KR20090127939A - 유방암의 위험도 평가, 진단, 예후 및 치료용 마커인 염색체 ２ 및 염색체 １６ 상의 유전적 변이 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암의 감수성 변이인 Chr2q14, Chr2q35 및 Chr16q12 상의 특정한 유전적 변이에 관한 것이다. 그와 같은 변이를 이용하여, 유방암의 위험도를 평가하고 유방암에 대한 증가된 감수성 및/또는 감소된 감수성을 진단하는 방법이 개시된다. 본 발명은 또한 유방암에 대한 감수성을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.

유방암, 유전적 변이, 다형성.

Description

유방암의 위험도 평가, 진단, 예후 및 치료용 마커인 염색체 ２ 및 염색체 １６ 상의 유전적 변이{Genetic variants on chr2 and chr16 as markers for use in breast cancer risk assessment, diagnosis, prognosis and treatment}

본 발명은 유방암의 감수성 변이인 Chr2q14, Chr2q35 및 Chr16q12 상의 특정한 유전적 변이에 관한 것이다. 그와 같은 변이를 이용하여, 유방암의 위험도를 평가하고 유방암에 대한 증가된 및/또는 감소된 감수성을 진단하는 방법이 개시된다. 본 발명은 또한 유방암에 대한 감수성을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.

유방암은 현재 전세계적으로 여성에서 가장 흔한 암이다. 현재 전세계적 발생율은 매년 1,151,000명 이상의 진단되노 신규 환자들이다(Parkin et al., 2005). 유방암 발생율은 선진국에서, 특히, 북유럽 민족 기원의 집단에서 가장 높고, 증가되고 있다. 미국에서, 연간 연령-표준화 발생율(annual age-standardized incidence rate)은 세계 평균을 3배 이상 초과하는, 100,000명 당 약 131명이다. 북유럽 국가들에서의 발생율은 유사하게 높다. 2006년에, 미국에서 214,650명의 침습성(invasive) 유방암 신규 환자들이 진단되고, 41,430명의 사람들이 상기 질환으로 사망할 것으로 추정된다[Jemal, et al., (2006), CA Cancer J Clin, 56, 106-30]. 이 수치에, 2006년에 예상되는 추가적인 61,980명의 유관상피내암 및 유소엽 상피내암(ductal and lobular carcinoma in-situ) 진단이 추가되어야 한다. 개인적인 관점에서, 생애 중에 유방암을 발병할 확률은 미국 여성의 경우 13.2%(즉, 8명의 여성 중 1명이 그들의 생애 동안 유방암을 발병함)이다. 대부분의 암의 경우와 같이, 조기 검출 및 적합한 치료가 중요한 인자이다. 전반적으로, 유방암에 대한 5-년 생존률은 88%이다. 그러나, 국소적 침습성 질환(regionally invasive disease) 또는 전이성 질환을 갖는 개인에서, 그 비율은 각각 81% 및 26%로 감소된다[Jemal, et al., (2006), CA Cancer J Clin, 56, 106-30].

점차적으로, 원발성 유방암 또는 재발성 유방암에 대한 고 위험도를 갖는 개인의 식별이 강조되고 있다. 그와 같은 개인들은 보다 집중적인 스크리닝, 예방적 화학요법, 호르몬 요법에 의해 관리될 수 있고, 매우 높은 위험도를 갖는 개인들의 경우, 예방적 외과수술(prophylactic surgery)에 의해 관리될 수 있다. 집단 스크리닝(mass screening) 프로그램은 의료 서비스에 대해 엄청난 경제적 부담이 되나, 예방적 치료법은 연관된 위험 및 삶의 질의 중요성을 갖는다.

유방암에 대한 유전적 소인(genetic predisposition):

유방암에 대한 공지된 위험 인자들의 두개의 주요한 종류는 내분비계 인자 및 유전학이다. 후자와 관련하여, 유방암 환자의 약 12%가 유방암을 갖는 1명 이상의 1촌 친척(first degree relative)를 갖는다[(2001), Lancet, 358, 1389-99]. 잘 알려진, 우세한 유방암 소인 유전자 BRCA1 및 BRCA2는 보인자(carrier)에게 크게 증가된 유방암 위험도를 부여하고, 일생의 침투도(lifetime penetrance) 추정값은 40-80%의 범위이다. BRCA1 및 BRCA2 돌연변이의 존재가 6건 이상의 유방암 케이스를 갖는 가족의 대부분 및 유방암, 및 난소암 또는 남성 유방암을 포함하는 가족의 높은 비율에서 원인일 수 있다. 그러나, 실제로 그와 같은 가족은 매우 드물다. BRCA1 및 BRCA2 돌연빈이는 보다 적은 수의 케이스를 갖는 가족, 또는 유방암 케이스만을 특징으로 하는 가족에서 훨씬 덜 빈번하게 발견된다. BRCA1 돌연변이와 BRCA2 돌연변이가 가족성 유방암(familiar breast cancer)에 대한 위험도의 15-20%를 차지한다. 비-시조 집단(non-founder population)에서, 모든 일반적인 BRCA 돌연변이가 검출될 수 있는 경우, 2-3%의 우발적(incident) 유방암 환자가 하나의 돌연변이를 가질 것으로 예상된다[Gorski, et al., (2005), Breast Cancer Res Treat, 92, 19-24; (2000), Br J Cancer, 83, 1301-8]. 이 낮은 "발견 가능성(chance to find)" 통계값은 명백한 유전적 소인을 갖는 패밀리 외에서 BRCA 돌연변이 테스트의 타당한 사용을 배제한다(Anon[(2003), J Clin Oncol, 21, 2397-406]). 드문, 높은 침투성 돌연변이가 TP53 및 PTEN 유전자에서 일어나는 것으로 알려져있으나, 이들은 함께 유방암에 대한 전체 유전적 위험도의 5% 이하를 차지한다[Easton, (1999), Breast Cancer Res, 1, 14-7]. 유방암에 대한 고 위험도를 부여하는 보다 많은, 보다 일반적인 돌연변이를 확인하기 위한 연관 연구는 대부분 성공하지 못했다[Smith, et al., (2006), Genes Chromosomes Cancer, 45, 646-55].

최근의 역학적 연구는 유방암 케이스의 대다수가 집단의 소인을 갖는 민감한 소수(predisposed, susceptible minority)에서 일어난다는 것을 확인했다[Antoniou, et al., (2002), Br J Cancer, 86, 76-83; Pharoah, et al., (2002), Nat Genet, 31, 33-6]. 쌍생아 연구로부터의 데이터 및 원발성 유방암(primary breast cancer)을 견뎌낸 환자의 반대쪽 유방에서 암의 일정한 높은 발병율의 관찰은 유방암에 대한 규명되지 않은 위험도의 상당한 부분은 내생적 인자, 가장 가능성있게는 유전적 인자와 관련된다는 것을 나타낸다[Lichtenstein, et al., (2000), N Engl J Med, 343, 78-85; Peto and Mack, (2000), Nat Genet, 26, 411-4]. 이 일반적인(widespread) 위험도를 뒷받침하는 유전적 인자의 지식은 매우 한정되어 있다. 분리(segregation) 분석은 유방암에 대한 규명되지 않은 유전적 위험도는 속성상 다유전자성(polygenic)일 가능성이 매우 높고, 위험 대립인자는 저위험도 내지 중간 위험도를 부여하고 상호간 및 호르몬 위험 인자(hormonal risk factor)와 상호작용할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 연구들은 이 저 위험도 내지 중간 위험도 위험 대립인자들을 포착하는 유전적 프로파일링에 의해 정의될 수 있는 분포의 최고 5분위수와 최저 5분위수 간의 상대적 위험도의 40-배 차이를 예측한다[Antoniou, et al., (2002), Br J Cancer, 86, 76-83; Pharoah, et al., (2002), Nat Genet, 31, 33-6]. 모든 유방암 케이스의 88%는 집단의 소인을 갖는 50%에서 발생하며, 최고 위험도에 있는 집단의 12%가 모든 유방암 케이스의 50%를 차지할 것으로 예상된다[Pharoah, et al., (2002), Nat Genet, 31, 33-6; Pharoah, (2003), Recent Results Cancer Res, 163, 7-18; discussion 264-6]. 따라서, 그와 같이 유전적으로 소인을 갖는 개인의 확인 및 그들을 위한 맞춤화된 의료적 관리 전략의 개발에 초점이 맞춰져 있다.

본 발명자들 및 다른 연구자들은 아이슬란드에서 5촌 이상 친척(5^th degree relative)까지 확장되는 유방암의 유의성 있는 가족성 위험도(familiar risk)가 있다는 것을 입증했다[Amundadottir, et al., (2004), PLoS Med, 1, e65; Tulinius, et al., (2002), J Med Genet, 39, 457-62]. 아이슬란드에서 BRCA1 돌연변이의 가족성 위험도에 대한 기여는 최소인 것으로 사료된다[Arason, et al., (1998), J Med Genet, 35, 446-9; Bergthorsson, et al., (1998), Hum Mutat, Suppl 1, S195-7]. BRCA2 유전자의 하나의 시조 돌연변이(founder mutation)(999del5)는 일반적인 아이슬란드 집단에서 0.6-0.8%의 보인자 빈도(carrier frequency)로 존재하고, 여성 유방암 환자에서는 7.7-8.6%의 보인자 빈도로 존재한다[Thorlacius, et al., (1997), Am J Hum Genet, 60, 1079-84; Gudmundsson, et al., (1996), Am J Hum Genet, 58, 749-56]. 이 단일 돌연변이는 1촌 내지 3촌 친척에서 유전성 유방암 위험도의 약 40%를 차지하는 것으로 추정된다[Tulinius, et al., (2002), J Med Genet, 39, 457-62]. 이 추정값은 비-시조(non-founder) 집단에서 통합된 모든 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이에서 기인되는 15-25%의 가족성 위험도보다 더 높으나, 약 60%의 아이슬란드 가족성 유방암 위험도가 여전히 설명되지 않는다. BRCA2 999del5에 대해 음성으로 테스트된 환자의 1촌 친척은 유방암에 대한 집단 위험도의 1.72배의 위험도를 갖는다(95% CI 1.49-1.96) [Tulinius, et al., (2002), J Med Genet, 39, 457-62].

유방암의 나머지 유전적 위험도에 기여하는 유전적 인자들에 대한 이해는 매 우 제한적이다. 두 개의 유전자, CHEK2 및 ATM의 변이가 저 침투성(low penetrance) 유방암 위험도 유전자인 것으로 정밀하게 확인되었다[Renwick, et al., (2006), Nat Genet, 38, 873-5; (2004), Am J Hum Genet, 74, 1175-82]. 다수의 다른 유전자들이 관련되었으나, 유방암 위험도에 대한 그들의 기여는 매우 큰 표본 세트를 이용한 분석에서 확인되지 않았다[Breast Cancer Association, (2006), J Natl Cancer Inst, 98, 1382-96].

유전적 위험도는 집단 내의 개체들 중에서 유전자 중 미묘한 차이에 의해 부여된다. 유전자는 가장 빈번하게는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNP) 때문에 개체들 간에 상이하나, 다른 변이도 중요하다. SNP는 인간 게놈에서 평균 1000개의 염기쌍마다 존재한다. 따라서, 250,000개의 염기쌍(bp)을 포함하는 통상적인 인간 유전자는 250개의 상이한 SNP를 포함할 수 있다. 소수의 SNP만이 엑손에 위치하고, 해당 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시킨다. 대부분의 SNP는 유전자 기능에 거의 또는 전혀 효과를 갖지 않을 수 있고, 다른 SNP는 해당 유전자에 의해 코딩된 mRNA의 전사, 스플라이싱(splicing), 번역, 또는 안정성을 변화시킬 수 있다. 인간에서 추가적인 유전적 다형성이 DNA의 짧거나 또는 긴 스트레치(stretch)의 삽입, 결실, 전위(translocation), 또는 역전에 의해 유발된다. 따라서, 질병 위험도를 부여하는 유전적 다형성은 단백질의 아미노산 서열을 직접적으로 변화시킬 수 있거나, 해당 유전자로부터 생성된 단백질의 양을 증가시킬 수 있거나, 또는 해당 유전자에 의해 생성된 단백질의 양을 감소시킬 수 있다.

일반적인 질환의 위험도를 부여하는 유전적 다형성이 밝혀져서, 그와 같은 위험 인자에 대한 유전적 테스트가 임상 의학에서 중요해지고 있다. 예는 알쯔하이머병의 차등적 진단(differential diagnosis)을 위해 치매 환자에서 apoE4 다형성의 유전적 보인자를 확인하기 위한 아포리포프로테인(apolipoprotein) E 테스트 및 심부 정맥 혈전증에 대한 소인을 테스트하기 위한 Factor V Leiden 테스트이다. 보다 중요하게는, 암의 치료에서, 종양 세포의 유전적 변이의 진단이 개별 환자를 위한 가장 적합한 치료 방법(treatment regime)의 선택을 위해 이용된다. 유방암 환자에서, 에스트로겐 수용체 발현 또는 Her2(heregulin type 2) 수용체 티로신 키나아제 발현의 유전적 변이가 항-에스트로겐 약물(타목시펜) 또는 항-Her2 항체(Herceptiin)이 치료 계획 내에 포함되어야 하는지 여부를 결정한다. 필라델피아 염색체의 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML) 진단에서, Bcr 및 Abl 수용체 티로신 키나아제를 코딩하는 유전자를 융합하는 유전적 전좌(genetic translocation)는 Bcr-Abl 키나아제의 특이적 저해제인 Gleevec(STI571)이 암의 치료를 위해 이용되어야 한다는 것을 나타낸다. 그와 같은 유전적 변화를 갖는 CML 환자의 경우, Bcr-Abl 키나아제의 저해는 종양 세포의 신속한 제거 및 백혈병의 완화를 가져온다.

유방암의 예방 또는 치료를 위해 범용적으로 성공적인 방법은 현재 존재하지 않는다. 유방암의 관리는 현재 일차적 예방(primary prevention), 조기 진단, 적합한 치료 및 이차적 예방(secondary prevention)의 조합에 의존한다. 유전적 검사를 이 관리 영역의 모든 측면에 통합시켜야 하는 임상적 요구가 존재한다. 암 감수성 유전자의 확인은 또한 (예를 들면, 저분자량 또는 고분자량 약물을 이용하여) 처리될 수 있고 보다 효과적인 치료법을 유도할 수 있는 주요한 분자적 경로를 규명할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 유방암의 위험도를 평가하는 방법에 관한 것이다. 위험도 평가는 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 유방암과 연관된 것으로 확인된 특정한 마커 또는 일배체형(haplotype)을 평가하는 것에 의해, 개인에서 유방암에 대한 증가된 감수성을 결정하는 방법, 및 개인에서 유방암에 대한 감소된 감수성을 결정하거나, 또는 유방암에 대한 보호(protection)를 진단하는 방법을 포함한다.

제1 양태에서, 본 발명은 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트(genotype dataset)에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 유방암에 대한 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19 중 하나에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형(linkage disequilibrium)인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 상기 개인의 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재의 결정에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재의 결정에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 유전형 데이터세트는 특정한 핵산 시료 주형과 관련된 유전형 데이터세트에 담긴 정보에 의해 특정한 개인으로부터 유래될 수 있고, 상기 핵산 시료는 1명의 개인으로부터 유래된 핵산을 포함한다.

다형성 마커의 특정한 감수성 대립인자의 존재의 결정은 그 대립인자에 의해 부여된 특정한 감수성의 존재에 대한 직접적인 표시를 제공한다. 반면에, 그와 같은 감수성 대립인자의 부재의 결정은 유전형 시료 또는 유전형 데이터세트가 유래된 개인에 상기 특정한 감수성이 존재하지 않는다는 표시를 제공한다. SNP 또는 삽입/결실 다형성과 같은 두개의 가능한 대립인자를 갖는 다형성 마커의 특정한 경우에, 특정한 대립인자의 부재의 결정은 (개인에서 특정한 게놈 영역이 결실 또는 중복을 포함하여, 상기 개인의 게놈 내의 특정한 게놈 영역의 단일 카피 또는 두개 이상의 카피가 존재할 수 있는 경우가 아니라면) 개인에서 대안적인 대립인자의 두 개의 카피의 존재를 나타낸다.

제2 양태에서, 본 발명은 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭, 및 rs13387042 LD 블럭과 연관된 마커들의 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, rs4848543 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭 및/또는 rs13387042 LD 블럭과 연관된 마커들은 이 LD 블럭들 중 하나 이상 내에 있는 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 마커들이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 것인 방법에 관한 것이다. 하나의 특정한 구체예에서, 표 10, 표 15 및 표 19에 열거된 마커들과 연관 불균형인 마커들은 0.2보다 큰 r²의 값을 갖는 마커들이다. 또 다른 구체예에서, 표 10, 표 15 및 표 19에 열거된 마커들과 연관 불균형인 마커들은 HapMap CEPH 집단과 같은 코카서스계 집단에서 0.2보다 큰 r²의 값을 갖는 마커들이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위해 이용될 마커를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은

a. 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내의 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 하나 이상의 다형성 마커를 확인하는 단계,

b. 유방암으로 진단되거나 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인의 시료의 유전형 상태(genotype status)를 결정하는 단계, 및

c. 대조군 개인의 시료의 유전형 상태를 결정하는 단계를 포함하고,

상기 대조군 시료에서의 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자의 빈도 대비, 유방암으로 진단되거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 유의성 있는 차이는 상기 하나 이상의 다형성이 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 대조군 시료에서의 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자의 빈도 대비, 유방암으로 진단되거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 증가는 상기 하나 이상의 다형성이 유방암에 대한 증가된 감수성을 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 대조군 시료에서의 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자의 빈도 대비, 유방암으로 진단되거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 감소는 상기 하나 이상의 다형성이 유방암에 대한 감소된 감수성 또는 보호를 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타낸다. 일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내의 마커들 중 하나 이상과 연관 불균형인 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택된다.

본 발명은 또한, 유방암에 대한 위험을 갖거나, 또는 유방암으로 진단된 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인으로부터 수득된 핵산 시료의 유전형을 분석하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 상기 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재는 유방암의 감수성을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 유전형 분석은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 플랭킹(flanking)하는 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해, 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 핵산의 세그먼트를 증폭하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 유전형 분석은 대립인자-특이적 프로브 혼성화, 대립인자-특이적 프라이머 연장(primer extension), 대립인자-특이적 증폭, 핵산 서열결정(nucleic acid sequencing), 5'-엑소뉴클레아제 처리(exonuclease digestion), 분자 표지 분석법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석, 및 단일 가닥 구조 분석(single-stranded conformation analysis)으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 대립인자-특이적 프로브 혼성화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 DNA 서열결정을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 방법은

1) 상기 핵산의 카피를 검출 올리고뉴클레오티드 프로브 및 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브와, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 핵산 간의 특이적 혼성화 조건 하에 접촉시키는 단계로서,

a) 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 의해 주어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고,

b) 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 3' 말단의 검출가능한 표지 및 5' 말단의 퀀칭 모이어티(quenching moiety)를 포함하며,

c) 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'에 배열된 상기 뉴클레오티드 서열의 제2 세그먼트에 상보적이어서, 상기 두개의 올리고뉴클레오티드가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 상기 검출 올리고뉴클레오티드에 대해 3' 에 위치하며, 및

d) 상기 제1 세그먼트와 상기 제2 세그먼트 간에 단일 염기 갭(single base gap)이 존재하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 간에 단일 염기 갭이 존재하는 것인 단계,

2) 상기 검출 프로브가 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 검출 프로브의 3' 말단으로부터 상기 검출가능한 표지를 절단하여 유리된 검출가능한 표지를 방출시키는 엔도뉴클레아제로 상기 핵산을 처리하는 단계, 및

3) 유리된 검출가능한 표지를 측정하는 단계로서, 상기 유리된 검출가능한 표지의 존재는 상기 검출 프로브가 상기 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고, 상기 다형성 부위의 서열이 상기 검출 프로브의 상보체(complement)라는 것을 나타내는 것인 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 유방암 치료제에 대한 반응의 확률에 대해 개인을 평가하는 방법으로서, 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 마커의 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 상기 치료제에 대한 양성 반응의 확률을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 치료제는 화학요법제 또는 호르몬 요법제이다. 일 구체예에서, 상기 호르몬 요법제는 선택적 에스트로겐 수용제 조절제(Selective Estrogen Receptor Modulator) 또는 아로마타아제 저해제(Aromatase inhibitor)이다. 바람직한 구체예에서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절제는 타목시펜 및 랄록시펜으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 아로마타아제 저해제는 엑세메스탄(Exemestane), 아나스트로졸(Anastrozole) 및 레트로졸(Letrozole)로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 선택적 에스트로겐 수용체 조절제는 아로마타아제 저해제와 조합되어 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 유방암으로 진단된 개인의 예후(prognosis)를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 상기 개인에서 유방암의 악화된 예후를 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 상기 개인의 예후는 원칙적으로 이차 종양의 형성, 종양의 급속한 확산, 종양의 등급(단계 0 내지 단계 IV) 및 종양의 재발을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 질환의 진행의 특징적인 패턴에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 유방암의 치료를 받는 개인의 치료의 진행을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재가 상기 개인의 치료 결과를 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 치료는 외과수술적 치료, 화학요법 치료, 방산선 치료, 유전자 치료 또는 면역치료 중 하나일 수 있다. 상기 치료는 단독으로 또는 조합되어 이용될 수 있다. 예를 들면, 외과수술적 치료는 화학요법 치료 및/또는 방사선요법 치료로 이어질 수 있다. 상기 개인의 치료 결과는 치료의 완료시 상기 개인의 종양의 진행과 관련된다. 그와 같은 결과의 척도는 종양의 재발율 또는 가능성, 종양의 확산, 및 이차 종양의 형성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태는 개인에서 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 키트는 상기 개인의 게놈에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자를 선택적으로 검출하는 시약을 포함하고, 상기 다형성 마커는 표 10, 15 및 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 키트에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 또는 rs13387042 (서열번호 2)이다. 또 다른 양태에서, 상기 시약은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편에 혼성화하는 하나 이상의 연속된(contiguous) 올리고뉴클레오티드, 완충액 및 검출가능한 표지를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 시약은 상기 개인으로부터 수득된 게놈 핵산 세그먼트의 반대쪽 가닥에 혼성화하는 한 쌍 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 하나의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편을 선택적으로 증폭시키도록 설계되고, 상기 단편은 크기가 30 bp 이상이다. 또 다른 구체예에서,상기 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 상기 개인의 게놈에 완전히 상보적이다. 또 다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 18개 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 20개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 상기 키트는:

a. 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된 검출 올리고뉴클레오티드 프로브;

b. 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브; 및

c. 엔도뉴클레아제 효소;를 포함하고,

상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시된 뉴클레오티드 서열의 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고; 및

상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 3' 말단에 검출가능한 표지를 포함하고 5' 말단에 퀀칭 모이어티(quenching moiety)를 포함하며;

상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 길이가 5개 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'에 배열된 상기 뉴클레오티드 서열의 제2 세그먼트에 상보적이어서, 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 상기 두개의 올리고뉴클레오티드가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우 상기 검출 올리고뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하며; 및

상기 제1 세그먼트와 상기 제2 세그먼트 간에 단일 염기 갭이 존재하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 간에 단일 염기 갭이 존재하며; 및

상기 핵산을 상기 엔도뉴클레아제에 의해 처리하는 단계는 상기 검출 프로브가 상기 핵산에 혼성화된 경우, 상기 검출 프로브의 3'말단으로부터 상기 검출가능한 표지를 절단하여 유리 상태의 검출가능한 표지를 방출시킨다.

