KR20130100075A - 유방암 또는 난소암의 유전성 소인 예측에 유용한 ｂｒｃａ2 유전자 돌연변이 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암 및 난소암의 소인 및 감수성을 판단하기 위해 이용될 수 있는 한국인 특이적인 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이에 관한 것이다.

Description

유방암 또는 난소암의 유전성 소인 예측에 유용한 ＢＲＣＡ2 유전자 돌연변이{BRCA2 germline mutations useful for predicting genetic predisposition of breast cancer or ovarian cancer}

본 발명은 지식경제부의 산업원천기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: 10038662, 과제명: 유방암 및 비뇨생식기 질환의 조기진단을 위한 저가 보급형 질량분석기 개발]

본 발명은 유방암 및 난소암의 발병 유전자로 알려진 BRCA1 및 BRCA2 유전자에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 유방암 및 난소암의 감수성 예측이나 진단시 이용될 수 있는 한국인 특이적인 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이 및 이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

BRCA1 유전자는 염색체 17번에 위치하며 22개의 엑손으로 구성되며, 최초로 유방암 및 난소암의 발병 위험성을 증가시키는 유전자로 검증된 유전자이다. BRCA2 유전자는 염색체 13번에 위치하며, 26개의 엑손으로 구성되고 BRCA1에 이어 유방암 및 난소암의 발병 위험성을 증가시키는 유전자로 검증되었다. 부모 중 한쪽으로부터 BRCA1, BRCA2 유전자 돌연변이를 유전받은 사람은 70세가 될 때까지 유방암 발병 확률이 87%에 이르며, 폐경기 이전의 40 내지 50세에 유방암이 발병할 확률은 59%이다.

BRCA1은 유방암뿐 아니라 난소암의 발병에도 관련이 있어, BRCA1 유전자 돌연변이를 가진 사람의 난소암 발병률은 70세 이전에 44%에 이른다(Ford, et al., 1994). 돌연변이가 일어난 BRCA 유전자는 모계뿐 아니라 부계로부터 유전될 수도 있으며, 여성뿐 아니라 남성도 유전자 돌연변이를 가진 경우, 유방암의 발병율은 높아진다.

대략 유방암의 7%, 난소암의 10%가 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이와 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 이들 두 유전자 중에 돌연변이가 있을 경우, 유방암 발생률이 56~87% 까지 상승되며, 난소암의 발생률도 정상인의 10배 이상으로 상승된다. 또한 유방암, 난소암의 재발율을 증가시키며, 전립선암, 대장암 등 기타 암들에 대한 질병민감도를 증가시키는 것으로 알려져 있다.

BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이 발생빈도는 민족별로 차이가 있으며, 현재까지 3400 여종의 생식세포 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이, 다형성 및 서열 변이가 확인되었다(Breast Cancer Information Core(BIC), National Center for Human Genome Research, National Institute of Health: http://research.nhgri.nih.gov/projects/bic/). BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이의 분석은 유방암의 유전에 관한 이해를 크게 심화시켰으나, 한국인을 대상으로 한 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이의 발생 빈도 및 특이적인 돌연변이 유형에 대해서는 밝혀진 바와 많지 않다. 특히, 유방암은 국내에서 연간 7,600 여명의 신규 환자가 발생하고 있으며, 여성의 경우 위암에 이어 두 번째로 높은 발병률을 기록하고 있다(한국 중앙 암 등록사업 연례보고서).

따라서, 한국인을 대상으로 한 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이 및 단일염기다형성을 포함하는 뉴클레오티드 변이 양상을 연구하여 한국인 특이적인 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이를 파악하는 것이 요구된다. BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이 유무를 분석하는 것은 유방암 및 난소암의 발병 위험성을 조기에 진단함으로써, 보다 적극적인 예방 프로그램을 수행하여 발병위험성을 최소화하는데 기여할 수 있을 것이다. 이에 본 발명자들은 다수의 한국인 유방암 환자들 및 정상인들로부터 수득된 시료를 분석하여, BRCA1 및 BRCA2 유전자 상에 존재하는 돌연변이 유형 및 빈도를 조사하여 유방암 및 난소암 예측 및 진단에 활용할 수 있는 유전자 돌연변이를 확인하였다.

