JP2012100557A - 新規遺伝子およびｆｏｎｇ遺伝子座の一塩基多型に基づく骨粗鬆症の検査方法 - Google Patents

新規遺伝子およびｆｏｎｇ遺伝子座の一塩基多型に基づく骨粗鬆症の検査方法 Download PDF

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Abstract

【課題】骨粗鬆症を検査する方法を提供する。
【解決手段】ＦＯＮＧ遺伝子座に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨粗鬆症を検査する。
【選択図】 なし

Description

本発明は骨粗鬆症を予測または判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。本発明は、さらに、骨粗鬆症に関連する遺伝子、当該遺伝子より発現されるタンパク質、および当該タンパク質に対する抗体に関する。
骨や関節の病気は世界中で深刻な問題であり、その中でも骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は最も多い疾患の一つである。骨粗鬆症は、中年以降に発症し、患者の約８割は女性である。現在、全世界で２億人以上が骨粗鬆症に罹患しており、人口の高齢化に伴い患者は急激に増大するものと予想される。
骨粗鬆症は、臨床上は、骨量の低下、骨強度の減少、および骨折傾向の増大等を特徴とする。骨密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ； ＢＭＤ）は骨粗鬆症の検査に一般的に用いられる表現型であり、骨粗鬆症による骨折リスクを評価するのに有用なツールである。ＢＭＤが遺伝的要因により影響を受けることは広く知られており、遺伝率は５０〜９０％であると推定されている。
骨粗鬆症リスクに関与する遺伝子座を同定するためにはいくつかの実験的アプローチが考えられる。例えば、骨代謝に関連する遺伝子や、まれな単一遺伝子骨疾患の病原遺伝子を幅広くスクリーニングすることで候補となる遺伝子を同定する試みがなされている（非特許文献１−３）。しかしながら、再現性が得られているのは、ほんのわずかな遺伝子のみである。
また、ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）によって骨粗鬆症の感受性遺伝子を同定する試みがなされている。ＧＷＡＳによれば、表現型にほとんど影響しない遺伝子バリアントの検出も可能であり、未知の感受性遺伝子を見出すことができると期待される。最近、いくつかのグループがＧＷＡＳを行い、骨粗鬆症感受性に関連する複数の遺伝子座を同定している（非特許文献４−９、特許文献１、２）。例えば、アジア人種について骨粗鬆症のＧＷＡＳを行い、ＪＡＧ１やＡＬＤＨ７Ａ１等のいくつかの遺伝子が同定されている（非特許文献９，１０）。しかしながら、骨粗鬆症に対するこれら遺伝子の遺伝的な寄与は完全には明らかになっていない。
そして、ＦＯＮＧ遺伝子座の多型と骨粗鬆症との関係は報告されていない。
特開２０１０−００００６６号公報 特開２００５−００６５３８号公報
Ralston, S.H. et al. Genetic regulation of bone mass and susceptibility to osteoporosis. Genes Dev 20, 2492-506 (2006) Liu, Y.Z. et al. Molecular studies of identification of genes for osteoporosis: the 2002 update. J Endocrinol 177, 147-96 (2003). Liu, Y.J. et al. Molecular genetic studies of gene identification for osteoporosis: a 2004 update. J Bone Miner Res 21, 1511-35 (2006) Kiel, D.P. et al. Genome-wide association with bone mass and geometry in the Framingham Heart Study. BMC Med Genet 8 Suppl 1, S14 (2007) Liu, Y.Z. et al. Identification of PLCL1 gene for hip bone size variation in females in a genome-wide association study. PLoS One 3, e3160 (2008) Richards, J.B. et al. Bone mineral density, osteoporosis, and osteoporotic fractures: a genome-wide association study. Lancet 371, 1505-12 (2008) Styrkarsdottir, U. et al. Multiple genetic loci for bone mineral density and fractures. N Engl J Med 358, 2355-65 (2008) Xiong, D.H. et al. Genome-wide association and follow-up replication studies identified ADAMTS18 and TGFBR3 as bone mass candidate genes in different ethnic groups. Am J Hum Genet 84, 388-98 (2009) Kung, A.W. et al. Association of JAG1 with bone mineral density and osteoporotic fractures: a genome-wide association study and follow-up replication studies. Am J Hum Genet 86, 229-39 (2010) Guo, Y. et al. Genome-wide association study identifies ALDH7A1 as a novel susceptibility gene for osteoporosis. PLoS Genet 6, e1000806 (2010)
