CZ20002282A3 - Gen asociovaný s poruchou nálady, jeho použití a způsob identifikace - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje použití úseku lidského chromozomu 18q velikosti 8,9 cM, ležícího mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S79 nebo jeho fragmentu pro identifikaci alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných nebo polymorfních variant, který je asociován s poruchou nálady nebo příbuznými poruchami. Také poskytuje způsob stanovení náchylnosti jedince k poruše nálady nebo příbuzné poruše, který obsahuje analýzu vzorku DNA na přítomnost úseku trinukleotidových repetic ve výše zmíněné oblasti. Dále poskytuje polynukleotidové sekvence užitečné pro detekci přítomnosti takových úseků trinukleotidových repetic.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká určení genetických faktoru sdružených s psychickým zdravím se zvláštním zřetelem na lidský gen nebo geny, které k němu přispívají nebo jsou zodpovědné za projevy poruchy nálady nebo příbuzné poruchy u postižených jedinců.

Hlavně, i když ne výlučně, vynález poskytuje způsob identifikace a charakterizace takového genu nebo genů lidského chromozomu 18, a také genů takto identifikovaných a jejich expresních produktů. Vynález se také týká způsobů určován genetické vnímavosti jedince k poruše nálady nebo příbuzné poruše. Poruchami nálady nebo příbuznými poruchami se míní následující poruchy, jak jsou definovány v knize Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, verze 4 (DSM-IV) taxonomie (kódy DSM-IV v závorkách): poruchy nálady (296.XX, 300.4, 311, 301.13, 295.70), schizofrenie a příbuzné poruchy (295.XX, 297.1, 298.8, 297.3, 298.9), úzkostné poruchy (300.XX, 309.81, 308.3), poruchy přizpůsobování (309.XX) a poruchy osobnosti (kódy 301.XX).

Způsoby podle vynálezu jsou konkrétně uvedeny ve vztahu ke genetickým faktorům na příkladu rodiny s poruchou nálady známou jako poruchy bipolárního (BP) spektra.

Dosavadní stav techniky

Bipolární porucha (BP) je vážný psychiatrický stav, který je charakterizován poruchami nálady v rozsahu od ·· ·· • · naprostého stavu euforie k vážnému stavu dysforie (deprese) . Byly popsány dva typy bipolární nemoci: typ I nemoci BP (BPI) je charakterizován hlavními epizodami deprese vystřídanými fázemi mánie a typ II nemoci BP (BPII) je charakterizován hlavními epizodami deprese vystřídanými fázemi hypománie. Příbuzní probandů s BP mají zvýšené riziko BP, unipolární poruchy (pacienti, kteří prožívají pouze epizody deprese, UP) , cyklotymie (menší epizody deprese a hypománie, CY) , a také schizoafektivní poruchy manického (SAm) a depresivního typu (SAd). Na základě těchto pozorování jsou BP, CY, UP a SA klasifikovány jako poruchy BP spektra. Pro zapojení genetických faktorů do etiologie poruch BP spektra svědčí studie prováděné na rodinách, dvojčatech a adoptivních rodinách (Tsuang and Faraóne, The Genetics of Mood Disorders, Baltimore, The John Hopkins University Press, 1990). Avšak přesný typ dědičnosti je neznámý. V některých studiích komplexní segregační analýza podporuje existenci jednoho hlavního lokusu pro BP (Spence et al. , Am. J. Med. Genet., Neuropsych. Genet., 60, 370-376, 1995). Jiní vědci navrhují model prahového rizika, ve kterém riziko rozvoje poruchy vyplývá z aditivní kombinace četných genetických faktorů a vlivu životního prostředí (McGuffin et al., Affective Disorders, Seminars in Psychiatrie Genetics, Gaskell, London, 110-127, 1994).

Díky složitému způsobu dědičnosti jsou aplikovány parametrické a neparametrické vazbové strategie na rodiny, ve kterých se zdá, že porucha BP se dědí mendelovským způsobem. Dřívější nálezy vazby na chromozomech Ílpl5 (Egeland et al., Nátuře, 325, 783-787, 1987) a Xq27-q28 (Mendlewicz et al., The Lancet, 1, 1230-1232, 1987, Baron et al., Nátuře, 326, 289-292, 1987) byly kontroverzní a reprodukována (Kelsoe et al., Nátuře, nemohly být původně 242, 238-243, 1989,

Baron et al., Nátuře Genet., 3, 49-55). S rozvojem lidské genetické mapy zaplněné vysoce polymorfními markéry a ustavičným vývojem technik analýzy dat byly započaty mnohé nové studie na hledání vazby. V několika studiích byl nalezen důkaz nebo náznak důkazu pro vazbu ke konkrétním oblastem na chromozomech 4, 12, 18, 21 a X (Blackwood et al. , Nátuře Genet., 12, 427-430, 1996, Craddock et al., Brit. J. Psychiatry, 164, 355-358, 1994, Berrettini et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA, 91, 5918-5921, 1994, Straub et al.,

Nátuře Genet., 8, 291-296, 1994 a Pekkarinen et al. , Genome

Research, 5, 105-115, 1995). Aby se otestovala validita publikovaných vazbových výsledků, musí být tyto nálezy opakovány v jiných nezávislých studiích.

Nedávno byla publikována vazba bipolárních poruch na pericentromerickou oblast chromozomu 18 (Berrettini et al., 1994). Byl také popsán ring-chromozom 18 se zlomy a deletovanými oblastmi v 18pter-pll a 18q23-qter u tří nepříbuzných pacientů s nemocí BP nebo příbuznými syndromy (Craddock et al., 1994). Vazba chromozomu 18 byla znovu potvrzena autory Stíne et al., (Am. J. Hum. Genet., 57, 1384-

1394, 19995)	), kteří také popsali	fakta svědčící	pro lokus na
18q21.2-q21.	32 v téže studii. Je	zaj ímavé	, že	Stíne et	al.,
pozorovali	jev parentálního	vlivu:	důkaz	vazby	byl
nej silněj ší	v paternálních rodokmenech,	ve	kterých	byl
postižen otec probanda nebo	jeden ze	; sourozenců	otce

probanda.

V nezávislé replikační studii testovali původci vynálezu vazbu s markéry chromozomu 18 u 10 belgických rodin s probandem s bipolární poruchou. Pro lokalizaci kauzativních genu se v těchto rodinách používaly analýza vazby nebo metoda pravděpodobnosti. Tato metoda studuje v rodině segregaci • ·

definovaného fenotypu nemoci se segregací polymorfních genetických markéru rozšířených v lidském genomu. Vypočítává se poměr pravděpodobnosti pozorované kosegregace (společné segregace) nemoci a genetického markéru při vazbě proti žádné vazbě a logaritmus tohoto poměru nebo logaritmus rozdílu je tzv. LOD-skóre (Z-statistika). LOD-skóre v hodnotě 3 (nebo-li poměr pravděpodobnosti 1000 nebo vyšší) se bere jako významný statistický důkaz vazby. Ve studii původců vynálezu nebyl nalezen důkaz vazby k pericentromerické oblasti, ale u jedné rodiny, MAD31, belgické rodiny probanda s BPII, byla nalezena přesvědčivá vazba s markéry lokalizovanými v 18q21.33-q23 (De bruyn et al., Biol. Psychiatry, 39, 679-688, 1996). Vícebodová vazbové analýza poskytla nejvyšší LOD-skóre v intervalu mezi STR (krátké tandemové repetice) polymorfismy D18S51 a D18S61, s maximem vícebodového LOD-skóre +1,34. Simulační studie ukázaly, že toto LOD-skóre je v rozmezí, které může být očekáváno u vázaného markéru daného informací dostupnou v rodině. Podobně také párová analýza postižených sourozenců zavrhla nulovou hypotézu neexistující vazby u několika z testovaných markérů. Dvě další skupiny také nalezly důkazy pro vazbu bipolární poruchy na 18q (Freimer et al., Nátuře Genetics, 12, 436-441, 1996, Coon et al. , Biol. Psychiatry, 39, 689-696, 1996). Ačkoliv se kandidátské oblasti v různých studiích nepřekrývají úplně, svědčí všechny pro přítomnost lokusu vnímavosti v 18q21-q23.

Podstata vynálezu

Další zkoumání chromozomové oblasti 18q u rodiny MAD31 bylo provedeno původci předkládaného vynálezu. Analýzou kosegregace bipolární poruchy u MAD31 s dvanácti markéry pro • · • · ·

STR polymorfísmus, které byly dříve lokalizovány mezi výše uvedenými markéry D18S51 a D18S61 a následnou analýzou LODskóre, jak je popsána výše, původci vynálezu dále zpřesnili kandidátskou oblast chromozomu 18, ve které muže být lokalizován gen asociovaný s poruchami nálady jako jsou poruchy bipolárního spektra, a zkonstruovali fyzikální mapu. Zkoumaná oblast může být tudíž použita k lokalizaci, izolaci a sekvencování genu nebo genů, které ovlivňují psychické zdraví a náladu.

Původci vynálezu také zkonstruovali YAC (kvasinkový umělý chromozom) kontigovou mapu kandidátské oblasti, aby určili relativní pořadí dvanácti STR markéru mapovaných kosegregační analýzou a identifikovali sedm klonů z YAC knihovny, které inkorporovaly kandidátskou oblast.

V procesu identifikace a charakterizace relevantního genu nebo genu může být použito velké množství procedur pro průzkum označených YAC klonů a, kde je to použitelné, DNA jedince postiženého poruchou nálady,· jak je zde definována. Například původci vynálezu použili YAC klony obsahující zkoumanou oblast chromozomu 18 pro identifikaci nových genů, které jsou údajně zapojeny do manifestace poruch nálady nebo příbuzných poruch, prostřednictvím fragmentace CAG nebo CTG.

Pro identifikaci kandidátských genu mohou být na uvedené YAC klony také použity další postupy, jak je projednáno níže.

Jakmile jsou jednou identifikovány kandidátské geny, je možné stanovit vnímavost jedince k poruše nálady nebo k příbuzné poruše detekcí výskytu polymorfismu spojeného s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou u těchto genů.

Tudíž prvním aspektem předkládaného vynálezu je použití oblasti lidského chromozomu 18q velikosti 8.9 cM umístěné mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S979 nebo jejího «· ·· » « · * · · · · • · · fragmentu pro identifikaci alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je asociovaný s poruchami nálady nebo příbuznými poruchami, jak je definováno výše. Jak bude popsáno dále, identifikovali původci vynálezu tuto kandidátskou oblast chromozomu 18q pro tento gen analýzou kosegregace bipolární nemoci u rodiny MAD31 s dvanácti markéry STR polymorfismu předem lokalizovanými mezi D18S51 a D18S61 a následnou analýzou LODskóre.

Ve druhém aspektu vynález zahrnuje použití YAC klonu obsahujícího část lidského chromozomu 18q umístěnou mezi pclymcrfními markéry D18S60 a D18S61 pro identifikaci alespoň jednoho· lidského genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je sdružený s poruchami nálady nebo příbuznými poruchami, jak je definováno výše. D18S60 je blízko D18S51, takže konkrétní YAC klony, které se mohou použít, jsou ty, které mají umělý chromozom překlenující kandidátskou oblast lidského chromozomu 18q mezi polymorfními markéry D18S51 a D18S61, jak bylo určeno původci vynálezu ve jejich dřívějším článku (De bruyn et al., 1996).

Konkrétní YAC klony pokrývající kandidátskou oblast, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, jsou 961_h_9, 942_c_3, 766_f_12, 731_c_7, 907_e_l, 752_g_8 a 717_d_3, výhodné jsou 961_h_9, 766_f_12 a 907_e_l, protože mají minimální překryvy v kandidátské oblasti. Vhodné YAC klony pro použití jsou ty, které obsahují umělý chromozom překlenující zpřesněnou kandidátskou oblast mezi D18S68 a D18S979.

Existuje velké množství metod, které mohou být použity pro kandidátskou oblast chromozomu 18q, jak je definováno výše, ať už je nebo není přítomna v YAC, pro identifikaci kandidátského genu nebo genů sdružených s poruchami nálady

• « nebo příbuznými poruchami. Například bylo dříve dokázáno, že existuje zřejmá asociace mezi výskytem trinukleotidových repetítivních expanzí (TRE) v lidském genomu a fenoménem očekávaných poruch nálady (Lindblad et al., Neurobiology of Disease, 2, 55-62, 1995 a 0'Donovan et al., Nátuře Genetics, 10, 380-381, 1995).

Ve třetím aspektu předkládaný vynález tudíž zahrnuje způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je sdružený s poruchami nálady nebo příbuznými poruchami, jak je zde definováno, a který zahrnuje detekci nukleotidových tripletových repeticí v oblasti lidského chromozomu 18q umístěné mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S979.

Alternativní způsob identifikace uvedeného genu nebo genu zahrnuje fragmentaci YAC klonu obsahujícího část lidského chromozomu lcq umístěnou mezi polymorfními markéry D18S60 a D18S61, například jednoho nebo více ze sedmi výše uvedených YAC klonů, a detekci každé nukleotidové tripletové repetice v uvedených fragmentech. Vhodnými prostředky detekce jsou náležitě značené sondy nukleových kyselin obsahující alespoň 5 a výhodně alespoň 10 CTG a/nebo CAG tripletu. Trinukleotidové repetice mohou být také určovány s použitím systému RED (detekce repetitivní expanze) (Shalling et al., Nátuře Genetics, 4, 135-139, 1993).

Ve čtvrtém provedení vynález zahrnuje způsob identifikace alespoň jednoho genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je sdružený s poruchami nálady nebo příbuznými poruchami a který se vyskytuje v YAC klonu obsahujícím oblast lidského chromozomu 18q mezi polymorfními markéry D18S60 a D18S61, způsob zahrnuje krok detekce expresního produktu genu obsahujícího nukleotidové tripletové repetice při použití protilátky schopné rozpoznat protein s aminokyselinovou sekvencí zahrnující sled alespoň 8, ale výhodněji alespoň 12, souvislých glutaminových zbytku. Tento způsob muže být prováděn subklonováním YAC DNA, například ze sedmi výše uvedených YAC klonů, do lidské DNA expresní knihovny. Výhodným prostředkem detekce relevantního expresního produktu je použití monoklonální protilátky, konkrétně mAB 1C2, jejíž příprava a vlastnosti jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 97/17445.

Jak bude detailně popsáno níže, pro identifikaci kandidátských genů obsahujících tripletové repetice prováděli původci vynálezu přímou CAG nebo CTG fragmentaci YAC klonu 961_h_9, 766_f_12 a 907_e_l, zahrnujících část lidského chromozomu 18q umístěnou mezi polymorfními markéry D18S60 a D18S61 a identifikovali velký počet sekvencí obsahujících CAG nebo CTG repetice, jejichž abnormální expanze muže souviset s genetickou predispozicí k poruše nálady nebo příbuzné poruše.

V pátém aspektu tudíž vynález poskytuje nukleovou kyselinu obsahující sekvenci nukleotidů ukázanou na kterémkoliv z obrázků 15a, 16a, 17a, nebo 18a.

V dalším aspektu vynález poskytuje protein obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí nukleotidů ukázanou na kterémkoliv z obrázků 15a, 16a, 17a, nebo 18a.

V ještě dalším aspektu vynález poskytuje mutovanou nukleovou kyselinu obsahující sekvenci nukleotidů, která se liší od sekvence nukleotidů ukázané na kterémkoliv z obrázků 15a, 16a, 17a, nebo 18a pouze rozsahem trinukleotidových repetic.

Je jasné, že předmětem vynálezu je také nukleotidové sekvence, která je ze 75 % a výhodně alespoň z 80 % homologní k jakékoliv ze sekvencí popsaných výše a která je funkčně totožná s jakoukoliv výše uvedenou sekvencí. Homologie je • · ·

4 4 4 vypočítána, jak to popsali autoři Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997, Karlin et al. , Proč. Nati.

Acad. Sci. USA, 87, 2264-68, 1990 a Karlin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993. Jsou také uvažovány aminokyselinové sekvence, které se od výše popsaných sekvencí liší pouze změnami konzervativních aminokyselin. Vhodné změny jsou odborníkovi dobře známy.

Znalost sekvencí popsaných výše může být využita pro navržení testů pro určení genetické vnímavosti jedince k poruše nálady nebo příbuzné poruše.

V dalším aspektu tedy vynález poskytuje způsob určování vnímavosti jedince k poruše nálady nebo příbuzné poruše, který zahrnuje kroky:

a) získání vzorku DNA. od uvedeného jedince

b) určení primeru vhodných pro amplifikaci nukleotidové sekvence obsažené v sekvenci ukázané na kterémkoliv z obrázku 15a, loa, 17a, nebo 18a, primery ohraničují trinukleotidové repetice obsažené v sekvenci,

c) použití uvedených primerů na uvedený vzorek DNA a provádění amplifikační reakce,

d) provádění stejné amplifikační reakce na vzorku DNA kontrolního jedince a

e) srovnání výsledku amplifikační reakce uvedeného jedince a kontrolního jedince, kde výskyt amplifikovaného fragmentu u uvedeného jedince, který je větší než fragment kontrolního jedince, gndikuje přítomnost vnímavosti k poruše nálady nebo příbuzné poruše u uvedeného jedince.

Kontrolním jedincem se míní osoba, která není postižena poruchou nálady nebo příbuznou poruchou a nemá rodinnou anamnézu poruchy nálady nebo příbuzné poruchy.