본 발명의 목적은 유방암 및 난소암의 진단에 활용될 수 있는 한국인 특이적인 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유방암 또는 난소암의 진단을 위해 프라이머 또는 프로브로 활용될 수 있는 한국인 특이적인 BRCA1 또는 BRCA2 유전자 돌연변이를 포함하는 20 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 한국인 특이적인 BRCA1 또는 BRCA2 유전자 돌연변이를 포함하는 20개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 서열을 프로브로 포함하는 유방암 및 난소암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 유전자 돌연변이는 다음과 같이 정의된다:

서열번호 1 및 서열번호 6은 각각 BRCA1(Gen Bank Accession No. NM_007294.1) 및 BRCA2(Gen Bank Accession No. NM_000059.1)의 코딩 서열(CDS)을 나타내며, 번역 개시 코돈인 ATG의 A를 뉴클레오티드 +1로 표시한다. BRCA1 및 BRCA2 유전자의 엑손 내의 돌연변이는 각각 서열번호 1 및 서열번호 6를 기준으로 표시된다. 삽입(insertion) 돌연변이는 'ins'로 표시하고, 결실(deletion) 돌연변이는 'del'로 표시하며, 'ins'와 'del' 다음의 문자는 실제 삽입 또는 결실된 뉴클레오티드를 의미한다. 치환(substitution) 돌연변이는 기호'>'를 표시하여 기재하며, '>'앞의 문자는 정상인 BRCA1, BRCA2 유전자의 뉴클레오티드이며, '>' 뒤의 문자는 돌연변이 BRCA1, BRCA2 유전자의 뉴클레오티드를 의미한다.

서열번호 2 내지 5는 GenBank 게놈 기준 서열 NT_010755.15를 참조하고 서열번호 7 내지 14는 GenBank 게놈 기준 서열 NT_024524.13을 참조한다. 서열번호 2 내지 5 및 서열번호 7 내지 14는 각각 BRCA1 및 BRCA2의 인트론(intron) 부위 또는 스플라이싱(splicing) 부위의 돌연변이를 표시하기 위해 이용되며, 해당되는 코돈과 인트론의 접경 부위의 서열, 즉, 코돈과 인트론의 일부를 포함하는 서열을 나타낸다. 인트론의 시작 부위에 존재하는 돌연변이는 선행하는 엑손의 마지막 뉴클레오티드의 번호(코딩 서열 기준) 다음에 '+' 및 이에 뒤이어 상기 뉴클레오티드로부터 돌연변이 부위까지의 뉴클레오티드의 수를 기재하고 그 다음에 돌연변이의 유형을 기재한다. 예를 들면, 'c.547+14delG'는 코딩서열상의 547번째 뉴클레오티드로부터 14번째에 위치한 뉴클레오티드 G가 결실된 돌연변이를 의미한다. 한편, 인트론의 종결 부위에 존재하는 돌연변이는 후행하는 엑손의 첫번째 뉴클레오티드 번호(코딩 서열 기준) 다음에 '-' 부호 및 뒤이어 상기 엑손 상의 뉴클레오티드로부터 상향(upstream)으로 인트론 내의 해당하는 위치까지의 뉴클레오티드의 수를 기재하고 그 다음에 돌연변이의 유형을 기재한다. 예를 들면, 'c.5194-10G>T'는 코딩 서열상의 5194번째 뉴클레오티드로부터 상향으로 10번째에 위치한 뉴클레오티드 G가 T로 치환된 돌연변이를 의미한다.

도 1 및 도 2는 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 구조 및 본 발명에서 확인된 유전자 돌연변이의 개략적인 분포를 도시한다.

본 발명의 일 양태는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 BRCA1 유전자 돌연변이를 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 20-80개, 20-60개, 20-50개, 또는 20-40개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

