KR101148825B1

KR101148825B1 - 대장암과 연관된 단백질, 대장암과 연관된 단일염기다형을포함하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단 방법

Info

Publication number: KR101148825B1
Application number: KR1020050016259A
Authority: KR
Inventors: 이연수; 김상훈; 신충렬; 박경희
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2005-02-26
Filing date: 2005-02-26
Publication date: 2012-05-24
Also published as: WO2006091049A1; KR20060094791A; US20090258345A1

Abstract

본 발명은 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 아미노산 서열을 갖는 핵인 단백질, 피검체에 있어서 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 대장암의 진단 방법 및 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 유래한 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 101 번째 염기를 포함하는 대장암 진단 또는 치료용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

폴리뉴클레오티드, 대장암 , 단일염기 다형, SNP

Description

대장암과 연관된 단백질, 대장암과 연관된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단 방법{A protein associated with a colon cancer, a polynucleotide associated with a colon cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing a colon cancer using the same}

도 1 및 2는 다른 암세포 및 정상 세포에 비하여 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 대장암 세포에서 현저하게 높은 수준으로 발현되는 것을 나타내는 도면이다.

도 3 및 4는 각각 간기 및 체세포 분열시에 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 핵인에서 발현됨을 나타내는 도면이다.

도 5는 핵인 단백질 B23에 대한 항체를 이용하여 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 핵인에서 발현됨을 보여주는 도면이다.

도 6은 GFP-XP_033371 융합단백질이 핵인의 해체에 관여한다는 것을 보여주는 도면이다.

본 발명은 대장암과 연관된 단백질, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이, 진단 키트 및 대장암의 진단 방법에 관한 것이다.

1. 대장암의 발생빈도

대장은 동물성 지방질과 고기를 많이 먹는 미국이나 유럽에 사는 민족에게서 많이 발생하며, 특히 미국에서는 발생률과 사망률이 모두 두 번째로 높은 암이다. 한국이나 일본을 비롯한 아시아 각국에서는 서구에 비하여 발생률이 낮으나 근래에는 식생활이 서구화 되어감에 따라 예전에 비하여 대장암의 발생률이 증가되어 가고 있는 추세로 최근의 조사 (1997년)에 따르면 우리 나라에서 남자의 경우 위암, 유방암에 이어서 네 번째로 많은 암이다.

다른 장기에 발생하는 암과 마찬가지로 대장암도 50세 이후에 주로 발생하지만 간혹 젊은 연령에서 발생하기도 한다.

3. 대장암의 발생원인과 위험인자

대장암의 발생원인은 아직까지 확실하게 밝혀지지는 않았지만 가족성 대장용종증, 특발성 비특이성 궤양성 대장염, 대장 및 직장의 용종, 특히 이중에서도 융모성 선종인 경우 암으로 변화할 수 있는 병으로 잘 알려져 있다. 대장암이 유전성이 있다는 확증은 아직 없으나 대개 약 10-30%의 환자에서 유전적인 요인을 가지는 것으로 생각된다.

대장암은 동양인보다 서양인에게 높은 빈도로 발생한다. 이는 서양인이 동양인보다 동물성 지방과 육류를 더 많이 섭취하는 것과 관련되는 것으로 여겨지고 있 다. 즉, 동물성 지방과 육류를 섭취하는 경우, 채소나 곡물 같은 섬유질이 많은 음식에 비하여 대변의 양이 적고 대장을 통과하는 시간이 길기 때문인 것으로 여겨진다. 동물성 지방을 많이 섭취하는 경우 대장 안에 정상적으로 존재하는 세균들에 변화가 야기된다. 또한, 대장 내용물이 대장을 통과하는데 걸리는 시간이 길어지는 경우, 대장 내에서 발암 물질이 생성될 가능성이 높아지고 그에 따라 대장의 세포가 발암 물질에 노출되는 시간이 길어지기 때문에 대장암의 발생이 증가하는 것으로 여겨진다. 역학적인 조사에 의하면 동물성 지방과 고기의 섭취량과 대장암의 발생률과는 상관관계가 있다.

3. 대장암의 증상

대장암을 의심할 수 있는 특징적인 증상은 없다. 다만 체중감소 등 일반적인 암 증상과 함께 암의 발생부위나 진행정도에 따른 증상들이 나타날 수 있다. 예를 들어, 항문에 가까운 하행결장이나 에스자 결장 및 직장에 암이 발생하는 경우, 혈변이나 배변장애 (설사와 변비를 반복하는 증상), 변이 가늘어지거나, 잔변감, 복통이 주로 발생한다. 상행결장에 암이 발생하는 경우, 자각하지 못하는 오랜 혈변으로 빈혈증상 (어지러움, 오심, 식욕부진, 권태감, 호흡곤란 등)이 발생한다.

그 외 암의 진행여부에 따라 대장 내강을 막을 경우 장폐쇄에 의한 증상이 유발되고 복부종괴로 발견되는 경우도 있으며 원발병소보다 간이나 폐에 전이되어 증상이 유발되는 경우도 있다.

4. 대장암의 진단

(1) 잠혈검사: 대변잠혈검사는 대장암에 대한 선별검사 (screening)로서 간 단히 받을 수 있는 검사이다. 다른 원인에 의해 잠혈 반응이 양성반응으로 나타날 수 있으므로 반드시 대장암이라고 할 수 없다.