• · • · • · · i

94

Primery výhodné pro použití v tomto způsobů jsou ukázané na obrázku 15b, 16b, 17b nebo 18b, ale mohu být použity jiné vhodné primery.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob určování vnímavosti jedince k poruše nálady nebo příbuzné poruše, který zahrnuje kroky:

a) získání vzorku proteinu od uvedeného jedince a

b) detekce výskytu proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci kódovanou sekvencí nukleotidů, která se liší od sekvence nukleotidů ukázané na kterémkoliv z obrázků 15a, 16a, 17a, nebo 18a pouze rozsahem trinukleotidových repetici, kde výskyt uvedeného proteinu indikuje přítomnost vnímavosti k poruše nálady nebo příbuzné poruše u uvedeného j edince.

Svrchu uvedený protein je výhodně detekován použitím protilátky, která je schopná rozpoznat sled alespoň 8 souvislých glutaminú, jako například protilátka mAB 1C2.

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být výhodně obsaženy v expresním vektoru, který může být vnesen do hostitelské buňky prokaryotického nebo eukaryotického původů. Vhodné expresní vektory zahrnují plazmidy, které mohou být použity k expresi cizorodé DNA v bakteriálních nebo eukaryotických hostitelských buňkách, virových vektorech, kvasinkových umělých chromozomech nebo savčích umělých chromozomech. Vektor může být transfekován nebo transformován do hostitelských buněk při použiti vhodných metod v oboru známých, jako je například elektroporace, mikroinjekce, infekce, lipoinfekce a přímé vychytávání. Tyto metody jsou detailněji popsány například autory Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, 1989)

00 ··

0 0 0 0 0 0 • 0000 0 · · * • 00 000 · · · • 00 0 0 00 0 ·· 00 ·· ··

0 0 a Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology, 1994).

Vynález také poskytuje hostitelskou buňku, tkáň nebo organismus obsahující expresní vektor podle vynálezu. Vynález dále poskytuje transgenní hostitelskou buňku, tkáň nebo organismus obsahující transgen schopný kódovat proteiny podle vynálezu, který může obsahovat genomovou DNA nebo cDNA. Transgen může být přítomný v transgenní hostitelské buňce, tkáni nebo organismu buď trvale integrován nebo mimo chromozom.

Molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci ukázanou na kterémkoliv z obrázku 15a, 16a, 17a, nebo 18a, a také protein ji kódovaný, mohou být terapeuticky použity v léčbě poruch nálady nebo příbuzných poruch u pacientu, kteří mají trinukleotidovou repetitivní expanzi (TRE) v alespoň jedné z výše uvedených sekvencí.

V dalším svém aspektu vynález tedy poskytuje výše popsané molekuly nukleové kyseliny a proteiny pro použití jako léčiva pro léčení jedinců s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou. Výhodně jsou nukleová kyselina nebo protein přítomny v příhodném nosiči nebo ve vhodném podávacím vehikulu. Například nukleová kyselina vložená do vektoru, např. plazmidu nebo virového vektoru může být transfekována do savčí buňky, jako je somatická buňka nebo buňka savčí zárodečné buněčná linie, jak je popsáno výše. Buňka pro transfekci může být přítomna v biologickém vzorku získaném od pacienta, jako je například krev nebo kostní dřeň, nebo může být získána z tkáňové kultury. Po transfekci může být vzorek vrácen nebo znovu podán pacientovi užitím metod odborníkům známých, například podle metod popsaných v publikacích: Kasid et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 473, 1990, Rosenberg et al., New Eng. J. Med., 323, 570, 1990, Wiliams et al.,

44 » * 4 » 4 4 4 4 » 4 4 4 » 4 4 I

44

4

4

4

Nátuře, 310, 476, 1994, Dick et al. , Cell, 42, 71, 1985,

Keller et al. , Nátuře, 318, 149, 1985 a Anderson et al. , US

Patent č. 5 399 346, 1994.

Existuje velké množství virových vektoru, které jsou odborníkům známy, které mohou být použity pro zavedení nukleových kyselin do savčích buněk, například retroviry, parvoviry, koronaviry, negativní RNA viry, jako pikornaviry nebo alfaviry a dvouvláknové DNA viry včetně adenovirú, herpesvirů, jako viry herpes simplex typu 1 a 2, virus Epstein-Barrové nebo cytomegalovirus a poxviry, jako vakcinie drůbeže nebo kanáru. Další viry zahrnují například viry Norwalk, togaviry, flaviviry, reoviry, papovaviry, hepadnaviry a viry hepatitidy.

Výhodný způsob pro zavedení nukleové kyseliny, která kóduje požadovaný protein, do buněk užívá virové vektory upravené metodami genetického inženýrství. Tyto vektory poskytují prostředek pro zanesení nukleových kyselin do klidových buněk a buněk s probíhajícím buněčným cyklem a byly modifikovány tak, aby se snížila cytotoxicita a zlepšila genetická stabilita. Zkušenému odborníkovi je známa příprava a použití těchto upravených vektoru, virus herpes simplex typu 1 (Krisky, D.M., et al., Gene Therapy, 4(10), 1120-1125,

1997), adenovirových vektoru (Amalfitanl, A., et al., Journal of Virology, 72(2), 926-933, 1998), oslabených lentivirových vektoru (Zufferey, R., et al. , Nátuře Biotechnology, 15(9), 871-875, 1997) a adenovirových/retrovirových chimérických vektorů (Feng, M. et al. , Nátuře Biotechnology, 15(9), 865870, 1997).

Protein může být podáván s použitím způsobů v oboru známých. Například způsob podávání je výhodně v místě cílových buněk. Podávání se může provádět prostřednictvím injekce. Další způsoby podávání (parenterální, slizniční, • ·· ♦♦ ·· •» » · · · * φφ· » φφφφ φφ φφφ · · * φ > φ ® · · · φφφ φ· ·· »· jsou v oboru podávány ve fyziologický

Φ · Φ * • φ φ · · φ · φ · φ φ φ · systémové, implantátem, intraperitoneální apod.) všeobecně známy. Přípravky mohou být výhodně farmaceuticky přijatelném nosiči, jako je roztok, sterilní voda, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného.

V ještě dalším ze svých aspektů vynález poskytuje způsob testování vhodný pro identifikaci sloučenin, které jsou schopné zvýšit nebo inhibovat expresi proteinů podle vynálezu. Tyto testy se mohou provádět například transfekci nukleové kyseliny podle vynálezu do hostitelských buněk a pak srovnáváním hladin transkriptú mRNA nebo hladin proteinu exprimovaného z uvedených nukleových kyselin v přítomnosti nebo chybění sloučeniny.

Pro měření transkripce nebo expresních hladin mohou být použity různé metody, dobře známy odborníkům v oboru.

Alternativně je možné identifikovat sloučeniny, které modulují transkripci, prostřednictvím použití testu s reportérovým genem, v oboru dobře známý typ testu. V tomto textu je konstruován reportérový plazmid, ve kterém je promotor genu, jehož hladiny transkripce se mají monitorovat, umístěn v protisměru od genu schopného exprimovat reportérovou molekulu. Reportérové molekula je molekula, jejíž stupeň exprese muže být snadno detekován a muže být buď transkript reportérového genu nebo protein s vlastnostmi, které umožní jeho detekci. Například molekula může být fluorescenční protein, jako je zelený fluorescenční protein (GFP) .

Testy sloučenin se mohou provádět zavedením reportérového plazmidu popsaného výše do příslušné hostitelské buňky a pak měřením množství reportérové molekuly exprimované v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny.

44

4 9 4 « Φ Φ 4

4 4 *

4 4 4

44 ··

Φ · 9 φ ··<« · Φ 444 ·· ΦΦΦ Φ * Φ · • · Φ * · · * • ΦΦ ΦΦ «Φ *·

Vynález se také týká sloučenin identifikovaných výše uvedenými metodami.

Další provedení předkládaného vynálezu se týkají způsobů identifikace relevantního genu nebo genů, které zahrnují subklonování YAC DNA, jak je definována výše, do vektorů, jako je BAC (bakteriální umělý chromozom) nebo PAC (Pl nebo fágový umělý chromozom) nebo kosmidových vektorů, jako jsou kosmidové vektory s exonovou pastí. Výchozím bodem těchto metod je konstrukce kontigové mapy oblasti lidského chromozomu 18q mezi polymorfními markéry D18S60 a D18S61. S tímto cílem původci vynálezu sekvencovali koncové oblasti fragmentu lidské DNA v každém ze sedmi výše uvedených YA.C klonu a tyto sekvence jsou zde odhaleny. Po subklonování YAC DNA do dalších vektoru, jak je popsáno výše, mohou být použity sondy obsahující tyto koncové sekvence nebo jejich části, obzvláště ty sekvence, které jsou ukázané na obrázcích 1 až 11 v tomto textu, spolu s jakýmkoliv známým místem se sekvenční značkou (STS) v této oblasti, jak je popsáno v kontigu YAC klonu zde ukázaném, pro detekci překryvů mezi uvedenými subklony a může být zkonstruována kontigová mapa. Pro vytvoření kontigové mapy subklonú mohou být také použity známé sekvence v nejnovějším YAC kontigu.

Jeden způsob, kterým gen nebo geny sdružené s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou mohou být identifikovány, je prostřednictvím použití známé techniky „vychytávání exonu („exon trapping).

To je test umělého sestřihu RNA, nejčastěji používaný v současných protokolech pro specializovaný kosmidový vektor s „exonovou pastí. Vektor obsahuje umělý minigen skládající se ze segmentu genomu SV40, obsahujícího počátek replikace a sekvenci silného promotoru, dva pro sestřih kompetentní • · ♦ ·· exony oddělené intronem, který obsahuje mnohočetné klonovací místo a polyadenylační místo SV40.

YAC DNA se subklonuje dc vektoru s výše popsanou exonovou pastí a rekombinantní DNA je transfekována do kmene savčích buněk. Transkripce z promotoru SV40 má za následek transkript RNA, který je normálně sestřižen tak, aby obsahoval dva exony z minigenu. Jestliže klonovaná DNA sama obsahuje funkční exon, může být připojen k exonům přítomným v minigenu vektoru. Při použití reverzní transkriptázy může být vytvořena kopie cDNA a při použití specifických primerú pro PCR se mohou identifikovat sestřihy týkající se exonú inzertu DNA. Tato procedura umožní identifikovat kódující oblasti v YAC DNA, kreré mohou býo srovnány s ekvivalentními oblasti DNA od osoby posrižené poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, pro identifikaci relevantního genu.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je tudíž způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutované varianty a jeho polymorfismů, který je asociován s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, který spočívá vtom, že s provedou kroky, kdy:

a) savčí buňky se transfekují kosmidovými vektory s exonovou pastí připraveným a mapovaným.i jak bylo popsáno výše,

b) savčí buňky se kultivují ve vhodném médiu,

c) RNA transkripty exprimované z promotoru SV40 se izolují,

d) z RNA transkriptů se připraví cDNA,

e) identifikují se sestřihové události zahrnující exony subklonované do kosmidových vektorů s exonovou pastí, aby se určila poloha kódujících úseků v subklonované DNA,

f) detekují se rozdíly mezi kódujícími úseky a ekvivalemtními úseky v DNA jedince postiženého poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, a • · • ·

g) identifikuje se gen nebo jeho mutovaná nebo polymorfní varianta, který je asociován s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou.

Jako alternativa k exonové pasti je možné subklonovat

YAc DNA do BAC, PA.C, kosmídu nebo jiných vektoru a kontigová mapa se pak konstruuje, jak bylo popsáno výše. Je známa celá řada dostupných metod , jejichž pomocí je možné stanovit pozici relevantních genů v subklonované DNA, a sice následuj ící:

a) Selekce nebo záchyt cDNA (také nazýváno přímá selekce nebo cDNA selekce!: tato metoda zahrnuje vytvoření hetercduplexu genomová DNA/cDNA hybridizaci klonované DNA (např. inzertu v YAC DNA; s komplexní směsí cDNA, jako jsou např. inzerty všech cDNA klonů z určité (např. z mozku) knihovny cDNA. Příbuzné sekvence hybridizují a v následném kroku jsou koncentrovány pomocí biotinstreptavidin záchytu a polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo využitím podobných postupů.

b) Hybridizace s mRNA/cDNA: genomový klon (tj . inzert specifického kosmidu) hybridizuje northernovým přenosem s mRNA z panelu kultivovaných buněčných linií nebo specifické (např. z mozku) knihovny cDNA. Pozitivní signál muže indikovat přítomnost genu v klonovaném fragmentu.

c) Identifikace ostrůvků CpG: ostrůvky CpG nebo HTF jsou krátké (kolem 1 kb) hypometylované sekvence bohaté na GC (více než 60 /), které se často nalézají na 5'-konci genu. Ostrůvky CpG obsahují často restrikční místa pro některé vzácně štěpící enzymy. Nahromadění vzácných restrikčních míst je často indikací pro výskyt ostrůvku CpG a tudíž možnoui existenci genu. ostrůvky CpG je možné detekovat hybridizaci DNA klonu pomocí Southernova přenosu s genomovou DNA naštěpenou vzácně štěpícími enzymy nebo • · · • ·

tzv. PCR objevující ostrůvky (jde o izolaci CpG ostrůvků PCR amplifikaci sekvencí YAC mezi ostrůvky a sousedními Alu-repeoicemi.

d) Zoo-blotting: hybridizace DNA klonu (např. inzertu specifického kosmidu) za snížené stringence pomocí Soutnernova přenosu s genomovou DNA z různých druhu živočichů, detekce hybridizačního signálu může znamenat konzervativní sekvence a indikovat možný gen.

Tudíž dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu včetně mutovaných a polymorfních variant, který je asociován s poruchou nálady nebo přícuzncu poruchou, kterýžto způsob spočívá v tom, že se provedou k r o v :

a) subklcnuje se YAC DNA popsaná výše do kosmidu, BAC, PAC nebe jínéhe vektoru,

b) použije se nuklecoidová sekvence uvedená na kterémkoliv z obr. 1 až 11 nebo jakékoliv jiné místo se sekvenční značkou (STS) v oblasti YAC kontigu popsaného zde, nebo její části obsahující sekvenci ne méně než 14 souvislých baží nebo k ní komplementární sekvenci, pro detekci přesahu mezi subklony a konstrukci jejich mapy,

c) identifikuje se pozice genů v subklonované DNA prostřednictvím identifikace jednoho nebo několika CpG ostrůvků, zco-přenosem, hybridizací subklonované DNA s cDNA knihovnou nebo northernovým přenosem mRNA z panelu kultivovaných buněčných linií,

d) detekují se rozdíly mezi uvedenými geny a ekvivalentními úseky DNA jedinců postižených poruchou nálady nebo příbuznou poruchou,

e) identifikuje se gen, který je asociován s poruchou nálady nebo příbuznými poruchami.

9 • 9

Jestliže se YAC DNA sekvencuje, počítačová analýza se pak - použije k vyhodnocení přítomnosti relevantních genu. K tomu se využijí takové techniky jako je vyhledávání homologií a predikce exonú.

Jakmile je jednou kandidátský gen izolován způsobem podle vynálezu, provede se podrobnější srovnání genu z normálního jedince a jedince postiženého poruchou nálady jako je např. bipolární porucha. Např. existují dvě metody, pojmenované testování mutací, kterými lze identifikovat mutace nebo polymorfismus. V první metodě se vzorek DNA testuje na přítomnost nebo nepřítomnost specifických mutací, ale přitom tato metoda vyžaduje znalost co mutace muže být. V druhé metodě se v DNA hledá jakákoliv odchylka od kontrolní (normální) DNA. Tato druhá metoda je užitečnější pro identifikaci kandidátských genu, kde mutace není identifikována předem.

Kromě toho následující techniky lze užít k další analýze genu identifikovaných způsobem podle vynálezu, aby se identifikovaly rozdíly mezi normálním nebo zdravým jedincem a jedincem postiženým poruchou nálady nebo příbuznou poruchou:

a) Southernuv přenos: klon se hybridizuje s nylonovou membránou, na kterou byla přenesena genomová DNA ze zdravých a nemocných jedinců naštěpená různými restrikčními enzymy. Velké rozdíly mezi nemocným a zdravým jedincem mohou být vizualizovány pomocí radioaktivního značení,

b) Mobilita heteroduplexú na polyakrylamidového gelu: tato technika je založena na skutečnosti, že mobilita heteroduplexú v nedenaturujícím polyakrylamidového gelu je menší než mobilita homoduplexů. tato technika je nejúčinnější pro fragmenty menší než 200 bp.

• ·

c) Analýza jednořetězcového konformačního polymorfismů (SSCP nebo SSCA): jednořetězcové DNA se skládá a vytváří komplexní struktury, které jsou stabilizované slabými intramolekulárními interakcemi. Elektroforetické mobility těchto struktur v nedenaturujícím polyakrylamidového gelu závisejí na délce řetězce a jeho konformaci,

d) Chemické štěpení v místech chybného párování (CCM): radioaktivně značená sonda hybridizuje s testovanou DNA a místa chybného párování (mismatches) se detekují sérií chemických reakcí, které štěpí jeden řetězec DNA v místě, kde došlo k chybnému párování. Je to velmi citlivá metoda a lze z i užít pro vzorky délky kilobazí.

e) Enzymatické štěpení v místech chybného párování: tento test je podobný CCM, až na to, že štěpení se provádí některými enzymy z bakteriofágu.

f) Elekroforéza na gelu s denaturačním gradientem: při torro způsobů DNA migruje elektroforetickým gelem, ve kterém je gradient denaturujících podmínek (chemický nebo teplotní). Migrace probíhá dokud DNA duplexy nedosáhnou takové polohy v gelu, kde dvoušroubovice taje a separují se jednotlivé řetězce, a po té již denaturovaná DNA nemigruje dále. Rozdíl v jediné bázi mezi normální a mutovanou DNA je dostatečný k tomu, aby došlo k k odlišné migraci a poloze na gelu.

g) Přímé sekvencování DNA.