(1) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 28번째 염기의 G에서 A로의 치환(c.28G>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(2) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 824번째 염기의 G에서 A로의 치환(c.824G>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(3) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1067번째 염기의 A에서 G로의 치환(c.1067A>G)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(4) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1511번째 염기의 G에서 A로의 치환(c.1511G>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(5) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1511번째 염기 G의 중복(c.1511dupG)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(6) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 2077번째 염기의 G에서 A로의 치환(c.2077G>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(7) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 2157번째 염기 A의 중복(c.2157dupA)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(8) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 2296번째 염기와 2297번째 염기에서 AG의 결실(c.2296_2297delAG)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(9) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 2856번째 염기에서 2857번째 염기까지 2개의 염기의 결실(c.2856_2857delTT)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(10) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 2884번째 염기의 G에서 A로의 치환(c.2884G>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(11) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 3213번째 염기의 A에서 C로의 치환(c.3213A>C)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(12) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 3607번째 염기의 C에서 T로의 치환(c.3607C>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(13) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 3982번째 염기 T의 중복(c.3982 dupT)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(14) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 3991번째 염기의 C에서 T로의 치환(c.3991C>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(15) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4092번째 염기에서 4093번째 염기까지 2개의 염기의 결실(c.4092_4093delTT)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(16) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4327번째 염기의 C에서 T로의 치환(c.4327C>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(17) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4459번째 염기의 A에서 G로의 치환(c.4459A>G)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(18) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4586번째 염기의 T에서 C로의 치환(c.4586T>C)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(19) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4985번째 염기의 T에서 C로의 치환(c.4985T>C)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(20) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5080번째 염기의 G에서 T로의 치환(c.5080 G>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(21) 서열번호 1의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5548번째 염기 C의 결실(c.5548delC)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(22) 서열번호 2의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 279번째 염기의 G에서 C로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(23) 서열번호 3의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 200번째 염기의 C에서 T로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(24) 서열번호 4의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 281번째 염기 G의 결실을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및

(25) 서열번호 5의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 245번째 염기의 G에서 T로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.

상기에서, 돌연변이 (1) 내지 (21)은 BRCA1 유전자의 코딩 서열상에 존재하는 돌연변이로서 서열번호 1을 기준으로 표시된다. 이들은 각각 서열번호 1의 해당하는 위치에서 뉴클레오티드의 결실, 중복, 또는 치환 돌연변이에 해당되며, 이에 의해 정상인 BRCA1과 다른 아미노산 서열이 생성되고, 이는 BRCA1 단백질의 생체 내 기능을 변화시킬 수 있다.

또한, 상기에서 돌연변이 (22) 내지 (25)는 BRCA1 유전자의 코딩 서열이 아닌 인트론 또는 스플라이싱 부위에서의 돌연변이이다:

돌연변이 (22)는 코딩 서열 상(서열번호 1)의 5152번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 1번째 위치(서열번호 2의 279번)에 존재하는 뉴클레오티드 G가 C로 치환된 것인 스플라이싱 부위의 돌연변이(c.5152+1G>C)이다. 스플라이싱 부위는 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA1 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (23)은 코딩 서열 상(서열번호 1)의 81번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 상향으로 13번째 위치(서열번호 3의 200번)에 존재하는 뉴클레오티드 C가 T로 치환된 것인 인트론 상의 돌연변이(c.81-13C>T)이다. 인트론은 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA1 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (24)는 코딩 서열 상(서열번호 1)의 547번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 14번째 위치(서열번호 4의 281번)에 존재하는 뉴클레오티드가 결실된 것인 인트론 상의 돌연변이(c.547+14delG)이다. 인트론은 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA1 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (25)는 코딩 서열 상(서열번호 1)의 4986번 위치에 존재하는 뉴클레오티드 바로 다음(서열번호 5의 245번)에 존재하는 뉴클레오티드 G가 T로 치환된 것인 스플라이싱 부위의 돌연변이(c.4986+1G>T)이다. 스플라이싱 부위는 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA1 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 또한 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 BRCA2 돌연변이를 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 20-80개, 20-60개, 20-50개, 또는 20-40개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

(26) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 880번째 염기의 G에서 T로의 치환(c.880G>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(27) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1046번째 염기의 A에서 G로의 치환(c.1046A>G)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(28) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1115번째 염기의 A에서 T로의 치환(c.1115A>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(29) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1176번째 염기부터 1180번째 염기까지 5개의 염기의 결실(c.1176_1180delCTGTG)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(30) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1568번째 염기의 A에서 G로의 치환(c.1568A>G)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(31) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1817번째 염기의 C에서 T로의 치환(c.1871C>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(32) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 2271번째 염기의 A에서 T로의 치환(c.2271A>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(33) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4347번째 염기의 C에서 A로의 치환(c.4347C>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(34) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4478번째 염기에서 4481번째 염기까지 4개의 염기의 결실(c.4478_4481delAAAG)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(35) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4593번째 염기 A의 결실(c.4593delA)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(36) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4802번째 염기의 A에서 G로의 치환(c.4802A>G)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(37) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5351번째 염기 A의 결실(c.5351delA)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(38) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5592번째 염기에서 5593번째 염기까지 2개의 염기의 결실(c.5592_5593delCA)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(39) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5645번째 염기의 C에서 A로의 치환(c.5645C>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(40) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5722번째 염기에서 5723번째 염기까지 2개의 염기의 결실(c.5722_5723 delCT)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(41) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 6100번째 염기의 C에서 T로의 치환(c.6100C>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(42) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 6688번째 염기 A의 결실(c.6688delA)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(43) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 7051번째 염기의 G에서 A로의 치환(c.7051 G>A)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(44) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 7375번째 염기의 A에서 T로의 치환(c.7375A>T)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(45) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 8023번째 염기의 A에서 G로의 치환(c.8023A>G)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(46) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 8944번째 염기의 A에서 C로의 치환(c.8944A>C)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(47) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 9097번째 염기 A의 중복(c.9097dupA)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(48) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 9431번째 염기 C의 결실(c.9431delC)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(49) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 9435번째 염기에서 9436번째 염기까지 2개의 염기의 결실(c.9435_9436delGT)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(50) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 10131번째 염기의 A에서 C로의 치환(c.10131A>C)을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