本発明は、骨粗鬆症の発症リスクや発症を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。また、本発明は、骨粗鬆症に関連する遺伝子、当該遺伝子より発現されるタンパク質、および当該タンパク質に対する抗体を提供する。
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、ＦＯＮＧ遺伝子座に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が骨粗鬆症と相関することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより骨粗鬆症の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＦＯＮＧ遺伝子座に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨粗鬆症を検査する方法。
（２）前記一塩基多型が、配列番号１の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、（１）に記載の方法。
（３）配列番号１の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨粗鬆症検査用プローブ。
（４）配列番号１の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨粗鬆症検査用プライマー。
（５）以下の（Ａ）〜（Ｄ）から選択されるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示す塩基配列における３８９〜８３２番目の塩基配列を含むＤＮＡ。（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列における３８９〜８３２番目の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
（７）前記タンパク質に対する抗体。
本発明によれば、これまで予測が困難であった骨粗鬆症の発症リスクを正確かつ簡便に予測することができる。また、骨粗鬆症の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は骨粗鬆症の予防や早期治療に貢献するものである。
１次スクリーニングにおけるＱ−Ｑプロットを示す図。斜め線からの偏差は、いずれのＳＮＰｓも骨粗鬆症と相関しないという帰無仮説からの偏差に相当する。 ２次スクリーニングにおけるＱ−Ｑプロットを示す図。斜め線からの偏差は、いずれのＳＮＰｓも骨粗鬆症と相関しないという帰無仮説からの偏差に相当する。 ヒト第２染色体ＦＯＮＧ遺伝子座領域の連鎖不平衡（ＬＤ）マップを示す図。 ＦＯＮＧ遺伝子からの転写産物に基づく遺伝子の塩基配列と推定アミノ酸配列。図中、ＦＴＣＤ−Ｎドメインと推定される部分を下線で示す。 予測されていたＬＯＣ３４８７５１の遺伝子構造と、ＦＯＮＧの遺伝子構造を示す図。図中、白抜き部分は非翻訳領域を、黒塗り部分はコード領域を示す。 （ａ）ノーザンブロッティングによるＦＯＮＧ遺伝子の発現解析の結果を示す写真。レーン１：腎臓、レーン２：骨格筋、レーン３：肝臓、レーン４：骨。（ｂ）各ヒト組織でのＦＯＮＧ遺伝子の発現レベルを示す図。縦軸は、βアクチン（ＡＣＴＢ）のｍＲＮＡ量に対するＦＯＮＧのｍＲＮＡ量の相対値（２回の独立した試験に基づく平均±標準誤差）を示す。
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、ヒトのＦＯＮＧ遺伝子座に含まれるＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて骨粗鬆症を検査する方法である。なお、本発明において、「検査」とは骨粗鬆症の発症リスクの検査及び骨粗鬆症の発症の有無の検査を含む。
ＦＯＮＧ遺伝子座は、ヒト第２染色体長腕３３．１領域に存在する、ＦＯＮＧ遺伝子産物をコードする遺伝子を包含する領域である。ＦＯＮＧ遺伝子座は、好ましくは、ヒト第２染色体上のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００００２．１１の２００６２５２５８〜２００７１６７３４の領域を意味する。
