、Ｄ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間の絞り込んだ候補領域にわたる人工染色体を有するものである。
【００２３】
気分障害もしくは関連疾患と関連する１個もしくは複数の候補遺伝子を同定するために、ＹＡＣに存在するかどうかを問わず、上記に特定するような染色体１８ｑの候補領域に適用することができる多数の方法がある。例えば、上記のように、ヒトゲノムにおけるトリヌクレオチド反復増加（ＴＲＥ）の程度と気分障害の存在との間には明白な関連がある。
【００２４】
従って、第三の態様として、本発明は、多型マーカーＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に配置されるヒト染色体１８ｑの領域におけるヌクレオチド三塩基反復を検出することを含んでなる本明細書において特定するような気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定する方法を含んでなる。
【００２５】
該遺伝子もしくは複数の遺伝子を同定する代わりの方法は、多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間に配置されるヒト染色体１８ｑの部分を含んでなるＹＡＣクローン、例えば７個の上記のＹＡＣクローンの一つもしくはそれ以上を断片化すること、および該断片における任意のヌクレオチド三塩基反復、特にＣＡＧもしくはＣＴＧの反復を検出することを含んでなる。少なくとも５個そして好ましくは少なくとも１０個のＣＴＧおよび／もしくはＣＡＧ三塩基反復を含んでなる核酸プローブは、適切に標識した場合に検出の適当な手段である。トリヌクレオチド反復はまた、既知のＲＥＤ（反復増加検出）系（Ｓｈａｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 〜 ｐｐ１３５−１３９）を用いて決定することもできる。
【００２６】
第四の態様として、本発明は、気分障害もしくは関連疾患と関連しそして多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間のヒト染色体１８ｑの領域にわたるＹＡＣクローンに存在する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つの遺伝子を同定する方法を含んでなり、該方法は、少なくとも８個であるが好ましくは少なくとも１２個の連続したグルタミン残基の列を含んでなるアミノ酸配列を有するタンパク質を認識することができる抗体の使用によりヌクレオチド三塩基反復を含む遺伝子の発現生成物を検出するという工程を含んでなる。そのような方法は、ヒトＤＮＡ発現ライブラリーに、例えば７個の上記のＹＡＣクローンから、ＹＡＣ ＤＮＡをサブクローニングすることにより実施することができる。関連する発現生成物を検出する好ましい手段はモノクローナル抗体、特にｍＡＢ１Ｃ２の使用により、その製造および特性は国際特許出願公開第ＷＯ ９７／１７４４５号に記述されている。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、ＢＡＣ（細菌人工染色体）もしくはＰＡＣ（Ｐ１もしくはファージ人工染色体）のようなベクターまたはエキソン−トラップ（ｅｘｏｎ−ｔｒａｐ）コスミドベクターのようなコスミドベクターへの上記に特定するような（ＹＡＣ）ＤＮＡの（サブ）クローニングを含む関連する遺伝子もしくは複数の遺伝子を同定する方法に関する。そのような方法の出発点は、多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間のヒト染色体１８ｑの領域のコンティグ地図の構築である。この目的のために、本発明者等は、７個の上記のＹＡＣクローンの各々におけるヒトＤＮＡの断片の末端領域をシーケンスし、そしてこれらの配列を本明細書に開示する。上記のような他のベクターへのＹＡＣ ＤＮＡのサブクローニングの後、該サブクローンとコンティグ地図との間の重複部分を検出することができるように、本明細書に示すＹＡＣクローンコンティグに記述するような、この領域における任意の既知の配列標識部位（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）と一緒に、これらの末端配列もしくはその一部、特に本明細書において図１〜１１に示す配列を含んでなるプローブを構築することができる。現在のＹＡＣコンティグにおける既知の配列もまた、コンティグ地図サブクローンの作製に用いることができる。
【００２８】
気分障害もしくは関連疾患と関連する１個もしくは複数の遺伝子を同定することができる一つの手段は、エキソントラッピング（ｅｘｏｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ）の既知の技術の使用による。これは、特殊化したエキソン−トラップコスミドベクターの現在のプロトコルにおいてほとんどの場合利用する人工ＲＮＡスプライシングアッセイである。該ベクターは、複製起点および強力なプロモーター配列を含有するＳＶ４０ゲノムの断片、多数のクローニング部位を含有するイントロンで隔てられた２個のスプライシング能力を有するエキソンならびにＳＶ４０ポリアデニル化部位からなる人工ミニ遺伝子を含有する。
【００２９】
ＹＡＣ ＤＮＡをエキソン−トラップベクターにサブクローニングし、そして組換えＤＮＡを哺乳動物細胞の株にトランスフェクションする。ＳＶ４０プロモーターからの転写はＲＮＡ転写産物をもたらし、それは、通常、ミニ遺伝子の２個のエキソンを含むようにスプライシングする。クローニングしたＤＮＡ自体が機能性のエキソンを含有する場合、それはベクターのミニ遺伝子に存在するエキソンにスプライシングされることができる。逆転写酵素を用いてｃＤＮＡコピーを作ることができ、そして特定のＰＣＲプライマーを用いて、インサートＤＮＡのエキソンに関するスプライシング事象を同定することができる。そのような方法は、関連する遺伝子を同定するために気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体からのＤＮＡの同等領域と比較することができるＹＡＣ ＤＮＡにおけるコーディング領域を同定することができる。
【００３０】
従って、第五の態様として、本発明は、
（１）上記のように調製しそしてマッピングしたエキソントラップコスミドベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクションすること；
（２）該哺乳動物細胞を適切な培地において培養すること；
（３）ＳＶ４０プロモーターから発現されるＲＮＡ転写産物を単離すること；
（４）該ＲＮＡ転写産物からｃＤＮＡを調製すること；
（５）該サブクローニングしたＤＮＡにおけるコーディング領域の部分を解明するために該エキソントラップコスミドベクターにサブクローニングしたＤＮＡのエキソンに関するスプライシング事象を同定すること；