Je zřejmé, že vzhledem ke způsobům popsaným ve vynálezu, v kroku detekce rozdílů mezi kódujícími úseky z YAC a DNA, jedincem postiženým poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, tento jedinec je kdokoliv s takovou poruchou a ne pouze člen rodiny MAD31.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je izolovaný lidský gen a jeho varianty, který je asociován s poruchou • · • · • · · · · ·

nálady a příbuznými poruchami, a který je získatelný kterýmkoliv způsobem popsaným ve vynálezu, a dále izolovaný lidský protein, který je kódován tímto genem, a také cDNA, která kóduje tento protein.

Experimenty uvedené ve vynálezu jsou následujících obrázků.	vysvětleny pomocí
Přehled obrázků:
Obr. 1 ukazuje nukleotidovou levého ramene YAC 766 f 12.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 2 ukazuje nukleotidovou pravého ramene YAC 766 f 12.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 3 ukazuje nukleotidovou levého ramene YAC 717 d 3.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 4 ukazuje nukleotidovou pravého ramene YAC 717 d 3.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 5 ukazuje nukleotidovou pravého ramene YAC 731 c 7.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 6 ukazuje nukleotidovou levého ramene YAC 752 g 8.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 7 ukazuje nukleotidovou levého ramene YAC 942 c 3.	sekvenci	koncové	sekvence
Obr. 8 ukazuje nukleotidovou	sekvenci	koncové	sekvence

pravého ramene YAC 942 c 3.

♦ ·

Obr. 9 ukazuje nukleotidovou sekvenci koncové sekvence levého ramene YAC 961_h_9.

Obr. 10 ukazuje nukleotidovou sekvenci koncové sekvence pravého ramene YAC 961_h_9.

Obr. 11 ukazuje nukleotidovou sekvenci koncové sekvence levého ramene YAC 907_e_l.

Obr. 12 ukazuje rodokmen rodiny MAD31.

Obr. 13 ukazuje haplotypovou analýzu rodiny MAD31. Postižení jedinci jsou znázorněni plným kosočtvercem, prázdné kosočtverce znázorňují jedince, kteří byly při posledním psychiatrickém vyšetření asymptomatičtí. Tmavě šedé sloupce představují markéry, o kterých se nedalo usoudit, zda jsou rekombinantní.

Obr. 14 ukazuje YAC kontigovou mapu oblasti lidského chromozomu 18 mezi polymorfními markéry D18560 a D18561. černé čáry představují pozitivní místa. YAC nejsou nakresleny v měřítku.

Obr. 15 ukazuje a) CAG repetice (vyznačeny tučně) a sousední nukleotidové sekvence izolované z YAC 961_h_9. Sekvence vyznačená kurzívou byla získána koncovým vyproštěním z fragmentovaného YAC. b) Primery pro PCR, které lze užít ke stanovení rozsahu trinukleotidových repetic v sekvenci.

Obr.

a sousední ukazuje a) CAG repetice (vyznačeny tučně) nukleotidové sekvence izolované z YAC 766 f 12.

Sekvence vyznačená kurzivou byla získána koncovým vyproštěním z fragmenzovaného YAC. b) Primery pro PCR, které lze užít ke stanovení rozsahu trinukleotidových repetic v sekvenci.

Obr. 17 ukazuje a) CAG repetice (vyznačeny tučně) a sousední nukleotidové sekvence izolované z YAC 766_f_12. Sekvence vyznačená kurzívou byla získána koncovým vyproštěním z fragmentovaného YAC. b) Primery pro PCR, které lze užít ke stanovení rozsahu trinukleotidových repetic v sekvenci.

Obr. 18 ukazuje a) CTG repetice (vyznačeny tučné) a sousední nukleotidové sekvence izolované z YAC 907_e_l. Sekvence vyznačená kurzívou byla získána koncovým vyproštěním z fragmerocvaného YAC. b) Primery pro PCR, které lze užít ke suanoveni rozsahu trinukleotidových repetic v sekvenci.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a) Údaje o rodině

Klinické diagnózy v rodině 1CAD31, belgické rodině s probandem s BPII, byly podrobně popsány v práci De bruyna et al., 1996. V této studii pouze 15 členů rodiny, kteří byli informativní pro analýzu vazby, bylo vybráno pro další genotypizaci. V rodině byly následující klinické diagnózy:

ΒΡΙ, 2 BPII, 2 UP, 4 hlavní depresivní porucha (MDD), 1 SAm a 1 SAd.

Rodokmen rodiny MAD31 je uveden na obrázku 12.

b) Genotypizace členu rodiny

Všechny genetické markéry představované krátkými tandemovými repeticemi (STR) jsou polymorfismy v dinukleotidových nebo tetranukleotidových repeticích. Informace týkající se genových markérů použité v této studii byly získány z různých zdrojů na Internetu:

Genome Database (GDB, http://gdbwww.gdb.org/), GenBank (httg : //wv:n . nebi . ním . rnh . gov . /) ,

Cooperative Human http : / /έ,έ! . chlc . org/ ; ,		Linkage	Center	(CHLC,
Eccles Institute h 11 p: Z / g e n e t i c s . u t a h. e dn Z )	of	Human	Genetuics	(EIHG,
a Généthon (http://www.genethon.fr/). Standardní polymerázová řetězová	reakce	(PCR) se

prováděla v objemu 25 μΐ a obsahovala 100 ng genomové DNA, 200mM každého z dNTP, 1,25 mM MgCl2, 30 pmol každého primerů a 0,2 jednotky DNa pelymerázy Goldstar (Eurogentec). Jeden primer byl koncově značen před PCR pomocí [ gamma-'-Ρ] ATP a T4 polynukleotidylkir.ázy. Po počátečním denaturačním kroku 2 minuty při 94 °C bylo provedeno 27 cyklů složených z denaturace 1 minutu při 94 °C, nasednutí primerů 1,5 minuty při vhodné teplotě, a syntéza (extenze) 2 minuty při 72 °C. Nakonec byl proveden závěrečný elongační krok 5 minut při 72 °C. Produkty PCR byly detekovány elektroforézou na 6% denaturujícím polyakrylamidovém gelu a exponovány na citlivý rentgenový film. Úspěšně analyzované STS, STR a EST • φφ φφ ·· • · · • · · φ · • φ φ · « * · · φφ φφ • Φ φφ φ · • ·

pokrývající zpřesněnou kandidátskou oblast popsány v následujícím textu.

jsou podrobně

o) .Analýza 1 od-skóre

Dvoubodové lod-skóre se počítalo pro 3 různé modely nemoci pomocí programového vybavení Fastlink 2.2 .(Cottingham et al., 1993). Pro všechny modely byly užity hodnoty frekvence genu nemoci 1 % a fenotypový poměr 1/1000. Model 1 zahrnoval všechny pacienty i nepostižené jedince, přičemž nepostižení v závislost:

byly přiřazeni do na věku vyšetření.

tříd výskytu nemoci 9 tříd výskytu nemoci věku, jak je popsali De bruyn et al. (1936.

byle násobeno faktorem 0,7, který odpovídal snížení maximálního výskytu 99 ( na 70» pro jedince starší než 60 let (Cot 19911 . Model 2 byl podobný modelu 1, ale pacientům bylo přiřazeno skóre diagnostické stability, vypočtené na základě klinických údajů jako je např. Počet epizod, počet symptomu během nejhorší epizody a průběh předchozího léčení (Rice et al., 1987, De bruyn et al. 1996). Model 3 byl stejný jako model 1, ale zahrnoval pouze pacienty.

D) Konstrukce kontigu YAC - protokoly

Pěstování YAC a extrakce DNA z YAC se prováděly podle standardních protokolu (Silverman, 1995). Pro konstrukci YACkontiau zahrnujícího celou kandidátskou oblast chromosomu 13q byla porovnávána data fyzikální mapy založené na místech se sekvenční značkou (STS, „sequence tagged sites)(Hudson et al., 1995) z internetové stránky Whitehed Institute (WI) (http://www-genome.wi.mit.edu/). CEPH mega-YAC byl získán z YAC Screen Centre Leiden (YCSL, Holandsko) a z CEPH (Paříž,

4 4

44

4 4

4 4

4 ·

4 ·

4 4 4

Francie). YAC byly analyzovány na přítomnost STS a STR, předtím lokalizovaných mezi D18S51 a D18S61, a sice ampliřikaci pomocí modifikované, tzv. „touchdcwn PCR. Informace o STS/STR byly získány z internetových stránek WI, GDB, Généthon, CHLC a GenBank. Bylo provedeno 30 cyklů PCR následující struktury: denaturace 1 minutu při 94 °C, nasednutí (2 cykly při každé teplotě) počínaje teplotou 65 °C a poklesem až na 51 °C po 1,5 minutu a nakonec extenze 2 minuty při 72 °C. Pak následovalo 10 cyklů obsahujících denaturaci 1 minutu při 94 °C, nasednutí 1,5 minuty při 50 °C a extenzi 2 minuty při 72 °C. A nakonec proběhla závěrečná extenze 10 minut při 72 °C. Amplifikované produkty byly vizualizovány elektroforézou na 1- TBE agarózovém gelu a barvením ethidiumbromidem.

E) Uspořádání STR markérů

STR markéru, dříve lokalizovaných mezi D18S51 a D18S61 bylo testováno na kosegregaci s bipolární poruchou v rodině MAD31. Rodičovské haplotypy byly konstruovány z genotypových informací od sourozenců v rodině MAD31 a minimalizací všech možných rekombinací. Výsledky této analýzy jsou uvedeny na obr. 13. Otec nebyl informativní pro 3 z uvedených markéru, matka nebyla informativní pro 5 markéru. Hvplotypy v rodině MAD31 vedly k následujícímu uspořádání STR markérů:

cen-[S51-S68-S34 6]-[S55-S9 69-S1113-S4 83-S4 65]-[S87 6-S4 77]S97 9-[S4 6 6-S817-S 61]-tel.

Vzájemné pořadí markérů uvnitř závorek nebylo možné odvodit z našich haplotypových dat. Pořadí markérů v rodině MAD31 bylo porovnáno s pořadím markérů získaným odlišnými

94 > 4 4 * ► · · « » · · ι ► 4 4 ι ·· ·· mapovacími technikami a výsledky jsou ukázány v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Srovnání pořadí ' markéru v kandidátské oblasti ql8 pro bipolární poruchu podle různých map

Β ·· ·· ·· ·* ·· · · ··«· a Β Β Β · · · · · * · * * « · Β Β · ·· · · · · · ·

Β Β * · ·> · · Β Β · · ··· Β· ·· ·· ·· ·*

Tabulka 1'

Markér*	Genetické mapy	Radiační hybridní mapa (Giacalone et al., 1996)
Généthon	Marshfield
D18S51		(-)3.4cM	(-)27.9 cR
D18S68	OcM	OcM	OcR
D18S346		5.3 cM	52.2 cR
D18S55	0.1 cM	OcM	72.5 cR
D18S969		0.6 cM
D18S1113	0.7 cM
D18S483	2.5 cM	3.2 cM	88 cR
D18S465	4.5 cM	5.3 cM	101.3 cR
D18S876
DI8S477	4.4 cM	5.3 cM	166.4 cR
D18S979		8.9 cM
D18S466	7.6 cM	11.1 cM	212.4 cR
D18S61	8.4 cM	!1.8cM	249.5 cR
D18S817		5.3 cM	260.6 cR

* Pořadí podle výsledků studia haplotypů v rodině MAD31 (-) markér je lokalizován proximálně od D18S68 • *· «· · • ··· • · · • · · ··· ·* ·· »· « f tt · · ·· • · r * • 4 6 *

46

46

4 * • · *

4 · • · 4

64

D18S68, společný pro všechny 3 mapy, byl vybrán jako výchozí bod mapy, a byla uvedena genetická vzdálenost ostatních markéru v cM nebo cR právě vzhledem k D18S63. Pořadí markéru je v dobré shodě s pořadím markéru na nedávno publikované radiační hybridní mapě chromosomu 18 (Giacalone et al . , 1996, Genomícs 37: 9-18) a na YAC-kontigové mapě WI (http://www-genome.wi.mit.edu/).

Avšak bylo pozorováno několik odlišností. Jedinou odchylkou od mapy Génethonu je obrácené pořadí markérů D18S465 a D18S477. Dvě neshody byly pozorovány na mapě Marshfielda (http://www.marshmed.org/genetics/). Původci vynálezu umístili na mapě na základě maternálního haplotypu D18S346 nad D18S55, zatímco- na Marshf ieldově mapě je tento markér umístěn mezi DÍ6S465 ,a D18S477. Avšak poloha D18S346 a D18S817 je v souladu s radiační hybridní mapou chromosomu 13 (Giacalone et al. , 1996) . Jedna odlišnost byla pozorována také na radiační hybridní mapě WI (http://wwwgenome.wi.mit.edu/), kde D18S68 je umístěn pod D18S465, avšak původci, stejně jako i jiné mapy, umístili tento markér nad D18S55.

F) Analýza lod-skóre a upřesnění kandidátské oblasti

Analýza lod-skóre poskytla pozitivní výsledky se všemi markéry, což potvrdilo předchozí pozorování, že 18q21.33-q23 je asociován s BP poruchou, přinejmenším v rodině MAD31 (De bruyn et al. , 1996). Výsledná statistika analýzy lodskóre u všech modelů je uvedena v následující tabulce 2.

c ·

Souhrnná statistika dvoubodového lod-skóre v rodině MAD31

D18S55, D18S483, D18S465 a D13S466 nebyly informativní

Nejvyšší hodnota dvoubodového lod-skóre byla získána pro markéry D18S1113, D18S876 a D18S477 podle modelu 1 bez rekombinaci (viz tabulka 2) . V modelu 1 všichni jedinci se spektrem BP byly považováni za postižené a přispěli tak plně k analýze vazby.

Před podrobným mapováním byla vybraná kandidátská oblast ohraničena D18S51

D18S61, mezi kterými je genetická sdílejí oblast údaje genového vzdálenost 15,2 cM na mapě podle Marshfielda nebo 13,1 cM na mapě dle Généthonu. Informativní rekombinanty s D18S51 a D18S61 byly pozorovány u dvou postižených jedinců (II.10 a II. 11 na obr. 13) . Avšak vzhledem k tomu, že nebyly testovány jiné markéry uvnitř kandidátské oblasti, nebylo jasné, zda tito dva jedinci skutečně identickou v rodové linii (IBDj . Další mapování ukazují, že všichni postižení jedinci sdílejí alely D18S969, D18S1113, D18S876 a D13S477 (viz obr. 13, haplotyp v rámečku). také alela z markéru D18S483 a D18S465 jsou pravděpodobně IBD, ale tyto markéry nebyly informativní u postiženého rodiče 1.1. Obligátní rekombinanty byly pozorovány s STR markéry D18S68, D18S979 a D18S817 (viz tabulka 2, obrázek 13) . Jelikož byly pozorovány neshody mezi různými mapami pro lokalizaci D18S346 a D18S817, původci vynálezu užili D18S68 a D18S979 k tomu, aby nově definovali kandidátskou oblast pro BP poruchy. Genetická vzdálenost těchto dvou markéru je 8,9 cM podle Marshfieldovy genetické mapy (http://www.marshmed.org./genetics/) .

g) Konstrukce YAC kontigu

Podle integrované mapy Wl jsou 56 CEPH megaYAC umístěny v počáteční kandidátské oblasti ležící mezi D18S51 a D18S61 (Chumakov et al., 1995, Nátuře 377, Suppl., De bruyn et al., « *·········

1996) . Z těchto YAC byly vybrány takové, které byly lokalizovány mezi D18S60 a D18S61. D18S51 není přítomen na WI mapě, ale byl lokalizován do blízkosti D13S60 na základě Marshfieldovy genetické mapy (http://www.marshmed.org./genetics/). Aby se omezil počet potenciálních chimérických YA.C, byly eliminovány YAC, které byly také pozitivní na mimochromozomální 18 STS. Takže bylo vybráno 25 YAC (viz obr. 14) a umístěno do kontigu technikou kontigového mapování YAC, tzn. sekvence z míst se sekvenční značkou (STS), jednoduchých tandemových repetic (STR) a exprimovaných sekvenčních značek (EST), které jsou známé tím, že leží mezi D18S60 a D18S61, byly amplifikovány pomocí PCR na DNA z YAC klonu. Použité sekvence STS, STR a EST jsou popsány na dalších stranách. Pozitivní YAC klony byly shromážděny do kontigcvé mapy (obr. 14).