*(51) 서열번호 7의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 258번째 염기의 G에서 A로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(52) 서열번호 8의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 96번째 염기의 G에서 A로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(53) 서열번호 9의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 294번째 염기의 G에서 A로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(54) 서열번호 10의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 167번째 염기의 A에서 G로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(55) 서열번호 11의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 145번째 염기의 A에서 G로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(56) 서열번호 12의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 124번째 염기의 C에서 T로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;

(57) 서열번호 13의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 270번째 염기의 T에서 C로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및

(58) 서열번호 14의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 124번째 염기의 G에서 A로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.

상기에서, 돌연변이 (26) 내지 (50)는 BRCA2 유전자의 코딩 서열상에 존재하는 돌연변이로서 서열번호 6를 기준으로 표시된다. 이들은 각각 서열번호 6의 해당하는 위치에서 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이에 해당되며, 이에 의해 정상인 BRCA2와 다른 아미노산 서열이 생성되고, 이는 BRCA2 단백질의 생체 내 기능을 변화시킬 수 있다.

또한, 상기에서 돌연변이 (51) 내지 (58)은 BRCA2 유전자의 코딩 서열이 아닌 인트론에서의 돌연변이이다:

돌연변이 (51)은 코딩 서열 상(서열번호 6)의 7976번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 24번째 위치(서열번호 7의 258번)에 존재하는 뉴클레오티드 G가 A로 치환된 것인 인트론 상의 돌연변이(c.7976+24G>A)이다. 인트론은 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (52)은 코딩 서열 상(서열번호 6)의 8488번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 상향으로 1번째 위치(서열번호 8의 96번)에 존재하는 뉴클레오티드 T가 C로 치환된 것인 스플라이싱 부위의 돌연변(c.8488-1G>A)이이다. 스플라이싱 부위는 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (53)은 코딩 서열 상(서열번호 6)의 9117번 위치(서열번호 9의 294번)에 존재하는 뉴클레오티드 G가 A로 치환된 것인 스플라이싱 부위의 돌연변이(c.9117G>A)이다. 스플라이싱 부위는 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (54)는 코딩 서열 상(서열번호 6)의 317번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 상향으로 10번째 위치(서열번호 10의 167번)에 존재하는 뉴클레오티드 A가 C로 치환된 것인 인트론 상의 돌연변이(c.317-10A>G)이다. 인트론은 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (55)은 코딩 서열 상(서열번호 6)의 8633번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 상향으로 26번째 위치(서열번호 11의 145번)에 존재하는 뉴클레오티드 A가 G로 치환된 것인 인트론 상의 돌연변이(c.8633-26A>G)이다. 인트론은 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (56)은 코딩 서열 상(서열번호 6)의 1번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 상향으로 37번째 위치(서열번호 12의 124번)에 존재하는 뉴클레오티드 C가 T로 치환된 것인 5'-UTR 상의 돌연변이(c.1-37C>T)이다. 5'-UTR은 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (57)는 코딩 서열 상(서열번호 6)의 67번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 2번째 위치(서열번호 13의 270번)에 존재하는 뉴클레오티드 T가 C로 치환된 것인 스플라이싱 부위의 돌연변이(c.67+2T>C)이다. 스플라이싱 부위는 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

돌연변이 (58)은 코딩 서열 상(서열번호 6)의 516번 위치에 존재하는 뉴클레오티드로부터 1번째 위치(서열번호 14의 124번)에 존재하는 뉴클레오티드 G가 A로 치환된 것인 스플라이싱 부위의 돌연변이(c.516+1G>A)이다. 스플라이싱 부위는 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로, 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성의 차이 때문에 BRCA2 발현 양상의 변화를 초래할 수 있다.