（６）該コーディング領域と該気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体のＤＮＡにおける同等領域との間の違いを検出すること；および
（７）該気分障害もしくは関連疾患と関連する該遺伝子またはその突然変異したもしくは多型の変異体を同定すること、
の工程を含んでなる気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異した変異体および多型を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定する方法を含んでなる。
【００３１】
エキソントラッピングの代わりの方法として、ＹＡＣ ＤＮＡをＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドもしくは他のベクターにサブクローニングし、そして上記のようにコンティグ地図を構築することができる。以下のように、サブクローニングしたＤＮＡ上の関連する遺伝子の位置を定めることができる利用可能な様々な既知の方法がある：
（ａ）ｃＤＮＡ選択もしくは捕獲（直接選択およびｃＤＮＡ選択とも呼ばれる）：この方法は、特定の（例えば脳）ｃＤＮＡライブラリーからの全てのｃＤＮＡクローンのインサートのようなｃＤＮＡの複雑な混合物に、クローニングしたＤＮＡ（例えばＹＡＣ ＤＮＡのインサート）をハイブリダイズさせることによるゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖の形成を含む。関連する配列はハイブリダイズし、そしてビオチン−ストレプトアビジン捕獲およびＰＣＲ（もしくは関連技術）を用いて次の工程において濃縮することができる；
（ｂ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション：ゲノムクローン（例えば、特定のコスミドのインサート）を培養細胞系のパネルからのｍＲＮＡのノーザンブロットにもしくは適切な（例えば脳）ｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイズさせることができる。陽性シグナルは、クローニングした断片内の遺伝子の存在を示すことができる；
（ｃ）ＣｐＧアイランド同定：ＣｐＧもしくはＨＴＦアイランドは、遺伝子の５’末端に存在することが多い短い（約１ｋｂ）低メチル化ＧＣリッチ（＞６０％）配列である。ＣｐＧアイランドは、いくつかのまれにしか切断しない制限酵素の制限部位を有することが多い。まれにしか切断しない制限部位のクラスター化は、ＣｐＧアイランド、従って可能性がある遺伝子を示す。ＣｐＧアイランドは、まれにしか切断しない酵素で消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットへのＤＮＡクローンのハイブリダイゼーションにより、もしくはアイランド−レスキューＰＣＲ（アイランドと隣接するＡｌｕ反復との間の配列を増幅することによるＹＡＣからのＣｐＧアイランドの単離）により検出することができる。
（ｄ）ズー・ブロッティング：ＤＮＡクローン（例えば、特定のコスミドのインサート）を様々な動物種からのゲノムＤＮＡサンプルのサザンブロットに対して減少したストリンジェンシーでハイブリダイズさせること。ハイブリダイゼーションシグナルの検出は保存配列を示唆し、可能性がある遺伝子を示すことができる。従って、第六の態様として、本発明は、
（１）上記のようなＹＡＣ ＤＮＡをコスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣもしくは他のベクターにサブクローニングすること；
（２）サブクローン間の重複部分を検出しそしてその地図を構築するために、本明細書に記述するＹＡＣクローンコンティグにおけるようなこの領域におけるヌクレオチド配列もしくは任意の他の配列標識部位（ＳＴＳ）、または１４個以上の連続した塩基からなるその一部もしくはその相補物を用いること；
（３）ＣｐＧアイランド同定、ズー・ブロッティング、ｃＤＮＡライブラリーもしくは培養細胞系のパネルからのｍＲＮＡのノーザンブロットへのサブクローニングしたＤＮＡのハイブリダイゼーションの一つもしくはそれ以上によりサブクローニングしたＤＮＡ内の遺伝子の位置を同定すること；
（４）該遺伝子と気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体のＤＮＡの同等領域との間の違いを検出すること；および
（５）該気分障害もしくは関連疾患と関連する該遺伝子を同定すること、
の工程を含んでなる気分障害もしくは関連疾患と関連する、その突然変異したおよび多型の変異体を包含する、少なくとも一つのヒト遺伝子を同定する方法を含んでなる。
【００３２】
クローニングしたＹＡＣ ＤＮＡをシーケンスする場合、関連する遺伝子の存在を確立するためにコンピューター解析を用いることができる。相同性検索およびエキソン予測のような技術を適用することができる。
【００３３】
本発明の方法に従っていったん候補遺伝子が単離されると、正常な個体からの遺伝子と双極性スペクトル障害のような気分障害に苦しむ個体からのものとの間でさらに詳細な比較を行うことができる。例えば、ＤＮＡ配列における突然変異もしくは多型を同定することができる、「突然変異試験」と記述されている２つの方法がある。第一のものとして、ＤＮＡサンプルを一つの特定の突然変異の有無に関して試験することができるが、これは、突然変異が何であるかもしれないかという知識を必要とする。第二のものとして、ＤＮＡのサンプルを標準（正常）ＤＮＡからの任意の偏差に関してスクリーニングする。この後者の方法は、突然変異が前もって同定されない場合に候補遺伝子を同定するのにいっそう有用である。さらに、正常なもしくは健康な個体からの遺伝子と気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体からのものとの間の違いを同定するために上記の方法により同定される遺伝子に以下の技術をさらに適用することができる：
（ａ）サザンブロッティング技術：患者および健康な個体の異なる制限酵素で消化したゲノムＤＮＡを含有するナイロン膜にクローンをハイブリダイズさせる。患者と健康な個体との間の大きな違いは、放射性ラベリングプロトコルを用いて視覚化することができる；
（ｂ）ポリアクリルアミドゲルにおけるヘテロ二本鎖移動度：この技術は、非変性ポリアクリルアミドゲルにおけるヘテロ二本鎖の移動度がホモ二本鎖の移動度より小さいということに基づく。これは２００ｂｐ未満の断片に最も有効である；
（ｃ）一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰもしくはＳＳＣＡ）：一本鎖ＤＮＡは、弱い分子内結合により安定化される複雑な構造を形成するように折り畳まる。
【００３４】
非変性ポリアクリルアミドゲル上のこれらの構造の電気泳動移動度は、それらの鎖長およびそれらの高次構造により決まる；
（ｄ）ミスマッチ化学切断法（ＣＣＭ）：放射性標識したプローブを試験ＤＮＡにハイブリダイズさせ、そしてミスマッチの部位でＤＮＡの一方の鎖を切断する一連の化学反応によりミスマッチを検出する。これは非常に高感度の方法であり、そしてキロ塩基長のサンプルに適用することができる；