V YAC kontigu zůstaly tři mezery, z nichž jedna, mezi D18S876 a GCT3G01, byla lokalizovaná v upřesněné kandidátské oblasti. Tiby byla mezera mezi DÍ8S876 a GCT3G01 doplněna, bylo analyzováno 14 dalších YAC klonů (viz tabulka 3) . Byly získány koncové fragmenty z YAC klonů 766.f.12 (SV11R), 752.g.8 (SV31L) a 942.c.3 (SV10R) a sekvencovány (viz dále). Byly vybrány oligonukleotidové primery pro tyto tři sekvence a DNA každého z těchto 14 klonů byla amplifikována pomocí PCR. Jak je uvedeno v tabulce 3, byly získány překryvy mezi 7 YAC klony na straně centromery a 2 YAC klony na straně telomery (717.d.3 a 907.e.l).

Výsledný YAC kontig je uveden na obr. 14. Na tomto obrázku jsou ukázány jen takové YAC klony, které nepochybně „zasáhly STS, STR a EST chromosomů 18. V několika málo případech byly také získány slabé pozitivní signály pro některé YAC klony, což jsou pravděpodobně falešně pozitivní výsledky. Avšak tyto signály nijak neovlivnily přiřazení YAC • · ··· • 4 • · klonů v kontigu. I přesto, že byly testovány všechny YAC pokrývající vybranou oblast stejně tak jako všechny dostupné STS/STR, na počátku nebyla mezera v kontigové mapě zaplněna. Toho bylo dosaženo až stanovením koncových sekvencí 8 vybraných YAC (viz níže). Pořadí markéru na základě YAC kontigové mapy bylo v úplné shodě s pořadím podle WI mapy, která integruje informace z genetické mapy, radiační hybridní mapy a STS YAC kontigové mapy (Hudson et al., 1995) . YAC kontigové mapa také potvrdila pořadí STR markérů jak bylo navrženo na základě haplotypové analýzy v rodině MAD31. Kromě

toho YAC kontigové	mapa	poskytuj e	další	informace
o relativním uspořádání	STR	markérů. Tak	např.	D18S55 je
přítomen v YAC 931 g 10,	ale	není v 931 f 1	(obr.	14), který
odděluje D18S55 od	j eho	klas tru [S5	5-S969-	S1113-S465]

získaného haplotypovou analýzou v rodině MAD31. Centromerová lokalizace D18S55 byla definována obsahem STS/STR okolních YAC (obr. 14) . Pokud se zkombinují haplotypové údaje a YAC kontigové mapa, lze získat následující pořadí STR markéru: cen-[S51-S 6 8-S34 6]-S55-[S969-S 1113]-[S4 83-S4 65) -S876-S477-S979S466-[S817-S61]-tel.

Z 25 YAC klonů pokrývajících celý kontig bylo vybráno 7 klonů, aby se identifikovala minimální překrývající oblast (tabulka 4) . Těchto 7 YAC klonů pokrývá celou upřesněnou oblast chromosomu 18. Dále YAC klony by výhodně neměly být chimérické, tj. měly by obsahovat pouze fragmenty z lidského chromosomu 18. Aby bylo možné testovat na přítomnost chimér, oba konce YAC byly subklonovány a sekvencovány (viz dále). Pro každou sekvenci byly připraveny oligonukleotidové primery a DNA z monochromozomálního mapovacího panelu byla amplifikována pomocí PCR užitím těchto primerů. Jak je ukázáno ještě dále, některé z YAC klonů obsahovaly fragmenty jiných chromosomů, odlišných od lidského chromosomu 18.

• 4 4 ·

444 4

4 4 « 4

44 44 • · 4 4 ·

444 4 44 *

4 4 4 4 4 4 • 4 · 4 4 4

44 44

YAC klony pak byly selektovány, aby obsahovaly co nejkratší překrývající se úseky (tabulka 5). Tyto 3 YAC klony byly stabilní, jak bylo zjištěno gelovou elektroforézou v pulzním elektrickém poli, a jejich velikosti odpovídaly publikovaným hodnotám. Tyto YAC klon byly přeneseny na jiný hostitelský kvasinkový kmen pro restrikční mapování a byly předmětem dalšího subklonování.

Popis úspěšně analyzovaných STS, STR a EST pokrývajících upřesněnou kandidátskou oblast

Vysvětlení termínu:

STS: místa se sekvenční značkou

STR: jednoduchá tandemová repetice

EST: exprimovaná sekvenční značka

Tyto markéry byly uspořádány od centroméry k teloméře. Jsou uvedeny pouze takové markéry, které byly účinně testovány a které fungovaly na YAC.

SEZNAM

1. D18S60:

Identifikátor v databázi: AFM178XE3 (také známé označení 178xe3, Z16781, D18S6CU

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = CCTGGCTCACCTGGCA

Pravý = TTGTAGCATCGTTGTAATGTTCC Délka produktu = 157

Přehled úplné sekvence:

AGCTATCCTGGCTCACCTGGCAAAAATACAGTGTATACACACACACACAC

ACACACACACACACACACAGAGTGTNTTANTNATTCCAGCAAATAATATTA

CATATAAAAGATCTAATTGGTTCATCATGTAAATTTAGTAGGAACATTACA

ACGATGCTACAAGANTTTATCCAAAACTGAGATTTCCTTAGAATATCTGTT

AAAAGTAATTTTATTCAGTTAATAGAAATTCTATTGAAAACATCAAACTTAT

AAAGCT

Identifikátor v Genbank: Z16781

Popis: H. sapiens (D13S60) DNA segment obsahující repetice (CA), klon Hledání v GDB ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ··· · · ··· * · ·

2. WI-9222:

Identifikátor v databázi: UTR-03540 (také známé označení G06101, D18S1033, 9222, X63657)

Zdroj: WICGR: Primery odvozené ze sekvencí uvedených v Genbank Chromozom: Chrl8 Primery:

Levý = GATCCCATAAAGCTACGAGGG Pravý = GAGTCTAAAGA.CAAGAAAGCATTGC Délka produktu = 99

Přehled úplné sekvence:

TCTTCTTACCCCTTGGAAGAAGACTGTTTCCAAATAATTTGAACAGCTTG

CTGCTAAATGGGACCCAATTTTTGGCCTATAGACACTTATGTATTGTTTTC

GAATACGTCAGATTGGACCAGTGCTCTTCAGGAATGTGGCTGCAAGCAA

GGGGCTAGAAGTTCACCTCGTGACAGTATTATTAATACTATGCAAATATG

GAATAGGAGACCATTTGATTTTCTAGGCTTTGTGGTAGAGAGGTGAAGG

TATGAGAATTAATAGCGTGTGAACAAAGTAAAGAACAGGATTCCAGAATG

ATCATTAAATTTGTTTCTATTTATTCTTTTTTGCCCCCCTAGAGATTAAGTC

CAGAAATGTACTTTCTGGCACATAAAGAAATCTTGAGGACTTTGTTTAAAC

CTTCCATAAAAAAACAATTTTCGGTTTCTCGGGTNNNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT

TCTTTCTTTGTGTATTTTATTCAAGATGAGTTGGACCCATTGCCAGTGAGT

CTGAATGTCAGTGACAGCCCTGTGTTGTGCTCAGGACTCACTCTGCTGC

TGGTGGAAACTCATGGCTTCTCTCTCTCTTTGATCCCATAAAGCTACGAG

GGGGACGGGAGAGGGCAGTGCAATGGGAAGTAAAGAGATATTTTCCAG

TAGGAAAAGCAATGCTTTCTTGTCTTTAGACTCAAATGCTTAGGGAAC GT

TTCATTTCTCATTCATGGGGAAAGGCAGCCTCCTTAAATGTTTTCTGAAG

AGCGGTAAAATCTAGAAGCTTAAGAATTTACAGTTCCTTCAATAACCATGA

TGACCTGAAGTTCACCTATCCCATTTTAGCATCTACTTGTTTTTCCCATCT

CTTC C TTTC C AATTTTG C TTATACTG CTGTAATATTTTTGTN NNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNGACCAGCTAAAATTTTC GACTTGACTTTTTAACTT

AACTCATGAATTAATTAAAGCAAATGAAAAAATTAAAAAGTGTGACTTTTT

CTCGGAGCATATATGTAGCTTTTAGGAAAGGCTGATGATGGTATAAAGTT

TGCTCATTAAGAAAAAAAGACAAGGCTGATTTTGAAGAGAGTTGCTTTTG

AAATAAAATGATCA

Identifikátor v Genbank: X63657

Popis: H.sapiens fvtl mRNA

Hledání v GDB

3. WI-7336:

Identifikátor v databázi: UTR-04664 (také známé označení PI5,

G00-679-135, G06527, 7336, U04313)

Zdroj: WICGR: Primery odvozené ze sekvencí uvedených v Genbank «4 44 44 ·· « 4 4 · 4 4 «444 4 44 4

44 4«· 44 4

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = AGACATTCTCGCTTCCCTGA Pravý = AATTTTGACCCCTTATGGGC Délka produktu = 332

Přehled úplné sekvence:

TAAGTGGCATAGCCCATGTTAAGTCCTCCCTGACTTTTCTGTGGATGCCG

ATTTCTGTAAACTCTGCATCCAGAGATTCATTTTCTAGATACAATAAATTG

CTAATGTTGCTGGATCAGGAAGCCGCCAGTACTTGTCATATGTAGCCTTC

AG AC AG ATAG AC CNNNNNNNNNNN C C AATTCTATCTTTTGTTTC CTTTTTT

CCCATAAGACAATGACATACGCTTTTAATGAAAAGGAATCACGTTAGAGG

AAAAATATTTATTCATTATTTGTCAAATTGTCCGGGGTAGTTGGCAGAAAT

ACAGTCTTCCACAAAGAAAATTCCTATAAGGAAGATTTGGAAGGTCTTCT

TCCCAGCACTATGCTTTCCTTCTTTGGGATAGAGAATGTTCCAGACATTC

TCGCTTCCCTGAAAGACTGAAGAAAGTGTAGTGCATGGGACCCACGAAA

CTGCCCTGGCTCCAGTGAAACTTGGGCACATGCTCAGGCTACTATAGGT

CCAGAAGTC CTTATGTTAAG CCCTGGCAGG C AG GTGTTT ATTAAAATTCT

GAATTTTGGGGATTTTCAAAAGATAATATTTTACATACACTGTATGTTATA

GAACTTCATGGATCAGATCTGGGGCAGCAACCTATAAATCAACACCTTAA

TATGCTGCAACAAAATGTAGAATATTCAGACAAAATGGATACATAAAGACT

AAGTAGCCCATAAGGGGTCAAAATTTGCTGCCAAATGCGTATGC C AC CA

ACTTACAAAAACACTTCGTTCGCAGAGCTTTTCAGATTGTGGAATGTTGG

ATAAGGAATTATAGACCTCTAGTAGCTGAAATGCAAGACCCCAAGAGGAA

GTTCAGATCTTAATATAAATTCACTTTC ATTTTGATAG CTGTCCCATCTG

GTCATGTGGTTGGCACTAGACTGGTGGCAGGGGCTTCTAGCTGACTCG

CACAGGGATTCTCACAATAGCCGATATCAGAATTTGTGTTGAAGGAACTT

GTCTCTTCATCTAATATGATAGCGGGAAAAGGAGAGGAAACTACTGCCTT

TAGAAAATATAAGTAAAGTGATTAAAGTGCTCACGTTACCTTGACACATAG

TTTTTCAGTCTATGGGTTTAGTTACTTTAGATGGCAAGCATGTAACTTATA

TTAATAGTAATTTGTAAAGTTGGGTGGATAAGCTATCCCTGTTGCCGGTT

CATGGATTACTTCTCTATAAAAAATATATATTTACCAAAAAATTTTGTGACA

TTCCTTCTCCCATCTCTTCCTTGACATGCATTGTAAATAGGTTCTTCTTGT

TCTGAG ATTC AATATTG AATTTCTC CTATG CTATTG AC AATAAAATATTATT

GAACTACC

Identifikátor v Genbank: G06527

Popis: WICGR: náhodná STS v genomu

4. WI-8145:

Identifikátor v databázi: EST102441 (také známé označení D18S1234, G00-677-827, G06845, 8145, T49159)

Zdroj: WICGR: STS pocházející ze sekvencí dbEST Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = GAAATGCACATAACATATATTTGCC Pravý = TGCTCACTGCCTATTTAATGTAGC Délka produktu = 184

Přehled úplné sekvence:

•i · · · • «· * · · * • « · · · · • · ·» · · · · · « · · · « ♦ · • · · · · · ·«· ·« ·♦ ♦·

GTTGTTTGGAN GCAG GTTTATTTATTATATACTTGCAATTGAATATAAGAT

ACAGACATATATATGTGTTATGTATTTCTAGAAATGCACATAACATATATTT

GCCTATTGTTTAATGTTTTTTCCAGANATTTATTACAGAAGGGCATGGAG

GGATACCTACTTATTCTTCATTATGAGAACAATTAAAGGCATTTATTAGAT

AGGAAATTAACAGANCATCTGCTTCTATAACTTTATTAGCTACATTAAATA

GGCAGTGAGCANTAATTTAAAANCTCACCATTATATAAANTANTAAATACC

AAAGTAAAAG _: levý a pravý primer

Podmínky PCR

Identifikátor v Genbank: T49159

Popis: yb09e07.sl Homo sapiens cDNA klon 70692 3' podobný gb: J02685

Popis UniGene Cluster: lidská mRNA pro Arg-Serpin (inhibitor aktivátoru plazminogenu - 2, PAI-2)

Hledání v GDB

5. WI-7061 :

Identifikátor v databázi: UTR-02902 (také známé označení PAI2, G00-678-979, G06377, 0061, M13Q82)

Zdroj: WICGR: Primery odvozené ze sekvencí uvedených v Genbank Chromozom: Chrl 8

Primery: Levý = TGCTCTTCTGAACAACTTCTGC Pravý = ATAGAAGGGCATGGAGGGAT Délka produktu = 338

Přehled úplné sekvence:

AACTAAGCGTGCTGCTTCTGCAAAAGATTTTTGTAGATGAGCTGTGTGCC

TCAGAATTGCTATTTCAAATTGCCAAAAATTTAGAGATGTTTTCTACATAT

TTCTGCTCTTCTGAACAACTTCTGCTAC C C ACTAAATAAAAACAC AG AAAT

AATTAGACAATTGTCTATTATAACATGACAACCCTATTAATCATTTGGTCT

TCTAAAATG G G ATC ATG C C C ATTTAG ATTTTC CTTACTATC AGTTTATTTT

TATAACATTAACTTTTACTTTGTTATTTATTATTTTATATAATGGTGAGTTTT

AAATTATTGCTCACTGCCTATTTAATGTAGCTAATAAAGTTATAGAAGCAG

ATGATCTGTTAATTTCCTATCTAATAAATGCCTTTAATTGTTCTCATAATGA

AGAATAAGTAGGTATCCCTCCATGCCCTTCTATAATAAATATCTGGAAAAA

ACATTAAACAATAGGCAAATATATGTTATGTGCATTTCTAGAAATACATAA

CACATATATATGTCTGTATCTTATATTCAATTGCAAGTATATAATAAATAAA

CCTGCTTCCAAACAACNNNNNNNNNNNNNNGGAATTC

Podmínky PCR

Identifikátor v Genbank: G06377 Popis: WICGR: Náhodná STS v genomu

6. D18568;

Identifikátor v databázi: AFM248YB9 (také známé označení 248yb9, Z17122, D18S63)

Zdroj: J WeissenCach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: ChrlS

Primery: Levý = ATGGGAGACGTAATACACCC Pravý = ATGCTGCTGGTCTGAGG Délka produktu - 285

Přehled úplné sekvence:

AAAGAGTTGGGGTTGTGAATTCCCACACCAGTCAACTATTGGCTATGGG

CTTACCATGGGAGACGTAATACACCCGGNACTTCCAACTCACATACCAG

AGACATGGCTCTAGCACCCAATGGAAATATGCTGAATGTTGCAGGTGCA

AGACAGCAACAAAGCAGACAGAGGCACATAGACAAGGCACCAACAGTGT

CCACTATACCCTGACAGTGTGGAAAGTTGTAGATAGGATGAAGAGAAAG

AATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA

CGGTAGANACTTACTACNCAAAGTGTGANCCTCAGACCAGCAGCATCTG

GCNAAATGGTGATCTATCACCTTCCAG

Identifikátor v Genbark: Z17122

Popis: H. sapiens D18S68) DNA segment obsahující repetice (CAi, klon

7. WI-3170:

Identifikátor v databázi: MR3726 (také známé označení

D18S1037, G04207, HALd22f2, 3170)

Zdroj: WICGR: Náhodná STS v genornu Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TGTGCTACTGATTAAGGTAAAGGC Pravý = TGCTTCTTCAATTTGTAGAGTTGG Délka produktu - 156

Přehled úplné sekvence:

CTGAGACAAGGCAGGCAAACAACCTCTAAAAATCTACAATTGGTGATTGG TGTGCTACTGATTAAGGTAAAGGCACAGAATTATACATCCAGGTTNCTAT TACTTATGGCAGACTCAGGACCCAGGTTNAGAGACCACTGGCCTTAAGA A, AAAAAATG G GGTTCCTGATTTCTGGATAATAATCCAACTCTACAAATTGA AG AAG C AAC ATAC C CTCTTTGTTA

Identifikátor v Genbank: G04207

Popis: WICGR: Náhodná STS v genornu • *

8. WI-5654:

Identifikátor v databázi: MR10908 (také známé označení D18S1259, G00-678-695, G05278, 5654)