본 발명에 따르면, BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 상기와 같은 돌연변이를 갖는 사람은 정상인에 비해 유방암 및/또는 난소암의 발생 가능성이 높다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기와 같은 BRCA1 또는 BRCA2 유전자에 존재하는 돌연변이를 포함하는 20 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 서열의 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 또는 프로브를 제공한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 전술된 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자 돌연변이의 존재 유무를 확인하여 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 BRCA1 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (1) 내지 (25)로부터 선택된 2개 이상의 조합을 포함하는 프로브 세트가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 BRCA1 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (1) 내지 (25)로 구성된 프로브 세트가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 BRCA2 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (26) 내지 (58)로부터 선택된 2개 이상의 조합을 포함하는 프로브 세트가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 BRCA2 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (26) 내지 (58)로 구성된 프로브 세트가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (1) 내지 (58)로부터 선택된 2개 이상의 조합을 포함하는 프로브 세트가 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 확인하기 위해 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (1) 내지 (58)로 구성된 프로브 세트가 이용될 수 있다.

이를 위해 이하의 실시예에 상세히 기재된 F-CSGE를 수행한 후 DNA 서열분석(sequencing)을 통해 확인하는 기술 외에 하기와 같이 여러 방법들이 이용될 수 있다:

(가) 엑손 및 인트론 경계 부분을 포함하는 표적 절편들을 각각 돌연변이 유무를 확인할 수 있는 한 쌍의 프라이머로 증폭하여 F-CSCE를 수행하지 않고, 바로 디데옥시(dideoxy) 반응을 통한 서열분석으로 돌연변이의 존재 유무를 확인할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 상기 돌연변이가 일어난 부위 및 이를 포함하는 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 프로브를 쓰지 않고, 바로 돌연변이의 존재 유무를 확인할 수 있다. 또는, BRCA1, BRCA2를 클로닝하여 벡터에 삽입한 후 서열분석을 수행할 수도 있다. 이 경우, 정상 BRCA1, BRCA2 유전자의 염기서열과 서열분석 결과를 서로 비교하여 돌연변이의 존재 유무를 확인할 수 있다.

(나) 유전자 돌연변이의 존재 유무는 또한 제한효소절단법을 이용하여 확인할 수 있다. 이는 BRCA1, BRCA2 유전자의 정상 유전자와 돌연변이 유전자의 염기서열이 서로 다르다는 점에 착안하여, 적당한 제한효소 또는 제한효소와 동일한 결과를 도출하는 화합물을 이용하여 정상 유전자는 절단되고 돌연변이 유전자는 절단되지 않거나 또는 역으로 정상 유전자는 절단되지 않고, 돌연변이 유전자는 절단되는 원리를 이용하는 방법이다. 이와 유사한 방법으로는 돌연변이 위치 부근에 결합한 프라이머를 절단하는 엔도뉴클레아제(endonuclease) 효소가 돌연변이에 의한 부정합 부위는 절단할 수 없는 원리를 이용한 인베이더 등이 있으며, 이들은 모두 본 발명의 돌연변이의 존재 유무를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

(다) 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자 상의 염기 위치 전후에 결합하는 프라이머가 돌연변이 위치의 염기에 따라서 결합하는 정도가 다른 것을 이용하여 돌연변이 양상을 확인하는 방법이 있다. 리버스 도트 블롯(reverse dot blot) 등이 있으며, 형광표지자, 비드 등을 사용한 다양한 방법들을 통해 상기 원리를 이용하여 본 발명의 돌연변이를 포함한 돌연변이의 존재 유무 및 그 양상을 확인할 수 있다.

(라) 대립형질-특이적 PCR(Allele-specific PCR)은 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자 상의 염기 위치 부위에 결합하는 프라이머를 이용한 PCR을 수행함으로써, 돌연변이 위치의 염기에 따라 선택적으로 PCR 반응이 일어나는 원리를 이용하여 돌연변이 양상을 확인하는 방법이다. FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)와 AlphaScan 등이 있으며, 이는 모두 본 발명의 돌연변이의 존재 유무를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

(마) 또 다른 방법으로서, SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)는 유전자의 절편 중에서 단쇄(single strand)를 분석하여 돌연변이 유무를 분석할 수 있다. 이는 돌연변이의 유무에 따라 단쇄의 이중구조가 다르다는 점에 착안하여 전기영동 또는 이와 유사한 결과를 도출할 수 있는 시스템을 이용하여 진단에 이용할 수 있다.