(2) 종양표지자 검사: 혈액검사에 의한 CEA (암태아성항원)를 측정하는 것이다. 대장암 환자의 약 50% 정도에서 CEA 수준이 증가되어 있으나, CEA 수준이 높다고 반드시 대장암인 것은 아니다. 따라서, CEA 수준이 높은 경우, 대장암일 가능성이 높기 때문에 추가로 진단 시험을 할 필요가 있다. 또한, CEA는 수준의 검사는 치료 후 재발여부를 평가하는데 사용된다.

(3) 대장조영술: 방사선학적으로 대장 점막의 윤곽변화를 보고 대장암을 발견하는 검사법이다. 전체 대장의 윤곽을 볼 수 있으며 수술 전에 암의 위치를 확인할 수 있다.

(4) 대장 내시경: 에스자 결장까지를 관찰하는 짧은 내시경과 맹장까지 모든 대장을 관찰하는 긴 내시경이 있으며 대장 조영술보다 정확도가 높다. 조직 검사를 시행할 수 있어 확진이 가능하고 용종 등을 제거할 수도 있어 대장암 진단에 반드시 필요한 검사법이다.

(5) 복부 초음파나 복부 컴퓨터 단층촬영: 대장 조영술과 대장 내시경을 통해 대장암이 진단된 경우 병의 국소적 진행정도와 원격전이 등을 보기 위한 검사법이다.

(6) 종양표지자 검사 (CEA and Serologic tumor marker)

대장암을 조기진단 하기 위해, 여러 종류의 단백질, 당 단백 물질이 종양 표지자로서의 가능성을 위해 광범위하게 연구되었으나, 대장암에 특이적인 종양 표지 자는 없는 실정이다. 그러나 현재 널리 사용되고 있는 CEA는 수술전 병기 결정이나 수술후 대장암의 재발유무를 검진하는 데 사용되고 있으나 무증상인 환자에서는 부적합하다.

5. 대장암의 병기와 치료방법

대장암의 병기는 Dukes 분류법을 사용하며 대장 점막의 침윤 정도와 주위 림프절 전이 정도, 타장기의 전이 유무에 따라 A,B,C,D로 분류한다. 각 병기는 다른 암과 마찬가지로 수술후 결정되며 병기에 따라 치료법과 예후의 차이가 있다.

(1) 내시경적 치료

최근 내시경은 대장암의 진단에 있어 필수적인 검사법으로 인정될 뿐아니라 대장암의 예방과 치료에서도 중요한 역할을 하고 있다. 내시경을 이용하여 암으로 진행될 수 있는 용종을 암이 되기 전에 미리 제거하여 대장암 발생율을 낮출 뿐 아니라 용종형태의 크기가 작은 대장암의 경우 내시경적 절제술만으로도 치료가 가능하다.

(2) 수술

대장암의 치료의 주된 치료법으로 치료 성적에 중요한 영향을 미친다. 암의 발생 부위에 따라 수술법은 차이가 있는데 결장인 경우엔 암이 있는 결장부위와 주위 림프절을 제거한 후 잘린 대장의 끝부분을 서로 연결하는데, 직장인 경우 항문에서 어느 정도 떨어져 있느냐에 따라 항문을 유지할수도 있고 항문을 제거하여 인공항문을 만들 수도 있다.

(3) 방사선 요법

직장암에서는 병기에 따라 수술후 항암제와 더불어 시행하고 있는 치료법이다. 5~6주간 주 5일씩 치료하며 원발부위 재발과 골반내 림프절 전이율을 줄인다.

(4) 항암제 치료

수술후 대장암 B 단계로 진단된 경우 항암제 치료 여부에 대해서는 아직 논란이 많아 어떤 기관에서는 시행하기도 하고 어떤 기관에서는 수술 후 관찰 및 주기적 검사만을 시행하기도 한다. 그러나 C 단계 대장암에서는 6개월 내지 1년간의 항암제 치료가 표준치료로 인정받고 있으며 D 단계는 말기로 항암제의 효과가 현저히 줄어들지만 다른 치료가 불가능하기 때문에 항암제 치료를 시행하고 있다.

6. 치료 성적

각 병기의 수술 후 5년 생존율은 병기 A에서는 90%, B에서는 80%, C에서는 45%,그리고 D에서는 10%미만이다. 대장암 역시 다른 암처럼 병기가 진행됨에 따라 5년 생존율이 현저히 감소함을 알 수 있어 조기진단과 치료가 매우 중요한 암이라 할 수 있다.

7. 예방

대장암과 직장암의 확실한 원인은 아직까지 밝혀져 있지 않다. 알려진 바에 의하면 동물성 지방질과 고기 섭취가 증가하는 경우 발생율이 증가하는 것으로 추측된다. 따라서, 동물성 지방질의 과다한 섭취를 피하고 신선한 채소류와 섬유질이 많은 음식을 골고루 균형있게 섭취할 것을 권장한다. 또한, 진한 색소와 방부제 등 화학물질이 포함된 음식물도 많이 먹지 않는 것이 좋다.

