PT760867E - Processo para a detecção de alterações no modo de reparação de erros no emparelhamento do adn - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A DETECÇÃO DE ALTERAÇÕES NO MODO DE REPARAÇÃO DE ERROS NO EMPARELHAMENTO DO ADN A presente invenção foi feita com apoio do governo, suportada pelo acordo n° GM 32741 e o acordo HG00395/GM50006 concedido pela General Sciences Divísion do National Institute of Health. 0 governo tem alguns direitos sobre a presente invenção. Âmbito da invenção A presente invenção envolve os genes para a reparação de erros de emparelhamento do ADN. Em particular, a presente invenção tem por objecto a identificação de mutações e polimorfismos em genes para a reparação de erros de emparelhamento do ADN, a identificação e caracterização de tumores com defeitos que envolvem a reparação de erros de emparelhamento do ADN e a detecção de susceptibilidade genética para o cancro.

Antecedentes

Nos últimos anos, com o desenvolvimento das poderosas técnicas de clonagem e amplificação, tal como a reacção em cadeia de polímerase (RCP), em combinação com um corpo de informação rapidamente acumulado respeitante à estrutura e localização de numerosos genes e marcadores humanos, tornou-se prático e aconselhável recolher e analisar amostras de ADN ou de ARN de indivíduos que são membros de famílias que estão identificadas como portadoras de uma alta frequência de certos distúrbios transmissíveis geneticamente. Por exemplo, os processos de rastreio são 1 utilizados por rotina para rastrear os genes envolvidos na anemia dos drepanócitos, fibrose quística, síndroma frágil do cromossoma X e esclerose múltipla. Para alguns tipos de distúrbios, o diagnóstico precoce pode melhorar muito o prognóstico de longo prazo da pessoa adoptando, por exemplo, uma rotina de diagnóstico agressiva e/ou fazendo alterações no estilo de vida se for apropriado quer para prevenir ou preparar para um problema antecipado.

Uma vez identificada uma mutação particular de um gene humano e ligada a uma doença, o desenvolvimento de processos de rastreio para identificar indivíduos de alto risco pode ser relativamente directo. Por exemplo, depois de se compreender a estrutura e o papel fenotipico anormal do gene mutante, é possível preparar iniciadores para serem utilizados na RCP para se obterem quantidades amplificadas de genes amplificados de indivíduos para serem analisados. Contudo, a descoberta inicial de um gene de mutante, isto é, a sua estrutura, a sua localização e a ligação com um problema de saúde hereditário, conhecido, requer um esforço experimental substancial e estratégias de investigação criativas.

Uma abordagem para descobrir o papel de um gene mutante que causa uma doença, começa com estudos clínicos nos indivíduos que pertencem a famílias que exibem uma elevada frequência da doença. Nestes estudos, a localização aproximada do locus que causa a doença é determinada indirectamente por meio da pesquisa de um marcador do cromossoma que tende a segregar com o locus. Uma limitação principal desta abordagem é que, embora a localização genómica aproximada do gene possa ser determinada, geralmente não permite o isolamento actual nem a sequenciaçâo do gene. Por exemplo, Lindblom et ai.3 relatou 2 resultados de estudos de análise de ligação realizados com marcadores de PCSS (polimorfismo do comprimento de sequências simples, SSLP na terminologia inglesa) em indivíduos de uma família conhecida por exibir uma elevada incidência de cancro do cólon não poliposo hereditário (CCNPH). Lindblcm et al. verificaram uma "ligação estreita" entre um marcador polimórfico no ramo curto do cromossoma 3 humano (3p21-23) e um locus de doença aparentemente responsável pelo aumento do risco de um indivíduo desenvolver cancro do cólon. Embora a 3p21-23 seja uma localização relativamente pouco específica em relação a todo o genoma, representa uma enorme região do ADN relativamente a pequena dimensão do gene mutante. 0 gene mutante podia ser separado dos marcadores identificando o locus de milhões de bases. No melhor, esses estudos de ligação têm apenas uma utilidade limitada para fins de rastreio porque, para prever o risco de uma pessoa, deve-se realizar a análise genética com marcadores genéticos fortemente ligados num certo número de indivíduos relacionados na família. É muita vez impossível obter essa informação, particularmente se os indivíduos da família afectada morreram. Também podem não existir marcadores informativos na família em análise. Sem conhecer a estrutura dos genes, não é possível fazer amostras, amplificá-las, sequenciá-las e determinar directamente se o indivíduo comporta o gene mutante.

Uma outra abordagem para descobrir o gene mutante que causa a doença, começa com a produção e a triagem dos iniciadores de RCP, com base na informação conhecida acerca da doença, por exemplo, teorias para estes mecanismos do estado da doença, estruturas e função das proteínas relacionadas, possíveis genes análogos em seres humanou ou noutras espécies, etc. 0 objectivo é isolar e sequenciar os 3 genes candidatos normais que se acredita que ocorrem algumas vezes nas formas mutantes tornando o indivíduo predisposto para a doença. Esta abordagem é altamente dependente do quanto se sabe acerca da doença ao nível molecular e da capacidade do investigador para construir estratégias e processos para encontrar genes candidatos. A associação de uma mutação num gene candidato com uma doença, deve ser demonstrada, em última análise, pela realização de ensaios nos membros de uma família que tem uma alta incidência da doença. A forma mais directa e definitiva para confirmar essa ligação em estudos de uma família é utilizar iniciadores de RCP que se destinam a amplificar porções de um gene candidato em amostras recolhidas dos membros dessa família. Os produtos dos genes amplificados são então sequenciados e comparados com a estrutura do gene normal com o fim de encontrar e caracterizar as mutações. Uma dada mutação está, em última análise, implicada quando mostra que os indivíduos afectados a têm, enquanto os indivíduos não afectados não a têm e que a mutação causa uma alteração na função da proteína que não é simplesmente um polimorfismo.

Outra maneira de mostrar uma elevada probabilidade de ligação entre uma mutação de um gene candidato e a doença é pela determinação da localização do cromossoma do gene, comparando assim a localização do mapa dos genes com regiões conhecidas de locus ligados à doença tal como o identificado por Lindblom et al. A localização coincidente no mapa de um gene candidato na região de um locus ligado à doença, identificado previamente, pode implicar fortemente uma associação entre uma mutação no gene candidato e a doença. 4 Há outras maneiras de mostrar que as mutações num gene candidato podem estar ligadas à doença. Por exemplo, podem introduzir-se formas mutantes, produzidas artificialmente, em animais. A incidência da doença em animais que comportam o gene mutante pode então ser comparada com animais com o genotípo normal. A incidência significativamente elevada da doença em animais com o genotipo mutante, relativamente a animais com o gene de tipo selvagem, podem suportar a teoria que as mutações no gene candidato são algumas vezes responsáveis pela ocorrência da doença.

Um tipo de doença que recebeu recentemente muita atenção por causa da descoberta de mutações de genes ligadas à doença é o Cancro do Cólon Não Polipóide Hereditário (CCNPH) Membros de famílias com CCNPH também exibem uma susceptibilidade acrescida para outros cancros incluindo os do endométrio, dos ovários, gástricos e da mama. Crê-se que aproximadamente 10 % dos cancros colorectais sejam CCNPH. Tumores de pacientes com CCNPH exibem um defeito genético raro em que sequências de ADN repetidas, curtas, tal como as sequências repetidas de dinucleótidos encontradas no ADN dos cromossomas humanos ("ADN de micro-satélite"), que parecem ser instáveis. Esta instabilidade genómica das sequências de ADN repetidas, curtas, algumas vezes designadas por fenotipo "RER+", é também observada, numa proporção significativa, numa grande variedade de tumores esporádicos, sugerindo que muitos tumores esporádicos podem ter adquirido mutações que são semelhantes (ou idênticas) às mutações que são herdadas nos CCNPH.

Os estudos da ligação genética identificaram locus de CCNPH que se pensa que sejam da ordem de 90 % dos CCNPH. Os locus constituem o mapa dos cromossomas 2pl5-16 (2p21) e 5 3p21-23. Estudos subsequentes identificaram o gene de reparação de erros de emparelhamento do ADN humano hMSH2 como sendo o gene no cromossoma 2p21 em que as mutações são responsáveis por uma fracção significativa dos cancros CCNPH1' 2 12. 0 hMSH2 é um dos vários genes cuja função normal é identificar e corrigir os erros de emparelhamento do ADN incluindo os que seguem cada ciclo de replicação do cromossoma. 0 processo de reparação dos erros de emparelhamento melhor definido é o processo de MutHLS de E.coli que promove uma reacção de reparação por excisão de um fragmento longo (aproximadamente 3 Kb) que depende dos produtos dos genes mutH, mutL, mutS e mutU (uvrD). 0 processo de MutHLS parece ser a via mais activa para a reparação dos erros de emparelhamento em E.coli e é conhecido tanto por aumentar a fidelidade da replicação do ADN como por actuar na recombinação de produtos intermédios contendo as bases desemparelhadas. 0 sistema tem sido reconstituído in vitro, e requer as proteínas de mutH, mutL, mutS e mutU (uvrD) (helicase II) em conjunto com a holoenzima polimerase III do ADN, a ligase de ADN, as proteínas de ligação do ADN de estrutura helicoidal simples (SSB) e uma das exonucleases de ADN de estrutura helicoidal simples, Exo I, Exo VII ou RecJ. hMSH2 é homóloga do gene bacteriano mutS. Uma via similar em fungos inclui o gene de levedura MSH2 e dois genes semelhantes a mutL, referidos como PMS1 e MLH1.

Cem o conhecimento de que as mutações num gene do tipo mutS humano (hMSH2) algumas vezes causa cancro e a descoberta de que os tumores CCNPH exibem instabilidade do ADN de micro-satélite, intensifiou-se o interesse em outros genes e produtos de genes de reparação dos erros de 6 emparelhamento do ADN e nos seus possíveis papéis no CCNPH e/ou noutros cancros. Estima-se que pelo menos 1 em cada 200 indivíduos comporta uma mutação que no gene hMSH2 ou noutros genes relacionados que codificam outras proteínas no mesmo processo de reparação dos erros de emparelhamento no ADN.

Um importante objectivo do trabalho dos requerentes tem sido identificar genes humanos que são úteis para a avaliação e identificação de indivíduos que estão em riso elevado de desenvolver cancro. Outros objectos são: determinar as sequências dos exões e as estruturas de intrões de flanqueio nesses genes; utilizar a informação estrutural para desenhar processos de ensaio com o fim de identificar e caracterizar mutações que resultam na ausência ou num defeito num produto de gene que confere susceptíbilidade ao cancro; e para distinguir essas mutações das variações polimórfícas "não perigosas". Um poutro objecto é utilizar a informação estrutural relacionada com os exões e as sequências de intrões de flanqueio de um gene ligado ao cancro, para diagnosticar tipos de tumores e prescrever a terapia apropriada. Um outro objecto é utilizar para o estudo a informação estrutural relacionada com um gene ligado ao cancro para identificar outros genes humanos candidatos relacionados.

Sumário da invenção

Com base no conhecimento dos requerentes sobre os mecanismos de reparação dos erros de emparelhamento do ADN em bactérias e fungos incluindo a conservação de genes de reparação de desemparelhamentos, os requerentes pensaram que homólogos de genes de reparação dos erros de emparelhamento de ADN devem existir e que essas mutações 7 nesses homólogos que afectam a função da proteína, causariam, provavelmente a instabilidade genética; levando possivelmente a um risco acrescido do desenvolvimento de certas formas de cancro humano.

Os requerentes isolaram e sequenciaram dois genes humanos, hPMSl e hMLHl, cada um dos quais codifica para uma proteína envolvida na reparação do desemparelhamento do ADN. hPMSl e hMLHl são homólogos do gene mutL encontrado na E.coli. Os estudos dos requerentes suportam-se fortemente numa associação entre as mutações nos genes de reparação dos erros de emparelhamento do ADN e a susceptibilidade a CCNPH. Assim, a informação sobre as sequências dos genes de reparação do desemparelhamento do ADN, nomeadamente as estruturas de ADNc e ADN genómico relacionadas com hPMSl e hMLHl, tornam possível um certo número de processos úteis que relacionam respeitantes à determinação do risco de cancro e no respectivo diagnóstico. Um grande número de estruturas de nculeótidos e de proteínas são úteis nesses processos.

Os requerentes mapearam a localização de hMLHl no cromossoma humano 3p21-23. Trata-se de uma região desse genoma humano, com base nos estudos sobre a família, que exibe um locus que predispõe os indivíduos para CCNPH. Adicionalmente, os requerentes verificaram uma mutação numa região conservada do ADNc de hMLHl em indivíduos afectados com CCNPH numa família sueca. Não se encontrou a mutação em indivíduos não afectados da mesma família, nem é um simples polimorfismo. Os requerentes também verificaram que uma mutação homóloga em fungos resulta numa proteína de reparação de erros de emparelhamento do ADN defeituosa. Os requerentes também encontraram uma mutação numa secção alterada em indivíduos afectados com hMLHl de uma família 8 inglesa. A descoberta dos requerentes de mutações ligadas ao cancro no hMLHl, combinada com a posição dos genes no mapa que é coincidente com um locus ligado ao CCNPH previamente identificado, ma is o provável papel do gene hMLHl na prevenção da mutação, faz do hMLHl um candidato de excelência subjacente a uma forma de cancro humano comum hereditário e um candidato primordial para avaliar e identificar indivíduos que tenham um elevado risco de desenvolvimento de cancro. 0 hMLHl tem 19 exões e 18 intrões. Os requerentes determinaram a localização de cada um dos 18 intrões relativamente ao ADN de hMLHl. Os requerentes também determinaram a estrutura de todas as regiões da fronteira intrão/exão de hMLHl. 0 conhecimento das estruturas de todas as regiões da fronteira intrão/exão de hMLHl torna possível estabelecer regimes de avaliação eficientes para localizar mutações que afectam negativamente a estrutura e a função dos produtos dos genes. Além disso, os requerentes desenharam conjuntos completos de pares de iniciadores de oligonucleótidos que podem ser utilizados na RCP para amplificar exões individuais completos em conjunto com estruturas de fronteira que rodeiam o intrão.

Os requerentes mapearam a localização do hPMSl no cromossoma humano 7. Os estudos subsequentes de outros39, confirmaram as previsões dos requerentes de que a mutação neste gene estava ligada ao CCNPH. A utilização mais imediata da presente invenção, será em testes de avaliação em seres humanos que são membros de famílias que exibem uma elevada frequência excepcional de cancro de início precoce, por exemplo, CCNPH. De acordo com isto, um dos aspectos da presente invenção compreende um 9 processo de diagnóstico de susceptibilidade para o cancro do cólon num indivíduo, por meio da detecção de uma mutação num ácido nucleico do hMLHl, tal como está estabelecido na reivindicação 1 ou um ácido nucleico em hPMSl, tal como está estabelecido na reivindicação 3, num tecido de um indivíduo, em que a mutação é indicativa de uma susceptibilidade do indivíduo para o cancro do cólon. 0 processo de diagnóstico compreende, preferencialmente, as etapas de: 1) amplificação de um ácido nucleico de um segmento do gene de reparação do erro de emparelhamento ou do produto do gene; 2) comparação do segmento amplificado com um segmento análogo de um alelo de tipo selvagem do gene de reparação do erro de emparelhamento ou do produto do gene; e 3) detecção da diferença entre o segmento amplificado e o segmento análogo, sendo a diferença indicativa de uma mutação no gene de reparação do erro de emparelhamento ou do produto do gene o que confere susceptibilidade do indivíduo para o cancro do cólon.

Um processo pode compreender a determinação se a diferença entre o segmento amplificado e o segmento análogo causa um fenotipo afectado, isto é, se a alteração da sequência afecta a capacidade do indivíduo para reparar os erros de emparelhamento do ADN. 0 processo de diagnóstico pode incluir as etapas de: 1) transcrição reversa de toda ou parte de uma cópia de ARN do gene de reparação do erro de emparelhamento do ADN; e 2) amplificação de um segmento do ADN produzido por transcrição reversa. Uma etapa de amplificação pode compreender: a selecção de um par de iniciadores de oligonucleótidos capaz de hibridar com as estruturas 10 helicoidais opostas do gene de reparação do erro de emparelhamento, numa orientação oposta; e realizar uma reacção em cadeia de polimerase utilizando iniciadores de oligonucleótidos tais que o ácido nucleico da cadeia de reparação do erro de emparelhamento que intervém entre os iniciadores seja amplificado para se tornar no segmento amplificado. 0 gene de reparação do erro de emparelhamento do ADN é o hMLHl ou o hPMSl. 0 segmento de ADN corresponde a uma única porção de uma sequência de nucleótido seleccionada no grupo que consiste nas SE Q. ID NOS: 6-24. Utilizam-se iniciadores de oligonucleótidos do "primeiro estádio" seleccionados no grupo que consiste nas SEQ. ID NOS: 44-82, na RCP para amplificar o segmento de AND are. Podem-se utilizar os iniciadores de oligonucleótidos incluídos no "segundo estádio" (SEQ. ID NOS: 83-122), com os iniciadores do primeiro estádio para permitir uma amplificação mais específica e a conservação do ADN de matriz.

Um processo de identificação e de classificação de um tumor que resulta de um defeito do gene reparador do erro de emparelhamento do ADN, pode compreender a detecção, no tumor, de uma mutação do gene de reparação do erro de emparelhamento ou do produto do gene, preferencialmente um homólogo de mutL {hMLHl ou hPMSl), sendo a mutação indicativa de um defeito no sistema de reparação do erro de emparelhamento do tumor.

Uma estrutura de nucleótido ou de proteína isolada pode incluir um segmento que corresponde, sob o ponto de vista da sequência, a uma única porção de um gene humano homólogo de mutL ou um produto do gene, preferencialmente derivado quer de hMLHl ou hPMSl. 11

Podem utilizar-se os iniciadores dos oligonucleótidos em conjunto numa reaeçâo em cadeia de polímerase para amplificar especificamente um único segmento de um gene humano homólogo de mutL, preferencialmente, hMLHl ou hPMSl.

Uma sonda pode incluir uma sequência de nucleótido capaz de se ligar especificamente por emparelhamento de Watson/Crick com as bases complementares numa porção do gene homólogo de mutL humano; e uma parte marcada ligada à sequência em que a parte marcada tem uma propriedade seleccionada no grupo que consiste em fluorescência, radioactividade e quimioluminescência.

Os requerentes também isolaram e sequenciaram genes MLH1 (mMLHl) e PM SI (rPMSl) de rato. Os requerentes utilizaram os seus conhecimentos dos genes de reparação de semparelhamentos em ratos para construir modelos de animais para o estudo do cancro. Os modelos serão úteis para identificar agentes oncogénicos adicionais e para estudar efeitos ambientais na mutagénese.

Os requerentes produziram anticorpos policlonais dirigidos à porção da proteína codificada pelo ADNc de rPMSl. Os anticorpos também reagem com a proteína de hPMSl e são úteis e são úteis para a detecção da presença da proteína codificada por um gene normal de hPMSl. Os requerentes também estão a produzir anticorpos monoclonais dirigidos a hMLHl ou hPMSl.

Para além das utilizações terapêuticas e de diagnóstico, o conhecimento dos requerentes sobre hMLHl ou hPMSl pode ser utilizado para investigar outros genes com funções relacionadas que são candidatos a desempenharem um papel em certas formas de cancro humano. 12

Descrição das figuras A figura 1 é um diagrama de fluxo que mostra uma visão global da sequência das etapas experimentais que os requerentes utilizaram para isolar, caracterizar e utilizar genes de PMS1 e MLH1 humanos e de rato. A figura 2 é um alinhamento de sequências de proteínas para os homólogos de mutL (SEQ. ID NOS: 1-3) mostrando duas regiões altamente conservadas (sublinhadas) que são utilizadas para criar oligonucleótidos de RCP degenerados para o isolamento adicional de homólogos de mutL. A figura 3 mostra toda a sequência de nucleótídos de ADNc (SEQ. ID NO: 4) para o gene humano MLH1 e a previsível sequência de aminoácidos correspondente (SEQ. ID NO: 5) para a proteína humana MLH1. As sequências de AND sublinhadas e as regiões de ADNc que correspondem aos iniciadores de RCP degenerados que foram origínalmente utilizados para amplificar uma porção do gene MLH1 (nucleótidos 118-135 e 343-359) . A figura 4A mostra as sequências de nucleótidos de 19 exões que correspondem colectivamente a toda a estrutura do ADNc de MLH1. Os exões são flanqueados pelas estruturas que rodeiam o intrão. Os sítios dos iniciadores estão sublinhados. Os exões com as suas estruturas de intrão de flanqueio correspondem às SEQ. ID NOS: 25-43. A figura 4B mostra toda sequências de nucleótidos de pares de iniciadores que foram utilizados na RCP para amplificar os exões individuais. Os iniciadores de 13 amplificação do "segundo estádio" (SEQ. ID NOS: 83-122} são iniciadores "aninhados" que são utilizados para amplificar os exões alvo do produto de amplificação obtido com iniciadores de amplificação do "primeiro estádio" correspondentes (SEQ. ID NOS: 44-82). As estruturas na figura 4B correspondem às estruturas nos quadros 2 e 3. A figura 5 é um alinhamento das sequências de aminoácidos previstas para as proteínas de MLH1 humanas e de fungos (SEQ. ID NOS: 5 e 123) . As identidades dos aminoácidos estão indicadas por caixas e os intervalos estão indicados por tracejado. A figura 6 é uma árvore filogenética das proteínas relacionadas com mutL.

A figura 7 é uma fotografia com duas colunas. A primeira coluna (A) é uma metáfase dispersa que mostra a hibridação do gene MLH1 humano do cromossoma 3. A segunda coluna (B) representa uma composição do cromossoma 3 de metáfases múltiplas dispersas alinhadas com um ideograma de um cromossoma 3 humano. A região de hibridação está indicada no ideograma por uma barra vertical. A figura 8 é uma comparação dos cromatogramas da sequência de indivíduos afectados e não afectados que mostra a identificação de uma mutação de transição de C a T que produz uma substituição de amoinoácido não conservadora na posição 44 da proteína de MLH1 humano. A figura 9 é um alinhamento da sequência de aminoácidos (SEQ. ID NOS: 124-131) de uma região 14 altamente conservada da família das proteínas MLH que rodeiam o sítio da previsível substituição de aminoácidos. Os caracteres a negrito indicam a posição previsível da serina com a substituição do aminoácido de fenilalanina nos indivíduos afectados. Também em evidência estão os resíduos de serina ou de alanina conservados nesta posição nas proteínas semelhantes a MutL. As bolas indicam as posições da mais alta conservação dos aminoácidos. Para a proteína MLH1, os pontos indicam que não se obteve a sequência. As sequências foram alinhadas tal como se descreve a seguir com referência à árvore filogenética da figura. A figura 10 mostra toda a sequência de nucleótidos para PMS1 humano (SEQ. ID NO: 132). A figura 11 é um alinhamento das sequências de aminoácidos previsíveis para as proteínas PMS1 humanas e de fungos (SEQ. ID NO: 133 e 134. respectivamente) . As identidades dos aminoácidos estão indicadas por caixas e os intervalos estão indicados por tracejados. A figura 12 é uma sequência parcial de nucleótido do ADNc de MLH1 de rato ou MLH1 de murino (SEQ. ID NO: 135) . A figura 13 é uma comparação da sequência de aminoácidos previsível para as proteínas MLH1 de murino e humanas, respectivamente). A figura 14 mostra a sequência de nucleótidos do ADN para PMS1 de rato (rPMSl) (SEQ. ID NO: 137). 15 A figura 15 é uma comparação das previsíveis sequências de aminoácídos para as proteínas de rPMSl e HPMS1 (SEQ. ID NOS: 138 e 133, respectivamente).

Definições

Gene - "Gene" significa uma sequência de nucleótidos que contém uma sequência de codificação completa. Geralmente, "genes" também inclui sequências de nucleótidos encontradas a montante (por exemplo, sequências de promotores, melhoradores, etc.) ou a jusante (por exemplo, os sinais de terminação da transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) da sequência de codificação que afectam a expressão do polipéptido codificado.

Produto do gene - Um "produto do gene" é uma cópia quer de ADN ou de ARN (ARNm) de uma porção de um gene ou uma sequência de aminoácido correspondente traduzidas no ARNm.

De tipo selvagem - A expressão "de tipo selvagem", quando aplicada a ácidos nucleicos e proteínas, significa uma versão de um ácido nucleico ou de uma proteína que funciona de uma forma indistinta de uma versão normal, de ocorrência natural desse ácido nucleico ou dessa proteína (isto é, um ácido nucleico ou uma proteína com actividade de tipo selvagem) . Por exemplo, um alelo de "tipo selvagem" de um gene de reparação de um erro de emparelhamento é capaz de substituir funcionalmente uma cópia endógena, normal do mesmo gene dentro de uma célula hospedeira sem alterar de forma detectável a reparação de um erro de emparelhamento nessa célula. Diferentes versões de tipo 16 selvagem do mesmo ácido nucleico ou proteína podem ou não diferir estruturalmente umas das outras.

De tipo não selvagem - A expressão "de tipo não selvagem", quando aplicada a ácidos nucleicos e proteínas, significa que funciona de uma maneira distinta de uma versão normal, de ocorrência natural desse ácido nucleico ou dessa proteína. Alelos de tipo não selvagem de um ácido nucleico podem diferir estruturalmente de alelos de tipo selvagem do mesmo ácido nucleico em qualquer uma das variedades de vias, incluindo, mas não se limitando a diferenças na sequência de aminoácidos de um polípéptido codificado e/ou diferenças nos níveis de expressão de um transcrito de nucleótido codificado do produto do polípéptido.

Por exemplo, a sequência de nucleótidos de um alelo de tipo não selvagem de um ácido nucleico podem diferir de um alelo de tipo selvagem, por exemplo, por adição, eliminação, substituição e/ou re-arranjo de nucleótidos. Do mesmo modo, a sequência de aminoácidos de uma proteína de reparação de um erro de emparelhamento, de tipo não selvagem, pode diferir da proteína de reparação de um erro de emparelhamento, de tipo selvagem por exemplo, por adição, eliminação, substituição e/ou re-arranjo dos aminoácidos.

Os ácidos nucleicos ou proteínas particulares de tipo não selvagem que, quando introduzidos numa célula hospedeira normal, interferem com o processo endógeno de reparação de um erro de emparelhamento, são designados por ácidos nucleicos ou proteínas "negativos dominantes". 17

Homólogo - 0 termo "homólogo" refere-se a ácidos nucleicos ou polipéptidos que estão altamente relacionados com o nível de sequências de nucleótidos ou de aminoácidos. Os ácidos nucleicos ou polipéptidos que são homólogos uns dos outros são designados por homólogos. 0 termo homólogo refere-se necessariamente a uma comparação entre duas sequências. Duas sequências de nucleótidos consideram-se como homólogas se os polipéptidos que elas codificam são pelo menos cerca de 50-60 % idênticos, preferencialmente cerca de 70 % idênticos, pelo menos numa extensão de pelo menos 20 aminoácidos. Preferencialmente, as sequências de nucleótidos homólogas são caracterizadas pela capacidade de codificar uma extensão de pelo menos 4-5 aminoácidos especificados de uma forma única. Tanto a identidade como o espaçamento aproximado destes aminoácidos relatívamente uns aos outros devem ser considerados para que as sequências de nculeótídos sejam consideradas homólogas. Para as sequências de nucleótidos com um comprimento inferior a 60 nucleótidos, a homologia é determinada pela capacidade de codificar uma extensão de pelo menos 4-5 aminoácidos especificados de uma forma única. A montante/a jusante - A expressão "a montante" e "a jusante" são termos compreendidos na técnica como referindo-se à posição de um elemento de uma sequência de nucleótidos. "A montante" significa um elemento que é mais 5' do que o elemento de referência. "A jusante" refere-se a um elemento que é mais 3' do que o elemento de referência. 18

Intrão/exão - Os termos "intrão" e "exão" são termos compreendidos na técnica como referindo-se a várias porções das sequências genómicas do gene. "Exões" são as porções de uma sequência de gene genómico que codifica a proteína. "Intrões" são sequências de nucleótidos encontradas entre os exões nas sequências genómicas do gene.

Afectado - 0 termo "afectado", tal como se utiliza aqui, refere-se aos membros de uma família que ou desenvolveu um cancro característico (por exemple, cancro do cólon numa linhagem de CCNPH) e/ou é previsível, com base, por exemple >, em estudos genéticos, que comporte uma mutação que confira susceptibilidade ao cancro. Único - Um segmento, fragmento ou porção de um gene ou de uma proteína "único/a" significa uma porção de um gene ou de uma proteína que é diferente, sob o ponto de vista da sequência, de qualquer outro segmento, fragmento ou porção de um gene ou de uma proteína no genorna de um indivíduo. Como matéria prática, um fragmento ou segmento único de um gene será normalmente um nucleótído de pelo menos cerca de 13 bases de comprimento e será suficientemente diferente de outros segmentos do gene de tal modo que os iniciadores de oligonucleótidos possam ser preparados e utilizados para amplificar selectivamente e específicamente o segmento. Um segmento único de uma proteína é normalmente uma sequência de aminoácido que pode ser traduzida de um segmento único de um gene. 19

Referências

As publicações que se seguem são referidas por um número no texto da descrição. Cada uma das publicações é incorporada aqui como referência. 1. Fishel, R., et al. Cell 75, 1027-1038 (1993) . 2. Leach, F., et al. Cell 75, 1215-1225 (1993) . 3. Lindblom, A., Tannergard, Pl, Werelius, B. & Nordenskjold, M. Nature Genetics 5 , 279-282 (1993). 4. Prolla, T. A., Christie, D. M. & Liskay, R. M.

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Descrição da invenção

Os requerentes encontraram genes de mamíferos que estão envolvidos na reparação de um erro de emparelhamento do ADN. Um dos genes, o hPMSl, codifica uma proteína que é homóloga de uma proteína de reparação de um erro de emparelhamento do ADN de uma levedura, PMS1. Os requerentes mapearam as localizações de hPMSl, no cromossoma 7 e humano e no gene PMS1 de rato no cromossoma 5 de rato, na banda G. Outro gene, o hMLHl (homólogo de MutL) codifica uma proteína que é homóloga da proteína de MLHl (MutLreparação de um erro de emparelhamento do ADN de um fungo. Os requerentes mapearam as localizações de hMLHl no cromossoma humano 3p21.3-23 e no cromossoma 9 de rato, na banda E.

Estudos1' 2 demonstraram o envolvimento de um homólogo de um gene de reparação de um erro de emparelhamento do ADN humano, hMSH2, no cromossoma 2p em CCNPH. Com base nos dados de ligação foi assinalado um segundo locus de CCNPH no cromossoma 3p21.3-233. O exame do ADN do tumor das famílias ligadas ao cromossoma 3 revelaram uma 23 instabilidade na repetição do nucleótido semelhante à observada noutras famílias6 com CCNPH e vários tipos de tumores esporádicos7-10. Como a instabilidade da repetição dos dinucleótídos é característica de um defeito na reparação5’ n' 12 de um erro de emparelhamento do ADN, os requerentes pensaram que CCNPH ligado ao cromossoma 3p21.3-23 podia resultar de uma mutação num segundo gene de reparação de um erro de emparelhamento do ADN. A reparação de um erro de emparelhamento do ADN na Escherichia coli requer um cero número de genes incluindo defeitos de mutS, mutL e mutH, em qualquer um deles, o que resulta em taxaslj elevadas de mutação espontânea. A análise genética no fungo Saccharomyces cerevisiae identificou três genes de reparação de um erro de emparelhamento do ADN: um homólogo de mutS, MSH214, e dois homólogos mutL, PMS116 e MLHl*. Cada um destes três genes desempemha um papel indispensável na fidelidade da replicação do ADN, incluindo a estabilização das repetições de dinucleótídos5.

Os requerentes acreditam que hMLHl é o gene do CCNPH previamente ligado ao cromossoma 3p, com base na semelhança do produto do gene hMLHl com a proteína de reparação de um erro de emparelhamento do ADN, MLH1 4, na localização coincidente do gene hMLHl e o locus de CCNPH no cromossoma 3 e as mutações de hMLHl sem sentido que os requerentes verificaram em indivíduos afectados de famílias de CCNPH ligadas ao cromossoma 3.

Os conhecimentos dos requerentes sobre a estrutura dos genes MLHl e PMS1 humanos e de rato tem muitas utilizações importantes. A informação sobre a sequência dos genes pode ser utilizada para avaliar indivíduos quanto ao risco de 24 cancro. 0 conhecimento sobre a estrutura dos genes torna possível preparar facilmente iniciadores de RCP que podem ser utilizados para amplificar selectivamente porções dos genes hMLHl e hPMSl para comparações subsequentes com a sequência normal e análise do risco de cancro. Este tipo de ensaio também torna possível pesquisar e caracterizar mutações de hMLHl e hPMSl ligadas ao cancro com o fim de eventualmente focar o esforço de avaliação em locus específicos dos genes. Ά caracterização específica das mutações ligadas ao cancro em hMLHl e hPMSl, torna possível a produção de outras ferramentas de diagnóstico valiosas tais como sondas específicas de alelos que podem ser utilizadas em testes de avaliação para determinar a presença ou a ausência de mutações específicas dos genes.