본 발명의 또 다른 양태는 개인에서 유방암에 대한 유전적 지표(genetic indicator)를 결정하는 장치로서,

컴퓨터 판독가능한 메모리; 및

상기 컴퓨터 판독가능한 메모리 상에 저장된 루틴(routine)을 포함하고,

상기 루틴은 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 마커에 대해 하나 이상의 개인의 마커 및/또는 일배체형 데이터를 분석하고, 상기 마커 또는 일배체형 정보에 기반한 결과물(output)을 생성하기 위해 프로세서 상에서 실행되도록 개조되고, 상기 결과물은 상기 개인의 유방암의 유전적 지표로서 상기 하나 이상의 마커 및/또는 일배체형의 위험도 척도(risk measure)를 포함하는 것인 장치에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 루틴은 상기 하나 이상의 마커 대립인자 및/또는 일배체형과 연관된 유방암의 위험도 척도를 더 포함하고, 상기 위험도 척도는 유방암으로 진단된 복수의 개인에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자 또는 하나 이상의 일배체형의 빈도의 지표와 복수의 기준(reference) 개인에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자 및/또는 일배체형의 빈도의 지표의 비교에 기반하며, 상기 개인의 개별적인 위험도는 상기 하나 이상의 마커 대립인자 및/또는 일배체형에 대한 상기 개인의 보인자 상태(carrier status)와 상기 하나 이상의 마커 대립인자 및/또는 일배체형에 대한 위험도 척도의 비교에 기반한다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 또는 rs13387042 (서열번호 2), 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다.

본 발명은 또한, 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단 및/또는 평가하기 위한 시약의 제조에서 올리고뉴클레오티드 프로브의 용도로서, 상기 프로브는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 세그먼트에 혼성화되고, 상기 프로브는 길이가 15 내지 500개의 뉴클레오티드로 구성되는 것인 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

a. 하나 이상의 다형성 마커에 대한 식별자(identifier);

b. 유방암으로 진단된 복수의 개인에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 빈도의 지표(indicator); 및

c. 복수의 기준 개인(reference individual)에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 지표;가 저장되고,

상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커들로부터 선택되는 것인 컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable medium)에 관한 것이다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 개인에서 하나 이상의 일배체형의 빈도가 더 평가되고, 상기 일배체형은 둘 이상의 마커를 포함하며, 상기 하나 이상의 일배체형의 존재는 유방암에 대한 감수성을 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 일배체형은 유방암에 대한 위험 일배체형(at-risk haplotype)이고, 즉, 상기 일배체형은 유방암을 발병할 증가된 위험도를 부여한다. 일 구체예에서, 상기 일배체형은 표 7, 표 8, 표 9, 표 13, 표 14 및 표 18에 열거된 일배체형의 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자는 표 9 및 표 13에 열거된 일배체형에 의해 정의된 일배체형 백그라운드(haplotype background)의 군으로부터 선택된 일배체형 백그라운드 상에 존재한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 유방암에 대한 고 침투성(high penetrance) 유전적 인자를 분석하는 단계를 더 수행하는 것에 관한 것이다. 일 구체예에서, 그와 같은 고 침투성 유전적 인자는 BRCA2 999del5이다. 최근의 증거는 BRCA1 및 BRCA2 변이와 연관된 위험도가 일부 경우에 가족에서 클러스터링(cluster)된 다른 유전적 인자 또는 환경적 인자에 의해 변형된다는 것을 시사한다(Antoniou, A.C., et al. Am J Hum Genet 2008 Mar 18 (Epub ahead of print)). 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 기록되고 알려진(예를 들면, Breast Cancer Mutation Data Base at: http://research.nhgri.nih.gov/bic/ 참조; 또한, 예를 들면, Fackenthal, J.D. & Olopade, O.I., Nature Reviews Cancer 7:937-48 (2007) 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌 참조), BRCA1 및 BRCA2 유전자에서 발견된 고 침투성 돌연변이와 같은, 유방암에 대한 다른 고 침투성 돌연변이가 평가되고 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 기재된 변이들과 조합될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 에스트로겐 수용체 또는 프로게스테론 수용체 상태에 대해 상기 개인을 평가하는 추가적인 단계가 수행된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 에스트로겐 양성 상태 또는 프로게스테론 양성 상태는 rs13387042 대립인자 A 및 rs3803662 대립인자 T, 및 이들과 연관된 마커들, 예를 들면, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들과 연관된 증가된 위험도와 연관된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 이전에 유방암으로 진단되었던 개인에서 하나 이상의 제2 원발성 종양(second primary tumor)을 발병할 위험도를 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, 및 rs3803662 LD 블럭과 연관된 마커들의 군으로부터 선택되며, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 하나 이상의 제2 원발성 종양을 발병할 위험도를 나타내는 것인 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19 중 하나에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커는 rs4848543 LD 블럭과 연관된다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 마커 rs4848543과, 0.2보다 큰 r² 값에 의해 정의된 강한 연관 불균형인 마커들의 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 7, 표 8 및 표 10에 열거된 마커들의 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 STEAP3/TSAP6 유전자와 연관된다. 바람직한 구체예에서, 상기 마커는 rs4848543이다. 다른 구체예에서, 상기 개인에서 하나 이상의 일배체형의 빈도를 평가하는 추가적인 단계가 수행된다. 일 구체예에서, 이 하나 이상의 일배체형은 표 7, 표 8 및 표 9에 열거된 일배체형의 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, BRCA2 999del5와 같은, 유방암에 대한 고 침투성 유전적 인자가 또한 평가된다.

일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 다른 유방암 표현형은 모든 유방암(All Breast Cancer), 다발성 원발성 유방암(Multiple Primary Breast Cancer), 조기 발병 유방암(early onset Breast Cancer) 또는 유방암을 정의하는 다른 의학적으로 인정되는 진단 방법에 의해 정의된 유방암으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, FHS(summed family history)가 유방암과 연관된 표현형이다.

본 명세서에 기재된 바와 같은, 본 발명의 방법, 용도, 키트, 또는 장치의 특정한 구체예에서, 평가대상 개인은 여성이다.

본 명세서에서 유방암에 대한 감수성을 검출하기 위해 유용한 것으로 개시된 마커들은 모두 본 명세서에 기재된 다양한 방법, 키트, 장치 및 용도에서 이용될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명을 실시하기 위해 유용한 하나 이상의 다형성 마커는 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 열거된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들의 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6 중 하나에 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내에 위치한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 서열번호 4 내의 하나 이상의 마커는 표 20에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 서열번호 5 내의 하나 이상의 마커는 표 21에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 서열번호 6 내의 하나 이상의 마커는 표 22에 표시된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 7, 8, 10, 14, 15, 18 및 19에 열거된 마커들의 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 또는 rs13387042 (서열번호 2)와, 0.2보다 큰 r²의 값에 의해 정의된 강한 연관 불균형인 마커들의 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs3803662 (서열번호 3)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs13387042 (서열번호 2)이다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 STEAP3/TSAP6 유전자, LOC643714 유전자, 및/또는 TNRC9 유전자와 연관된다(즉, 연관 불균형이다). 하나의 그와 같은 구체예에서, 상기 하나의 다형성 마커는 STEAP3/TSAP6 유전자, LOC643714 유전자, 및/또는 TNRC9 유전자 내에 위치한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543, rs13387042, rs3803662, rs12922061, rs4784227 및 rs17271951로부터 선택된다.

본 발명의 특정한 방법, 용도, 키트 또는 장치에서, 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재는 유방암에 대한 증가된 감수성을 나타낸다. 본 발명의 다른 방법에서, 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재는 유방암에 대한 감소된 감수성을 나타낸다. 일 구체예에서, 유방암에 대한 증가된 감수성은 하기로 구성된 일배체형 백그라운드의 군으로부터 선택된 일배체형 백그라운드 상에 존재한다:

(i) rs8955398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 1, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4;

(ii) rs8955398 대립인자 4, rs4848543 대립인자 1, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4;

(iii) rs8955398 대립인자 4, rs4848543 대립인자 1, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 2, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4;

(iv) rs8955398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 1, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 2, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 3;

(v) rs8955398 대립인자 4, rs4848543 대립인자 1, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 3;

(vi) rs8955398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 1, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4.

또 다른 구체예에서, 유방암에 대한 증가된 감수성은 하기로 구성된 일배체형 백그라운드의 군으로부터 선택된 일배체형 백그라운드 상에 존재한다:

(i) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 1, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(ii) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 2, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 3;

(iii) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 2, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 3;

(iv) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 3;

(v) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 1, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 2, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(vi) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 2, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 1;

(vii) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 1, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 1;

(viii) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 1, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(ix) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 1, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 1;

(x) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 1, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3.

하나의 바람직한 구체예에서, 상기 유방암의 증가된 위험도를 부여하는 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형은 rs4848543 대립인자 1이다. 또 다른 구체예에서, 증가된 위험도는 1.25 이상의 위험도, 1.3 이상의 위험도, 1.4 이상의 위험도, 1.5 이상의 위험도, 1.6 이상의 위험도, 1.7 이상의 위험도, 및 2.0 이상의 위험도를 포함한, 1.2 이상의 상대적 위험도 또는 오즈비를 특징으로 한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재는 유방암에 대한 감수된 감수성(감소된 위험도)을 나타낸다. 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형은 예를 들면, 1 미만의 상대적 위험도(relative risk, RR) 또는 오즈비(odds ratio, OR)를 갖는 표 8, 9, 13, 14 및 18에 열거된 마커 대립인자 및 일배체형의 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 유방암에 대한 감소된 감수성을 나타내는 하나 이상의 대립인자는 하기로 구성된 일배체형 백그라운드의 군으로부터 선택된 일배체형 백그라운드 상에 존재한다:

(i) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 3, rs838066 대립인자 4, rs838100 대립인자 1, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 3 및 rs3731603 대립인자 3;

(ii) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 3, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 1, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 3 및 rs3731603 대립인자 3;

(iii) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 2, rs12711924 대립인자 3 및 rs3731603 대립인자 3;

(iv) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 3, rs838066 대립인자 4, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 2, rs12711924 대립인자 3 및 rs3731603 대립인자 3;

(v) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 3, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 2, rs12711924 대립인자 3 및 rs3731603 대립인자 3;

(vi) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4;

(vii) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 3, rs838066 대립인자 4, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4;

(viii) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 1, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 3, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 3 및 rs3731603 대립인자 3; 및

(ix) rs895398 대립인자 2, rs4848543 대립인자 2, rs6759589 대립인자 3, rs838066 대립인자 2, rs838100 대립인자 1, rs838086 대립인자 1, rs12711924 대립인자 1 및 rs3731603 대립인자 4.

또 다른 구체예에서, 유방암에 대한 감소된 감수성은 하기로 구성된 일배체형 백그라운드의 군으로부터 선택된 일배체형 백그라운드 상에 존재한다:

(i) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 2, rs12621130 대립인자 3, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(ii) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 1, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 1;

(iii) rs10191184 대립인자 1, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 1, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 1;

(iv) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 2, rs12621130 대립인자 3, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 1;

(v) rs10191184 대립인자 1, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 1, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 2, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 3;

(vi) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 1, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 3;

(vii) rs10191184 대립인자 1, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 1, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 1;

(viii) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(ix) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 2, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(x) rs10191184 대립인자 1, rs6435957 대립인자 2, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 2, rs12621130 대립인자 3, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 2, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 1, rs13011060 대립인자 3;

(xi) rs10191184 대립인자 3, rs6435957 대립인자 4, rs10171745 대립인자 3, rs6716542 대립인자 3, rs4491709 대립인자 4, rs12621130 대립인자 1, rs6735174 대립인자 1, rs6435959 대립인자 4, rs2372943 대립인자 3, rs13387042 대립인자 3, rs10490444 대립인자 3, rs13011060 대립인자 1.

일부 구체예에서, 감소된 감수성은 0.8 미만의 위험도, 0.7 미만의 위험도, 0.6 미만의 위험도, 및 0.5 미만의 위험도를 포함한, 0.9 미만의 위험도(상대적 위험도 또는 오즈비)를 특징으로 한다.

원칙적으로, 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 확인된 마커 및 일배체형의 평가는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들 중 하나와 연관 불균형이 아닌, 유방암에 대한 하나 이상의 위험 변이의 하나 이상의 위험 대립인자의 존재 또는 부재에 대해 개인으로부터 수득된 게놈 DNA를 포함하는 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트를 분석하는 것과 조합될 수 있다. 다시 말하면, 본 명세서에 기재된 위험 인자들 중 어느 것과도 연관되지 않은 유전적 위험 인자들은 복수의 위험 인자에 기반하여 개인에 대한 전체 위험도(overall risk)에 대한 추정값을 수득하기 위해, 본 발명의 위험 인자들과 조합될 수 있다. 또한, 전체 통합 위험도(overall combined risk)를 수득하기 위해, 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 개시된 두개 이상의 위험 인자의 분석이 통합될 수 있다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 개인 또는 개인으로부터 유래된 시료에 대해 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)의 분석이 수행되고, 전체 위험도 분석이 수행된다. 또 다른 구체예에서, rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)의 분석이 수행된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법, 용도, 키트 및 장치는 상기 개인의 위험도 평가, 진단, 또는 예후의 판단을 수행하기 위해 비-유전적 정보(non-genetic information)를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 그와 같은 비-유전적 정보는 연령, 성별, 민족, 사회경제적 지위, 과거 질병 진단, 개인의 병력(medical history), 유방암의 가족력(family history), 생화학적 척도, 및/또는 임상적 척도를 포함한다. 유전적 인자 및 비-유전적 인자에 대한 통합 위험도(combined risk)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 수득될 수 있다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 유전적 세그먼트(예를 들면, 마커) 간의 연관 불균형(linkage disequilibrium, LD)은 연관 불균형 척도의 특정한 값을 특징으로 한다. 본 명세서에서 더 설명되는 바와 같이, 연관 불균형은 LD 척도 r² 및 |D'|의 특정한 수치값을 특징으로 할 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.1보다 큰 r²값을 특징으로 한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.2보다 큰 r²값을 특징으로 한다. 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99를 포함하나, 이에 한정되지 않는, r²에 대한 다른 컷오프 값도 가능하다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.5보다 큰 |D'| 값을 특징으로 한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 연관 불균형은 0.8보다 큰 |D'| 값을 특징으로 한다. 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 및 0.99를 포함하나, 이에 한정되지 않는, |D'|에 대한 다른 컷오프 값도 가능하다. 일부 구체예에서, 연관 불균형은 |D'| 또는 r²에 대한 수치 컷오프 값을 특징으로 한다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 연관 불균형은 0.8보다 큰 |D'| 또는 0.2보다 큰 r²의 수치 컷오프 값, 또는 양자 모두를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, LD는 특정한 집단에서 결정된다. 일부 그와 같은 구체예에서, 상기 집단은 코카서스계 집단, 중국계 집단, 일본계 집단, 및 아프리카계 집단으로부터 선택된다. 특정한 그와 같은 구체예에서, 상기 집단은 코카서스계 집단, 중국계 집단, 일본계 집단, 및 아프리카계 집단으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 집단은 코카서스계 CEPH 집단이다.

본 발명의 방법, 용도, 장치 또는 키트의 특정한 다른 구체예에서, 개체는 특정한 인간 선조(ancestry)로부터 유래한다. 일 구체예에서, 상기 선조는 블랙 아프리카계 선조, 코카서스계 선조 및 중국계 선조로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 블랙 아프리카계 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 아프리카계 미국인 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 유럽계 선조이다. 또 다른 구체예에서, 상기 선조는 코카서스계 선조이다. 특정한 구체예에서, 상기 선조는 유전적 분석 또는 유전형분석을 받는 개인에 의해 자가-보고된다. 다른 구체예에서, 상기 선조는 개인으로부터의 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 대립인자의 존재 또는 부재는 상기 개인의 선조를 나타내는 것인 유전적 결정(genetic determination)에 의해 결정된다.

발명의 상세한 설명

하기에서 본 발명의 바람직한 구체예가 설명된다.

본 발명은 유방암과 연관된 것으로 확인된 다형성 변이 및 일배체형을 개시한다. 일정한 다형성 마커(예를 들면, 마커 rs4848543, 마커 rs13387042 및 마커 rs3803662, 및 이들과 연관 불균형인 마커들, rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, 및 rs3803662 LD 블럭과 연관된 마커들, 예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22의 마커들, 예를 들면, 표 10, 표 15 및 표 19에 열거된 마커들)에서의 특정한 대립인자 및 그와 같은 대립인자를 포함하는 일배체형이 유방암과 연관된 것으로 확인되었다. 본 명세서에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 그와 같은 마커 및 일배체형은 유방암의 위험 관리를 위해 유용하다. 본 발명의 추가적인 응용은 이 마커들의 특정한 대립인자의 존재 또는 부재를 평가하기 위한 키트를 포함한다.

정의

달리 표시되지 않으면, 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 명세서 내에 기재된 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수치를 포함하며 정의된 범위 내의 각 정수 또는 비-정수 분수(non-integer fraction)를 포함한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 발명에서, 하기의 용어들은 표시된 바와 같은 의미를 갖는다:

본 명세서에 기재된 바와 같이, 종종 "마커(marker)"로 불리는, "다형성 마커(polymorphic marker)"는 게놈 다형성 부위(genomic polymorphic site)를 의미한다. 각 다형성 마커는 다형성 부위에서 특정한 대립인자에 특징적인 두 개 이상의 서열 변이를 갖는다. 따라서, 다형성 마커에 대한 유전적 연관(genetic association)은 특정한 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립인자에 대해 연관이 있다는 것을 의미한다. 마커는 SNP(single nucleotide polymorphism), 마이크로새틀라이트(microsatellite), 삽입, 결실, 중복 및 전위(translocation)를 포함한, 게놈에서 발견되는 임의의 변이 형태의 대립인자를 포함할 수 있다.

"대립인자(allele)"는 염색체 상에 있는 주어진 유전자 좌(위치)의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 다형성 마커 대립인자는 따라서, 염색체 상의 마커의 조성(즉, 서열)을 의미한다. 개인으로부터의 게놈 DNA는 각 염색체 상의 마커의 각 카피를 대표하는, 임의의 주어진 다형성 마커에 대해 두 개의 대립인자(예를 들면, 대립인자-특이적 서열)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 뉴클레오티드에 대한 서열 코드는 A = 1, C = 2, G = 3, T = 4이다. 마이크로새틀라이트 대립인자(microsatellite allele)의 경우, CEPH 표본(Centre d'Etudes du Polymorphisme Humain, genomics repository, CEPH sample 1347-02)이 기준으로 이용되고, 이 표본에서 각 마이크로새틀라이트의 보다 짧은 대립인자는 0으로 설정되고 다른 표본에서 모든 다른 대립인자는 이 기준에 대비하여 번호가 부여된다. 따라서, 예를 들면, 대립인자 1은 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립인자보다 1 bp 더 길고, 대립인자 2는 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립인자보다 2 bp 더 길며, 대립인자 3은 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립인자보다 3 bp 더 길며, 대립인자 -1은 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립인자보다 1 bp 더 짧고, 대립인자 -2는 CEPH 표본에서의 보다 짧은 대립인자보다 2 bp 더 짧다.

본 명세서에 기재된 서열 코뉴클레오티드 중의성(sequence conucleotide ambiguity)은 IUPAC-IUB에 의해 제안된 바와 같다. 이 코드들은 EMBL, GenBank, 및 PIR 데이터베이스에 의해 사용된 코드들과 양립될 수 있다.

IUB 코드	의미
A	아데노신
C	시티딘
G	구아닌
T	티미딘
R	G 또는 A
Y	T 또는 C
K	G 또는 T
M	A 또는 C
S	G 또는 C
W	A 또는 T
B	C G 또는 T
D	A G 또는 T
H	A C 또는 T
V	A C 또는 G
N	A C G 또는 T (임의의 염기)

집단(자연 집단 또는 인위적 집단, 예를 들면, 합성 분자들의 라이브러리) 내에서 하나 이상의 서열이 가능한 뉴클레오티드 위치가 본 명세서에서 "다형성 부위(polymorphic site)"로 지칭된다.