（ｅ）ミスマッチ酵素切断法：該アッセイはＣＣＭと同様であるが、ある種のバクテリオファージもしくは真核生物の酵素により切断を行う；
（ｆ）変性勾配ゲル電気泳動：この技術では、変性剤（化学物質もしくは温度）の増加する量の勾配がある電気泳動ゲルを通してＤＮＡ二本鎖を移動させる。鎖が融解しそして分離するゲル上の位置にＤＮＡ二本鎖が達するまで移動は続き、その後、変性したＤＮＡはさらに移動しない。正常および突然変異体ＤＮＡ二本鎖の間の単一塩基対の違いは、それらをゲルの異なる位置に移動させるのに十分である。
（ｇ）ダイレクトＤＮＡシーケンス。
【００３５】
これらの適当なアッセイ技術のさらに詳細な説明を以下に提供する。
遺伝子型判定 本明細書において用いる場合、「遺伝子型判定」という用語は、ＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドが位置９４２でチミジン（Ｔ）を含むかどうかを決定することを意味する。「遺伝子型判定」という用語は、「遺伝子検査」、「遺伝子スクリーニング」、「対立遺伝子もしくは多型を決定することもしくは同定すること」、「分子診断」のような用語または任意の他の同様の語句と同義である。
【００３６】
適切なサンプルＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの違いを識別することができる任意の方法もまた用いることができる。実際、多数の既知の異なる方法が、本発明のＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドの遺伝子型判定（すなわち、遺伝子型を決定すること）における使用に適している。これらの方法には、ダイレクトシーケンス、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎＴＭ、分子ビーコン、ＤＮＡチップおよびアレイ上のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、単一ヌクレオチドプライマー伸長ならびにオリゴライゲーションアッセイが包含されるがこれらに限定されるものではない。
遺伝子型スクリーニング 一つの態様として、本発明は、個体からのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸の遺伝子型スクリーニングの方法を提供する。個体からのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸の遺伝子型スクリーニングの方法は、その個体からの標的サンプルからの核酸の増幅を必要とし得る。
標的サンプル 本発明の標的サンプルは、解析する個体からのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドを含んでなる任意の標的核酸であることができる。そのような核酸のアッセイには、実質的に任意の生物学的サンプル（真正（ｐｕｒｅ）赤血球以外）が適当である。例えば、都合の良い標的サンプルには、全血、白血球、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、口腔（ｂｕｃｃａｌ）、皮膚および毛髪が包含されるがこれらに限定されるものではない。ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡのアッセイには、標的サンプルは、典型的に、標的核酸が発現される細胞もしくは器官から得られる。
遺伝子型判定ＳＮＰ 多数の異なる方法がＳＮＰの遺伝子型を決定することにおける使用に適している。これらの方法には、ダイレクトシーケンス、ＰＣＲ− ＲＦＬＰ、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ、ＴａｑｍａｎＴＭ、分子ビーコン、ＤＮＡチップおよびアレイ上のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、単一ヌクレオチドプライマー伸長ならびにオリゴライゲーションアッセイが包含されるがこれらに限定されるものではない。適切なＤＮＡ配列における単一ヌクレオチドの違いを識別することができる任意の方法もまた用いることができる。
増幅 本明細書において用いる場合、「増幅」という用語は、鋳型特異性を伴う核酸複製を意味する。鋳型特異性は、「標的サンプル」もしくは「標的配列」特異性に関する。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることが求められるという意味で「標的」である。その結果として、増幅技術は、主としてこれを選別するために設計されている。増幅方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特定の対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＡＳＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自律配列複製および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
ＴＡＱＭＡＮ 遺伝子型を決定するのに適当な手段は、ＴａｑｍａｎＴＭ技術に基づくことができる。ＴａｑｍａｎＴＭ技術は、以下の米国特許４，６８３，２０２；４，６８３，１９５および４，９６５，１８８に開示されている。ＴａｑｍａｎＴＭ対立遺伝子識別アッセイに含まれるウラシルＮ−グリコシラーゼの使用は、米国特許５，０３５，９９６に開示されている。
ＰＣＲ ＰＣＲ技術は当該技術分野において周知である（例えば、ＥＰ−Ａ−０２００３６２およびＥＰ−Ａ−０２０１１８４ならびに米国特許第４ ６８３ １９５号および第４ ６８３ ２０２号を参照）。標的配列を増幅する工程は、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを導入することおよびその後のＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な一連の温度サイクリングからなる。ＰＣＲでは、例えばゲノムＤＮＡにおける特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法論（標識したプローブでのハイブリダイゼーション、ビオチン化したプライマーの導入およびその後のアビジン−酵素結合体検出、ならびに増幅配列へのｄＣＴＰもしくはｄＡＴＰのような３２ｐで標識したデオキシヌクレオチド三リン酸の導入のような）による検出可能なレベルに増幅することが可能である。あるいはまた、差次的に標識し、従って各々検出することができるプライマーで異なる多型部位（マーカー）を増幅することが可能である。多数のマーカーを解析する一つの手段は、各マーカーを異なる蛍光プローブで標識することを含む。次にＰＣＲ生成物を蛍光に基づく自動シーケンサーで解析する。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列をプライマー分子の適切な組で増幅することができる。特に、ＰＣＲ工程自体によって生じる増幅断片は、それら自体が次のＰＣＲ増幅の効率のよい鋳型である。例として、ＰＣＲはまた、ヒトにおけるもしくはヒトからのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドの適当な部分を増幅するプライマーを同定するために用いることもできる。