Zdroj: WICGR: Náhodná STS v genomu Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = CTTAATGAAAACAATGCCAGAGC Pravý = TGCAAAATGTGGAATAATCTGG Délka produktu - 149

Přehled úplné sekvence:

CTACAAAATGCATGTGGCTTiGGCTTTGAAATAGTACACCCTATCAAAGA

CTAAATTTTCTTAATGAAAACAATGCCAGAGCTTTTTTCATGATATTTTGTT

TTTAGAGATGGGGAACAATCTGGACGTTGTTTCCTTATCTGGGTGGTAAT

CGAGGCTTAGCAATTTCCCACAGCGTTACACAAATCCAGATTATTCCACA

TTTTGCAAATA

Identifikátor v Genbank: G05278

Popis: WICGR: Náhodná STS v genomu

9. D18S55:

Identifikátor v databázi: A.FM122XC1 (také známé označení 122xcl, Z16621, D18S55, GC378-D18S55)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = GGGAAGTCAAATGCAAAATC

Pravý = AGCTTCTGAGTAATCTTATGCTGTG Délka produktu = 143

Přehled úplné sekvence:

AGCTGAACATGCCTTTTCATGGAGCAGTTTCNAAATACACTTTTGGTACA

ATCTGCAGGTGGATATTTGGAGCTCAGGAGTTfGAGACCAGCCTGGGCA

ACATGGTGAAATCCCGTCTCTACTAAAATACAAAAAATTAGCCAGGTGTG

GCGGCATGTGCCTGTAGNCCCAGGATGGATTGAGTGGGTGAGATATGG

AATAAGTGGTGGGAAGTCAAATGCAAAATCAATTCAGTTTGTCAATATTG

ATTCTCTATTCTAGCCTGGCGTGGTTTTTCCTCGTCACACACACACACAG

ACACACACACACACACACACACACACACACACAGCATAAGATTACTCAGA

AGCT

Identifikátor v Genbank: Z16621

Popis: H. sapiens (D18S55) DNA segment obsahující repetice (CA), klon

10. D18S969:

Identifikátor v databázi: GATA-P18099 (také známé označení G08003, CHLC.GATA69F01, CHLC.GATA69F01, P18099)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = AACAAGTGTGTATGGGGGTG

Pravý = CATATTCACCCAGTTTGTTGC Délka produktu = 365

Přehled úplné sekvence:

CAGGGAAATGCAAATCAAAACCACAATGAGTTATCTCCTCATACCTTTAAT

G ATG GCTAATATTAAACAAGAGATAACAAGTGTGTATGGGGGTGTGGAG

AAAAGAGAATGTNCGAACACTCTTGGTTGAAATATAAGTTGGTAGANCCA

TTATGCAAAACAGTATGAATCTTTATCAGTATAANATTAGGACCTNGCATA

TGATCNCAGCAATCNCCACNTCTGNGNGATCNCACNCNCTATCTCTCTAT

ATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT

ATCTGTCTGTCTATCATCTATCTATCTTCTATCTATCTATCTATCTTfCTAT

CTATCTATCTGTCTATCTATNCCGGAATATTTTTCAGCCATNNAAATAAGG

AAGTCCTGCTATTTGCAACAAACTGGGTGAATATGGAGAACGTTATGCTA

AATGCAATATGCTAAAGACAGACACAGAAAGACAAGTATGACCTCACTTA

TATGTGGAAACTGAAAAAGCCATACTCATTACAGCAAAGAGTAGAATGTT

GGTTACCAGGGGCAAAGAGGGTAGAAATGAGGGGAGTGAGAAAATGTC

AATCAAAGTGTAAGAATGTTATAACATAAATAAATTCATAGAG

Identifikátor v Genbank: G08003

Popis: lidský STS CHLC.GATA69F01.P13099 klon GATA69F01.

11. D18S1113:

Identifikátor v databázi: AFM200VG9 (také známé označení D18S1113, 200vg9, w2403)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = GTTGACTCAAGTCCAAACCTG

Pravý = CAAAGACATTGTAGACGTTCTCTG Délka produktu = 207

Přehled úplné sekvence:

AGCTGCATATAAAACTATTCCATTTCACATTTTTGAAGACATTTGTAGCCA

TGATACTTTGCTGTTGTCTGTGGGCCACCTCTTTTTGAAGTGTGTAGTTA

ACTGTGCTCCTGTAATCTGTTGTCTGTTGACTCAAGTCCAAACCTGTTCT

GCGTGGCATGTTTCTNCAACTTGATGTGATGCTATTTATCACTTTCTTTGA

AGTTAAGTCTCTATGTCTTTGTATTCTTTCTGTGTACCCAGGGATATGTTT

GTGCATGCACACGCATAAACACACACACACACACACACACACACAGAGA

CAGAGACAGAGAACGTCTACAATGTCTTTGTGAG

12. D18S868:

Identifikátor v databázi: GATA-D18S868 (také známé označení G09150, CHLC.GATA3E12 , CHLC.GATA3E12.496, CHLC.496, D18S8oSi Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = AGCCAATACCTTGTAGTAAATATCC Pravý = GATTCTCCAGACAAATAATCCC Délka produktu = 189

Přehled úplné sekvence:

GAGTGAGCCAATACCTTGTAGTAAATATCCATCTATCTTTGATGTATCTAT

GTATCTATCTTTGTATCTATATGTCTATGTATCTATGTATGTATGTATCTAT

CTATCATCTATCTATCTATCATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCT

ATCTATCTATATC C NTTTGGGATTATTTGTCTGGAGAATCCTGATTAACAT

AGTCTGCTAACTTTTATCTGTATCTCCTATGTGTATGCTTCTCCTTCTTCC

TGTCTCTCTCTCTTCTTTGTCCTCATTTAANCTCCTTTCCTGGGNATATTG

GNAATTTTGATTGGANTCTGGACANTGTAGGAGTAAAAATTT

Identifikátor v Genbank: G09150

Popis: lidský STS CHLC . GATA3E12 . P6553 klon C-ATA3E12 .

13. WI-9959:

Identifikátor v databázi: MR12816 (také známé označení D18S1251, G00-678-524, G05488, 9959)

Zdroj: WICGR: Náhodná STS v genomu Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TGCCAACAGCAGTCAAGC

Pravý = AGCACCTGCAGCAGTAATAGC Délka produktu - 110

Přehled úplné sekvence:

ctgttttatttgaaaaaaaaaatctgtctccaagaagaaaagttcattctACCTGTTGCCAACAGC AGTCAAGCGGACATGTTTAAAATTTTTTAAAAAAGTA CCAACT GG N GTTTAATAGC CTC ATifTG G CTTTTGCTATTACTGCTGCAGGTGCTT TNATTTTTTTCCTCTGCATTATAATTAC

Identifikátor v Genbank: G05488

Oescription: WICGR: Náhodná STS v genomu

Hledání v GDB

»» · ·

14. D18S537:

Identifikátor v databázi: CHLC.GATA2E06.13 (také známé označení CHLC.13, GATA2E06, D18S537, GATA-D18S537)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TCCATCTATCTTTGATGTATCTATG Pravý = AGTTAGCAGACTATGTTAATCAGGA Délka produktu = 191

Přehled úplné sekvence:

AAAG CTGAGTGAGC C AATAC CTTGTAGTAAATATCCATCTATCTTTGATGT

ATCTATGTATCTATCTTTGTATCTATATGTCTATGTATCTATGTATGTATGT

ATCTATCTATCATCTATCTATCTATCATCTATCTATCTATCTATCTATCTAT

CTATCTATCTATCTATATC C NTTN G GTATTATTN GTCTG G N G AATCCTGAT

TAACATAGTCTGCTAACTTNTATCTGTATCTNCTATGTGTATGCTTCTNCT

TCTTCCTGTCTCTCTCTCTGCTTTGTCCTCAATTNAAATCTCC

Identifikátor v Genbank: G07990

Popis: lidský STS CHLC.GATA2E06.P60Q6 klen GATA2E06.

Hledání v GDB

15. D18S483:

Identifikátor v databázi: AFM324WC9 'také známé označení 324wc9, Z24399, DI8S483)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TTCTGCACAATTTCAATAGATTC Pravý = GAACTGAGCAAACGAGTATGA Délka produktu = 214

Přehled úplné sekvence:

AGCTCTGCTGGAAGAGCAGGGCTGTTTTCTGCACAATTTCAATAGATTCC

CCTACCCTGGGTTTTTCAGTAGATAGATAGATAGATGATAGATAGGTAGA

TAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATGATAGATAGATTTT

ATATATAGTATATAAAATCTACACACACACACACACACACACACACACATA

TTTGCCTTTCCTTGACTATCATACTCGTTTGCTCAGTTCTTTTTTTTTTTAA

ATTTTTGTTTGTAAATCCAAAATGCTT

Identifikátor v Genbank: Z24399

Popis: H. sapiens (D18S483) DNA segment obsahující repetice (CA), klon

Hledání v GDB

4 • ·

444 • 4 ·*

16. D18S465:

Identifikátor v databázi: AFM250YH1 (také známé označení 260yhl, Z23850, D18S465)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: ChrlB

Primery: Levý = ATATTCCCCTATGGAAGTACAG Pravý = AAAGTTAATTTTCAGGCACTCT Délka produktu = 232

Přehled úplné sekvence:

AGCTCTGTC C CTCTAGAG AAC G CTG ACTAATATATTCCCCTATGGAAGTA CAGATGGTTTTTNTAAaATAAATTTATCTGATTGTGATGAGATAATCATCA TTTTTATGTTCAGTGTTTTTCTAAATTTTTTATTGTTATTGTTTTTATACTCT AAATGGTTTTTAAATATGCACATATGTGCATATTTTACACACACACACACA CACACACACACTCTCTTTATTTAGAAGCATTATAGATAGAGTGCCTGAAAA TTAACTTTTAAC C N AAG AAAAG AC AATAAG G AAC AATAG G G A AGTTAT C C TTTG CTAAG GGTATG G AAAATATTC AC ATATTATTTATAAC AN GTTAAAC C AAGTCATGCTTGANTATAATAGCT

Identifikátor v Genbank: Z23350

Popis: H. sapiens (1183465.) DNA segment obsahující repetice (CA), klon Hledání v GDB

17, D18S968:

Identifikátor v databázi: GATA-P34272 (také známé označení G10262, CHLC.GATA117C05, CHLC.GATA117C05.P34272)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = GAAATTAACCAGACACTCCTAACC Pravý = CTTA.GAATTGCCTTTGCTGC Délka produktu = 147

Přehled úplné sekvence:

GAATAAAAATATGAGGTATTAGAAATTTACAGATAGGAAGAAATTAACCAG

ACACTCCTAACCACCGATNAGTTTAAAGAGGAGATAGATAGATAGATGAT

AGATAGATAGATAGATAGATAGATACCACTGAAAATGCAANCACAAATTA

GCAGATTATATGTGATGCAGCAAAGGCAATTCTAAGTAGATTCTAACTGC

TACATTGATAGCAGTACCCACTGACATTACCGGAAAGGATGGTATCCATA

ACCACCTACCTATATACCTCCGCAGCTGGANATTAGGNTTAAGCTTCTTN

GGGCNCCTGGCGGCCCCNNTTGTGGTCCCCGGTNGGNCCCCGNTTNN

GNNTNGCTNNGNTTNCNTTGGNGNCCCCCNNTNGGTTTNNGGNNNNNT

NNNNNTNGNNNNNTTNCCCNNNNNNNNTNTNNNNCNNNNNNNNNTNNN

NNNNNNNNNNGGNNNNNGGGN

Identifikátor v Genbank: G10262

Popis: lidský STS CHLC.GATA117C05.P34272 klon GATA117C05.

18, GATA-P6051:

Identifikátor v databázi: G.ATA-P6051 (také známé označení CHLC.GATA3E08, CHLC.GATA3E0 8.P6051)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = GCAACAA.CCCTAATGAGTATACG Pravý = GAGTCTCACCAGGGCTTACA Délka produktu =149

Přehled úplné sekvence:

AAAGCTGTCTCCTTTTGTAAAGTGTGCTCAGAGGAATCTTTTTCAGTAAAT

AAAGTCTGCACCCAGACATCTCACTTTGTATACCACGGAGAATTTACCAT

GACTCTTCTCAGTGATAAACGTCAATATAGAATAATCAGGAGAAAAAGAG

AAATCCAGTAAAGAAATAAGTCTGTAGAAAGCAACAACCCTAATGAGTAT

ACGATATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATG

NATCTATCTATCTAACATTATATAAAATATATATTTCCTCCTGTATTGGGG

C CCTGTGTGTAAGCCCTGGTGAGACTCAAAAATTTGANTATTCCTNTTTN

T

Identifikátor v Genbank: GQ9104

Popis: lidský STS CHLC . C-ATA3E08 . P6051 klon GATA3E08.

19. D18S875;

Identifikátor v databázi: GATA-D18S875 (také známé označení G08001, CHLC.GATA52HC4 , D18S875)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TCCTCTCATCTCGGATATGG

Pravý = AAGGCTTTCAGACTTACACTGG Délka produktu = 394

Přehled úplné sekvence:

TTATTTATTCACTCATTCAATAAATATTTATGAATTTCCTTTAATGGCNANG

AAAGTATGTTTGGTACTGAATATGGTGAGCAAGATTTTCCTCTCATCTCG

GATATGG AAAG ATCTTG G AAATC ATTATAC NTC ATACTTAC AATAN G AAAG

AAGCTGAGCAATTTGAAAATCAACAATTTCTTTTGTACNTGTCAGAAAAGT

G AAG ATATATTAATC AG G GTTCTTC AGAG AAAC ATAAC C AATAG G N C AC A

GNTCTATATGNCCNCNTTTATCTATCTATCTATCTATCTATCNCTATCTAT

CNCANACCNGGNGAANTNATNTTTGNGAGATTNATGCAAGNCTGAGAAA

NACCNAAGAANCTGCTCCCTGTNAAACTNGAGATNCAAGAANCTGAANA

GTATAGNTCCAGTCCNAAGTCTANAGACCTTAGAATTAGGAAAACTGATA

4 4 4 • 444	• 4 4 4 4 444	4 · 4 4 4 «4 ·
4 4 4 · 4	4 4 44	4 4 4 4

CTATAAATACCAGTGTAAGTCTGAAAGCCTTAAANACCANATAGTG C C AT TGAAAGGGCAGAAGACTGATGTCCCAGTTCAAGCAGGCAAAGTTAGAGA AGCCTTATTTTCTGCAACATTGTTCTATTCAGACCCTTNANANGATTGACN ATGTCCACCCA

Identifikátor v Genbank: G08001

Popis: lidský STS CHLC.GATA52H04.Pl6177 klon GATA52H04.

Hledání v GDB

20. WI-2620:

Identifikátor v databázi: MR1436 (také známé označení G03602, D18S890, HHAal2h3, 2620)

Zdroj: WICGR: náhodná STS v genomu Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TCTCCAAGCTATTGATTGGATAA

Pravý = TTAAGAGCCAATTTATATAAAAGCAGC Délka produktu = 177

Přehled úplné sekvence:

CCCCTTTTGCCAACGCCATGCTTCACGTAGGGAGCCTGACATGCAGAAA

ACTCTCCAAGCTATTGATTGGATAAAGAGCCAGAGCTGACTGAATTCCAT

TCTTCTTGAGCCTCTCATTCTGTGTTTCTCGAATTTTTACCAAAGCATCTT

GACACACAAATATCTGACTCAAGGAAAAGGAAAAACAACTGCTTTTTCTC

CAGCTGCTTTTATATAAATTGGCTCTTAAACTTTCTAAGTTTATTATGGAT

A

Identifikátor v Genbank: G03602

Popis: WICGR: Náhodná STS v genomu

Hledání v GDB

21. WI-4211:

Identifikátor v databázi: MR6638 (také známé označení G03617, D18S980, 4211)

Zdroj: WICGR: Náhodná STS v genomu

Chromozom: Chrl 8

Primery: Levý = ATGCTTCAGGATGACGTAATACA Pravý = AAATTCTCGCTGATTGGAGG Délka produktu = 113

Přehled úplné sekvence:

CTAGTACCATAATCCCTTTTGGAATAAACCATCCCACCTTTAGTCAGANC

AGATGCTTCAGGATGACGTAATACATAATAAGCCTACTCAGTTCTACTCT

GGCTTTGTATGTCTTCAAAGTGATATTTTTTTAAGTATTACTTGTCCCTCC

AATCAGCGAGAATTT

Identifikátor v Genbank: G03617

Popis: WICGR: Náhodná STS v genornu

Hledání v GDB

22. D18S876:

Identifikátor v databázi: GATA-D18S876 (také známé označení G09963, CHLC.GATA61E10, D18S876)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TCAAACTTATAACTGCAGAGAACG Pravý = ATGGTAAACCCTCCCCATTA Délka produktu = 171

Přehled úplné sekvence:

AAGACTGCAATTACATTTGCATCAAACTTATAACTGCAGAGAACGTTGC C

CACTATTTTATACCACACAACAGTATTCTTAGCCAGATTACATCTATCTAT

CTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCATCTATCTAGC

TAG C TATC TATCTATAG AACTAATG G G GAG G GTTTAC C ATGTTTG G GTG A

ACCCAAACATTTTATGGNCAAGGGNTTGGAAAATTACCCTTATCTACAAC

TNTTNAACTTGTTTTGGTAGGNGTGNTAATTCCNTGGGNTTGGAANAACT

TTTGNAATTTCCTCNTTGTTTNTNATTNNNNATTNNTNNNCATTATTNTGG

GGTNTTCNGGGTGGAGGGCTNANTTTGGCCNCCCGGGTCCNNGGNGC

NAGTNGGNNNGGNTNNTNGGGTTTNCTTGGGAANCNTNCCNCCTNCNG

GGGNTTCANGGGNTTTTTNTTTNNTTG

Identifikátor v Genbank: G09963

Popis: lidský STS CHLC.GATA61E10.P17745 klon GATA61E10.