"단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism)" 또는 "SNP"는 게놈의 특정한 위치에 있는 단일 뉴클레오티드가 종의 멤버 간에 또는 개체 내에서 쌍을 이루는 염색체 간에 상이할 때 나타나는 DNA 서열 변이이다. 대부분의 SNP 다형성은 두 개의 대립인자를 갖는다. 각 개체는 이 경우, 상기 다형성의 하나의 대립인자에 대해 동형접합(즉, 개체의 두 개의 염색체 카피 모두 SNP 위치에서 동일한 뉴클레오티드를 가짐)이거나, 또는 개체는 이형접합이다(즉, 상기 개체의 두 개의 자매 염색체(sister nucleotide)가 상이한 뉴클레오티드를 포함함). 본 명세서에서 보고된 바와 같이, SNP 명명은 NCBI(the National Center for Biotechnological Information)에 의해 각각의 독특한 SNP에 부여된 공식적인 기준 SNP(Reference SNP, rs) ID 식별 택(tag)을 의미한다.

본 명세서에 기재된 "변이(variant)"는 기준(reference) DNA와 상이한 DNA의 세그먼트를 의미한다. 본 명세서에서 정의된 "마커(marker)" 또는 "다형성 마커(polymorphic marker)"는 변이이다. 기준과 상이한 대립인자(allele)는 "변이" 대립인자로 지칭된다.

"마이크로새틀라이트(microsatellite)"는 특정한 부위에 있는 길이가 2 내지 8개의 뉴클레오티드로 구성된 염기의 작은 반복체(repeat)(예를 들면, CA 반복체)를 복수 개 갖는 다형성 마커이며, 전체 집단에서 반복체 길이의 수는 변한다.

"indel"은 통상적으로 단지 수개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 작은 삽입 또는 결실을 포함하는 다형성의 일반적인 형태이다.

본 명세서에 기재된, "일배체형(haplotype)"은 세그먼트를 따라 배열된 대립인자의 특정한 조합을 특징으로 하는 DNA의 하나의 가닥 내에 있는 게놈 DNA의 세그먼트를 의미한다. 인간과 같은 이배체(diploid) 개체의 경우, 일배체형은 각 다형성 마커 또는 유전자 좌에 대해 대립인자의 쌍 중 하나의 대립인자(one member)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 일배체형은 두개 이상의 대립인자, 세개 이상의 대립인자, 네개 이상의 대립인자, 또는 다섯개 이상의 대립인자를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 일배체형은 마커 명칭 및 상기 마커의 대립인자로 기재되며, 예를 들면, 일배체형 "1 rs4848543" 또는 "1-rs4848543"은 마커 rs4848543의 대립인자 1(대립인자 A)이 일배체형에 있다는 것을 의미하고, "rs4848543 대립인자 1(rs4848543 allele 1)" 또는 "rs4848543 대립인자 A(rs4848543 allele A)"와 동등하다. 또한, 일배체형에서 대립인자 코드는 개별적인 마커에 대한 것과 같고, 즉, 1 = A, 2 = C, 3 = G 및 4 = T이다.

본 명세서에 기재된 용어 "감수성(susceptibility)"은 개체(또는 개체들의 군)이 평균 개체들보다 유방암을 발병하는 경향이 있거나, 또는 유방암 발병에 저항할 수 있는 능력이 더 약한 것을 의미한다. 상기 용어는 증가된 감수성 및 감소된 감수성을 모두 포함한다. 따라서, 본 발명의 다형성 마커의 특정한 대립인자 및/또는 일배체형은 1보다 큰 상대적 위험도(RR) 또는 오즈비(OR)를 특징으로 하는, 유방암의 증가된 감수성(즉, 증가된 위험도)을 특징으로 할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형은 1 미만의 상대적 위험도 또는 오즈비를 특징으로 하는, 유방암의 감소된 감수성(즉, 감소된 위험도)을 특징으로 한다.

용어 "및/또는"은 본 명세서에서 상기 용어에 의해 연결된 항목들 중 하나 또는 양자 모두가 포함된다는 것을 나타내는 것으로 이해될 것이다. 바꾸어 말하면, 본 명세서에서 상기 용어는 "하나 또는 그 나머지 또는 양자 모두(one or the other or both)"를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

연관된 유전적 요소(유전자 및/또는 마커)와 관련하여, 용어 "연관된(associated with)"은 상기 요소들이 연관 불균형 상태에 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 용어는 상기 요소들이 0.2 보다 큰 연관 불균형 척도 r² 값에 의해 결정된 연관 불균형 상태에 있다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "참조표(look-up table)"는 하나의 형태의 데이터를 또 다른 형태와 상관시키거나, 또는 하나 이상의 형태의 데이터를 상기 데이터가 관련된 예상되는 결과, 예를 들면, 표현형 또는 성향과 상관시키는 표이다. 예를 들면, 참조표는 하나 이상의 다형성 마커에 대한 대립인자 데이터와, 특정한 대립인자 데이터를 포함하는 개체가 표시할 것 같거나, 또는 그 특정한 대립인자 데이터를 갖지 않는 개인보다 표시할 가능성이 더 높은, 특정한 질병 진단과 같은 특정한 성향 또는 표현형 간의 상관관계를 포함할 수 있다. 참조표는 다면적(multidimensional)일 수 있고, 즉, 참조표는 단일 마커들에 대한 복수 개의 대립인자에 대한 정보를 동시에 포함할 수 있거나, 또는 그들은 복수 개의 마커들에 대한 정보를 포함할 수 있고, 그들은 또한 질병 진단에 대한 세부사항, 인종 정보, 바이오마커, 생화학적 측정값, 치료적 방법, 또는 약물 등과 같은 다른 인자들을 포함할 수 있다.

"컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable medium)"는 상업적으로 구매가능하거나 또는 맞춤-제작된(custom-made) 인터페이스를 이용하여 컴퓨터에 의해 접근될 수 있는 정보 저장 매체이다. 대표적인 컴퓨터-판독가능한 매체는 메모리(예를 들면, RAM, ROM, 플래쉬 메모리, 등), 광학적 저장 매체(예를 들면, CD-ROM), 자기 저장 매체(예를 들면, 컴퓨터 하드 드라이브, 플로피 디스크, 등), 천공 카드(punch card), 또는 기타 상업적으로 구입가능한 매체를 포함한다. 목표 시스템(system of interest)과 매체, 컴퓨터간, 또는 컴퓨터와 저장 또는 저장된 정보의 접근을 위한 컴퓨터-판독가능한 매체 간에 정보가 전달될 수 있다. 그와 같은 전송은 전기적이거나, 또는 IR 링크, 무선 연결 등과 같은 다른 이용가능한 방법에 의해 수행될 수 있다.

"핵산 시료(nucleic acid sample)"는 개체로부터 수득된 핵산을 함유하는 시료이다. 특정한 구체예에서, 즉, 특정한 다형성 마커 및/또는 일배체형의 검출에서, 핵산 시료는 게놈 DNA를 포함한다. 그와 같은 핵산 시료는 혈액 시료, 양수 시료, 뇌척수액 시료, 또는 피부, 근육, 볼 점막 또는 결막 점막, 태반, 위장관 또는 기타 기관으로부터의 조직 시료를 포함한, 게놈 DNA를 포함하는 원천(source)으로부터 수득될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유방암 치료제(breast cancer therapeutic agent)"는 유방암과 연관된 증상을 개선시키거나 또는 예방하기 위해 이용될 수 있는 작용제를 의미한다.

본 명세서에 기재된 용어 "유방암-연관 핵산(breast cancer-associated nucleic acid)"은 유방암과 연관된 것으로 확인된 핵산을 의미한다. 이는 본 명세서에 기재된 마커 및 일배체형 및 이들과 강한 연관 불균형(LD)인 마커 및 일배체형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 유방암-연관 핵산은 특정한 게놈 영역 내에 위치하거나 또는 상기 영역과 연관된(즉, 연관 불균형인) 하나 이상의 다형성 마커를 통해 유방암과 연관된 것으로 확인된 LD-블럭과 같은 특정한 게놈 영역을 의미한다.

용어 "모든 유방암(All Breast Cancer)" 또는 "All BC"는 유방암의 특정한 서브 표현형(subphenotype)과 관계없이, 유방암으로 진단된 모든 개체를 의미한다.

용어 "중간 소인(Medium Predisposition)" 유방암 또는 "MedPre" 유방암은 유방암의 서브-표현형을 의미한다. 이 표현형의 정의는 발단자(proband)가 하기 기준 중 하나 이상을 충족시킬 것을 요구한다:

1. 시발자(proband)는 3M(meiotic event)의 유전적 거리 내에 3명 이상의 영향받은(affected) 친척을 포함하는 유방암 케이스의 클러스터(cluster)의 구성원이다.

2. 시발자는 3M 내의 관계된 영향받은 쌍 중 일 구성원이고, 상기 쌍 중 1인은 50세 이전에 진단받았다.

3. 시발자는 3M 내의 관계된 영향받은 쌍 중 일 구성원이고, 상기 쌍 중 1인은 임의의 종류의 2차 원발성 종양을 진단받았다.

4. 시발자는 임의의 종류의 원발성 종양을 진단받았다.

본 명세서에서 제시된 연구에서 분석된 1600명의 아이슬란드 환자들 중에서, 653명이 MedPre 기준을 충족시킨다(40.8%).

본 명세서에 기재된 용어 "다발성 원발성 유방암(Multiple Primary Breast Tumor)" 또는 "MPBC"는 제1 유방암 진단 외에 하나 이상의 원발성 종양이 진단되고, 상기 두 종양은 상기 제1 유방암과 동시에 또는 상기 제1 유방암에 뒤이어 발생하고 반대쪽 유방 또는 같은쪽 유방에서 발생한, 임상적으로 및 조직학적으로 독립적인 원발성 종양으로 확인된 케이스를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "가족력 점수(Family history score" 또는 "FHS"는 상기 질환을 갖는 시발자에 대해 유방암에 걸린 친척의 수에 근거하여 정의된다. 각 시발자에 대해, 영향받은 1촌 친척 1인당 1점이 부여되고, 영향받은 2촌 친척 1인당 0.5점이 부여되며, 영향받은 3촌 친척 1인당 0.25점이 부여된다. 모든 영향받은 친척에 대해 수득된 총합이 총 가족력 점수(summed family history score) 또는 FHS이다.

본 명세서에 기재된, 용어 "rs4848543 LD 블럭" 또는 "rs4848543 연관 불균형 블럭"은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Build 34의 위치 119,987,002와 120,129,001 및 NCBI Build 36의 위치 119,608,327과 120,129,001 사이에 있는 염색체 2 상의 게놈 영역을 의미한다. rs4848543 LD 블럭은 크기가 141,999 bp이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "STEAP3 유전자" 또는 "TSAP6 유전자"는 종양 억제자 활성화 경로 6(Tumor Suppressor Activated Pathway 6, TSAP6) 유전자로도 불리는, 전립선의 6-막관통 상피 항원(Six-transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate, STEAP3) 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 염색체 2q14.2 상에 존재하고, 위치 120076561-120118373 (NCBI Build 34)에 걸친다.

본 명세서에 기재된, 용어 "rs13387042 LD 블럭" 또는 "rs13387042 연관 불균형 블럭"은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Build 34의 위치 218,062,001과 218,141,002 사이에 있는 염색체 2 상의 연관 불균형(LD) 블럭을 의미한다. 상기 LD 블럭은 79,001개의 염기쌍에 걸친다(Build 34).

본 명세서에 기재된, 용어 "rs3803662 LD 블럭" 또는 "rs3803662 연관 불균형 블럭"은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Build 34의 위치 52,291,041과 52,436,127 사이에 있는 염색체 16 상의 연관 불균형(LD) 블럭을 의미한다. 상기 LD 블럭은 145,086개의 염기쌍에 걸친다(Build 34).

본 명세서에 기재된 용어 "Daly 일배체형(Daly haplotype)"은 HapMap 프로젝트에서 분석된 SNP의 추가적인 세트에 대해 효율적인 대리물(surrogate)(r²>0.8)로 확인된, 주어진 LD 블럭(높은 LD의 영역) 내의 이-마커 일배체형(two-marker haplotype)을 의미한다. 이 추가적인 SNP들은 UTAH CEPH (CEU) HapMap 표본에서 5%보다 큰 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency)를 가지며, 이들은 Hap300 SNP 칩 상에 존재하지 않고 또한 상기 칩에 존재하는 SNP에 의해 효율적으로 태깅되지도 않는다[Pe'er, et al., (2006), Nat Genet, 38, 663-7].

본 명세서에서 정의된 용어 "에스트로겐 수용체 양성 유방암(estrogen receptor positive breast cancer)" 또는 "ER 양성 유방암"은 에스트로겐 수용체의 발현에 대해 양성으로 결정된 유방암 조직의 시료를 의미한다. 에스트로겐 수용체의 발현은 예를 들면, 방사선면역분석법 또는 면역조직화학법에 의해 결정될 수 있다. 10 fmol/mg 이상의 방사선면역계수 측정값(radioimmunometric measurement) 또는 10% 이상의 양성 핵의 방사선조직화학적 평가가 양성으로 간주된다.

본 명세서에서 정의된 용어 "프로게스테론 수용체 양성 유방암(progesterone receptor positive breast cancer)" 또는 "PR 양성 유방암"은 프로게스테론 수용체의 발현에 대해 양성으로 결정된 유방암 조직의 시료를 의미한다. 프로게스테론 수용체의 발현은 예를 들면, 방사선면역분석법 또는 면역조직화학법에 의해 결정될 수 있다. 10 fmol/mg 이상의 방사선면역계수 측정값 또는 10% 이상의 양성 핵의 면역조직화학적 평가가 양성으로 간주된다.

유방암으로 진단된 개체들의 집단의 연관 분석(association analysis)을 통해, 특정한 다형성 마커의 특정한 대립인자가 유방암과 연관된다는 것이 발견되었다. 암과 연관된 변이에 대한 게놈-전체 분석이 세그먼트 Chr2q14 및 Chr2q35 내에 있는 염색체 2의 두 개의 별개의 영역, 및 염색체 16 상의 영역(Chr16q12)과 유방암의 연관을 밝혔다. 이 영역 내에서 특정한 마커 및 일배체형이 유방암의 증가된 위험도와 연관되는 것으로 확인되었다.

표 1에 표시된 바와 같이, 염색체 2q14.2 상의 마커 rs4848543의 대립인자 A (rs4848543 A 대립인자 또는 rs4848543 1 대립인자 또는 A-rs4848543로도 지칭됨)가 유방암의 증가된 위험도와 연관되는 것으로 확인되었다. 4477명의 암-불포함 집단 대조군(cancer-free population control) 대비, 1598명의 환자에서 MedPre 유방암 표현형의 분석은 8.3x10^-8의 p-값으로 1.42의 추정된 상대적 위험도(RR)를 산출했다. 상기 실험에서 사용된 게놈-전체 칩의 일부로 테스트된 317,089개의 SNP 마커에 대한 보정(correction) 후에, p-값은 0.026이었고, 즉, 연관은 게놈-전체 수준에서 유의성이 있었다. 보다 광범위한 All BC 표현형에 대한 연관은 약간 더 약했고, RR-값은 1.16이었다(표 1 참조). 이 결과들은 독립적인 아이슬란드 유방암 코호트에서 재현되었다.

rs4848543 마커는 본 명세서에서 rs4848543 LD 블럭이라 지칭되는 영역 내에 위치한다. 이 SNP 마커, 및 상기 마커와 상관된 마커들(예를 들면, 표 10에 열거된 마커들)은 본 발명의 방법에서 유용하다. 인간 게놈의 국소적 연관 불균형(local linkage disequilibrium) 패턴 때문에, 본 명세서에서 암과 연관된 것으로 확인된 rs4848543과 강한 LD인 다수의 다형성 마커들이 있다. 따라서, 공지된 SNP 또는 마이크로새틀라이트(microsatellite) 또는 indel과 같은 다른 다형성 마커들을 포함한 이 상관된 마커들(예를 들면, 표 10에 열거된 마커들), 및 다른 상관된 SNP 또는 다른 다형성 마커들이 단독으로 또는 조합되어, 본 명세서에 기재된 유방암에 대한 연관을 검출하기 위한 대리 마커(surrogate marker)로서 이용될 수 있다. 특히, rs4848543 LD 블럭 내에 위치한 다른 다형성 마커들이 본 발명의 방법에서 대리 마커로 이용될 수 있는 것으로 예상된다.

게놈-전체 연관 분석을 통해 염색체 2 상의 제2 영역(2q35)이 확인되었다. 마커 rs13387042의 대립인자 A (rs13387042 A 대립인자 또는 rs13387042 1 대립인자 또는 A-rs13387042로도 지칭됨)는 유방암의 증가된 위험도와 연관되는 것으로 확인되었다(표 11 참조). 이 SNP는 STEAP3/TSAP6 유전자 좌(locus)로부터 떨어진 위치에 있는 염색체 2q35 상에 위치한다. 유방암을 갖는 2,181명의 개인들(All BC) 및 12,441명의 집단 대조군의 분석은 rs13387042의 대립인자 A가 4.0x10^-5의 p-값으로 1.19의 위험도를 부여한다는 것을 밝혔다. MedPre 유방암의 위험도(RR)는 Any BC의 위험도와 유사한 것으로 확인되었다. rs13387042에 대한 연관을 검출하기 위해 이용될 수 있는 대리 마커가 표 15에 열거된다.

이 결과는 아이슬란드 집단으로부터의 제2의 독립적 표본(583명의 케이스 및 7966명의 대조군)에서 재현되어, 이 제2 그룹에서 AllBC와 연관된 rs13387042의 대립인자 A에 대해 1.20의 RR의 추정치를 생성하였다(P-값_corr = 3.8x10^-3). 따라서, 독립적인 아이슬란드 표본에서 RR의 매우 유사한 점 추정치(point estimate) 및 2.0x10^-7의 전체 P-값_corr 으로 최초의 발견이 유의성있게 재현되었고, 이는 테스트된 317,089개의 SNP에 대한 Bonferroni 보정 후 유의성 수준에 가까웠다. rs13387042 대립인자 A 변이의 관찰된 빈도와 상대적 위험도는 아이슬란드 집단에서 15.6%의 추정된 집단 귀속 위험도(population attributable risk)에 해당한다.

스페인 표본 및 스웨덴 표본에서의 재현 연구는 이 발견들을 확인했다. 스페인으로부터의 446명의 유방암 케이스 및 977명의 대조군 표본의 분석은 1.21의 RR을 산출했다(P-값 1.8x10^-2; 표 11). A-rs13387042 변이의 빈도는 스페인 대조군 표본에서 더 높아서, 상기 변이는 보다 널리 퍼졌으며 따라서 스페인 추출(Spanish extraction)의 표본에서 보다 높은 유방암 부하(burden)에 기여할 수 있다는 것을 시사했다. 두 개의 스웨덴 코호트, "스웨덴 가족성(Sweden Familial)" 및 "스웨덴 순차성(Sweden Conssecutive)" 도 분석되었다. "스웨덴 순차성(Sweden Consecutive)" 코호트는 유방암에 대해 1.31의 유의성 있는 RR을 보였고(P-값= 2.0x10^-4), "스웨덴 가족성(Sweden Familial)" 코호트는 통계적으로 유의성이 없는, 1.11의 상대적 위험도 추정값을 보였다. 그러나, 전반적으로, 통합된 스웨덴 코호트는 1.22의 유의성 있는 상대적 위험도 추정값을 보였다(P-값= 8.1x10^-4).

아이슬란드 코호트, 스페인 코호트 및 스웨덴 코호트에 대한 추정값을 Mantel-Haenszel 모델을 이용하여 결합 분석(joint analysis)에서 통합하였다. 결과는 3.8x10^-11의 P-값을 갖는 1.20의 추정된 상대적 위험도였다. 이는 조사된 317,089개의 SNP에 대해 보정하기 위해 Bonferroni 방법을 이용한 게놈-전체 유의성에 대한 역치(threshold)보다 훨씬 낮았다. 따라서, 본 발명자들은 rs1338704 대립인자 A가 유럽계 후손의 여러 집단 표본에서 유방암에 대해 유의성있고 재현가능한 위험도를 부여하는 것으로 결론지었다. 전체 집단 귀속 위험도(overall population attributable risk)는 16.4%로 추정되었다.

1600명의 유방암 환자 및 11563명의 대조군으로부터의 데이터를 이용한 추가적인 게놈-전체 SNP 분석은 SNP rs3803662의 대립인자 T(T-rs3803662; rs3803662 대립인자 T)가 Any BC에 대한 1.23-배 증가된 위험도 추정값을 부여한다는 것을 확인하였다(표 16). 이 결과는 594명의 아이슬란드 유방암 환자 및 1433명의 대조군의 제2의 독립적인 코호트에서 확인되었다. 이 두 개의 아이슬란드 표본으로부터의 통합된 데이터는 개인들 간의 혈연관계(relatedness)에 대해 보정되었을 때, 1.23의 상대적 위험도 추정값 및 2.8x10^-7 의 P-값을 생성했다. 이는 10.1%의 추정된 집단 귀속 위험도에 해당했다(표 16). rs3803662에 대한 연관을 검출하기 위해 이용될 수 있는 대리 마커들이 표 19에 열거된다.

전술된 스웨덴 코호트 및 스페인 코호트에서 이 발견의 재현 분석 및 네덜란드, 네이메헨(Nijmegen)으로부터의 1384명의 대조군 및 558명의 유방암 환자의 분석을 수행하였다. 표 16에 표시된 바와 같이, 이 3개의 재현 코호트 모두에서 rs3803662 대립인자 T에 대한 유의성있게 증가된 위험도가 관찰되었다. 이 3개의 비-아이슬란드 재현 코호트의 통합된 분석은 1.35의 전체 상대적 위험도 추정값을 보였고 P-값은 5.1x10^-12이었다. 아이슬란드 코호트와 재현 코호트의 결합 분석은 2.7x10^-17의 P-값을 갖는 1.28의 통합된 상대적 위험도 추정값을 보여주었다. 이는 테스트된 SNP의 갯수에 대해 보정되었을 때, 게놈-전체 유의성에 대한 역치보다 훨씬 낮았다. 상응하는 전체 집단 귀속 위험도는 13.4%였다(표 16).

rs13387042 대립인자 A 및 rs3803662 대립인자 T와 에스트로겐 수용체(ER) 및 프로게스테론 수용체(PR) 상태 간의 연관을 조사하였다. rs13387042 대립인자 A 및 rs3803662 대립인자 T를 포함하는 유의성 있는 유방암 위험도는 ER 양성 종양으로 진단된 환자들에 명확하게 한정되었고 ER 양성 종양과 ER 음성 종양에 대한 OR간의 차이도 유의성이 있었다(표 25). 유사하게, PR 양성 종양으로 진단된 환자들 중에 우세하게 유방암 위험도에 대한 경향이 있었다.