대장암과 관련이 많은 병이 있는데, 가족성 대장 용종증, 특발성 비특이성 궤양성 대장염, 대장 및 직장용종과 같은 질병이 있는 경우에는 특별한 관심을 가지고 주기적인 검사를 받는 것이 대장암과 직장암 예방에 도움이 된다.

이상과 같이, 종래 대장암 특이적인 마커로 CEA가 알려져 있었으나, 대장암을 조기에 진단하는 데에는 많은 문제점이 여전히 남아 있다.

종래 C14orf120 (NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371)은 인체 염색체 14의 오픈리딩 프레임 120으로 그 기능은 밝혀진 바 없었다. 컴퓨터에 의한 자동분석 결과, 상기 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 Sas10/Utp3 패밀리에 속하는 Sas10 및 Utp3 요소를 가지고 있으나, 이 패밀리의 정확한 기능은 알려진 바 없다. c14orf120 유전자는 14q11.2 밴드에 존재하는 것으로 알려져 있다.

또한, 종래 인간의 c14orf120 유전자에서 약 5 개 정도의 단일염기 다형 (SNP)가 관찰되었다. 그러나, 이들 단일염기다형과 직장암과의 연관성이 있는지 여부는 전혀 개시된 바 없다. 단일염기다형이란 생물체에서 나타나는 유전자의 다형 중 하나로서 유전자 다형에는 RFLP (restriction fragment length polymorphism: 제한 단편 길이 다형), STR (short tandem repeats), VNTR (variable number tandem repeat), SNP(single nucleotide polymorphism : 단일염기 다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기 다형으로서, 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 단일염기 다형은 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현될 수도 있다. 다른 경우에는 비코딩 영역 서열에 단일염기 다형이 발생할 수 있다. 이들 중 일부 는 결함 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다 (예를 들면, 결함 있는 스플라이싱의 결과로서). 어떤 단일염기 다형은 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수 있다.

단일염기 다형은 인간의 경우 약 1,000bp 마다 1회의 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 단일염기 다형이 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 단일 염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 단일염기 다형에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용될 수 있다. 현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능 분석에 관한 연구를 수행하고 있다. 이렇게 찾아낸 단일염기 다형의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개, 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고 있다. 그러나 이러한 단일염기 다형은 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 단일염기 다형이 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.

따라서, 이상과 같은 종래 기술에 의하면, 종래 대장암 특이적인 마커는 CEA외에 알려진 것이 없으며, 특히 C14orf120가 대장암 특이적으로 발현된다는 사실은 알려진 바 없다. 또한, c14orf120 유전자 상에서의 유전적 다형성이 대장암과 특이적으로 연관되어 있다는 사실도 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 C14orf120의 세포에서의 발현과 기능을 밝히고자 노력하던 중, 상기 C14orf120이 대장암과 연관되어 있다는 사실 및 c14orf120 유전자 상 에서의 단일염기 다형이 대장암과 연관되어 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 대장암과 연관된 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 단백질을 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 대장암과 관련 있는 단일염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 대장암과 관련있는 단일염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이 또는 대장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 대장암과 관련 있는 폴리뉴클레오티드의 분석 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 아미노산 서열을 갖는 핵인 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 피검체에 있어서 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 대장암의 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단백질의 발현량은 상기 피검체 유래의 세포 중의 상기 단백질의 양 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정되는 것일 수 있다. 상기 단백질의 발현량이 정상 세포의 발현량에 비하여 20 % 이상 증진되어 있는 경우, 상기 피검체를 대장암 환자 또는 대장암에 걸린 위험이 높은 것으로 판정하는 것이 바람직하나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

종래 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 C14orf120으로 알려져 있으며, 인체 염색체 14의 오픈리딩 프레임 120으로 그 기능은 밝혀진 바 없었다. 컴퓨터에 의한 자동분석 결과, 상기 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 Sas10/Utp3 패밀리에 속하는 Sas10 및 Utp3 요소를 가지고 있으나, 이 패밀리의 정확한 기능은 알려진 바 없다. XP_033371의 단백질의 아미노산 서열은 서열목록 13에 나타내었다.

본 발명자들은 상기 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 정상 세포와 암세포에서의 발현 수준을 조사하였다. 그 결과 상기 단백질은 정상 세포 및 다른 암세포에 비하여 특히, 대장암 세포에서 발현 수준이 현저하게 증가되어 있었다. 도 1 및 2는 다른 암세포 및 정상 세포에 비하여 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 대장암 세포에서 현저하게 많은 양으로 발현되는 것을 나타내는 도면이다.

다음으로, 본 발명자들은 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질의 유전자를 SNU-449 세포주로부터 분리하고 클로닝한 다음, GFP 단백질과의 융합된 유전자를 클로닝하고 이를 골육종 세포주 (U2OS)에 형질전환하여 세포 내의 발현 위치를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 간기 및 체세포 분열시에 핵인 (nucleolus)에 존재하는 것으로 확인되었다. 도 3 및 4는 각각 간기 및 체세포 분열시에 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 핵인에서 발현됨을 나타내는 도면이다. 도 5는 핵인 단백질 B23에 대한 항체를 이용하여 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질이 핵인에서 발현됨을 보여주는 도면이다. 또한, 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 핵인의 해체 (disassembly)에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 도 6은 GFP-XP_033371 융합단백질이 핵인의 해체에 관여한다는 것을 보여주는 도면이다.