プライマー 本発明はまた、一連の有用なプライマーも提供する。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「プライマー」という用語は、適切なバッファーにおいてそして適当な温度で適切な条件下で（すなわち、４種の異なるヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合のための因子の存在下で）鋳型指示ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドをさす。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される用途により決まるが、典型的には１５〜３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにいっそう冷たい温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。
【００３８】
「プライマー部位」という用語は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域をさす。
【００３９】
「プライマー対」という用語は、増幅するＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流プライマーおよび増幅する配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’下流プライマーを含む一組のプライマーを意味する。
【００４０】
本発明のプライマーはＤＮＡもしくはＲＮＡ、および一本鎖もしくは二本鎖であることができる。あるいはまた、プライマーは、天然に存在するかもしくは合成であることができるが、典型的には合成手段により製造される。
プライマーハイブリダイゼーション条件 本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合をさす。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子により影響を受ける。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う、温度、イオン強度および有機溶媒のような他の化合物の存在の条件に関して用いる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、典型的に、ストリンジェントな条件下で、例えば、１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で行う。例えば、５Ｘ ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸Ｎａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５−３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プライマーハイブリダイゼーションに適している。
対立遺伝子特異的プライマー 対立遺伝子特異的プライマーは、多型に重なる標的ＤＮＡ上の部位にハイブリダイズし、そしてプライマーが完全な相補性を示す対立遺伝子型の増幅のみをプライミングする（Ｇｉｂｂｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７，２４２７−２４４８（１９８９）を参照）。このプライマーは、遠位部位でハイブリダイズする第二のプライマーとともに用いることができる。増幅はこれら２個のプライマーから進行し、特定の対立遺伝子型が存在することを示す検出可能な生成物をもたらす。コントロールは、一方が多型部位で単一塩基ミスマッチを示しそしてもう一方が遠位部位に完全な相補性を示すもう一対のプライマーで行うことができる。単一塩基ミスマッチは増幅を妨げ、そして検出可能な生成物は形成されない。多型と一列に並ぶオリゴヌクレオチドの最も３’の位置は、プライマーからの伸長に最も不安定であるので、この位置にミスマッチが含まれる場合に該方法は最もうまくいく（例えばＷＯ ９３／２２４５６を参照）。
【００４３】
単一塩基ミスマッチを検出するために特異的ハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーションプローブは、当該技術分野において既知でありそしてＭａｎｉａｔａｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒに記述されている方法に従って設計することができる。
【００４４】
（ｉ）ＰＣＲプライマー 好ましくは、スクリーニングは、ヌクレオチド９４２を含むヒトのＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）の部分を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いて実施する。
【００４５】
そのようなＰＣＲプライマーの例を配列番号９および１０として示す。
増幅した標的配列における多型の検出 増幅した核酸配列は、対立遺伝子特異的プローブ、タイリングアレイ、ダイレクトシーケンス、変性勾配ゲル電気泳動および一本鎖高次構造多型（ＳＣＣＰ）解析が包含されるがこれらに限定されるものではない方法を用いて検出することができる。
対立遺伝子特異的プローブ 二人の個体からのそれぞれの断片における異なる多型の型の存在のために一方の個体からの標的ＤＮＡの断片にハイブリダイズするがもう一方の個体からの対応する断片にハイブリダイズしない対立遺伝子特異的プローブを設計することができる。
【００４６】
本明細書において用いる場合、「プローブ」という用語は、精製された制限消化産物におけるように天然に存在しようともしくは合成で製造しようと、対象の別のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をさす。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、典型的に、核酸の相補鎖に塩基特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドである。
【００４７】