Adicionalmente, a informação sobre a sequência do gene para hMLHl e/ou hPMSl, pode ser utilizada, por exemplo, num sistema de dois híbridos, para pesquisar outros genes com funções relacionadas que são candidatos para o envolvimento no cancro.

As estruturas dos genes hMLHl e hPMSl são úteis para a produção de proteínas que são utilizadas para desenvolver anticorpos dirigidos a porções específicas ou a toda a proteína hMLHl e hPMSl. Esses anticorpos podem então ser utilizados para isolar as proteínas correspondentes e possivelmente as proteínas relacionadas para fins de investigação e de diagnóstico.

As sequências dos genes MLH1 e PMS1 de rato são úteis para a produção de ratos com mutações nos respectivos genes. Os ratos mutantes são úteis para o estudo da função dos genes, particularmente na sua relação com o cancro. 25

Processos para o isolamento e caracterização de genes de MLH1 e PMS1 de mamíferos

Os requerentes isolaram e caracterizaram quatro genes de mamíferos, isto é, MLH1 (hMLHl), PMS1 humano (hPMSl), MLH1 de rato {rPMSl) e PM SI de rato {rPMSl) . Devido à semelhança estrutural entre estes genes, os processos utilizados pelos requerentes para isolá-los e caracterizá-los são geralmente os mesmos. A figura 1 mostra, em termos amplos, a abordagem experimental que os requerentes utilizaram para isolar e caracterizar os quatro genes. A discussão que se segue refere-se aos processos, nas suas várias etapas, mostrados na figura 1.

Etapa 1 Preparação de conjuntos de oligonucleótidos degenerados para RCP

Relatórios anteriores indicaram que porções de três proteínas semelhantes a MutL, duas de bactérias, MutL e HexB, e uma de fungos, PMS1, estão altamente conservadas10' 18, 19. Depois da inspecção das sequências de aminoácidos das proteínas HexB, MutL e PMS1, como se mostra na figura 2, os requerentes prepararam conjuntos de pares de oligonucleótidos degenerados correspondendo a duas regiões altamente conservadas KELVEN e GFRGEA, das proteínas semelhantes a MutL. As sequências (SEQ. ID NOS: 135 e 136, respectivamente) dos oligonucleótidos degenerados que foram utilizados para isolar os quarto genes são: 5’-CTTGATTCTAGAGC(T/C)TCNCCNC(T/G)(A/G)AANCC-3’ e 51-AGGTCGGAGCTCAA(A/G)GA(A/G)(T/C)TNGTNGANAA-3'.

As sequências sublinhadas dentro dos iniciadores são os sítios de endonucleases de restrição Xbal e Saci, respectivamente. Foram introduzidos de modo a facilitar a 26 clonagem de fragmentos amplificados de RCP. Na preparação dos oligonucleótidos, os reguerentes tiveram em conta o facto de um dado aminoácido poder ser codificado por mais do que um triplete de ADN (codão). A degenerescência dentro destas sequências está indicada por múltiplos nucleótidos dentro dos parêntesis ou N, para a presença de qualquer base nessa posição.

Etapa 2 Transcrição reversa e RCP em ARNm seleccionado de poli A+ isolado de células humanas

Os requerentes isolaram ARN mensageiro (enriquecido com poli A+) a partir de células humanas de cultura, ADNc de estrutura helicoidal dupla sintetizado a partir de ARNm e realizaram a RCP com os oligonucleótidos degenerados 4. Depois de tentarem um certo número de condições diferentes de RCP, por exemplo, ajustando a temperatura de têmpera, os requerentes amplificaram com sucesso um ADN da dimensão prevista (-210 pb) para uma proteína semelhante a MutL.

Etapa 3 Clonagem e sequenciação de fragmentos gerados por RCP; identificação de dois fragmentos de genes representando MLH1 e PMSl humanos

Os requerentes isolaram material amplificado por RCP (-210 pb) de um gel de agarose e clonaram este material num plasmido (p(JC19) . Determinaram a sequência de ADN de vários clones diferentes. A sequência de aminoácidos inferida da sequência de ADN dos dois clones mostrou semelhanças com outras proteínas conhecidas semelhantes a MutL 4' l6, Wr 15. A sequência de aminoácidos prevista para um dos clones foi a mais parecida com a proteína de fundo PMSl. Por isso, os requerentes designaram-na por hPMSl, para a PMSl humana. Verificou-se que o segundo clone codificava um polipéptido 27 que se parecia de mais perto com a proteína de fungo MLH1 e foi designada por hMLHl, para MLHl humana.

Etapa 4 Isolamento dos clones de ADNc de PMS1 e MLHl humanos e de rato utilizando fragmentos da RCP como sondas

Os requerentes utilizaram fragmentos de 210 pb de RCP dos ADNc de hPMS1 e hMLHl, como sondas para avaliar ambas as bibliotecas de ADNc humano e de rato (da Stratagene, ou tal como descrito na referência 30) . Isolou-se um certo número de ADNcs que correspondiam a esses dois genes. Muitos dos ADNcs estavam truncados na extremidade 5'. Quando necessário, utilizaram-se técnicas de RCP31 para se obter a extremidade 5' do gene para além de outra avaliação das bibliotecas de ADNc. As sequências completas do ADNc composto foram utilizadas para prever as sequências de aminoácidos das proteínas PMS1 e MLHl humanas e de ratos.

Etapa 5 Isolamento dos clones genómicos de PMS1 e MLHl humanas e de ratos

As informações sobre a estrutura do ADN genómico e o ADNc dos genes de PMS1 e MLHl humanas são necessárias de modo a avaliar cuidadosamente quanto a mutações em famílias predispostas para o cancro. Os requerentes utilizaram sequências de ADNc como sondas para isolar as sequências genómícas de PMS1 e MLHl humanas. Isolaram quatro cosmidos e dois clones PI para hPMSl, que, em conjunto, é provável que contenham a maior parte, se não toda a sequência do ADNc (exão). Para o hMLHl os requerentes isolaram quatro clones de fagos λ sobrepostos contendo as sequências genómicas 51-MLHl e quatro clones Pl (dois clones de comprimento completo e dois que incluem a extremidade de codificação 5' mais porções da região do promotor). A 28 análise de Rcp utilizando pares de oligonucleótidos específicos para as extremidades 5' e 3f do ADNc de hMLHl, indica claramente que o clone Pl contém a informação completa do ADNc completo de hMLHl. Do mesmo modo, os clones genómicos para os genes de PMSl e MLHl de rato foram isolados e parcíalmente caracterizados (descritos na etapa 8) .

Etapa 6 Mapeamento posicionai dos cromossomas dos genes PMSl e MLHl humanos e de ratos por meio de hibridação in situ de fluorescência

Os requerentes isolaram clones genómicos isolados a partir de genes PMSl e MLHl humanos e de ratos para a localização cromossómica por hibridação in situ de fluorescência (FISH)20, 21. Os requerentes mapearam o gene MLHl humano com o cromossoma 3p21.3-23, mostrado na FIG. 7, tal como se discute com mais detalhe a seguir. Os requerentes mapearam o gene MLHl de rato para o cromossoma 9, banda E, uma região de sintonia entre o de rato e o humano 22. Para além das técnicas de FISH, os requerentes utilizaram RCP com um par de oligonucleótidos específicos de hMLHl para analisar o ADN a partir de um painel de mapeamento de híbridos de células somáticas de roedores/seres humanos (Coriell Institute for Medial Research, Camden, N.J.). Os resultados da RCP obtidos pelos requerentes indicam que o hMLHl mapeia para o cromossoma 3. A posição de 3p21.3-23 de hMLHl é coincidente com uma região conhecida por arvorar um segundo locus para CCNPH com base nos dados de ligação.

Os requerentes mapearam o gene hPMSl, tal como se mostra na figura 12, no braço longo (q) do cromossoma 7 (quer 7qll ou 7q22) e o PMSl de rato do cromossoma 5, banda 29 G, duas regiões de sintonia entre os de rato e os humanos 22. Os requerentes realizaram a RCP utilizando oligonucleótidos específicos para hPMSl no ADN de um painel de células de roedor/ser humano. Em acordo com os dados de FISH, a localização de hPMSl foi confirmada como sendo no cromossoma 7. Estas observações asseguram aos requerentes que a sua posição no mapa humano para hPMSl no cromossoma 7 está ccrrecta. A localização física de hPMSlê útil para o fim da identificação de famílias que podem ter potencialmente um cancro ligado a uma mutação em hPMSl.

Etapa 7 Utilização das sequências do ADN genómico e do ADNc para identificar mutações nos genes hPMSl e hMLHl para famílias com CCNPH.

Os requerentes analisaram amostras recolhidas de indivíduos em famílias CCNPH com o fim de para identificar mutações nos genes hPMSl e hMLHl. A abordagem dos requerentes consiste em preparar iniciadores de RCP com base no seu conhecimento das estruturas dos genes, para se obter segmentos de exão/intrão que os requerentes puderam comparar com as sequências normais conhecidas. Os requerentes referem esta abordagem como uma "avaliação do exão".

Utilizando a informação sobre as sequências de ADNc os requerentes prepararam e continuam a preparar oligonucleótidos específicos de hPMSl e hMLHl para delinear as fronteiras do exão/intrão dentro das sequências genómicas. Os oligonucleótidos específicos de hPMSl e hMLHl foram utilizados para sondar clones genómicos quanto à presença de exões contendo essas sequências. Os oligonucleótidos que hibridam foram utilizados como iniciadores para a sequenciação do ADN dos clones 30 genómicos. As junções exâo/intrão foram identificadas comparando as sequências do ADN genómico com as do ADNc. A amplificação de exões específicos do ADNc por meio de RCP e sequenciação dos produtos é um dos processos para avaliar as famílias CCNPH quanto às mutações L' 2. Os requerentes identificaram clones genómicos contendo informação sobre o ADNc de hMLHl e determinaram as estruturas de todas as regiões de fronteira do exão/intrâo que flanqueiam os 19 exões de hMCHl.

Os requerentes utilizaram a abordagem da avaliação do exão para examinar o gene de MLH1 de indivíduos de famílias com CCNPH mostrando uma ligação com o cromossoma 3 3. Como será discutido com mais detalhe a seguir, os requerentes identificaram uma mutação no gene MLHl dessa família, consistindo numa substituição de C a T. Os requerentes previram que a mutação de C a T causa uma substituição de serina por fenilalanina numa região altamente conservada da proteína. Os requerentes continuam a identificação de famílias com CCNPH a partir das quais podem obter amostras de modo a encontrar mutações adicionais nos genes hMLHl e hPMSl.

Os requerentes estão também a utilizar uma segunda abordagem para identificar mutações em hMLHl e hPMSl. Esta abordagem consiste em preparar iniciadores de oligonucleótidos específicos de hPMSl ou hMLHl para produzir um ADNc com uma primeira estrutura helicoidal por transcrição reversa de ARN. A RCP, utilizando iniciadores específicos dos genes permitirá aos requerentes amplificar regiões específicas destes genes. A sequenciação do ADN dos fragmentos amplificados permitirá aos requerentes detectar mutações. 31

Etapa 8 Preparação de vectores para atingirem alvos para quebrar os genes de PMSl ou MLH1 nas células ES; estudos em ratos deficientes na reparação de erros de emparelhamento.

Os requerentes construíram um vector para atingir um gene com base no seu conhecimento da estrutura do ASN genómico de PMS1. Os requerentes utilizaram o vector de PMS1 para romper o gene em células embrionárias do estema de ratos j6. As células foram injectadas em blastócitos de ratos que se desenvolveram em ratos que são quiméricos (misturas) para as células que comportam a mutação de PMSl. Os animais quiméricos serão utilizados para criar murganhos que são heterozigóticos e homozigóticos para a mutação de PMSl. Estes murganhos serão úteis para o estudo do papel do gene PMSl em todo o organismo. MLHl humano A discussão que se segue é uma explicação mais detalhada de trabalho experimental dos requerentes com MLHl. Tal como foi mencionado ante, para clonar genes MLH de mamíferos, os requerentes utilizaram técnicas de RCP tal como as utilizadas para identificar os genes MSH1, MSH2 e MLHl de fungos e o gene MSH2 humano lf 2r 4' 14. Como matriz na RCP, os requerentes utilizaram ADNc de estrutura helicoidal dupla sintetizada a partir de ARN enriquecido com poli (A+) preparado a partir de fibroblastos humanos primários de cultura. Os oligonucleótidos degenerados foram atingidos nas sequências de amínoácidos de terminação N KELVEN e GFRGEA (ver FIG. 3), duas das regiões mais conservadas da família de MutL de proteínas previamente descrita para as bactérias e para os fungos 16, 18'19. Identificaram-se dois produtos de RCP com a dimensão prevista, clonaram-se e eles mostraram codificar uma 32 sequência de aminoácidos prevista com homologia das proteínas semelhantes a MutL. Estes dois fragmentos gerados por RCP foram utilizados para isolar clones de ADNc humano e ADN genómico.

Os iniciadores de oligonucleótidos que os requerentes utilizaram para amplificar as sequências relacionadas com MutL humano foram 5'-CTTGATTCTAGAGC(T/C)TCNCCNC(T/G)(A/G)AANCC-3' (SEQ. ID NO: 135) e 5’-AGGTCGGAGCTCAA(A/G)GA(A/G)(T/C)TNGTNGANAA-3’ (SEQ. ID NO: 136). A RCP foi realizada em misturas reaccionais de 50 μΐ contendo uma matriz de ADNc, 1,0 μΜ de cada um dos iniciadores, 5 UI de Taq polimerase (C), KC1 50 mM, tampão Tris 10 mH a pH 7,5 e MgCl 1,5 rnM. Realizou-se a RCP por 35 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 43 °C e 1,5 minutos a 62 °C. Os fragmentos da dimensão desejada, aproximadamente 212 pb, foram clonados em pUC19 e sequenciaram-se. Os produtos de RCP de MLH1 clonados foram marcados com um kit de marcação aleatória de iniciadores (RadPrime, Gibco BRL) e utilizou-se para sondar o ADNc humano e bibliotecas de cosmido genómico por processos padrão. A sequenciação dos ADNs dos plasmidos de estrutura helicoidal dupla foi realizada como descrito previamente *. A sequência de nucleótidos de ADNc de hMLHl, tal como se mostra na figura 3, codifica uma secção de leitura aberta de 2268 pb. Também se mostra na figura 3 a sequência de proteína prevista codificada pelo ADNc de hMLHl. As sequências de ADN sublinhadas são as regiões de ADNc que correspondem a iniciadores de RCP degenerados que foram originalmente utilizados para amplificar uma porção do gene de MLHl (nucleótidos 118-135 e 343-359). 33 A figura 4A mostra 19 sequências de nucleótidos que correspondem a porções de hMLHl. Cada sequência inclui um dos 19 exões, na sua totalidade, rodeados por sequências de flanqueio do intrão. Os sítios dos iniciadores alvo de RC.P estão sublinhados. Mais detalhes relacionados com a derivação e utilizações das sequências mostradas na figura 4a, tal como se estabelece a seguir.

Tal como se mostra na figura 5, a proteína hMLHl é constituída por 765 aminoácidos e partilha 41 % de identidade com o produto de proteína do gene de reparação do erro de emparelhamento do ADN de fungos hMLHl 4. As regiões da proteína hMLHl mais semelhantes a MLHl de fungos correspondem aos aminoácidos 11 a 317, mostrando 55 % de identidade e os últimos 13 aminoácidos que são idênticos entre as duas proteínas. A figura 5 mostra um alinhamento das sequências da prevista hMLHl e da proteína MLHl de S. cerevisíae. As identidades dos aminoácidos estão indicadas pelas caixas e os intervalos estão indicados pelos tracejados. 0 alinhamento da sequência de proteínas do elemento do par foi realizado com o DNAStar MegAlign utilizando o processo clustal 27. Os parâmetros de alinhamento dos elementos do par foram um ktupre de 1, perda do intervalo de 3, janela de 5 e diagonais de 5. Além disso, tal como se mostra na figura 13, as sequências de aminoácidos previstas das proteínas MLHl humanas e de rato mostram pelo menos 74 % de identidade. A figura 6 mostra uma árvore filogenética de proteínas relacionadas com MutL. A árvore filogenética foi construída utilizando as sequências de aminoácidos previstas de 7 proteínas relacionadas com MutL: MLHl humana; MLHl de rato; MLHl de S. cerevisíae; PMS1 de S. cerevisíae; E. coli; MutL; MutL de S. typhimurium e HexB de S. pneumoniae. As 34 sequências necessárias foram obtidas do Genebamk da versão 7.3. A árvore fiiogenética foi gerada com o programa PILEUP do software da Genetics Computer Group utilizando uma perda de intervalo de 3 a uma perda de comprimento de 0,1. As sequências de ADN registadas de hMLHl e hPMSl tinham sido submetidas ao GenBank.

Localização do intrão de hMLhtl e estruturas das fronteiras do intrão/exão

No pedido de patente de invenção norte-americana anterior com o n° 08/209.521 dos requerentes, estes descreveram a sequência de nculeótidos de um clone de ADN complementar (ADNc) de um gene humano, hMLHl. A sequência de ADNc de hMLHl (SEQ. ID NO: 4) é apresentada no presente pedido de patente de invenção na figura 3. Os requerentes fazem notar que pode haver algumas variações entre as estruturas individuais do ADNc de hMLHl, resultantes dos polimorfismos dentro da população humana e a degenerescência do código genético.

No presente pedido de patente de invenção, os requerentes reportam os resultados dos seus estudos de sequenciação genómica. Especificamente, os requerentes clonaram a região genómica humana que inclui o gene hMLHl, com um foco específico nos exões individuais e nas estruturas das fronteiras do intrão/exão que os rodeiam. Tendo em vista este último objectivo de desenhar uma abordagem compreensiva e eficiente para identificar e caracterizar as mutações que conferem susceptibilidade ao cancro, os requerentes acreditam que é importante conhecer as sequências de tipo selvagem das estruturas do intrão que flanqueiam os exões no gene hMLHl. Uma vantagem em conhecer a sequência de intrões próxima das fronteiras dos exões, é 35 que isso torna possível preparar os pares de iniciadores para amplificar selectivamente os exões individuais de uma forma total. Mais importante ainda, é também possível que a mutação numa região do intrão, que, por exemplo, pode causar um erro no seccionamento do ARNm, podia resultar num produto de gene defeituoso, isto é, com susceptibilidade ao cancro, sem mostrar qualquer anomalia numa região do exão do gene. Os requerentes acreditam que uma abordagem de avaliação compreensiva requer a investigação de mutações, não apenas no exão ou no ADNc, mas também nas estruturas do intrão que flanqueiam as fronteiras dos exões.

Os requerentes clonaram a região genómica humana que inclui hMLHl utilizando abordagens que são conhecidas na técnica e outras abordagens conhecidas podiam ter sido utilizadas. Os requerentes utilizaram RCP para avaliar uma biblioteca genómica humana de PI para o gene hMLHl. Os requerentes obtiveram quatro clones, dois que continham o gene completo e dois a que faltavam as terminações C. Os requerentes caracterizaram um dos clones de comprimento completo pelo ciclo de sequenciação, o que resultou na sua definição de todas as sequências de junção de intrões/exões para ambos os lados dos 19 exões de hMLHl. Prepararam assim múltiplos conjuntos de iniciadores de RCP para amplificar cada exão individual (iniciadores do primeiro estádio) e verificaram a sequência de cada exão e a sequência de flanqueio do intrão por meio da amplificação de várias amostras de ADN genómico diferentes e a sequenciação dos fragmentos resultantes utilizando um sequenciador ABI 373. Além disso, os requerentes determinaram as dimensões de cada exão de hMLHl utilizando processos de RcP. Finalmente, os requerentes projectaram um conjunto de iniciadores de RCP "aninhados" (iniciadores do segundo estádio) para uma nova amplificação dos exões individuais. Os requerentes 36 utilizaram iniciadores do segundo estádio num processo multiplex para a análise de famílias com CCNPH e tumores para as mutações de hMLHl. Geralmente, na abordagem do iniciador de RCP "aninhado", os requerentes realizaram uma primeira amplificação em multiplex com quatro a oito conjuntos dos iniciadores "do primeiro estádio", cada um deles dirigido a um exão diferente. Depois os requerentes voltaram a amplificar os exões individuais do produto ou a primeira etapa de amplificação, utilizando um único conjunto de iniciadores do segundo estádio. Exemplos e outros detalhes relacionados com a utilização dos requerentes dos iniciadores do primeiro e do segundo estádios estão indicados a seguir.

Através de estudes de sequenciação genómica dos requerentes, eles identificaram todos os dezanove exões dentro do gene hMLHl e mapearam as fronteiras do íntrão/exão. 0 quadro 1 apresente as coordenadas do nucleótido (isto é, o ponto de inserção de cada intrão dentro da região de codificação do gene) dos exões de hMLHl (SEQ. ID NOS: 25-43). As coordenadas apresentadas baseiam-se na sequência do ADNc de hMLHl, a que se atribuí a posição "1" com o "A" do início de "ATG" (em que A é o nucleótido 1 na SEQ. ID NO: 4). 37

Quadro 1 Número do intrão Coordenadas da sequência de ADNc intrão 1 116&117 intrão 2 207 & 208 intrão 3 306 & 307 intrão 4 380 & 381 intrão 5 453 & 454 intrão 6 545 & 546 intrão 7 592 & 593 intrão 8 677 & 678 intrão 9 790 & 791 intrão 10 884 & 885 intrão 11 1038 & 1039 intrão 12 1409 & 1410 intrão 13 1558 & 1559 intrão 14 1667 & 1668 intrão 15 1731 & 1732 intrão 16 1896 & 1897 intrão 17 1989 & 1990 intrão 18 2103 & 2104

Os requerentes também determinaram a sequência de nucleótidos das regiões do intrão que flanqueiam, os exões do gene hMLHl. As SEQ. ID NOS: 6-24 são sequências individuais do intrão ligadas às suas respectivas sequências de exões a montante e a jusante. As mesmas estruturas de nucleótidos estão indicadas na fig. 4A, em que os exões estão numerados desde a terminação N até à terminação C no que respeita ao locus crcmossómíco. Os números de 5 dígitos indicam os iniciadores utilizados para amplificar o exão. Todas as sequências estão numeradas assumindo que o A do codão de ATG é o nucleótido 1. Os números entre ( ) são as coordenadas dos nucleótidos da 38 sequência correspondente encontrada no exão indicado. O expoente é o intrão. 0 índice é o exão ou as sequências não traduzidas encontradas no clone de ARNm/ADNc. Os índices e as sequências sublinhadas correspondem aos iniciadores. 0 codão de paragem em 2269-2271 está em itálico e sublinhado. 0 quadro 2 apresenta as sequências de pares de iniciadores (iniciadores do "primeiro estádio") que os requerentes utilizaram para amplificar exoes individuais em conjunto com as estruturas de flanqueio do intrão:

Quadro 2 EXÃO NO. LOCALIZAÇÃO 00 RO. 00 NO DA SEQ ID DO SEQUÊNCIA DO NUCLEÓTIDO DO INICIADOR INICIADOR INICIADOR INCIADOR 1 a montante 18442 44 5'aggcactgaggtgattggc 1 a jusante 19109 45 5' tcgtagcccttaagtgagc 2 a montante 19689 46 5'aatatgtacattagagtagttg 2 a jusante 19688 47 5'cagagaaaggtcctgactc 3 a montante 19687 48 5'agagatttggaaaatgagtaac 3 a jusante 19786 49 5'acaatgtcatcacaggagg 4 a montante 18492 50 5'aacctttccctttggtgagg 4 a jusante 18421 51 5'gattactctgagacctaggc 5 a montante 18313 52 5'gattttctcttttccccttggg 5 a jusante 18179 53 5'caaacaaagcttcaacaatttac 6 a montante 18318 54 5'gggttttatttteaagtacttctatg 6 a jusante 18317 55 5'gctcagcaactgttcaatgtatgagc 7 a montante 19009 56 5'ctagtgtgtgtttttggc 7 a jusante 1S135 57 5'cataaccttatctccacc 8 a montante 18197 58 5' ctcagccatgagacaataaatcc 8 a jusante 18924 59 5' ggttcccaaataatgtgatgg 9 a montante 18765 60 5'caaaagcttcagaatctc 9 a jusante 18198 61 5' ctgtgg gtgtttcctgtgagtçg 10 a montante 18305 62 5'catgactftgtgtgaatgtacacc 10 a jusante 18306 63 5’ gaggagagcctgatagaacatctg 11 a montante 18182 64 5' ggg ctttttctccccctccc 11 a jusante 19041 65 5'aaaatctgggctctcacg 12 a montante 1.8579 66 5'aattatacctcatactagc 12 a jusante 18178 67 5' gttttattacagaataaaggagg 12 a jusante 19070 68 5' aagccaaagttagaagqca 39 EXÃO NO. LOCALIZAÇÃO DO INICIADOR NO. DO INICIADOR NO DA 5EQ TD DO INICIADOR SEQUÊNCIA DO NUCLEÓTIDO DO inciador 13 a montante 18420 69 5'tgcaacccacaaaatttgge 13 a jusante 18443 70 5' etttctccatttccaaaace 14 a montante 19028 71 5'tggtgtctctagrtctgg 14 a jusante 18897 72 5' cattgttgtagtag ctctgc 15 a montante 19025 73 5' cecatttgtcccaactgg 15 a jusante J857S 74 51cggtcagttgaaatgtcag 16 a montante 18184 75 5' catttggatgctccgttaaagc 16 a jusante 18314 76 5' cacccggctggaaattttatttg 17 a montante 18429 77 5' ggaaaggcactggagaaatggg 17 a jusante 18315 78 5'ccctccagcacacatgcatgtaccg 18 a montante 18444 79. 5’taagtagtctgtgatctccg 18 a jusante 18581 80 51atgtatgaggtcctgtcc 19 a montante 18638 81 5'gacaccagtgtatgttgg 19 a jusante 18637 82 51 gagaaagaagaacacatccc

Adicionalmente, os requerentes prepararam um conjunto de iniciadores de amplificação do "segundo estádio", cujas estruturas se indicam a seguir no quadro 3. Os requerentes utilizam os iniciadores do segundo estádio em conjunto com os iniciadores do primeiro estádio num protocolo de amplificação, tal como se descreve a seguir.

Quadro 3 EXÃO NO. LOCALIZAÇÃO DO INICIADOR NO. DO INICIADOR NO DA SEQ ID DO INICIADOR SEQOÊNCIA DE NUCLEÓTIDOS DO INCIADOR 1 a montante 19295 83 51 tgt.aaaacgacggccagtcact gaqgtgattggctgaa 1 a jusante 19446 84 *5'tagcccttaagtgagcccg 2 a montante 18685 85 5'tgtaaaa cgacggccagttacat tagagtagttgcaga ·“> a jusante 1S067 86 * 5' aggtcctg actcttçca tg 3 a montante 18687 87 5'tgtaaaacgacggccagtttgga aaatgagtaacatgatt 3 a jusante 19068 88 *5'tgtcatcacaggaggatat 4 a montante 19294 89 5'tgtaaaacgacggccagtctttc cctttggtgaggtga 4 a jusante 19077 90 *5tac.tctgagacctaggccca 5 a montante 19301 91 5'tgtaaaacgacggccagttctct tttccccttgggattag 5 a jusante 19046 32 *5'acaaagcttcaacaatttactc t 40 6 a montante 19711 93 5 'tgtaaaa cgacggccagtgtttt attttcaagtacttctatgaatt β a jusante 19079 94 *5'cagcaactgttcaatgtatgag cact ‘ a montante 19293 95 5'tgtaaaacgacggccagtgtgtg tgtttttggcaac 7 a jusante 19435 96 * 5'aaccttatctccaccagc S a montante 19329 97 5'tgtaaaacgacggccagtagcc atgaqacaataaatccttg 8 a jusante 19450 98 *5'tcccaaataatgtgatggaatg 9 a montante 19608 99 5'tgtaaaacgacggccagtaagc ttcagaatctctttt 9 a jusante 19449 100 *5 'tgggtgtttcctgtgagtggatt 10 a montante 19297 101 5'tgtaaaacgacggccagtacttt gtgtgaatgtacacctgtg .10 a jusante 19081 102 *5’gagagcctgatagaacatctgt tg 11 a montante 19486 103 5'tgtaaaacgacggccagtcttttt ctcccectcccacta 11 a jusante 19455 104 * 5'tctgggctctcacgtct 12 a montante 20546 105 *5' cttattctgagcctctcc 12 a jusante 20002 106 5'tgtaaaacgacggccagtgtttg ctcagaggctgc 12 a montante 19829 107 *51gatggttcgtacagattcccg 12 a jusante 19385 108 51tgtaaaacgacggccag ittatt acagaataaaggaggtag 13 a montante 19300 109 5'tgtaaaacgacggccagtaacc cacaaaatttggctaag 13 a jusante 19078 110 * 5 'tctccatttccaaaaccttg 14 a montante 19456 111 *5'tgtctctagttctggtgc 14 a jusante 19472 112 5'tgtaaaacgacggccagttgttg tagtagctctgct tg 15 a montante 19697 113 *5' atttgtcccaactggttgta 15 a jusante 19466 114 51tgtaaaacgacggccagttcagt tgaaatgtcagaaagtg 16 a montante 19269 115 5'tgtaaaacgacggccagt 16 a jusante 19047 116 * 5'ccggctggaaattttatttggag 17 a montante 19298 117 5'tgtaaaacgacggccagtaggc actggagaaatgggatttg 17 a jusante 19080 118 *51tccagcacacatgcatgtaccg 3âci C 18 a montante 19436 119 * 5' gtagtctgtg atctccgttt; 18 a jusante 19471 120 5'tgtaaaacgacggccagttatga jgtcctgtcctag 19 a montante 19447 121 ‘5'accagtgtatgttgggatg 19 a jusante 19330 122 ( 1tgtaaaacgacggccagtgaaa jaagaacacatcccaca 41

No quadro 3 um asterisco (*) indica que o nucleótido 5' é biotinilado. Os exões 1-7, 10, 13 e 16-19 podem ser especificamente amplificadod nas reacções de RCP contendo quer MgCl2 1,5 mM ou 3 mM. Os exões 11 e 14 podem ser especificamente amplificados em reacções de RCP contendo MgCl2 3 mM. No que respeita ao exão 12, os iniciadores de amplificação do segundo estádio foram preparados de modo a que o exão 12 fosse novamente amplificado em duas metades. O conjunto de iniciadores 20546 e 20002 amplifica a metade do terminal N. 0 conjunto de iniciadores 19829 e 19835 amplifica a metade do terminal C. Um iniciador alternativo de 18178 é o 19070. A informação sobre a sequência de hMLHl fornecida pelos estudos dos requerentes e descrita neste pedido de patente de invenção e os pedidos de patentes de invenção relacionados que a precederam, pode ser utilizada para preparar um grande número de iniciadores diferentes de oligonucleótidos para serem utilizados na identificação das mutações de hMLHl que estão correlacionadas com a susceptibilidade para o cancro e/ou com o desenvolvimento de tumores em indivíduos, incluindo os iniciadores que irão amplificar mais do que um exão (e/ou flanquear as sequências de intrões) numa única banda de produto.

Um especialista na matéria será familiar com considerações importantes para preparar os iniciadores de RCP para serem utilizados para amplificar os fragmentos ou genes desejados 37. Estas considerações podem ser similares, embora não necessariamente idênticas às envolvidas na preparação de iniciadores de sequenciação, tal como se discutiu antes. Geralmente, é importante que os iniciadores hibridem de uma forma relativamente específica (isto é, com uma Tm superior a 55 graus C e 42 preferencialmente próxima dos 60 graus C) . Na maior parte dos casos, os iniciadores com um comprimento entre cerca de 17 e 25 funcionam bem. Iniciadores mais compridos podem ser úteis para a amplificação de fragmentos mais compridos. Em todos os casos é desejável evitar utilizar iniciadores que sejam complementares a mais do que uma sequência no genoma humano, de modo a que cada par dos iniciadores de RCP amplifique apenas um único fragmento correcto. Apesar disso, é apenas absolutamente necessário que a banda correcta se possa distinguir de outras bandas de produto na reacção de RCP.

As condições exactas da RCP (por exemplo, a concentração do sal, o número de ciclos, o tipo de polimerase de ADN, etc.) podem variar como é sabido na técnica para melhorar, por exemplo, o rendimento ou a especificidade da reacção. Em particular, os requerentes verificaram que era valioso utilizar iniciadores "aninhados" nas reacções de RCP de modo a reduzir a quantidade de substrato de ADN necessária e a melhorar a especificidade da amplificação.