STEAP3/TSAP6의 생물학:

STEAP3/TSAP6에 대한 cDNA는 온도 민감성 p53 유전자를 포함하는 마우스 골수(murine myeloid) LTR6 세포주에서 p53 활성화에 의해 유도된 일련의 mRNA 중 하나로부터 최초로 분리되었다[Amson, et al., (1996), Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 3953-7]. 이 마우스 형은 종양 억제자 활성화 경로 6(Tumour Suppressor Activated Pathway 6, TSAP6)으로 명명되었다. 이후에, 상기 유전자는 LTR6 세포에서 활성화된 p53에 의해 유도될 수 있는 것으로 확인되었다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. pHyde로 지칭된 랫트 버전은 상이한 전이성 성향을 갖는 두 개의 세포주에서 차등적으로 발현된 유전자들을 검출하기 위한 실험 동안 전립선암 세포주로부터 분리되었다[Rinaldy and Steiner, (1999), DNA Cell Biol, 18, 829-36]. pHyde cDNA는 랫트 및 인간 전립선 세포주 및 이종이식편(xenograft)에서 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것으로 확인되었다[Rinaldy, et al., (2000), Gan To Kagaku Ryoho, 27 Suppl 2, 215-22; Steiner, et al., (2000), Cancer Res, 60, 4419-25]. pHyde에 의한 아폽토시스 유도는 이후에 카스파아제-3 경로를 통해 작동하는 것으로 확인되었다[Zhang, et al., (2001), Oncogene, 20, 5982-90]. STEAP3/TSAP6의 하향 조절(down regulation)은 또한 간세포 육종(hepatocellular carcinoma)의 진행과 연관된 것으로 확인되었다[Coulouarn, et al., (2005), J Hepatol, 42, 860-9].

Passer 등은 STEAP3/TSAP6의 인간 버전에 대한 cDNA를 분리하고 그 mRNA가 유방암 세포주 MCF7에서 p53 활성화에 의해 유도가능하다는 것을 확인하였다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. p53에 의한 유도는 전사 수준에서 일어나는 것으로 보이며 -478번 뉴클레오티드와 -357번 뉴클레오티드(accession number AY214461에 의해 정의된 서열) 사이에 있는 STEAP3/TSAP6 프로모터 내의 보존된 p53 반응 요소에 의해 매개되는 것으로 보인다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. 상기 단백질은 488개의 아미노산으로 구성되며, 50-55kDa, 6-pass 막관통(transmembrane) 단백질로 확인되었다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. STEAP3/TSAP6 상에 표적화된 안티센스 RNA는 p53-의존성 아폽토시스를 저해하였고, STEAP3/TSAP6이 아폽토시스의 작동자(effector)로 작용한다는 견해를 더 뒷받침하였다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. STEAP3/TSAP6은 세포 주기 조절 및 아폽토시스에 관여하는 두 개의 단백질, Nix 및 Myt1과 물리적으로 상호작용하였다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. Nix (BNIP3L로도 알려짐)는 미토콘드리아에 존재하는(mitochondrial) Bcl2-관련, 아폽토시스 촉진성(proapoptotic) 단백질이다. Nix 및 STEAP3/TSAP6은 각각 서로의 아폽토시스 촉진성 효과를 강화시킨다[Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9]. Myt1은 사이클린(cyclin) 의존성 키나아제 p34^cdc2를 인산화시키고 그에 의해 저해하는 것에 의해 세포 주기를 G2/M 체크포인트(checkpoint)에서 차단하기 위해 작용하는 듀얼 특이성(Ser/Thr 및 Tyr) 키나아제이다. Myt1과 TSAP6 간의 상호작용은 Myt1을 그의 저인산화된(hypophosphorylated), 활성 상태로 유지시키는 것에 의해 p34^cdc2의 Myt1-의존성 인산화를 촉진한다 [Passer, et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 2284-9].

다소 역설적이나, STEAP3/TSAP6은 최근에 마우스의 nm1054 돌연변이 스트레인에서 소적혈구성, 저색소성 빈혈을 발생시키는 유전자로 확인되었다[Ohgami, et al., (2005), Nat Genet, 37, 1264-9]. 세포외 철(extracellular iron)은 트랜스페린(Tf)에 의해 장, 망상내피 시스템(reticuloendothelial system) 및 간으로부터 체내의 모든 증식 세포로 운반된다. Tf-결합 철은 트랜스페린-수용체(TfR1) 매개 내포작용(endocytosis)에 의해 세포로 들어간다. 철은 산성화에 의해 엔도좀(endosome)에서 Tf로부터 방출되고, 철이 이가 금속 수송체(divalent metal transporter) Dmt1에 의해 세포질로 전달된다. 그 후, Tf 및 TfR1은 세포외 환경으로 리사이클링된다. 환경에 존재하는 철 및 Tf-결합 철은 주로 산성화된 Fe³⁺ (ferric) 상태로 존재하고 세포질막을 통해 전달될 수 있기 전에 Fe²⁺ (ferrous) 상태로 환원되어야 한다. 빈혈과의 연관을 통해, STEAP3/TSAP6는 적혈구 계통 세포(erythroid lineage cell)에서 이 반응을 수행하는 주요한 페리리덕타아제(ferrireductase)로 확인되었고, 이는 STEAP3/TSAP6가 철 흡수를 위해 큰 중요성을 갖는다는 것을 시사한다[Ohgami, et al., (2005), Nat Genet, 37, 1264-9]. STEAP3/TSAP6는 또한 구리 환원효소(cupric reductase) 활성 및 이 금속환원효소(metalloreductase) 활성으로서 STEAP 패밀리의 다른 멤버, STEAP2 및 STEAP4에 의해 공유된다[Ohgami, et al., (2006), Blood, 108, 1388-94].

STEAP3/TSAP6는 또한 비-고전적(non-classical) 경로를 통한 단백질의 분비의 자극에 관여하는 것으로 확인되었다. 고전적인 단백질 분비는 분비용 단백질에 대한 NH₂-말단 신호 서열에 의해 매개된다. 상기 신호 서열은 상기 단백질을 소포체(endoplasmic reticulum)/골지 경로 및 뒤이은 분비 소포(secretary vesicle)에서 원형질막 통과로 이끈다. 분비 소포의 원형질막으로의 융합 후, 분비된 단백질은 세포외 공간으로 분비된다. 단백질 분비는 또한, 세포내 소포(intracellular vesicle)가 엔도좀의 내강(lumen)으로 분리되어, 소위 다중소포 구조(multivesicular structure)를 형성하는 것인 비-고전적 경로에 의해 수행될 수 있다. 상기 다중소포 구조와 원형질막과의 융합은 이 막-캡슐화 소포의 세포외 공간으로의 분비를 초래한다. 이 소포들은 엑소좀(exosome)으로 알려져 있다. STEAP3/TSAP6은 p53 의존적 방식으로 엑소좀 생성을 자극하는 것으로 확인되었다 [Amzallag, et al., (2004), J Biol Chem, 279, 46104-12; Yu, et al., (2006), Cancer Res, 66, 4795-801]. 엑소좀은 중요한 항-발암성(anti-oncogenic) 반응에 관여될 수 있다. p53-STEAP3/TSAP6 경로 자극에 대한 반응으로 엑소좀에서 분비되는 단백질 중 하나는 유방 종양 세포에서 혈관생성(angiogenesis), 종양 침윤 및 전이에 대한 입증된 저해 효과를 갖는 Maspin(mammary serine protease inhibitor)이다[Sheng, et al., (1996), Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 11669-74; Shi, et al., (2001), Cancer Res, 61, 6945-51; Zhang, et al., (1997), Mol Med, 3, 49-59; Zou, et al., (1994), Science, 263, 526-9]. 엑소좀은 TCTP(Translationally Controlled Tumour Protein)/히스타민 방출 인자(Histamine Releasing Factor)와 같은 염증자극 인자(pro-inflammatory factor) 및 Her2/Neu 및 Mart1과 같은 종양-특이적 항원을 포함할 수 있다[Amzallag, et al., (2004), J Biol Chem, 279, 46104-12; Andre, et al., (2002), Lancet, 360, 295-305]. STEAP3/TSAP6-매개 엔도좀 형성은 p53을 발현하도록 유도된 세포들이 인접 세포(neighboring cell)에서 세포 주기 중단(cell cycle arrest), 프로아폽토시스(proapoptosis) 반응 및 사망을 초래하는 것인 소위 "바이스탠더 효과(bystander effect)"를 일으킬 수 있다는 것이 시사되었다[Yu, et al., (2006), Cancer Res, 66, 4795-801].

STEAP3/TSAP6의 가능한 유전적 변이와 암 위험도 간의 관계에 관해 거의 알려진 것이 없다. 전립선암 세포주, 이종이식편 및 종양 시료에서 돌연변이에 대한 스크리닝은 4개의 세포주, 8개의 이종이식편 및 56개의 종양 시료(총 68개의 시료)에서 2개의 미스센스(missense) 돌연변이(Ala184Thr 및 Ile305Thr)를 발견했다. 본 발명자는 STEAP3/TSAP6은 전립선암에서 고전적인 종양 억제자 유전자가 아닌 것으로 결론지었다. 본 발명자들이 아는 바에 따르면, 다른 종류의 암에서 STEAP3/TSAP6 유전적 변이의 연구는 보고된 바 없다.

유방암의 개선된 치료법의 개발을 위한 STEAP3/TSAP6 경로의 이용 가능성

본 발명자들에 의한 STEAP3/TSAP6 LD 블럭 내의 유전적 변이의 발견은 이 유전자가 유방암의 발병에서 공통된 인자라는 것을 나타낸다. 그러므로, STEAP3/TSAP6, 그의 동족체(homologue) 및 STEAP3/TSAP6 경로 상의 다른 요소들을 표적화하는 치료법이 유방암의 치료 또는 예방을 위한 후보로 간주될 수 있다. 그와 같은 표적은 하기를 포함한다: STEAP3/TSAP6 자체(OMIM# 609671); 동족체(homologue) STEAP1 (OMIM# 604415), STEAP2/TIARP/STAMP1 (OMIM# 605094), 및 STEAP4 (NM_024636); 상호작용 단백질(interacting protein) Nix/BNIP3L (OMIM# 605368), Myt1 (OMIM# 602474), TCTP/히스타민 분비 인자(OMIM# 600763); 경로 단백질 p34^cdc2 (OMIM# 116940), 사이클린 B1 (OMIM# 123836), HER2/Neu (OMIM# 164870), Maspin (OMIM# 154790); 및 확인되거나 또는 관련될 수 있는 STEP3/TSAP6 경로의 다른 멤버들. 치료법은 STEAP3/TSAP6의 소형 분자 촉진제(agonist) 또는 길항제, 그의 동족체 또는 경로 성분들; 또는 유전자 요법 또는 면역요법 프로토콜에서 트랜스유전자(transgene)으로서 STEAP3/TSAP6, 동족체 또는 경로 성분의 이용을 포함할 수 있다. STEAP3/TSAP6, 그의 동족체 또는 경로 성분들 및/또는 그들의 활성에 영향을 미치는 분자가 또한 그들의 "바이스탠더 효과"의 강화를 통해 세포살상(cytostatic) 또는 세포독성 치료요법(화학요법, 방사선요법, 유전자요법 또는 면역요법)을 위한 아쥬반트(adjuvant)로 개발될 수 있다.

마커 및 일배체형의 평가

집단 내의 게놈 서열은 개인들이 비교될 때 동일하지 않다. 오히려, 게놈은 게놈 상의 다수의 위치에서 개인들 간에 서열 변이성(sequence variability)을 보인다. 그와 같은 서열 상의 변이는 일반적으로 다형성(polymorphism)으로 지칭되며, 각 게놈 내에 다수의 그와 같은 부위들이 있다. 예를 들면, 인간 게놈은 평균적으로 500 bp마다 나타나는 서열 변이를 보인다. 가장 일반적인 서열 변이는 게놈 내의 단일 염기 위치에서의 염기의 변화로 구성되고, 그와 같은 서열 변이, 또는 다형성은 일반적으로 단일 뉴클레오티드 다형성("SNP")로 지칭된다. 이 SNP들은 단일 돌연변이 사건에서 일어난 것으로 사료되며, 따라서, 통상적으로 각 SNP 부위에 두 개의 가능한 대립인자들이 있다; 본래의 대립인자와 돌연변이된 대립인자. 자연적인 유전적 부동(genetic drift) 및 또한 가능한 선택적 압력 때문에, 본래의 돌연변이가 주어진 집단에서 그의 대립인자의 특정한 빈도를 특징으로 하는 다형성을 초래했다. 마이크로새틀라이트, 삽입, 결실, 역전 및 카피수 변화를 포함한, 다수의 다른 종류의 서열 변이가 인간 게놈 내에서 발견된다. 다형성 마이크로새틀라이트는 특정한 부위에 복수 개의 짧은 염기 반복체(small repeat of bases)(예를 들면, CA 반복체, 상보성 가닥 상의 TG)를 가지며, 전체 집단에서 반복체 길이의 수가 변화한다. 일반적인 용어로, 다형성 부위에 대한 서열의 각 버전은 상기 다형성 부위의 특정한 대립인자를 나타낸다. 모든 서열 변이들은 해당 서열 변이의 특징적인, 특정한 다형성 부위에서 일어나는, 다형성으로 지칭될 수 있다. 일반적인 용어로, 다형성은 임의의 수의 특정한 대립인자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 다형성은 임의의 주어진 집단에서 둘 이상의 대립인자의 존재를 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 다형성은 세개 이상의 대립인자의 존재를 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 다형성은 4개 이상의 대립인자, 5개 이상의 대립인자, 6개 이상의 대립인자, 7개 이상의 대립인자, 9개 이상의 대립인자 또는 10개 이상의 대립인자의 존재를 특징으로 한다. 모든 그와 같은 다형성은 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있고, 따라서, 본 발명의 범위 내에 속한다.

일부 경우에, 기준 대립인자(reference allele)를 선택하지 않고, 다형성 부위에서 상이한 대립인자를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 특정한 다형성 부위에 대해 기준 서열이 지칭될 수 있다. 기준 대립인자는 종종 "야생형(wild-type)" 대립인자로 지칭되고, 이는 통상적으로 최초의 서열결정된(first sequenced) 대립인자 또는 "영향받지 않은(non-affected)" 개체(예를 들면, 성향(trait)이나 질병 표현형을 보이지 않는 개체)로부터의 대립인자로 선택된다.

본 명세서에서 지칭되는 SNP 마커에 대한 대립인자는 이용된 SNP 분석법에서 다형성 부위에서 그들이 나타나는 경우, 염기 A, C, G 또는 T로 지칭된다. 본 명세서에서 이용된 SNP에 대한 대립인자 코드는 하기와 같다: 1 = A, 2 = C, 3 = G, 4 = T. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 반대쪽 DNA 가닥을 분석하거나 또는 판독하는 것에 의해, 각 경우에 상보적 대립인자가 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, A/G 다형성을 포함하는 다형성 부위(다형성 마커)에 대해, 이용되는 분석법은 가능한 두 염기, 즉, A 및 G 중 하나 또는 양자 모두의 백분율 또는 비를 측정할 수 있다. 대안적으로, DNA 주형 상의 반대쪽 가닥을 결정(분석)하는 분석법을 설계하는 것에 의해, 상보적 염기 T 및 C의 존재가 측정될 수 있다. 정량적으로(예를 들면, 상대적 위험도의 측면에서), 동일한 결과가 각 DNA 가닥(+ 가닥 또는 - 가닥)의 측정으로부터 수득될 것이다.

일반적으로, 특정한 서열에 대해 기준 서열이 지정된다. 기준과 상이한 대립인자는 종종 "변이(variant)" 대립인자로 지칭된다. 본 명세서에서 사용된, 변이 서열(variant sequence)은 기준 서열과 상이하나, 그 외에는 실질적으로 유사한 서열을 의미한다. 본 명세서에 기재된 다형성 유전적 마커의 대립인자는 변이(variant)이다. 추가적인 변이들은 폴리펩티드에 영향을 미치는 변화들을 포함할 수 있다. 기준 뉴클레오티드 서열과 비교한 경우, 서열 차이는 프레임 쉬프트(frame shift)를 초래하는, 단일 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실, 하나보다 많은 수의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실; 코딩된 아미노산의 변화를 초래하는, 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화; 조기 종료 코돈(premature stop codon)의 생성을 초래하는, 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화; 뉴클레오티드에 의해 코딩된, 하나 이상의 아미노산의 결실을 초래하는, 수개의 뉴클레오티드의 결실; 해독 프레임(reading frame)의 코딩 서열의 중단(interruption)을 초래하는, 불균등 재조합(unequal recombination) 또는 유전자 전환(gene conversion)과 같은, 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 삽입; 전체 서열 또는 일부 서열의 중복; 전위; 또는 뉴클레오티드 서열의 재배열을 포함한다. 그와 같은 서열 변화는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열의 변화가 프레임 쉬프트를 유발하는 경우, 프레임 쉬프트는 코딩된 아미노산의 변화를 초래할 수 있고, 및/또는 조기 종료 코돈의 생성을 초래하여, 절단된(truncated) 폴리펩티드의 생성을 유발한다. 대안적으로, 질병 또는 성향과 연관된 다형성은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 동의적 변화(synonymous change)(즉, 아미노산 서열의 변화를 초래하지 않는 변화)일 수 있다. 그와 같은 다형성은 예를 들면, 스플라이싱 부위(splice site)를 변화시키고, mRNA의 안정성 또는 수송에 영향을 미치거나 또는 코딩된 폴리펩티드의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 다형성은 또한 증폭 또는 결실과 같은 구조적 변화가 체세포 수준(somatic level)에서 일어날 가능성을 증가시키도록 DNA를 변화시킬 수 있다. 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 특정한 기준 아미노산 서열을 갖는 "기준(reference)" 폴리펩티드이고, 변이 대립인자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 변이 아미노산 서열을 갖는 "변이(variant)" 폴리펩티드로 지칭된다.

일배체형은 세그먼트를 따라 배열된 대립인자의 특정한 조합을 특징으로 하는 DNA의 세그먼트를 의미한다. 인간과 같은 이배체 개체의 경우, 일배체형은 각 다형성 마커 또는 유전자 좌에 대한 1쌍의 대립인자 중 하나의 대립인자를 포함한다. 특정한 구체예에서, 일배체형은 두개 이상의 대립인자, 세개 이상의 대립인자,네개 이상의 대립인자, 또는 다섯개 이상의 대립인자를 포함할 수 있고, 각 대립인자는 세그먼트 상의 특정한 다형성 마커에 대응된다. 일배체형은 다양한 다형성 마커의 조합, 예를 들면, 다형성 부위에 특정한 대립인자를 갖는 SNP와 마이크로새틀라이트의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일배체형은 다양한 유전적 마커에서 대립인자의 조합을 포함한다.

특정한 다형성 마커 및/또는 일배체형의 검출은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된, 다형성 부위에서 서열을 검출하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, PCR, LCR, 이중 PCR(nested PCR) 및 핵산 증폭을 위한 기타 기법을 이용한, 형광-기반 기법(Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999); Kutyavin et al., Nucleic Acid Res. 34: e128 (2006)))과 같은, SNP 및/또는 마이크로새틀라이트 마커의 존재에 대한 유전형분석을 위한 표준 기법이 이용될 수 있다. SNP 유전형분석을 위해 이용할 수 있는 특정한 방법들은 TaqMan 유전형 분석법(genotyping assay) 및 SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, 실시간 PCR, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립인자가 확인될 수 있다.

본 명세서에 기재된 특정한 방법에서, 연구 대상인 특정한 질병 또는 성향(예를 들면,유방암)에 대한 증가된 감수성(즉, 증가된 위험도)을 갖는 개체는 상기 질병 또는 성향에 대해 증가된 감수성을 부여하는 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형(즉, 위험 마커 대립인자 또는 일배체형)이 확인된 개체이다. 일 양태에서, 상기 위험 마커 또는 일배체형은 유방암의 유의성 있는 증가된 위험도(또는 감수성)를 부과하는 마커 또는 일배체형이다. 일 구체예에서, 마커 또는 일배체형과 연관된 유의성은 상대적 위험도(relative risk, RR)에 의해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 마커 또는 일배체형과 연관된 유의성은 오즈비(odds ratio, OR)에 의해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 유의성은 백분율로 측정된다. 일 구체예에서, 유의성 있는 증가된 위험도는 1.2 이상, 1.3 이상, 1.4 이상, 1.5 이상, 1.6 이상, 1.7 이상, 1.8 이상, 1.9 이상, 2.0 이상, 2.5 이상, 3.0 이상, 4.0 이상, 및 5.0 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 1.2 이상의 위험도(상대적 위험도 및/또는 오즈비)로 측정된다. 특정한 구체예에서, 1.2 이상의 위험도(상대적 위험도 및/또는 오즈비)는 유의성이 있다. 또 다른 특정한 구체예에서, 1.3 이상의 위험도는 유의성이 있다. 또 다른 구체예에서, 1.4 이상의 위험도는 유의성이 있다. 또 다른 구체예에서, 약 1.5 이상의 위험도는 유의성이 있다. 또 다른 추가적인 구체예에서, 약 1.7 이상의 위험도는 유의성이 있다. 그러나, 다른 컷오프, 예를 들면, 1.15, 1.25, 1.35 이상 등이 고려되며, 그와 같은 컷오프도 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 증가는 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 및 500%를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 약 20% 이상이다. 하나의 특정한 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 증가는 20% 이상이다. 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 증가는 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 100% 이상이다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 본 발명의 특징으로 적합한 것으로 간주되는 다른 컷오프 또는 범위도 고려되고, 그들도 본 발명의 범위 내에 속한다. 특정한 구체예에서, 위험의 유의성 있는 증가는 0.05 미만, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만, 또는 0.000000001 미만의 p-값과 같은 p-값을 특징으로 한다.