또한, NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질과 상호작용하는 단백질을 확인하기 위하여 효모 2-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 이용하여 조사한 결과, 표 1과 같은 단백질과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.

표 1.

서열 명칭	유전자	서열분석된 영역	비고	상태	코딩서열
C2				실패
C3	Myc-결합단백질 연관 단백질	179-2332	가상 단백질	양호	75-2918
C4	YB-1	839-1500		양호	115-1089
C5	AATF	271-1051	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C6	AATF	223-1011	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C8	Myc-결합단백질 연관 단백질	2493-2988	AMY1-연관 단백질1;Myc-결합단백질연관 단백질	양호	75-2918
C10	Myc-결합단백질 연관 단백질	2746-2988	AMY1-연관 단백질1;Myc-결합단백질연관 단백질	양호	75-2918
C11	AATF	271-1054	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C12	AATF	214-994	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C14	AATF	271-1046	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C15	Myc-결합단백 질 연관 단백 질	2743-2988	AMY1-연관 단백질1;Myc-결합단백질연관 단백질	양호	75-2918
C16	AATF	17-774	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C17	AATF	262-1043	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C18	Myc-결합단백 질 연관 단백 질	2746-2988	AMY1-연관 단백질1;Myc-결합단백질연관 단백질	양호	75-2918
C19	Myc-결합단백 질 연관 단백 질	2743-2988	AMY1-연관 단백질1;Myc-결합단백질연관 단백질	양호	75-2918
C20,C21	Myc-결합단백 질 연관 단백 질	2538-2988	AMY1-연관 단백질1;Myc-결합단백질연관 단백질	양호	75-2918
C23	AATF	223-1051	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C29				실패
C30	AATF	587-1415	세포사 길항 전사인자	양호	180-1852
C34				실패
C36				실패
C37	AATF	17-835	세포사 길항 전사인자	양호	180-1862
C38	C1QBP	216-1032	보체인자1, 1 서브요소 결합단백질	양호	22-870

표 1에 나타낸 바와 같이, 총 18개의 양성 콜로니가 발견되었으며, C1QBP1, YB-1이 각각 1개, AATF가 10개, Myc 결합단백질 연관 단백질 6개 발견되었다.

이상과 같은 결과로부터, NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 핵인에 존재하고, 핵인에 연관되어 있는 기능을 가지고 있으며, 유사분열시에 염색체에 존재하는 것으로 미루어 세포 주기와 관련된 기능을 가지고 있다. 또한, AATF와 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 기능상 연관성이 있다. AATF는 RB와 결합하고, RB의 성장억제 기능을 저해하는 종양단백질로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 AATF와 결합하여 RB의 결합을 촉진 또는 협력하여 종양을 유발하는 기능을 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 유래한 c14orf120 유전자 부위에 존재하는 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 다형성 부위 (101 번 위치) 뉴클레오티드를 포함하는 대장암 진단 또는 치료용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 서열번호 1 내지 5의 다형성 부위를 포함하는 10 개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 상기 길이는 10 내지 400 뉴클레오티드, 바람직하기로는 10 내지 100 뉴클레오티드, 더욱 바람직하기로는 10 내지 50 뉴클레오티드인 것이다. 여기서 각 서열의 다형성 부위의 위치는 101번 위치이다.

상기 서열번호 1 내지 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기 다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기 다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 서열번호 1 내지 5의 다형성 서열 중 다형성 부위 (101 번 위치)는 대장암과 연관성이 있는 것이다. 이는 대장암 환자와 정상인으로부터 유래한 혈액 시료로부터 얻어진 DNA를 서열 분석한 결과를 통하여 확인할 수 있었다. 표 2 및 3은 서열번호 1 내지 5의 다형성 서열의 대장암과의 연관성 및 상기 다형성 서열의 특성을 나타낸 것이다.

표 2.

표2 (계속).

표 3. 서열번호 1 내지 5의 다형성 서열의 특성

표 2 및 3에 있어서, 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍ A1과 A2는 시쿼넘 (Sequenom)사의 균질적 MassEXTEND (homogeneous MassEXTEND : 이하 hME라고도 한다) 기법에 의하여 서열분석을 하는 과정에서 질량이 작은 대립인자를 A1 및 질량이 큰 대립인자를 A2로 임의적으로 실험의 편의상 명명한 것이다.

ㆍrs 번호는 NCBI 젠뱅크에서 부여한 SNP 명칭이다.

ㆍ서열번호는 각 SNP 부위를 포함하는 서열의 서열번호를 나타낸 것으로, 각각 101번째 위치에 A1 및 A2 대립인자를 포함하는 서열을 나타낸 것이다.

ㆍcas-A2, con_A2 및 Delta는 각각 질병군 (case sample)에서의 A2 대립인자의 빈도, 정상군 (normal sample)에서의 A2 대립인자의 빈도 및 상기 cas-A2와 con_A2의 차이의 절대값을 나타내는 것이다. 여기서 cas-A2는 질병군에서 (A2A2 유전자형의 빈도x2 + A1A2 유전형의 빈도)/(질병군의 샘플 수 x2)이고, con-A2는 정상군에서 (A2A2 유전자형의 빈도x2 + A1A2 유전자형의 빈도)/(정상군의 샘플 수 x2)이다.