Seguem-se dois exemplos. O primeiro exemplo ilustra a utilização de um par de iniciadores de um primeiro estádio (SEQ. ID NOS: 69 e 70) para amplificar o segmento de intrão/exão (SEQ. ID NO: 18) . 0 segundo exemplo ilustra a utilização de iniciadores do segundo estádio para amplificar um segmento alvo de intrão/exão a partir do produto de uma primeira etapa de amplificação de RCP utilizando iniciadores do primeiro estádio. EXEMPLO 1: Amplificação dos clones genómicos de hMLHl a

partir de uma biblioteca de fagos PI 43

Utílizou-se 25 ng de ADN genómico (ou pode-se utilizar 1 ng de fago Pl) nas reacções de RCP incluindo:

dNTPs 0,05mM KC1 50 itiM Mg 3 mM

Tris-HCl 10 mM a pH 8,5 gelatina a 0,01% iniciadores 5 μΜ

As reacções foram realizadas num equipamento de realização de ciclos térmicos Cetus do modelo 9600 da Perkin-Elmer. Incubaram-se as misturas reaccionais a 95 graus C. durante 5 minutes, seguido de 35 ciclos (30 ciclos de um fago Pl) de: 94 GRAUS C. durante 30 segundos 55 GRAUS C. durante 30 segundos 72 GRAUS C. durante 1 minuto.

Realizou-se então uma extensão final da reacção durante 7 minutos a 72 graus C. Os clones de Pl desejáveis foram os que produziram uma banda de produtos de aproximadamente um pb. EXEMPLO 2: Amplificação das sequências de hMLHl a partir de ADN genómico utilizando iniciadores de RCP encastrados

Os requerentes realizaram uma amplificação por RCP em duas etapas das sequências de hMLHl a partir de ADN genómico, como se segue. Normalmente, a primeira amplificação foi realizada numa reacção de 25 microlitros incluindo: 44 25 ng de AND cromossómico

Tampão II de RCP da Perkin-Elmer (pode-se utilizar qualquer tampão apropriado) MgCl2 3mM 50 μΜ de cada dNTP Taq ADN polimerase

Iniciadores de 5 μΜ (SEQ 10 NOS: 69, 70) e incubou-se a 95 graus C durante 5 minutos, seguido se 20 ciclos de 94 graus C durante 30 segundos 55 graus C durante 30 segundos. A banda do produto foi normalmente suficientemente pequena (inferior a aproximadamente 500 pb) de tal modo que não se realizaram etapas de extensão como parte de cada ciclo. Em vez disso, realizou-se apenas uma etapa de extensão, a 72 graus C, durante 7 minutos, depois de os 20 ciclos estarem completos. Armazenaram-se os produtos da reacção a 4 graus C. A segunda reacção de amplificação, normalmente 25 a 50 microlitros em volume, incluiu: 1 ou 2 microlitros (consoante o volume da reacção) do primeiro produto da reacção de amplificação Tampão II de RCP da Perkin-Elmer (pode-se utilizar qualquer tampão apropriado)

MgCI2 3mM 50 μΜ de cada dNTP Taq ADN polimerase

Iniciadores de 5 μΜ encastrados (SEQ 10 NOS: 109, 110), 45 e incubou-se a 95 graus C durante 5 minutos, seguido se 20-25 ciclos de 94 graus C durante 30 segundos 55 graus C durante 30 segundos. realizou-se uma única etapa de extensão, a 72 graus C, durante 7 minutos, depois de os ciclos estarem completos. Armazenaram-se os produtos da reacção a 4 graus C.

Pode-se utilizar qualquer conjunto de iniciadores capazes de amplificar uma sequência alvo de hMLHl na primeira reacção de amplificação. Os requerentes utilizaram cada um dos conjuntos de iniciadores apresentados no quadro 2 para amplificar um exão individual de hMLHl na primeira reacção de amplificação. Os requerentes utilizaram também combinações desses conjuntos de iniciadores, amplificando assim múltiplos exões individuais de hMLHl na primeira reacção de amplificação.

Os iniciadores encastrados utilizados na primeira etapa de amplificação foram produzidos relativamente aos iniciadores utilizados na reacção de amplificação. Isto é, quando se utilizou um único conjunto de iniciadores na primeira reacção de amplificação, os iniciadores utilizados na segunda reacção de amplificação deviam ser idênticos aos iniciadores utilizados na primeira reacção, excepto no facto de os iniciadores utilizados na segunda reacção não deverem incluir os principais nucleótidos de 5' dos iniciadores da primeira reacção de amplificação e deveriam amplificar-se suficientemente mais na extremidade 3' e pelo facto de a Tm dos iniciadores da segunda amplificação ser aproximadamente a mesma que a Tm dos iniciadores da primeira reacção de amplificação. Os iniciadores da segunda 46 reacção de amplificação perderam os 3 nucleótidos principais de 5' dos iniciadores da primeira reacção de amplificação e estenderam-se aproximadamente 3-6 nuceló-tidos mais na extremidade 3'. As SEQ ID NOS: 109, 110 são exemplos de pares de iniciadores aninhados que podem ser utilizados numa segunda reacção de amplificação quando se utilizaram as SEQ ID NOS: 69 e 70 na primeira reacção de amplificação.

Os requerentes também verificaram que pode ser valioso incluir uma sequência padrão na extremidade 5' de um dos iniciadores da segunda reacção de amplificação para iniciar as reacções de sequenciação. Adicionalmente, os requerentes verificaram que é útil biotinilar esse último nucleótido de um ou de ambos os iniciadores da segunda reacção de amplificação de modo a que a banda do produto possa ser facilmente purificada utilizando pérolas40 magnéticas as reacções de sequenciação podem ser realizadas directamente nos produtos associados às pérolas 41'45.

Para uma discussão adicional sobre a amplificação de multiplexes e os processos de sequenciação, ver referências de Zu et al. e Espelund et al. 46,47 . hMLHl liga-se ao cancro

Como uma primeira etapa para determinar se foi um candidato para o locus CCNPH hMLHl no cromossoma humano 3p21-23 3, os requerentes mapearam hMLHl por híbridação in situ por fluorescência (HISF, FISH na terminologia inglesa) 20'21. Os requerentes utilizaram dois fragmentos genómicos separados (dados não mostrados) do gene hMLHl em análise por HISF. O exame de várias metáfases de cromossomas dispersos localizou hMLHl com o cromossoma 3p21.3.23. 47 A coluna A da figura 7 mostra a hibridação das sondas de hMLHl numa metáfase dispersa. Hibridaram-se sondas genómicas de hMLHl biotiniladas com cromossomas humanos em bandas de metáfase, tal como foi previamente descrito 20,21. Realizou-se a detecção com avidina e conjugado de isotiocianato de fluoresceína (CITF, FITC na terminologia inglesa) (sinal verde); os cromossomas, que se mostramn a azul, foram contra-corados com 4'6-diamino-2-fenitindole (DAFI, DAPI na terminologia inglesa). Obtiveram-se imagens com uma câmara CCD arrefecida, melhorada, pseudocolorida e combinada com os seguintes programas: CCD Image Capture; NIH Image 1.4; Adobe Photoshop e Genejoin Maxpix respectivamonte. A coluna B da figura 7 mostra uma composição do cromossoma 3 de múoltiplasm roetafases dispersas alinhadas com o ideograma do cromossoma 3 humano. A região de hibridação (porção distai de 3p21.3-23) está indicada no ideograma por uma barra vertical.

Como confirmação independente da localização de hMLHl no cromossoma 3, os requerentes utilizaram tanto a RCP com um par de oligonucleótidos específicos de hMLHl, como a análise de mancha de Southern com uma sonda específica de hMLHl para analisar o ADN do painel de células de roedores/humanos NIGMS2 (Corielllnst. Para Med. Res., Camden, NJ, EUA). Os resultados de ambas as técnicas indicaram a ligação do cromossoma 3. Os requerentes também mapearam o gene hMLHl por HISF com a banda E do cromossoma 9. Esta é uma podição de sintenia com o cromossoma humano 3p 22. Por isso, o gene hMLHl localiza-se no 3p21.3-23, dentro da região genómica implicada nas famílias de CCNPH, ligado ao cromossoma 3

Em seguida, os requerentes analisaram amostras de sangue de indivíduos afectados e não afectados de duas 48 famílias 3 candidatas a mutações do cromossoma 3. Uma das famílias, a família 1, mostrou uma forte ligação (pontuação lod = 3,01 na fracção de recombinação 0) entre CCNPH e um marcador em 3p. Para a segunda família, a família 2, a pontuação lod referida (1,02) estava abaixo do nível de significância geralmente aceite e assim só sugeria ligação ao mesmo marcador em 3p. A análise subsequente de ligação da família 2 com o marcador de micro-satélite D351298 em 3p21.3 deu uma pontuação lod mais significativa de 1,88 numa fracção de recombinação de 0. Inicialmente, os requerentes pesquisaram mutações nos dois exões amplificados por RCP do gene hMLHl por sequenciação directa do ADN (figura 4) . Os requerentes examinaram estes dois exões de três indivíduos afectados da família 1 e não detectaram diferenças da sequência esperada. Na família 2, os requerentes observaram que quatro indivíduos afectados com cancro do cólon são heterozigóticos para uma substituição C para T num exão que codifica os aminoácidos 41-9, o que corresponde a uma região altamente conservada da proteína (figura 9) . Para um indivíduo afectado, os requerentes pesquisaram ADNc amplificado por RCP no que respeita a mais diferenças da sequência. A informação combinada das sequências obtida a partir dos exões e do ADNc deste indivíduo afectado representa 95 % (isto é, apenas os primeiros 116 pb) da secção de leitura aberta. Os requerentes não observaram alterações dos nucleótidos para além da substituição de C por T. Além disso, verificou-se que quatro indivíduos da família 2, que se previa que fossem portadores com base nos dados da ligação e ainda não afectados com cancro do cólon, eram heterozigóticos para a mesma substituição de C por T. Dois dos previstos portadores estavam abaixo e dois estavam acima da idade média de aparecimento (50 anos) nesta família em particular. Dois indivíduos examinados, nâo afectados, da 49 mesma família, ambos previsivelmente não portadores, pelos dados da ligação, exibiram a sequência normal expectável nesta posição. As análises da ligação que incluem a substituição de C por T na família 2, dão uma pontuação lod de 2,23 numa fracção de recombinação 0. Utilizando critérios de diagnóstico de cancro pouco severos, os requerentes calcularam uma pontuação lod de 2.53. Estes dados indicam que a substituição de C por T mostra uma ligação significativa ao CCNPH na família 2. A figura 8 mostra os cromatogramas da sequência indicando uma mutação da transição de C para T que produz uma substituição de aminoácidos não conservadora na posição 44 da proteína hMLHl. Apresenta-se a análise da sequência de um indivíduos não afectado (painéis do topo, estruturas helicoidais mais e menos) e um indivíduo afectado (painéis inferiores, estruturas helicoidais mais e menos). A posição do nucleótido heterozigótico está indicada por uma seta. A análise dos cromatógrafos da sequência indica que há suficiente sinal de T no pico C e suficiente sinal de A no pico G para que os indivíduos afectados sejam heterozigóticos neste sítio.

Para determinar se esta substituição de C por T foi um polimorfismo, os requerentes sequenciaram este mesmo exão amplificado a partir do ADN genómíco de 48 indivíduos não aparentados e observou-se apenas a sequência normal. Os requerentes examinaram mais 26 indivíduos não aparentados utilizando a análise de hibridação dos oligonucleótidos específicos dos alelos (OEA) j3. As sequências de OEA (SEQ ID NOS: 141 e 142, respectivamente) utilizadas pelos requerentes foram: 5' -ACTTGTGGA TTTTGC-3' e 5' -ACTTGTGAA TTITGC-3'. 50

Com base na sequenciação directa do ADN e na análise dos OEA, nenhum destes 74 indivíduos não aparentados comportava a substituição de C por T. Por isso, não é provável que a substituição de C por T observada nos indivíduos da família 2 seja um polimorfismo. Tal como se mencionou antes, os requerentes não detectaram esta mesma substituição de C por T em indivíduos afectados de uma segunda família ligada ao cromossoma 3, a família 1 J. Os requerentes continuam a estudar indivíduos da família 1 para pesquisar mutações na hMLHl. 0 quadro 4 a seguir resume as análises experimentais dos requerentes de amostras de sangue de indivíduos afectados e não afectados da família 2 e indivíduos não afectados.

Quadro 4

Humero de indivíduos com a mutação de C para T / Número de indivíduos analisados F Status H Afectados 4/4 í Portadores previ.stos 4/4 L I A NSo portadores previstos 0/2 2 indivíduos não aparentados 0/14

Com base em vários critérios, os requerentes sugerem que a substituição de C por T na região de codificação de hMLHl representa a mutação que está na base de CCNPH na família 2 3. Em primeiro lugar, a sequência de ADN e a análise por OEA não detectaram a substituição de C por T em 74 indivíduos não aparentados. Assim, a substituição de C 51 por T não é simplesmente um polmorfismo. Em segundo lugar, é expectável que a substituição de C por T produza uma alteração de serina para fenilalanina na posição 44 (ver figura 9' . Esta substituição do aminoácído é uma alteração não conservadora numa região conservada da proteína (figuras 3 e 9}. As previsões da estrutura secundária, utilizando os parâmetros de Chou-Fasman sugerem uma estrutura em folha de hélice enrolada em beta com a posição 44 localizada na volta. A substituição observada de Ser por Fen, na posição 44, diminui consideravelmente esta previsão para este anel, sugerindo que a substituição prevista dos aminoácidos altera a conformação da proteína hMLHl. Ά sugestão de que a substituição de Ser por Fen é uma mutação que confere susceptibilidade ao cancro é ainda suportada pelas experiências dos requerentes que mostram uma substituição análoga (alanina por fenilalanina) num gene de hMLHl de fungos resulta numa proteína de reparação do desemparelhâinento, não funcional. Nas bactérias e nos fungos, uma mutação que afecte a reparação do desemparelhamento do ADN causa aumentos comparáveis na taxa de mutação espontânea incluindo as adições e eliminações dentro das repetições dos dinucleótidos 4' 3'li,13,14'15'ib. Nos seres humanos, a mutação de hMSH2 é a base de CCNPH do cromossoma 2 lf 1, tumores que mostram uma instabilidade do micro-satélite e um defeito aparente na reparação do desemparelhamento i2. 0 CCNPH associado ao cromossoma 3 está também associado com a instabilidade das repetições dos dinucleótidos Combinado com estas observações, c elevado grau de conservação entre a proteína humana MLH1 e a proteína de reparação do desemparelhamento do ΑΡΝ de fungos sugere a probabilidade da hMLHl funcionar na reparação do desemparelhamento do ADN. Durante o isolamento do gene de hMLHl, os requerentes identificaram o gene de hPMSl. Esta observação sugere que a reparação do 52 desemparelhamento do ADN em mamíferos, assim como em fungos 4, pode requerer pelom menos duas proteínas semelhantes a MutL.

Deve notar-se que parece que famílias de CCNPH diferentes mostram diferentes mutações no gene de MLH1. Tal como se explicou antes, os indivíduos da família 1 mostraram uma "ligação estreita" entre CCNPH e um locus na região de 3p21-23. Contudo, os indivíduos afectados na família 1 não têm a mutação de C por T encontrada na família 2. Parece que os indivíduos afectados na família 1 têm uma mutação diferente no seu gene de MLH1. Além disso, os requerentes utilizaram a informação sobre a estrutura e os processos descritos neste pedido de patente de invenção para encontrar e caracterizar a mutação de hMLHl que, aparentemente, confere susceptibilidade ao cancro em portadores heterozigóticos do gene mutante numa grande família inglesa com CCNPH. A mutação de hMLHl na família inglesa é uma deslocação seccional de + 1 T que é previsível que leve à síntese de uma proteína hMLHl truncada. Ao contrário, por exemplo, a anemia drepanocitária, em que praticamente todos os indivíduos afectados conhecidos têm a mesma mutação, descobriram-se mutações múltiplas de hMLHl e ligadas ao cancro. Por isso, o conhecimento de toda a sequência de ADNc para hMLHl (e provavelmente para hPMSl), assim como as sequências genómicas particularmente as que rodeiam os exões, serão úteis e importantes para a caracterização das mutações em famílias identificadas como exibindo uma elevada frequência de cancro.

Na sequência da verificação dos requerentes de que um cancro confere mutação na hMLHl, estudos de outros resultaram na caracterização de pelo menos mais 5 mutações 53 em hMLHl, cada uma das quais parecendo ter conferido susceptibilidade ac cancro em indivíduos de pelo menos uma família CCNPH. Por exemplo, Papadopouios et al. identificaram essa mutação, caracterizada pela eliminação de uma secção de 165 pares de bases entre os eodões 578 a 632. Numa outra família, Papadopouios et al. Observaram uma mutação de hMLHl caracterizada por uma deslocação de uma secção e a substituição de novos aminoácidos, nomeadamente uma eliminação de 4 pares de bases entre os eodões 727 e 728. Papadopouios et al. também reportaram uma mutação de ligada a cancro, caracterizada por uma extensão das terminações de COOH, nomeadamente uma inserção de 4 pares de bases entre os eodões 755 e 756 38.

Em resumo, os requerentes mostraram que hMLHl do gene de reparação do desemparelhamento do ADN que é provavelmente o gene hereditário do cancro do cólon não poliposo previamente localizado por análise de ligação ao cromossoma 3p21-23 3. A disponibilidade da sequência do gene de hMLHl facilitará a avaliação das famílias com CCNPH no que respeita às mutações ligadas ao cancro. Além disso, embora a perda da heterozigosidade (PEH) dos marcadores ligados não seja uma característica quer das formas de 2p ou de 3p de CCNPH 3'6. A PEH que envolve a região de 3p21.3-23 tem sido observada em vários cancros humanos z4~2b. isto sugere a possibilidade de que a mutação de hMLHl pode desempenhar algum papel nestes tumores. PMSl humana

Isolou-se PMSl humana utilizando os processos discutidos com referência à figura 1. A figura 10 mostra toda a sequência de nucleótidos do ADNc de hPMSl. A figura 11 mostra um alinhamento das previsíveis sequências de 54 proteínas PMS1 humanas e de fungos. Os requerentes determinaram por análise por HISF que a PM SI humana está localizada no cromossoma 7. Na sequência da descoberta de hPMSl pelos requerentes, outros identificaram mutações no gene que parece conferir susceptibilidade ao CCMPH '. MLH1 de rato

Utilizando o processo sublinhado antes no que se refere à figura 1, os requerentes determinaram uma sequência parcial de nucleótidos do ADNc de MLH1 de rato; como se mostra na figura 12 (SEQ 10 NO: 135}. A figura 13 mostra a correspondente sequência de aminoácidos previsível para a proteína MLH1 (SEQ 10 NO: 136) em comparação com a sequência previsível de hMLHl (SEQ 10 NO: 5). A comparação das proteínas MLH1 humanas e de rato assim como a comparação de hMLHl com as proteínas MLHl de fungos, tal como se mostra na figura 9, indicam um elevado grau de conservação. PMS1 de rato

Utilizando os processos discutidos antes no que se refere à figura 1, os requerentes isolaram e sequencíaram o gene de PMS1 de rato, como se mostra na figura 14 (SEQ 10 NO: 137}. Esta sequência de ADNc codifica uma proteína previsível de 864 aminoácidos (SEQ 10 NO: 138), tal como se mostra na figura 15, onde se compara a sequência de aminoácidos para hPMSl (SEQ 10 NO: 133). O grau de identidade entre as proteínas PMS1 de rato e humanas é elevado, como seria expectável entre dois mamíferos. Do mesmo modo, tal como se fez notar antes, há uma forte semelhança entre a proteína PMS1 humana e a proteína de reparação do desemparelhamento do ADN de fungos PMS1, tal 55 como se mostra na figura 11. O facto de a PMS1 e a MLHl funcionarem nos fungos para reparar o desemparelhamento do ADN, sugere fortemente que a PMS1 e a MLHl humanas e de ratos são também proteínas de reparação do desemparelhamento.

Utilizações das MLHl e PMSI de rato

Os requerentes crêem que o isolamento e a caracterização por eles feita dos genes de a rPMSl e rMLHl terão muitas aplicações na investigação. Por exemplo, tal como já se discutiu antes, os requerentes utilizaram os seus conhecimentos sobre o gene de rPMSl para produzir anticorpos que reagem especificamente com hPMSl. Os requerentes já explicaram que os anticorpos dirigidos às proteínas humanas, MLHl ou PMS1 podem ser utilizados ambos para fins de investigação assim como para fins de diagnóstico.

Os requerentes também acreditam que o seu conhecimento de rPMSl e rMLHl será útil para a construção de modelos de ratos de modo a estudar as consequências dos defeitos de reparação do desemparelhamento do ADN. Os requerentes esperam que os ratos com defeitos de rPMSl e rMLHl terão uma elevada propensão para o cancro porque o CCNPH associado aos cromossomas 2p e 3p são ambos devidos a um defeito num gene de reparação do desemparelhamento i,£:. Como se fez notar antes, os requerentes também produziram ratos quiméricos que comportam um gene defeituoso de rPMSl. Os requerentes estão neste momento a produzir ratos hetrerozigótícos quanto à mutação de rPMSl ou rMLHl. Estes ratos hetrerozigótícos devem providenciar modelos de animais úteis para estudar o cancro humano, em particular CCNPH. Os ratos serão úteis para a análise tanto dos 56 factores intrínsecos como dos extrínsecos que determina o risco e a progressão do cancro. Também os cancros associados com a deficiência da reparação do desemparelhamento podem responder de forma diferente à terapia convencional em comparação com outros cancros. Esses modelos de animais serão úteis para a determinação se existem diferenças e vão permitir o desenvolvimento de regimes para o tratamento efectivo deste tipo de tumores. Esses modelos de animais podem também ser utilizados para estudar a relação entre factores hereditários versus factores dietéticos na carcinogénese.

Distinção entre mutações e polimorfismos

Para os estudos sobre a susceptibilidade para o cancro e para a identificação e caracterização de tumores, é importante distinguir "mutações" de "polimorfismos". Uma "mutação" produz um "alelo de tipo não selvagem" de um gene. Um alelo de tipo não selvagem de um gene produz um transcrito e/ou um produto de proteína que não funciona normalmente dentro de uma célula. As "mutações" podem ser qualquer alteração na sequência de nucleótidos incluindo inserções, eliminações, substituições e re-arranjos. "Polimorfismos", por outro lado, são diferenças da sequência que se encontram dentro da população de genes que funcionam normalmente (isto é, "de tipo selvagem"). Alguns polimorfismos resultam da degenerescência do código do ácido nucleico. Isto é, dado que a maior parte dos aminoácidos estão codificados por mais do que um codão de triplete, muitas sequências de nucleótidos diferentes podem codificar o mesmo polipéptido. Outros polimorfismos são simplesmente diferenças de sequências que não têm um efeito significativo na função do gene ou polipéptido codificado. 57

Por exemplo, os polipéptidos podem muitas vezes tolerar pequenas inserções ou eliminações ou substituições "conservadoras" na sua sequência de aminoácidos sem alterar significativamente a função do polipéptido.

As substituições "conservadoras" são aquelas em que um aminoácido particular é substituído por outro aminoácido de caraeterísticas químicas semelhantes. Por exemplo, os aminoácidos são muitas vezes caracterizados como "não polares (hidrofóbicos)" incluindo aianina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalína, triptofano e metionina; "polar neutro", incluindo glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina e glutamína; "carregados positivamente (básicos)", incluindo arginina, lisina e histidina; e "carregados negativamente (ácidos)", incluindo ácido aspártico e ácido glutâmico. Uma substituição de um dos aminoácidos por outro no mesmo grupo é geralmente considerada como sendo "conservadora", particularmente se os grupos laterais dos dois aminoácidos relavantes forem de uma dimensão semelhante. A primeira etapa na identificação de uma mutação ou polimorfismo numa sequência de genes de reparação de desemparelhamento envolve a identificação, utilizando técnicas disponíveis incluindo as aqui descritas, de um gene de reparação de desemparelhamento (ou fragmento de gene), sequência que difere de uma sequência normal (por exemplo de tipo selvagem) conhecida do mesmo gene de reparação de desemparelhamento (ou fragmento de gene). Por exemplo, podia-se identificar uma sequência de gene de hMLHl (ou fragmento de gene) que difere em pelo menos uma posição de nucleótido de uma normal sequência de hMLHl, conhecida (por exemplo de tipo selvagem), tal como uma qualquer das SEQ 10 NOS: 6-24. 58

As mutações podem distinguir-se dos polimorfismos utilizando qualquer um de uma variedade de processos, talvez o mais directo dos quais seja a recolha e correlação de dados com o desenvolvimento do tumor. Isto é, por exemplo, pode-se identificar um indivíduo cuja sequência de gene de hMLHl difere de uma sequência reportada nas SEQ 10 NOS: 6-24, mas que não tem cancro e não tem história de cancro na família. Particularmente se outros elementos da família dos indivíduos, em especial pessoas mais velhas, tiverem sequências de genes de hMLHl que diferem das SEQ 10 NOS: 6-24, da mesma forma, é provável que as sequências de genes de hMLHl desses indivíduos possam ser categorizadas como um "polimorfismo". Se outros indivíduos não aparentados forem identificados com a mesma sequência de gene de hMLHl e não tiverem uma história familiar de cancro, a categorização pode ser confirmada.

As mutações que são responsáveis por conferirem susceptibílidade genética ao cancro podem ser identificadas porque, entre outras coisas, essas mutações é provável que estejam presentes em todos os tecidos de um indivíduo não afectado e na linha de germes de pelo menos um desses parentes do indivíduo e não é provável que se encontre em famílias não aparentadas sem história de cancro.

Quando se quer distinguir as mutações dos polimorfismos, pode ser válido, algumas vezes, avaliar uma diferença particular da sequência na presença de pelo menos uma mutação conhecida do gene de reparação do desempareihamento. Nalguns casos, uma alteração particular da sequência não terá efeito detectável (isto é, parecerá ser um polimorfismo) quando ensaiada isoladamente, mas fará, por exemplo, aumentar a pertinência de uma mutação conhecida, de tal modo que os indivíduos que são portadores 59 tanto da diferença do polimorfismo aparente e uma mutação conhecida têm uma probabilidade mais elevada de desenvolver cancro do que os indivíduos que são apenas portadores da mutação. As diferenças das sequências que têm esse efeito são consideradas apropriadamente como sendo mutações, embora sejam fracas.

Tal como se discutiu antes e previamente (pedidos de patentes de invenção norte-americanas U.S. n°s 08/168,877 e 08/209,521), as mutações nos genes de reparação de desemparelhamento ou produtos de genes produziram versões de tipo não selvagem desses genes ou produtos de genes. Algumas mutações podem por isso distinguir-se de polimorfismos pelas suas características funcionais em ensaio de reparação de desemparelhamentos in vivo ou in vítro. Qualquer ensaio de reparação de desemparelhamentos pode ser utilizado para analisar estas características 4a" 63. É geralmente desejável utilizar mais do que um ensaio de reparação de desemparelhamentos antes de classificar uma alteração da sequência como um polimorfismo, dado que algumas mutações terão efeitos que não serão observados em todos os ensaios.

Por exemplo, não é expectável que um gene de reparação de desemparelhamento contendo uma mutação seja capaz de substituir uma cópia endógena do mesmo gene numa célula hospedeira sem afectar, de forma detectável, a reparação de desemparelhamento nessa célula; em que seria expectável que um gene de reparação de desemparelhamentos fosse capaz de substituir uma cópia endógena do mesmo gene numa célula hospedeira sem afectar, de forma detectável, a reparação de desemparelhamento nessa célula. 0 requerentes notaram que para esses estudos de "substituição", é geralmente desejável introduzir o gene a ser ensaiado numa célula 60 hospedeira da mesma espécie (ou pelo menos fortemente relacionada) que a célula de que derivou o gene de ensaio, para evitar complicações devidas, por exemplo, à inabilidade de um produto de gene de uma espécie para interagir com outros produtos de genes de reparação de desemparelhamentos de outras espécies. Do mesmo modo, não é expectável que uma proteína mutante de reparação de desemparelhamentos funcione normalmente num sistema de reparação de desemparelhamentos funcione normalmente num sistema de reparação de desemparelhamento in vitro (preferencialmente a partir de um organismo relacionado); em que seria expectável que uma proteína polimórfica de reparação de desemparelhamento funcionasse normalmente.

Os processos aqui descritos e os descritos previamente permitem a identificação de diferentes tipos de mutações de genes de reparação de desemparelhamentos. Os exemplos que se seguem ilustram protocolos para distinguir mutações de polimorfismos nos genes de reparação de desemparelhamentos do ADN. EXEMPLO 3: Os requerentes desenvolveram um sistema para ensaiar no fungo S. cerevisiae o significado funcional de mutações encontradas quer nos genes de hMLHl, quer nos de hPMSl. 0 sistema está descrito no presente pedido de patente de invenção utilizando como exemplo a mutação causada pela substituição de serina (SER) por fenilalanina (FEN) em hMLHl, que se verificou numa família com CCNPH, tal como descrito antes. Os requerentes derivaram uma estirpe de fungo que foi praticamente eliminada do seu gene de MLH1 e e por isso é um forte agente de mutação (isto é, 1000 vezes acima da taxa normal num ensaio simples de marcador genético que envolve a reversão da dependência do crescimento de um dado aminoácido para a independência 61 (reversão do alelo hom3-10, Prolla, Christie e Liskay, Mol Cell. Biol, 14: 407-415, 1994). Quando os requerentes colocaram o MLH1 de um fungo normal, o gene (completo com todas as regiões de controlo conhecidas) num plasma de fungo que se manteve de forma estável como uma cópia única na estirpe eliminada de MLH1, o fenótipo do agente de mutação é completamente corrigido utilizando a reversão para o ensaio de independência do aminoácido. Contudo, se os requerentes introduziam uma cópia eliminada da MLH1 de fungo, não há correcção. Os requerentes em seguida ensaiaram a mutação que, na família com CCNPH causou uma alteração de SER para FEN. Os requerentes verificaram que a proteína mutante de fungo resultante não pode corrigir o fenotipo do agente de mutação, sugerindo fortemente que a alteração da sequência do gene de tipo selvagem provavelmente confere susceptibilidade ao cancro e é por isso classificada como uma mutação, não um polimorfismo. Os requerentes em seguida ensaiaram as proteínas tratadas por engenharia genética para conter outros aminoácidos na posição "serena" e verificaram que a maior parte das alterações resultam num mutante completo ou pelo menos um fenotipo parcialmente mutante.

Como se verificam outras mutações "pontuais", nos genes de MLH1 e de PMS1, em famílias de cancro, elas podem ser tratadas por engenharia genética no gene homólogo de fungo apropriado e estudou-se a sua consequência na função da proteína. Além disso, os requerentes identificaram um certo número de aminoácidos altamente conservados tanto nos genes de MLH1 como PMS1. Os requerentes também puseram em evidência que hMLH1 interage com hPMSl de fungos. Esta verificação levanta a possibilidade de que as mutações observadas no gene de hMLH1 podem ser mais directamente ensaiadas no sistema de fungos. Os requerentes planeiam 62 fa2er sistematicamente mutações que iriam alterar o aminoácido nestas posições conservadas e determinar quais as substituições de aminoácidos que são toleradas e quais as que não são. Recolhendo informação sobre as mutações relacionadas com hMLH1 e hPMSl, tanto por determinação como por documentação actual, encontraram mutações em famílias com CCNPH e por meio de síntese artificial de mutantes para ensaiar em sistemas experimentais, pode eventualmente ser possível praticar um protocolo de ensaio da susceptíbilidade ao cancro que, uma vez determinada a estrutura de hMLH1 e hPMSl de indivíduos, requer apenas a comparação dessa estrutura com mutações conhecidas versus os dados do polimorfismo. EXEMPLO 4: Um outro processo que os requerentes utilizaram para estudar as interacções físicas entre hMLH1 e hPMSl, pode também ser utilizado para estudar se uma alteração particular num produto de gene resulta numa alteração do grau de interacção proteína-proteína. A informação respeitante às alterações na interacção de proteína-proteína pode demonstrar ou confirmar se uma variação genómica particular é uma mutação ou um polimorfismo. No seguimento das verificações laboratoriais dos requerentes sobre a interacção entre as proteínas MLH1 e PMS1 de fungos in vitro e In vivo, (pedido de patente de invenção norte-americana U.S. com o n° de série 08/168.877), ensaiou-se a interacção entre as contra-partes humanas destas duas proteínas de reparação do desemparelhamento do ADN. Ensaiaram-se as proteínas humanas MLH1 e PMS1 quanto à interacção in vitro utilizando a cromatografia de afinidade da proteína de ligação da maltose (PLM). Preparou-se a proteína h MLH1 como uma proteína de fusão de PLM, imobilizada ou numa coluna de resina de amilose por via de PLM ensaiou-se quanto à 63 ligação a hPMSl, sintetizada in vitro. A proteína hPMSl ligada à matriz de PLM - h MLH1, enquanto proteína de controlo não mostrou afinidade para a matriz. Quando se fez passar a proteína h MLH1, traduzida in vitro, sobre uma matriz de proteína de fusão de PLM - hPMSl, a proteína h MLHl ligou-se à matriz de PLM - hPMSl, enquanto as proteínas de controlo não se ligaram.