本発明のプローブは、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光、放射性および発光系が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の検出系においてそれが検出可能であるように任意の「レポーター分子」で標識することができる。対象の標的配列（すなわち、検出される配列）もまた、レポーター分子で標識することができる。本発明は、任意の特定の検出系もしくは標識に限定されない。
【００４８】
本発明のプローブに選択するハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な差、好ましくは本質的に２値の応答（ｂｉｎａｒｙ ｒｅｓｐｏｓｅ）があり、それによりプローブが対立遺伝子の一方のみにハイブリダイズするように十分にストリンジェントである。典型的なハイブリダイゼーション条件は、１塩基対ミスマッチを決定することができるように本発明の対立遺伝子特異的プライマーに上記に示したようなストリンジェントな条件である。
タイリングアレイ 本発明の多型はまた、核酸アレイへのハイブリダイゼーションにより同定することもでき、そのいくつかの例はＷＯ ９５／１１９９５に記述されている。「タイリング」という用語は、一般に、解析する配列（「標的配列」）に相補的な配列ならびにその配列のあらかじめ選択したバリエーションで構成されている特定の一組のオリゴヌクレオチドプローブの合成を意味する。これらのバリエーションには、通常、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドでの１個もしくはそれ以上の塩基位置での置換が含まれる。
ダイレクトシーケンス 本発明の多型の配列の直接解析は、ジデオキシ連鎖停止法もしくはマクサム・ギルバート法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．，ＣＳＨＰ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９を参照）のいずれかを用いて、または例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡシーケンサーで解析するＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンス化学を用いる標準的なＡＢＩシーケンス技術を用いて実施することができる。好ましくは、本発明のアッセイに用いる多型は、同定された配列のＰｓｔＩ制限解析で生じる断片の有無により同定する。
１．５変性勾配ゲル電気泳動 ＰＣＲを用いて生成される本発明の増幅生成物はまた、変性勾配ゲル電気泳動の使用により解析することもできる。異なる対立遺伝子は、溶液中のＤＮＡの異なる配列依存的融解特性および電気泳動移動度に基づいて同定することができる。Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２），第７章。
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析 本発明の標的配列の対立遺伝子はまた、Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２７６６−２７７０（１９８９）に記述されているように、一本鎖ＰＣＲ生成物の電気泳動移動度の変化により塩基の違いを同定する一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析を用いて識別することもできる。増幅ＰＣＲ生成物を上記のように生成せしめ、そして加熱するかもしくはそうでなければ変性させて、一本鎖増幅生成物を生成せしめることができる。一本鎖核酸は、塩基配列に部分的に依存する二次構造を再生するかもしくは形成することができる。一本鎖増幅生成物の異なる電気泳動移動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の違いに関係することができる。
試験配列とコントロール配列との間の違いを同定すること 増幅された核酸配列のこれらの検出方法は、基準核酸配列と試験核酸配列との間の変異の１つもしくはそれ以上の点の違いを同定するためにまたは２人もしくはそれ以上の個体からのＣＡＰ２遺伝子の異なる多型の型を比較するために用いることができる。
基準核酸配列 本明細書において用いる場合、「基準核酸配列」は、そのアッセイにおいて試験する対立遺伝子の各々のホモ接合体である一人もしくはそれ以上の個体に相当するコントロールＤＮＡ配列のようなコントロール核酸配列を意味する。例として、コントロールＤＮＡ配列には：（ｉ）ホモ接合体の個体からのゲノムＤＮＡ；（ｉｉ）ホモ接合体の個体から増幅される関連したＳＮＰを含有するＰＣＲ生成物；または（ｉｉｉ）プラスミドもしくは他の適当なベクターにクローニングされている関連したＳＮＰを含有するＤＮＡ配列を包含することができるがこれらに限定されるものではない。コントロールサンプルはまた、対立遺伝子の既知の組からの複数の対立遺伝子を含んでなる対立遺伝子ラダーであることもできる。各々異なる対立遺伝子もしくは対立遺伝子の組を含有する複数のコントロールサンプルがあることができる。他の基準／コントロールサンプルには、典型的に、図表示、文書表示、鋳型またはＰＣＲ生成物もしくは核酸の他の断片における多型の存在を同定するのに適当な任意の他の手段が包含される。「基準核酸配列」、基準サンプルおよびコントロールサンプルという用語は、本文の全体にわたって互換的に用いる。
Ｈ．治療用途 本発明の一つの態様は、双極性気分障害にかかりやすい素因に関して個体をスクリーニングすること、およびポリヌクレオチド素因が同定される場合に、双極性気分障害を遅らせるかもしくは軽減するかもしくは防ぐためにその個体を処置することを提供する。
【００４９】
本発明のこの態様の実施形態として、双極性気分障害にかかりやすい個体の素因は、上記に説明する検出の方法を用いて個体がヌクレオチド９４２がチミジン（Ｔ）であるＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドのホモ接合体であるか、位置９４２のグアノシン（Ｇ）がチミジン（Ｔ）で置換されるＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドのヘテロ接合体であるか、もしくはヌクレオチド９４２がグアノシン（Ｇ）であるＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチドのホモ接合体であるかを決定することにより評価する。
【００５０】
従って、該多型に関して、位置９４２でＴ／Ｔホモ接合体である個体は、危険性が最も高いと分類される。Ｇ／Ｔヘテロ接合体である個体は、中程度の危険を有すると分類される。Ｇ／Ｇホモ接合体である個体は、最も低い危険性のカテゴリーにあると分類される。
【００５１】
場合により、個体の危険因子の評価は、ＣＡＰ２をコードするポリヌクレオチド多型の存在並びに既知のポリヌクレオチド指標もしくは生理学的指標もしくは他の指標の両方を参照することにより計算される。このように本発明は、個体の危険性の測定が基づくことができるさらなる情報を提供する。