본 발명의 위험 다형성 마커 또는 일배체형은 하나 이상의 마커의 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형이 비교군(대조군)에서의 존재의 빈도 대비 유방암에 대한 위험도를 갖는 개체(질병군(affected))에 보다 빈번하게 존재하고, 상기 마커 또는 일배체형의 존재가 상기 질병 또는 성향에 대한 감수성을 나타내는 것인 마커 또는 일배체형이다. 일 구체예에서, 대조군은 집단 표본(population sample), 즉, 일반적인 집단으로부터의 랜덤 표본일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 대조군은 질병에 걸리지 않은 개인, 예를 들면, 유방암으로 진단되지 않은 개인의 군으로 대표된다. 일 구체예에서, 그와 같은, 질병-불포함(disease-free) 대조군은 하나 이상의 특정한 질병-연관 증상의 부재를 특징으로 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 질병-불포함 대조군은 하나 이상의 질병-특이적 위험 인자의 부재를 특징으로 한다. 일 구체예에서, 그와 같은 위험 인자는 하나 이상의 환경적 위험 인자이다. 대표적인 환경적 인자들은 특정한 질병 또는 성향을 발현할 위험도에 영향을 미치는 것으로 알려지거나, 상기 위험도에 영향을 미치는 것으로 고려되는 천연 산물, 미네랄, 또는 기타 화학물질이다. 기타 환경적 위험 인자들은 식음습관(food and drink habit), 주요 거주지의 지리적 위치 및 직업적 위험 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 생활방식(lifestyle)과 관련된 위험 인자들이다. 또 다른 구체예에서, 위험 인자는 하나 이상의 유전적 위험 인자를 포함한다.

상관관계에 대한 간단한 검정의 예로서 2 x 2 표(two by two table) 상에서의 Fisher-exact 검정이 있다. 염색체의 코호트가 주어지면, 마커 및 일배체형을 모두 포함하는 염색체, 마커 또는 일배체형을 중 하나를 포함하고, 나머지 하나는 포함하지 않는 염색체 및 마커나 일배체형 중 어느 것도 포함하지 않는 염색체의 갯수로부터 2 x 2 표가 작성된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 질병 또는 성향에 대한 감소된 감수성(즉, 감소된 위험도)을 갖는 개체는 상기 질병 또는 성향에 대한 감소된 감수성을 부여하는 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 특정한 대립인자 또는 일배체형이 확인된 개체이다. 감소된 위험도를 부여하는 마커 대립인자 및/또는 일배체형은 또한 보호성(protective)인 것으로 표현된다. 일 양태에서, 보호성 마커 또는 일배체형은 질병 또는 성향의 유의성 있는 감소된 위험도(또는 감수성)를 부여하는 마커 또는 일배체형이다. 일 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.9 미만, 0.8 미만, 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만 및 0.1 미만을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 0.9 미만의 상대적 위험도로 측정된다. 하나의 특정한 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.7 미만이다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.5 미만이다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 감소된 위험도는 0.3 미만이다. 또 다른 구체예에서, 위험도(또는 감수성)의 감소는 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 및 98% 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 20% 이상이다. 하나의 특정한 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 감소는 약 30% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 감소는 약 50% 이상이다. 또 다른 구체예에서, 위험도의 유의성 있는 감소는 약 70% 이상이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 본 발명의 특징으로 적합한 것으로 간주되는 다른 컷오프 또는 범위도 고려되고, 그들도 본 발명의 범위 내에 속한다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 연구된 집단에 존재하는 두개의 대립인자를 갖는 마커에 대해, 하나의 대립인자가 상기 집단 내에서 성향 또는 질병을 갖는 개인의 그룹에서 대조군 대비 증가된 빈도로 발견되는 경우, 상기 마커의 나머지 다른 대립인자는 상기 성향 또는 질병을 갖는 개인의 그룹에서 대조군 대비 감소된 빈도로 발견될 것으로 이해할 것이다. 그와 같은 경우에, 상기 마커의 하나의 대립인자(상기 성향 또는 질병을 갖는 개인에서 증가된 빈도로 발견되는 대립인자)은 위험 대립인자(at-risk allele)이고, 나머지 다른 대립인자는 보호성 대립인자(protective allele)일 것이다.

질병 또는 성향(예를 들면, 유방암)과 연관된 유전적 변이가 단독으로 주어진 유전형에 대해 질병의 위험도를 예측하기 위해 이용될 수 있다. SNP와 같은 이대립인자 마커(biallelic marker)의 경우, 3개의 가능한 유전형이 있다: 위험 변이에 대한 동형접합체, 이형접합체(heterozygote), 및 상기 위험 변이의 비-보인자(non-carrier). 복수의 유전자 좌에서의 변이와 연관된 위험도가 전체 위험도를 추정하기 위해 이용될 수 있다. 복수 개의 SNP 변이에 대해, k( = 3 ⁿ x 2 ^p ) 개의 가능한 유전형이 있고; 상기에서 n은 상염색체 유전자좌(autosomal loci)의 갯수이고 p는 성염색체 유전자좌의 갯수이다. 전체 위험도 평가 계산은 통상적으로 상이한 유전적 변의의 상대적 위험도가 곱해진다는 것, 즉, 특정한 유전형 조합과 연관된 전체 위험도(예를 들면, RR 또는 OR)가 각 유전자좌의 유전자형에 대한 위험도 값의 곱이라는 것을 가정한다. 제시된 위험도가 일치된(matched) 성별 및 민족을 갖는 기준 집단 대비 개인, 또는 개인에 대한 특정한 유전형에 대한 상대적 위험도를 나타내는 경우, 통합 위험도(combined risk)는 유전자좌-특이적 위험도 값의 곱이고, 이는 또한 집단 대비 전체 위험도 추정치에 해당한다. 개인에 대한 위험도가 위험 대립인자의 비-보인자에 대한 비교에 근거하는 경우, 통합 위험도는 모든 유전자좌의 유전형의 주어진 조합을 갖는 인간을 상기 유전자좌들에서 위험 변이를 보유하지 않는 개인들의 군에 비교하는 추정치에 해당한다. 위험 변이의 비-보인자들의 그룹은 가장 낮은 추정된 위험도를 가지며 그 자체(즉, 비-보인자)와 비교하여 1.0의 통합 위험도를 가지나, 집단 대비, 1.0 미만의 전체 위험도를 갖는다. 비-보인자 그룹은 잠재적으로 매우 작을 수 있고, 특히, 다수의 유전자좌에 대해 매우 작을 수 있으며, 그 경우, 그의 관련성은 그만큼 작다는 것에 주목해야 한다.

승법 모델(multiplicative model)은 일반적으로 복합 성향(complex trait)의 데이터에 합리적으로 잘 맞는 간명(parsimonious) 모델이다. 승법성(multiplicity)으로부터의 편향은 일반적인 질환에 대한 일반적인 변이에서는 드물게 설명되었으며, 보고된 경우에도, 제안적인 것에 불과하며, 이는 유전자좌 간의 통계적 상호작용을 입증할 수 있기 위해서는 매우 큰 표본 크기가 통상적으로 요구되기 때문이다.

예로서, 전립선 암과 연관된 것으로 개시된 총 8개의 변이를 고려한다(Gudmundsson, J., et al., Nat Genet 39:631-7 (2007), Gudmundsson, J., et al., Nat Genet 39:977-83 (2007); Yeager, M., et al, Nat Genet 39:645-49 (2007), Amundadottir, L., el al., Nat Genet 38:652-8 (2006); Haiman, C.A., et al., Nat Genet 39:638-44 (2007)). 이 유전자좌들 중 7개는 상염색체 상에 있고, 나머지 유전자좌는 염색체 X 상에 있다. 이 때, 이론적인 유전형 조합의 총수는 3⁷ x 2¹ = 4374이다. 그 유전형 분류(genotypic class) 중 일부는 매우 드무나, 여전히 가능하고, 전체 위험도 평가를 위해 고려되어야 한다. 복수 개의 유전적 변이의 경우에 적용된 승법 모델은 상기 유전적 변이가 "환경적(environmental)" 인자와 명확하게 상관되지 않는다는 것을 가정할 때 비-유전적 위험 변이와의 결합(conjugation)에서 유효할 것으로 보인다. 다시 말하면, 비-유전적 위험 인자와 유전적 위험 인자가 상호작용하지 않는다는 것을 가정할 때, 유전적 변이와 비-유전적 변이는 통합 위험도를 추정하기 위해 승법 모델 하에 평가될 수 있다.

동일한 정량적 접근방법을 이용하여, 본 명세서에 기재된, 유방암과 연관된 복수 개의 변이와 연관된 통합 위험도 또는 전체 위험도가 평가될 수 있다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 마커 rs4848543, rs13387042 및 rs3803662 또는 이 마커들과 연관 불균형인 대리 마커들이 평가되고, 유전형 조합(3³= 27가지의 가능한 조합)에 대한 위험도가 계산된다. 또 다른 구체예에서, 전체 위험도를 산출하기 위해 상기 마커들 중 두개(예를 들면, 마커 rs13387042 및 rs3803662)에 대한 유전형이 조합될 수 있다. 다른 구체예에서, 유방암에 대한 소인을 부여하는 것으로 알려진 추가적인 마커들(예를 들면, BRCA1, BRCA2, BARD1과 같은, 고 침투성 위험 인자)가 본 명세서에 기재된 하나 이상의 위험 인자들과 조합된다.

연관 불균형(Linkage Disequilibrium)

각 감수분열 사건 동안 각 염색체 쌍에 대해 평균 1회 일어나는, 재조합의 자연적인 현상은 자연이 서열(및 결과적으로 생물학적 기능)에 변화를 제공하는 한가지 방법이다. 재조합은 게놈에서 랜덤하게 일어나지 않는 것으로 발견되었다; 오히려, 재조합율의 빈도에 큰 변화가 있어서, 높은 재조합 빈도를 갖는 작은 영역(따라서, 재조합 핫스팟(recombination hotspot)으로 불림) 및 일반적으로 연관 불균형(LD) 블럭이라 불리는, 낮은 재조합 빈도의 보다 넓은 영역을 생성한다(Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526-530 (2006); Jeffreys, A.J., et al.,Nature Genet 29:217-222 (2001); May, C.A., et al., Nature Genet 31:272-275(2002)).

연관 불균형(Linkage Disequilibrium, LD)은 두 개의 유전적 요소의 비-랜덤 조합(non-random assortment)을 의미한다. 예를 들면, 특정한 유전적 요소(예를 들면, 다형성 마커의 대립인자(allele))가 0.50(50%)의 빈도로 집단에서 일어나고, 또 다른 요소가 0.50(50%)의 빈도로 일어나는 경우, 두 요소를 모두 갖는 개인의 예상되는 발생율은 상기 요소들의 랜덤 분포를 가정하면, 0.25(25%)이다. 그러나, 상기 두 요소들이 0.125보다 더 높은 빈도로 함께 나타나는 것으로 발견되는 경우, 상기 요소들은 연관 불균형에 있다고 하며, 이는 그들이 그들의 독립적인 대립인자 빈도가 예측하는 비율보다 더 높은 비율로 함께 유전되는 경향이 있기 때문이다. 개략적으로, LD는 일반적으로 두 요소간의 재조합 사건의 빈도와 상관관계를 갖는다. 집단에서 대립인자 또는 일배체형 빈도는 집단 내의 개체의 유전형을 분석하고 상기 집단에서 각 대립인자 또는 일배체형의 발생 빈도를 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 이배체(diploid)의 집단, 예를 들면, 인간 집단의 경우, 개인들은 일반적으로 각 유전적 요소(예를 들면, 마커, 일배체형 또는 유전자)에 대해 두 개의 대립인자 또는 대립인자 조합을 가질 것이다.

다수의 상이한 척도들이 연관 불균형(LD)의 강도를 평가하기 위해 제안되었다. 대부분은 이대립인자(biallelic) 부위의 쌍 간의 연관의 강도를 획득한다. LD의 두 개의 중요한 일대일 척도(pairwise measures)는 r² (△²으로 표시되기도 함) 및 |D'|이다. 두 척도는 모두 0(불균형 없음) 내지 1('완전한' 불균형)의 범위이나, 그들의 해석은 약간 다르다. |D'|는 가능한 일배체형 중 2개 또는 3개만 존재하는 경우, 그 값이 1이고, 모든 4개의 가능한 일배체형이 존재하는 경우는 그 값이 1보다 작은 것으로 정의된다. 따라서, 1보다 작은 |D'|의 값은 두 부위 간에 과거에 재조합이 일어났을 수도 있다는 것을 나타낸다(재발성 돌연변이(recurrent mutation)는 |D'|가 1보다 작게할 수 있으나, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 경우, 이는 통상적으로 재조합보다 가능성이 낮은 것으로 간주됨). 척도 r²는 두 부위간의 통계적 상관성을 나타내고, 두 개의 일배체형만 존재하는 경우 1의 값을 취한다.

r²와, 감수성 유전자 좌와 SNP 간의 연관성을 검출하기 위해 요구되는 표본 크기 간에 단순한 반비례 관계(inverse relationship)가 있기 때문에, r² 측정값은 이론의 여지는 있지만 연관 맵핑(association mapping)에 대한 가장 적합한 척도이다. 이 척도는 부위의 쌍에 대해 정의되나, 일부 적용의 경우, 다수의 다형성 부위를 포함하는 전체 영역에서 LD가 얼마나 강한지를 결정하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들면, LD의 강도가 유전자 좌들 간에 또는 집단 전체에 있어서 유의성 있게 상이한지 여부, 또는 하나의 영역에서 특정한 모델 하에서 예측된 것보다 더 크거나 또는 더 작은 LD가 존재하는지 여부). 한 영역에 대해 LD를 측정하는 것은 간단하지 않으나, 하나의 방법은 집단 유전학에서 개발된, 척도 r을 이용하는 것이다. 개략적으로 말하면, r은 데이터에서 확인되는 LD를 생성하기 위해, 특정한 집단 모델 하에서 어느 정도의 재조합이 요구되는지를 측정한다. 이 종류의 방법은 또한 잠재적으로 LD 데이터가 재조합 핫스팟의 존재에 대한 증거를 제공하는지 여부를 결정하는 문제에 대한 통계적으로 엄격한 방식을 제공할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 경우, 유의성 있는 r² 값은 0.1 이상, 예를 들면, 0.1 이상, 0.15 이상, 0.2 이상, 0.25 이상, 0.3 이상, 0.35 이상, 0.4 이상, 0.45 이상, 0.5 이상, 0.55 이상, 0.6 이상, 0.65 이상, 0.7 이상, 0.75 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.91 이상, 0.92 이상, 0.93 이상, 0.94 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 0.99 이상 또는 1.0 이상일 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 유의성 있는 r² 값은 0.2 이상일 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 연관 불균형은 0.3 이상, 0.4 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 0.99 이상과 같은, 0.2 이상의 |D'| 값을 특징으로 하는 연관 불균형을 의미한다. 따라서, 연관 불균형은 별개의 마커들의 대립인자 간의 상관관계를 나타낸다. 연관 불균형은 상관 계수(correlation coefficient) 또는 |D'| (1.0 이하의 r² 및 1.0 이하의 |D'|)에 의해 측정된다. 일부 구체예에서, 연관 불균형은 r² 및 |D'| 척도 모두에 대한 값으로 정의된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 유의성 있는 연관 불균형은 0.1보다 큰 r² 및 0.8보다 큰 |D'|으로 정의된다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 연관 불균형은 0.2보다 큰 r² 및 0.8보다 큰 |D'|으로 정의된다. 또 다른 구체예에서, 유의성 있는 연관 불균형은 0.2보다 큰 r² 및 0.9보다 큰 |D'|으로 정의된다. 연관 불균형을 결정하기 위해 r² 및 |D'| 값의 다른 조합 및 변경(permutation)도 고려되며, 본 발명의 범위 내에 속한다. 연관 불균형은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 하나의 인간 집단에서 결정될 수 있거나, 또는 하나보다 많은 인간 집단으로부터의 개인들을 포함하는 표본의 집합(colleciton)에서 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, LD는 정의된 바와 같은(http://www.hapmap.org), 하나 이상의 HapMap 집단(코카서스인, 아프리카인, 일본인, 중국인)으로부터의 표본에서 결정된다. 하나의 그와 같은 구체예에서, LD는 HapMap 표본의 CEU 집단에서 결정된다. 또 다른 구체예에서, LD는 YRI 집단에서 결정된다. 또 다른 구체예에서, LD는 아이슬란드 집단으로부터의 표본에서 결정된다.

게놈의 모든 다형성이 집단 수준에서 동일하다면, 모든 상이한 다형성 상태를 평가하기 위해 모든 단일 다형성이 연관(association) 연구에서 조사되어야 할 것이다. 그러나, 다형성 간의 연관 불균형 때문에, 긴밀하게 연관된 다형성들이 강한 상관관계를 가지며, 이는 유의성 있는 연관을 관찰하기 위해 연관 연구에서 조사되어야 하는 다형성의 갯수를 감소시킨다. LD의 또 다른 결과는 이 다형성들이 강한 상관관계를 갖는다는 사실 때문에, 다수의 다형성들이 연관 신호(association signal)를 생성할 수 있다는 것이다.

게놈 LD 맵이 게놈 전체에 대해 생성되었고, 그와 같은 LD 맵이 질병-유전자를 맵핑하기 위한 프레임워크로 작용할 것으로 제안되었다(Risch, N. & Merkiangas, K, Science 273:1516-1517 (1996); Maniatis, N., et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:2228-2233 (2002); Reich, DE et al, Nature 411:199-204 (2001)).

현재, 인간 게놈의 많은 부분들이 수개의 공통된 일배체형을 포함하는 일련의 별개의 일배체형 블럭들로 분류될 수 있다는 것이 확립되었다; 이 블럭들의 경우, 연관 불균형 데이터는 재조합을 나타내는 증거를 거의 제공하지 않는다(예를 들면, Wall., J.D. and Pritchard, J.K., Nature Reviews Genetics 4:587-597 (2003); Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232 (2001); Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003) 참조).

이와 같은 일배체형 블럭을 정의하는 두 가지 주요한 방법들이 있다: 블럭은 한정된 일배체형 다양성을 갖는 DNA의 영역(예를 들면, Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232 (2001); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7335-7339 (2002) 참조), 또는, 연관 불균형을 이용하여 확인된, 광범위한 과거의 재조합(extensive historical recombination)을 갖는 이행 구역(transition zone) 간의 영역(예를 들면, Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003); Wang, N. et al., Am. J. Hum. Genet. 71:1227-1234 (2002); Stumpf, M.P., and Goldstein, D.B., Curr. Biol. 13:1-8 (2003) 참조)으로 정의될 수 있다. 보다 최근에, 인간 게놈 전체에 대한 재조합률(recombination rate) 및 상응하는 핫스팟의 상세 맵(fine-scale map)이 작성되었다(Myers, S., et al., Science 310:321-32324 (2005); Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526530 (2006)). 상기 맵은 게놈 전체에서 재조합의 엄청난 변이를 보여주며, 재조합률은 핫스팟에서 10-60 cM/Mb로 높았고, 개재 영역(intervening region)에서는 재조합률이 0에 가까워서, 제한적인 일배체형 다양성 및 높은 LD의 영역을 나타낸다. 따라서, 상기 맵은 일배체형 블럭 및/또는 LD 블럭을 재조합 핫스팟에 의해 둘러싸인(flanked) 영역으로 정의하기 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "일배체형 블럭(haplotype block)" 또는 "LD 블럭"은 전술된 특징들에 의해 정의되는 블럭, 또는 그와 같은 영역을 정의하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 이용되는 다른 대안적인 방법에 의해 정의되는 블럭을 포함한다.

일배체형 블럭을 식별하는 일부 대표적인 방법들이 예를 들면, 미국특허출원공개 제20030099964호, 제20030170665호, 제20040023237호 및 제20040146870호에 개시된다. 일배체형 블럭(LD 블럭)은 단일 마커, 또는 복수 개의 마커를 포함하는 일배체형을 이용하여, 표현형과 일배체형 상태 간의 연관을 맵핑하기 위해 이용될 수 있다. 각 일배체형 블럭에서 주요한 일배체형이 식별되고, 그 후, 일련의 "태깅(tagging)" SNP 또는 마커들(일배체형들을 구별하기 위해 필요한 최소 세트의 SNP 또는 마커)이 식별될 수 있다. 이 태깅 SNP 또는 마커들은 표현형과 일배체형 간의 연관을 확인하기 위해, 개체들의 군(group)으로부터의 표본의 평가에서 이용될 수 있다. 필요한 경우, 인접한 일배체형 블럭들 간에는 연관 불균형이 존재할 수 있기 때문에, 이 블럭들이 동시에 평가될 수 있다.

다양한 집단에서 차등적인 과거의 재조합률(historical rate of assortment) 때문에, 연관 불균형은 집단 간에 다를 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, LD는 코카서스계 표본에서 결정된 LD를 의미한다. 특정한 구체예에서, LD는 HapMap 컨소시움(http://www.hapmap.org에 설명된 바와 같이)으로부터의 코카서스계 CEPH 표본에서 결정된다. 다른 구체예에서, LD는 아프리카계 집단, 아프리카계-미국인 집단, 히스패닉계 집단, 일본계 집단, 중국계 집단에서 결정된다. 일부 구체예에서, LD는 (http://www.hapmap.org)에 기재된 바와 같이, 중국, 일본, 아프리카로부터의 HapMap 표본에서 결정된다.