ㆍ유전형의 빈도 (genotype frequency)는 각 유전자형의 빈도를 나타내는 것으로, cas_A1A1, cas_A1A2 및 cas_A2A2 및 con_A1A1, con_A1A2 및 con_A2A2는 각각 질병군과 정상군에서 A1A1, A1A2 및 A2A2 유전자형을 갖는 사람의 수를 나타낸다.

ㆍ카이제곱 (df=2)은 자유도 (degree of freedom)가 2인 카이제곱 값을 나타낸 것으로, Chi-value는 카이제곱 결과 값으로 p-value 계산의 기준이 되는 값이다. 표 2에 나타낸 Chi-exact-p-value는 p-value of Fisher's exact test of chi-square test를 나타내는 것으로, 유전자형 수의 값이 5 보다 작은 값이 포함되는 경우 일반 카이제곱 검정 결과가 부정확할 수 있으므로, Fisher's exact test를 통해 보다 정확한 통계적 유의성 (p-value)을 검정하는데 사용되는 변수이다. 본 발명에서는 p-value≤ 0.05인 경우 질병군과 정상군의 유전자형기 같지 않다 즉, 유의하다고 판단하였다.

ㆍ위험 대립인자 (risk allele)는 기준 대립인자를 A2로 하여 질병군에서의 A2의 빈도가 정상군에서의 A2의 빈도 보다 큰 경우 (즉, cas_A2 〉con-A2)에는 A2를 위험 대립인자로 하고, 그 반대의 경우에는 A1을 위험 대립인자로 하였다.

ㆍ검정력 4 (power 4)는 데이터가 신뢰할 수 있는지를 검정할 결과를 나타내는 것이다.

ㆍ오즈 비율 (odds ratio : OR)은 정상군 중에서 위험 대립인자를 가질 확률에 대한 질병군 중에서 위험 대립인자를 가질 확률의 비율을 나타낸다. 본 발명에서는 Mantel-Haenszel odds ratio 방법을 사용하였다. CI (confidence interval)는 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타내는 것으로, (하한 신뢰구간, 상한 신뢰구간)을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성이 없어 유의하지 않다

표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 5의 다형성 마커는 대립인자 출현빈도의 기대치와 관찰치 사이의 chi-square 분석 결과, 95% 신뢰도에서 Chi-exact-p-value 값이 6.32x10^-4～4.88x10^-2 범위로서 모두 대조군과 유의하게 달랐으며, 오즈 비율 (odds ratio)의 범위가 1.36～1.52로서 대장암과 연관성이 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 또한, 다형성 부위를 포함한 서열번호 1 내지 5로부터 유래한 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보체와 혼성화하는 대장암 진단용 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 대립형질 특이적 (allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 서열번호 1 내지 5의 각 다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기서, 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행된다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25～30 ℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 그 3′말단이 서열번호 1 내지 5의 다형성 부위 (101번 위치의 염기)와 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개 의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction : LCR)에서는 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 "프로브(probe)"란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙부위 (즉, 15 뉴클레오티드로 된 프로브이면 7번 위치가, 16 뉴클레오티드로 된 프로브이면 8 또는 9번 위치)가 상기 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레 오티드를 포함하는 대장암 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 검체로부터 핵산을 얻는 단계; 및

서열번호 1 내지 5의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 하나 이상의 다형성 부위 (101번째)의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다. 여기서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열이 상기 표 2에 나타낸 바와 같은 위험 대립인자 (risk allele)와 하나 이상이 동일한 경우, 대장암의 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법 중 먼저 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산 에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. 마지막 두 가지의 방법은 등온전사에 근거한 등온 반응과 관련되는 것으로서, 증폭산물로서 30 또는 100배의 단일가닥 RNA 및 이중 가닥 DNA를 생산한다.

본 발명의 방법의 일 구체예는, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 본 발명의 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 유래한 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 101 번째 염기를 포함하는 대장암 진단 또는 치료용 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

마이크로어레이 및 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 대장암과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다.상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 구체예에는, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과 위험 대립인자에 해당하는 뉴클레오티드를 갖는 서열번호 1 내지 5의 다형성 부위의 염기서열이 각각 A, G, C 또는 A인 경우 상기 검체를 대장암 환자 또는 대장암에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 위험 대립인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될 수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : c14orf120 유전자 산물의 기능의 확인

(1) 암세포주 및 정상세포에서의 발현 수준의 확인

여러 암세포주 및 정상세포에서 c14orf120 유전자가 발현되는 정도를 확인하여, 암세포주 및 정상세포를 배양하고, 그로부터 총 RNA를 분리한 다음, 서열번호 6 및 7의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 RT-PCR을 수행하여 c14orf120 유전자의 cDNA 단편을 증폭하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 경구 아데노암, 골암 및 간암에 비하여 대장암에서의 c14orf120 유전자의 발현 수준이 2-8 배 정도 높았다. 도 1에서, 레인 1 내지 7은 각각 IMR-90, Hela (자궁경부샘암종), U2OS (골육종), Hep1 (인간 간세포 암종), HCT116 (인간 대장암 암종), Hep3B (인간 간암), Huh-7 (인간 간암)을 나타낸다.