ＦＯＮＧ遺伝子座に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトｒｓ７６０５３７８を挙げることができる。ここで、ｒｓ番号はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのｄｂＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／）の登録番号を示す。ｒｓ７６０５３７８はＦＯＮＧ遺伝子座のイントロン３に存在する。ｒｓ７６０５３７８はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＴ＿００５４０３．１６の５０８８６３４３番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＡである場合は骨粗鬆症の可能性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、ｒｓ７６０５３７８がＡＡ＞ＡＣ＞ＣＣの順で骨粗鬆症の可能性が高い。
なお、ｒｓ７６０５３７８について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、配列番号１に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
上記塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトＦＯＮＧ遺伝子座の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。そのようなＳＮＰｓとしては、例えば、ｒｓ１０１９４０７６、ｒｓ５７６９６６１９、ｒｓ２３４６６６２、ｒｓ７５７７７６３、ｒｓ２６８９７６３、ｒｓ７６９９５４、ｒｓ７９６３６３、ｒｓ７６９９５７、ｒｓ７６９９５８、ｒｓ７９７１６３、ｒｓ２６８９７６６、ｒｓ５９０３６９８５、およびｒｓ５８３１９９０１が挙げられる。これらＳＮＰｓの詳細について表１に示す。表１中、ｒ2はｒｓ７６０５３７８に対する各ＳＮＰのｒ2を示す。また、表１中、各ＳＮＰについて、メジャーアレルがリスクアレルである。すなわち、例えば、ｒｓ１０１９４０７６は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＴ＿００５４０３．１６の５０８８７０８０番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合は骨粗鬆症の可能性が高い。なお、ｒｓ５７６９６６１９は、チミン（Ｔ）が欠失している場合に骨粗鬆症の可能性が高い。なお、ｒｓ５９０３６９８５は、４塩基（ＡＡＡＧ）が挿入されている場合に骨粗鬆症の可能性が高い。いずれもリスクアレルのホモ接合体が骨粗鬆症の可能性が高い。
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べることによって、骨粗鬆症を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。なお、ＦＯＮＧ遺伝子座の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
ＦＯＮＧ遺伝子座に含まれるＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
ＦＯＮＧ遺伝子座に含まれるＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
また、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、ＦＯＮＧ遺伝子座に含まれる目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、骨粗鬆症を検査するためのデータを得ることができる。
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、骨粗鬆症を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、ＦＯＮＧ遺伝子座における上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１において塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さはより好ましくは、１５〜３５塩基であり、さらに好ましくは２０〜３５塩基である。
また、プライマーとしては、ＦＯＮＧ遺伝子座における上記多型部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１の塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
＜３＞本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、ヒトのＦＯＮＧ遺伝子である。ヒトのＦＯＮＧ遺伝子としては、例えば、配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。配列番号２の塩基配列は、ＦＯＮＧ遺伝子座からの転写産物に基づくＦＯＮＧ遺伝子の塩基配列である。上記配列の遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしていると推定される。配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ホルムイミノトランスフェラーゼ活性を有すると推定される。また、本発明の遺伝子は、特に、配列番号２の塩基配列中、前記タンパク質をコードすると推定される領域である３８９〜８３２番目の塩基配列を含むＤＮＡを含む。
本発明の遺伝子は、人種の違いなどによって１又は複数の塩基に置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