따라서, 게놈에서 다형성 마커에 대한 관찰된 연관에 대해, 게놈 내의 추가적인 마커들이 또한 연관을 보일 수 있다는 것이 명백하다. 이는 재조합률의 큰 변이에서 관찰된 바와 같이, 게놈 전체에서 LD의 불균등한 분포의 당연한 결과이다. 따라서, 연관을 검출하기 위해 이용되는 마커들은 주어진 질병 또는 성향과 연관된 게놈 영역(즉, 일배체형 블럭 또는 LD 블럭)에 대한 "택(tag)"을 나타낸다. 하나 이상의 원인이 되는(causative)(기능성) 변이 또는 돌연변이가 상기 질병 또는 성향과 연관된 것으로 확인되는 영역 내에 존재할 수 있다. 그와 같은 변이는 연관을 검출하기 위해 이용되는 태깅 마커에 대해 관찰되는 것보다 더 높은 상대적 위험도(RR) 또는 오즈비(OR)를 부여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 질병과의 연관을 검출하기 위해 이용되는 마커, 및 상기 마커와 연관 불균형인 마커를 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형과 LD인 마커가 대리 마커(surrogate marker)로 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 대리 마커는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 초기에 상기 질병과 연관된 것으로 확인된 마커 또는 일배체형의 경우보다 더 작은 상대적 위험도(RR) 및/또는 오즈비(OR)을 갖는다. 다른 구체예에서, 대리 마커는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 질환과 연관된 것으로 초기에 확인된 마커에 대해 초기에 결정된 RR 또는 OR 값보다 큰 RR 또는 OR 값을 갖는다. 그와 같은 구체예의 예는 본 명세서에 기재된 변이와 같은, 상기 질병과 연관되는 것으로 초기에 확인된 보다 더 일반적인 변이(> 10% 집단 빈도)와 LD인 드물거나, 또는 비교적 드문(< 10% 대립인자의 집단 빈도) 변이일 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들에 의해 발견된 연관을 검출하기 위해 그와 같은 마커들을 식별하고 이용하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있고, 따라서, 본 발명의 범위에 속한다.

일배체형 빈도의 결정

기대값-극대화 알고리즘(expectation-maximization algorithm)을 이용하여 환자군 및 대조군에서 일배체형의 빈도를 추정할 수 있다(Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. B, 39:1-38 (1977)). 결실된 유전형 및 그 상태(phase)에 따른 불확실성을 처리할 수 있는 이 알고리즘의 구현이 이용될 수 있다. 귀무 가설(null hypothesis) 하에서, 환자와 대조군은 동일한 빈도를 갖는 것으로 가정된다. 가능성 방식(likelihood approach)을 이용하여, 본 명세서에 기재된 마커들을 포함할 수 있는, 후보 위험-일배체형이 대조군에서보다 환자에서 보다 높은 빈도를 가지며, 다른 일배체형의 빈도는 양 군에서 동일한 것으로 가정되는 것인 대안적인 가설이 테스트된다. 양 가설 하에 가능성이 각각 극대화되고, 상응하는 1-df 가능성 비 통계값이 통계적 유의성을 평가하기 위해 이용된다.

연관 영역(linkage region) 내에서 위험 마커와 일배체형 및 보호성 마커와 일배체형을 찾기 위해, 예를 들면, 마커들이 실제 영역에 걸쳐있는 경우, 유전형 분석된 마커들의 모든 가능한 조합의 연관이 연구된다. 통합된 환자군과 대조군이 원래의 환자군 및 대조군과 동일한 크기인 두개의 세트로 무작위로 분류될 수 있다. 그 후, 마커 및 일배체형 분석이 반복되고, 기록된 가장 유의성 있는 p-값이 결정된다. 이 랜덤화 체계(randomization scheme)는 p-값의 경험적 분포를 구성하기 위해 예를 들면, 100회 이상 반복될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 0.05 미만의 p-값은 유의성 있는 마커 및/또는 일배체형 연관을 나타낸다.

일배체형 분석

일배체형 분석의 일반적인 방법은 NEsted MOdels에 적용된 가능성-기반 추론(likelihood-based inference)을 이용하는 단계를 포함한다(Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet. 35:131-38 (2003)). 상기 방법은 다수의 다형성 마커, SNP 및 마이크로새틀라이트에 대해 이용될 수 있는 프로그램 NEMO에서 구현된다. 상기 방법 및 소프트웨어는 특별히, 상이한 위험도를 부여하는 일배체형 그룹을 식별하는 것을 목적으로 하는 케이스-대조군(case-control) 연구를 위해 설계된다. 상기 방법 및 소프트웨어는 또한 LD 구조를 연구하기 위한 도구이다. NEMO에서, 관찰된 데이터가 이를 결실-데이터(missing-data) 문제로 처리하기 때문에, EM 알고리즘을 이용하여, 최대 가능성 추정치, 가능성 비(likelihood ratio) 및 p-값이 직접 계산된다.

상태(phase)의 불확실성 및 결실된 유전형에 따른 정보 소실을 반영한, 관찰된 데이터에 대해 직접 계산된 가능성에 기반한 가능성 비 테스트가 유효한 p-값을 제공하기 위해 이용될 수 있으나, 정보의 불완전성 때문에 소실된 데이터의 양을 아는 것이 여전히 유용할 것이다. 일배체형 분석의 정보 척도(information measure)는 Nicolae and Kong (Technical Report 537, Department of Statistics, University of Statistics, University of Chicago; Biometrics, 60(2):368-75 (2004))에서 연관성 분석(linkage analysis)를 위해 정의된 정보 척도의 당연한 연장(natural extension)으로 설명되며, NEMO에서 구현된다.

질병에 대한 단일 마커 연관을 위해, 각각의 개별적인 대립인자에 대해 양측 p-값(two-sided p-value)을 계산하기 위해 Fisher exact 테스트가 이용될 수 있다. 통상적으로, 모든 p-값은 특별히 표시되지 않으면, 다중 비교(multiple comparison)에 대해 조정되지 않은 상태로 제시된다. (마이크로새틀라이트, SNP 및 일배체형에 대해) 제시된 빈도는 보인자 빈도(carrier frequency)와 대립되는, 대립인자 빈도(allelic frequency)이다. 연관 분석을 위한 가족으로 동원된 환자들의 혈연관계(relatedness)에 따른 편향을 최소화하기 위해, 환자 목록에서 1촌 및 2촌(first and second-degree) 친척들이 제외될 수 있다. 또한, 혈연관계(sibship)에 대해 Risch, N. & Teng, J. (Genome Res., 8:1273-1288 (1998))에 기재된 분산 조정 절차(variance adjustment procedure), DNA 풀링 (ibid)을 확대하여 일반적인 가족 관계(familial relationship)에 적용될 수 있도록, 상기 테스트가 환자들 간의 잔여 혈연관계(remaining relateteness)에 대해 보정하기 위해 연관에 대해 반복될 수 있고, 비교를 위해 조정된 p-값 및 조정되지 않은 p-값을 제시할 수 있다. 차이는 예상되는 바와 같이 일반적으로 매우 작다. 복수 회의 테스트에 대해 보정된 단일-마커 연관성의 유의성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 동일한 유전형 데이터를 이용하여 랜덤화 테스트를 수행할 수 있다. 환자와 대조구의 코호트가 랜덤화되고 연관 분석이 복수 회(예를 들면, 500,000회 이하) 재수행되며, 그 p-값은 본 발명자들이 본래의 환자 및 대조구 코호트를 이용하여 관찰한 p-값과 동일하거나 그보다 더 낮은, 일부 대립인자에 대한 p-값을 생성하는 재현의 일부(fraction of replications)이다.

단일 마커 분석 및 일배체형 분석에 대해, 승법 모델(multiplicative model)(일배체형 상대적 위험도 모델), 즉, 한 사람이 갖는 두 개의 대립인자/일배체형의 위험도들이 곱해진다는 승법 모델을 가정하여 상대적 위험도(RR) 및 집단 귀속 위험도(population attributable risk, PAR)가 계산될 수 있다(Terwilliger, J.D. & Ott, J., Hum. Hered. 42:337-46 (1992) and Falk, C.T. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3):227-33 (1987)). 예를 들면, RR이 a 대비 A의 위험도라면, 동형접합체 AA를 갖는 사람의 위험도는 이형접합체 Aa의 위험도의 RR배이고, 동형접합체 aa를 갖는 사람의 RR²배일 것이다. 승법 모델은 분석 및 계산을 단순화하는 유용한 특성을 갖는다- 환자 집단(affected population) 및 대조구 집단 내에서 일배체형은 독립적이고, 즉, 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에 있다. 그 결과, 환자(affected)와 대조군 각각의 일배체형 계수(haplotype count)는 다항 분포를 가지나, 대안적인 가설 하에서 상이한 일배체형 빈도를 갖는 다항 분포를 갖는다. 구체적으로, 두개의 일배체형, h _i 및 h _j 에 대해, risk(h _i )/risk(h _j ) = (f _i /p _i )/(f _j /p _j )이고, 상기에서 f와 p는 각각 환자 집단 및 대조구 집단에서의 빈도를 나타낸다. 실제 모델이 승법성이 아닌 경우, 일부 검정력 손실(power loss)이 있으나, 이 손실은 극단적인 경우를 제외하고는 작은(mild) 경향이 있다. 가장 중요한 것은, p-값은 귀무 가설 하에 계산되기 때문에, 항상 유효하다는 것이다.

NEMO를 이용한 연관 불균형

마커들의 쌍 간의 LD는 D' 및 r² 의 표준 정의를 이용하여 계산될 수 있다(Lewontin, R., Genetics 49:49-67 (1964); Hill, W.G. & Robertson, A. Theor. Appl. Genet. 22:226-231 (1968)). NEMO를 이용하여, 두 마커 대립인자 조합의 빈도가 최대 가능성(maxium likelihood)에 의해 추정되고 연관 균형으로부터의 편향이 가능성 비 테스트(likelihood ratio test)에 의해 평가된다. D' 및 r²의 정의가 한계 대립인자 확률(marginal allele probability)에 의해 가중된 두 마커의 모든 가능한 대립인자 조합에 대해 평균하는 것에 의해 마이크로새틀라이트를 포함하도록 확대된다. 특정한 영역에서 LD 구조를 규명하기 위해 모든 마커 조합을 도시하는 경우, 본 발명자들은 상단 좌측 코너에 D'을 도시하고, 하단 우측 코너에 p-값을 도시한다. LD 도면(plot)에서, 마커들은 필요한 경우, 그들의 물리적 위치에 따라 도시되지 않고, 등거리로 도시될 수 있다.

위험도 평가 및 진단

주어진 집단 내에서, 사람이 특정된 기간 동안 특정한 질병 또는 성향을 발생시킬 가능성으로 정의된, 질병 또는 성향을 발생시킬 절대 위험도(absolute risk)가 있다. 예를 들면, 여성의 유방암에 대한 평생 절대 위험도(lifetime absolute risk)는 1/9이다. 즉, 9명의 여성 당 1명은 그들의 일생 중 어느 시점에 유방암을 발병할 것이다. 위험도(risk)는 통상적으로 특정인이 아니라, 매우 많은 수의 사람들을 조사하는 것에 의해 측정된다. 위험도는 종종 절대적 위험도(Absolute Risk, AR) 및 상대적 위험도(Relative Risk, RR)로 제시된다. 상대적 위험도는 두개의 변이와 연관된 위험도, 또는 두개의 상이한 사람들의 그룹의 위험도를 비교하기 위해 이용된다. 예를 들면, 상대적 위험도는 특정한 유전형을 갖는 사람들의 그룹과 다른 유전형을 갖는 또 다른 그룹을 비교하기 위해 이용될 수 있다. 질병에 대해, 2의 상대적 위험도는 하나의 그룹이 나머지 그룹보다 질병을 발병할 가능성이 두배 높다는 것을 의미한다. 제시된 위험도는 일치된 성별 및 민족의 집단 대비, 1인, 또는 1인의 특정한 유전형에 대한 상대적 위험도이다. 동일한 성별 및 민족의 2인의 위험도는 단순한 방식으로 비교될 수 있다. 예를 들면, 집단에 비교되는 경우, 제1 개체는 1.5의 상대적 위험도를 가지며, 제2 개체는 0.5의 상대적 위험도를 가지며, 제2 개체 대비 제1 개체의 위험도는 1.5/0.5 = 3이다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정한 다형성 마커 및 그와 같은 마커를 포함하는 일배체형이 유방암의 위험도 평가를 위해 유용한 것으로 확인되었다. 위험도 평가는 유방암에 대한 감수성을 진단하기 위한 마커의 이용을 포함할 수 있다. 다형성 마커의 특정한 대립인자는 유방암의 진단을 갖지 않는 개체들에서보다, 유방암의 진단을 갖는 개체들에서 보다 빈번하게 발견된다. 그러므로, 이 마커 대립인자들은 개체에서 유방암, 또는 유방암에 대한 감수성을 검출하기 위한 예측적 가치(predictive value)를 갖는다. 본 발명의 마커와 같은, 위험 마커들을 포함하는 일배체형 블럭 또는 LD 블럭 내의 태깅 마커들(tagging markers)이 일배체형 블럭 또는 LD 블럭 내의 다른 마커 및/또는 일배체형에 대한 대리물(surrogate)로 이용될 수 있다. 1의 r ² 값을 갖는 마커들이 위험 변이(at-risk variant)에 대한 완벽한 대리물이고, 즉, 하나의 마커에 대한 유전형이 나머지 마커에 대한 유전형을 완벽하게 예측한다. 1보다 작은 r ² 값을 갖는 마커들도 위험 변이의 대리물일 수 있거나, 또는 대안적으로 그 위험 변이만큼 높거나 또는 그 변이보다 훨씬 더 높은 상대적 위험도 값을 갖는 변이를 나타낸다. 확인된 위험 변이는 그 자체로 기능적 변이가 아닐 수 있으나, 이 경우, 진정한 기능적 변이와 연관 불균형 관계일 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 마커에 대한 그와 같은 대리 마커(surrogate marker)의 평가를 포함한다. 그와 같은 마커들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 공개 데이터베이스에 설명(annotate)되고, 맵핑되고, 열거되어 있거나, 또는 대안적으로 개체들의 군에서 본 발명의 마커에 의해 확인된 영역 또는 그 영역의 일부를 서열결정하고, 결과적으로 수득된 서열의 군에서 다형성을 식별하는 것에 의해 용이하게 식별될 수 있다. 그 결과, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 용이하게, 과도한 실험 없이 본 명세서에 기재된 마커 및/또는 일배체형과 연관 불균형인 대리 마커들의 유전형을 분석할 수 있다. 검출된 위험 변이와 LD인 태깅 마커 또는 대리 마커도 개인에서 유방암, 또는 유방암에 대한 감수성에 대한 연관을 검출하기 위한 예측적 가치를 갖는다. 본 발명의 마커들과 LD인 이 태깅 마커들 또는 대리 마커들은 또한 이들이 유사하게 유방암에 대한 감수성을 검출하기 위한 예측적 가치를 갖기 때문에, 일배체형들을 구별하는 다른 마커들을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 유방암과 연관된 것으로 본 명세서에 기재된 변이의 존재에 대해 개인으로부터 유래된 게놈 DNA를 포함하는 시료를 평가하는 것에 의해 실시될 수 있다. 그와 같은 평가는 당업자에게 잘 알려지고 본 명세서에서 더 설명될 방법을 이용하여, 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 그와 같은 평가의 결과에 근거하여 시료가 유래된 개인이 유방암의 증가된 위험도 또는 감소된 위험도(증가된 감수성 또는 감소된 감수성)를 갖는지 여부를 결정한다. 대안적으로, 본 발명은 유방암과 연관된 것으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커(또는 유방암과 연관된 것으로 본 명세서에서 입증된 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 마커)의 유전형 상태에 대한 정보를 포함하는 데이터세트를 이용하여 실시될 수 있다. 다시 말하면, 그와 같은 유전적 상태에 대한 정보, 예를 들면, 특정한 다형성 마커, 또는 복수 개의 마커에서의 유전형 계수(genotype count)의 형태(예를 들면, 특정한 위험 대립인자의 존재 또는 부재의 표시), 또는 하나 이상의 마커에 대한 실제의 유전형의 형태로 유전적 상태에 대한 정보를 포함하는 데이터세트가 유방암과 연관된 것으로 본 발명자들에 의해 입증된 특정한 다형성 마커의 특정한 위험 대립인자의 존재 또는 부재를 위해 조사될 수 있다. 본 명세서에서 입증된, 유방암과 연관된 변이(예를 들면, 마커 대립인자)에 대한 양성 결과는 상기 데이터세트가 유래된 개인이 하나 이상의 유방암의 증가된 감수성(증가된 위험도)을 갖는다는 것을 나타낸다.

본 발명의 특정한 구체예에서, 다형성 마커는 다형성 마커에 대한 유전형 데이터를 다형성의 하나 이상의 대립인자와 질환 간의 상관관계를 포함하는 참조표를 참조하는 것에 의해, 유방암과 상관된다. 일부 구체예에서, 상기 표는 하나의 다형성에 대한 상관관계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 표는 복수 개의 다형성에 대한 상관관계를 포함한다. 두 시나리오 모두에서, 마커와 유방암 간의 상관관계의 표시를 제공하는 참조표를 참조하는 것에 의해, 유방암에 대한 위험도, 또는 유방암에 대한 감수성이 시료가 유래된 개인에서 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 상관관계가 통계적 척도로서 보고된다. 통계적 척도는 상대적 위험도(RR), 절대 위험도(AR), 또는 오즈비(OR)과 같은 위험도 척도로 보고될 수 있다.

본 발명의 마커 및 일배체형, 예를 들면, 염색체 2q14.2, 염색체 2q35, 및 염색체 16q12 상의 다형성 마커 및 일배체형, 예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표20, 표 21 및 표 22에 제시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들, 예를 들면, 마커 rs4848543, rs13387042 및 rs3803662는 단독으로, 또는 조합되어 유방암의 위험도 평가 및 진단적 목적을 위해 유용할 수 있다. 따라서, 개별적인 마커에 의한 위험도의 증가가 비교적 크지 않은 경우, 즉, 10-30%의 수준인 경우에도, 연관은 유의성 있는 영향을 가질 수 있다. 따라서, 상대적으로 일반적인 변이가 전체 위험도에 대해 유의성 있는 기여도를 가질 수 있거나(집단 귀속 위험도(PAR)이 높음), 또는 마커들의 조합이 마커들의 통합된 위험도에 근거하여, 유방암을 발병할 유의성 있는 통합 위험도(combined risk)를 갖는 개체들의 그룹을 정의하기 위해 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 복수의 변이(마커 및/또는 일배체형)가 전체 위험도 평가를 위해 이용된다. 일 구체예에서, 이 변이들은 본 명세서에 개시된 변이들로부터 선택된다. 다른 구체예는 유방암에 대한 감수성의 진단을 위해 유용한 것으로 알려진 다른 변이와 조합된 본 발명의 변이의 용도를 포함한다. 그와 같은 구체예에서, 개인에서 복수의 마커 및/또는 일배체형의 유전형 상태(genotype status)가 결정되고, 상기 개인의 상태가 연관된 변이의 집단 빈도, 또는 연령-조화되고(age-matched) 성별-조화된 개체와 같은 임상적으로 건강한 개체에서의 상기 변이의 빈도와 비교된다. 다변량 분석(multivariate analysis) 또는 결합 위험도 분석과 같은, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 방법들이 복수의 유전자 좌에서의 유전형 상태에 근거하여 부여된 전체 위험도를 결정하기 위해 뒤이어 이용될 수 있다. 그와 같은 분석에 근거한 위험도의 평가가 뒤이어 본 명세서에 개시된 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있다.

전술된 바와 같이, 인간 게놈의 일배체형 블럭 구조는 질병 또는 성향(trait)과 원래 연관된 변이와 연관 불균형인 다수의 변이(마커 및/또는 일배체형)가 상기 질병 또는 성향에 대한 연관을 평가하기 위한 대리 마커(surrogate marker)로 이용될 수 있게 하는 효과를 갖는다. 그와 같은 대리 마커의 갯수는 해당 영역에서 과거의 재조합율(historical recombination rate), 해당 영역에서의 돌연변이 빈도(즉, 해당 영역에서 다형성 부위 또는 마커의 갯수), 및 해당 영역에서 LD의 정도(LD 블럭의 크기)와 같은 인자에 의존적일 것이다. 이 마커들은 통상적으로 본 명세서에 기재된 방법 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 다른 방법을 이용하여 정의된 LD 블럭 또는 일배체형 블럭의 물리적 경계 내에 위치한다. 그러나, 종종 마커 및 일배체형 연관이 정의된 일배체형 블럭의 물리적 경계를 넘어 연장되는 것으로 발견된다. 그와 같은 경우에, 마커 및/또는 일배체형은 또한 정의된 바와 같은 일배체형 블럭 내에 물리적으로 위치하는 마커 및/또는 일배체형을 위한 대리 마커 및/또는 일배체형으로 이용될 수 있다. 그 결과, 본 발명의 마커 및 일배체형과 LD(통상적으로, 0.4보다 큰 r²을 포함한, 0.3보다 큰 r²을 포함한, 0.2보다 큰 r²과 같은, 0.1보다 큰 r²을 특징으로 함)인 마커 및 일배체형도, 그들이 물리적으로 정의된 바와 같은 일배체형 블럭의 경계 외부에 존재하는 경우에도 본 발명의 범위 내에 속한다. 이는 본 명세서(예를 들면, 표 10, 표 15 및 표 19)에 기재된 마커들을 포함하나, 또한 표 10, 표 15 및 표 19에 열거된 하나 이상의 마커와 강한 LD(예를 들면, 0.1보다 큰 r², 0.2보다 큰 r² 및/또는 |D'| > 0.8을 특징으로 함)인 다른 마커들을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 SNP 마커의 경우, 환자에서 과량으로 존재하는 것으로 확인된 대립인자(위험-대립형질)에 대한 반대 대립인자(opposite allele)는 유방암에서 감소된 빈도로 발견된다. 따라서, 이 마커들 및 일배체형은 유방암에 대해 보호성이고, 즉, 그들은 이 마커들 및/또는 일배체형을 갖는 개인들이 유방암을 발병할 감소된 위험도 또는 유방암에 대한 감소된 감수성을 부여한다.