도 2는 정상조직의 세포에 대하여 복수 조직 노던블롯팅 키트 (BD Biosciences, USA)를 이용한 노던블롯팅 분석에 의하여 c14orf120 유전자의 mRNA의 양을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상조직에서는 c14orf120 유전자의 발현은 미약하였다.

(2) c14orf120 유전자의 클로닝 및 GFP 및 효모 2-하이브리드 융합단백질 발현용 벡터의 제조

SNU-449 세포주로부터 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, c14orf120 유전자에 특이적인 프라이머 (서열번호 6 및 7)를 사용하여 RT-PCR을 통하여 c14orf120 유전자의 cDNA를 얻고, 이를 서열분석하였다. 서열분석 결과, NCBI의 Blast 검색통하여 c14orf120 유전자와 동일한 서열을 가지고 있음을 확인하였다.

다음으로, 상기 PCR 산물은 TA 클로닝에 의하여 pGEM-T-Easy/c14orf120 vector (Promega, USA)에 삽입하였다. 다음으로, 상기 pGEM-T-Easy/c14orf120 벡터로부터 PCR에 의하여 c14orf120 유전자를 증폭하고, pEGFPC1 벡터 (BD Biosciences, USA)에 제한효소 EcoR I 및 BamH I 부위를 사용하여 c14orf120 전장유전자를 삽입하여 GFP-c14orf120 융합 단백질 발현용 벡터, pEGFPC1/c14orf120를 제조하였다. 또한, 상기 pGEM-T-Easy/c14orf120 벡터로부터 PCR에 의하여 c14orf120 유전자를 증폭하고, pGBKT7 벡터 (BD Biosciences, USA)에 EcoR I 및 BamH I 부위에 c14orf120 전장유전자를 삽입하여 효모 2-하이브리드용 벡터, pGBKT7/c14orf120를 제조하였다.

(3) c14orf120 유전자의 세포 내 발현 위치의 확인

도 3은 c14orf120-GFP 융합 단백질 발현용 벡터, pEGFPC1/c14orf120를 간기 의 U2OS 세포주에 형질전환시킨 후, 그로부터 발광되는 형광을 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, GFP-c14orf120 융합 단백질은 핵인에서 발현되는 것이 확인되었다.

도 4는 c14orf120-GFP 융합 단백질 발현용 벡터, pEGFPC1/c14orf120를 U2OS 세포주에 형질전환시킨 후 유사분열시에 그로부터 발광되는 형광을 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, c14orf120-GFP 융합 단백질은 염색체에 위치하는 것이 확인되었다. DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole)는 염색체를 나타내는 표지 시약이며, merge image는 GFP-c14orf120와 DAPI 영상을 합쳐서 세포내 GFP-c14orf120 융합단백질의 발현 위치를 정확하게 판독하는데 사용되었다.

도 5는 핵인 단백질 B23의 항체를 이용하여 C14orf120이 세포 내에서 위치를 확인한 결과를 나타내는 도면이다, 핵인 단백질로 알려진 B23항체를 사용하여 면역형광법 (immunofluorescence assay)으로 B23과 c14orf120의 세포내 위치를 관찰하였다. 세포배양한 U2OS 세포주에 pEGFPC1/c14orf120 벡터를 주입(transfection)하여 형질전환시킨 후, 고정화하고 B23항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. 세척 후 다시 2차 항체와 40분간 반응시키고 DAPI를 처리하여 형광현미경이나 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 B23과 c14orf120은 같은 핵인 부위에 분포함을 확인할 수 있었다.

도 6은 GFP-XP_033371 융합단백질이 핵인의 해체에 관여한다는 것을 보여주는 도면이다. 도 6은 pEGFPC1/c14orf120 벡터를 U2OS 세포에 일시적 형질감염시킨 후 세포에 UV (40J/m²)를 조사하고 6시간 후에 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. GFP-c14orf120를 발현하는 형질전환된 U2OS세포주에 자외선 (40J/m² )을 주사한 후 고정화하여 세포내 변화를 관찰하였다. GFP-null은 GFP만 발현되는 형질전환 된 세포주이고 GFP-C14ORF120는 GFP-c14orf120 융합단백질이 발현되는 형질전환 세포주이다. 자외선에 의해 세포가 손상을 받게 되면 GFP-null 세포주와는 달리 GFP-c14orf120 세포주는 세포핵 전체에 병소(foci)를 형성하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, pEGFPC1/c14orf120 벡터의 처리군에서는 핵인의 해체가 관찰되었다.

(4) c14orf120 유전자와 상호작용하는 단백질의 확인

상기 효모 2-하이브리드용 벡터 pGBKT7/c14orf120를 이용하여 c14orf120와 상호작용하는 단백질을 확인하였다. 실험은 상업용 키트 (BD Matchmarker^TM Systems)를 이용하여 제조사 (BD Biosciences, USA)의 지침서에 따라 수행하였다. 효모 AH109 종에 pGBKT7-c14orf120 벡터를 삽입하여 형질전환체를 구축한 후 인간고환 cDNA 라이브러리 (human testis cDNA library) 벡터가 삽입된 효모 Y187 종과 교배하였다. 24시간 후 이배체 효모를 세척하고 아미노산 (Trp, Leu, His, Ade)이 부족한 제한배지 플레이트에 골고루 도말하였다. 대략 5일-7일 후 형성된 세포군(colony)를 수거하여 베타-갈락토시다아제 방법 (beta-galactosidase assay)으로 C14ORF120와 상호 결합하는 유전자가 함유된 효모를 선발하였다. 이후 콜로니 피시알(colony PCR)을 수행하여 해당 유전자의 염기서열을 파악하였다.