すなわち、本発明の遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。前記「１若しくは数個」とは、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
本発明の遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
また、本発明の遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列の相補配列または配列番号２に示す塩基配列の３８９〜８３２番目の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
プローブは、上記ＤＮＡの相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。
＜４＞本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質である。
本発明のタンパク質としては、例えば配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質は、ホルムイミノトランスフェラーゼ活性を有すると推定される。
本発明のタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
本発明のタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。
＜５＞本発明の抗体
本発明の抗体は本発明のタンパク質に対する抗体である。本発明のタンパク質を特異的に認識するものである限り、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のタンパク質を含む免疫原でマウスやウサギなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、その抗血清から本発明のタンパク質を特異的に認識する抗体を回収することによって得ることができる。ＢＳＡやＫＬＨなどのキャリアタンパク質に結合させて免疫に使用してもよい。抗体はプロテインＡなどによって精製することができる。
モノクローナル抗体は、例えば、本発明のタンパク質を含む免疫原でマウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、該哺乳動物から単離したリンパ球をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマが産生する抗体の中から、本発明のタンパク質を特異的に認識する抗体を選択することによって得ることができる。モノクローナル抗体には、Ｆ（ａｂ’）２化抗体、Ｆ（ａｂ’）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）等のモノクローナル抗体のフラグメントも含まれる。
本発明の抗体は本発明のタンパク質を含む融合タンパク質の検出や免疫沈降やＥＬＩＳＡなどに使用できる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
（実施例１）骨粗鬆症と相関するＳＮＰｓの同定
まず、骨粗鬆症感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）を行った。解析に用いた被検者の特徴は表２に示すとおりである。
１次および２次スクリーニングに用いた骨粗鬆症の被検者（ケース； 患者）および非骨粗鬆症の被検者（コントロール； 対照）は、ＢｉｏＢａｎｋ Ｊａｐａｎ（ＢＢＪ）（Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007)）より得た。１次追試の患者群は、ＢＢＪより得た。２次追試の患者群、並びに、１次および２次追試の対照群には、互いに血縁関係を有さない外来の閉経後女性ボランティアのサンプルを用いた。対照群は、骨粗鬆症以外の種々の疾患を有する。
骨粗鬆症の判定は日本骨粗鬆症学会の基準に準じて行い、腰椎（ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ）および大腿骨頸部（ｆｅｍｏｒａｌ ｎｅｃｋ）の両方について若年成年男性のＢＭＤの７０％未満である場合に骨粗鬆症と判定した。当該基準は、世界保健期間（ＷＨＯ）の基準であるＴスコアで−２．５未満に相当する。ＢＭＤは、標準的なプロトコルに従って二重エネルギー放射線吸収測定法を行うことで測定した。
１次および２次スクリーニングにおいて、統計解析にはＦｉｓｈｅｒの正確確率検定（ａｌｌｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｍｏｄｅｌ， ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｅｆｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌ， およびｒｅｃｅｓｓｉｖｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌの３モデル）を用いた。追試において、統計解析にはχ2検定（ａｌｌｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｍｏｄｅｌ， ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｅｆｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌ， およびｒｅｃｅｓｓｉｖｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌの３モデル）を用いた。