一般的な方法論参考文献 一般に、本明細書に記述する技術は当該技術分野において周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照することができる。
【００５２】
本明細書に記述する方法に関して、ＹＡＣからのコーディング領域と気分障害もしくは関連疾患に苦しむ個体のＤＮＡとの間の違いを検出する工程において、該個体はその疾患にかかっている誰でもあることができ、そして必ずしも家系ＭＡＤ３１の一員であるとは限らないと理解される。
【００５３】
さらなる態様によれば、本発明は、気分障害もしくは関連疾患と関連しそして上記の方法のいずれかにより得ることができる単離されたヒト遺伝子およびその変異体、該遺伝子によりコードされる単離されたヒトタンパク質ならびに該タンパク質をコードするｃＤＮＡを提供する。
【００５４】
いったん遺伝子が同定されると、コードされるタンパク質の機能を決定するために多数の方法が利用可能である。これらの方法は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．１５，Ｊｕｎｅ ２０００）により記述されており、そして引用することにより本明細書に組み込まれる。一つの方法は、ゲノム配列から機能連鎖を示す算定法を含み、そして遺伝子近接法（ｇｅｎｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる。いくつかのゲノムにおいて、２個のタンパク質をコードする遺伝子が染色体上で近接する場合、これらのタンパク質は機能的に関連している傾向がある。この方法は、オペロンが一般的である原核生物における機能連鎖を明らかにすることにおいて有効であることができるが、真核生物における相互作用するタンパク質を解析することにも効果を発揮する。
ＣＡＰ−２遺伝子
１７．１ｋｂのゲノムにわたる５’ＵＴＲおよび６個のコーディングエキソンを含有する細胞質アンチプロテイナーゼ２遺伝子（ＣＡＰ２）の完全なイントロン−エキソン構造を本明細書に開示する。イントロンのサイズを測るために、ＣＡＰ２ ｃＤＮＡ配列にわたるプライマーの異なる組み合わせを用いる。このようにして、５個のイントロンのサイズおよびエキソン−イントロン境界配列を得た。スプライス連結部の５’供与および３’受容部位は、共通配列と相関関係があった（表１）。第一の５’ＵＴＲエキソンは非常に小さく（７３ｂｐ）、そして多型であるがＭＡＤ３１ベルギー人家系においても罹患およびコントロール集団においても増加していないと判明した（ＣＡＧ）２（ＣＧＧ）６（ＣＡＧ）６配列を含有する。
【００５５】
ＣＡＰ２から得られるアミノ酸配列は、胎盤トロンビンインヒビターもしくはＰＩ６（６８％の同一性）およびプロテイナーゼインヒビター９ ＰＩ９（６３％）を包含する細胞質セルピンのオボアルブミンファミリーの他のヒトメンバーに高度の同一性を示す。５種のエキソン多型が同定され、これらから３種はアミノ酸変化をもたらす。ＰＩ６およびＰＩ９のアミノ酸配列とＣＡＰ２の推定一次構造との整列により、アミノ酸位置６８で、ＣＡＰ２はＡｒｇもしくはＧｌｎのいずれかであることができ、そしてＰＩ６ではＧｌｎであることが示された。同様に、アミノ酸位置３５９で、ＣＡＰ２はＡｒｇもしくはＨｉｓのいずれかを示し、そしてＰＩ６はＨｉｓを示す１５。さらに、アミノ酸位置３０４で、ＣＡＰ２はＴｈｒもしくはＡｌａのいずれかを示し、そしてＰＩ９はＡｌａを示す。逆に、アミノ酸位置３１４で、ＣＡＰ２はＡｌａを示し、一方、ＩＰ６およびＩＰ９はＶａｌを示す。
【００５６】
ＤＨＰＬＣにより検出されるこれらの変異体のうち２種（ｃ．９１０Ａ＞Ｇおよびｃ．９４２Ｃ＞Ｔ）は、ＳＳＣＰ解析により以前に同定されなかった。
【００５７】
ベルギー系の７５／７５症例−コントロールサンプルにおける関連解析を適用した。症例およびコントロールは、民族性、性別、年齢に関して厳密に一致させた。６種のＳＮＰの対立遺伝子および遺伝子型頻度の比較により、６種のＳＮＰのうち５種で患者とコントロールとの間に有意な関連は示されなかった。エキソン７におけるＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞Ｔ置換の頻度は、ＢＰ患者とコントロールとの間で有意に異なり：ＢＰ患者は、コントロールと比較した場合にＴ対立遺伝子の頻度が高かった（ｐ＝０．０３）。６種のＳＮＰは同じ遺伝子内に位置するが、これらのうち４種は連鎖不平衡になかった。ＳＮＰ ｃ．２０３Ｇ＞ＡとＳＮＰ ＩＶＳ４＋９８Ａ＞Ｇとの間に非常に強いＬＤがあったが、コントロールにおいてのみであった。ＢＰ症例では、これら２種のＳＮＰ間のＬＤは弱かった。さらに、ＣＡＰ２−ＣＡＧ−ＣＧＧ反復とＣＡＰ２ ＳＮＰとの間でＬＤは見出されなかった。ＢＰ障害およびＣＡＰ２ ＳＮＰで関連の強い証拠が見出されなかったことは、我々の集団における有意なＬＤ結果の欠如と一緒に、ＣＡＰ２がＢＰ障害の病因において主要な役割を果たしていないかもしれないことを示唆する。
【００５８】
家系ＭＡＤ３１の１人の罹患個体において、Ｄ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９６９との間で近位組換えが起こった１１。ＣＡＰ２遺伝子はこれらの２種のマーカーの間に位置する。ＣＡＰ２−ＳＮＰは、この近位組換えが遺伝子の下流で起こったことを示した。
【実施例１】
【００５９】
Ａ．家系、患者およびコントロール被験体
ＢＰＩＩ発端者を有するベルギー人家系、ＭＡＤ３１における家系および臨床診断は他の所で詳細に記述された１０。簡潔に言えば、家系ＭＡＤ３１における異なる臨床診断は以下のとおりである：１ ＢＰＩ、２ ＢＰＩＩ、２ ＵＰ、４ 大鬱病性障害（ＭＤＤ）、１ 統合失調性躁病（ＳＡｍ）および１ 統合失調性鬱病（ＳＡｄ）。
【００６０】
症例−コントロールサンプルは、ブリュッセルのＥｒａｓｍｅ病院で確かめられたベルギー系の７５人の関係のない患者、ならびに病院における告示によって募集された７５人の年齢、性別および民族性の一致するコントロール被験体からなった。全てのコントロール個体は、精神医学症状を除くために面接した。患者は、ＢＰ障害の研究診断基準（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）１６を満たした。
Ｂ．ＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、ＣＡＰ２ ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ４０３７７）１５にわたる６つの重複するプライマー組を用いて増幅した。約５０ｎｇのゲノムＤＮＡもしくは１ｎｇのｃＤＮＡおよび１０ｐｇの各プライマーを標準的なＰＣＲ反応において使用した。増幅条件は以下のとおりであった：９４℃で４分間の最初の変性工程、続いて１分間９４℃、１分間５５℃、２分間７２℃で３５サイクル、および７２℃で１０分間の最後の伸長期間。
Ｃ．サザンブロット解析