그 결과 표 1에 나타낸 바와 같이, 총 18개의 양성 콜로니가 발견되었으며, C1QBP1, YB-1이 각각 1개, AATF가 10개, Myc 결합단백질 연관 단백질 6개 발견되었다.

이상과 같은 결과로부터, NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 핵인에 존재하고, 핵인에 연관되어 있는 기능을 가지고 있으며, 유사분열시에 염색체에 존재하는 것으로 미루어 세포 주기와 관련된 기능을 있을 확인하였다. 또한, AATF와 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 기능상 연관성이 있음을 알 수 있었다. AATF는 RB와 결합하고, RB의 성장억제 기능을 저해하는 종양단백질로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 NCBI 젠뱅크 허가번호 XP_033371의 단백질은 AATF와 결합하여 RB의 결합을 촉진 또는 협력하여 종양을 유발하는 기능을 한다.

본 발명자들은 이와 같은 사실을 토대로 c14orf120 유전자 중의 단일염기다형이 대장암과 연관성이 있는지를 하기 실시예 2에 나타낸 바와 같이 확인하였다.

실시예 2 : c14orf120 유전자 중의 단일염기 다형의 출현 빈도의 분석

본 실시예에서는 한국인 중 대장암 환자로 판명되어 치료 중인 환자군 (300 명)과 환자군과 동일 연령 대에 해당하면서 아직 대장암의 증상이 없는 정상인 (300 명)의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, c14orf120 유전자 중의 단일염기 다형의 출현 빈도를 분석하였다. 본 실시예에 선택된 단일염기 다형은 공개된 데이터베이스 (NCBI dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)로부터 선택된 rs7151139, rs10142383, rs2236261, rs6573195 및 rs2295706이었다. 분석은 선택된 단일염기 다형 주변의 서열을 이용한 프라이머를 이용하여 시료 중의 단일염기 서열을 분석 하였다.

1. DNA 시료의 준비

대장암 환자 및 정상인으로부터 수집한 혈액으로부터 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 공지의 추출 방법 (Molecular cloning : A Laboratory Manual, p 392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)과 상업용 키트 (Centra system)의 설명서에 따라 이루어졌다. 추출된 DNA 중 순도가 UV 측정치 (260/280nm)가 최소 1.7 이상되는 것만을 선별하여 사용하였다.

2. 표적 DNA의 증폭

분석하고자 하는 단일염기 다형이 포함된 일정한 DNA 영역인 표적 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR 방법은 통상적인 방법으로 진행하였으며, 그 조건은 다음과 같았다. 먼저, 표적 게놈 DNA를 2.5 ng/ml로 준비하였다. 다음으로 다음의 PCR 반응액을 준비하였다.

물(HPLC 급) 2.24㎕

10x 버퍼 (15 mM MgCl₂, 25 mM MgCl₂ 함유) 0.5㎕

dNTP 믹스(GIBCO)(25 mM/각) 0.04㎕

Taq pol(HotStar)(5U/㎕) 0.02㎕

전위/후위 프라이머 믹스 (1μM/각) 0.02㎕

DNA 1.00㎕

총 반응 부피 5.00㎕

여기서, 상기 전위 및 후위 프라이머는 공지의 데이데이터 베이스의 단일염기 다형의 상류와 하류로부터, 적당한 위치에서 선택하였다. 상기 프라이머를 표 4에 정리하였다.

열 순환 반응은, 95 ℃에서 15분 동안 유지하고, 95 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 45회 반복하고, 72 ℃에서 3분 동안 유지한 후, 4 ℃에 보관하였다.

3. 증폭된 표적 DNA 중의 단일염기 다형의 분석

표적 DNA 단편 중의 단일염기 다형의 분석은 시쿼넘 (Sequenom)사의 균질적 MassExtension (homogeneous MassExtension : 이하 hME라고도 한다) 기법을 이용하였다. 상기 MassExtension 기법의 원리는 다음과 같다. 먼저, 표적 DNA 단편 중의 단일염기 다형 바로 전까지의 염기에 상보적인 프라이머 (연장용 프라이머 (extension primer)라고도 한다.)를 제작한다. 다음으로, 상기 프라이머를 표적 DNA 단편에 혼성화시키고, DNA 중합 반응을 일으킨다. 이 때, 반응액 중에 대상 단일염기 다형 대립인자 중 제1 대립인자 염기 (예를 들면, A 대립인자)에 상보적인 염기가 첨가된 후 반응이 멈추도록 하는 시약 (예를 들면, ddTTP)을 포함시킨다. 그 결과, 표적 DNA 단편에 제1 대립인자 (예를 들면, A 대립인자)가 존재하는 경우에는, 상기 제1 대립인자에 상보적인 염기 (예를 들면, T) 하나만이 첨가된 산물이 얻어진다. 반면, 표적 DNA 단편에 제2 대립인자 (예를 들면, G 대립인자)가 존재하는 경우에는, 상기 제2 대립인자에 상보적인 염기 (예를 들면, C)가 첨가된 가장 근접한 제1 대립인자 염기 (예를 들면, A)까지 연장된 산물을 얻게 된다. 이렇게 얻어진 상기 프라이머로부터 연장된 산물의 길이를 질량 분석을 통하여 결정함으로써, 표적 DNA에 존재하는 대립인자의 종류를 결정할 수 있다. 구체적인 실험조건은 다음과 같았다.