オッズ比（Ｏｄｄｓ Ｒａｔｉｏ； ＯＲ）および信頼区間（Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌ； ＣＩ）はメジャーアレルを参考に算出した。ハプロタイプの相関解析はＨａｐｌｏｖｉｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った（Barrett, J.C et al. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21, 263-5 (2005)）。メタ解析はＭａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ法により行った。
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所ゲノム医科学研究センターの倫理委員会によって承認された。
［１次スクリーニング］
１次スクリーニングでは、ＢＢＪに登録された骨粗鬆症の患者１９０人と対照１５５７人について、常染色体に存在する２６８，０６４個のＳＮＰｓの遺伝型を解析し、２２４，５０７個のＳＮＰｓについて遺伝型のデータを取得した。上記２６８，０６４個のＳＮＰｓは、日本人集団におけるタグＳＮＰｓとしてＪＳＮＰ（Haga, H. et al. Gene-based SNP discovery as part of the Japanese Millennium Genome Project: identification of 190,562 genetic variations in the human genome. Single-nucleotide polymorphism. J Hum Genet 47, 605-10 (2002)）またはＨａｐＭａｐデータベース（Frazer, K.A. et al. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature 449, 851-61 (2007)）から選択されたものであり、日本人集団の一般的なＳＮＰｓの約５６％をカバーする。試料としては末梢血白血球から常法により抽出したゲノムＤＮＡを用い、解析にはｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ（Ｐｅｒｌｅｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。Ｑｕａｎｔｉｌｅ−ｑｕａｎｔｉｌｅ（Ｑ−Ｑ）プロット（図１）により、骨粗鬆症に関連する可能性のある多くのＳＮＰｓが存在することが明らかとなった。
［２次スクリーニング］
１次スクリーニングにおいてデータの得られた２２４，５０７個のＳＮＰｓの内、Ｐ値の低い上位３０００個のＳＮＰｓを選択し、２次スクリーニングを行った。患者５２６人と対照１５３７人について、前記３０００個のＳＮＰｓの遺伝型を解析し、１６５４個のＳＮＰｓについて遺伝型のデータを取得した。患者群の解析はｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ（Ｐｅｒｌｅｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、対照群の解析はｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＰＣＲ ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ（Ohnishi, Y. et al. A high-throughput SNP typing system for genome-wide association studies. J Hum Genet 46, 471-7 (2001)）により行った。Ｑｕａｎｔｉｌｅ−ｑｕａｎｔｉｌｅ（Ｑ−Ｑ）プロットを図２に示す。
［１次追試］
２次スクリーニングにおいて結果の得られた１６５４個のＳＮＰｓ（図２）の内、Ｐ値の低い上位３個のＳＮＰｓを選択し、追試を行った。患者１３２６人と対照１２９２人について、前記３個のＳＮＰｓの遺伝型を解析した。相関解析における有意性の閾値をＰ＜１．６７×１０-2（＝０．０５／３）と設定した。当該閾値は、３回のテストに基づくボンフェローニ補正後のＰ＜０．０５に相当する。前記３個のＳＮＰｓの内、最小のＰ値を示すｒｓ７６０５３７８のみが骨粗鬆症と有意に相関を示した（Ｐ＝２．９９×１０-3）。ｒｓ７６０５３７８について表３に示す。なお、ｒｓ７６０５３７８について、Ａが骨粗鬆症のリスクアレルである。
ＲＡＦ：リスクアレル頻度（ｒｉｓｋ ａｌｌｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）
ａ：Ｐｅａｒｓｏｎのχ2検定（ａｌｌｅｌｅ ｍｏｄｅｌ）のＰ値
ｂ：２×２頻度表からのリスクアレルのオッズ比（ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ； ＯＲ）
ｃ：Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定の結果
ｄ：日本人被検者を用いた全４試験（１次および２次スクリーニング並びに１次および２次追試）のメタ解析
ｅ：日本人被検者を用いた全４試験および漢民族集団を用いた試験のメタ解析
［２次追試］