家系ＭＡＤ３１の３人の罹患メンバーおよび２人の非罹患メンバーからのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで別個に消化し、そして１％アガロースゲル上で泳動した。サザンブロッティングは、標準プロトコル１７に従って実施した。
【００６１】
５０ｎｇのＣＡＰ２ ｃＤＮＡをランダムプライムラベリング（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションは、６５℃でＣｈｕｒｃｈバッファーにおいて一晩実施した。次に、膜を６５℃で１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて１回、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて１回、そして０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおいて２回洗浄し、続いてＫｏｄａｋ Ｘ線フィルムに−７０℃で７２時間露出した。
Ｄ．ＳＳＣＰおよびＤＨＰＬＣ解析
ＰＣＲ増幅したＤＮＡは、あらかじめ成形されたすぐに使用できるゲルおよびＨｙｄｒｏｌｉｎｋ ５％グリセロールゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でＤＮＡ解析システムを用いてＳＳＣＰにより解析した。
【００６２】
変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）は、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した自動機器で実施した。粗ＰＣＲ生成物をＤＮＡＳｅｐカラム上に載せ、そして０．９ｍｌ／分の一定の流速で、０．１Ｍトリエチルアミンアセテートバッファー（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７におけるアセトニトリル勾配を用いてカラムから溶出した。勾配は、溶離剤ＡおよびＢを混合することにより作製した。溶離剤Ａは０．１Ｍ ＴＥＡＡ、０．１Ｍ Ｎａ４ＥＤＴＡであった。溶離剤Ｂは０．１Ｍ ＴＥＡＡ中２５％のアセトニトリルであった。ヘテロ二本鎖分子の成功した分離に必要な勾配および温度は、Ｗａｖｅｍａｋｅｒバージョン３．４．４により予測した。
Ｅ．ＤＮＡシーケンス
シーケンスは、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３７７自動シーケンサーおよびＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＥ）を用いてプラスミドＤＮＡもしくはゲル精製したＰＣＲ鋳型に行った。ＰＣＲ断片は最初にアガロースゲル上で視覚化し、そして次にＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡフィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてゲル精製した。
Ｆ．パイロシーケンス
ビオチン化したＰＣＲ生成物をストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上に固定した。ｓｓＤＮＡは、固定したＰＣＲ生成物を５０μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨにおいて５分間インキュベーションし、続いて１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート ｐＨ７．６において２回連続して洗浄することにより得た。プライマー エキソン７−１０２５（５’−ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＣ−３’）は、エキソン７におけるＳＮＰ ｃ．９４２の検出のためのパイロシーケンスプライマーとして用いた。プライマーアニーリングは、７２℃で２分間そして次に室温で５分間のインキュベーションにより行った。パイロシーケンスは、ＰＳＱ９６パイロシーケンサー（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。
Ｇ．統計解析
ＢＰ症例およびコントロールの全対立遺伝子および遺伝子型分布を比較し、そしてＧｅｎｅｐｏｐ１８を用いてハーディー・ワインバーグ平衡を試験した。対立遺伝子および遺伝子型特異的比較は、カイ二乗解析もしくは必要に応じてフィッシャーの直接確率検定を用いて行った。遺伝子型判定した全てのＳＮＰのデータを合わせる複数点関連解析にはＤｉｓｍｕｌｔプログラム１９を用いた。連鎖不平衡（ＬＤ）は、ＧｅｎｅｐｏｐのＬｉｎｋｄｏｓを用いて計算した。患者およびコンロトールにおけるハプロタイプ頻度を概算するために、最尤法に基づくＡｒｌｅｑｕｉｎアルゴリズムを適用した２０。
Ｈ．ＣＡＰ２遺伝子のゲノム構造
我々は、ＣＡＰ２遺伝子のゲノム構造を決定した。第一に、家系ＭＡＤ３１の５人の選択したメンバー（３人の罹患および２人の非罹患）からのＨｉｎｄＩＩＩでそしてＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡを含有する２枚の異なるサザンブロットに対してＰＣＲで得られたＣＡＰ２ ｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせることによりＣＡＰ２遺伝子をゲノム再編成に関して解析した。観察されるハイブリダイズしたバンドに基づき、２５ｋｂの最小ゲノムサイズが概算された。罹患および非罹患個体のハイブリダイゼーションパターンの間で違いは認められなかった。
【００６３】
ｃＤＮＡプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲからイントロンの位置およびサイズが得られた。シーケンスの後、ｃＤＮＡおよびゲノム配列の比較により正確なエキソン−イントロン境界を決定した（表１）。これらのゲノム配列からイントロンプライマーを設計した（表４）。
【００６４】
【表１】
この解析により、ＣＡＰ２は７３ｂｐ（エキソン１）〜４０５ｂｐ（エキソン７）におよぶサイズを有する１個の非コーディングエキソンおよび６個のコーディングエキソンを含有することが示された（図１および表１）。イントロン２〜６のサイズはＰＣＲにより決定し、そして１．３Ｋｂ（イントロン２）〜１．８Ｋｂ（イントロン３）であった（図１）。これらの実験が進行中であった間に、ＣＡＰ２遺伝子を含有するＢＡＣ ７９３Ｊ２の完全な配列が利用できるようになった（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００９８０２）。エキソン−イントロン境界配列、イントロンおよびエキソンサイズを確かめ、そしてイントロン１のサイズを８．１ｋｂと決定した。全体で、ＣＡＰ２遺伝子は１７．１ｋｂのゲノム領域にわたる。
【００６６】
ＣＡＰ２遺伝子の方向を定めるために、ＣＡＰ２−ＣＡＧ断片化ＹＡＣ２１をＬ４０３７７（ＣＡＰ２エキソン７）を含む遺伝子に対してセントロメアおよびテロメアのＳＴＳマーカーの存在に関して解析した。ＰＣＲ解析により、ＣＡＰ２に対してセントロメアのマーカーでの陽性ヒットおよび遺伝子に対してテロメアのマーカーでの増幅の欠如が示され、ＣＡＰ２の転写方向がセントロメアからテロメアへであることが示された。