Hledání v GDB

23. GCT3G01:

Identifikátor v databázi: GCT-P10825 (také známé označení G09484, CHLC.GCT3G01, CHLC.GCT3G01.P10825)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = CTTTGCAATCTTAGTTAATTGGC

Pravý - GAACTATGATATGGAGTAACAGCG Délka produktu = 128

Přehled úplné sekvence:

AGATGTTTAACTTTGCAATCTTAGTTAATTGGCAGAAATGAAATTTAGTTT

CCACAACTiTTATTCGATATTAAAACACCACCACCATCAGCAGCAGCAGC

AGCAGCAGCAGCATCGCTGTTACTCCATATCATAGTTCAGAGCATTTAAA

G N G GTC AAAATATAC AACTAG GCTGACACCN G N ATAAG GTTTAATTTTAA

ACCNGNGGTCTNCCCTCTAAGGNGGNTTTTTTTTTCTTGNCNTGGCTTCT

TTTTCCNTTTGCTTTTGTAAAATATCAAGGNATTTTTGGGTTNTTCNTGGN ··· • ··· • ·

ANTTNNCNNANTNNTNNTTNNNCNCNCCCCCCNTTTGNGGCGGGGGTC

CCCNNNTTGCCCCGGGGTTGNGTGCAGTAGGGGGGTCNCGGGTNNNG

NAAGTTTNGGGGCCCT

Identifikátor v Genbank: G09484

Popis: lidský STS CHLC.GCT3G01.P10825 klon GCT3G01.

24, WI-528:

Identifikátor v databázi: MH232 (také známé označení G03589, 528, D18S828)

Zdroj: WICGR: náhodná STS v genomu

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TTCTGCCTTTCCTGACTGTC Pravý = TGTTTCCCATGTCTTGATGA Délka produktu = 211

Přehled úplné sekvence:

CTACTAAGCAAATTCTGCTCAGCCTTCTGCCTTTCCTGACTGTCTTGTTG

GCCCTTCCCACTTTAAGGATGCCTGTTTAAGTAGCCACCTCTAATTAGGA

ATCTTCCCTTGTTCTTTCTCAGGAGGCTTAGACACTGTCAGTTTCCTGAA

GACAGAAAATAAGCCTGCATTATCCTAGTAGTGGATTCAAAACTAATTGT

GTCCTGAGTCTTTCAATCATCAAGACATGGGAAACACTCAACAG

Identifikátor v Genbank: G03589

Popis: WICGR: Náhodná STS v genomu

Hledání v GDB

25. WI-1783:

Identifikátor v databázi: MR432 (také známé označení G03587, _shu_31.Seq, 1783, D18S824)

Zdroj: WICGR: Náhodná STS v genomu Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = CCAGTAATTAGACATTGACAGGTTC

Pravý = TTTTACTAGACAGGCTTGATAAACAA Délka produktu = 305

Přehled úplné sekvence:

CCAGTAATTAGACATTGACAGGTTCCATACTAGTAATGTAG G G AATAG G G

CTGCTGCTTTTTGGGTTTCCTTGAGTATACTTTGTGCTGCATAAATATGG

CAATGGATAGTAAATAATTTGTATGCAGACCTTTAGTGTCGATTAACCTGT

GAATAAGGGAACAACAATCAAGGACAAAAATGAAAAGACTAATTCTCTAT

ACATTTTGAGCTTTTGTAAAAAAGTAAGATTAGCTGAATATATCTGAAAAA

TTTCTAATCTCCTTTACAATTTTTTAAATTGTTTATCAAGCCTGTCTAGTAA

AAATAATTCAGTTTCGGAATGTGG

Genbank ID: G03587

• · ·	• · • ·	9 999	• · • 9	9 9 9 «
• * · • · · · ·	• 9 99	9 9 99	9 9 9 9	» · 99

Popis: WICGR: Náhodná STS v genomu

Hledání v GDB

26. D18S477:

Identifikátor v databázi: AFM301XF5 (také známé označení 301xf5, Z24212, D18S477)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = GGACATCCTTGATTTGCTCATAA Pravý = GATTGACTGAAAACAGGCACAT Délka produktu = 243

Přehled úplné sekvence:

G GAC ATC CTTGATTTG CTC ATAATACACTCATTC CTTTC ACCATTGAGTGT

GCACATATTTCTCTGATTGGAAAGAACTACAGAGGAGGTTTTACNTTTTA

CTTTC CAGTTTG CTATTAAAG AG AGAAAACTAAC AGAG N G AAATC AAG CA

ACTCAAAACAACCTTACACACACACACACACACACACACTCACAAAGATA

TTTTGTTC AC CATATGTATTGATGTGCCTGTTTTCAGTCAATCCACAG G AA

GGGCTAAGGAGAGTGACATCTGGGCTACATTAAAAGGACAGTCACATTG

CTCAAAGNACTCAAGTTTAGCCCGAGTACAGTAGCT

Identifikátor v Genbank: Z24212

Pc-pis: H. sapiens (D18S477) DNA segment obsahující repetice (CA), klon Hledání v GDB

27. D18S979:

Identifikátor v databázi: GATA-P28080 (také známé označení G08015, CHLC.GATA92C08, CHLC.GATA92C08.P28080)

Zdroj: CHLC: geneticky mapované polymorfní tetranukleotidové repetice

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = AGCTTGCAGATAGCCTGCTA

Pravý = TACGGTAGGTAGGTAGATAGATTCG Délka produktu = 155

Přehled úplné sekvence:

CTCTACAGTCTCTNACCTTTGGACTCCAGGACTTTCACCAGCACCCTCAA

CATTCCCACTGGGTTCTCAGGACTTTATAGTTGTACTGAGCCATGCCACT

GGATCCTAGGGTCTCCAGCTTGCAGATAGCCTGCTATGGGACTTAATCT

TTGTAATAAGGTGAGTCAATTCTGCCAATAAACCTACTTTCATCTCTATCT

ATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATATCTATCATCTATCTATCGAAT

CTATCTACCTACCTACCGTATTAGTTCTGTCTCTCTGGAGN

Identifikátor v Genbank: G08015 ·· *

··· ♦ · • ♦·· ♦ 4 99

4 4 4

4 4 4

4 9 4

9 9 4

44

Popis: lidský STS CHLC.GATA92C08.P28080 klon GATA92C08.

28. WI-9340:

Identifikátor v databázi: UTR-05134 (také známé označení G06102, D18S1034, 9340, X60221 }

Zdroj: WICGR: primery odvozené ze sekvencí uvedených v Genbank Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = TGAGAGAA.CGAAATCTCTATCGG Pravý = AGGCAGCAAGTTTTTATAAAGGC Délka produktu = 115

Přehled úplné sekvence:

ATGTATCTATCCCAATTGAGTCAGCTAGAAACAGTTGACTGACTAAATGG

AAACTAGTCTATTTGACAAAGTCTTTCTGTGTTGGTGTCTACTGAAGTTAT

AGTTTACCCTTCCTAAAAATGAAAAGTTTGTTTCATATAGTGAGAGAACGA

AATCTCTATCGGCCAGTCAGATGTTTCTCATCCTTCTTGCTCTGCCTTTG

AGTTGTTCCGTGATCATTCTGAATAAGCATTTGCCTTTATAAAAACTTGCT

GCCTGACTAAAGATTAACAGGTTATAGTTTAAATnGTAATTAATTCTACC

ATCTTGCAATAAAGTGACAATTGAATG

Identifikátor v Genbank^-: G06102

Popis: WICGR: Náhodná STS v genomu

Hledání v GDB

29. D18S466:

Identifikátor v databázi: ΑΠΤ094ΥΕ5 (také známé označení 094ye5, Z23354, D18S466)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = ACACTGTAGCAGAGGCTTGACC Pravý = AGGCCAAGTTATGTGCCACC Délka produktu ~ 214

Přehled úplné sekvence:

aaatgacactttaaqgaggtaacactgtagcagaggcttgaccaccacccagttctcactagcactgaggatgctc tattggttgggttacccacacacgcatagacatgcacacacacagacacacagacacacacacacacacacac acaccagatataqcattccaaaccatcaatatqctatqcaatactqcattaacaqgtcatgcctgtggtggcacata acttggcctagaaaatactggggacgtctgcattcccttttattatcgaattgacttacttggcttctgagttttcctcagaa gtaatacttcaatacctcttccatttctgccttgancaítgtttggggtaccaagtatagct

Identifikátor v Genbank: Z23354

Popis: H. sapiens (D18S466) DNA segment obsahující repetice (CA), klon Hledání v GDB ♦ · ·· • · · · • · · · • · · * ·· ··

30. D18S1092:

Identifikátor v databázi: AFMA112WE9 (také známé označení D18S1092, w5374, all2we9)

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = CTCTCAAAGTAAGAGCGATGTTGTA Pravý = CCGAAGTAGAAAATCTTGGCA Délka produktu = 163

Přehled úplné sekvence:

aqctctcaaagtaaqaqcgatqttqta actgactgagttgttttgtgaanttttgnttttggagtcagtggagcat gttattagatgtaaatttaaacacacacacacacacacacacacacacacacgagaagtaag tqccaag attttctacttcqgcgcctatatttctatatactgattttctgtatttcccagacttgaatataqattgtctttctqntttat catagacaatctcataataanttaggcataataaggtaatgaggnttttctgggcttcttttcatcatccctgca atttgagtctcntttatagntgaantcttctctgtaataacntcttgttttagct

Hledání v GDB

31. D18S61

Identifikátor v databázi: ΆΕΜ193ΥΕ8 (také známé označení 193yf8, Z16334, D18S61;

Zdroj: J Weissenbach, Genethon: geneticky mapovaná polymorfní STS

Chromozom: Chrl8

Primery: Levý = ATTTCTAAGAGGACTCCCAAACT Pravý = ATATTTTGAAACTCAGGAGCAT Délka produktu = 174

Přehled úplné sekvence:

C GTCTTAC C AAAC C AAC ATAATATAG C AATG G N AAC CAAAAATTTCTAAGA

GGACTCCCAAACTACATTCTTCTNCCTGAATTAAATACAGGCATTCAANA

NAAACANACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGCACA

C C CTTC AAATC N TAG C ATAAATTC C N CTTATATAAAC ATAAC CATGCTCCT

GAGTTTCAAAATATTGGGTGGTTCGAAGTTCGAAGCAACAAATTTCCAGT

TAGTGTCTATTANTTGTTGGACAGCT

Identifikátor v Genbank: Z16834

Popis: H. sapiens (D18S61) DNA segment obsahující repetice (CA), klon Hledání v GDB

Φ· φ

»·· ·« 44 44 44

9 4 4 9 9

4 99 9 4 · ·

4 4 4 9 4 4 ·

4 4 4 4 4 9

94 ·4 ··

Markéry (STR) použité k upřesnění kandidátské oblasti

Následně jsou uvedeny markéry, které byly užity u rodiny

MAD31 k upřesnění kandidátské oblasti. Většina těchto markéru již byla popsána výše a je proto uveden již jen jejich název.

Podrobná informace a dalších markérech je uvedena dále.

Data již byla uvedena pro: D18S68, D18S55, D18S969, D18S1113, D18S483, D18S465, D18S876, D18S477, D18S979, D18S466 and

D18S61.

Nová data

1. D18S51:

Jiné názvy: UT574, (D18S379)

Sekvence primerů:

UT574a GAGCCATGTTCATGCCACTG UT574b CAAACCCGACTACCAGCAAC

Sekvence DNA:

AATTGAGCNCAGGAGTTTAAGACCAGCCTGGGTAACACAGTGAGACCCC

TGTCTCTACAAAAAAATACAAAAATNAGTTGGGCATGGTGGCACGTGCCT

GTAGTCTCAGCTACTTGCAGGGCTGAGGCAGGAGGAGTTCTTGAGCCCA

GAAGGTTAAGGCTGCAGTGAGCCATGTTCATGCCACTGCACTTCACTCT

GAGTGACAAATTGAGACCTTGTCTCAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA

GAAAGAAAGAAAGAANGAAAGAAAGAAAGTAAGAAAAAGAGAGGGAAAG

AAAGAGAAANAGNAAANAAATAGTAGCAACTGTTATTGTAAGACATCTCC

ACACACCAGAGAAGTTAATTTTAATTTTAACATGTTAAGAACAGAGAGAAG

CCAACATGTCCACCTTAGGCTGACGGTTTGTTTATTTGTGTTGTTGCTGG

TAGTCGGGTTTGTTATTTTTAAAGTAGCTTATCCAATACTTCATTAACAAT

TTCAGTAAGTTATTTCATCTTTCAACATAAATACGNACAAGGATTTCTTCT

GGTCAAGACCAAACTAATATTAGTCCATAGTAGGAGCTAATACTATCACA

TTTACTAAGTATTCTATTTGCAATTTGACTGTAGCCCATAGCCTTTTGTCG

GCTAAAGTGAGCTTAATGCTGATCGACTCTAGAG

Identifikátor v Genbank: L18333

2. D18S346:

Jiný název: UT575

Páry primerů:

Primer A: TGGAGGTTGCAATGAGCTG Primer B: CATGCACACCTAATTGGCG

999 • · • ···

Sekvence DNA:

ACGAGGACAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAACCCCGTT TNTACTAAAANTACDAAANTTGGTCGGGAGGCTGGGGCAGGNGACATGC TTGACCCCAG G AG GTGGAGGTTGCAATGAGCTGAGATTG CACCACTGCA

CTNCAGCNTGG......AAGAAAGAGAAAGGANAGNNAGGNAGNNANNAAAC

TACATNTGAAGTCAACACTAGTATTGGTGGGAGAGGAATTTTATGCTGCA

TTCCCCNACAACCACTAGATACGCCAATTAGGTGTGCATGGTCCATGCTA

T

Identifikátor v Genbank: L26588

3. D18S817:

Jiný název: UT6365

Páry primerů:

Primer A: GCAAAGCAGAAGTGAGCATG Primer B: TAGGACTACAGGCGTGTGC

Sekvence DNA:

CATATGGGTCCACAAGCAACCTCAGTCCTTGTCTCTTCAGAAGAAAGAAT

TCTACTGAGGGNCATAAGGCAGAAGGAGAGACCTAGGCAAGTTGCAAAG

CAGAAGTGAGCATGTATTAAAAAGCTTTAGAACAGTAAGGAAAGGAAGAA

AAGAAAAGAAGGAAAGTTCAACTTGGAAGAGGGCCAAGCCGGCAACTTG

GCAGAAGGATTGCTTGAGCCCAGGAGTTAAGACCAGTCTGGGCAATATA

GTGAGACTCCATCTCTGCATACATACATACATACATACATACATAGATACA

TACATACATATTGCAGGGTATGATGGCACACGCCTGTAGTCCTAGCTACT

CTGGAGGTTGAGATGGGAGGGTCACTGAGCCTGGGAANTTGAGGCTGC

NNTGAGCCATGATC

Identifikátor v Genbank: L30552

Charakterizace YAC ·· ·«· ·· J· • · « • · ···

4· ·· • > » • · · ·· ·♦ ·· ··

YAC bylo vybráno, které pokrývají kandidátskou oblast a ohraničují mezeru. Tyto YAC byly dále charakterizovány stanovením koncových sekvencí pomocí inverzní PCR.

Vybrané YAC byly 961_h_9, 942_c_3, 766_f_12, 731_c_7,

907_e_l, 752_g__8, 717_d_3, 745_d_2.

Nové STS založené na koncových sekvencích (pokud není uvedeno jinak, STS byly testovány na monochromosomálním mapovacím panelu pro identifikaci chimérismu YAC, pokud STS nezasáhl chromosom 18-chimérický YAC, pak je to uvedeno níže v textu).

1. SV32L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 745_d_2.

Primer A: GTTATTACAATGTCACCCTCATT

Primer B: ACATCTGTAAGAGCTTCACAAACA

Sekvence DNA:

ATTC CTTNGTTATTACAATGTCACCCTCATTTAAAAAGTGGAAAGATAAAG AGGAAGCAATCTATTTTTTTCCTTTTTTTCTGATAGCACTTGTTTGTGAAG CTCTTACAGATGTTCTTAAGTAAAATCAACTCCTCCATTTTTTTTGTAGCA ACTACACATATTTATCAATAATAGTTCACAAATACATTTTCAAATT

Délka amplifikované sekvence: 107 párů baží (bp)

Toto STS se nevyskytuje na monochromozomovém mapovacím panelu.