検証のため、独立した人的集団を被検者として２次追試を行った。患者２４０人と対照２８５人について、ｒｓ７６０５３７８の遺伝型を解析したところ、ｒｓ７６０５３７８と骨粗鬆症との有意な相関が再現された（Ｐ＝３．９７×１０-2）。なお、相関解析における有意性の閾値はＰ＜０．０５と設定した。
また、１次および２次スクリーニング並びに１次および２次追試からなる全４試験のメタ解析を行ったところ、ｒｓ７６０５３７８のｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐ ｖａｌｕｅは１．５１×１０-8（ＯＲ＝１．２５； ９５％ ＣＩ：１．１６−１．３５）であり（表３）、ＧＷＡＳの有意性の閾値として設定したＰ＜２．２３×１０-7（＝０．０５／２２４，５０７）をパスした。当該閾値は、２２４，５０７回のテストに基づくボンフェローニ補正後のＰ＜０．０５に相当する。よって、ｒｓ７６０５３７８が骨粗鬆症と有意に相関することが確認された。
［漢民族集団を用いた追試］
さらに、漢民族集団において、ｒｓ７６０５３７８と骨粗鬆症との相関を解析した。患者３３８人と対照１２２人について、ｒｓ７６０５３７８の遺伝型を解析したところ、骨粗鬆症と相関する傾向が認められた。
さらに、日本人集団を用いた４試験とこの漢民族集団を用いた試験からなる全５試験のメタ解析を行ったところ、ｒｓ７６０５３７８のｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐ ｖａｌｕｅは１．３３×１０-8（ＯＲ＝１．２４； ９５％ ＣＩ：１．１５−１．３３）であり（表３）、日本人を用いた４試験のメタ解析の結果と比較して、さらに高い有意性を示した。よって、ｒｓ７６０５３７８が骨粗鬆症と有意に相関することが再度確認された。
［骨粗鬆症と最も強く相関するＳＮＰの同定］
ＨａｐＭａｐプロジェクトデータベース（リリース２３ａ）を参照し、ｒｓ７６０５３７８に対するＤ’＞０．８であり、かつ、マイナーアレル頻度＞０．１であるＳＮＰｓを選択し、ＦＯＮＧ領域の連鎖不平衡（ＬＤ）マップを作成した（図３）。ｒｓ７６０５３７８近傍の連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックには、ＨａｐＭａｐプロジェクトデータベースに登録された５１個のＳＮＰｓと１個の予測遺伝子が含まれていた。当該５１個のＳＮＰｓ全てをｒ2＞０．８でカバーする、ｒｓ７６０５３７８を含む１４個のタグＳＮＰｓを選択し、患者２０３９人と対照１２９２人について、遺伝型を解析したところ、ｒｓ７６０５３７８よりも有意に骨粗鬆症と相関するＳＮＰは見出せなかった。なお、Ｄ’およびｒ2はいずれも連鎖不平衡の程度を示す尺度である。
さらに、ｒｓ７６０５３７８に対してｒ2＞０．８を示す約２５ｋｂの領域を、患者２４人から取得したゲノムＤＮＡのダイレクトシーケンスにより検索したところ、ＨａｐＭａｐデータベースに登録された３９個の既知ＳＮＰｓに加え、２０個の新規ＳＮＰｓが見出された（表４）。当該５９個のＳＮＰｓ全てを用いてペアワイズｒ2値を算出し、ｒ2＞０．９５を示す２２個のタグＳＮＰｓを選択して遺伝型を解析したところ、ｒｓ７６０５３７８よりも有意に骨粗鬆症と相関するＳＮＰは見出されなかった。
さらに、ｓ７６０５３７８近傍の連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックから選択した前記１４個のタグＳＮＰｓについて、ハプロタイプ解析を行った。ｒｓ７６０５３７８を単独で解析するのに比較して、より有意に骨粗鬆症と相関したハプロタイプは見出されなかった（表５）。
ＯＲ：アレル２に対するアレル１のオッズ比
ＣＩ：信頼区間（Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌ）
前記２次追試で用いた骨粗鬆症患者群において１％以上の頻度で出現する全てのハプロタイプを示す。１および２は、それぞれ骨粗鬆症患者群におけるマイナーアレルおよびメジャーアレルを示す。
＊１４個のＳＮＰｓのアレル（左からｒｓ１２３７３７８８、ｒｓ７５７２４７３、ｒｓ１２６１５４３５、ｒｓ１０９３１８７５、ｒｓ１２４７３６７９、ｒｓ６７５９６４４、ｒｓ１７５２９４９７、ｒｓ６７４３２７１、ｒｓ４６７３４９１、ｒｓ７６０５３７８、ｒｓ２０３０６５３、ｒｓ２１６４８８９、ｒｓ１２４７０９８６、およびｒｓ１０２０３１２２）
以上より、ｒｓ７６０５３７８が骨粗鬆症と最も強く相関するＳＮＰであることが明らかとなった。また、ｒｓ７６０５３７８に対してｒ2＝１を示す、すなわちｒｓ７６０５３７８と完全連鎖する１２個のＳＮＰｓが検出された（表４）。よって、特にこれら１３個のＳＮＰは、骨粗鬆症の原因ＳＮＰｓであると推測され、いずれも骨粗鬆症の検査に用いることができる。
（実施例２）ＦＯＮＧの同定と発現
［ＦＯＮＧの同定］
ＮＣＢＩ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｂｕｉｌｄ ３６．３）において、ｒｓ７６０５３７８はＬＯＣ３４８７５１遺伝子内に存在する。前記データベースにおいて、ＬＯＣ３４８７５１にはＲｅｆｓｅｑ転写産物（９６６ｂｐ）が登録されているが、あくまでｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測に基づくものであった。そこで、骨を試料として、発現した転写産物の全長配列をＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。その結果、１４７アミノ酸残基のタンパク質の存在が予測される１９９７ｂｐの新規な転写産物が同定された（図４）。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に、当該転写産物に基づく遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。この新規に見出された遺伝子をＦＯＮＧと命名した。