【００６７】
【表２】
突然変異検出および解析
２４人のＢＰ患者のＤＮＡから全てのエキソンをＰＣＲ増幅するためにイントロンプライマーを設計した。ＳＳＣＰ解析を用いてＰＣＲ生成物を突然変異に関してスクリーニングした。２種の非同義ＳＮＰがｃ．２０３Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ６８Ｇｌｎ）およびｃ．１０７６Ｇ＞Ａ（Ａｒｇ３５９Ｈｉｓ）で同定された。Ｌｅｕをコードする１種の同義ＳＮＰがｃ．４７７Ａ＞Ｇ（コドン１５９）で同定された。さらに、１種のＳＮＰがイントロン４、ＩＶＳ４＋９８Ａ＞Ｇにおいて検出された。これらの結果はＤＨＰＬＣ解析により確かめられ、そしてｃ．９１０Ａ＞Ｇ（Ｔｈｒ３０４Ａｌａ）およびＡｌａをコードするｃ．９４２Ｃ＞Ｔ（Ａｌａ３１４Ａｌａ）におけるものの、エキソン７における２種の追加のＳＮＰの同定をもたらした（表２）。
【００６９】
【表３】
７５人の関係のない双極性患者および７５人の一致するコントロールにおけるＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析をこれらの変異体のうち３種について行った：ＳＮＰ ＩＶＳ４＋９８Ａ＞ＧにはＲｓａＩ−ＲＦＬＰアッセイを適用した。ＳＮＰ ｃ．９１０Ａ＞ＧにはＰｖｕＩＩ−ＲＦＬＰ解析を適用した。ＳＮＰ ｃ．１０７６Ｇ＞ＡにはＨｈａＩ−ＲＦＬＰ解析を適用した。ＳＮＰ ｃ．４７７Ａ＞Ｇおよびｃ．２０３Ｇ＞Ａは、ゲノムＤＮＡから作製したＰＣＲ断片のダイレクトシーケンスにより解析した。ＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞Ｔを解析するためにはパイロシーケンスを用いた。
【００７１】
これらのＳＮＰのうち５種において対立遺伝子頻度もしくは遺伝子型分布におけるＢＰ患者とコントロールとの間の有意な差はなかった。しかしながら、ＳＮＰ ｃ．２０３Ｇ＞Ａ（ｐ＝０．０５）およびｃ．４７７Ａ＞Ｇ（ｐ＝０．０３）のハーディー・ワインバーグ平衡のわずかな偏差が、両方ともＢＰにおいてあり、これは過剰のヘテロ接合体によってもたらされる（ｅｘ３ではｐ＝０．０３；ｅｘ５ではｐ＝０．０２）。さらに、コントロールにおいてＳＮＰ ｃ．２０３Ｇ＞Ａのわずかに過剰のヘテロ接合体がある（ｐ＝０．０４）
ＳＮＰ ｃ．９４２Ｃ＞ＴのＴ対立遺伝子は、コントロール（１％）におけるよりＢＰ症例（６％）において有意に高い頻度を有した（χ２＝４．８３；ｐ＝０．０３）。遺伝子型を比較する場合、２／７５（３％）のコントロールと比較して９／７３（１２％）が１個のＴ対立遺伝子を有した（χ２＝５．０２；ｐ＝０．０３）。興味深いことに、性別の層化後にデータを解析した場合、有意な差が認められた。男性では、Ｔ対立遺伝子はＢＰ患者において８％の頻度を有し、一方、コントロールにおいてそれは認められなかった（フィッシャーの直接確率検定、ｐ＝０．０３）。女性では、対立遺伝子もしくは遺伝子型分布における違いは症例とコントロールとの間で認められなかった。
【００７２】
これらの結果を確かめるために、関係のない患者および一致するコントロール群を拡張し、そして１１３人のＢＰ患者および１６３人の年齢、性別および民族性の一致するコントロールにおいて最終的な遺伝子型判定関連解析を行った。表３は、患者およびコントロール集団におけるこれらの多型の対立遺伝子および遺伝子型頻度を示す。
【００７３】
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】１８ｑ２１．３３−ｑ２３ ＢＰ候補領域（Ｖｅｒｈｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ １９９９）の最小のＹＡＣタイリング経路。ＹＡＣを実線で、ＣＣＧ／ＣＧＧ断片化生成物を点線で表す。括弧の間のＹＡＣサイズは、ＰＦＧＥ解析により概算される。詰まった丸は、陽性のＳＴＳ／ＳＴＲヒットを示す。斜線付きボックスは、ＹＡＣ断片化により単離されたＣＣＧ／ＣＧＧ反復および３つのＣｐＧアイランドを強調する。
【図２】細胞質アンチプロテイナーゼ２（ＣＡＰ２）遺伝子のゲノム構造。黒色のボックスはエキソンを表し、そしてｂｐ単位のそれらのサイズをボックスの上に示す。イントロンサイズはｋｂ単位である。組み合わされたＣＡＧ−ＣＧＧ反復を示す。転写開始および終始コドンを示す。
Claims (13)
- 個体からのサンプルにおいて、個体のＣＡＰ２遺伝子における一塩基多型を決定すること、およびＣＡＰ２遺伝子における多型を参照することにより個体の状態を決定することを含んでなる個体におけるＢＰもしくはＢＰに対する感受性を診断する方法。
- 個体の一塩基多型がＣＡＰ２遺伝子における多型と連鎖不平衡にある請求項１に記載の方法。
- 一塩基多型がＳＮＰ ｃ．９４２Ｇ＞Ｔに等しい請求項１もしくは２に記載の方法。
- 個体のＣＡＰ２遺伝子における一塩基多型が、ＡＲＭＳ法およびサザンブロッティング技術のような制限断片長多型、ＳＳＣＰ解析、ミスマッチ化学切断法および変性高速液体クロマトグラフィーから選択される方法により決定される請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
- 個体のＣＡＰ２遺伝子における一塩基多型が、一塩基多型を含有するＣＡＰ２遺伝子の断片を増幅する１対のＰＣＲプライマーを用いて決定される請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
- 一塩基多型がＳＮＰ ｃ．９４２Ｇ＞Ｔからなる請求項５に記載の方法。
- ＣＡＰ２遺伝子の断片を増幅するＰＣＲプライマー対が、配列番号９および配列番号１０の配列を含んでなるフォワードおよびリバースプライマーからなる請求項５に記載の方法。
- 一塩基多型を含有するＣＡＰ２遺伝子の断片を増幅することができる１対のＰＣＲプライマー。
- 配列番号９および配列番号１０の配列を含んでなるフォワードおよびリバースプライマーからなる１対のＰＣＲプライマー。
- 請求項８もしくは９に記載のＰＣＲプライマー対を含んでなる診断キット。
- 個体のＣＡＰ２遺伝子における一塩基多型が、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによって決定される請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
- 個体のＣＡＰ２遺伝子における一塩基多型ＳＮＰ ｃ．９４２Ｇ＞Ｔを検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ。
- 請求項１２に記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含んでなる診断キット。
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