2. SV32R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 745_d_2.

Primer A: ACGTTTCTCAATTGTTTAGTC Primer B: TGTCTTGGCATTATTTTTAC

Sekvence DNA:

AGACAATGGGAGAAATTGCACTGCCCTGAGTCAGAAATCAGATCTGTTG

CCATACAGCTGCCGTTATGTGATCATTTGCAAGTCAACGTTTCTCAATTG

TTTAGTCATTTGTRAGACAAAAAGACTGGTTGGATTTCAGAGAATTTGGA • · 4 « · · • · · · 4 44 · • •••4 © · 44 44 44

ATCCTCCTTCAGGTTTAACAAGCAATAAATGATACTCTTCAGTGTAAAAAT

AATGCCAAGACATNATTTGACTTTAAATTAAATCCAAACAAGATATC

Délka amplifikované sekvence: 127 bp

Toto STS se nevyskytuje na monochromozomovém mapovacím panelu.

3. SV11L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 766_f_12.

Primer A: CTATGCTCTGATCTTTGTTACTTT Primer B: ATTAACGGGAAAGAATGGTAT

Sekvence DNA:

GTCTTTATTTCATATAACTATGCTCTGATCTTTGTTACTTTCTCCTTTTAAC

TCAGTTTAAGCTTTATTCTTATTTTCCAGCTGCTGAAGGTATATAGTTAGG

TTGTTTATTGGATACCATTCTTTCCCGTTAATGTCAGTGGTTACTGCTATC

AATGTAGCAGTTA

Délka amplifikované sekvence: 118 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 18 a musí být lokalizováno mezi CHLC.GATA-p6051 a D13S968.

4. SVÍ IR:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 766_f_12. Primer A: AěGGTATATTATTTGTGTCG Primer B: AAACTTTTCTTAACCTCATA

Sekvence DNA:

ATAAGGTATATTATTTGTGTCGTGAGTTAAGAAATCATTAATAACTATTTT CAGAATGACAAATGTCATTATATGTTGTAAAAAAGATAAATACGTGAAATT ATG AG GTTAAG AAAAGTTTA

Délka amplifikované sekvence: 119 bp.

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 18 a musí být lokalizováno mezi D18S876 a GCT3G01.

5. SV34L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 717_d_3.

Primer A: TCTACACATATGGGAAAGCAGGAA Primer B: GCTGGTGGTTTTGGAGGTAGG

Sekvence DNA:

ACATAAAATGTCGCTCAAAAACAATTATGTGTGTCTACACATATGGGAAA

GCAGGAAACAAATTTGTTTACAACATACATTACTTTTGTTTTTTAGGCAAG ataaaatntcctacctccaaaaccaccagcacngtccgcaataactatac

ATC

Délka amplifikované sekvence: 98 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 18.

6. SV34R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 717_d_3. Primer A: ATAAGAGACCAGAATGTGATA Primer B: TCTTTGGAGGAGGGTAGTC

Sekvence DNA:

AATATC ATTCTTC AC C CAC GTTATACATAAGAGAC CAGAATGTGATATTGT

CATCTCACATGGAAAAATCTGCTGTGATCAGTTCCTGAAGCTTGCTGTGA

TCCTCCCTTAGGAAAGTAGAAAAATCTTTTTGAAACACTTTATTCTACAAT

CAATGAAAATTAGGTGAAGCTACAGAAGCCAGAAATTACTCTAAGATTAG

ACAATTATTTAAGANGACCAATTGTCTTTGGTCTTCTTCTGAAGGGTCTG

ACTACCCTCCTCCAAAGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCNTGA

Délka amplifikované sekvence: 244 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 1, tudíž YAC 717_d_3 je chimérický.

7, SV25L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 731_c_7.

Primer A: AAATCTCTTAAGCTCATGCTAGTG Primer B: CCTGCCTACCAGCCTGTC

Sekvence DNA:

AGTGGAGAGATAGAAAGAGAGGAAGATTTTTTTTTTTAAATCTCTTAAGCT

CATGCTAGTGTAGGTGCTGGCAGGTCTGAACACTCTGTAGGACAGGCTG

GTAGGCAGGAA

Délka amplifikované sekvence: 72 bp

Toto STS se nevyskytuje na monochromozomovém mapovacím panelu

8, SV25R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 731_c_7. Primer A: TGGGGTGCGCTGTGTTGT Primer B: GAGATTTCATGCATTCCTGTAYGA

Sekvence DNA:

GGAGGGTGTTNTCACANAAGTCTGGGGTGCGCTGTGTTGTTCATTGTAA AAACCCTTTGGANCATCTGGGAATGTGCTGCCCCACATGTCCAGGTAAC GTTCTCAG GAAGG G GAG G CTGGAAATCTCTGTGTGTTCTTACAGGAATG CATGAAATCTCCCANCCCCTCTTGTTGGA.AATTTCCCTCACTTT e ·

444 444 444

4444 · 4444 4 ··

Délka amplifikované sekvence: 136 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 7, tudíž YAC 731_c_7 je chimérický.

9. SV31L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 752_g_8.

Primer A: GAGGCACAGCTTACCAGTTCA Primer B: ATTCATTTTCTCATTTTATCC

Sekvence DNA:

CTTCTCNATGANTGGACAAATGTCATTGGGTCAGCATGAGGCACAGCTT ACCAGTTCAGATTCCAGTAGCTGAGGAACAAATCTTAACTCCAAAAATAA GTAATTGCGTCACTTTGGAGGAATTATTTGACCTTTTCATAACTTTGACAT CACAACAATGAGGGTGAAGTTAGTAAAATAAATGATTATTATGAGGATAA AATGAGAAAATGAATTNAGTGCTTAAGACAATGCTTGGTAACTAGTTAAN CCG

Délka amplifikované sekvence: 178 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 18 a musí být lokalizováno mezi D18S876 and GCT3G01.

10. SV31R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 752_g_8.

Primer A: CAAGATTATGCCTCAACT Primer B: TAAGCTCATAATCTCTGGA

Sekvence DNA.:

AAACTTTAACCAATTTAAACTCG CTAACAGTTCTATAAAATAAG CAAGATT ATGCCTCAACTTTATGGATAAAGAAATGGAGGCATTAAGAGATAACTAAC TTG C C C AAG G C C AC AC AAGTG ACTG AGTAAG AATTG C AAAG C C AATG AG TCTGGCTCCAGAGATTATGAGCTTAATCACCACACTGTGCCACCTCCTGT GTTTCCTGG

Délka amplifikované sekvence: 131 bp

Toto STS se nevyskytuje na monoehromozomovém mapovacím panelu a není informativní, co se týče chiméričnosti YAC.

11, SV10L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 942_c_3. Primer A: TCACTTGGTTGGTTAACA.TTACT Primer B: TAGAAAAACAGTTGCATTTGATAT

Sekvence DNA:

GGTNTTTCACTTGGTTGGTTAACATTACTTCTAAGTTTTTTATTGTTTTTTA TGCTATTGCTAATG G G ATTG CTTTCTTAATTTATTTTTTCC AATAG CTTGT TGTTAGTTTATATCAAATGCAACTGTTTTTCTATG CAAATTATGTTTC CT

Délka amplifikované sekvence: 130 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 18 a musí být lokalizováno mezi CHLC.GATA-p6051 and D13S968.

12. SV10R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 942_c_3.

Primer A: AACCCAAGGGAGCACAACTG Primer B: GGCAATAGGCTTTCCAACAT

Sekvence DNA:

TTG GTG GTG C C CTAG GTTTG G C AATTATAAATAAAG CTG CTAC AAAC ATT CATGTGCAGGTCTCC GTGTGGACATAATTTTCCAGTTCATTTGGGTAAAA CCCAAGGGAGCACAACTGTTGGATCCTATNATAAAAATATNTCTCGTTTC ATTTAAAAAACCTGGGAAACTATCTNCCCACAGTGGCTGTCCCTTTTTGT ATC C C CAC CAACAATGTTGGAAAGCCTATTGCCANCAT

Délka amplifikované sekvence: 135 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 18 a musí být lokalizováno mezi D18S8T6 a GCT3G01.

13. SV6L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 96í_h_9.

Nebyl navržen žádný primer, protože tato sekvence je totožná se známým STR markérem D18S42, který tuto oblast opravdu mapuj e.

Primer A:

Primer B:

Sekvence DNA:

CATGNCTCACAGTGTTCTGAGGCTGCTCTGGACATGCAATCTTGCATGC

TTTTGTCATGACAGGTCTTAAANAGTTTATCAGCTTNCTCAAATAGCTGAA

TGACANAACACTGGATTTTTGTTCAAATANCCTATCAACTTGGCNTCTGT

GTTGCGGTTGTCACTTGGTAACAAAATAAGTC

Délka amplifikované sekvence:

SV6L rozpoznává D18S42, který musí být tudíž lokalizován mezi WI-7336 a WI-8145.

14. SV6R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 961_h_9.

Primer A: TTGTGGAATGGCTAAGT • · ·

Primer B: GAAAGTATCAAGGCAGTG

Sekvence DNA:

TAATTGACAAATAAAAATTGTATATTTTN C ATATTTAAC ATGTTATG CTAAC ATATATATGGATTGTGGAATGGCTAAGTCAGAAATTCTTTTACATTCATAT TTCCATATTATTTACTTTNNGCTTTAAAAAATATGTAAATGANAATACTTAT TTTTTTCAGTGTCACTGCCTTGATACTTTCACATTTNN GTTAC ATATTATTT CCCTTNCATCTAACAAATATATATTGAGTTTCTATAATGTGTCTGACACTG A

Délka amplifikované sekvence: 122 bp

SV6R amplifikuje segment na chromozomu 18. Tento segment musí být lokalizován mezi WI-2620 and WI-4211.

15, SV26L:

Pochází z koncové sekvence levého raménka YAC 907_e_l. Primer A: TATTTGGTTTGTTTGCTGAGGT Primer B: CAAGAAGGATGGATACAAACAAG

Sekvence DNA:

TGGTCACTGGTGCCTTATTTGGTTTGTTTGCTGAGGTCATATTTCCTGTG GCCTTCATGCTTGATTTGTTGGAGTCTAGCCATGTAAAANTCTGTTGGAG TCTAG G C ATTTAAAAAATAG GTATTt ATTGTAATCTTTG C C ATTTGCTTGT TTGTATCCATCCTTCTTGGGAAGGCTTTACAGGCATTCAAAAGG

Délka amplifikované sekvence: 154 bp

Toto STS se vyskytuje na chromozomu 13, tudíž YAC 907_e_l je chimérický.

16. SV26R:

Pochází z koncové sekvence pravého raménka YAC 907_e_l. Primer A: CGCTATGCATGGATTTA Primer B: GCTGAATTfAGGATGTAA

Sekvence DNA:

CGCTATGCATGGATTTAAACTGAGTGTAGTGCACTCACTATGTTGCAGTC

TCTTATTCTAGGTTCCTAATATTTACATCCTAAATTCAGCT

Délka amplifikované sekvence: 90 bp

Není jasný výskyt na monochromozomovém mapovacím panelu: žádná informace, co se týče chiméričnosti na této straně YAC.

··« ·ι

Testování 3 koncových sekvencí obklopujících mezeru v dalších YAC: STS-markery WI-4211, D18S876 a GCT3G01 byly také ukázány v pořadí , aby bylo možné jasněji identifikovat YAC na opačných stranách mezery v následující tabulce 3.

Tabulka 3

YACs	STSs
WI-4211	D18S876	SV31L	SV11R	SV10R	GCT3G01
940 b 1	+	+	+	-	-	-
766 f 12	+	+	4	+	-	-
846 a 5	+	- 7	+	4·	-	-
752 g 8	+	+	+	+	-	-
745 d 2	+	+	+	4*	-	-
961 c 1	+	+	-	-	-	-
942 c 3	4*	+	4·	4·	+	-
717 d 3	-	-	+	+	- 7	+
972 e 11	-	-	-	-	-	+
940 h 10	-	-	-	-	+	+
821 e 7	-	-	-	-	+	4-
731 c 7	-	-	-	-	-	+
889 c 4	-	-	-	-	+	+
907 e 1	-	-	-	+	4*	+

+ pozitivní zásah, -: není zásah, ve dvou případech, kdy se očekával pozitivní zásah (za předpokládaného uspořádání markérů), ale nebyl pozorován, přičemž důvod není jasný.

YAC 745_d_2 byl vyloučen z další analýzy, neboť zde nebyl jasný zásah v chromzomu 18. Ze 7 zbývajících z monochromsomálního mapovacího panelu bylo zjištěno, že 3 byly chimérické a 4 nechimérické, jak ukazuje následující tabulka 4.

• · ··

9*

Tabulka 4'

YAC	chimérický	chromozom
961 _h_9 (6)	ne
942_c_3 (10)	ne
766_f_12 (11)	ne
731_c_7 (25)	ano	chromozom 7
907_e_1 (26)	ano	chromozom 13
752_g_8 (31)	ne
717 d 3 (34)	ano	chromozom 1

Pro nechimérické YAC byly STS založené na koncových

sekvencích obklopujících mezeru (10R, 11R a 31L) bylky
testovány na	14 YAC obklopujících mezeru. Překryvy mezi YAC
na opačných	stranách mezery	byly prokázány, tj. koncová
sekvence 11R (766_f_12) detekuje YAC 766_f_12 a YAC
907_E_l.
YAC pak	byly selektovány,	aby obsahovaly minimální možné
překrývající	se části
Tabulka 5
YAC	velikost	chimérický
961_h_9	1180 kb	není
766__f_12	1620 kb	není
907 e 1	1690 kb	je (chr. 13)

Tyto tři YAC jsou stabilní jak bylo určeno PFGE a jejich velikost zhruba odpovídá publikovaným velikostem. Tyto YAC byly přeneseny do jiných hostitelských kmenů kvasinek kvůli restrikčnímu mapování.

• 00 • »···

0

Příklad 2

Konstrukce frgamentačního vektoru

Fragment EcoRI/SalI velikosti 4,5 kb z pBLCS.l (lewis et al., 1992) nesoucí lysin-2 a telomerovou sekvenci byl směrově klonován do plazmidu GEM3zf(-) naštěpeného EcoRI/SalI. Poté bylo „koncové vyprošťovací místo ligováno k EcoRI místu. K tomu byly dva oligonukleotidy:

řetězec 1: 5TTCGGATCCGGTACCATCGAT-3' a řetězec 2: 3'- GCCTAGGCCATGGTAGCTATT-5', ligovány do částečně (dATP) zaplněného místa EcoRI, čímž byl vytvořen vektor pDFl. Tripletové repetice obsahující fragmnetační vektory byly konstruovány klonováním adapterů 21 bp a 30 bp CAG/CTG do Klencwem zaplněnýcého místa Pstl v pDFl. Transformace a selekce poskytla fragmnetační vektory (CAG) a (CTG)-. s orientací repetic ve smyslu 5' ke 3' vzhledem k telomeře.

Transformace kvasinek

Linearizovaný (naštěpený Sáli) vektor byl použit k transformaci YAC klonů 961_h_9, 766_f_12 nebo 907_e_l užitím metody s LiAc. Po transformaci byly YAC klony vysety na SDLys- plotny pro selekci na přítomnost fragmnetčních vektoru. Po 2 až 3 dnech byly pořízeny repliky kolonií na SDLys*-Trp-Ura“ a SDlys'-Trp'-Ura’’ plotny. Kolonie rostoucí na pudě SDlys-Trp-Ura* ale nikoliv na SDLys-Trp'-Ura' obsahovaly fragmnetované YAC.

* 4 9 44 9 9 9 94	C · 9 9 « · · 9 9 4 99	·· 44 9 · · * 9 4 9 9
4 44 4 4	4 · » ·	6 6 6 6

Analýza fragmentovaných YAC

Kvasinková DNA izolovaná z klonů se správným fenotypem byly analyzovány gelovou elektroforézou v pulzním poli (PFGE) , po které následoval kapilární přenos a hybridizace s genem Lys2 a byly stanoveny velikosti fragmnetovaných YAC srovnáním se standardem DNA známé velikosti.

Konečné vyproštění

Fragmentované YAc charakterizované velikostí společnou pro ostatní fragmentované YAC, nasvědčující přítomnosti hlavních CAG nebo CTG tripletových repetic, byly naštěpeny jedním z enzymů štěpících v koncovém vyprošťovacím místě, pak byly ligovány a užity k transformaci E. Coli. Po namnožení transformovaných bakterií byla izolována plazmidová DNA a konce fragmentovaných YAC, odpovídající jedné ze sekvencí obklopujících izolované trnucleotidové repetice, byly sekvencovány.

Pomoci sekvencování bylo zjištěno, že fragmentované YAc stejné délky byly všechny fragmentovány ve stejném místě. Bylo provedeno prohledávání databáze Genbank programem BLAST s nově identifikovanou sekvencí, aby se zjistila homologie s dosud známými sekvencemi. Úplná sekvence zahrnující CAG nebo CTG repetice fragmentovaných YAC byla získány kosmidovým sekvencováním, užitím primeru specifických pro sekvenci a sestřihových primeru, jak bylo již dříve publikováno (Fuentes et al., 1992, Hum. Gnete. 101: 346-350) nebo pomocí soupravy pro ,procházení

PO chromosomu' (Clontech

Laboratories, Palo Alto, USA) jak popsali Siebert etal.,

1087-1088 a Siebert et al.,

Nucl. Acid. Resd., 1995, 23(6)

1995, CLONTECHniques X (II) :1-3.