(바) 또 다른 방법으로서, 이형이중가닥(Heteroduplex) 분석법은 이형이중가닥을 생성시켜 이를 염기서열분석기(예를 들면, ABI377)와 같은 장비를 이용하여 분석하는 방법이다. 이와 유사한 방법으로는 생성된 이형이중가닥을 2-D로 분리하는 TDGS(Two-Dimensional Gene Scanning)와 D-HPLC, DGGE 등이 있으며, 이는 모두 본 발명의 돌연변이의 존재 유무를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

(사) 또 다른 방법으로서, 프라이머 연장(primer extension) 분석법은 돌연변이의 유무를 확인하고자 할 때, 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자 상의 염기 위치의 5' 방향에 선택적으로 결합하는 프라이머를 제작하여 부착시킨 후, 중합효소를 이용하여 프라이머를 연장시켜 돌연변이의 유무를 확인하는 방법이다.

(아) 또 다른 방법으로서, 실시간 PCR(real time PCR) 분석법은 돌연변이의 유무를 확인하고자 할 때, 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자 상의 염기 위치 부근에 상보적으로 결합하는 프라이머를 제작하고, 프라이머의 양 말단에 형광표지자와 퀀처(quencher)를 표지하여 PCR의 진행과 함께 유리되는 형광표지자의 양을 측정하여 돌연변이 양상을 확인하는 방법이다. Taqman 등의 방법이 이에 해당되며 이와 유사한 방법으로는 Molecualr beacon 등이 있다. 이는 모두 본 발명의 돌연변이의 존재 유무를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

(자) 또 다른 방법으로서, 올리고뉴클레오티드의 결합을 이용한 분석법(OLA: Oligonucleotide ligation assay)은 돌연변이의 유무를 확인하고자 할 때, 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자 상의 염기 위치 전후에 결합하는 프라이머를 제작하여, 돌연변이 위치에 정확히 상보적으로 결합한 프라이머끼리만 결합효소(ligase)에 의한 결합이 이루어지는 원리를 이용하여 돌연변이 양상을 확인하는 방법이다. OLA와 Colorimetric OLA, OLA에 기반한 DNA 칩 등이 있다. 이는 모두 본 발명의 돌연변이의 존재 유무를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 BRCA1 또는 BRCA2 유전자에 존재하는 돌연변이를 포함하는 20 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 서열의 폴리뉴클레오티드를 프로브로 포함하는 유방암 및/또는 난소암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 일 양태에 따른 마이크로어레이에서, 프로브인 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 20 내지 80개, 20 내지 60개, 또는 20 내지 50개의 연속된 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 일 양태에 따른 마이크로어레이에서, 프로브인 폴리뉴클레오티드는 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지, 서열 택(sequence tag), 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 마이크로어레이는 표면개질 유리, 실리콘, 또는 나일론 등의 재질로 된 작은 고형의 기판 표면에 BRCA1 또는 BRCA2 유전자 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 서열의 폴리뉴클레오티드인 프로브를 고밀도로 부착시킨 마이크로 칩일 수 있다. 마이크로어레이 상의 프로브와 시료 내의 표적 물질과의 혼성화(hybridization) 여부를 검출하여 시료의 BRCA1 또는 BRCA2 유전자의 돌연변이 존재 여부를 확인하고 이를 통해 대상자의 유방암 및/또는 난소암의 소인 또는 감수성을 예측할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자 돌연변이에 기인한 유방암 및/또는 난소암 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 하나 이상의 컨테이너 수단(container means)과 상기 하나 이상의 컨테이너 수단을 밀폐된 공간 내에 수용하도록 구획(compartment)되어 있는 캐리어 수단(carrier means)으로 구성되며, 상기 하나 이상의 컨테이너 수단은 상기 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 내포한다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유방암 및/또는 난소암 유발 유전자인 BRCA1, BRCA2의 뉴클레오티드 서열상에 존재하는 한국인 특이적인 돌연변이의 유형을 제공하여, 유방암 및 난소암의 소인을 저비용, 고효율로 진단할 수 있게 한다.