なお、ＬＯＣ３４８７５１は５つのエクソンで構成されるが、本実験のＲＴ−ＰＣＲでは、予測されていたエクソン１は確認されず、エクソン２の一部およびエクソン３−５のみが確認された。上記１９９７ｂｐの転写産物を含む多数のスプライシングバリアントを同定したところ、主要なスプライシングバリアントは４つのエクソンで構成されており、ＬＯＣ３４８７５１のエクソン３および４を共通して含んでいた。一方、エクソン５についてはスプライシングバリアント間で多様性に富むことが明らかとなった。予測されていたＬＯＣ３４８７５１の遺伝子構造と、ＦＯＮＧの遺伝子構造を図５に示す。
［ＦＯＮＧの発現］
ＦＯＮＧの発現と転写産物のサイズを確認するため、以下の手順でノーザンブロッティングを行い、ＲＮＡの検出を行った。
ＦＯＮＧの４１３−７３１番目の塩基配列に相当するｃＤＮＡフラグメントをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＤＩＧラベルしたプローブを、クローニング後のベクターを基に、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて合成した。腎臓、肝臓、骨格筋、および骨からのｍＲＮＡの抽出はＦａｓｔＴｒａｃｋ ２．０ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により行った。各組織から抽出されたｍＲＮＡ２μｇを電気泳動に供し、ＤＩＧ Ｅａｓｙ ＨｙｂおよびＤＩＧ Ｗａｓｈ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ （Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示に従って使用しｍＲＮＡの検出を行った。予測された転写産物の長さに相当するバンドが、全ての組織に共通して検出された（図６（ａ））。
また、リアルタイムＰＣＲにより、種々のヒト組織におけるＦＯＮＧの発現を調べたところ、ＦＯＮＧは、肝臓および骨格筋において高度に発現しており、また骨においても中程度に発現していることが明らかとなった（図６（ｂ））。
［ＦＯＮＧの機能推定］
Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｔｉｆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）によると、前記１４７アミノ酸残基のタンパク質は、シグナルペプチド、およびホルムイミノトランスフェラーゼドメイン−Ｎ末サブドメイン（ＦＴＣＤ−Ｎドメイン）を有していると予測された。ＦＴＣＤ−Ｎドメインを図４に下線で示す。ＦＴＣＤは、ヒスチジンからグルタミン酸への変換に関与する哺乳類の代謝酵素であり、そのＮ末ドメインはＮ−ホルムイミノ−Ｌ−グルタミン酸からテトラヒドロ葉酸へホルムイミノ基を転移し、Ｌ−グルタミン酸と５−ホルムイミノテトラヒドロ葉酸を生成する活性を有する。グルタミン酸シグナル伝達は骨の恒常性に重要であり、例えば、グルタミン酸は破骨細胞により分泌され、また、グルタミン酸トランスポータ１のＫＯマウスは骨粗鬆症を発症することが知られている。すなわちＦＯＮＧは骨の代謝を制御している可能性がある。
また、ｒｓ７６０５３７８および当該ＳＮＰと完全連鎖する１２個のＳＮＰｓは、いずれもＦＯＮＧ遺伝子座のイントロン３に、または３’フランクキング領域に存在し、ＦＯＮＧより発現されるタンパク質のアミノ酸配列に影響しない。よって、これらＳＮＰｓはＦＯＮＧの発現に影響することで骨粗鬆症と関連している可能性がある。
以上の通り、骨粗鬆症感受性遺伝子の候補として新規にＦＯＮＧを同定した。

Claims (7)

  1. ＦＯＮＧ遺伝子座に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨粗鬆症を検査する方法。
  2. 前記一塩基多型が、配列番号１の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
  3. 配列番号１の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨粗鬆症検査用プローブ。
  4. 配列番号１の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨粗鬆症検査用プライマー。
  5. 以下の（Ａ）〜（Ｄ）から選択されるＤＮＡ。
    （Ａ）配列番号２に示す塩基配列における３８９〜８３２番目の塩基配列を含むＤＮＡ。（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列における３８９〜８３２番目の塩基配列と相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号３のアミノ酸配列をからなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （Ｄ）配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
    （ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
  7. 請求項６に記載のタンパク質に対する抗体。
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