As ínteracções potenciais in vivo entre foram MLHl e PMS1 ensaiadas utilizando o sistema de "dois híbridos" de fungo 28. Os resultados iniciais dos requerentes indicam que h MLHl e hPMSl interagem in vivo em fungos. 0 mesmo sistema pode também ser utilizado para detectar alterações na interacção proteína-proteína que resulta das alterações na estrutura do gene ou do produto do gene e que ainda tem de ser classificada que como polimorfismo ou como mutação que confere susceptibilidade ao cancro.

Detecção de famílias com CCNPH e as suas mutações

Tem sido estimado que aproximadamente 1.000.000 de indivíduos nos Estados Unidos são portadores (SÃO heterozigóticos para) de um gene 29 mutante de CCNPH. Além disso, as estimativas sugerem que 50-60 % das famílias segregam mutações no gene de MSH2 que reside no cromossoma 2P·1' 2 Uma outra fracção significativa parece estar associada com o gene de CCNPH que mapeia o cromossoma 3p21-22, presumivelmente devido a mutações no gene de hMLHl tal como a transição de C para T discutida antes. A identificação de famílias que segregam alelos mutantes quer do gene de hMSH2 ou hMLHl e a determinação dos indivíduos que nestas famílias actualmente têm a mutação serão de grande utilidade na intervenção precoce nestas doenças. Essa intervenção precoce irá provavelmente incluir a 64 detecção precoce através da avaliação e o tratamento de seguimento agressivo dos indivíduos afectados. Além disso, a determinação da base genética tanto para tumores familiares como esporádicos pode dirigir o processo de terapia no tumor primário ou nas recorrências.

Inicialmente, as famílias candidatas a CCNPH serão diagnosticadas parcialmente através do estudo das histórias da família, muito provavelmente ao nível local, por exemplo, por oncologistas hospitalares. Um critério para CCNPH é a observação de instabilidade de micro-satélites em tumores de indivíduos 3'6. 0 paciente será avaliado quanto a mutações em hMSH2, hMLHl, hPMSl e outros genes envolvidos na reparação do desemparelhamento do ADN, tal como são identificados. Isto é feito mais facilmente por amostragem de sangue do indivíduo. Também altamente útil será o tecido de tumor congelado em fresco. É importante notar para o processo de avaliação, que os indivíduos afectados são heterozigóticos para a mutação ofensiva nos seus tecidos normais.

Os tecidos disponíveis, por exemplo, sangue e tumor, são trabalhados para a análise da mutação à base de RCP, utilizando um ou os dois processos que se seguem: 1) Análise de ligação com um marcador de micro-satélite fortemente ligado ao gene de hMLHl.

Uma abordagem para identificar famílias propensas ao cancro com uma mutação de hMLHl consiste em realizar análises de ligação com um marcador altamente polimórfico localizado dentro ou fortemente ligado ao hMLHl. Os micro-satélites são altamente polimórficos e por isso são muito úteis como marcadores na análise de ligação. Por os 65 requerentes disporem do gene de hMLH1 num único fragmento genómico grande num clone de fago PI (-100 kpb), é muito provável que um ou mais micro-sAtélites, por exemplo, traços de repetições de dinucleótidos existam dentro ou muito próximo do gene de hMLH1. Pelo menos um desses micro-satélites tem sido referenciado 38. Uma vez identificados esses marcadores, preparam-se os amplificadores de RCP para amplificar as extensões de ADN contendo os micro-satélites. Vai-se avaliar o ADN de indivíduos afectados e não afectados de uma família com uma alta frequência de cancro para determinar a segregação dos marcadores de MLH1 e a presença do cancro. Os dados resultantes podem ser utilizados para calcular uma pontuação lod e assim determinar a probabilidade de ligação entre hMLHl e a ocorrência de cancro. Uma vez estabelecida a ligação numa dada família, pode-se utilizar o mesmo marcador polimórfico para ensaiar outros membros aparentados quanto à probabilidade de serem portadores da mutação de hMLHl. 2) Sequenciação de ADNc de transcrição reversa a) Faz-se a transcrição reversa (TR) do ARN de indivíduos afectados, indivíduos não afectados e não aparentados, seguida de RCP para amplificar o ADNc em 4-5 porções sobrepostas 34' 37. Deve notar-se que para os fins de RCP, podem utilizar-se, potencialmente, muitas sequências de pares de iniciadores de oligonucleótidos diferentes, para amplificar porções relevantes de um gene de hMLHl ou hPMSl para fins de avaliação genética. Com o conhecimento das estruturas de ADNc para os genes, é um exercício linear construir o pares de iniciadores que provavelmente serão efectivos para amplificar especificamente porções seleccionadas do gene. Embora as sequências de iniciadores tenham normalmente entre 20 e 30 bases de comprimento pode 66 iniciadores mais ser possível utilizar iniciadores mais curtos, potencialmente tão pequenos quanto aproxímadamente 13 bases, para amplificar especificamente segmentos de genes seleccionados. A principal limitação quanto ao tamanho reduzido que uma sequência de iniciador pode ter é que deve ser suficientemente longa para hibridar especificamente com o segmento de gene atingido. A especificidade de RCP é normalmente melhorada aumentando o comprimento dos iniciadores e/ou utilizando pares de iniciadores incluídos.

Os produtos de RCP, que no total representam todo o ADNc são então sequenciados e comparados com sequências de tipo selvagem conhecidas. Na maior parte dos casos será observada uma mutação no indivíduo afectado. Idealmente, a natureza da mutação indicará que é provável que inactive o produto do gene. Se assim não for, deve-se determinar a possibilidade de que a alteração não seja simplesmente um polimorfismo. b) Algumas mutações, por exemplo, as que afectam o seccionamento ou que resultam da translação de codões de paragem, podem desestabilizar o ARN mensageiro produzido a partir do gene mutante e por isso compreendem o processo de detecção da mutação com base na TR. Uma técnica recentemente referenciada pode circunscrever este problema, ensaiando se o ADNc mutante pode dirigir a síntese de proteínas de comprimento normal num sistema de transcrição/tradução acoplado in vitro 32. 3) Sequenciação directa do ADN genómico

Uma segunda via para detectar mutações baseia-se no exame de exões e das fronteiras de intrão/exão por meio de um ciclo de RCP para sequenciar directamente uma matriz de 67 ADN 1,2. Este processo requer a utilização de pares de oligonucleótidos, tal como os descritos nos quadros 2 e 3 anteriores, o que amplifica os exões individuais para a sequenciação directa do ciclo de RCP. 0 processo depende da informação sobre a sequência do ADN genómico em cada fronteira de intrão/exão (50 pb ou superior para cada fronteira). A vantagem da técnica é de duas vezes. Primeiro, porque o ADN é mais estável do que o ARN, sendo que a condição do material utilizado para RCP não é tão importante como o é para os protocolos à base de ARN. Em segundo lugar, a maioria das mutações dentro da actual região do gene, incluindo as de um intrão que afecta o seccionamento, serão detectáveis.

Para cada gene candidato, a detecção da mutação pode exigir conhecimento tanto de toda a estrutura do ADNc como de todas as fronteiras de intrão/exão da estrutura genómica. Com essa informação, pode-se determinar o tipo de mutação causal numa família particular. Por sua vez, um esquema de detecção mutações mais específico e eficiente pode ser adaptado para a família em particular. A avaliação da doença (CCNPH) é complexa porque tem uma base geneticamente heterogénea no sentido de que mais do que um gene está envolvido e, para cada gene, estão envolvidos múltiplos tipos de mutações 2. Qualquer família é muito provável que segregue uma mutação particular. Contudo, como se determina a natureza da mutação em múltiplas famílias, o espectro das mutações mais prevalentes na população será determinado. Em geral, a determinação das mutações mais frequentes será dirigida para a detecção da mutação.

Dado que o CCNPH é tão prevalente na população humana, a detecção de um portador à nascença poderia fazer parte dos ensaios padrão dos recém-nascidos. As famílias em risco 68 podem ser identificadas e todos os elementos não ensaiados previamente podem ser ensaiados. Eventualmente, pode determinar-se todos os indivíduos afectados.

Modo de rastreio e de ensaio da mutação

Ensaio à base de ADN 0 ensaio inicial, incluindo a identificação de prováveis famílias de CCNPH por diagnóstico padrão e estudo da história da família, será provavelmente feito em laboratórios de diagnóstico de ADN mais pequenos e locais. Contudo, o ensaio em larga escala de múltiplos elementos da família e certamente um ensaio alargado da população, exigirão, em última análise, grandes faculdades comerciais centralizadas e eficientes.

Os ensaios serão desenvolvidos com base na determinação das mutações mais comuns para os genes principais subjacentes a CCNPH, incluindo pelo menos o gene de hPMS2 no cromossoma 2p e o gene de MLH1 no cromossoma 3p. Provavelmente vai desenvolver-se uma variedade de ensaios. Por exemplo, uma possibilidade é um conjunto de testes utilizando hibridações de oligonucleótidos que distinguem os alelos normais vs os mutantes 33. Como já se fez notar, o conhecimento dos requerentes sobre as estruturas de nucleótidos para os genes de hMLHl, hPMSl and hMSH2, torna possível a preparação de numerosos pares de iniciadores de oligonucleótidos que podem ser utilizados para amplificar porções específicas de um gene de reparação de desemparelhamentos em indivíduos para a avaliação genética e análise do risco de cancro. 0 conhecimento dos requerentes sobre as estruturas dos genes também torna possível a preparação de sondas marcadas que podem ser 69 utilizadas rapidamente para determinar a presença ou a ausência de toda ou de uma porção dos genes de reparação do desemparelhamento do ADN. Por exemplo, as sondas de oligómeros específicas de alelos (OEA) podem ser preparadas para fazer a distinção entre alelos. Os OEAs são segmentos curtos de ADN que são idênticas na sequência excepto no facto de uma diferença numa única base que reflecte a diferença entre alelos normais e mutantes. Sob condições de hibridação apropriadas estas sondas podem reconhecer uma única diferença de bases entre duas sequências de alguma forma idênticas. As sondas podem ser marcadas radioactivamente ou com uma variedade de moléculas repórteres não radioactívas, por exemplo, partes fluorescente ou quimiolumínescentes. As sondas marcadas são então utilizadas para analisar a amostra de RCP quanto à presença de alelo causador da doença. A presença ou a ausência de vários genes diferentes que causam a doença pose ser facilmente determinada numa única amostra. 0 comprimento da sonda deve ser suficientemente longo para evitar a ligação não específica às sequências de nucleótidos diferentes da squência alvo. Todos os testes dependerão, em última análise, de informação precisa e completa sobre a estrutura relacionada com os genes de hMLHl, hMSH2r hPMSl e outros genes de reparação do desemparelhamento do ADN implicados no CCNPH.

Avaliação baseada na detecção de proteínas

Podem utilizar-se ensaios à base da funcionalidade do produto de proteína, per se. Os ensaios de exame da proteína utilizarão, mais provavelmente, reagentes de anticorpos específicos para cada uma das proteínas hMLHl, hPMSl e hMSH2 ou outros produtos de gene relacionados com o "cancro", conforme são identificados. 70

Por exemplo, um espécimen de tumor congelado pode ser seccionado transversalmente e preparado para a coloração do anticorpo utilizando técnicas indirectas de fluorescência. É expectável que algumas mutações de genes alterem ou desestabilizem suficientemente a estrutura da proteína de tal modo que dêem um sinal alterado ou reduzido depois da coloração do anticorpo. É provável que esses ensaios sejam realizados em casos em que o envolvimento dos genes num cancro de uma família tenha ainda de ser estabelecida. Os requerentes estão em processo de desenvolvimento de anticorpos monoclonais de diagnóstico contra as proteínas MLH1 e PMS1 humanas. Os requerentes estão a sobre-expressar as proteínas humanas MLH1 e PMS1 em bactérias. Os requerentes purificaram as proteínas, injectaram-nas em ratos e derivaram os anticorpos monoclonais específicos da proteína que podem ser utilizados para fins de diagnóstico e de investigação.

Identificação e caracterização de tumores de reparação do desemparelhamento do ADN

Para além da sua utilidade no diagnóstico da susceptibilidade ao cancro num indivíduo, as sequências de nucleótidos que são homólogas de um gene de reparação de desemparelhamento podem ser valiosas para, entre outras coisas, serem utilizadas na identificação e na caracterização de tumores com defeitos da reparação de desemparelhamento. Essa identificação e caracterização é valiosa porque os tumores com defeitos da reparação de desemparelhamento podem responder melhor a regimes de terapia particulares. Por exemplo, os tumores com defeitos da reparação de desemparelhamento podem ser sensíveis aos agentes de danificação do ADN, especialmente quando administrados em combinação com outros agentes 71 terapêuticos.

Os defeitos nos genes de reparação de desemparelhamentos não precisam de estar presentes por todos os tecidos do indivíduo para contribuírem para a formação do tumor nesse indivíduo. A mutação espontânea de um gene de reparação de desemparelhamento numa célula ou num tecido particular pode contribuir para a formação do tumor nesse tecido. De facto, pelo menos nalguns casos, uma única mutação no gene de reparação de desemparelhamento não é suficiente para o desenvolvimento do tumor. Nesses casos, um indivíduo com uma única mutação num gene de reparação de desemparelhamento é susceptível ao cancro, mas não desenvolverá um tumor até ocorrer uma mutação secundária. Adicionalmente, nalguns casos, a mutação do gene de reparação de desemparelhamento que está estrictamente associada a um tumor num indivíduo, será responsável por conferir susceptibilidade ao cancro numa família com uma predisposição hereditária para o desenvolvimento de cancro. A informação sobre a sequência providenciada pelos requerentes pode ser utilizada com processos conhecidos na técnica para analisar tumores (ou linhas de células de tumores) e para identificar mutações associadas a tumores nos genes de reparação de desemparelhamentos. Preferencialmente, é possível demonstrar que estas mutações associadas a tumores não estão presentes nos tecidos que não são de tumor do mesmo indivíduo. A informação descrita neste pedido de patente de invenção é particularmente útil para a identificação de mutações do gene de reparação de desemparelhamento dentro de tumores (ou de linhas de células de tumor) que exibem instabilidade genómica dos elementos curtos e repetidos do ADN. 72 A informação sobre a sequência e os protocolos de ensaio podem também ser utilizados para determinar se dois tumores estão relacionados, isto é, se um segundo tumor é o resultado de metástases de um primeiro tumor encontrado mais cedo que exibe uma mutação particular do gene de reparação de desemparelhamento do ADN.

Isolamento de genes adicionais com ima função relacionada

As proteínas que interagem fisicamente quer com hMLHl e/ou hPMSl, estão provavelmente envolvidas na reparação do desemparelhamento do ADN. Por analogia com hMLHl e hMSH2, as mutações nos genes que codificam para essas proteínas serão fortes candidatos para uma ligação potencial ao cancro. Uma abordagem poderosa de genética molecular utilizando fungos, referida como "sistema de dois híbridos", permite uma detecção e um isolamento relativamente rápidos dos genes que codificam as proteínas que interagem com o produto do gene de interesse, por exemplo, hMLH 28. 0 sistema de dois híbridos envolve dois vectores de plasmido, cada um deles destinado a codificar uma proteína de fusão. Cada um dos dois vectores contém uma porção ou um domínio de um activador de transcrição. A célula de fungo utilizada no esquema de detecção contém um gene "repórter". 0 activador não pode activar sozinho a transcrição. Contudo, se os dois domínios forem colocados em grande proximidade, então a transcrição pode ocorrer. Insere-se o ADNc para a proteína de interesse, por exemplo HMLHl, dentro de uma secção de leitura em um dos vectores. Isto é designado por "isco" ("bait" na terminologia inglesa). Introduz-se uma biblioteca de ADNcs humanos, inserida num segundo vector de plasmido de modo a fazer fusões com o 73 outro domínio do activador de transcrição, nas células do fungo que exibem o vector "isco". Se uma célula particular de fungo recebe um elemento da biblioteca que contém um ADNc humano que codifica uma proteína que interage com a proteína HMLHl, esta interacção vai levar os dois domínios do activador de transcrição a uma grande proximidade, activa a transcrição do gene repórter e a célula do fungo vai ficar azul. Em seguida, a inserção é sequenciada para determinar se está relacionada com qualquer sequência na base de dados. Pode-se utilizar o mesmo processo para identificar proteínas de fungos em processos de reparação do desemparelhamento do ADN ou em processos relacionados. Realizar a "caça" em seres humanos e em fungos em paralelo tem certas vantagens. A função de novos homólogos de fungos pode ser rapidamente determinada em fungos por meio do rompimento do gene e o subsequente exame das consequências genéticas de ser defeituoso no novo gene encontrado. Estes estudos com fungos ajudarão a guiar a análise de novas proteínas humanas que "interagem com hMLHl ou hPMSl " mais ou menos da mesma maneira que os estudos sobre PMSl e MLH1 influenciaram os estudos dos requerentes sobre os genes humanos de PMSl e MLH1.

Produção de anticorpos

Utilizando o conhecimento dos requerentes sobre as sequências de ADN para hMLHl e hPMSl, eles puderam sintetizar todas ou porções das estruturas de proteínas previstas para o fim da produção de anticorpos. Uma utilização importante para os anticorpos dirigida às proteínas hMLHl e hPMSl será a captura de outras proteínas que podem estar envolvidas na reparação do desemparelhamento do ADN. Por exemplo, utilizando técnicas de co-imuno-precipitação, podem precipitar-se os anticorpos 74 dirigidos quer a hMLHl ou hPMSl, em conjunto com outras proteínas associadas que estão funcionalmente e/ou fisicamente relacionadas. Outra utilização importante para os anticorpos terá por fim o isolamento das proteínas hMLHl e hPMSl de tecidos de tumores. As proteínas hMLHl e hPMSl de tecidos de tumores podem então ser caracterizadas com o fim de se determinar as estratégias de tratamento apropriadas.

Os requerentes estão em processo de desenvolvimento de anticorpos monoclonais dirigidos às proteínas hMLHl e hPMSl. EXEMPLO 5: Os requerentes utilizaram também o proceso que se segue para produzir anticorpos policlonais dirigidos para as formas humanas e de rato da proteína PMS1.

Os requerentes inseriram um fragmento de 3' do ADNc de PMS1 de rato no vector do plasmido de expressão bacteriano, pET (Novagen, Madison, WI). A esperada porção expressa da proteína PMS1 de rato corresponde a uma região de aproximadamente 200 aminoácidos no fim da proteína PMS1. Esta porção da rPMSl está conservada com PMS1 de fungo mas não está conservada com nenhuma das proteínas MLH1 humanas ou de rato. Uma das razões pela qual os requerentes seleccionaram esta porção de proteína PMS1 para a produção de anticorpos é porque não queriam que os anticorpos reagissem de forma cruzada com MLH1. O fragmento de proteína PMS1 de rato foi altamente expresso em E. colí.r purificada a partir de um gel de poliacrilamída e preparou-se então a proteína eluída para injecções de animais. Enviaram-se aproximadamente 2 mg do fragmento de proteína PMS1 para a Pocono Rabbit Farra (PA) para injecções em coelhos. Os soros dos coelhos foram titulados múltiplas 75 vezes em função do antigénio de PMS1 utilizando técnicas padronizadas de ELISA. Os anticorpos de coelhos específicos para a proteína PMS1 de rato foram purificados por afinidade utilizando colunas contendo a proteína PMS1 de rato imobilizada. A preparação do anticorpo policlonal purificado por afinidade foi ensaiada utilizando ainda a análise de mancha de Western e a mancha de pontos. Os requerentes verificaram que os anticorpos policlonais reconheceram não só a proteína PMS1 de rato, mas também a proteína PMSl humana que é muito semelhante. Com base nas manchas de Western, não há indicação de que outras proteínas fossem fortemente reconhecidas pelos anticorpos dos requerentes, incluindo as proteínas MLH1 quer de rato quer humanas.

Ratos deficientes na reparação do desemparelhamento do ADN. EXEMPLO 6: Para criar um sistema de um modelo experimental para estudar os defeitos de reparação do desemparelhamento do ADN e o cancro resultante num modelo completo de animais, os requerentes derivaram ratos deficientes na reparação do desemparelhamento do ADN utilizando a tecnologia das células indiferenciadas embriónicas (IE). Utilizando o ADN genómico que contém uma porção do gene de PMSl de rato os requerentes construíram um vector que, após recombinação homóloga causa um rompimento do gene cromossómico de PMSl de rato. As células IE de rato de 129 estirpes de ratos foram confirmadas como contendo um alelo de PMSl de rato com rompimento. As células de IE foram injectadas em blastócitos hospedeiros de C57/BL6 para produzir animais que eram quiméricos ou uma mistura das células dos 129 e dos C57/BL6. A incorporação das células IE foi determinada pela presença de adesivos de coloração de revestimento de cutias (indicativo da 76 contribuição das células IE) . Todos os machos quiméricos foram criados com ratos fêmea C57/BL6.

Em seguida, nasceram doze crias (Fa) em que se detectou a cor da pele de cutia indicando a transmissão da linha de células do material genético das células IE. As análises do ADN extraído das pontas das caudas das crias indicaram que seis dos animais eram heterozígóticos (continham um alelo de tipo selvagem e um alelo mutante) para a mutação de PMS1 de rato. Dos seis animais heterozígóticos, três eram fêmeas (animais F2-8, F2-ll e F2-12) e três eram machos (F2, F2-10 e F2-13) . Para a criação criaram-se cercados para se obter ratos que eram homozigóticos para a mutação de rPMSl e mais ratos heterozígóticos. 0 cercado de criação #1 que continha os animais F2-II e F2-IO, originaram um total de treze ratos em três ninhadas, quatro dos quais tinham sido genotipados. 0 cercado de criação #2 (animais F2-8 e F2-13) originaram vinte e dois animais e em três ninhadas, três dos quais tinham sido genotipados. Dos sete animais genotipados, identificaram-se três animais fêmeas homozigóticas. Um animal morreu às seis semanas de idade por causas desconhecidas. As restantes fêmeas homozigóticas estavam vivas e de saúde às doze semanas de idade. Os resultados indicam que os ratos homozigóticos com defeitos da PMS1 de rato, são viáveis.

Utilizaram-se os cercados de criação #3 e #4 para cruzar novamente a mutação PMS1 de rato nos ratos C57/BL6 anteriores. 0 cercado de criação #3 (animal F2-I2 cruzado com um rato C57/BL6) produziu vinte e um animais em duas ninhadas, nove dos quais tinham sido genotipados. 0 cercado de criação #4 (animal F2~6 cruzado com um rato C57/BL6) deu 77 oito ratos. Além disso, o macho quimérico original (cercado de criação #5) tinha produzido mais trinta e uma crias.

Para genotipar os animais, desenvolveu-se uma série de iniciadores de RCP que foram utilizados para identificar genes de PMS1 de rato mutantes e de tipo selvagem. Eles são: (SEQ ID NOS: 143-148, respectivamente)

Iniciador 1: 5'TTCGGTGACAGATTTGTAAATG-3'

Iniciador 2: 5"TTTACGGAGCCCTGGC-3'

Iniciador 3: 5'TCACCATAAAAATAGTTTCCCG-3'

Iniciador 4: 5'TCCTGGATCATATTTTCTGAGC-3'

Iniciador 5: 5'TTTCAGGTATGTCCTGTTACCC-3'

Iniciador 6: 5'TGAGGCAGCTTTTAAGAAACTC-3'

Iniciadores 1+2 (5' marcado)

Iniciadores 1+3 (5' não marcado)

Iniciadores 4+5 (3' marcado)

Iniciadores 4+6 (3' não marcado)

Os ratos desenvolvidos pelos requerentes originam um sistema de modelo de animais para estudas as consequências dos defeitos na reparação do desemparelhamento do ADN e no CCNPH resultante. A sobrevivência de longo prazo dos ratos homozigóticos e heterozigóticos para a mutação de PMS1 de rato e os tipos e tempos dos tumores nestes ratos serão determinados. Os ratos serão avaliados diariamente no que respeita a qualquer indicação de início de cancro tal como indicado por uma aparência de corcova em combinação com a deterioração das condições de revestimento. Estes ratos portadores da mutação de PMS1 de rato serão utilizados para ensaiar os efeitos de outros factores, ambientais e genéticos, na formação do tumor. Por exemplo, o efeito da dieta no cólon e noutros tipos de tumores pode ser comparado para os animais normais versus os que são portadores da mutação de PMSl de rato quer no genotipo 78 heterozigótico quer homozigótico. Além disso, a mutação de PMS1 de rato pode ser posta em diferentes contextos genéticos anteriores para se aprender acerca das interacções entre os genes da reparação do desemparelhamento e outros genes envolvidos no cancro humano, por exemplo p53. Os ratos portadores de mutações de PMS1 de rato serão úteis para ensaiar a eficácia da terapia somática de genes nos cancros que aparecem em ratos, por exemplo, os expectáveis cancros do cólon. Além disso, as linhas de células de fibroblastos isogénicos de zPMSl de ratos heterozigóticos e homozigóticos podem ser estabelecidas para serem utilizadas em vários estudos celulares, incluindo a determinação das taxas de mutação espontâneas.

Os requerentes estão actualmente a construir um vector para romper o gene rMLHl de rato para derivar ratos que comportam mutação em rMLHl. Os requerentes vão comparar ratos portadores de defeitos na rPMSl com ratos portadores de defeitos na rMLHl. Além disso, os requerentes vão produzir ratos que são portadores de mutações em ambos os genes de CCNPH. Outros estudos sobre os ratos mutantes em rMLHl serão tal como se descreveu antes para os ratos mutantes em rPMS1.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL i) REQUERENTE: Liskay, Robert M.

Bronner, C. Eric

Baker, Sean M.

Bollag, Roni J.

Kolodner, Riehard D. 79

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: COMPOSÇÕES E PROCESSOS RELACIONADOS COM OS GENES DE REPARAÇÃO DO DESEM-PARELHAMENTO DO ADN (iii) NUMERO DE SEQUÊNCIAS: 148 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Kolisch, Hartwell, Oickinson, MeCormaek & Heuser (B) RUA: 520 S.W. Yamhill Street, Suite 200 (C) CIDADE: Portland (D) ESTADO: Oregon (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 97204 (V) FORMA LISÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-OOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO: (B) DATA DE REGISTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O ADVOGADO /AGENTE: (A) NOME: Van Ryseelberghe, Pierre C. (B) NÚMERO DE REGISTO: 33.557 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ARMAZENAGEM: OHSU 306B (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: 80 (A) TELEFONE: (503) 224-6655 (B) TELEFAX: (503) 295-6679 (C) TELEX: 360619 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 361 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: Met Pro Ile Gin Val Leu Pro Pro Gin Leu Ala Asn Gin Ile Ala Ala 1 5 10 15 Gli GlU val Val Glu Arg Pro Ala Ser Val Val Lis Glu Leu Val Glu 20 25 30 Asn Ser Leu Asp Ala Gli Ala Tre Arg Val Asp Ile Asp Ile Glu Arg 35 40 45 Gli Gli Ala Lis Leu Ile Arg Ile Arg Asp Asn Gli Cis Gli Ile Lis 50 55 60 Lis Glu Glu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Arg His Ala Tre Ser Lis Ile 65 70 75 80 Alâ Ser Leu Asp Asp Leu Glu Ala Ile Ile Ser Leu Gli Fen Arg Gli 85 90 95 Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser Ser Val Ser Arg Leu Tre Leu Tre Ser 100 105 110 Arg Tre Ala Glu Gin Ala Glu Ala Trp Gin Ala Tir Ala Glu Gli Arg 115 120 125 Asp Met Asp Val Tre val Lis Pro Ala Ala His Pro Val Gli Tre Tre 130 135 140 3jG ii Glu Val Leu Asp Leu Fen Tir Asn Tre Pro Ala Arg Arg Lis Fen 81 150 145 155 160

Met Arg Tre Glu Lis Tre Glu Fen Asn His Ile Asp Glu Ile Ile Arg 165 170 175 Arg Ile Ala Leu Ala Arg Fen Asp Vai Tre Leu Asn Leu Ser His Asn 180 185 190 Gli Lis Leu Vai Arg Gin Tir Arg Ala Vai Ala Lis Asp Gli Gin Lis 195 200 205 Glu Arg Arg Leu Gli Ala Ile Cis Gli Tre Pro Fen Leu Glu Gin Ala 210 215 220 Leu Ala Ile Glu Trp Gin His Gli Asp Lis Tre Lis Arg Gli Trp Vai 225 230 235 240 Ala Asp Pro Asn His Tre Tre Tre Ala Leu Tre Glu Ile Gin Tir Cis 245 250 255 Tir Vai Asn Gli Arg Met Met Arg Asp Arg Leu Ile Asn His Ala Ile 260 265 270 Arg Gin Ala Cis Glu Asp Lis Leu Gli Ala Asp Gin Gin Pro Ala Fen 275 280 285 Vai Leu Tir Leu Glu Ile Asp Pro His Gin Vai Asp Vai Asn Vai His 290 295 300 Pro Ala Lis His Glu Vai Arg Fen His Gin Ser Arg Leu Vai His Asp 305 310 315 320 Fen Ile Tir Gin Gli Vai Leu Ser Vai Leu Gin Gin Gin Tre Glu Tre 325 330 335 Ala Leu Pro Leu Glu Glu Ile Ala Pro Ala Pro Arg His Vai Gin Glu 340 345 350 Asn Arg Ile Ala Ala Gli Arg Asn His 355 360 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 538 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIAL: linear 82 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) SEQUÊNCIA OESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Met Ser His Ile Ile Glu Leu Pro Glu Met Leu Ala Asn Gin Ile Ala 1 5 10 15 Ala Gli Glu Vai Ile Glu Arg Pro Ala Ser Vai Cis Lis Glu Leu Vai 20 25 30 Glu Asn Ala Ile Asp Ala Gli Ser Ser Gin Ile Ile Ile Glu Ile Glu 35 40 45 Glu Ala Gli Leu Lis Lis Vai Gin Ile Tre Asp Asn Gli His Gli Ile 50 55 60 Ala HlS Asp Glu Vai Glu Leu Ala Leu Arg Arg His Ala Tre Ser Lis 65 70 75 80 Ile LÍS Asn Gin Ala Asp Leu Fen Arg Ile Arg Tre Leu Gli Fen Arg 85 90 95 Gli Glu Ala Leu Pro Ser Ile Ala Ser Vai Ser Vai Leu Tre Leu Leu 100 105 110 Tre Ala Vai Asp Gli Ala Ser His Gli Tre Lis Leu Vai Ala Arg Gli 115 120 125 Gli Glu Vai Glu Glu Vai Ile Pro Ala Tre Ser Pro Vai Gli Tre Lis 130 135 140 Vai Cis Vai Glu Asp Leu Fen Fen Asn Tre Pro Ala Arg Leu Lis Tir 145 150 155 160 Met Lis Ser Gin Gin Ala Glu Leu Ser His Ile Ile Asp Ile Vai Asn 165 170 175 Arg Leu Gli Leu Ala His Pro Glu Ile Ser Fen Ser Leu Ile Ser Asp 180 185 190 Gli Lis Glu Met Tre Arg Tre Ala Gli Tre Cj 3* Gin Leu Arg Gin Ala 195 200 205 Ile Ala Gli Ile Tir Gli Leu Vai Ser Ala Lis Lis Met Ile Glu Ile 210 215 220 Glu Asn Ser Asp Leu Asp Fen Glu Ile Ser G1 i Fen Vai Ser Leu Pro 225 230 235 240 Glu Leu Tre Arg Ala Asn Arg Asn Tir Ile Ser Leu Fen Ile Asn Gli 245 250 255 Arg Tir Ile Lis Asn Fen Leu Leu Asn Arg Ala Ile Leu Asp Gli Fen 260 265 270 83 η

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Met Fen His His Ile Glu Asn Leu Leu Ile Glu Tre Glu Lis Arg Cis 1 5 10 15 Lis Gin Lis Glu Gin Arg Tir Ile Pro Vai Lis Tir Leu Fen Ser Met 20 25 30 Tre Gin Ile His Gin Ile Asn Asp Ile Asp Vai His Arg Lis Tre Ser 35 40 45 Gli Gin Vai Ile Tre Asp Leu Tre Tre Ala Vai Lis Glu Leu Vai Asp 50 55 60 Asn Ser Ile Asp Ala Asn Ala Asn Gin Ile Glu Ile Ile Fen Lis Asp 65 70 75 80 Tir Gli Leu Glu Ser Ile Glu Cis Ser Asp Asn Gli ASp Gli Ile Asp 85 90 95 Pro Ser Asn Tir Glu Fen Leu Ala Leu L r s His Tir Tre Ser Lis Ile 100 105 110 Ala Lis Fen Gin Asp Vai Ala Lis Vai Gin Tre Leu Gli Fen Arg Gli 115 120 125 Glu Ala Leu Ser Ser Leu Cis G1 i Ile Ala Lis Leu Ser Vai Ile Tre 130 135 140 Tre Tre Ser Pro Pro Lis Ala Asp Lis Glu Leu Tir Asp Met Vai Gli 145 150 155 160 His Ile Tre Ser Lis Tre Tre Tre Ser Arg Asn Lis Gli Tre Tre Vai 165 170 175 Leu Vai Ser Gin Leu Fen His Asn Leu Pro Vai Arg Gin Lis Glu Fen 180 185 190 Ser Lis Tre Fen Lis Arg Gin Fen Tre Lis Cis Leu Tre Vai Ile Gin 195 200 205 Gli Tir Ala Ile Ile Asn Ala Ala Ile Lis Fen Ser Vai Trp Asn Ile 85 210 215 220