도 1은 BRCA1 유전자의 구조 및 돌연변이 분포를 개략적으로 도시한다. 번호는 엑손을 나타내며 화살표 머리는 돌연변이가 존재하는 위치를 개략적으로 표시한다.
도 2는 BRCA2 유전자의 구조 및 돌연변이 분포를 개략적으로 도시한다. 번호는 엑손을 나타내며 화살표 머리는 돌연변이가 존재하는 위치를 개략적으로 표시한다.
도 3은 BRCA1 유전자 돌연변이 중 하나인, BRCA1 유전자(서열번호 1)의 1511번째 뉴클레오티드(엑손 11에 위치함) 위치에 G가 삽입된 돌연변이(c.1511dupG)의 F-CSCE 분석 그래프를 도시한다.
도 4는 BRCA2 유전자 돌연변이 중 하나인, BRCA2 유전자(서열번호 6)의 9117번째 뉴클레오티드(엑손 23에 위치함)에서 G가 A로 치환된 돌연변이(c.9117G>A)의 F-CSCE 분석 그래프를 도시한다.

실시예 1. BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자의 돌연변이 검출 및 확인

1. 게놈 DNA의 분리

유방암 및 난소암 환자의 게놈 DNA는 200 ㎕ EDTA-말초혈액으로부터 G-DEX 키트(Catalog No. PK1104, Intron, KOREA)를 이용하여 분리하였다. 대조군으로서 정상인 50인의 말초혈액으로부터 환자군과 동일한 방법으로 게놈 DNA를 분리하였다.

2. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 BRCA1, BRCA2 유전자의 증폭

중합효소 연쇄 반응은 다중(multiplex) 방법으로 수행하였다. 이는 각 PCR 단위 튜브에 동일한 주형을 넣고, 프라이머 쌍을 한 가지가 아닌 이중(duplex), 삼중(triplex) 또는 사중(quadraplex)의 조합으로 첨가하여 수행하는 방법이다. 다중 중합효소연쇄반응법은 전체 중합효소연쇄반응에 소요되는 비용을 1/3 수준으로 절감한다. BRCA1 및 BRCA2는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 각각 24개 및 27개의 엑손을 포함하는 거대 유전자이다. 특히, BRCA1의 엑손 11은 그 크기가 매우 커서 한 쌍의 프라이머에 의해서는 중합효소연쇄반응을 수행할 수 없어서 총 10개의 중복 절편으로 나누어 열 쌍의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 이 엑손 11의 10개의 절편은 11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6, 11-7, 11-8, 11-9, 및 11-10으로 명명하였다. BRCA2는 26개의 엑손 중에서 엑손 10, 엑손 11 및 엑손 27의 크기가 크기 때문에, 엑손 10은 10-1, 10-2, 10-3, 및 10-4로 나누고, 엑손 11은 11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6, 11-7, 11-8, 11-9, 11-10, 11-11, 11-12, 11-13, 11-14 및 11-15로 나누었고, 엑손 27은 27-1 및 27-2로 나누어 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 그 결과, BRCA1 및 BRCA2는 표 1a 및 1b에 표시된 바와 같이 24개의 다중 중합효소연쇄반응을 통해 총 75개의 절편으로 증폭되었다. 각 중합효소연쇄반응의 산물은 20 bp의 전방향 및 역방향 프라이머 염기서열 및 최소 40 bp의 5'- 및 3'-인접(flanknig) 영역을 포함하도록 설계하였다.

표 1A. BRCA1 유전자의 증폭

표 1B. BRCA2 유전자의 증폭

다중 PCR 반응의 구성 및 반응 조건은 각각 표 2 및 표 3에 표시된 바와 같다.

성분	부피(㎕)
10X Taq-완충액(MgCl2 불포함)	1
MgCl2(25 mM)	0.6
프라이머 믹스	1(정방향 0.5 + 역방향 0.5)
dNTPs(각각 10 mM씩)	0.125
Taq 폴리머라아제	0.1
DNA(게놈 DNA)	1
5X Band Doctor	0.4
증류수	5.78
총 부피	10

순서	온도	시간	사이클 수
1	95℃	5분	1
2	95℃	30초	35
	57℃	40초
	72℃	45초
3	72℃	7분	1
4	4℃	∞	-

3. F-CSCE(Fluorescence Conformation Senstitive Capillary Electrophoresis)

F-CSCE는 유전자 염기 서열상에 존재하는 유전자 변이를 검색하기 위해 이용되는 방법이다. 유전자상에 돌연변이가 존재할 경우, 돌연변이 대립형질과 정상 대립형질 간에 이형이중가닥(heteroduplex)이 형성될 수 있다. 그 결과, DNA 이중쇄(double strand)의 3차 구조 형태가 상이해져서 모세관 전기영동 시 이동속도의 차이가 생기는 점을 이용하여, 돌연변이를 검출할 수 있다.