• 4

II 4

44 • · 4 I » 4 4 I

Výsledky

YAC 961 h_9 byl transformován fragmentačním AG) nebo (CTG); . Vektor CTG neodhalil přítomnost nalýza dvanásti (CAG)7 fragmentovaných

Klon vektorem žádných repetic CTG.

YAC ukázala, že pět z nich mělo stejnou velikost přibližně

Koncové vyproštění bylo provedeno s EcoRI a sekvencování třech z těchto fragmentu odhalilo, že všechny sdílely koncové sekvence vyznačené kurzívou na obr. 15a. Prohledávíní GenBank programem BLAST ukázalo přítomnost sekvenční homologie s genem CAP2 (GenBank přístup. Číslo L40377). Sekvence zahrnující CAG repetice ukázaná na obr. 15a byla získána jak kosmidovým sekvencováním tak i procházením pc chromosomu. Poloha sekvence v mapě byla určena mezi markéry D18S68 a WI-31“0 pomocí mapování obsahu STS.

YAC 766 f 12 byl fragmentován užitím fragmentačního

100 vektoru (CAG) nebo :tg;

A opět vektor(CTG) neodhalil žádné CTG repetice. Analýza dvaceti (CAG)- fragmentovaných YAC ukázala na existenci dvou skupin fragmentů stejné velikosti: pět s přibližnou velikostí 650 kb a dva přibližné velikosti 50 kb.

Koncové vyproštění bylo provedeno pomocí EcoRI u čtyřech fragmentovaných YAC velikosti 650 kb. Sekvencování potvrdilo, že všechny sdílejí identické 3'-konce, charakteristické sekvencí, která je zvýrazněna kurzívou na obr. 16a. Prohledávání pomocí programu BLAST ukázalo homologii této sekvence s rodinu Alu repetičních sekvencí

Sekvence obsahující repetice CAG uvedená na obr. 16a byla získán kosmidovým sekvencováním. Sekvence byla lokalizována mezi markéry WI-2620 a WI-4211 mapováním podle obsahu STS YAC kontigové mapy.

Koncové vyproštění bylo provedeno také u dvou fragmentů velikosti 50 kb. Sekvencování odhalilo sekvenci uvedenou kurzívou na obr. 17a. Prohledávání pomocí programu BLAST ukázalo, že zde není žádná homologie se známými sekvencemi. Kosmidové sekvencování umožnilo identifikovat úplnou sekvenci obsahující CAG repetice, uvedenou na obr. 17a. Sekvence byla lokalizována mezi markéry D18S968 a D18S875 mapováním podle obsahu STS YAC kontigové mapy.

* YAC klon 907_e_l byl transformován fragmentačním vektorem (CAG)·? nebo (CTG)i₀. Vektor (CAG)·? neodhalil přítomnost žádných repetic CAG. Analýza dvacetišesti (CTG)io fragmentovaných YAC ukázala, že jedenadvacet z nich mělo stejnou velikost přibližně 900 kb. Koncové vyproštění bylo provedeno s KpnI u třech z těchto YAC fragmentu. Sekvencování odhalilo sekvenci, vyznačenou kurzívou na obr. 18a. Prohledávíní programem BLAST ukázalo přítomnost homologie s markérem GCT3G0I (GenBank přístup. Číslo G09484). Sekvence zahrnující CTG repetice byla získána z databáze Genbank. Poloha sekvence v mapě byla lokalizována mezi markéry 10R

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití úseku lidského chromozomu 18q velikosti 8,9 cM ležícího mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S979 nebo jeho fragmentu pro identifikaci alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných nebo polymorfních variant, který je asociován s poruchou nálady nebo příbuznými poruchami.
2. 2. Použití YAC klonu obsahujícího část lidského chromozomu 18q ležícího mezi polymorfními markéry D18S60 a D18S61 pro identifikaci alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných nebo polymorfních variant, který je asociován s poruchou nálady nebo příbuznými poruchami.
3. 3. Použití podle nároku 2, kdy část chromozomu obsahuje úsek chromozomu 18q mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S979 nebo fragment tohoto úseku.
4. 4. Použití podle nároku 2 nebo 3, kdy YAC klon je

   961_h_9, 942_c_3, 766_f_12, 731_c_7, 907_e_l, 752_g_8 nebo ⁷¹⁷_d_3.
5. 5. Použití podle nároku 4, kdy YAC klon je 961_h_9, 766 f 12 nebo 907 e 1.
6. 6. Použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, kdy porucha nálady nebo příbuzná porucha je vybrána ze skupiny, která podle taxonomie „Diagnostického a statického manuálu mentálních poruch, verze 4 (DSM-IV) obsahuje poruchy (296.XX, 300.4, 311, 301, 13, 295.70), schizofrenii a příbuzné poruchy (295.XX, 297.1, 298.9, 297.3, 298.9), • ·4 44 44 ··

   44 4 4 · 4 9 9 9

   44·· 4 44·· 4 44 úzkostné poruchy (300.XX, 309.81, 308.3), poruchy přizpůsobování (309.XX) a poruchy osobností (kódy 301.XX).

   Ί. Způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je asociovaný s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, vyznačující se tím, že obsahuje detekci nukleotidových tripletových repetic v úseku lidského chromozomu 18q mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S979.

   8. Způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je asociovaný s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, vyznačující se tím, že obsahuje fragmentaci YAC klonu definovaného v kterémkoliv z nároku 2 až 4 a detekci nukleotidových tripletových repetic.

   9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se t i m, že opakovaný triplet je CAG nebo CTG.

   10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že opakovaný triplet se detekuje pomocí sondy obsahující alespoň 5 CTG a/nebo CAG repetic.

   11. Způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu, včetně jeho mutovaných a polymorfních variant, který je asociovaný s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, přičemž gen je přítomen v DNA obsažené v YAC klonech definovaných v kterémkoliv z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že tento způsob obsahuje kroky, kdy se detekuje exprimovaný produkt tohoto genu pomocí protilátky schopné

   9» 99 > 9 9 » 9 9 9 9 rozpoznat tento protein s aminokyselinovou sekvencí obsahující souvislou sekvenci alespoň 8 glutaminových zbytků.

   12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že DNA tvoří část lidské cDNA expresní knihovny.

   13. ZpUsob podle nároku 11 nebo 12 vyznačuj ící se tím, že protilátka je monoklonální protilátka (mAB) 1C2 .

   14. Způsob přípravy kontigové mapy YAC klonů úseku lidského chromozomu 18q mezi polymorfními markéry D18S60 a D18S61, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se

   a) YAC klony podle kteréhokoliv z nároku 2 až 5 subklcnují oo vektoru s „exonovou pastí,

   b) kterákoliv z nukleotidových sekvencí uvedených na obrázcích 1 až 11 nebo kterákoliv jiná známá sekvence se sekvenční značkou ze zde popsaného YAC kontigu, nebo jejich část obsahující souvislou sekvenci ne méně než 14 baží nebo sekvenci komplementární, se užije k detekci překryvů mezi kosmidovými vektory, a

   c) zkonstruuje se kosmidová kontigová mapa YAC klonu daného úseku.

   15. Způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu, nebo jakékoliv jeho mutované nebo polymorfní varianty, kterýžto gen je asociován s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, vyznačující se tím, že způsob obsahuje kroky, kdy se:

   a) savčí buňky transfekují kosmidovými vektory s exonovou pastí připraveným podle nároku 14, • 44 44 ·· 44 • 4 4 4 4 4 444 •444 4 4444 4 44 • 44 4444 444

   444 44 44 44 44

   b) savčí buňky kultivují ve vhodném médiu,

   c) RNA transkripty exprimované z promotoru SV40 se izoluj i,

   d) z RNA transkriptů se pnpravi cDNA,

   e) identifikují se sestřihové události zahrnující exony subklonované do kosmidových vektoru s exonovou pastí podle nároku 14, aby se určil v subklonované DNA,

   f) detekují rozdíly a ekvivalentními úseky v DNA nálady nebo příbuznou poruchou,

   g) identifikuje se gen polymorfní varianta, který je nebo příbuznou poruchou.

   poloha kódujících úseků mezi kódujícími úseky jedince postiženého poruchou a

   nebo jeho mutovaná nebo asociován s poruchou nálady

   16. Způsob identifikace alespoň jednoho lidského genu nebo jeho mutovaných r.ebo polymorfních variant, kterýžto gen je asociován s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, vyznačující se tím, že způsob obsahuje kroky, kdy se :

   a) subklonují YAC klony podle kteréhokoliv z nároků 2 až 5 do kosmidu, BAC, PAC nebo jiného vektoru,

   b) použije se kterákoliv nukleotidová sekvence uvedená na obr. 1 až 11 nebo jakékoliv jiné známé místo se sekvenční značkou z YAC kontigu popsaného zde, nebo její část obsahující souvislou sekvenci ne méně než 14 baží nebo k ní komplementární sekvenci, pro detekci překryvú mezi subklony a ke konstrukci jejich mapy,

   c) identifikuje se pozice genů v subklonované DNA prostřednictvím identifikace jednoho nebo několika CpG ostrůvků, zoo-přenosem, hybridizací subklonované DNA s cDNA

   9 tt *· 99 99 99

   4 9 4 4 9 9 4 9 9 9

   4 4 44 4 4 4 44 4 4 4 4

   4 4 4 9 4 9 9 4 4 9 4 4 4

   4 4 9 9 4 9 4 9 4 4 ·

   444 99 99 99 49 44 knihovnou nebo northernovým přenosem mRNA z panelu kultivovaných buněčných linií,

   d) detekují se rozdíly mezi geny a ekvivalentními úseky DNA jedinou postižených poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, a

   f) identifikuje se gen, který když je defektní, je asociován s poruchou nálady nebo příbuznými poruchami.

   17. Izolovaný lidský gen, včetně jeho mutovaných nebo polymorfních variant, kterýžto gen je asociován s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, a který lze získat způsobem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 13, 15 nebo 16.

   18. Lidský protein, který, když je defektní, je asociován s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, a který je produktem exprese genu podle nároku 17.

   19. cDNA kódující protein podle nároku 18, kterou lze získat způsobem podle kteréhokoliv z nároku 7 až 13, 15 nebo

   16.

   20. Použití sondy obsahující souvislou sekvenci alespoň 14 nukleotidů z cDNA podle nároku 19 nebo sekvenci k ní komplementární ve způsobu detekce u pacienta patologické mutace nebo genetické variace asociované s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou, přičemž způsob obsahuje hybridizaci sondy se vzorkem z pacienta a z kontrolního jedince.

   21. Molekula nukleové kyseliny, která obsahuje kteroukoliv nukleotidovou sekvenci ze sekvencí uvedených na obr. 15a, 16a, 17a nebo 18a.

   • ·· 99 99 89 99 89 9 9 9 9 9 9 9 9 8 989 9 · 99· 9 9 9 9 888 99 89 99 99 88

   ΊΟ

   22. Molekula nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která se liší kterékoliv ze sekvencí uvedených na obr. 15a, 16a, 17a nebo 18a pouze rozsahem trinukletidových repetic.

   23. Protein kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle nároku 21 .

   24. Protein kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle nároku 22.

   25. Způsob stanovení náchylnosti k poruše nálady nebo příbuzné poruše u jedince, vyznačující se tím, že obsahuje analýzu vzorku DNA z jedince na přítomnost DNA polymorfismu asociovaného s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou v úseku chromozomu 18q ležícím mezi polymorfními markéry D18S68 a D18S979.

   2 6 . Způsob podle nároku 25 v y z n a č u j ící s e tím, že DNA polymorfismus je rozsah trinukleotidových repetic. 27. Způsob podle nároku 26 v y z n a č u j ící s e

   tím, že rozsah trinukleotidových repetic je obsažen v nukleotidové sekvenci, která se liší od kterékoliv ze sekvenci uvedených na obr. 15a, 16a, 17a nebo 18a pouze rozsahem trinukletidových repetic.

   28. Způsob podle nároku 26 nebo 27 vyznačuj ící se t í m, že obsahuje kroky, kdy se:

   a) získá vzorek DNA od jedince • ·· ·· ·· ·* ·· 49 4 4 4 9 4 4 9 9

   9 9 4 4 9 4 9 49 9 9 9 4

   9 9 4 4 4 4 9 9 4 9 9 4 · • · · · · 9 4 9 9 9 9

   444 94 99 94 44 94

   b) poskytnou primery vhodné pro amplifikaci nukleotidové sekvence obsažené v sekvenci ukázané na kterémkoliv z obrázků 15a, 16a, 17a, nebo 18a, přičemž primery ohraničují trinukleotidové repetice obsažené v sekvenci,

   c) primery se použijí na uvedený vzorek DNA k provedení amplifikační reakce,

   d) stejná amplifikační reakce se provede na vzorku DNA kontrolního jedince, a

   e) srovnají se výsledky amplifikační reakce testovaného jedince a kontrolního jedince, přičemž výskyt amplifikovaného fragmentu u testovaného jedince, který je větší než fragment kontrolního jedince, indikuje přítomnost náchylnosti k poruše nálady nebo příbuzné poruše u testovaného jedince.

   29. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, která má být amplifikována, je obsažena v sekvenci uvedené na obr. 15a, přičemž primery mají sekvenci uvedenou na obr. 15b.

   30. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, která má být amplifikována, je obsažena v sekvenci uvedené na obr. 16a, přičemž primery mají sekvenci uvedenou na obr. 16b.

   31. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, která má být amplifikována, je obsažena v sekvenci uvedené na obr. 17a, přičemž primery mají sekvenci uvedenou na obr. 17b.

   32. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, která má být amplifikována, • 44 44 44 44 44

   44 4 444 4 4 4 4

   4 444 * · 444 4 44 4

   4 4 444 44 444 44 4

   444 444 4 4 44 4

   444 44 44 44 44 44 je obsažena v sekvenci uvedené na obr. 18a, přičemž primery mají sekvenci uvedenou na obr. 18b.

   33. Způsob detekce náchylnosti jedince k poruše nálady nebo příbuzné poruše, vyznačující setím, že zahrnuje kroky, kdy se:

   a) získá vzorek proteinů od jedince a

   b) detekuje se přítomnost proteinu podle nároku 24, přičemž výskyt tohoto proteinu u testovaného jedince indikuje přítomnost náchylnosti k poruše nálady nebo příbuzné poruše.

   34. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že protein se detekuje protilátkou, která je schopná rozpoznat souvislý řetězec alespoň 8 glutaminu.

   35. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka 1C2.

   36. Nukieová kyselina podle nároku 21 pro použití jako léčivo k léčení poruchy nálady nebo příbuzné poruchy.

   37. Protein podle nároku 23 pro použití jako léčivo k léčení poruchy nálady nebo příbuzné poruchy.

   38. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 21 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   39. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 23 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   • ·· ♦♦ ·· • · · · · · • ··· 4 * · ·· ··· ·· 99 44

   40. Expresní vektor, který obsahuje nukleotidovou sekvenci podle nároku 21 nebo 22.

   41. Reportérový plazmid, který obsahuje promotorový úsek molekuly nukleové kyseliny podle nároku 21 nebo 22 umístěný proti směru od reportérového genu, který kóduje reportérovou molekulu, takže exprese reportérového genu je řízena tímto promotorovým úsekem.

   42. Buněčná linie transfekovaná expresním vektorem podle nároku 40.

   43. Eukaryotická buňka nebo mnohabuněčná tkáň nebo organismus obsahující transgen kódující protein podle nároku 2 3 nebo 2 4 .

   44. Způsob určení, zda sloučenina je zesilovač nebo inhibitor exprese genu asociovaného s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   a) buňka podle nároku 42 přivede do kontaktu s testovanou sloučeninou,

   b) detekuje a/nebo kvantitativně vyhodnotí přítomnost jakéhokoliv transkriptu mRNA odpovídajícího nukleové kyselině podle nároku 21 nebo 22, a

   c) srovná hladina transkripce této nukleové kyseliny s hladinou transkripce téže nukleové kyseliny v buňce podle nároku 42, která nebyla vystavena testované sloučenině.

   45. Způsob určení, zda sloučenina je zesilovač nebo inhibitor exprese genu asociovaného s poruchou nálady nebo
7. 7 4

   « ·· 46 46 ·· ·· · 4 4 • • • 4 9 • · ·· • 4 ··· • • • • 6 · · » 4 • · • • • • ··· ·· 94 ♦ » ·· 94

   příbuznou poruchou vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   a) buňka podle nároku 42 přivede do kontaktu s testovanou sloučeninou,

   b) detekuje a/nebo kvantitativně vyhodnotí exprese proteinu podle nároku 23 nebo 24, a

   c) srovná se hladina exprese tohoto proteinu s expresí *

   téhož proteinu v buňce podle nároku 42, která nebyla • vystavena testované sloučenině.

   46. Způsob určení, zda sloučenina je zesilovač nebo inhibitor ex.prese genu asociovaného s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se:

   a) buňka transřekovaná reportérovým plazmidem podle nároku 41 se přivede do kontaktu s testovanou sloučeninou,

   b) detekuje nebo kvantitativně vyhodnotí množství exprimované reportérové molekuly, a

   c) srovná se toto množství s exprimovaným množstvím v buňce obsahující reportérový plazmid, která nebyla vystavena testované sloučenině.

   47. Sloučenina, která byla identifikována jako zesilovač « nebo inhibitor exprese genu asociovaného s poruchou nálady nebo příbuznou poruchou způsobem podle kteréhokoliv z nároků