Tre Pro Lis Gli Lis Lis Asn Leu Ile Leu Ser Tre Met Arg Asn Ser 225 230 235 240 Ser Met Arg Lis Asn Ile Ser Ser Vai Fen Gli AI a Gli Gli Met Arg 245 250 255 Gli Glu Leu Glu Vai Aap Leu Vai Leu Asp Leu Asn Pro Fen Lis Asn 260 265 270 Arg Met Leu Gli Lis Tir Tre Asp Asp Pro Asp Fen Leu Asp Leu Asp 275 280 285 Tir Lis Ile Arg Vai Lis Gli Tir Ile Ser Gin Asn Ser Fen Gli Cis 290 295 300 Gli Arg Asn Ser Lis Asp Arg Gin Fen Ile Tir Vai Asn Lis Arg Pro 305 310 315 320 Vai Glu Tir Ser Tre Leu Leu Lis Cis Cis Asn Glu Vai Tir Lis Tre 325 330 335 Fen Asn Asn Vai Gin Fen pro Ala Vai Fen Leu Asn Leu Glu Leu Pro 340 345 350 Met Ser Leu Ile Asp Vai Asn Vai Tre pro Asp Lis Arg Vai Ile Leu 355 360 365 Leu His Asn Glu Arg Ala Vai Ile Asp Ile Fen Lis Tre Tre Leu Ser 370 375 380 Asp Tir Tir Asn Arg Gin Glu Leu Ala Leu Pro Lis Arg Met Cis Ser 385 390 395 400 Gin Ser Glu Gin Gin Ala Gin Lis Arg Leu Leu Tre Glu Vai Fen Asp 405 410 415 Asp Asp Fen li iT S Lis Met Glu Vai Vai Gli Gin Fen Asn Leu Gli Fen 420 425 430 Ile ile Vai Tre Arg Lis Vai Asp Asn Lis Ser Asp Leu Fen Ile Vai 435 440 445 Asp Gin His Ala Ser Asp Glu Lis Tir Asn Fen Glu Tre Leu Gin Ala 450 455 460 Vai Tre Vai Fen Lis Ser Gin Lis Leu Ile Ile Pro Gin Pro Vai Glu 465 470 475 480 Leu Ser Vai Ile Asp Glu Leu Vai Vai Leu Asp Asn Leu Pro Vai Fen 485 490 495 Glu Lis Asn Gli Fen Lis Leu Lis Ile Asp Glu Glu Glu Glu Fen Gli 500 505 510 86

Ser Arg Vai Lis Leu Leu Ser Leu Pro Tre Ser Lis Gin Tre Leu Fen 515 520 525 Asp Leu Gli Asp Fen Asn Glu Leu Ile His Leu Ile Lis Glu Asp Gli 530 535 540 Gli Leu Arg Arg Asp Asn Ile Arg Cis Ser Lis Ile Arg Ser Met Fen 545 550 555 560 Ala Met Arg Ala Cis Arg Ser Ser Ile Met Ile Gli Lis Pro Leu Asn 565 570 575 Lis Lis Tre Met Tre Arg Vai Vai His Asn Leu Ser Glu Leu Asp Lis 580 585 590 Pro Trp Asn Gis Pro His Gli Arg Pro Tre Met Arg His Leu Met 595 600 605 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIS: (A) COMPRIMENTO: 2484 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 4: CTTGGCTCTT CTGGCGCCAA AATGTCGTTC GTGGCAGGGG TTATTCGGCG GCTGGACGAG 60 ACAGTGGTGA ACCGCATCGC GGCGGGGGAA GTTATCCAGC GGCCAGCTAA TGCTATCAAA 120 GAGATGATTG AGAACTGTTT AGATGCAAAA TCCACAAGTA TTCAAGTGAT TGTTAAAGAG 180 GGAGGCCTGA AGTTGATTCA GATCCAAGAC AATGGCACCG GGATCAGGAA AGAAGATCTG 240 GATATTGTAT GTGAAAGGTT CACTACTAGT AAACTGCAGT CCTTTGAGGA TTTAGCCAGT 300 ATTTCTACCT ATGGCTTTCG AGGTGAGGCT TTGGCCAGCA TAAGCCATGT GGCTCATGTT 360 ACTATTACAA CGAAAACAGC TGATGGAAAG TGTGCATACA GAGCAAGTTA CTCAGATGGA 420 AAACTGAAAG CCCCTCCTAA ACCATGTGCT GGCAATCAAG GGACCCAGAT CACGGTGGAG 480 GACCTTTTTT ACAACATAGC CACGAGGAGA AAAGCTTTÃÃ MMTCCAAG TGAAGAATAT 540 GGGATAATTT TGGAAGTTGT TGGCAGGTAT TCAGTACACA ATGCAGGCAT TAGTTTCTCA 600 GTTAAAAAAC AAGGAGAGAC AGTAGCTGAT GTTAGGACAC TACCCAATGC CTCAACCGTG 660 GACAATATTC GCTCCATCTT TGGAAATGCT GTTAGTCGAG AACTGATAGA AATTGGATGT 720 GAGGATAAAA CCCTAGCCTT CAAAATGAAT GGTTACATAT CCAATGCAAA CTACTCAGTG 780 87 AAGAAGTGCA TCTTCTTACT CTTCATCAAC CATCGTCTGG TAGAATCAAC TTCCTTGAGA 840 AAAGCCATAG AAACAGTGTA TGCAGCCTAT TTGCCCAAAA ACACACACCC ATTCCTGTAC 900 CTCAGTTTAG AAATCAGTCC CCAGAATGTG GATGTTAATG TGCACCCCAC AAAGCATGAA 960 GTTCACTTCC TGCACGAGGA GAGCATCCTG GAGCGGGTGC AGCAGCACAT CGAGAGCAAG 1020 CTCCTGGGCT CCAATTCCTC CAGGATGTAC TTCACCCAGA CTTTGCTACC AGGACTTGCT 1080 GGCCCCTCTG GGGAGATGGT TAAATCCACA ACAAGTCTGA CCTCGTCTTC TACTTCTGGA 1140 AGTAGTGATA AGGTCTATGC CCACCAGATG GTTCGTACAG ATTCCCGGGA ACAGAAGCTT 1200 GATGCATTTC TGCAGCCTCT GAGCAAACCC CTGTCCAGTC AGCCCCAGGC CATTGTCACA 1260 GAGGATAAGA CAGATATTTC TAGTGGCAGG GCTAGGCAGC AAGATGAGGA GATGCTTGAA 1320 CTCCCAGCCC CTGCTGAAGT GGCTGCCAAA AATCAGAGCT TGGAGGGGGA TACAACAAAG 1380 GGGACTTCAG AAATGTCAGA GAAGAGAGGA CCTACTTCCA GCAACCCCAG AAAGAGACAT 1440 CGGGAAGATT CTGATGTGGA AATGGTGGAA GATGATTCCC GAAAGGAAAT GACTGCAGCT 1500 TGTACCCCCC GGAGAAGGAT CATTAACCTC ACTAGTGTTT TGAGTCTCCA GGAAGAAATT 1560 AATGAGCAGG GACATGAGGT TCTCCGGGAG ATGTTGCATA ACCACTCCTT CGTGGGCTGT 1620 GTGAATCCTC AGTGGGCCTT GGCACAGCAT CAAACCAAGT TATACCTTCT CAACACCACC 1680 AAGCTTAGTG AAGAACTGTT CTACCAGATA CTCATTTATG ATTTTGCCAA TTTTGGTGTT 1740 CTCAGGTTAT CGGAGCCAGC ACCGCTCTTT GACCTTGCCA TGCTTGCCTT AGATAGTCCA 1800 GAGAGTGGCT GGACAGAGGA AGATGGTCCC AAAGAAGGAC TTGCTGAATA CATTGTTGAG 1860 TTTCTGAAGA AGAAGGCTGA GATGCTTGCA GACTATTTCT CTTTGGAAAT TGATGAGGAA 1920 GGGAFCCTGA TTGGATTACC CCTTCTGATT GACAACTATG TGCCCCCTTT GGAGGGACTG 1980 CCTATCTTCA TTCTTCGACT AGCCACTGAG GTGAATTGGG ACGAAGAAAA GGAATGTTTT 2040 GAAAGCCTCA GTAAAGAATG CGCTATGTTC TATTCCATCC GGAAGCAGTA CATATCTGAG 2100 GAGTCGACCC TCTCAGGCCA GCAGAGTGAA GTGCCTGGCT CCATTCCAAA CTCCTGGAAG 2160 TGGACTGTGG AACACATTGT CTATAAAGCC TTGCGCTCAC ACATTCTGCC TCCTAAACAT 2220 TTCACAGAAG ATGGAAATAT CCTGCAGCTT GCTAACCTGC CTGATCTATA CAAAGTCTTT 2280 GAGAGGTGTT AAATATGGTT ATTTATGCAC TGTGGGATGT GTTCTTCTTT CTCTGTATTC 2340 CGATACAAAG TGTTGTATCA AAGTGTGATA TACAAAGTGT ACCAACATAA GTGTTGGTAG 2400 CACTTAACAC TTATACTTGC CTTCTGATAG TATTCCTTTA TACACAGTGG ATTGATTATA 2460 AATAAATAGA TGTGTCTTAA CATA 2484 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIS: (A) COMPRIMENTO: 756 aminoácidos (b) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 88 68 68 892 TBA ηθΐ βχν 9X8 usv ΘΤΙ 082 XTI usv BTV usv X9S 9TI 882 082 ds¥ tr[9 stD TT9 911 ni9 8X2 9TI j&S βχν ®TI usv dsv 002 dsv BTV TBA 9X1 ΠΤ9 TT9 881 usv εχΗ TBA X9S XTI βχν 0LX ni9 X9S ox<3 usv sxi Π91 ςςτ 08T ΠΘΊ dsv ηΤ9 TBA 9X1 9TI 881 OX<3 oxd BTV sii nei sxx 021 εττ ΤΤ9 dsv BTV 9X1 sjt 90T 9TI X9S BTV Π9Ί BTV ΔΤ9 06 ηθΊ dsv H9 U93 X9S uto 81 9TI dsv nai dsv ΠΤ9 sxi 88 9TI Πθί STX nai TT9 TT9 st! BTV dsv Π91 sxo usv 82 βχν UT9 ©TI TBA ηχ9 TTD 01 πθί βχν βχν ®TI TBA TI9

QLZ nsi J9S 9X lL X9g ΠΙ9 882 std ST1 εχΐ ΙΒΔ J9S OPZ U9J BTV nei exi sxi 022 Χ«Λ eiV as¥ TI9 ua.3 ςοζ oxd πθί 9XJ βΧΥ ISA 0 6 X aei X9S ΘΙΙ TT9 BTV SZ.T 911 sji TT9 Jjl ΠΙ9 09T BTV 9TI us¥ χχΐ U93 OH TI9 ei¥ sxo OJd sxi 821 BTV βχν Jtj, BTV SJD 0X1 SXH ei¥ ΤΒΛ sxw X9S 86 9XJ, X9S ®XI J9S ei¥ 08 u93 βχν ηχ9 sxo Tba 09 usv ds ¥ ui9 9TI UT9 Çfr UT9 9TI X9S 9X1 X9S οε 911 BTV usv BIV OXd 8T ΤΒΛ ΤΒΔ 9X£ niD dsv 092

U93 ΠΘΊ πθχ U9.3 9X1 8H XTI ΤΤ9 usv ΔΘΚ εχΐ 822 9TI τϊθτ ΠΤ9 βχν 0X2 TBA 9X1 X9S BTV USV 86Τ UT9 εχΊ εχτ ΤΒΛ X9S 08Τ TT9 τ*λ ΤΒΛ ηχο πθί 89T BTV 3ΤΊ βχν βχν 9*1 ςη UT9 9X1 ΤΤ9 UT9 USV οετ TT9 dsv X9S χχΐ X9S 8ΤΤ 9X1 9X1 9X1 9X1 ΤΒΛ 001 TT9 βχν U9d ΤΤ9 χχΐ 88 Π9Τ ST1 X9S 9X1 9X1 0 L 89 βχν ΘΤΙ ΤΤ9 9X1 ΤΤ9 08 ΠΤ9 εχΐ ΤΒΛ ΘΤΙ ΤΒΛ 88 ni9 9ΤΙ T9W ηΐ9 εχΐ 02 H¥ BTV 9X1 βχν usv 8 Τ BTV ΤΒΛ U9J J9S dBW :ç :ON αΐ 03S :SI0N3flÕ3S ¥0 OV5lHDS3C1 (tx) euxe^oxd :¥ΊΩ03ΊΟΜ 3Q Odli (tx)

Arg Lis Ala Ile Glu Tre Vai Tir Ala Ala Tir Leu Pro Lis Asn Tre 275 280 285 His Pro Fen Leu Tir Leu Ser Leu Glu Ile Ser Pro Gin Asn Vai Asp 290 295 300 Vai Asn Vai His Pro Tre LiS His Glu Vai His Fen Leu His Glu Glu 305 310 315 320 Ser Ile Leu Glu Arg Vai Gin Gin His Ile Glu Ser Lis Leu Leu Gli 325 330 335 Ser Asn Ser Ser Arg Met Tir Fen Tre Gin Tre Leu Leu Pro Gli Leu 340 345 350 Ala Gli Pro Ser Gli Glu Met Vai Lis Ser Tre Tre Ser Leu Tre Ser 355 360 365 Ser Ser Tre Ser Gli Ser Ser Asp Lis Vai Tir Ala His Gin Met Vai 370 375 380 Arg Tre Asp Ser Arg Glu Gin Lis Leu Asp Ala Fen Leu Gin Pro Leu 385 390 395 400 Ser Lis Pro Leu Ser Ser Gin Pro Gin Ala Ile Vai Tre Glu Asp Lis 405 410 415 Tre Asp Ile Ser Ser Gli Arg Ala Arg Gin Gin Asp Glu Glu Met Leu 420 425 430 Glu Leu Pro Ala pro Ala Glu Vai Ala Ala Lis Asn Gin Ser Leu Glu 435 440 445 Gli Asp Tre Tre Lis Gli Tre Ser Glu Met Ser Glu Lis Arg Gli Pro 450 455 450 Tre Ser Ser Asn Pro Arg Lis Arg His Arg Glu AsP Ser Asp Vai Glu 465 470 475 480 Met Vai Glu Asp Asp Ser Arg Lis Glu Met Tre Ala Ala Cis Tre Pro 485 490 495 Arg Arg Arg Ile Ile Asn Leu Tre Ser Vai Leu Ser Leu Gin Glu Glu 500 505 510 Ile Asn Glu Gin Gli His GlU Vai Leu Arg Glu Met Leu His Asn His 515 520 525 Ser Fen Vai Gli Cis Vai Asn Pro Gin Trp Ala Leu Ala Gin His Gin 530 535 540 Tre Lis Leu Tir Leu Leu Asn Tre Tre Lis Leu Ser Glu Glu Leu Fen 545 550 555 560 Tir Gin Ile Leu Ile Tir Asp Fen Ala Asn Fen Gli Vai Leu Arg Leu 90 575 565 570

Ser Glu Pro Ala Pro Leu Fen Asp Leu Ala Met Leu Ala Leu Asp Ser 580 585 590 Pro Glu Ser Gli Trp Tre Glu Glu Asp Gli Pro Lis Glu Gli Leu Ala 595 600 605 Glu Tir Ile Vai Glu Fen Leu Lis Lis Lis Ala Glu Met Leu Ala Asp 610 615 620 Tir Fen Ser Leu Glu Ile Asp Glu Glu Gli Asn Leu Ile Gli Leu Pro 625 630 635 640 Leu Leu Ile Asp Asn Tir Vai pro PrO Leu Glu Gli Leu Pro Ile Fen 645 650 655 Ile Leu Arg Leu Ala Tre Glu Vai Asn Trp Asp Glu Glu Lis Glu Cis 660 665 670 Fen Glu Ser Leu Ser Lis Glu Cis Ala Met Fen Tir Ser Ile Arg Lis 675 680 685 Gin Tir Ile Ser Glu Glu Ser Tre Leu Ser Gli Gin Gin Ser Glu Vai 690 695 700 Pro Gli Ser Ile Pro Asn Ser Trp Lis Trp Tre Vai Glu His Ile Vai 705 710 715 720 Tir Lis Ala Leu Arg Ser His Ile Leu Pro Pro Lis His Fen Tre Glu 725 730 735 Asp Gli Asn Ile Leu Gin Leu Ala Asn Leu pro Asp Leu Tir Lis Vai 740 745 750

Fen Glu Arg Cis 755 (2) INFORMATION PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 397 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 91 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6 TGGCTGGATG CTAAGCTACA GCTGAAGGAA GAACGTGAGC ACGAGGCACT GAGGTGATTG 60 CCTGAAGGCA CTTCCGTTGA GCATCTAGAC GTTTCCTTGG CTCTTCTGGC GCCAAAATGT 120 CGTTCGTGGC AGGGGTTATT CGGCGGCTGG ACGAGACAGT GGTGAACCGC ATCGCGGCGG 180 GGGAAGTTAT CCAGCGGCCA GCTAATGCTA TCAAAGAGAT GATTGAGAAC TGGTACGGAG 240 GGAGTCGAGC CGGGCTCACT TAAGGGCTAC GACTTAACGG GCCGCGTCAC TCAATGGCGC 300 GGACACGCCT CTTTCCCCGG GCAGAGGCAT GTACAGCGCA TGCCCACAAC GGCGGAGGCC 360 GCOGGGTTCC CTACGTGCCA TAAGCCTTCT CCTTTTC 397 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 393 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 7: AAACACGTTA ATGAGGCACT ATTGTTTGTA TTTGGAGTTT GTTATCATTG CTTGGCTCAT 60 ATTAAAATAT GTACATTAGA GTAGTTGCAG ACTGATAAAT TATTTTCTGT TTGATTTGCC 120 AGTTTAGATG CAAAATCCAC AAGTATTCAA GTGATTGTTA AAGAGGGAGG CCTGAAGTTG 180 ATTCAGATCC AAGACAATGG CACCGGGATC AGGGTAAGTA AAACCTCAAA GTAGCAGGAT 240 GTTTGTGCGC TTCATGGAAG AGTCAGGACC TTTCTCTGTT CTGGAAACTA GGCTTTTGCA 300 GATGGGATTT TTTCACTGAA AAATTCAACA CCAACAATAA ATATTTATTG AGTACCTATT 360 ATTTGCGGGG CACTGTTCAG GGGATGTGTC AGf 393 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 352 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples 92 (D) TOPOLOGIA: linear {ii> TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 8: TTTCCTGGAT TAATCAAGAA ATGGAATCA AAGAGATTTG GAAAATGAGT AACATGATTA 60 TTTACTCATC TTTTTGGTAT CTAACAGAAA GAAGATCTGG ATATTGTATG TGAAAGGTTC 120 ACTACTAGTA AACTGCAGTC CTTTGAGGAT TTAGCCAGTA TTTCTACCTA TGGCTTTCGA 180 GGXGAGGTAA GCTAAAGATT CAAGAAATGT 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(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 10: TTGATATGAT TTTCTCTTTT CCCCTTGGGA TTAGTATCTA TCTCTCTACI GGATATTAAT 60 TTGTTATATT TTCTCATTAG AGCAAGTTAC TCAGATGGAA AACTGAAAGC CCCTCCTAAA 120 CCATGTGCTG GCAATCAAGG GACCCAGATC ACGGTAAGAA TGGTACATGG GAGAGTAAAT 180 TGTTGAAGCT TTGTTTGTAT AAATATTGGA ATAAAAAATA AAATTGCTTC TAAGTTTTCA 240 GGGTAATAAT AAAATGAATT TGCACTAGTT AATGGAGGTC CCAAGATATC CTCTAAGCAA 300 GATAAATGAC TATTGGCTTT TTGGGATGGC AGCCTG 336 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 275 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 11: GCTTTTGCCA GGACCATCTT GGGTTTTATT TTCAAGTACT TCTATGAATT TACAAGAAAA 60 ATCAATCTTC TGTTCAGGTG GAGGACCTTT TTTACAACAT AGCCACGAGG AGAAAAGCTT 120 TAAAAAATCC AAGTGAAGAA TATGGGAAAA TTTTGGAAGT TGTTGGCAGG TACAGTCCAA 180 AATCTGGGAG TGGGTCTCTG AGATTTGTCA TCAAAGTAAT GTGTTCTAGT GCTCATACAT 240 TGAACAGTTG CTGAGCTAGA TGGTGAAAAG TAAAA 275 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 389 pares de bases 94 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ 10 NO: 12: CAGCAACCTA TAAAAGTAGA GAGGAGTCTG TGTTTTGACG CAGCACCTTT AGCATTTTTA 60 TTTGGATGAA GTTTCTGCTG GTTTATTTTT CTGTGGGTAA AATATTAATA GGCTGTATGG 120 AGATATTTTT CTTTATATGT ACCTTTGTTT AGATTACTCA ACTCCACTAA TTTATTTAAC 180 TAAAAGGGGG CTCTGACATC TAGTGTGTGT TTTTGGCAAC TCTTTTCTTA CTCTTTTGTT 240 TTTCTTTTCC AGGTATTCAG TACACAATGC AGGCATTAGT TTCTCAGTTA AAAAAGTAAG 300 TTCTTGGTTT ATGGGGGATG GTTTTGTTTT ATGAAAAGAA AAAAGGGGAT TTTTAATAGT 360 TTGCTGGTGG AGATAAGGTT ATGATGffT 389 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 381 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: ATGTTTCAGT CTCAGCCATG AGACAATAAA TCCTTGTGTC TTCTGCTGTT TGTTTATCAG 60 CAAGGAGAGA CAGTAGCTGA TGTTAGGACA CTACCCAATG CCTCAACCGT GGACAATATT 120 CGCTCCATCT TTGGAAATGC TGTTAGTCGG TATGTCGATA ACCTATATAA AAAAATCTTT 180 TAGATTTATT ATCTTGGTTT ATCATTCCAT CACATTATTT GGGAACCTTT CAAGATATTA 240 TGTGTGTTAA GAGTTTGCTT TAGTCAAATA CACAGGCTTG TTTTATGCTT CAGATTTGTT 300 AATGGAGTTC TTATTTCACG TAATCAACAC TTTCTAGCTG TATGTAATCT CCTAGATTCT 360 GTGGCGTGAA TCATGTGTIC T 381 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14: 95 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 526 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: ACTGAGTAGC GTAGGTGGGT GAGTGGGTGG GTGGGTGGGT GGGTGGATGG ATGGATGGGA 60 GGATGGGTGG GTGAATGGGT GAACAGACAA ATGGATaGAT GAATGGACAG GCACAGGACG 120 ACCTCAAATG GACCAAGTCT TCGGCGCCCT CATTTCACAA AGTTAGTTTA TGGGAAGGAA 180 CCTTGTGTTT TTAAATTCTG ATTCTTTTGT AATCTTTGAG TTTTGAGTAT TTTCAAAAGC 240 TTCAGAATCT CTTTTCTAAT AGAGAACTGA TAGAAATTGG ATGTGAGGAT AAAACCCTAG 300 CCTTCAAAAT GAATGGTTAC ATATCCAATG CAAACTACTC AGTGAAGAAG TGCATCTTCT 360 TACTCTTCAT CAACCGIAAG TTAAAAAGAA CCACATGGGA AATCCACTCA CAGGAAACAC 420 CCACAGGGAA TTTTATGGGA CCATGGAAAA ATTTCTGAGT CCAIAGGTTT GATTAAACAT 480 GGAGAAACCT CATGGCAAAG TTTGGTTTTA TTGGGAAGCA TGTATA 526 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 434 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: ATAGTGGGCT GCAAAGTGGC CACAGGTAAA QGTGCACCTT TCTTCCTGGG GATGTGATGT 60 GCATATCACT ACAGAAATGT CTTTCCTGAG GTGATGTCAT GACTTTGTGT GAATGTACAC 120 CTGTGJW;CTC ACCCCTCAGG ACAGTTTTGA ACTGGTTGCT TTCTTTTTAT TGTTTAGATC 180 96 GTCTGGTAGA ATCAACTTCC TTGAGAAAAG CCATAGAAAC AGTGTATGCA GCCTATTTGC 240 CCAAAAACAC ACACCCATTC CTGTACCTCA GGTAATGTAG CACCAAACTC CTCAACCAAG 300 ACTCACAAGG AACAGATGTT CTATCAGGCT CTCCTCTTTG AAAGAGATGA GCATGCTAAT 360 AGTACAATCA GAGTGAATCC CATACACCAC TGGCAAAAGG ATGTTCTGTC CCTTCTTACA 420 GGTACAAGGC ACAG 434 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 458 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: CTTACGCAAA GCTACACAGC TCTTAAGTAG CAGTGCCAAT ATTTGAACA ACTCAGACTC 60 GAGCCTGAGG TTTTGACCAC TGTGTCATCT GGCCTCAAAT CTTCTGGCCA CCACATACAC 120 CATATGTGGG CTTTTTCTCC CCCTCCCACT ATCTAAGGTA ATTGT1TCTCT CTTATTTTCC 180 TGACAGTTTA GAAATCAGTC CCCAGAATGT GGATGTTAAT GTGCACCCCA CAAAGCATGA 240 AGTTCACTTC CTGCACGAGG AGAGCATCCT GGAGCGGGTG CAGCAGCACA TCGAGAGCAA 300 GCTCCTGGGC TCCAATTCCT CCAGGATGTA CTTCACCCAG GTCAGGGCGC TTCTCATCCA 360 GCTACTTCTC TGGGGCCTTT GAAATGTGCC CGGCCAGACG TGAGAGCCCA GATTTTTGCT 420 GTIATTTAGG AACTTTTTTT GAAGTATTAC CTGGATAG 458 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 618 pares de bases (b) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (d) TOPOLOGIA: linear 97 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 17: gataattata cctcatacta gctictttct TAGTACTGCT CCATTTGGGG ACCTGTATAT 60 CTATACTTCT TATTCTGAGT CICTCCACTA TATATATATA TATATATATA TTTTTTTTTT 120 TTTTTTTTTT TAATACAGAC TTTGCTACCA GGACTTGCTG GCCCCTCTGG GGAGATGGTT 180 AAATCCACAA CAAGTCTGAC CTCGTCTTCT ACTTCTGGAA GTAGTGATAA GGTCTATGCC 240 CACCAGATGG TTCGTACAGA TTCCCGGGAA CAGAAGCTTG ATGCATTTCT GCAGCCTCTG 300 AGCAAACCCC TGTCCAGTCA GCCCCAGGCC ATTGTCACAG AGCATAAGAC AGATATTTCT 360 AGTGGCAGGG CTAGGCAGCA AGATGAGGAG ATGCTTGAAC TCCCAGCCCC TGCTGAAGTG 420

GcrGCCAAAA ATCAGAGCTT GGAGGGGGAT ACAACAAAGG GGACTTCAGA AATGICAGAG 480 AAGAGAGGAC CTACTTCCAG CAACCCCAGG TATGGCCTTT TGGGAAAAGT ACAGCCTACC 540 TCCTTTATTC TGTAATAAAA CTGCCTTCTA ACTTTGGCTT TTCATGAATC ACTTGCATCT 600 TCTCTCTGCC GACTTCCC 618 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 478 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CTGTGCTCCA CCACAGGTCA TCCAGCTCTC TAGACCAGCC CAGAGAAGTT GCTTGCTCCC 60 AAATCCAACC CACAAAATTT GGCTAAGTTT AAAAACAAGA ATAATAATGA TCTGCACTTC 120 CTTTTCTTCA TTCCAGAAAG AGACATCGGG AAGATTCTGA TGTGGAAATG GTGGAAGATG 180 ATTCCCGAAA GGAAATGACT GCAGCTTGTA CCCCCCGGAG AAGGATCATT AACCTCACTA 240 GTGTTTTGAG TCTCCAGGAA GAAATTAATG AGCAGGGACA TGAGGGTACG TAAACGCTGT 300 GGCCTGCCTG GGATGCATAG GGCCTCAACT GCCAAGGTTT TGGAAATGGA GAAAGCAGTC 360 ATGTTGTCAG AGTGGCACTA CAGTTTTGAT GGGCAAGCTC CTCTTCCTTT ACTAACCCAC 420 AATAGCATCA CCTTAAAGAC AATTTTTGAT TGGGAQAAAA GGGAGAAAAT AATCTCTG 478 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19: 98 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 377 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 19: CAGTTTTCAC CAGGAGGCTC AAATCAGGCC TTTGCTTACT TGGTGTCTCT AGTTCTGGTC 60 CCTGGTGCTT TGGTCAATGA AGTGGGGTTG GTAGGATTCT ATTACTTACC TGTTTTTTGG 120 TTTTATTTTT TGTTTTGCAG TTCTCCGGGA GATGTTGCAT AACCACTCCT TCGTGGGCTG 180 TGTGAATCCT CAGTGGGCCT TGGCACAGCA TCAAACCAAG TTATACCTTC TCAACACCAC 240 CAAGCTTAGG TAAATCAGCT GAGTGTGTGA ACAAGCAGAC CTACTACAAC AATCCTCCAC 300 GGAGCACAGG CACAAAAGCT AAGGAGAGCA CCATGAAGGT AGTTGGGAAG GGCACAGGCT 360 TTGGAGTCAG CACATGT 377 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIS: (A) COMPRIMENTO: 325 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIS: SEQ ID NO: 20: CCCCTCGTTG AAGCGTTGGA ATCCCACTCT TTGGAAGATT GTCTTAGACT CTTAACCAGA 60 TTCCACAGCC ACGGAGAACT ATGTCTGTCf CATCCAIGTG TCAGGGATTA CGTCTCCCAT 120 TTGTCCCAAC TGGTTGTATC TCAAGCATGA ATTCAGCTTT TCCTTAAAGT CACTTCATTT 180 TTATTTTCAG TGAAGAACTG TTCTACCAGA TACTCATTTA TGATTTTGCC AATTTTGCTG 240 TTCTCAGGTT ATCGGTAAGT TTÃGATCCTT TTCACTTCIG ACATTTCAAC TGAGCGCCCC 300 GCAAACAGTA GCTCTCCACT AAATA 325 99 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 341 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: CATTTATGGT TTCTCACCTG CCATTCTGAT AGTGGATTCT TGGGAATTCA GGCTTCATTT 60 GGATGCTCCG TTAAAGCTTG CTCCTTCATG TTCTTGCTTC TTCCTAGGAG CCAGCACCGC 120 TCTTTGACCT TGCCATGCTT GCCTTAGATA GTCCAGAGAG TGGCTGGACA GAGGAAGA1G 180 GTCCCAAAGA AGGACTfGCT GAATACATTG TTGAGTTTCT GAAGAAGAAG GCTGAGATGC 240 TTGCAGACTA TTTCTCTTTG GAAATTGATG AGGTGTGACA GCCATTCTTA TACTTCTGTT 300 GTATTCTCCA AATAAAATTT CCAGCCGGGT GCATTGGCTCA 341 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 260 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN A (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: CAGATAGGAG GCACAAGGCC TGGGAAAGGC ACTGGAGAAA TGGGATTTGT TTAAACTATG 60 ACAGCATTAX TTCTTGTTCC CTTGTCCTTT TTCCTGCAAG CAGGAAGGGA ACCTGATTGG 120 AITACCCCTT CTGATTGACA ACfATGfGCC CCCTTTGGAG GGACTGCCIA TCTTCATTCT 180 TCGACTAGCC ACTGAGGTCA GTGATCAAGC AGATACTAAG CATTTCGGTA CATGCATGTG 240 TGCTGGAGGG AAAGGGCAAA 260 100 575 565 570

Ser Glu Pro Ala Pro Leu Fen Asp Leu Ala Met Leu Ala Leu Asp Ser 580 585 590 Pro Glu Ser Gli Trp Tre Glu Glu Asp Gli Pro Lis Glu Gli Leu Ala 595 600 605 Glu Tir Ile Vai Glu Fen Leu Lis Lis Lis Ala Glu Met Leu Ala Asp 610 615 620 Tir Fen Ser Leu Glu Ile Asp Glu Glu Gli Asn Leu Ile Gli Leu Pro 625 630 635 640 Leu Leu Ile Asp Asn Tir Vai pro PrO Leu Glu Gli Leu Pro Ile Fen 645 650 655 Ile Leu Arg Leu Ala Tre Glu Vai Asn Trp Asp Glu Glu Lis Glu Cis 660 665 670 Fen Glu Ser Leu Ser Lis Glu Cis Ala Met Fen Tir Ser Ile Arg Lis 675 680 685 Gin Tir Ile Ser Glu Glu Ser Tre Leu Ser Gli Gin Gin Ser Glu Vai 690 695 700 Pro Gli Ser Ile Pro Asn Ser Trp Lis Trp Tre Vai Glu His Ile Vai 705 710 715 720 Tir Lis Ala Leu Arg Ser His Ile Leu Pro Pro Lis His Fen Tre Glu 725 730 735 Asp Gli Asn Ile Leu Gin Leu Ala Asn Leu pro Asp Leu Tir Lis Vai 740 745 750