상기에서 수득된 중합효소연쇄반응 산물을 1/5 내지 1/10 비율로 희석하였다. 96 웰 프레이트의 각 웰에 한 종류의 다중 중합효소연쇄반응 산물을 적재하였다(적재 혼합물(loading mix)의 성분: 희석한 산물 0.5 ㎕, GeneScan-ROX 500 DNA 크기 표준 0.5 ㎕, 증류수 8.5 ㎕). ABI 3130 시퀀서에서 구조 분석 폴리머(conformation analysis polymer)를 이용하여 분석하였다. 데이터는 Genemapper 4.0 프로그램을 이용하여 분석했다. 도 3 및 도 4에 개시된 바와 같이, 돌연변이가 있는 유전자와 돌연변이가 없는 정상 유전자(대조군)는 F-CSCE를 통해 나타난 분석결과가 상이한 양상을 보이므로, F-CSCE 상에서의 분석결과가 대조군과 다른 DNA는 염기서열 분석을 통해 그 변이 유무를 최종 분석하였다.

4. DNA 염기서열분석

F-CSCE 분석을 통해 나타난 돌연변이 및 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)의 존재가 예상되는 중합효소연쇄반응 산물은 F-CSCE 분석에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 다시 증폭하여, ABI3730xl 시퀀서(Applied Biosystems)에서 POP7 폴리머를 이용하여 분석하였다. 그 결과, F-CSCE를 통해 돌연변이가 존재하는 것으로 파악된 DNA 절편 상의 구체적인 돌연변이 양상을 분석하였다.

환자군에서 확인된 BRCA1 및 BRCA2 유전자 상의 돌연변이가 병인성 돌연변이(pathogenic mutation)라는 것을 확인하기 위해, 50명의 정상인을 대상으로 동일한 돌연변이의 존재 여부를 조사하였다. 환자군과 달리, 정상인에서는 병인성 돌연변이로 판단된 돌연변이가 전혀 검출되지 않았다.

<110> Lab Genomics <120> BRCA1 and BRCA2 Germline Mutations useful for predicting genetic predisposition of Breast or Ovarian Cancer <130> PN094065 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5589 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggatttat ctgctcttcg cgttgaagaa gtacaaaatg tcattaatgc tatgcagaaa 60 atcttagagt gtcccatctg tctggagttg atcaaggaac ctgtctccac aaagtgtgac 120 cacatatttt gcaaattttg catgctgaaa cttctcaacc agaagaaagg gccttcacag 180 tgtcctttat gtaagaatga tataaccaaa aggagcctac aagaaagtac gagatttagt 240 caacttgttg aagagctatt gaaaatcatt tgtgcttttc agcttgacac aggtttggag 300 tatgcaaaca gctataattt tgcaaaaaag gaaaataact ctcctgaaca tctaaaagat 360 gaagtttcta tcatccaaag tatgggctac agaaaccgtg ccaaaagact tctacagagt 420 gaacccgaaa atccttcctt gcaggaaacc agtctcagtg tccaactctc taaccttgga 480 actgtgagaa ctctgaggac aaagcagcgg atacaacctc aaaagacgtc tgtctacatt 540 gaattgggat ctgattcttc tgaagatacc gttaataagg caacttattg cagtgtggga 600 gatcaagaat tgttacaaat cacccctcaa ggaaccaggg atgaaatcag tttggattct 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Claims (3)

1. 하기의 BRCA2 유전자 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유방암 또는 난소암의 진단을 위한 폴리뉴클레오티드 세트:
   (26) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 880번째 염기의 G에서 T로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (29) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 1176번째 염기부터 1180번째 염기까지 5개의 염기의 결실을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (35) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 4593번째 염기 A의 결실을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (38) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 5592번째 염기에서 5593번째 염기까지 2개의 염기의 결실을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (42) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 6688번째 염기 A의 결실을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (44) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 7375번째 염기의 A에서 T로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (47) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 9097번째 염기 A의 중복을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (48) 서열번호 6의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 9431번째 염기 C의 결실을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
   (52) 서열번호 8의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 96번째 염기의 G에서 A로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 및
   (58) 서열번호 14의 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 124번째 염기의 G에서 A로의 치환을 포함하는 20-100개의 연속 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항의 폴리뉴클레오티드 세트 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드 세트를 프로브로 포함하는 BRCA2 유전자 돌연변이 검출용 마이크로어레이.
3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 세트는 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지되는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.

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