특정한 일배체형을 포함한, 본 발명의 특정 변이들은 일부 경우에, 다양한 유전적 마커들의 조합, 예를 들면, SNP와 마이크로새틀라이트의 조합을 포함한다. 따라서, 일배체형을 검출하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려지고 및/또는 본 명세서에 기재된, 다형성 부위에서의 서열을 검출하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 특정한 일배체형 또는 일련의 마커들과 질병 표현형 간의 상관관계가 표준 기법을 이용하여 검증될 수 있다. 상관관계에 대한 간단한 검정의 예는 2 x 2 표(two by two table) 상에서의 Fisher-exact 검정이다.

특정한 구체예에서, 유방암과 연관된 것으로 확인된 마커 대립인자 또는 일배체형(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커 대립인자, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)은 상기 마커 대립인자 또는 일배체형이 건강한 개체(대조군)에서의 존재 대비, 유방암에 대한 위험을 갖는 개체(질병군(affected))에 보다 빈번하게 존재하고, 상기 마커 대립인자 또는 일배체형의 존재는 유방암 또는 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 마커 대립인자 또는 일배체형이다. 다른 구체에에서, 유방암과 연관된 것으로 확인된 하나 이상의 마커(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커 대립인자, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)와 연관 불균형인 위험 마커(at-risk marker)는 건강한 개체(대조군)에서의 존재 대비, 유방암에 대한 위험을 갖는 개체(질병군)에 보다 빈번하게 존재하는 태깅(tagging) 마커이고, 상기 태깅 마커의 존재는 유방암에 대한 증가된 감수성을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 유방암과 연관된 것으로 확인된 하나 이상의 마커(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커 대립인자, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)와 연관 불균형인 위험 마커 대립인자(즉, 증가된 감수성을 부여하는 대립인자)는 건강한 개체(대조군)에서의 존재의 빈도 대비, 유방암에 대한 위험을 갖는 개체(질병군)에 보다 빈번하게 존재하는 하나 이상의 대립인자를 포함하는 마커이고, 상기 마커의 존재는 유방암에 대한 증가된 감수성을 나타낸다.

연구 집단(study population)

일반적으로, 본 발명의 방법 및 키트는 임의의 원천 및 임의의 개체으로부터의 핵산 물질(DNA 또는 RNA)를 포함하는 시료로부터 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다. 개인은 성인, 아동, 또는 태아일 수 있다. 본 발명은 또한, 표적 집단의 구성원인 개체에서 마커 및/또는 일배체형을 평가하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 그와 같은 표적 집단은 다른 유전적 인자, 바이오마커, 생체물리적 인자(예를 들면, 체중, BMD, 혈압), 또는 전반적인 건강 및/또는 생활방식 파라미터(예를 들면, 질병 또는 관련 질병의 병력, 질병의 과거 진단, 질병의 가족력)에 기반하여, 상기 질병을 발병할 위험도를 갖는 개체들의 집단 또는 그룹이다.

본 발명은 40세 이상, 45세 이상, 또는 50세 이상, 55세 이상, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상, 80세 이상, 또는 85세 이상의 개인과 같은, 특정한 연령 서브그룹으로부터의 개인을 포함하는 구체예를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예는 80세 미만, 75세 미만, 또는 70세 미만, 65세 미만, 60세 미만, 55세 미만, 50세 미만, 45세 미만, 40세 미만, 35세 미만, 또는 30세 미만과 같은, 85세 미만의 개인과 같은, 다른 연령군에 관한 것이다. 다른 구체예는 전술된 임의의 연령 범위에 속하는 발병 연령을 갖는 개인에 관한 것이다. 또한, 특정한 구체예에서, 45세를 초과하나, 60세 미만인 발병 연령과 같은 일정 범위의 연령이 관련된 것일 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 앞서 열거된 연령값에 의해 일괄된 모든 연령 범위를 포함한, 다른 연령 범위도 고려된다. 본 발명은 또한 하나의 성별의 개인, 남성 또는 여성에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 여성에 관한 것인다.

아이슬란드 집단은 북유럽 선조 기원의 코카서스인 집단이다. 아이슬란드 집단에서 유전적 연관(genetic linkage)과 관련성(association)의 결과를 보고하는 다수의 연구가 최근 수년간 발표되었다. 그와 같은 다수의 연구들은 다른 집단에서, 최초에 아이슬란드 집단에서 특정 질환과 연관된 것으로 확인된 변이의 재현을 보여준다(Stacey, S.N., et al., Nat Genet. May 27 2007 (Epub ahead of print; Helgadottir, A., et al., Science 316:1491-93 (2007); Steinthorsdottir, V., et al., Nat Genet. 39:770-75 (2007); Gudmundsson, J., et al., Nat Genet. 39:631-37 (2007); Amundadottir, L.T., et al., Nat Genet. 38:652-58 (2006); Grant, S.F., et al., Nat Genet. 38:320-23 (2006)). 따라서, 아이슬란드 집단에서의 유전적 발견이 아프리카 및 아시아로부터의 집단을 포함한, 다른 집단에서 재현되었다.

유방암과 연관된 것으로 확인된 본 발명의 마커들은 다른 인간 집단에서 유사한 연관성을 보이는 것으로 사료된다. 따라서, 개별적인 인간 집단을 포함하는 특정한 구체예가 또한 고려되며 본 발명의 범위 내에 속한다. 그와 같은 구체예는 코카서스 집단, 유럽 집단, 미국 집단, 유라시아 집단, 아시아 집단, 중앙/남아시아 집단, 동아시아 집단, 중동 집단, 아프리카 집단, 라틴 아메리카 집단, 및 오세아니아 집단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 인간 집단으로부터의 인간 개체에 관한 것이다. 유럽 집단은 스웨덴 집단, 노르웨이 집단, 핀란드 집단, 러시아 집단, 덴마크 집단, 아이슬란드 집단, 아일랜드 집단, 켈트(Kelt) 집단, 영국 집단, 스코틀랜드 집단, 네덜란드 집단, 벨기에 집단, 프랑스 집단, 독일 집단, 스페인 집단, 포르투갈 집단, 이탈리아 집단, 폴란드 집단, 불가리아 집단, 슬라브 집단, 세르비아 집단, 보스니아 집단, 체코 집단, 그리스 집단, 및 터키 집단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 반투(Bantu), 만덴크(Mandenk), 요루바(Yoruba), 산(San), 음부티 피그미(Mbuti Pygmy), 오르카디안(Orcadian), 아디겔(Adygel), 러시안(Russian), 사르디니안(Sardinian), 투스칸(Tuscan), 모자비트(Mozabite), 베두인(Bedouin), 드루즈(Druze), 팔레스티니안(Palestinian), 발로치(Balochi), 브라휘(Brahui), 마크라니(Makrani), 신디(Sindhi), 파탄(Pathan), 부루쇼(Burusho), 하자라(Hazara), 위구르(Uygur), 칼라쉬(Kalash), 한(Han), 다이(Dai), 다우르(Daur), 헤젠(Hezhen), 라후(Lahu), 미아오(Miao), 오로켄(Oroqen), 쉬(She), 투지아(Tujia), 투(Tu), 시보(Xibo), 이(Yi), 몽골란(Mongolan), 낙시(Naxi), 캄보디안(Cambodian), 일본인( Japanese), 야쿠트(Yakut), 멜라네시안(Melanesian), 파푸안(Papuan), 카리티아난(Karitianan), 수루이(Surui), 콜럼비안(Columbian), 마야(Maya) 및 피마(Pima)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정한 인간 집단에서 실시될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 아프리카 후손 또는 계통의 사람을 포함하는 집단과 같은 블랙 아프리카 선조(ancestry)를 포함하는 집단에 관한 것이다. 블랙 아프리가 선조는 흑인(black race)에 속하거나 또는 니그로 인종(negro race)에 속하는, 아프리카계 미국인(African-American), 아프로-아메리칸(Afro-American), 블랙 아메리칸(Black American)으로 자가-보고하는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 아프리카계 미국인 또는 블랙 아메리칸은 북미에 거주하고 아프리카의 흑인군에 속하는 기원을 갖는 사람들이다. 또 다른 예에서, 블랙 아프리카 선조의 자가-보고된 사람은 한 명 이상의 블랙 아프리카 선조의 부모 또는 한 명 이상의 블랙 아프리카 선조의 조부모를 가질 수 있다.

개체에서 인종적 기여는 또한 유전적 분석에 의해 결정될 수 있다. 선조의 유전적 분석은 Smith et al. (Am J Hum Genet 74, 1001-13 (2004))에 개시된 마커와 같은, 연관되지 않은(unlinked) 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 수행될 수 있다.

특정한 구체예에서, 본 발명은 앞서 기재된 바와 같이, 특정한 집단에서 확인된 마커 및/또는 일배체형에 관한 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 상이한 집단에 적용되는 경우, 연관 불균형(LD)의 척도는 상이한 결과를 가져올 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이는 특정한 게놈 영역에서 LD의 차이를 초래했을 수 있는 차등적 선택 압력(differential selective pressure) 및 상이한 인간 집단의 상이한 집단 역사 때문이다. 일부 마커들, 예를 들면, SNP 마커들이 상이한 집단에서 상이한 집단 빈도를 가지거나, 또는 하나의 집단에서는 다형성이나, 또 다른 집단에서는 다형성이 아니라는 것이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 입수가능한 방법을 적용하고, 본 명세서에서 고려되는 바와 같이, 임의의 인간 집단에서 본 발명을 실시할 것이다. 이는 특정한 집단 내에서 가장 강력한 연관을 제공하는 마커들을 확인하기 위해, 본 발명의 LD 영역에서 다형성 마커를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 위험 변이는 다양한 인간 집단에서 상이한 일배체형 배경에 상이한 빈도로 존재할 수 있다. 그러나, 당해 분야에서 알려진 방법 및 본 발명의 마커를 이용하여, 본 발명이 임의의 주어진 인간 집단에서 실시될 수 있다.

유전적 검사의 유용성

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 변이가 일반적으로 그 자체로 특정한 유방암을 발병할 개인의 절대적 확인을 제공하지 않는다는 것을 고려하고 이해할 것이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 변이는 본 발명의 위험 또는 보호성 변이를 갖는 개인이 유방암을 발병할 증가된 및/또는 감소된 가능성을 나타낸다. 그러나, 이 정보는 하기에서 보다 상세하게 요약되는 바와 같이, 그 자체로 매우 유용하며, 이 정보는 질병 관리 및 적합한 치료 옵션의 선택을 위해 이용될 수 있기 때문이다.

질병(예를 들면, 유방암)을 발병할 위험도를 부여하는 유전적 변이에 대한 지식은 상기 질환을 발병할 증가된 위험도를 갖는 개체(즉, 위험 변이의 보인자)와 상기 질환을 발병할 감소된 위험도를 갖는 개체(즉, 보호성 변이의 보인자)를 구별하기 위해 유전적 테스트를 적용할 기회를 제공한다. 상기 언급된 두 그룹에 속하는 개체들에 대해, 유전적 테스트의 핵심 가치는 조기 단계에 질병, 또는 질병에 대한 소인을 진단하고 가장 적절한 치료를 제공할 수 있도록 하기 위해 임상의에게 질병의 예후/공격성(aggressiveness)에 대한 정보를 제공할 수 있는 가능성이다.

유방암에 대한 유전 위험도를 예측하는 모델

유방암 위험도 평가의 목표는 고-위험도 여성에서 생존율과 삶의 질을 증가시키면서 비용, 불필요한 개입 및 보다 낮은 위험도의 여성에서 우려를 최소화하기 위해 모든 여성에 대해 맞춤화된 의료 관리 전략의 수립을 위한 합립적인 프레임워크를 제공하는 것이다. 위험도 예측 모델은 주어진 세트의 선천척 위험 특성(예를 들면, 가족력, 과거의 양성 유방 병변(prior benign breast lesion), 과거의 유방 종양)을 갖는 개인에서 유방암에 대한 위험도를 추정한다. 임상에서 가장 일반적으로 이용되는 유방암 위험도 예측 모델은 가족력을 고려하는 것에 의해 유전된 위험 인자들을 추정한다. 위험 추정치는 과거에 유방암으로 진단받은 1명 이상의 가까운 친척을 갖는 개인에 대한 증가된 위험도의 관찰에 근거한다. 위험 추정치는 복잡한 가계도 구조를 고려하지 않는다. 이 모델들은 유방암 소인 돌연변이(breast cancer predisposing mutation)를 갖는 유전자의 보인자와 비-보인자를 구별할 수 없는 추가적인 단점을 갖는다.

보다 정교한 위험도 모델은 특정한 가족력을 다루고 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이에 대한 보인자 상태를 고려할 수 있는 능력을 갖는 보다 우수한 메카니즘을 갖는다. 예를 들면, BOADICEA(Breast and Ovarian Analysis of Disease Incidence and Carrier Estimation Algorithm) (Antoniou et al., 2004)는 가계도 분석 프로그램 MENDEL을 통해 개별적인 가계도 구조에 근거하여 가족력을 고려한다. 공지된 BRCA1 및 BRCA2 상태에 대한 정보도 고려된다. BOADICEA 및 현재 사용되는 모든 다른 유방암 위험도 모델의 주요한 한계는 그들이 다른 소인 유전자로부터의 유전형 정보를 고려하지 않는다는 것이다. 현재의 모델들은 위험도의 비-BRCA 유전적 결정인자(genetic determinant)의 지식 부족을 보충하는 대리물(surrogate)로 작용하기 위해 가족력에 크게 의존한다. 따라서, 이용가능한 모델들은 질병의 공지된 가족력이 있는 상황들에 한정된다. 보다 낮은 침투성 유방암 소인 유전자들은 집단에서 비교적 일반적일 수 있고 BRCA1 및 BRCA2 유전자처럼 가족성 클러스터링(familiar clustering)을 주도하는 강한 경향을 보이지 않을 수 있다. 소인성 대립인자(predisposition allele)의 비교적 높은 유전적 부하(genetic load)를 갖는 환자들은 질병의 가족력을 거의 또는 전혀 보이지 않을 수 있다. 따라서, 유전자-기반 테스트를 통해 직접적으로 수득된 유전된 감수성 데이터를 내포시키는 모델을 구축할 필요성이 존재한다. 모델들을 보다 정확하게 만드는 것 외에, 이는 가족력 파라미터에 대한 의존성을 감소시키고 위험도 프로파일링을 가족력이 그와 같은 주요 인자가 아닌 보다 넓은 위험 집단(at-risk populatoin)으로 확장하는 것을 지원할 것이다.

개선된 유전적 위험도 모델의 유방암 일차 예방(primary prevention)의 임상적 관리로의 통합

임상적 일차 예방 옵션은 현재 화학적 예방(chemopreventative)(또는 호르몬) 치료 및 예방적 수술(prophylactic surgery)이다. 고위험군으로 확인된 환자들에게 화학적 예방 요법의 장기 코스가 처방될 수 있다. 이 개념은 심혈관 의학 부분에서는 잘 수용되나, 임상적 종양학에서는 이제 영향을 미치기 시작하고 있다. 가장 널리 이용되는 종양의 화학적 예방제는 선택적 에스트로겐 수용제 조절제(SERM)인 타목시펜이다. 처음에 유방암 재발에 대한 아쥬반트 요법으로 이용되었던 타목시펜은 이제 유방암 예방제로서 입증된 효능을 갖는다(Cuzick et al., 2003; Martino et al., 2004). FDA는 일부 고위험 여성에서 화학적 예방제로서 타목시펜의 이용을 허가했다.

안타깝게도, 장기적인 타목시펜 이용은 자궁내막암(endometrial cancer)에 대한 위험도를 약 2.5배 증가시키고 정맥 혈전증의 위험도를 약 2.0배 증가시킨다. 폐색전증, 뇌졸중, 및 백내장에 대한 위험도도 증가된었다(Cuzick et al., 2003). 따라서, 유방암 발생률을 낮추기 위한 타목시펜 이용의 장점은 전체 사망률의 상응하는 감소로 용이하게 실현되지 못할 수 있다. 랄록시펜이라 불리는 또 다른 SERM은 예방적 모드에서 보다 효과적이고, 자궁내막암에 대한 동일한 위험을 갖지 않는다. 그러나, 랄록시펜으로 장기 치료된 환자에서 혈전증에 대한 위험도는 여전히 증가된다(Cuzick et al., 2003; Martino et al., 2004). 또한, 타목시펜과 랄록시펜은 모두 그들과 연관된 삶의 질 문제를 갖는다. 화학적 예방 모드에서 SERM 요법의 합리적인 위험:이익 분석을 수행하기 위해, 유방암에 대한 가장 높은 위험도를 갖는 개체들을 확인해야 하는 임상적 요구가 있다. 유방암에 대한 위험도의 상당한 부분이 유전적이라는 점을 고려할 때, 유방암에 대해 개인의 위험도를 정량하기 위한 유전적 테스트에 대한 명백한 임상적 요구가 존재한다. 아로마타아제 저해제와 같은, 이용가능해질 수 있는 미래의 암 화학적 예방 치료제로부터 유사한 문제들이 발생할 것을 예상할 수 있다. 또한, 화학적 예방 요법이 보다 안전해지기 때문에, 유전적으로 소인을 가지나, BRCA1 및 BRCA2 보인자와 연관된 크게 증가된 위험도를 갖지 않는 환자들을 확인해야 할 증가된 요구가 존재한다.

유방암에 대한 고위험도를 갖는 것으로 확인된 환자들은 예방적 수술에 대해 고려될 수 있다; 양측 유방절제술 또는 난소절제술 또는 양자 모두. 명백하게, 그와 같은 근치적인 치료법(drastic treatment)은 매우 높은 위험도를 갖는 환자들에게만 권고된다. 실제로, 그와 같은 위험도는 현재 BRCA1, BRCA2, 또는 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni Syndrome)의 p53, 코우덴 증후군(Cowden's syndrome)의 PTEN과 같은 희귀 유방암 소인성 증후군(rare breast cancer predisposition syndrome)에 관여하는 것으로 알려진 유전자들에 돌연변이를 갖는 개체들에서만 확인될 수 있다.

BRCA1 및 BRCA2 돌연변이의 침투율의 추정치는 그들이 집단-기반 추정치로부터 유래되는 경우보다 다중-케이스 가족(multiple-case family)들로부터 유래될 때 더 높은 경향이 있다. 이는 상이한 돌연변이-보인(mutaion-carrying) 가족들이 유방암에 대한 상이한 침투율을 보이기 때문이다(예를 들면, Thorlacius et al., 1997 참조). 이 변이에 기여하는 주요한 인자들 중 하나는 그 효과가 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이의 침투율을 변형시키는 것인 미지의 소인성 유전자(unknown predisposition gene)의 작용이다. 따라서, BRCA1 또는 BRCA2 유전자에 돌연변이를 갖는 개체에 대한 절대적 위험도는 변형시키는 유전자(modifying gene)의 존재 및 작용에 대한 이해 없이 정확하게 정량될 수 없다. BRCA1 및 BRCA2 보인자에 대한 치료 옵션은 가혹할 수 있기 때문에, 가능한 한 가장 정확하게 개별적인 BRCA 보인자에 대한 위험도를 정량하는 것이 중요하다. 따라서, BRCA1 및 BRCA2 보인자에서 유방암의 침투를 변형시키는 효과를 갖는 소인성 유전자(predisposition gene)를 확인하고 이 유전자들에 기반한 개선된 위험도 평가 모델을 수립해야 하는 필요성이 존재한다.

또한, 유방암의 강한 가족력 때문에 유방암에 대한 매우 높은 위험도를 갖는 것으로 인식되나, 알려진 소인성 유전자에서 돌연변이를 확인할 수 없는 개체들이 있다. 그와 같은 경우에, 고 침투성 소인성 유전자를 유전받았는지 여부를 확인하기 위해 개체를 테스트할 수 없기 때문에, 예방적 수술의 고려가 어렵다. 따라서, 개체의 위험도가 정확하게 평가될 수 없다. 따라서, 밝혀지지 않은 고 침투성 소인성 유전자를 확인하고 일차적인 예방 전략에서 사용할 관련된 유전적 테스트를 개발해야 하는 명백한 임상적 요구가 존재한다.

조기 진단

대부분의 서양 국가에서 유방암에 대한 임상적 스크리닝은 정기적인 임상적 유방 검사(clinical breast excamination, CBE) 및 X-선 유방촬영술이다. CBE는 우수한 유방촬영 스크리닝 프로그램에서 사용될 때 부가적인 이익을 거의 갖지 않는다는 것을 나타내는 우수한 증거가 있다. 영국에서, 50세 내지 70세의 여성들은 3년마다 스크리닝 유방촬영술을 받을 수 있다. 미국의 경우, 건강관리 제공자에 따라 다르나, 미국 암협회(the American Cancer Society)는 40세부터 매년 유방촬영 스크리닝을 권장한다. 유방촬영 스크리닝은 50세 이상의 스크리닝된 여성에서 사망율을 감소시키는 입증된 효과를 갖는다.

유전적 검사가 기존의 유방촬영 스크리닝 프로그램에 대한 접근을 감소시키는 수단으로 이용될 것 같지 않다. 그러나, 유방촬영 스크리닝도 단점을 가지며 유전적 검사가 강화된 스크리닝 프로그램을 위한 대상자들을 선별하기 위해 이용되는 것이 고려될 수 있다. 유방촬영 스크리닝의 단점 중 하나는 현재까지 50세 전에 스크리닝된 여성에 대해 개선된 생존율에 대한 유의성 있는 효과를 입증하는 것이 가능하지 않았다는 것이다.