Fen Glu Arg Cis 755 (2) INFORMATION PARA A SEQ ID NO: 6: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 397 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 91 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6 TGGCTGGATG CTAAGCTACA GCTGAAGGAA GAACGTGAGC ACGAGGCACT GAGGTGATTG 60 CCTGAAGGCA CTTCCGTTGA GCATCTAGAC GTTTCCTTGG CTCTTCTGGC GCCAAAATGT 120 CGTTCGTGGC AGGGGTTATT CGGCGGCTGG ACGAGACAGT GGTGAACCGC ATCGCGGCGG 180 GGGMGTTAT CCAGCGGCCA GCTAATGCTA TCAAAGAGAT GATTGAGAAC TGGTACGGAG 240 GGAGTCGAGC CGGGCTCÃCT TAAGGGCTAC GACTTAACGG GCCGCGTCAC TCAATGGCGC 300 GGACACGCCT CTTTCCCCGG GCAGAGGCAT GTACAGCGCA TGCCCACAAC GGCGGAGGCC 360 GCOGGGTTCC CTACGTGCCA TAAGCCTTCT CCTTTTC 397 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 393 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: AAACACGTIA ATGAGGCACT ATTGTTTGTA TTTGGAGTTT GTTATCATTG CTTGGCTCAT 60 ATTAAAATAT GTACATTAGA GTAGTTGCAG ACTGATAAAT TATTTTCTGT TTGATTTGCC 120 AGTTTAGATG CAAAATCCAC AAGTATTCAA GTGATTGTTA AAGAGGGAGG CCTGAAGTTG 180 ATTCAGATCC AAGACAATGG CACCGGGATC AGGGTAAGTA AAACCTCAAA GTAGCAGGAT 240 GTTTGTGCGC TTCATGGAAG AGTCAGGACC TTTCTCTGTT CTGGAAACTA GGCTTTTGCA 300 GATGGGATTT TTTCACTGAA AAATTCAACA CCAACAATAA ATATTTATTG AGTACCTATT 360 ATTTGCGGGG CACTGTTCAG GGGATGTGTC AGT 393 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 352 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples 92 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: TTTCCTGGAT TAATCAAGAA ATGGAATCA AAGAGATTTG GAAAATGAGT AACATGATTA SO TTTACTCATC TTTTTGGTAT CTAACAGAAA GAAGATCTGG ATATTGTATG TGAAAGGTTC 120 ACTACTAGTA AACTGCAGTC CTTTGAGGAT TTAGCCAGTA TTTCTACCTA TGGCTTTCGA 180 GGTGAGGTAA GCTAAAGATT CAAGAAATGT GTAAAATATC CTCCTGTGAT GACATTGTCT 240 GTCATTTGTT AGTATGTATT TCTCAACATA GATAAATAAG GTTTGGTACC TTTTACTTGT 300 TAAATGTAIG CAAATCTGAG CAAACTTAAT GAACTTTAAC TTTCAAAGAC TG 352 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 287 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: TGGAAGCAGC GCAGATAAC CTTTCCCTTT GGTGAGGTGA CAGTGGGTGA CCCAGCAGTG 60 AGTTTTTCTT TCAGTCTATT TTCTTTTCTT CCTTAGGCTT TGGCCAGCAT AAGCCATGTG 120 GCTCATGTTA CTATTACAAC GAAAACAGCT GATGGAAAGT GTGCATACAG GTATAGTGCT 180 GACTTCTTTf ACTCATATAT AfTCATTCTG AAATGTATTT TGGGCCTAGG TCTCAGAGTA 240 ATCCTGTCTC AACACCAGTG TTATCTTTGG CAGAGATCTT GAGTACG 287 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 336 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 93 (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: TTGATATGAT TTTCTCTTTT CCCCTTGGGA TTAGTATCTA TCTCTCTACT GGATATTAAT 60 TTGTTATATT TTCTCATTAG AGCAAGTTAC TCAGATGGAA AACTGAAAGC CCCTCCTAAA 120 CCATGTGCTG GCAATCAAGG GACCCAGATC ACGGTAAGAA TGGTACATGG GAGAGTAAAT 180 TGTTGAAGCT TTGTTTGTAT AAATATTGGA ATAAAAAATA AAATTGCTTC TAAGTTTTGA 240 GGGTAATAAT AAAATGAATT TGCACTAGTT AATGGAGGTC CCAAGATATC CTCTAAGCAA 300 GATAAATGAC TATTGGCTTT TTGGCATGGC AGCCTG 336 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 275 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GCTTTTGCCA GGACCATCTT GGGTTTTATT TTCAAGTACT TCTATGAATT TACAAGAAAA 60 ATCAATCTTC TGTTCAGGTG GAGGACCTTT TTTACAACAT AGCCACGAGG AGAAAAGCTT 120 TAAAAAATCC AAGTGAAGAA TATGGGAAAA TTTTGGAAGT TGTTGGCAGG TACAGTCCAA 180 AATCTGGGAG TGGGTCTCTG AGATTTGTCA TCAAAGTAAT GTGTTCTAGT GCTCATACAT 240 TGAACAGTTG CTGAGCTAGA TGGTGAAAAG TAAAA 275 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 389 pares de bases 94 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ 10 NO: 12: CAGCAACCTA TAAAAGTAGA GAGGAGTCTG TGTTTTGACG CAGCACCTTT AGCATTTTTA 60 TTTGGATGAA GTTTCTGCTG GTTTATTTTT CTGTGGGTAA AATATTAATA GGCTGTATGG 120 AGATATTTTT CTTTATATGT ACCTTTGTTT AGATTACTCA ACTCCACTAA TTTATTTAAC 180 TAAAAGGGGG CTCTGACATC TAGTGTGTGT TTTTGGCAAC TCTTTTCTTA CTCTTTTGTT 240 TTTCTTTTCC AGGTATTCAG TACACAATGC AGGCATTAGT TTCTCAGTTA AAAAAGTAAG 300 TTCTTGGTTT ATGGGGGATG GTTTTGTTTT ATGAAAAGAA AAAAGGGGAT TTTTAATAGT 360 TTGCTGGTGG AGATAAGGTT ATGATGTTT 389 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 381 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: ATGTTTCAGT CTCAGCCATG AGACAATAAA TCCTTGTGTC TTCTGCTGlf TGTTTATCAG 60 CAAGGAGAGA CAGTAGCTGA TGTTAGGACA CTACCCAATG CCTCAACCGT GGACAATATT 120 CGCTCCATCT TTGGAAATGC TGTTAGTCGG TATGTCGATA ACCTATATAA AAAAATCTTT 180 TACATTTATT ATCTTGGTTT ATCATTCCAT CACATTATTT GGGAACCTTT CAAGATATTA 240 TGTGTGTTAA GAGTTTGCTT TAGTCAAATA CACAGGCTTG TTTTATGCTT CAGATTTGTT 300 AATGGAGTTC TTATTTCACG TAATCAACAC TTTCTAGCTG TATGTAATCT CCTAGATTCT 360 GTGGCGTGAA TCATGTGTTC T 381 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14: 95 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 526 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: ACTGAGTAGC GTAGGTGGGT GAGTGGGTGG GTGGGTGGGT GGGTGGATGG ATGGATGGGA 60 GGATGGGTGG GTGAATGGGT GAACAGACAA ATGGATeGAT GAATGGACAG GCACAGGACG 120 ACCTCAAATG GACCAAGTCT TCGGCGCCCT CATTTCACAA AGTTAGTTTA TGGGAAGGAA 180 CCTTGTGTTT TTAAATTCTG ATTCTTTTGT AATCTTTGAG TTTTGAGTAT TTTCAAAAGC 240 TTCAGAATCT CTTTTCTAAT AGAGAACTGA TAGAAATTGG ATGTGAGGAT AAAACCCTAG 300 CCTTCAAAAT GAATGGTTAC ATATCCAATG CAAACTACTC AGTGAAGAAG TGCATCTTCT 360 TACTCTTCAT CAACCGTAAG TTAAAAAGAA CCACATGGGA AATCCACTCA CAGGAAACAC 420 CCAGAGGGAA TTTTATGGGA CCATGGAAAA ATTTCTGAGT CCATAGGTTT GATTAAACAT 480 GGAGAAACCT CATGGCAAAG TTTGGTTTTA TTGGGAAGCA TGTATA 526 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N0: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 434 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: ATAGTGGGCT GCAAAGTGGC CACAGGTAAA GGTGCACCTT TCTTCCTGGG GATGTGATGT 60 GCATATCACT ACAGAAATGT CTTTCCTGAG GfGATGTCAT GACTTTGTGT GAATGTACAC 120 CfGTGACCTC ACCCCTCAGG ACAGTTTTGA ACTGGTTGCT TTCTTTTTAT fGTTTAGATC 180 96 GTCTGGTAGA ATCAACTTCC TTGAGAAAAG CCATAGAAAC AGTGTATGCA GCCTATTTGC 240 CCAAAAACAC ACACCCATTC CTGTACCTCA GGTAATGTAG CACCAAACTC CTCAACCAAG 300 ACTCACAAGG AACAGATGTT CTATCAGGCT CTCCTCTTTG AAAGAGATGA GCATGCTAAT 360 AGXACAATCA GAGTGAATCC CATACACCAC TGGCAAAAGG ATGTTCTGTC CCTTCTTACA 420 GGTACAAGGC ACAG 434 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 458 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: CTTACGCAAA GCTACACAGC TCTTAAGTAG CAGTGCCAAT ATTTGAACA ACTCAGACTC 60 GAGCCfGAGG TTTTGACCAC TGTGTCATCT GGCCTCAAAT CTTCTGGCCA CCACATACAC 120 CATATGTGGG CTTTTTCTCC CCCTCCCACT ATCTAAGGTA ATTGT' TCTCT CTTATTTTCC 180 TGACAGTTTA GAAATCAGTC CCCAGAATGT GGATGTTAAT GTGCACCCCA CAAAGCATGA 240 AGTTCACTTC CTGCACGAGG AGAGCATCCT GGAGCGGGTG CAGCAGCACA TCGAGAGCAA 300 GCTCCTGGGC TCCAATTCCT CCAGGATGTA CTTCACCCAG GTCAGGGCGC TTCTCATCCA 360 GCTACTTCTC TGGGGCCTTT GAAATGTGCC CGGCCAGACG TGAGAGCCCA GATTTTTGCT 420 GTTATTTAGG AACTTTTTTT GAAGTATTAC CTGGATAG 458 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 618 pares de bases (b) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (d) TOPOLOGIA: linear 97 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17 : GATAATTATA CCTCATACTA GCTTCTTTCT TAGTACTGCT CCATTTGGGG ACCTGTATAT 60 CTATACTTCT TATTCTGAGT CTCICCACTA TATATA1ATA TATATATATA TTTTTTTTTT 120 τττττΐϋ?τττ TAATACAGAC TTTGCTACCA ggacttgctg GCCCCTCTGG GGAGATGGTT 180 AAAICCACAA CAAGTCTGAC CTCGTCTTCT ACTTCTGGAA GTAGTGATAA GGTCTATGCC 240 CACCAGATGG TTCGTACAGA TTCCCGGGAA CAGAAGCTTG ATGCATTTCT GCAGCCTCTG 300 AGCAAACCCC TGTCCAGTCA GCCCCAGGCC ATTGTCACAG AGCATAAGAC AGATATTTCT 360 AGTGGCAGGG CTAGGCAGCA AGATGAGGAG ATGCTTGAAC TCCCAGCCCC TGCTGAAGTG 420 GcrGCCAAAA ATCAGAGCTT GGAGGGGGAT ACAACAAAGG GGACTTCAGA AATGTCAGAG 480 AAGAGAGGAC CTACTTCCAG CAACCCCAGG TATGGCCTTT TGGGAAAAGT ACAGCCTACC 540 TCCTTTATTC TGTAATAAAA CTGCCTTCTA ACTTTGGCTT TTCATGAATC ACTTGCATCT 600 TCTCTCTGCC GACTTCCC 618 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 478 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CTGTGCTCCA CCACAGGTCA TCCAGCTCTC TAGACCAGCC CAGAGAAGTT GCTTGCTCCC 60 AAATCCAACC CACAAAATTT GGCTAAGTTT AAAAACAAGA ATAATAATGA TCTGCACTTC 120 CTTTTCTTCA TTCCAGAAAG AGACATCGGG AAGATTCTGA TGTGGAAATG GTGGAAGATG 180 ATTCCCGAAA GGAAATGACT GCAGCTTGTA CCCCCCGGAG AAGGATCATT AACCTCACTA 240 GTGTTTTGAG TCTCCAGGAA GAAATTAATG AGCAGGGACA TGAGGGTACG TAAACGCTGT 300 GGCCTGCCTG GGATGCATAG GGCCTCAACT GCCAAGGTTT TGGAAATGGA GAAAGCAGTC 360 ATGTTGTCAG AGTGGCACTA CAGTTTTGAT GGGCAAGCTC CTCTTCCTTT ACTAACCCAC 420 AATAGCATCA CCTTAAAGAC AATTTTTGAT TGGGAQAAAA GGGAGAAAAT AATCTCTG 478 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19: 98 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 377 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: GAGTTTTCAC CAGGAGGCTC AAATCAGGCC TTTGCTTACT TGGTGTCTCT AGTTCTGGTC 60 CCTGGTGCTT TGGTCAATGA AGTGGGGTTG GTAGGATTCT ATTACTTACC TGTTTTTTGG 120 TTTTATTTTT TGTTTTGCAG TTCTCCGGGA GATGTTGCAT AACCACTCCT TCGTGGGCTG 180 TGTGAATCCT CAGTGGGCCT TGGCACAGCA TCAAACCAAG ITATACCTTC TCAACACCAC 240 CAAGCTTAGG TAAATCAGCT GAGTGTGTGA ACAAGCAGAC CTACTACAAC AATCCTCCAC 300 GGAGCACAGG CACAAAAGCT AAGGAGAGCA CCATGAAGGT AGTTGGGAAG GGCACAGGCT 360 TTGGAGTCAG CACATGT 377 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 325 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20: CCCCTCGTTG AAGCGTTGGA ATCCCACTCT TTGGAAGATT GTCTTAGACT CTTAACCAGA 60 TTCCACAGCC ACGCAGAACT ATGTCTGTCT CATCCATGTG TCAGGGATTA CGTCTCCCAT 120 TTGTCCCAAC TGGTTGTATC TCAAGCATGA ATTCAGCTTT TCCTTAAAGT CACTTCATTT 180 TTATTTTCAG TGAAGAACTG TTCTACCAGA TACTCATTTA TGATTTTGCC AATTTTGCTG 240 TTCTCAGGTT ATCGGTAAGT TTAGATCCTT TTCACTTCTG ACATTTCAAC TGACCGCCCC 300 GCAAACAGTA GCTCTCCACT AAATA 325 99 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 341 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: CATTTATGGT TTCTCACCTG CCATTCTGAT AGTGGATTCT TGGGAATTCA GGCTTCATTT 60 GGATGCTCCG TTAAAGCTTG CTCCTTCATG TTCTTGCTTC TTCCTAGGAG CCAGCACCGC 120 TCTTTGACCT TGCCATGCTT GCCTTAGATA GTCCAGAGAG TGGCTGGACA GAGGAAGATG 180 GTCCCAAAGA AGGACTTGCT GAATACATTG TTGAGTTTCT GAAGAAGAAG GCTGAGATGC 240 TTGCAGACTA TTTCTCTTTG GAAATTGATG AGGTGTGACA GCCATTCTTA TACTTCTGTT 300 GTATTCTCCA AATAAAATTT CCAGCCGGGT GCATTGGCTCA 341 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 260 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN A (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: CAGATAGGAG GCACAAGGCC TGGGAAAGGC ACtGGAGAAA TGGGATTTGT TTAAACTATG 60 ACAGCATTAT TTCTTGTTCC CTTGTCCTTT fTCCTGCAAG CAGGAAGGGA ACCTGATTGG 120 ATTACCCCTT CTGATTGACA ACTATGTGCC CCCTTTGGAG GGACTGCCTA TCTTCATTCT 180 TCGACTAGCC ACTGAGGTCA GTGATCAAGC AGATACTAAG CATTTCGGTA CATGCATGTG 240 TGCTGGAGGG AAAGGGCAAA 260 100 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 340 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: CTATATCTTC CCAGCAATAT TCACAGTCCG TTTACAGTTT TAACGCCTAA AGTATCACAT 60 TTCGTTTTT AGCTTTAAGT AGTCTGTGAT CTCCGTTTAG AATGAGAATG TTTAAATTCG 120 TACCTATTTT GAGGTATTGA ATTTCTTTGG ACCAGGTGAA TTGGGACGAA GAAAAGGAAT 180 GTTTTGAAAG CCTCAGTAAA GAATGCGCTA TGTTCTATTC CATCCGGAAG CAGTACATAT 240 CTGAGGAGTC GACCCTCTCA GGCCAGCAGG TACAGTGGTC ATGCACACTG GCACCCCAGG 300 ACTAGGACAG GACCTCATAC ATCTTAGGAG ATGAAACTTG 340 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 563 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24: AATCCTCTTG TGTTCAGGCC TGTGGATCCC TGAGAGGCTA GCCCACAAGA TCCACTTCAA 60 AAGCCCTAGA TAACACCAAG TCTTTCCAGA CCCAGTGCAC ATCCCATCAG CCAGGACACC 120 AGTGTATGTT GGGATGCAAA CAGGGAGGCT TAfGACATCT AATGTGTTXT CCAGAGTGAA 180

GfGCCTGGCT CCATTCCAAA CTCCTGGAAG TGGACTGTGG AACACATTGT CTATAAAGCC 240 TTGCGCTCAC ACATTCTGCC TCCTAAACAT TTCACAGAAG ATGGAAATAT CCTGCAGCTT 300 101 GCTAACCTGC CTGATCTATA CAAAGTGTTT GAGAGGTGTT AAATATGGTT ATTTATGCAC 360 TGTGGGATGT GTTCTTCTTT CTCTGTATTC CGATACAAAG TGTTGTATCA AAGTGTGATA 420 TACAAAGTGT ACCAACATAA GTGTTGGTAG CACTTAAGAC TTATACTTGC CTTCTGATAG 480 TATTCCTTTA TACACAGTGG ATTGATTATA AATAAATAGA TGTGTCTTAA CATAATTTCT 540 TATTTAATTT TATTATGTAT ATA 563 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 137 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25: CTTGGCTCTT CTGGCGCCAA AATGTCGTTC GTGGCAGGGG TTATTCGGCG GCTGGACGAG 60 ACAGTGGTGA ACCGCATCGC GGCGGGGGAA GTTATCCAGC GGCCAGCTAA TGCTATCAAA 120 GAGATGATTG AGAACTG 137 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 91 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: TTTAGATGCA AAATCCACAA GTATTCAAGT GAITGTTAAA GAGGGAGGCC TGAAGTTGAT 60 TCAGATCCAA GACAATGGCA CCGGGATCAG G 91 102 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 27: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 99 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (O) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: AAAGAAGATC TGGATATTGT ATGTGAAAGG TTCACTACTA GTAAACTGCA GTCCTTTGAG 60 GATTTAGCCA GTAfTTCTAC CTATGGCfTT CGAGGTGAG 74 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (DO) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28: GCTTTGGCCA GCATAAGCCA TGTGGCTCAT GTTACTATTA CAACGAAAAC AGCTGATGGA 60 AAGTGTGCAT ACAG 74 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 pares de bases 103 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29: AGCAAGTTAC TCAGATGGAA AACTGAAAGC CCCTCCTAAA CCATGTGCTG GCAATCAAGG 60 GACCCAGATC ACG 73 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 92 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (O) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30: GTGGAGGACC TTTTTTACAA CATAGCCACG AGGAGAAAAG CTTTAAAAAA TCCAAGTGAA 60 GAATATGGGA AAATTTTGGA AGTTGTTGGC AG 92 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 104 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31: GTATTCAGTA CACAA IGCAG GCATT AGTTT CTCAGTTAAA AAA 43 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 32: (i) CARAC1ERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 89 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32: CAAGGAGAGA CAGTAGCTGA TGTTAGGACA CTACCCAATG CCTCAACCGT GGACAATATT 60 CGCTCCATCT TTGGAAATGC TGTTAGTCG 89 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 113 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33: AGAACTGATA GAAATTGGAT GTGAGGATAA AACCCTAGCC TTCAAAATGA ATGGTTACAT 60 ATCCAATGCA AACTACTCAG TGAAGAAGTG CATCTTCTTA CTCTTCATCA ACC 113 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 34: 105 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 94 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34: ATCGTCTGGT AGAATCAACT TCCTTGAGAA AAGCCATAGA AACAGTGTAT GCAGCCTATT 60 TGCCCAAAAA CACACACCCA TTCCTGTACC TCAG 94 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 154 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35: TTTAGAAATC AGTCCCCAGA ATGTGGATGT TAATGTGCAC CCCACAAAGC ATGAAGTTCA 60 CTTCCTGCAC GAGGAGAGCA TCCTGGAGCG GGTGCAGCAG CACATCGAGA GCAAGCTCCT 120 GGGCTCCAAT TCCTCCAGGA TGTACTTCAC CCAG 154 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 371 pares de bases 106 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36: ACTT1GCTAC CAGGACTTGC TGGCCCCTCT GGGGAGATGG TTAAATCCAC AACAAGTCTG 60 ACCTCGTCTT CTACTTCTGG AAGTAGTGAT AAGGTCTATG CCCACCAGAT GGTTCGTACA 120 GATTCCCGGG AACAGAAGCT TGATGCATTT CTGCAGCCTC TGAGCAAACC CCTGTCCAGT 180 CAGCCCCAGG CCATTGTCAC AGAGGATAAG ACAGATATTT CTAGTGGCAG GGCTAGGCAG 240 CAAGATGAGG AGATGCTTGA ACTCCCAGCC CCTGCTGAAG TGGCIGCCAA AAATCAGAGC 300 TTGGAGGGGG ATACAACAAA GGGGACTTCA GAAATGTCAG AGAAGAGAGG ACCTACTTCC 360 AGCAACCCCA G 371 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N0: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 149 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37: AAAGAGACAT CGGGAAGATT CTGATGTGGA AATGGTGGAA GATGATTCCC GAAAGGAAAT 60 GACTGCAGCT TGTACCCCCC GGAGAAGGAT CATTAACCTC ACTAGTGTTT TGAGTCTCCA 120 GGAAGAAATT AATGAGCAGG GACATGAGG 149 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 pares de bases 107 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38: TTCTCCGGGA GATGTTGCAT AACCACTCCT TCGTGGGCTG TGTGAATCCT CAGTGGGCCT 60 TGCCACAGCA TCAAACCAAG ITATACCTTC TCAACACCAC CAAGCTTAG 109 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 39: TGAAGAACTG TTCTACCAGA TACTCATTTA GATTTTGCC AATTTTGGTG TTCTCAGGTT 60 ATCG 64 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 165 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 108 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40: GAGCCAGCAC CGCTCTTTGA CCTTGCCATG CTTGCCTTAG ATAGTCCAGA GAGTGGCTGG 60 ACAGAGGAAG ATGGTCCCAA AGAAGGACTT GCTGAATACA TTGTTGAGTT TCTGAAGAAG 120 AAGGCTGAGA TGCTTGCAGA CTATTTCfCT TIGGAAATTO ATGAG 165 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 93 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 41: GAAGGGAACC TGATTGGATT ACCCCTTCTG ATTGACAACT ATGTGCCCCC TTTGGAGGGA 60 CTGCCTATCT TCATTCTTCG ACTAGCCACT GAG 93 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 114 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 42: GTGAATTGGG ACGAAGAAAA GGAATGTTTT GAAAGCCTCA GTAAAGAATG CGCTATGTTC 60 TATTCCATCC GGAAGCAGTA CATATCTGAG GAGTCGACCC TCTCAGGCCA GCAG 114 109 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 360 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 43: AGTGAAGTGC CTGGCTCCAT TCCAAACTCC TGGAAGTGGA CTGTGGAACA CATTGTCTAT 60 AAAGCCTTGC GCTCACACAT TCTGCCTCCT AAACATTTCA CAGAAGATGG AAATATCCTG 120 CAGCTTGCfA ACCTGCCTGA TCTATACAAA GTCTTTGAGA GGTGTTAAAT ATGGTTATTT 180 ATGCACTGTG GGATGTGTTC TTCTTTCTCT GTATTCCGAT ACAAAGTGTT GTATCAAAGT 240 GTGATATACA AAGTGTACA ACATAAGTGT TGGTAGCACT TAAGACTTAT ACTTCCCTTC 300 TGATAGTATT CCTTTATACA CAGTGGATTG ATTATAAATA AATAGATGTG TCTTAACATA 360 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 {D) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota = "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" 110 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 44: AGGCACTGAG GTGATTGGC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 iniciadores (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= " dirigidos ao ADN do intrão genómico 1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 45: TCGTAGCCCTTAAGTGAGC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: 111 (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO' 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 46: AATATGTACA TTAGAGTAGT TG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 47: CAGAGAAAGG TCCTGACTC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 112 (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= " iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 48: AGAGATTTGG AAAATGAGTA AC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 49: ACAATGTCAT CACAGGAGG 19 113 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 50: AACCTTTCCC TTTGGTGAGG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" 114 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 51: GATTACTCTG AGACCTAGGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 52: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 52: GATTTTCTCT TTTCCCCTTG GG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc feature 115 (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (Ο) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 53: CAAACAAAGC TTCAACAATT TAC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 54: GGGTTTTATT TTCAAGTACT TCTATG 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 116 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 55: GCTCAGCAAC TGTTCAATGT ATGAGC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 56: CTAGTGTGTG TTTTTGGC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases 117 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 57: CATAACCTTA TCTCCACC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 58: (X) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / notâ= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 58: CTCAGCCÃTG AGACAATAAA TCC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 59: 118 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 59: GGTTCCCAAA TAATGTGATG G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 60: 119 18

CAAAAGCTTC AGAATCTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 61: CTGTGGGTGT TTCCTGTGAG TGG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 120 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" Çxí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 62: CATGACTTTG TGTGAATGTA CACC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 63: GAGGAGAGCC TGATAGAACA TCTG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 121 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 64: GGGCTTTTTC TCCCCCTCCC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 65: AAAATCTGGG CTCTCACG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases 122 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 66: AATTATACCT CATACTAGC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: irdsc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 67: GTTTTATTAC AGAATAAAGG AGG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 68: 123 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucieico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 68: AAGCCAAAGT TAGAAGGCA 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucieico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota = "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 69: 124 20

IGCAACCCAC MAATTTGGC (2) INFORMAÇÃO PARA A 3EQ ID NO: 70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 70: CTTTCTCCA TTTCCAAAACC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc__feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 125 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 71: TGGTGTCTCT AGTTCTGG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 72: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (d) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc feature 126 (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (Ο) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do Intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:72: CATTGTTGTA GTAGCTCTGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 73: CCCATTTGTC CCAACTGG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples 127 (D) TOPOLOGIA: linear (íx) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 74: CGGTCAGTTG AAATGTCAG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc^feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 75: CATTTGGATG CTCCGTTAAA GC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 128 (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 "iniciadores (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota = dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 76 CACCCGGCTG GAAATTTTAT TTG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc^feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 iniciadores (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 77: GGAANGGCAC TGGAGAAATG GG 22 129 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 78: CCCTCCAGCA CACATGCATG TACCG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" 130 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 79: TAAGTAGTCT GTGATCTCCG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 80: ATGTATGAGG TCCTGTCC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc feature 131 EB) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrâo genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 81: GACACCAGTG TATGTTGG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 82: GAGAAAGAAG AACACATCCC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 132 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 83: TGTAAAACGA CGGCCAGTCA CTGAGGTGAT TGGCTGAA 38 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota = "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 84: TAGCCCTTAA GTGAGCCCG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases 133 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 iniciadores (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= ' dirigidos ao ADN do intrão genómico" 38

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 85: TGTAAAACGA CGGCCAGTTA CATTAGAGTA GTTGCAGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 iniciadores (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / notã= ' dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 86: AGGTCCTGAC TCTTCCATG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 87: 134 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 87: TGTAAAACGA CGGCCAGTTT GGAAAATGAG TAACATGATT 40 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 88: 135 19

TGTCATCACA GGAGGATAT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc __f eature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 "iniciadores (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / notã= dirigidos ao ADN do intrão genómico" 38

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 89 TGTAAAACGA CGGCCAGTCT TTCCCTTTGG TGAGGTGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 136 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 90: TACTCTGAGA CCTAGGCCCA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 91: TGTAAAACGA CGGCCAGTTC TCTTTTCCCC TTGGGATTAG 40 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 137 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 92: ACAAAGCTTC AACAATTTAC TCT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 93: TGTAAAACGA CGGCCAGTGT TTTATTTTCA AGTACTTCTA TGAATT 46 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases 138 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 94: CAGCAACTGT TCAATGTATG AGCACT 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 95: TGTAAAACGA CGGCCAGTGT GTGTGTTTTT GGCAAC 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 96: 139 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 96: AACCTTATCT CCACCAGC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 97: 140 41

TGTAAAACGA CGGCCAGTAG CCATGAGACA ATAAATCCTT G (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc__f eature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 98: TCCCAAATAA TGTGATGGAA TG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 141 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do íntrão genórtiico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 99: TGTAAAACGA CGGCCAGTAA GCTTCAGAAT CTCTTTT 37 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc__feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 100: TGGGTGTTTC CTGTGAGTGG ATT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 142 (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOME/CHAVE: mísc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 101: TGTAAAACGA CCGCCAGTAC TTTGTGTGAA TGTACACCTG TG 42 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 102: GAGAGCCTGA TAGAACATCT GTTG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 103: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases 143 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota- "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 103: TGTAAAACGA CGGCCAGTCT TTTTCTCCCC CTCCCACTA 39 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / ncta= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 104: TCTGGGCTCT CACGTCT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 105: 144 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 105: CTTATTCTGA GTCTCTCC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feâture (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota- "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 106: 145 35

TGTAAAACGA CGGCCAGTGT TTGCTCAGAG GCTGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do íntrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 107: GATGSTTCGT ACAGATTCCC G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 146 iniciadores (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota- dirigidos ao ADN do intrão genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 108: TGTAAAACGA CGGCCAGTTT ATTACAGAAT AAAGGAGGTA G 41 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota- "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 109: TGTAAAACGA CGGCCAGTAA CCCACAAAAT TTGGCTAAG 39 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 147 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mísc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 110: TCTCCATTTC CAAAACCTTG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 111: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 111: TGTCTCTAGT TCTGGTGC 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 112: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases 148 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 112: TGTAAAACGA CGGCCAGTTG TTGTAGTAGC TCTGCTTG 38 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 113: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 113: ATTTGTCCCA ACTGGTTGTA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 114: 149 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (XÍ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 114: TGTAAAACGA CGGCCAGTTC AGTTGAAATG TCAGAAGTG 39 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 115: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota- "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " 150 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 115: TGTAAAACGA CGGCCAGT 18 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 116: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (0) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 116: CCGGCTGGAA ATTTTATTTG GAG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 117: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO; ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mísc feature 151 (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (Ο) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota = "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómíco " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 117: TGTAAAACGA CGGCCAGTAG GCACTGGAGA AATGGGATTTG 41 (2) INFORMAÇÃO PAPA A SEQ ID NO: 118: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 118: TCCAGCACAC ATGCATGTAC CGAAAT 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 119: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 152 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 119: GTAGTCTGTG ATCTCCGTTT 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 120: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota~ "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 120: TGTAAAACGA CGGCCAGTTA TGAGGTCCTG TCCTAG 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 121: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases 153 (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 121: ACCAGTGTAT GTTGGGATG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 122: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (O) OUTRA INFORMAÇÃO: / nota= "iniciadores dirigidos ao ADN do intrão genómico " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 122: TGTAAAACGA CGGCCAGTGA AAGAAGAACA CATCCCACA 39 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 123: 154 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 770 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 123:

Met Ser Leu Arg Ile Lis Ala Leu Asp Ala Ser Vai Vai Asn Lis Ile 1 5 10 15 Ala Ala Gli Glu Ile Ile Ile Ser Pro Vai Asn Ala Leu Lis Glu Met 20 25 30 Met Glu Asn Ser Ile Asp Ala Asn Ala Tre Met Ile Asp Ile Leu Vai 35 40 45 Lis Glu Gli Gli ile Lis Vai Leu Gin Ile Tre Asp Asn Gli Ser Gli 50 55 60 Ile Asn Lis Ala Asp Leu Pro Ile Leu Cis Glu Arg Fen Tre Tre Ser 65 70 75 80 Lis Leu Gin Lis Fen Glu Asp Leu Ser Gin Ile Gin Tre Tir Gli Fen 85 90 95 Arg G1 i Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser His Vai Ala Arg Vai Tre Vai 100 105 110 Tre Tre Lis Vai Lis Glu Asp Arg Cis Ala Trp Arg Vai Ser Tir Ala 115 120 125 Glu Gli Lis Met Leu Glu Ser Pro Lis Pro Vai Ala Gli Lis Asp Gli 130 135 140 Tre Tre Ile Leu Vai Glu Asp Leu Fen Fen Asn Ile Pro Ser Arg Leu 145 150 155 160 Arg Ala Leu Arg Ser His Asn Asp Glu Tir Ser Lis Ile Leu Asp Vai 165 170 175 Vai Gli Arg Tir Ala Ile His Ser Lis Asp Ile Gli Fen Ser Cis Lis 180 185 190 Lis Fen Gli Asp Ser Asn Tir Ser Leu Ser Vai Lis Pro Ser Tir Tre 195 200 205 155 951 951 nax 118¾ I^A us¥ IBA biY r* 10 εχΊ Odi X©A biY ©II dxx TI0 dsv STX 96fr 06% 98t jas ©TI oJd nari ei¥ usv sH ηχ9 dsv dsv BXV ©II das Odd Tt? A SJX 0 XX 99 09^ 9LV ττχ d 8¾ TT0 nei UT9 sii UX0 stx STX εχΐ Odd UT0 dsv STl ΠΘΊ dsv Q9fr 991 09£ USV dsv usv ©xi ©dx uε¾ bX¥ dsv fid¥ Odi UT0 ηχ9 das ni0 usv nax sn Off 9Zf MI nai sfl ηχ0 5 XV ηχ0 UXD das sth das XBA usv ©dl TeA st-t Odd 92fr 0Z% ni0 d©s nai UI9 βαν st<i adx das das TX0 UX0 uai usv uai UI9 UT0 çn OXí' SOI' das I3S aas Α©Ί uai das 33· ÍL ©XI εχΐ BTY uxs d©s εχν dsv ©Π Êdv OOfr 969 069 989 ΤΒΛ nai STX US¥ ηχ0 UX0 βαν ΒΤΊ BX¥ stx Êd¥ nai UX0 das usv Βχν 089 9X9 0X9 ©dl adi ατχ ias USV ΠΧ0 ΧΒΛ X©A uxo BXV UX0 βαν nax das STX ÉdV S99 099 999 USV ÕJY dsv das ni0 ©II aax dsv usv uai odd ©II nax das ήχο Odd ose 0t?9 sth USV aux d©S ©XI jas aas BXV STX uai 33il, biY das dux dsv ©XI ςεε οεε 929 ©XV d©S nai ηχ0 BXV STH n©i UX0 USV BT¥ aXI sn ηχ0 ©XI θχΐ ήχο 029 ςχε οχε 909 dsv UT0 das nai uai ÈdV T©A nxs βαν STX Θ3Χ Odd sth ΧΒΛ usv ΧΒΛ ooe 962 062 dsv ΤΘΛ 6χγ 51¾ Odá dsv ©xi TBA 911 TTD nax dTI ©XI uai Odd δ αν 982 082 9X2 uai TIO sti oia nax ατχ usv das ατχ T*A 33S ds¾ nax BXV 6iv èdV OLZ 992 092 nai ' naX ‘ ds¾ ST0 33 Jj X«A nai 6av usv USV ©XI uai uai ©II nax d©S 992 sxi TT3 ds¥ TÇA 922 uai ©dx ©ΤΙ πθί 012 βαν dsv utq χβλ οςζ ^1 ΘΤΙ αθδ s-çrj εΤΊ aas ©ΤΙ uai usv nax 118¾ sx0 Ι^Λ ςεζ οεζ ΟϊΖ αθδ ηγ9 ΒΘ1 usv ΠΘ1 dsv ηχ9 ΤβΛ επ das ©H STH 022 512 usv jaS ΒΤΥ ΐΒΛ das sti 118¾ uai χ©Λ ©dl θτι 500 505 510 Tre Ser Ile Lis Lis Leu Arg Glu Lis Vai Asp Asp Ser Ile His Arg 515 520 525 Glu Leu Tre Asp Ile Fen Ala Asn Leu Asn Tir Vai Gli Vai Vai Asp 530 535 540 Glu Glu Arg Arg Leu Ala Ala Ile Gin His Asp Leu Lis Leu Fen Leu 545 550 555 560 Ile Asp Tir Gli Ser Vai Cis Tir Glu Leu Fen Tir Gin Ile Gli Leu 565 570 575 Tre Asp Fen Ala Asn Fen Gli Lis Ile Asn Leu Gin Ser Tre Asn Vai 580 585 590 Ser Asp Asp Ile Vai Leu Tir Asn Leu Leu Ser Glu Fen Asp Glu Leu 595 600 605 Asn Asp Asp Ala Ser Lis Glu Lis Ile Ile Ser Lis Ile Trp Asp Met 610 615 620 Ser Ser Het Leu Asn Glu Tir Tir Ser Ile Glu Leu Vai Asn Asp Gli 625 630 635 640 Leu Asp Asn Asp Leu Lis Ser Vai Lis Leu Lis Ser Leu Pro Leu Leu 645 650 655 Leu Lis Gli Tir Ile Pro Ser Leu Vai Lis Leu Pro Fen Fen Ile Tir 660 665 670 Arg Leu Gli Lis Glu Vai Asp Trp Glu Asp Glu Gin Glu Cis Leu Asp 675 680 685 Gli Ile Leu Arg Glu lie Ala Leu Leu Tir Ile Pro Asp Met Vai Pro 690 695 700 Lis Vai Asp Tre Leu Asp Ala Ser Leu Ser Glu Asp Glu Lis Ala Gin 705 710 715 720 Fen Ile Asn Arg Lis Glu Mis Ile Ser Ser Leu Leu Glu His Vai Leu 725 730 735 Fen Pro Cis Ile Lis Arg Arg Fen Leu Ala Pro Arg His Ile Leu Lis 740 745 750 Asp Vai Vai Glu Ile Ala Asn Leu Pro Asp Leu Tir Lis Vai Fen Glu 755 760 765

Arg Cis 770 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 124: 157 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 124:

Val Asn Arg Ile Ale Ala Gli Glu val Ile Gin Arg Pro Ala Asn Ala 1 5 10 15 Ile Lis Glu Met Ile Glu Asn Cis Leu Asp Ala Lis Fen Tre Ser Ile 20 25 30 Gin Val Ile Val Lis Glu Gli Gli Leu Lis Leu Ile Gin ile Gin Asp 35 40 45 Asn Gli Tre Gli Ile Arg Lis Glu Asp Leu Asp Ile Val Cis Glu Arg 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 125 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 125

Vai Asn Arg Ile Ala Ala Gli Glu Vai Ile Gin Arg Pro Ala Asn Ala 1 5 10 15

Ile Lis Glu Met Ile Glu Asn Cis Leu Asp Ala Lis Ser Tre Ser Ile 20 25 30 158

Gin Vai Ile Vai Lis Glu Gli Gli Leu Lis Leu Ile Gin He Gin Asp 35 40 45

Asn Gli Tre Gli Ile Arg Lis Glu Asp Leu Asp Ile Vai Cis Glu Arg 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 126: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 126

Pro Ala Asn Ala Ile Lis Glu Met Ile Glu Asn cis Leu Asp Ala Lis 15 10 15

Ser Tre Asn Ile Gin Vai Vai Vai Lis Glu Gli Gli Leu Lis Leu Ile 20 25 30

Gin Ile Gin Asp Asn Gli Tre Gli Ile Arg Lis Glu Asp Leu Asp Ile 35 40 45

Vai Cis Glu Arg 50 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 127: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 159 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 127

Vai Asn Lis Ile Ala Ala Gli Glu Ile Ile Ile Ser Pro Vai Asn Ala 15 10 15

Leu Lis Glu Met Met Glu Asn Ser Ile Asp Ala Asn Ala Tre Met Ile 20 25 30

Asp Ile Leu Vai Lis Glu Gli Gli Ile Lis Vai Leu Gin Ile Tre Asp 35 40 45

Asn Gli Ser Gli Ile Asn Lis Ala Asp Leu Pro Ile Leu Cis Glu Arg 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 128: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 128

Val His Arg Ile Tre Ser Gli Gin Val Ile Tre Asp Leu Tre Tre Ala 1 5 10 15 Val Lis Glu Leu Val Asp Asn Ser Ile Asp Ala Asn Ala Asn Gin Ile 20 25 30 Glu Ile Ile Fen Lis Asp Tir Gli Leu Glu Ser Ile Glu Cis Ser Asp 35 40 45 Asn Gli Asp Gli Ile Asp Pro Ser Asn Tir Glu Fen Leu Ala Leu Lis 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 129 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 160 (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 129 (XS 1-1 < Asn Gin Ile Ala Ala Gli Glu Vai Vai Glu Arg Pro Ala Ser Vai 1 5 10 15 1-1 <TS > Lis Glu Leu Vai Glu Asn Ser Leu Asp Ala Gli Ala Tre Arg Ile 20 25 30 Asp Ile Asp Ile Glu Arg Gli Gli Ala Lis Leu Ile Arg Ile Arg Asp 35 40 45 Asn Gli Cis Gli Ile Lis Lis Asp Glu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Arg 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 130: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 130

Ala Asn Gin Ile Ala Ala Gli Glu Vai Vai Glu Arg Pro Ala Ser Vai 15 10 15

Vai Lis Glu Leu Vai Glu Asn Ser Leu Asp Ala Gli Ala Tre Arg Vai 20 25 30

Asp Ile Asp Ile Glu Arg Gli Gli Ala Lis Leu Ile Arg Ile Arg Asp 35 40 45 161

Asn Gli Cis Gli Ile Lis Lis Glu Glu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Arg 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 131: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 131

Ala Asn Gin Ile Ala Ala Gli Glu Vai Ile Glu Arg Pro Ala Ser Vai 15 10 15

Cis Lis Glu Leu Vai Glu Asn Ala Ile Asp Ala Gli Ser Ser Gin Ile 20 25 30

Ile Ile Glu Ile Glu Glu Ala Gli Leu Lis Lis Vai Gin Ile Tre Asp 35 40 45

Asn Gli His Gli Ile Ala His Asp Glu Vai Glu Leu Ala Leu Arg Arg 50 55 60 ((2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 132: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2687 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 132 162 CCATGGAGCG AGCTGAGAGC TCGAGTACAG AACCTGCTAA GGCCATCAAA CCTATTGATC 60 GGAAGTCAGT CCATCAGATT TGCTCTGGGC AGGTGGTACT GAGTCTAAGC ACTGCGGTAA 120 AGCAGTTAGT AGAAAACAGT CTGGATCCTG CTGCCACTAA TATTGATCTA AAGCTTAAGG 180 ACTATGGAGT GGATCTTATT GAAGTTTCAG ACAATGGATG TGGGGTAGM GAAGAAAACT 240 TCCAAGGCTT AACTCTCAAA CATCACACAT CTAAGATTCA AGAGTTTGCC CACCTAACTC 300 AGGTTGAAAC TTTTGGCTTT CGGGGGGAAG CTCTGAGCTC ACTTTGTGCA CTGAGCGATG 360 TCACCATTTC TACCTGCCAC GCATCGGCGA AGGTTGGAAC TCGACTCATG TTTGATCACA 420 ATCGGAAAAT TATCCAGAAA ACCCCCTACC CCCGCCCCAG AGGGACCACA CTCAGCGTGC 480 AGCAGTTATT TTCCACACTA CCTGTGCGCC ATAAGGAATT TCAAAGGAAT ATTAAGAAGG 540 AGTATGCCAA AATGGTCCAG GTCTTACATG CATACTGTAT CATTTCAGCA GGCATCCGTG 600 TAAGTTGCAC CAATCAGCTT GGACAAGGAA AACGACAGCC TGTGGTATGC ACAGGTGGAÃ 660 GCCCAGCAT AAAGGAAMT ATCGGCTCTG TGTTTGGGCA GAAGCAGTTG ; CAAAGCCTCA 720 TTCTTTTGT TCAGCTGCCC CCTAGTGACT CCGTGTGTGA , AGAGACGGT TTGAGCTGT1 ' 780 CGGATGCTCT CATAATCTT TTTTACATCT CAGGTTTCAl ' TTCACAATGC : ACGCATGGAG 840 TTAAGGAG TTCAACAGAC . AGACAGTTTT TCTTTATCAA CCGGCGGCCT TGTGACCCAG 900 CAMGGTCTG AGATCGTG . AAGAGGTCT , ACCACATGTA AATCGACAC CAGTATCCAT 960 TTGTTGTTCT TAACATTTCT GTTGATTCAG AATGCGTTGA TATCAATGTT ACTCCAGATA 1020 AAAAGCAAAT TTGCTACAA GAGGAAAAGC TTTTGTTGGC AGTTTTAAAG ACCTCTTTGA 1080 TAGGAATGTT TGATAGTGAT GTCAACAAGC TAAATGTCAG TCAGCAGCCA CTGCTGGATG 1140 TTGAAGGTAA CTTAATAAAA ATGCATGCAG CGGATTTGGA AAAGCCCATG GTAGAAAAGC 1200 AGGATCAATC CCCTTCATTA AGGACTGGAG AAGAAAAAAA AGACGTGTCC ATTTCCAGAC 1260 TGCGAGAGGC CTTTTCTCTT CGTCACACAA CAGAGAACAA GCCTCACAGC CCAAAGACTC 1320 CAGAACCAAG AAGGAGCCCT CTAGGACAGA AAAGGGGTAT GCTGTCTTCT AGCACTTCAG 1380 GTGCCATCTC TGACAAAGGC GTCCTGAGAT CTCAGAAAGA GGCAGTGAGT TCCAGTCACG 1440 GACCCAGTGA CCCTACGGAC AGAGCGGAGG TGGAGAAGGA CTCGGGGCAC GGCAGCACTT 1500 CCGTGGATTC TGAGGGGTTC AGCATCCCAG ACACGGGCAG TCACTGCAGC AGCGAGTATG 1560 CGGCCAGCTC CCCAGGGGAC AGGGGCTCGC AGGAACATGT GGACTCTCAG GAGAAAGCGC 1620 CTGAAACTGA CGACTCTTTT TCAGATGTC-G ACTGCCATTC AAACCAGGAA GATACCGGAT 1680 GTAAATTTCG AGTTTTGCCT CAGCCAACTA ATCTCGCAAC CCCAAACACA AAGCGTTTTA 1740 AAAAAGAAGA AATTCTTTCC AGTTCTGACA TTTGTCAAAA GTTAGTAAAT ACTCAGGACA 1600 TGTCAGCCTC TCAGGTTGAT TGAGCTGTGA AAATTAATAA GAAAGTTGTG CCCCTGGACT 1860 TTTCTATGAG TTCTTTAGCT AAACGAATAA AGCAGTTACA TCATGAAGCA CAGCAAAGTG 1920 AAGGGGAACA GAATTACAGG AAGTTTAGGG CAAAGATTTG TCCTGGAGAA AATCAAGCAG 1980 CCGAAGATGA ACTAAGAAAA GAGATAAGTA AAACGATGTT TGCAGAAATG GAAATCATTG 2040 GTCAGTTTAA CCTGGGATTT ATAATAACCA AACTGAATGA GGATATCTTC ATAGTGGACC 2100 AGCATGCCAC GGACGAGAAG TATAACTTCG AGATGCTGCA GCAGCACACC GTGCTCCAGG 2160 GGCAGAGGCT CATAGCACCT CAGACTCTCA ACTTAACTGC TGTTAATGAA GCTGTTCTGA 2220 TAGAAAATCT GGAAATATTT AGAAAGAATG GCTTTGATTT TGTTATCGAT GAAAATGCTC 2280 CAGTCACTGA AAGGGCTAAA CTGATTTCCT TGCCAACTAG TMAAACTGG ACCTTCGGAC 2340 CCCAGGACGT CGATGAACTG ATCTTCATGC TGAGCGACAG CCCTGGGGTC ATGTGCCGCC 2400 CTTCCCGAGT CAAGCAGATG TTTGCCTCCA GAGCCTGCCG GAAGTCGGTG ATGATTGGGA 2460 163 CTGCTCTCAA CACAAGCGAA TGAAGAAACT GATCACCCAC ATGGGGGAGA TGGGCCACCC 2520 CTGGMCTGT CCCCATGGAA GGCCACCATG AGACACATCG CCAACCTGGG TGTCATTTCT 2580 CAGAACTGAC CGTAGTCACT GTATGGAATA ATTGGTTTTA TCGCAGATTT TTATGTTTTG 2640 AAACACAGAG TCTTCACTAA CCTTTTTTG? TTTAAAATGA AACCTGC 2687 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 133: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 862 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 133

Met Glu Arg Ala Glu Ser Ser Ser Tre Glu Pro Ala Lis Ala Ile Lis 1 5 10 15 Pro Ile Asp Arg Lis Ser Vai His Gin ile Cis Ser Gli Gin Vai Vai 20 25 30 Leu Ser Leu ser Tre Ala Vai Lis Glu Leu Vai Glu Asn Ser Leu Asp 35 40 45 Ala Gli Ala Tre Asn Ile Asp Leu Lis Leu Lis Asp Tir Gli Vai Asp 50 55 60 Leu Ile Glu Vai Ser Asp Asn Gli Cis Gli Vai Glu Glu Glu Asn Fen 65 70 75 80 Glu Gli Leu Tre Leu Lis His His Tre Ser Lis Ile Gin Glu Fen Ala 85 90 95 Asp Leu Tre Gin Vai Glu Tre Fen Gli Fen Arg Gli Glu Ala Leu Ser 100 105 110 Ser Leu Cis Ala Leu Ser Asp Vai Tre Ile Ser Tre Cis His Ala Ser 115 120 125

Ma Lis Vai Gli Tre Arg Leu Met Fen Asp His Asn Gli Lis Ile Ile 130 135 140 164

Gin Lis Tre Pro Tir Pro Arg Pro Arg Gli Tre Tre Vai Ser Vai Gin 145 150 155 160 Gin Leu Fen Ser Tre Leu Pro Vai Arg His Lis Glu Fen Gin Arg Asn 165 170 175 Ile Lis Lis Glu Tir Ala Lis Met Vai Gin Vai Leu His Ala Tir Cis 180 185 190 Ile Ile Ser Ala Gli Ile Arg Vai Ser Cis Tre Asn Gin Leu Gli Gin 195 200 205 Gli Lis Arg Gin Pro Vai Vai Cis Ile Gli Gli Ser Pro Ser Ile Lis 210 215 220 Glu Asn Ile Gli Ser Vai Fen Gli Gin Lis Gin Leu Gin Ser Leu Ile 225 230 235 240 Pro Fen Vai Gin Leu Pro Pro Ser Asp Ser Vai Cis Glu Glu Tir Gli 245 250 255 Leu Ser Cis Ser Asp Ala Leu His Asn Leu Fen Tir Ile Ser Gli Fen 260 265 270 Ile Ser Gin Cis Tre His Gli Vai Gli Arg Ser Ser Tre Asp Arg Gin 275 280 285 Fen Fen Fen Ile Asn Arg Arg Pro Cis Asp Pro Ala Lis Vai Cis Arg 290 295 300 Leu Vai Asn Glu Vai Tir His Met Tir Asn Arg His Gin Tir Pro Fen 305 310 315 320 Vai Vai Leu Asn Ile Ser Vai Asp Ser Glu Cis Vai Asp Ile Asn Vai 325 330 335 Tre Pro Asp Lis Arg Gin Ile Leu Leu Gin Glu Glu Lis Leu Leu Leu 340 345 350 Ala Vai Leu Lis Tre Ser Leu Ile Gli Met Fen Asp Ser Asp Vai Asn 355 360 365 Lis Leu Asn Vai Ser Gin Gin Pro Leu Leu Asp Vai Glu Gli Asn Leu 370 375 380 Ile Lis Met His Ala Ala Asp Leu Glu Lis Pro Met Vai Glu His Gin 385 390 395 400 Asp Gin Ser Pro Ser Leu Arg Ile Gli Glu Glu Lis Lis Asp Vai Ser 405 410 415 Ile Ser Arg Leu Arg Glu Ala Fen Ser Leu Arg His Tre Tre Glu Asn 420 425 430 Lis Pro His Ser Pro Lis Tre Pro Glu Pro Arg Arg Ser Pro Leu Gli 165 435 440 445

Gin Lis Arg Gli Met Leu Ser Ser Ser Tre Ser Gli Ala Ile Ser Asp 450 455 460 Lis Gli Vai Leu Arg Ser Gin Lis Glu Ala Vai Ser Ser Ser His Gli 465 470 475 480 Pro Ser Asp Pro Tre Asp Arg Ala Glu Vai Glu Lis Asp Ser Gli His 485 490 495 Glí Ser Tre Ser Vai Asp Ser Glu Gli Fen Ser Ile Pro Asp Tre Gli 500 505 510 Ser His Cis Ser Ser Glu Tir Ala Ala Ser Ser Pro Gli Asp Arg Gli 515 520 525 Ser Gin Glu His Vai Asp Ser Gin Glu Lis Ala Pro Glu Tre Asp Asp 530 535 540 Ser Fen Ser Asp Vai Asp Cis His Ser Asn Gin Glu Asp Tre Gli Cis 545 550 555 560 Lís Fen Arg Vai Leu Pro Gin Pro Ile Asn Leu Ala Tre Pro Asn Tre 565 570 575 Lis Arg Fen Lis Lis Glu Glu Ile Leu Ser Ser Ser Asp Ile Cis Gin 580 585 590 Lis Leu Vai Asn Tre Gin Asp Met Ser Ala Ser Gin Vai Asp Vai Ala 595 600 605 Vai Lis Ile Aan Lis Lis Vai Vai Pro Leu Asp Fen Ser Met Ser Ser 610 615 620 Leu Ala Lis Arg Ile Lis Gin Leu His His Glu Ala Gin Gin Ser Glu 625 630 635 640 Gli Glu Gin Asn Tir Arg Lis Fen Arg Ala Lis Ile Cis Pro Gli Glu 645 650 655 Asn Gin Ala Ala Glu Asp Glu Leu Arg Lis Glu Ile Ser Lis Tre Met 660 665 670 Fen Ala Glu Met Glu Ile Ile Gli Gin Fen Asn Leu G11 Fen Ile Ile 675 680 685 Tre Lis Leu Asn Glu Asp Ile Fen Ile Vai Asp Gin His Ala Tre Asp 690 695 700 Glu Lis Tir Asn Fen Glu Met Leu Gin Gin His Tre Vai Leu Gin Gli 705 710 715 720 Gin Arg Leu Ile Ala Pro Gin Tre Leu Asn Leu Tre Ala Vai Asn Glu 725 730 735 166

Ala Vai Leu Ile Glu Asn Leu Glu Ile Fen Arg Lis Asn Gli Fen Asp 740 745 750 Fen Vai Ile Asp Glu Asn Ala Pro Vai Tre Glu Arg Ala Lis Leu Ile 755 760 765 Ser Leu Pro Tre Ser s Asn Trp Tre Fen G1 i Pro Gin Asp Vai Asp 770 775 780 Glu Leu Ile Fen Met Leu Ser Asp Ser Pro Gli Vai Met Cis Arg Pro 785 790 795 800 Ser Arg Vai Lis Gin Met Fen Ala Ser Arg Ala Cis Arg Lis Ser Vai 805 810 815 Met Ile Gli Tre Ala Leu Asn Tre Ser Glu Met Lis Lis Leu Ile Tre 820 825 830 His Met Gli Glu Met Gli His Pro Trp Asn Cis Pro His Gli Arg Pro 835 840 845 Tre Met Arg His Ile Ala Asn Leu Gli Vai Ile Ser Gin Asn 850 855 860 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 134 • (i 5 CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 903 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 134:

Met Fen His His Ile Glu Asn Leu Leu Ile Glu Tre Glu Lis Arg Cis 1 X 5 10 15 Lis Gin Lis Glu Gin Arg Tir Ile Pro Vai Lis Tir Leu Fen Ser Met 20 25 30 Tre Gin Ile His Gin Ile Asn Asp Ile Asp Vai His Arg Ile Tre Ser 35 40 45 Gli Gin Vai Ile Tre Asp Leu Tre Tre Ala Vai Lis Glu Leu Vai Asp 167 50 55 60

Asn Ser Ile Asp Ala Asn Ala Asn Gin Ile Glu Ile Ile Fen Ile Asp 65 70 75 80 Tir Gli Leu Glu Ser Ile Glu Cis Ser Asp Asn Gli Asp Gli Ile Asp 85 90 95 Pro Ser Asn Tir Glu Fen Leu Ala Leu Lis His Tir Tre Ser Lis Ile 100 105 110 Ala Lis Fen Gin Asp Vai Ala Lis Vai Gin Tre Leu Gli Fen Arg Gli 115 120 125 Glu Aia Leu Ser Ser Leu Cis Gli Ile Ala Lis Leu Ser Vai Ile Tre 130 135 140 Tre Tre Ser Pro Pro Lis Ala Asp Lis Leu Glu Tir Asp Met Vai Gli 145 150 155 160 Hís Ile Tre Ser Lis Tre Tre Ser Arg Asn Lis Gli Tre Tre Vai Leu 165 170 175 Vai Ser Gin Leu Fen His Asn Leu Pro Vai Arg Gin Lis Glu Fen Ser 180 185 190 Lis Tre Fen Lis Arg Gin Fen Tre Lis Cis Leu Tre Vai Ile Gin Gli 195 200 205 Tir Ala Ile Ile Asn Ala Ala Ile Lis Fen Ser Vai Trp Asn Ile Tre 210 215 220 Pro Lis Gli Lis Lis Asn Leu Ile Leu Ser Tre Met Arg Asn Ser Ser 225 230 235 240 Met Arg LÍB Asn Ile Ser Ser Vai Fen Gli Ala Gli Gli Met Fen Gli 245 250 255 Leu Glu Glu Vai Asp Leu Vai Leu Asp Leu Asn Pro Fen Lis Asn Arg 260 265 270 Met Leu G1 i Lis Tir Tre Asp Asp Pro Asp Fen Leu Asp Leu Asp Tir 275 280 285 Lis Ile Arg Vai Lis G1 i Tir Ile Ser Gin Asn Ser Fen Gli Cis Gli 290 295 300 Arg Asn Ser Lis Asp Arg Gin Fen Ile Tir Vai ASn Ile Arg Pro Vai 305 310 315 320 Glu Tir Ser Tre Leu Leu Lis Cis Cis Asn Glu Vai Tir Lis Tre Fen 325 330 335 Asn Asn Vai Gin Fen Pro Ala Vai Fen Leu Asn Leu Glu Leu Pro Met 340 345 350 168

Ser Leu Ile Asp Vai ASn Vai Tre Pro Asp Lis Arg Vai Ile Leu Leu 355 360 365 His Asn Glu Arg Ala Vai Ile Asp Ile Fen Lis Tre Tre Leu Ser Asp 370 375 380 Tir Tir Asn Arg Gin Glu Leu Ala Leu Pro Lis Arg Met Cis Ser Gin 385 390 395 400 Ser Glu Gin Gin Ala Gin Lis Arg Leu Lis Tre Glu Vai Fen Asp Asp 405 410 415 Ser Glu Ser Asn Gin Ser Asn His Ala His Fen Asn Ser Tre Tre Gli 435 440 445 Vai Ile Asp Lis Ser Asn Gli Tre Glu Leu Tre Ser Vai Met Asp Gli 450 455 460 Asn Tir Tre Asn Vai Tre Asp Vai Ile Gli Ser Glu Cis Glu Vai Ser 465 470 475 480 Vai Asp Ser Ser Vai Vai Leu Asp Glu Gli Asn Ser Ser Tre Pro Tre 485 490 495 Lis Lis Leu Pro Ser Ile Lis Tre Asp Ser Gin Asn Leu Ser Asp Leu 500 505 510 Asn Leu Asn Asn Fen Ser Asn Pro Glu Fen Gin Asn Ile Tre Ser Pro 515 520 525 Asp Lis Ala Arg Ser Leu Glu Lis Vai Vai Glu Glu Pro Vai Tir Fen 530 535 540 Asp Ile Asp Gli Glu Lis Fen Gin Glu Lis Ala Vai Leu Ser Gin Ala 545 550 555 560 Asp Gli Leu Vai Fen Vai Asp Asn Glu Cis His Glu His Tre Asn Asp 565 570 575 Cis Cis His Gin Glu Arg Arg Gli Ser Tre Asp Ile Glu Gin Asp Asp 580 585 590 Glu Ala Asp Ser Ile Tir Ala Glu Ile Glu Pro Vai Glu Ile Asn Vai 595 600 605 Arg Tre Pro Leu Lis Asn Ser Arg Lis Ser Ile Ser Lis Asp Asn Tir 610 615 620 Arg Ser Leu Ser Asp Gli Leu Tre His Arg Lis Fen Glu Asp Glu Ile 625 630 635 640 Leu Glu Tir Asn Leu Ser Tre Lis Asn Fen Lis Glu Ile Ser Lis Asn 645 650 655 Gli Lis Gin Met Ser Ser Ile Ile Ser Lis Arg Lis Ser Glu Ala Gin 169 665 670 660

Glu Asn Ile Ile Lis Asn Lis Asp Glu Leu Glu Asp Fen Glu Gin Gli 675 680 685 Glu Lis Tir Leu Tre Leu Tre Vai Ser Lis Asn Asp Fen Lis Lis Met 690 695 700 Glu Vai Vai Gli Gin Fen Asn Leu Gli Fen Ile Ile Vai Tre Arg Lis 705 710 715 720 Vai Asp Asn Lis Ser Lis Leu Fen Ile Vai Asp Gin His Ala Ser Asp 725 730 735 Glu Lis Tir Asn Fen Glu Tre Leu Gin Ala Vai Tre Vai Fen Lis Ser 740 745 750 Gin Lis Leu Ile Ile Pro Gin Pro Vai Glu Leu Ser Vai Ile Asp Glu 755 760 765 Leu Vai Vai Leu Asp Asn Leu Pro Vai Fen Glu Lis Asn Gli Fen Lis 770 775 780 Leu Lis Ile Asp Glu Glu Glu Glu Fen Gli Ser Arg Vai Lis Leu Leu 785 790 795 800 Ser Leu Pro Tre Ser Lis Gin Tre Leu Fen Asp Leu Gli Asp Fen Asn 805 810 815 Glu Leu Ile His Leu Ile Lis Glu Asp Gli Gli Leu Arg Arg Asp Asn 820 825 830 Ile Arg Cis Ser Lis Ile Arg Ser Met Fen Ala Met Arg Ala Cis Arg 835 840 845 Ser Ser Ile Met Ile Gli Lis Pro Leu Asn Lis Lis Tre Met Tre Arg 850 855 860 Vai Vai His Asn Leu Ser Glu Leu Asp Ile Pro Trp Asn Cis Pro His 865 870 875 880 Gli Arg Pro Tre Met Arg His Leu Met Glu Ile Arg Asp Trp Ser Ser 865 890 895 Fen Ser Lis Asp m -t v* i ir Glu Ile 900 (2) INFORMAÇÃO PARA Ã SEQ ID NO: 135: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2577 pares de bases 170 (Β) ΤΙΡο: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 135: TTCCGGCCAA TGCTATCAAA GAGATGATAG AAAACTGTTT AGATGCAAA TCTACAAATA 60 TTCAAGTGGT TGTTAAGGAA GGTGGCCTGA AGCTAATTCA GATCCAAGAC AATGGCACTG 120 GAATCAGGAA GGAAGATCTG GATATTGTGT GTGAGAGGTT CACTACGAGT AAACTGCAGA 180 CTTTTGAGGA TTTAGCCAGT ATTTCTACCT ATGGCTTTCG TGGTGAGCAT TTGGCAAGCA 240 TAAGTCATGT GGCCCATGTC ACTATTACAA CCAAAACAGC TGATGGGAAA TGTGCGTACA 300 GAGCAAGTTA CTCAGATGGA AAGCTGCAAG CCCCTCCTAA ACCCTGTGCA GGCAACCAGG 360 GCACCCTGAT CACGGTGGAA GACCTTTTTT ACAACATAAT CACAAGGAGG AAAGCTTTAA 420 AAAATCCAAG TGAAGAGTAC GGAAAAATTT TGGAAGTTGT TGGCAGGTAT TCAATACACA 480 ATTCAGGCAT TAGTATCTCÃ GTTAAAAAAC AAGGTGAGAC AGTATCTGAT GTCAGAACAC 540 TGCCCAATGC CACAACCGTG GACAACATTC GCTCCATCTT TGGAAATGCG GTTAGTCGAG 600 AACTGATAGA AGTTGGGTGT GAGGATAAAA CCCTAGCTTT CAAAATGAAT GGCTATATAT 660 CGAATGCAAA GTATTCAGTG AAGAAGTGCA TTTTCCTACT CTTCATCAAC CACCGTCTGG 720 TAGAATCAGC TGCCTTGAGA AAAGCCATTG AAACTGTATA TGCAGCATAC TTGCCAAAAA 780 CACACACCCA TTCCTGTACC TCAGTTTGAA ATCAGCCCTC AGAACGTGAC GTCAATGTAC 840 ACCCCACCAA GACAGAAGTT CATTTTCTGC ACGAGGAGAG CATTCTGCAG CGTGTGCAGC 900 AGCACATTGA GAGCAAGCTG CTGGGCTCCA ATTCCTCCAG GATGTATTTC ACCCAGACCT 960 TGCTTCCAGG ACTTGCTGGG CCTCTGGGGA GGCAGCTAGA CCCACGACAG GGGTGGCTTC 1020 CTCATCCACT AGTGGAAGTG GCGACAAGGT CTACGCTTAC CAGATGTCGC GTACGGACTC 1080 CCGGGATCAG AAGCTTGACG CCTTTCTGCA GCCTGTAACC AGCCTTGTGC CCAGCCAGCC 1140 CCAGGACCCT CGCCCTGTCC GAGGGGCCAG GACAGAGGGC TCTCCTGAAA GGGCCACGCG 1200 GGAGGATGAG GAGATGCTTG CTCTCCCAGC CCCCGCTGAA GCAGCTGCTG AGAGTGAGAA 1260 CTTGGAGAGG GAATCACTAA TGGAGACTTC AGACGCAGCC CAGAAAGCGG CACCCACTTC 1320 CAGTCCAGGA AGCTCCAGAA AGAGTCATCG GGAGGACTCT GATGTGGAAA TGGTGGAAAA 1380 TGCTTCCGGG AAGGAAATGA CAGCTGCTTG CTACCCCAGG AGGAGGATCA TTAACCTCAC 1440 CAGCGTCTTG AGTCTCCAGG AAGAGATTAG TGAGCGGTGC CATGAGACTC TCCGGGAGAT 1500 ACTCCGTAAC CATTCCTTTG TGGGCTGTGT GAATCCTCAG TGGGCCTTGG CACAGCACCA 1560 GACCAAGCTA TACCTCCTCA ACACTACCAA GCTCAGTGAA GAGCTGTTCT ACCAGATACT 1620 CATTTATGAT TTTGCCAACT TTGGTGTTCT GAGGTTATCG GAACCAGCGC CACTCTTCGA 1680 CCTGGCCATG CTGGCTTAGA CAGTCCTGAA AGTGGCTGGA CAGAGGACGA CGGCCCGAAG 1740 AAGGGCTTGC AGAGTACATT GTCGAGTTTC TGAAGAGAAG CGAGATGCTT CCAGACTATT 1800 CTCTGTGAGA TCGATGAGAA GGGAACCTGA TTGATTACTC TTCTGATGAC AGCTATGTGC 1860 CACCTTTGGA GGGACTGCCT ATCTTCATTC TTCGACTGGC CACTGAGCTG AATTGGGTGA 1920 AGAAAAGGAG TGTTTTGAAA GTCTCAGTAA AGAATGTGCT ATGTTTTACT CCATTCGGAA 1980 GCAGTATATA CTGGAGGAGT CC-ACCCTCTC AGGCCAGCAG AGTGACATGC CTGGCTCCAC 2040 171 GTCAAAGCCC TGGAAGTGGA CTGTGGAGCA CATTATCTAT AAAGCCTTCC GCTCACACCT 2100 CCTACCTCCG AAGCATTTCA CAGAAGATGG CAATGTCCTG CAGCTTGCCA ACCTGCCAGA 2160 TCTATACAAA GTCTTTGAGC GGTGTTAAAT ACAATCATAG CCACCGTAGA GACTGCATGA 2220 CCATCCAAGG CGAAGTGTAT GGTACTAATC TGGAAGCCAC AGAATAGGAC ACTTGGTTTC 2280 AGCTCCAGGG TTTTCAGTCC TCACTATTCT TGTTCTGTAT CCCAGTATTG GTGCTGCAAC 2340 TTAATGTACT TCACCTGTGG ATTGGCTGCA AATAAACTCA CGTGTATTGG AAAAAAOOAA 2400 TTCCTGCAGC CCGGGGGATC CACTAGTTCT AGAGCGGCCG CCACCGGTGG AGCTCCAGCT 2460 TTTGTTCCCT TTAGTGAGGG TIAATTTCGA GCTTGGCGTA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC 2520 CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAACAT ACGAGCCGGA AGCATAA 2577 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 136: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 728 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 136:

Pro Ala Asn Ala Ile Lis Glu Met Ile Glu Asn Cis Leu Asp Ala Lis 1 5 10 15 Ser Tre Asn Ile Gin Vai Vai Vai Lis GlU Gli Gli Leu Lis Leu Ile 20 25 30 Gin I le Gin Asp Asn Gli Tre Gli Ile Arg Lis Glu Asp Leu Asp Ile 35 40 45 Vai Cis Glu Arg Fen Tre Tre Ser Lis Leu Gin Tre Fen Glu Asp Leu 50 55 60 Ala Ser Ile Ser Tre Tir Gli Fen Arg Gli Glu His Leu Ala Ser Ile 65 70 75 80 Ser His Vai Ala His Vai Tre Ile Tre Tre Ile Tre Ala Asp Gli Lis 85 90 95 Cis Ala Tir Arg Ala Ser Tir Ser Asp Gli Lis Leu Gin Aia Pro Pro 100 105 110 Lis Pro Cis Ala Gli Asn Gin Gli Tre Leu Ile Tre Vai Glu Asp Leu 172 115 120 125 Fen Tir Asn Ile Ile Tre Arg Arg Lis Ala Leu Lis Asn Pro Ser Glu 130 135 140 Glu Tir Gli Lis Ile Leu Glu Vai Vai Gli Arg Tir Ser Ile His Asn 145 150 155 160 Ser Gli Ile Ser Ile Ser Vai Ile Lis Gin Gli Glu Tre val Ser Asp 165 170 175 Vai Arg Tre Leu Pro Aen Ala Tre Tre Vai Asp Asn Ile Arg Ser Ile 180 185 190 Fen Gli Asn Ala Vai Ser Arg Glu Leu Ile Glu Vai Gli Cis Glu Asp 195 200 205 Lis Tre Leu Ala Fen Lis Met Asn Gli Tir Ile Ser Asn Ala Lis Tir 210 215 220 Ser Vai Lis Lis Cis Ile Fen Leu Leu Fen Ile Asn His Arg Leu Val 225 230 235 240 Glu Ser Ala Ala Leu Arg Lis Ala Ile Glu Tre Vai Tir Ala Ala Tir 245 250 255 Leu Pro Lis Tre His Tre His Ser Cis Tre Ser Vai Glx Asn Gin Pro 260 265 270 Ser Glu Arg Asp Vai Asn Vai His Pro Tre Lis Tre Glu Val His Fen 275 280 285 Leu His Glu Glu Ser ile Leu Gin Arg Vai Gin Gin His Ile Glu Ser 290 295 300 Lis Leu Leu Gli Ser Asn Ser Ser Arg Met Vai Fen His Pro Asp Leu 305 310 315 320 Ala Ser Arg Tre Cis Trp Ala Ser Gli Glu Ala Ala Arg Pro Tre Tre 325 330 335 Gli Vai Ala Ser Ser Ser Tre Ser Gli Ser Gli Asp Lis Val Tir Ala 340 345 350 Tir Gin Met Ser Arg Tre Asp Ser Arg Asp Gin Lis Leu Asp Ala Fen 355 360 365 Leu Gin Pro Vai Ser Ser Leu Vai Pro Ser Gin Pro Gin Asp Pro Arg 370 375 380 Pro Vai Arg Gli Ala Arg Tre Glu Gli Ser Pro Glu Arg Alâ Tre Arg 385 390 395 400 Glu Asp Glu Glu Met Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ala Glu Alâ Ala Ala 405 410 415 173

Glu Ser Glu Asn Leu alu Arg Glu Ser Leu Met Glu Tre Ser Asp Ala 420 425 430 Ala Gin Lis Ala Ala Pro Tre Ser Ser Pro Gli Ser Ser Arg Lis Ser 435 440 445 His Arg Glu Asp Ser Asp Vai Glu Met Val Glu Asn Ala Ser Gli Lis 450 455 460 Glu Met Tre Ala Ala Cis Tir Pro Arg Arg Arg Ile Ile Asn Leu Tre 465 470 475 480 Ser Vai Leu Ser Leu Gin Glu Glu Ile Ser Glu Arg Cis His Glu Tre 485 490 495 Leu Arg Glu Ile Leu Arg Asn His Ser Fen Val Gli Cis Val Asn Pro 500 505 510 Gin Trp Ala Leu Ala Gin His Gin Tre Lis Leu Tir Leu Leu Asn Tre 515 520 525 Tre Lis Leu Ser Glu Glu Leu Fen Tir Gin Ile Leu Ile Tir Asp Fen 530 535 540 Ala Asn Fen Gli Vai Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Pro Leu Fen Asp 545 550 555 560 Leu Ala Met Leu Ala Cis Tre Vai Leu Lis Val Ala Gli Gin Arg Tre 565 570 575 Tre Ala Arg Arg Arg Ala Cis Arg Vai His Cis Arg Val Ser Glu Glu 580 585 590 Lis Arg Asp Ala Cis Arg Leu Fen Ser Val Arg Ser Met Arg Arg Glu 595 600 605 Pro Asp Glx Leu Leu Fen ^íí Glx Gin Leu Cis Ala Met Fen Gli Gli 610 615 620 Tre Ala Tir Leu His Ser Ser Tre Gli His Glx Gli Glu Leu Gli Glu 625 630 635 640 G1 u Lis Glu Cis Fen Glu Ser Leu Ser Lis Glu Cis Ala Met Fen Tir 645 650 655 Ser I le Arg Lis Gin Tir Ile Leu Glu Glu Ser Tre Leu Ser Gli Gin 660 665 670 Gin Ser Asp Met Pro Gli Ser Tre Ser Lis Pro Trp Lis Trp Tre Val 675 680 685 Glu His Ile Ile Tir Lis Ala Fen Arg Ser His Leu Leu Pro Pro Lis 690 695 700 His Fen Tre Glu Asp Gli Asn Vai Leu Gin Leu Ala Asn Leu Pro Asp 174 705 710 715 720

Leu Tir Lis Vai Fen Glu Arg Cis 725 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 137: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3065 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 137: CGGTGAAGGT CCTGAAGAAT TTCCAGATTC CTGAGTATCA TTGGAGGAGA CAGATAACCT 60 GTCGTCAGGT AACGATGGTG TATATGCAAC AGAAATGGGT GTTCCTGGAG ACGCGTCTTT 120 TCCCGAGAGC GGCACCGCAA CTCTCCCGCG GTGACTGTGA CTGGAGGAGT CCTGCATCCA 180 TGGAGCAAAC CGAAGGCGTG AGTACAGAAT GTGCTAAGGC CATCAAGCCT ATTGATGGGA 240 AGTCAGTCCA TCAAATTTGT TCTGGGCAGG TGATACTCAG TTTAAGCACC GCTGTGAAGG 300 AGTTGATAGA AAATAGTGTA GATGCTGGTG CTACTACTAT TGATCTAAGG CTTAAAGACT 360 ATGGGGTGGA CCTCATTGAA GTTTCAGACA ATGGATGTGG GGTAGAAGAA GAAAACTTTG 420 AAGGTCTAGC TCTGAAACAT CACACATCTA AGATTCAAGA GTTTGCCGAC CTCACGCAGG 480 TTGAAACTTT CGGCTTTCGG GGGGAAGCTC TGAGCTCTCT GTGTGCACTA AGTGATGTCA 540 CTATATCTAC CTGCCACGGG TCTGCAAGCG TTGGGACTCG ACTGGTGTTT GACCATAATG 600 GGAAAATCAC CCAGAAAACT CCCTACCCCC GACCTAAAGG AACCACAGTC AGTGTGCAGC 660 ACTTATTTTA TACACTACCC GTGCGTTACA AAGAGTTTCA GAGGAACATT AAAAAGGAGT 720 ATTCCAAAAT GGTGCAGGTC TTACAGGCCT ACTGTATCAT CTCAGCAGGC CTCCGTGTAA 780 GCTGCACTAA TCACCTCGGA CAGGGGAACC GGCACGCTGT GCTGTCCACA AGCGGCACGT 840 CTGGCATGAA GGAAAATATC GGGTCTGTGT TTGGCCAGAA GCAGTTCCAA AGCCTCATTC 900 CTTTTGTTCA GCTGCCCCCT AGTGACGCTG TGTGTGAAGA GTACOOCCTG AGCACTTCAG 960 GACGCCACAA AACCTTTTCT ACGTTTTCGG GCTTCATTTC ACAGTGCACG CACGGCGCCG 1020 GGAGGAGTGC AACAGACAGG CAGTTTTTCT TCATCAATCA GAGGCCCTGT GACCCAGCAA 1080 AGGTCTCTAA GCTTGTCAAT GAGGTTTATC ACATGTATAA CCGGCATCAG TACCCATTTG 1140 TCGTCCTTAA CGTTTCCGTT GACTCAGAAT GTGTGGATAT TAATGTAACT CCAGATAAAA 1200 GGCAAATTCT ACTACAAGAA GAGAAGCTAT TGCTGGCCGT TTTAAAGACC TCCTTGATAG 1260 GAATGTTTGA CAGTGATGCA AACAAGCTTA ATGTCAACCA GCAGCCACTG CTAGATGTTG 1320 AAGGTAACTT AGTAAAGTCG CATACTGCAG AACTAGAAAA GCCTGTGCCA GGAAAGCAAG 1380 175 ATAACTCTCC TTCACTGAAG AGCACAGCAG AC GAGAAAAb GGTAGCATCC ATCTCCAGGC 1440 TGAGAGAGGC CTTTTCTCTT CATCCTACTA AAGAGATCAA GTCTAGOOGT CCAGAGACTG 1500 CTGAACTGAC ACGGAGTTTT CCAAGTGAGA AAAGGGGCGT GTTATCCTCT TATCCTTCAG 1560 ACGTCATCTC TTACAGAGGC CTCCGTGGCT CGCAGGACAA ATTGGTGAGT CCCACGGACA 1620 GCCCTGGTGA CTGTATGGAC GAGAGAAAA TAGAAAAAGA CTCAGGGCTC AGCAGCACCT 1680 CAGCTGGCTC TGAGGAAGAG TTCAGCACCC CAGAAGTGGC CAGTAGCTTT AGCAGTGACT 1740 ATAACGTGAG CTCCCTAGAA GACAGACCTT CTCAGGAAAC CATAAACTGT GGTGACCTGC 1800 TGCCGTCCTC CAGGTACAGG ACAGTCCTTG AAGCCAGAAG ACCATGGATA TCAATGCAAA 1860 GCTCTACCTC TAGCTCGTCT GTCACCCACA AATGCCAAGC GCTTCAAGAC AGAGGAAGAC 1920 CCTCAAATGT CAACATATCT CAAAGATTGC CTGGTCCTCA GAGCACCTCA GCAGCTGAGG 1980 TCGATGTAGC CATAAAAATG AATAAGAGAT CGTGCTCCTC GAGTTCTCTA GCTAAGCGAA 2040 TGAAGCAGTT ACAGCACCTA AAGGCGCAGA ACAAACATGA ACTGAGTTAC AGAAAATTTA 2100 GGGCCAAGAT TTGCCCTGGA GAAAACCAAG CAGCAGAAGA TGAACTCAGA AAAGAGATTA 2160 GTAAAICGAT GTTTGCAGAG ATGGAGATCT TGGGTCAGTT TAACCTGGGA TTTATAGTAA 2220 CCAAACTGAA AGAGGACCTC TTCCTGGTGG ACCAGCATGC TGCGGATGAG AAGTACAACT 2280 TTGAGATGCT GCAGCAGCAC ACGGTGCTCC AGGCGCAGAG GCTCATCACG TGGGTGCACA 2340 CAGGCTTCAG AGTTCCCAGA CCCCAGACTC TGAACTTAAC TGCTGTCAAT GAAGCTGTAC 2400 TGATAGAAAA TCTGGAAATA TTCAGAAAGA ATGGCTTTGA CTTTGTCATT GATGAGGATG 2460 CTCCAGTCAC TGAAAGGGCT AAATTGATTT CCTTACCAAC TAGTAAAAAC TGGACCTTTG 2520 GACCCCAAGA TATAGATGAA CTGATCTTTA TGTTAAGTGA CAGCCCTGGG GTCATGTGCC 2580 GGCCCTCACG AGTCAGACAG ATGTTTGCTT CCAGAGCCTG TCGGAAGTCA GTGATGATTG 2640 GAACGGCGCT CAATGCGAGC GAGATGAAGA AGCTCATCAC CCACATOOGT GAGATGGACC 2700 ACCCCTGGAA CTGCCCCCAC GGCAGGCCAA CCATGAGGCA CGTTGCCAAT CTGGATGTCA 2760 TCTCTCAGAA CTGACACACC CCTTGTAGCA TAGAGTTTAT TACAGATTGT TCGGTTCGCA 2820 AAGAGAAGGT TTTAAGTAAT CTGATTATCG TTGTACAAAA ATTAGCATGC TGCTTTAATG 2880 TACTGGATCC ATTTAAAAGC AGTGTTAAGG CAGGCATGAT GGAGTGTTCC TCTAGCTCAG 2940 CTACTTGGGT GATCCGGTGG GAGCTCATGT GAGCCCAGGA CTTTGAGACC ACTCCGAGCC 3000 ACATTCATGA GACTCAATTC AAGGACAAAA AAAAAAAGAT ÂTTTTTGAAG CCTTTTAAAA 3060 AAAAA 3065 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 138: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 864 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 176 (íi) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 138:

Met Glu Gin Tre Glu G1 i Vai Ser Tre Glu cis Ala Lis Ala Ile Lis 1 5 10 15 Pro ile Asp Gli Lis Ser val His Gin Ile Cis Ser Gli Gin Val Ile 20 25 30 Leu Ser Leu Ser Tre Ala vai Lis Glu Leu Ile Glu Asn Ser Val Asp 35 40 45 Ala Gli Ala Tre Tre ile Asp Leu Arg Leu Lis Asp Tir Gli Val Asp 50 55 60 Leu Ile Glu Vai Ser Asp Asp Gli Cis Gli val Glu Glu Glu Asn Fen 65 70 75 80 Glu Gli Leu Ala Leu LÍS His H i s Tre Ser Ij l s Ile Gin Glu Fen Ala 85 90 95 Asp Leu Tre Gin Vâl Glu Tre Fen Gli Fen Arg Gli Glu Ala Leu Ser 100 105 110 Ser Leu Cis Ala Leu Ser Asp Val Tre Ile Ser Tre Cis His Gli Ser 115 120 125 Ala Ser Vai Gli Tre Arg Leu Val Fen Asp His Asn Gli Lis Ile Tre 130 135 140 Gin Lis Tre Pro Tir Pro Arg Pro Lis Gli Tre Tre Val Ser Val Gin 145 150 155 160 His Leu Fen Tir Tre Leu Pro Val Arg Tir Lis Glu Fen Gin Arg Asn 165 170 175 Ile Lis Lis Glu Tir Ser Lis Met Val Gin Val Leu Gin Ala Tir Cis 180 185 190 Ile Ile Ser Ala Gli Vai Arg Val Ser Cis Tre Asn Gin Leu Gli Gin 195 200 205 Gli Lis Arg His Ala Vai Val Cis Tre Ser Gli Tre Ser Gli Mat Lis 210 215 220 Glu Asn Ile Gli Ser Vai Fen Gli Gin Lis Gin Leu Gin Ser Leu Ile 225 230 235 240 Pro Fen Vai Gin Leu Pro Pro Ser Asp Ala Val Cis Glu Glu Tir Gli 245 250 255 Leu Ser Tre Ser Gli Arg His Lis Tre Fen Ser Tre Fen Ser Gli Fen 260 265 270 177

Ile Ser Gin Cis Tre His Gli Ala Gli Arg Ser Ala Tre Asp Arg Gin 275 280 285 Fen Fen Fen Ile Asn Gin Arg Pro Cis Asp Pro Ala Lis Val Ser Lis 290 295 300 Leu Vai Asn Glu Vai Tir His Met Tir Asn Arg His Gin Tir Pro Fen 305 310 315 320 Vai Vai Leu Asn Vai Ser Vai Asp Ser Glu Cis Val Asp Ile Asn Val 325 330 335 Tre Pro Asp Lis Arg Gin Ile Leu Leu Gin Glu Glu Lis Leu Leu Leu 340 345 350 Ala Vai Leu Lis Tre Ser Leu Ile Gli Met Fen Asp Ser Asp Ala Asn 355 360 365 Lis Leu Asn Vai Asn Gin Gin Pro Leu Leu Asp Val Glu Gli Asn Leu 370 375 380 Vai Lis Ser His Tre Ala Glu Leu Glu Lis Pro Val Pro Gli Lis Gin 385 390 395 400 Asp Asn Ser Pro Ser Leu Lis Ser Tre Ala Asp Glu Lis Arg Val Ala 405 410 415 Ser Ile Ser Arg Leu Arg Glu Ala Fen Ser Leu His Pro Tre Lis Glu 420 425 430 Ile Lis Ser Arg Gli Pro Glu Tre Ala Glu Leu Tre Arg Ser Fen Pro 435 440 445 Ser Glu Lis Arg Gli Vai Leu Ser Ser Tir Pro Ser Asp Val Ile Ser 450 455 460 Tir Arg Gli Leu Arg Gli Ser Gin Asp Lis Leu Val Ser Pro Tre Asp 465 470 475 480 Ser Pro Gli Asp Cis Met Asp Arg Glu Lis Ile Glu Lis Asp Ser Gli 485 490 495 Leu Ser Ser Tre Ser Ala G1 i Ser Glu Glu Glu Fen Ser Tre Pro Glu 500 505 510 Vai Ala Ser Ser Fen Ser Ser Asp Tir Asn Val Ser Ser Leu Glu Asp 515 520 525 Arg Pro Ser Gin alu Tre Ile Asn Cis Gli Asp Leu Leu Pro Ser Ser 530 535 540 Arg Tir Arg Tre Vai Leu Glu Ala Arg Arg Pro Trp Ile Ser Met Gin 545 550 555 560 Ser Ser Tre Ser Ser Ser Ser val Tre His Lis Cis Gin ^^1 Leu Gin 178 575 565 570

Asp Arg Gli Arg Pro Ser Asn Val Asn Ile Ser Gin Arg Leu Pro Gli 580 585 590 Pro Gin Ser Tre Ser Ala Ala Glu Val Asp Val Ala Ile Lis Met Asn 595 600 605 Lis Arg Ser Cis Ser Ser Ser Ser Leu Ala Lis Arg Met Lis Gin Leu 610 615 620 Gin His Leu Lis Ala Gin Asn Lis His Glu Leu Ser Tir Arg Lis Fen 625 630 635 640 Arg Ala Lis Ile Cis Pro Gli Glu Asn Gin Ala Ai a Glu Asp Glu Leu 645 650 655 Arg Lis Glu Ile Ser Lis Ser Met Fen Ala Glu Met Glu Ile Leu Gli 660 665 670 Gin Fen Asn Leu Gli Fen Ile Val Tre Lis Leu Lis Glu Asp Leu Fen 675 680 685 Leu Vai Asp Gin His Ala Ala Asp Glu Lis Tir Asn Fen Glu Met Leu 690 695 700 Gin Gin His Tre Vai Leu Gin Ala Gin Arg Leu Ile Tre Trp Val His 705 710 715 720 Tre Gli Fen Arg Vai Pro Arg Pro Gin Tre Leu Asn Leu Tre Ala Val 725 730 735 Asn Glu Ala Vai Leu Ile Glu Asn Leu Glu Ile Fen Arg Lis Asn Gli 740 745 750 Fen Asp Fen Vai Ile Asp Glu Asp Ala Pro Val Tre Glu Arg Ala Lis 775 760 765 Leu Ile Ser Leu Pro Tre Ser Lis Asn Trp Tre Fen Gli Pro Gin Asp 770 775 780 Ile Asp Glu Leu Ile Fen Met Leu Ser Asp Ser Pro Gli Val Met Cis 785 790 795 800 Arg Pro Ser Arg Vai Arg Gin Met Fen Ala Ser Arg Ala Cis Arg Lis 805 810 815 Ser Vai Met Ile Gli Tre Ala Leu Asn Ala Ser Glu Met Lis Lis Leu 820 825 830 Ile Tre His Met Gli Glu Met Asp His Pro Trp Asn Cis Pro His Gli 835 840 845 Arg Pro Tre Met Arg His val Ala Asn Leu Asp Val Ile Ser Gin Asn 850 855 860 179 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 139: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 139 CTTGATTCTA GAGCITCNCC NCKRAANCC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 140: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 140 AGGTCGGAGC TCAARGARIT NGTNGANAA 29 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 141: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 141 15

ACTTGTGGA TTTTGC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 142: (i) CARACIERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 142: ACTTGTGAAT TTTGC 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 143: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 143: TTCGGTGACA GATTTGTAAA TG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 144: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 181 to Η 2 2 Ω ~ Λ H* 0 Ω X μ. 2 0 Ρ V S Ω v 0 5 0 Ω to > > 0 Q D D Ω tfl > > v v '11 p > R Vrf· w 5d μ 0 Ω B μ Ω 0 Ω 0 Ω H R H 0 Ω H 0 Ω 2 > 2 0 to H 0 Ω B K H > H q Ω G 2 Μ 0 2 2 H 0 0 2 0 TJ 2 ,, 2 H' jp > >* 2 G 2 μ H ih Ω 0 0 H H W EU' 2 Ω P H 0 c E2 2 Ω 0 M H H D H w Ω W Η μ 2 0 w i-3 > > í> H- 2 0 α Ω > R 0 M G H > 0 0 to 0 Ω W 2 0 0 W »6 Ω W H W 3 0 H > 0 P* Ω D c t\) > D G 3 H 0 N) > 0 to Q R> (D Ω 0 N) H W 2 0 Z 0) 0 H Μ Φ Ό B O· Ω H H (D Ό Η P- &) D H H D H- íli 0 0 H q > > 0 H α 0 (D B μ 0 fl β (fl Z & K \ *> 01 2 0 n] μ W Ω α H M W w CA α Η (Í5 > 0 H- (1 > 1 I 3 Η 2 H 2 2 EU 0 H EU 03 fl 03 (1) 2 [fl (1 m 0 0) μ ET) Ω ÍY) Η Η 2 2 fTj μ Λ Λ Β 0 Ω X μ. 0 2 > Ρ 5 2 Ω ~ 2 V} 0 Ω 0 > D D 0 W > > <1 !t* Ω Η ν/ 2 > 0 > II) μ 0 > 0 μ Μ β π 0 Β > Β 0 to Η 0 Ω Ω Ω Η 2 Ω 2 3 Β > p <1 0 2 0 Ω Β p >ί Ω G Η Ω μ Η 0 0 μ μ W > > 0 G 2 ».....3 > Ω D Η 0 Μ Η Μ Ω Ρ Ρ > Η· ρ; 0 Μ W Ω Η α Ω > Μ 0 μ 0) κ 0 0 (!) 0 Ω Η μ W " Η Ω 0 Η* Ω μ- 0 Η D G Μ μ Η C Ω > 0 Ω Β § 0 η Μ Ζ Ω 2 Ευ 0 Η (0 ζ 0 Ω Η Η Φ 2 Μ 0 Η D Η* 0) 0 8« > Ρ η Ρ G μ Η Ω 0 φ » μ μ \Λ ·· 01 2 *fc» Ω Κ W (β α Ω Η ϋΐ D μ, 3 φ Ω Η 3 Β σ D μ EU § 0) 2 W Φ 0 03 (xi ) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ I D NO; 14 4 rTTACGGAGC COTGGO 16 μ (/1 ·· ··

00 W (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear fxi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 147 TTTCAGGTAT GTCCTGTTAC CC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 148: (i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 148 TGAGGCAGCT TTTAAGAAAC TC 22

Lisboa, 13 de Setembro de 2006

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo de diagnóstico da propensão para cancro do cólon de um indivíduo, caracterizado pelo facto de compreender: a detecção da presença de uma mutação numa sequência de ácido nucleico de hMLHl, que se pode obter por: (i) preparação de um primeiro iniciador degenerado correspondendo à sequência de aminoácidos GFRGEA e um segundo iniciador degenerado comportando a sequência da SEQ ID n° 140 (ii) realização de uma RCP (reacção em cadeia de polimerase) utilizando os referidos iniciadores no ADNc obtido a partir de culturas de fibroblastos primários humanos para gerar um produto de RCP e; (iii) isolamento da sequência completa de hMLHl de uma biblioteca de ADNc humano utilizando o referido produto como sonda, em que a referida mutação se deteeta por comparação de uma sequência de hMLHl isolada de um tecido desse indivíduo com uma sequência de hMLHl de tipo selvagem, sendo a presença da mutação indicativa da susceptibilidade do indivíduo para cancro do cólon e em que a mutação é caracterízada por uma mutação da transição de C para T que produz uma substituição não conservadora de aminoácido na posição 44 da proteína hMLHl (SEQ ID N° 5). 1
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peio facto de a sequência de ácidos nucleicos de hMLHl ter a sequência da SEQ ID N° 4,
3. 3. Processo de diagnóstico de propensão para o cancro do cólon de um indivíduo, caracterizado pelo facto de compreender: a detecção da presença de uma mutação numa sequência de ácidos nucleicos de hPMSl que comporta a sequência da SEQ ID N° 132, em que a referida mutação é detectada comparando uma sequência de ácidos nucleicos de hPMSl isolada de um tecido do indivíduo com uma sequência de hPMSl de tipo selvagem, respectivamente, sendo a presença de uma mutação indicativa de que o indivíduo tem propensão para o cancro do cólon.
4. 4. Processo de diagnóstico da propensão para o cancro do cólon de um indivíduo, caracterizado pelo facto de compreender: a detecção da ligação de um anticorpo que se liga especificamente a um poiipéptido de hMLHl comportando a sequência da SEQ ID N° 5 ou um poiipéptido de hPMSl comportando a sequência da SEQ ID N° 133, com uma amostra obtida do indivíduo, sendo a quantidade de ligação do referido anticorpo indicativa de que o indivíduo tem propensão para o cancro do cólon. 2
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a etapa de detecção compreender: a amplificação de um segmento da sequência de hMLHl isolada; a comparação do segmento amplificado com um segmento análogo da sequência de hMLHl de tipo selvagem; e a detecção de uma diferença entre o segmento amplificado e o segmento análogo, sendo a diferença indicativa da mutação da transição de C para T na sequência de hMLHl.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo facto de a etapa de detecção compreender: a amplificação de um segmento da sequência de hPMSl isolado; a comparação do segmento amplificado com um segmento análogo da sequência de hPMSl de tipo selvagem; e a detecção de uma diferença entre o segmento amplificado e o segmento análogo, sendo a diferença indicativa de uma mutação na sequência de hPMSl.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a diferença na sequência de nucleótidos ser seleccionada no grupo que consiste em eliminações de pelo menos um dos nucleótidos, inserções de pelo menos um dos nucleótidos, substituições de pelo menos um dos nucleótidos e re-arranjos dos nucleótidos. 3
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a etapa de amplificação compreender: a transcrição reversa de todo ou de uma parte do produto do gene de ARN para o ADN; e a amplificação de um segmento do ADN produzido por transcrição reversa.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a etapa de amplificação compreender: a selecção de um par de iniciadores de oligonucleótido capazes de hibridarem com as estruturas helicoidais opostas do segmento de ADN e na orientação oposta; e a realização de uma reacção em cadeia de polimerase utilizando os iniciadores de oligonucleótido de tal modo que o ácido nucleico que intervém entre os iniciadores é amplificado para se tornar num segmento amplificado.
10. 10. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes caracterizado pelo facto de a etapa de detecção de uma mutação compreender a determinação se a diferença entre o segmento amplificado e o segmento análogo causa um fenótipo afectado.
11. 11. Polinucleótído isolado caracterizado pelo facto de codificar a proteína de reparação do desemparelhamento de ADN e compreender a sequência da SEQ ID N° 132. 4
12. 12. Polípéptido de reparação do desemparelhamento de ADN isolado, caracterizado pelo facto de ser codificado pelo polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11.
13. 13. Polípéptido de reparação do desemparelhamento de ADN isolado, caracterizado pelo facto de comportar a sequência da SEQ ID N° 133.
14. 14. Anticorpo purificado caracterizado pelo facto de se ligar especificamente a um polípéptido de acordo com a reivindicação 12 ou com a reivindicação 13.
15. 15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
16. 16. Sonda caracterizada pelo facto de compreender: uma sequência de nucleótidos com menos de 500 pb capazes de se ligararem especificamente a bases complementares da SEQ ID N° 4, por meio do emparelhamento de Watson/Crick, com uma Tm maior do que 55 °C; e uma parte marcada ligada à sequência. em que a parte marcada tem uma propriedade seleccíonada no grupo que consiste em fluorescência, radioactividade e quimio-luminescência.
17. 17· Sonda caracterizada pelo facto de compreender: uma sequência de nucleótidos capazes de se ligararem especificamente a bases complementares da SEQ ID N° 132, por meio do emparelhamento de Watson/Crick, com uma Tm maior do que 55 °C; e uma parte marcada ligada à sequência, em que a parte marcada tem uma propriedade seleccionada no grupo que consiste em fluorescência, radioacti-vidade e quimio-lumínescência. Lisboa, 13 de Setembro de 2006 6 processo para avaliar outros genes neste processo de reparação de erros de emparelhamento.