먼저, 상기 PCR 산물로부터 결합되지 않는 dNTP를 제거하였다. 이를 위하여 순수 1.53㎕, HME 버퍼 0.17㎕, SAP (shrimp alkaline phosphatase) 0.30㎕를 1.5 ml 튜브에 넣고 혼합하여 SAP 효소 용액을 준비하였다. 상기 튜브를 5,000 rpm에서 10 초 동안 원심분리하였다. 그 후, PCR 산물을 상기 SAP 용액 튜브에 넣고, 밀봉한 다음 37 ℃에서 20분, 85 ℃에서 5분 동안 유지한 후, 4 ℃에 보관하였다.

다음으로, 상기 표적 DNA 산물을 주형으로 하여 균질적 연장 반응을 실시하였다. 반응액은 다음과 같았다.

물(나노급 순수) 1.728㎕

hME 연장 믹스 (2.25 mM d/ddNTPs를 포함하는 10x버퍼) 0.200㎕

연장 프라이머 (각 100μM) 0.054㎕

Thermosequenase(32U/㎕) 0.018㎕

총부피 2.00㎕

상기 반응액을 잘 혼합한 후, 스핀다운 원심분리하였다. 상기 반응액이 든 튜브 또는 플레이트를 잘 밀봉한 다음, 94 ℃에서 2분 동안 유지한 다음, 94 ℃에서 5초, 52 ℃에서 5초, 72 ℃에서 5초를 40회 반복 한 다음, 4 ℃에 보관하였다. 이렇게 얻어진 균질적 연장 반응 산물을 레진 (SpectroCLEAN)을 사용하여 세척하였다.

얻어진 연장 반응 산물을 질량 분석 방법 중 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight)를 이용하여 다형성 부위의 서열을 분석하였다. 상기 MALDI-TOF는 분석하고자 하는 물질이 레이저 빔을 받으면, 이온화된 매트릭스 (matrix)와 함께 비행하여 진공상태에서 반대편에 있는 검출기까지 날아가는 데 걸린 시간을 계산하여 질량을 분석해내는 원리에 의하여 작동한다. 질량이 작은 물질은 검출기에 빨리 도달하게 되는데, 이렇게 얻어지는 질량의 차이와 이미 알고 있는 단일염기 다형의 서열을 근거로 하여 표적 DNA의 단일염기 다형의 서열을 결정할 수 있는 것이다. 표적 서열의 증폭 및 extension 반응에 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.

표 4.

상기와 같은 MALDI-TOF를 사용한 표적 DNA의 다형성 부위의 서열을 결정한 결과는 표 2에 나타내었다. 이 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자 (homozygote) 또는 이형접합자 (heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 그러나 집단 단위에서는 이형접합자 빈도 및 동형접합자 빈도간의 조성은 통계적으로 유의한 수준을 넘지 못한다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으 로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다.

본 발명의 단백질 및 그를 이용한 대장암의 진단 방법에 의하면, 대장암을 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하면, 대장암의 진단, 치료 및 유전자 지문 분석과 같은 대장암과 관련된 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 의하면, 대장암을 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명의 대장암과 관련되는 폴리뉴클레오티드를 분석하는 방법에 의하면, 대장암의 존재 또는 위험의 유무를 효과적으로 진단할 수 있다.

<110> Samsung Elecotronics Co. Ltd. <120> A protein associated with a colon cancer, a polynucleotide associated with a colon cancer comprising single nucleotide polymorphism, microarray and diagnostic kit comprising the same and method for diagnosing a colon cancer using the same <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (101) <223> n=A or G, polymorphic site <400> 1 tctataccac agtagtgttg atctcaagag cttagcatgt tggcttaaag acatccaggg 60 atgaggtgtt ggagtcagat tgagtttgaa tcttagctct ncttgtatta ctgtgttatc 120 ttggccaagt atttaacctc tctgaaatag gttttctcag ggctgtgaag tttggaagat 180 acataaaagc ccaaagaaaa a 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (101) <223> n=C or G, polymorphic site <400> 2 tgacctcagg tgatccaccc acctcggcat cccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc 60 accacaccag gccttgggta ccatgccttg aaccatttca ntgccttttg gagatggatg 120 agttgccagc atccttctta gatccctata tatttgttta tttattgaac aaatacatat 180 taacttatct ttttgaccaa a 201 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Claims

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서열번호 1의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드로서, 101번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이.
서열번호 1의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드로서, 101번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장암 진단용 키트.
피검체로부터 분리된 핵산 시료를 제공하는 단계; 및

서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 하나 이상의 다형성 부위 (101 번째)의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 데이터를 얻는 방법.
제11항에 있어서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 제9항에 따른 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및

상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과 서열번호 1의 상기 다형성 부위의 염기서열이 A인지를 판정하는 단계를 포함하는 방법.