유방촬영술이 50세 미만의 여성에서 덜 효과적인 한가지 이유는 유방 조직의 밀도(density)가 더 어린 여성에서 더 높아서, 종양의 유방촬영에 의한 검출을 더 어렵게한다는 것이다. 그러나, 소인을 갖는 개체에서 유방암은 어린 연령군에서 일어나는 경향이 있고 높은 유방 밀도와 유방암 위험도 간의 명확한 연관이 있다. 따라서, 높은 소인을 갖는 개체가 최고 위험도의 그룹에서 최적 미만으로 작동될 기법에 의해 관리될 수 있기 때문에, 이들에서 유방촬영 스크리닝의 단순한 증가에 따른 문제가 있다. 최근의 연구는 CE-MRI(contrast-enhanced magnetic resonance)가 유방촬영 스크리닝보다 더 민감하고 이 고위험도 그룹에서 보다 조기에 종양을 검출한다는 것을 보여주었다(Warner et al., 2004; Leach et al., 2005). CE-MRI 전략은 통상적인 X-선 유방촬영술과 조합되어 이용될 때 특히 효과적이다 (Leach et al., 2005). CE-MRI는 고 비용을 초래하는 전문 센터(specialist center)를 필요로 하므로, 50세 미만의 스크리닝은 최고 위험도에 있는 개체들로 제한되어야 한다. 현재의 CE-MRI 시험은 BRCA1, BRCA2 또는 p53 돌연변이 또는 질병의 매우 강한 가족력을 갖는 개체들로의 적용에 한정된다. 이 스크리닝 방법(modality)을 보다 넓은 범위의 고-위험군 환자들로 확장하는 것은 유전자-기반 위험도 프로파일링 도구의 제공에 의해 크게 촉진될 것이다.

조기발병 유방암 및 유전적 소인을 갖는 여성에서 발생하는 암이 장년층의, 덜 강한 유전적 소인을 갖는 여성에서 발생한 암보다 더 빠르게 성장한다는 견해를 뒷받침하는 좋은 증거가 있다. 이 증거는 젊은 여성에서 중간암(interval cancer)의 보다 높은 비율의 관찰로부터 유래되며, 즉, 잘 스크리닝된 집단에서 스크리닝을 위한 방문간 간격에 발생하는 암이 젊은 여성들 사이에서 더 높다. 따라서, 방법에 관계 없이, 더 젊은 여성들에서는 스크리닝 간격이 단축되어야 한다는 제안이 있다. 보다 값비싼 방법을 이용한 보다 빈번한 스크리닝이 유방암의 전체 비율이 비교적 낮은 연령군에 대해 요구되는 것으로 보인다는 점에서 역설이 있다. 질병을 발병할 가장 높은 소인을 갖는 젊은 개체들을 조기에 확인하고, 그들을 보다 값비싸고 광범위한 스크리닝 체계로 전달하는 것에 대한 명백한 임상적 필요성이 존재한다.

치료

현재, 원발성 유방암은 외과적 수술, 아쥬반트 화학요법, 방사선요법, 뒤이은 장기적 호르몬 요법에 의해 치료된다. 종종 3개 또는 4개의 치료법의 조합이 이용된다.

동일한 질병 단계에 있는 유방암 환자들이 아쥬반트 화학요법에 대해 매우 상이한 반응을 가져서 전체적인 치료 결과에 광범위한 변이가 초래될 수 있다. 유방암 환자의 아쥬반트 화학요법 치료에 대한 적격(eligibility)을 결정하는 것에 대한 합의된 가이드라인(St Galen 및 NIH 기준)이 수립되었다. 그러나, 전이의 가장 강력한 임상적 및 조직학적 예측자도 유방 종양의 임상적 반응을 정확하게 예측하지 못했다(Goldhirsch et al., 1998; Eifel et al., 2001). 화학요법 또는 호르몬 요법은 전이의 위험도를 약 1/3 감소시키나, 이 치료를 받는 환자의 70-80%는 상기 치료 없이도 생존했을 것이다. 따라서, 유방암 환자의 대다수는 현재 효과적이지 않거나 또는 불필요한 치료법을 제공받고 있다. 임상의들이 가장 높은 효과를 받을 수 있는 환자들에게 보다 적합하게 치료법을 맞춤화할 수 있게 할 예후적 척도(prognostic measure)의 개발에서의 개선에 대한 명백한 임상적 요구가 존재한다. 유전적 소인에 대해 개체들을 프로파일링하는 것이 그들의 치료 결과에 적합한 결과를 밝히고 그에 의해 합리적인 치료 계획을 보조할 수 있을 것으로 기대하는 것은 타당하다.

여러 과거의 연구들이 이 개념을 예시한다: BRCA 돌연변이 보인자인 유방암 환자들은 아쥬반트 화학요법으로 치료되는 경우 보다 우수한 임상적 반응률 및 생존을 보이는 것으로 나타난다[Chappuis, et al., (2002), J Med Genet, 39, 608-10; Goffin, et al., (2003), Cancer, 97, 527-36]. BRCA 돌연변이 보인자들은 비-보인자(non-carrier) 대비 난소암에 대한 백금 화학요법에 대해 개선된 반응을 보인다[Cass, et al., (2003), Cancer, 97, 2187-95]. 관련된 유전자들이 알려지지 않은, 소인을 갖는 환자에 유사한 고려가 적용될 수 있다. 예를 들면, 침윤성 소엽성 유방암(infiltrating lobular breast carcinoma, ILBC)은 강한 가족성 요소(familiar component)를 갖는 것으로 알려져 있으나, 관련된 유전적 변이는 확인되지 않았다. ILBC를 갖는 환자들은 일반적인 화학요법 방식(common chemotherapy regime)에 대한 보다 열등한 반응을 보인다[Mathieu, et al., (2004), Eur J Cancer, 40, 342-51].

유전적 소인 모델(genetic predisposition model)은 치료 전략의 개별화(individualization)를 보조하며, 또한 이 전략들의 수립에서 필수적인 역할을 수행할 수 있다. 예를 들면, BRCA1 및 BRCA2 돌연변이 종양 세포는 그들의 결함있는 DNA 복구 경로의 결과로 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제(PARP) 저해제에 매우 민감한 것으로 확인되었다[Farmer, et al., (2005), Nature, 434, 917-21]. 이는 BRCA 보인자 환자들에서의 그들의 이용을 목적으로 PARP를 표적으로 하는 소형 분자 약물의 개발을 촉진했다. 이 예로부터, 유전적 소인의 지식이 유전적 위험도 프로파일링과 조합하여 사용될 맞춤화된 화학요법 방식의 개발을 가져올 약물 표적을 확인할 수 있다는 것이 명백하다.

암 화학요법은 정상적인 조직, 특히, 높은 증식성의 조혈 및 장 상피 세포 구획에 대해 잘 알려진, 용량-제한적(dose-limiting) 부작용을 갖는다. 세포독성 약물에 대한 정상 조직의 민감성에 유전에 기반한 개별적인 차이가 존재한다는 것이 예상될 수 있다. 이 인자들을 이해하는 것이 합리적인 치료 계획 및 정상조직을 화학요법의 유해한 효과로부터 보호하도록 설계된 약물의 개발을 보조할 수 있다.

유전적 프로파일링은 또한 개선된 방사선요법 방식에 기여할 수 있다: 표준 방사선 요법 치료를 받은 유방암 환자의 그룹 내에서, 일부 환자들은 정상적으로 내인되는(tolerated) 방사선량에 대해 부작용을 경험할 것이다. 급성 반응은 홍반, 습성 박리(moist desquamation), 부종 및 방사선 폐렴을 포함한다. 모세혈관 확장, 부종, 폐섬유증 및 유방 섬유증을 포함한 장기 반응이 방사선요법 후 수년 뒤에 발생할 수 있다. 급성 반응 및 장기 반응은 모두 이환율의 상당한 원천이며 치명적일 수 있다. 한 연구에서, 87%의 환자들이 방사선요법에 대해 일부 유해한 부작용을 가지며, 11%는 심각한 부작용을 갖는 것으로 확인되었다(LENT/SOMA Grade 3-4); [Hoeller, et al., (2003), Int J Radiat Oncol Biol Phys, 55, 1013-8]. 방사선요법에 대한 부작용을 경험할 확률은 주로 정상 조직 반응에서 구성적인 개별적 차이(constitutive individual difference) 때문이며 이들은 강한 유전적 요소를 갖는다는 견해가 있다. 공지된 유방암 소인 유전자 중 여러개(예를 들면, BRCA1, BRCA2, ATM)가 DNA 이중가닥 절단(double strand break) 복구의 경로에 영향을 미친다. DNA 이중가닥 절단은 방사선요법에 의해 유도되는 주요한 세포독성 병변이다. 이는 이 경로에 속하는 유전자에 변이를 가져서 유방암에 대한 유전적 소인을 갖는 개체들이 방사선요법으로부터 과도한 정상조직 손상을 겪을 보다 높은 위험을 가질 수 있다는 우려를 가져왔다.

집단에서 구성적으로 방사선민감성인(constitutively radiosensitive) 개체들의 존재는 부작용의 빈도를 수용가능한 수준으로 유지시키기 위해, 환자 집단의 대다수에 대해 방사선요법 선량 비율(radiotherapy dose rate)이 제한되어야 한다는 것을 의미한다. 따라서, 방사선요법에 대한 부작용에 대해 증가된 위험을 갖는 개체들을 확인할 수 있는 신뢰할 수 있는 테스트에 대한 임상적 요구가 존재한다. 그와 같은 테스트는 방사선민감성인 개체에 대한 보수적인 치료 또는 대안적인 치료를 의미하여, 비교적 방사선내성(radioresistant)인 대다수의 환자들에 대한 방사선치료 선량의 증가를 가능하게 할 것이다. 유방암 환자들을 단순하게 방사선민감성(radiosensitive), 중간(intermediate) 및 방사선내성(radioresistant) 범주로 분류하기 위한 테스트에 의해 가능해진 선량 증가(dose escalation)는 국소 종양 통제(local tumor control)의 약 35% 증가 및 그에 따른 생존율의 개선을 가져올 것이다(Burnet et al., 1996).

이온화 방사선에 대한 노출은 유방에서 종양발생에 기여하는 입증된 인자이다(Dumitrescu and Cotarla 2005). 공지된 유방암 소인 유전자들은 방사선-유도 DNA 손상에 대한 세포 반응의 경로 성분들을 코딩한다(Narod and Foulkes 2004). 따라서, 이차 원발성 유방 종양에 대한 위험도가 방사선요법 영역 내에 있는 정상 조직의 방사선조사에 의해 증가될 수 있다는 우려가 있다. 방사선 요법으로부터 BRCA 보인자에 대한 측정가능한 증가된 위험도는 없는 것으로 보이나, 그들의 이차 원발성 종양에 대한 위험도는 이미 매우 높다. 이차 원발성 종양에 대한 위험도가 방사선요법으로 치료된 ATM 및 CHEK2 유전자의 유방암 소인성 대립인자의 보인자에서 증가된다는 것을 시사하는 증거가 있다(Bernstein et al., 2004; Broeks et al., 2004). 방사선요법(및, 가능하게는 집중적인 유방촬영 스크리닝)으로부터의 이차 원발성 종양의 위험도는 치료 계획 단계 동안 환자로부터 정확안 유전적 위험도 프로파일을 수득하는 것에 의해 더 잘 정의될 것으로 예상된다.

이차 예방(Secondary Prevention)

단계 1 또는 단계 2 유방암으로 진단된 환자의 약 30%는 그들의 최초 종양의 국소(loco-regional) 또는 원격 전이 재발(distant metastatic recurrence)을 경험할 것이다. 원발성 유방암을 앓았던 환자들은 또한 유방보존 수술(breast-conserving surgery)을 받은 경우, 반대쪽 유방 또는 같은쪽 유방에 이차 원발성 종양을 진단받을 위험도가 크게 증가된다. 이차 예방(secondary prevention)은 재발 또는 이차 원발성 종양의 발생을 예방하기 위해 이용되는 방법을 의미한다. 현재 사용되는 방법은 단독이거나 또는 아로마타아제 저해제와 조합된 타목시펜 또는 또 다른 SERM에 의한 장기 치료, 위험도 저하를 위한 반대쪽 유방의 절제술, 및 위험도-저하를 위한 난소절제술(가족성 유방-난소암의 위험도를 갖는 환자의 경우)을 포함한다. 타목시펜의 사용에 대한 고려사항은 앞서 검토되었다. 위험도 저하를 위한 수술적 옵션을 고려할 때, 고지된(informed) 비용:이익 분석을 수행하기 위해 위험도가 정량화될 수 있어야 한다는 것이 명백하다.

유방암에 대한 공지된 유전적 소인을 갖는 환자들이 대부분의 환자들보다 더 악화될 수 있다는 여러 징후가 있다. CHEK2 유전자 1100delC 변이를 갖는 환자들은 비-보인자 대비 원격 전이의 약 2.8배 증가된 위험도 및 질병 재발의 3.9배 증가된 위험도를 갖는다[de Bock, et al., (2004), J Med Genet, 41, 731-5]. BRCA1 림프절-음성(node-negative) 종양을 갖는 환자들은 BRCA1 돌연변이를 갖지 않는 유사한 환자들보다 전이의 더 높은 위험도를 갖는다[Goffin, et al., (2003), Cancer, 97, 527-36; Moller, et al., (2002), Int J Cancer, 101, 555-9; Eerola, et al., (2001), Int J Cancer, 93, 368-72]. 따라서, 국소 재발 및 전이의 위험도를 평가하고, 그에 의해 이차 예방적 치료의 선택을 안내하기 위해 유전적 프로파일링이 이용될 수 있다.

일반적으로, 원발성 종양 진단을 받은 환자들은 0.7%의 일정한 연별 발생율로 이차 원발성 종양의 위험도를 갖는다(Peto and Mack 2000). BRCA 돌연변이를 갖는 환자들은 대부분의 유방암 환자들보다 이차 원발성 종양에 대해 유의성있게 더 높은 위험도를 가지며, 절대적 위험도는 40-60%의 범위이다(Easton 1999). BRCA 돌연변이의 보인자는 이차 원발성 종양에 대해 크게 증가된 위험도를 갖는다 [Stacey, et al., (2006), PLoS Med, 3, e217; Metcalfe, et al., (2004), J Clin Oncol, 22, 2328-35]. CHEK2 유전자에 돌연변이를 갖는 환자들은 반대쪽 유방암의 약 5.7배 증가된 위험도를 갖는다[de Bock, et al., (2004), J Med Genet, 41, 731-5]. BARD1 Cys557Ser 변이의 보인자는 이차 원발성 종양을 진단받을 가능성이 2.7배 더 높다[Stacey, et al., (2006), PLoS Med, 3, e217]. 유전적 위험도 프로파일링은 환자에서 이차 원발성 종양의 위험도를 평가하기 위해 이용될 수 있고 예방적 수단이 얼마나 공격적이어야 하는지 여부에 대한 결정을 알려줄 것이다.

방법

유방암의 위험도 평가 및 진단 방법이 본 명세서에서 설명되고 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 유방암의 치료제에 대한 반응의 확률에 대해 개인을 평가하는 방법, 및 유방암에 대한 치료제의 효과를 예측하는 방법을 포함한다. 유방암에 대한 감수성을 검출하기 위해 개체로부터의 시료를 분석하는 키트도 본 발명에 포함된다.

진단 및 스크리닝 분석법

특정한 구체예에서, 본 발명은 유방암을 갖는 개체 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개체에서 보다 빈번하게 나타나는 유전적 마커의 특정한 대립인자를 검출하는 것에 의해, 유방암, 또는 유방암에 대한 감수성을 진단하거나 또는 상기 진단을 보조하는 방법에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 다형성 마커(예를 들면, 본 명세서에 기재된 마커)의 하나 이상의 대립인자를 검출하는 것에 의해 유방암에 대한 감수성을 진단하는 방법이다. 본 발명은 특정한 마커의 특정한 대립인자 또는 일배체형의 검출이 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법을 기재한다. 그와 같은 예후적 또는 예측적 분석법은 또한 유방암의 증상의 발생 전에 개체의 예방적 치료를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 의료 전문가에 의해 수행되는 진단과 같은 진단의 임상적 적용 방법에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 일반인(layman)에 의해 수행되는 진단 방법 또는 감수성의 결정 방법에 관한 것이다. Molecular Inversion Probe 어레이 기술 (예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies (예를 들면, Illumina GoldenGate and Infinium assays)와 같은 SNP 마커의 고효율 유전형분석(high-throughput genotyping)을 포함한, 유전형분석 기술에서의 최근의 기술적 진전은 개인들이 비교적 낮은 비용으로 그들의 게놈을 백만개 까지의 SNP에 대해 동시에 평가받을 수 있게 한다. 결과적으로 수득된, 개인에게 이용가능하게 된 유전형 정보는 다양한 SNP와 연관된 질병 또는 성향 위험도에 대한 공개 문헌으로부터의 정보와 비교될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 질병-연관 대립인자의 진단적 응용은 임상적 테스트의 결과에 근거하여 의료전문가에 의해, 또는 자신의 유전형 데이터의 분석을 통해 개인에 의해 수행될 수 있다. 바꾸어 말하면, 유전적 위험도에 근거한 감수성의 진단 또는 평가가 대상자의 유전형에 대한 정보 및 다양한 위험 인자에 대한 발표문헌에 근거하여, 의료 전문가, 유전학 상담자(genetic counselor), 또는 일반인에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명에서, 용어 "진단하는(diagnosing)" 및 "감수성을 진단하다(dignose a susceptibility)" 및 "감수성을 결정하다(determine a suceptiblity)"는 전술된 방법을 포함한, 모든 이용가능한 진단 방법을 의미하도록 의도된다.

또한, 특정한 다른 구체예에서, 본 발명은 유방암으로 진단되지 않은 개인 또는 일반적 집단에서보다 유방암으로 진단된 환자에서 덜 빈번하게 나타나는 특정한 유전적 마커 대립인자 또는 일배체형을 검출하는 것에 의해, 유방암에 대한 감소된 감수성을 진단하거나 또는 상기 진단을 보조하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 기재되고 예시된 바와 같이, 특정한 마커 대립인자 또는 일배체형(예를 들면, rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭, STEAP3/TSAP6 유전자 내에 위치한 마커들, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커들 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)이 유방암(예를 들면, All BC 및/또는 MedPre 유방암)과 연관된다. 일 구체예에서, 상기 마커 대립인자 또는 일배체형은 유방암의 유의성 있는 위험도 또는 그에 대한 감수성을 부여하는 마커 대립인자 또는 일배체형이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭, STEAP3/TSAP6 유전자 내에 위치한 마커들, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커들 및 일배체형, 및 이들과 (예를 들면, r² > 0.2로 정의된) 연관 불균형인 마커들로부터 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 마커 대립인자 또는 일배체형, 예를 들면, rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭, STEAP3/TSAP6 유전자 내에 위치한 마커들, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커들 및 일배체형, 또는 이들과 연관 불균형인 마커들을 스크리닝하는 것에 의해, 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 대립인자 또는 일배체형은 건강한 개체(집단 대조군과 같은, 대조군)에서 그의 존재의 빈도 대비, 유방암을 갖거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개체(질병군, 예를 들면, All BC 또는 MedPre 유방암)에 보다 빈번하게 존재한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 마커 rs4848543, 마커 rs13387042, 마커 rs3803662, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 것인 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 마커 대립인자 또는 일배체형의 연관의 유의성은 0.05 미만의 p 값을 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 연관의 유의성은 보다 작은 p-값, 예를 들면, 0.01 미만, 0.001 미만, 0.0001 미만, 0.00001 미만, 0.000001 미만, 0.0000001 미만, 0.00000001 미만 또는 0.000000001 미만의 p-값과 같은 보다 작은 p-값을 특징으로 한다.

이 구체예들에서, 상기 하나 이상의 마커 대립인자 또는 일배체형의 존재는 유방암의 감수성을 나타낸다. 이 진단 방법들은 유방암과 연관된 하나 이상의 마커 대립인자 또는 일배체형의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 일배체형은 다양한 유전적 마커(예를 들면, SNP, 마이크로새틀라이트)에서의 대립인자의 조합을 포함한다. 특정한 일배체형을 구성하는 특정한 유전적 마커 대립인자의 검출은 본 명세서에 기재되고 및/또는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 유전적 마커는 핵산 수준에서(예를 들면, 직접적인 뉴클레오티드 서열결정에 의해 또는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 공지된 다른 수단에 의해) 또는 상기 유전적 마커가 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩된 단백질의 코딩 서열에 영향을 미친다면, 아미노산 수준에서(예를 들면, 단백질 서열결정에 의해 또는 그와 같은 단백질을 인식하는 항체를 이용한 면역분석법에 의해) 검출될 수 있다. 본 발명의 마커 대립인자 또는 일배체형은 유방암과 연관된 게놈 DNA 서열의 단편에 대응된다. 그와 같은 단편은 대상이 되는 다형성 마커 또는 일배체형의 DNA 서열을 포함하나, 또한 상기 마커 또는 일배체형과 강한 LD(linkage disequilibrium)인(예를 들면, 0.2보다 큰 r² 및/또는 0.8보다 큰 |D'|의 값에 의해 결정됨) DNA 세그먼트를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 유방암에 대한 감수성의 진단이 서던 분석(Southern analysis), 노던 분석(Northern analysis), 및/또는 인-시투 혼성화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 혼성화 방법을 이용하여 달성될 수 있다(모든 보충물(supplement)을 포함한, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons 참조). 테스트 대상 또는 개체로부터의 생물학적 시료(게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA의 "테스트 시료(test sample)")는 유방암을 갖거나 유방암에 대한 감수성을 갖거나 또는 유방암에 대한 소인을 갖는 것으로 의심되는 개체("테스트 개체(test subject)")로부터 수득된다. 상기 개체는 성인, 아동, 또는 태아일 수 있다. 테스트 시료는 혈액 시료, 양수 시료, 뇌척수액 시료, 또는 피부, 근육, 구강점막, 또는 결막 점막, 태반, 위장관 또는 다른 기관으로부터의 조직 시료와 같은, 게놈 DNA를 포함하는 임의의 출처로부터 유래될 수 있다. 태아 세포 또는 조직으로부터의 DNA의 테스트 시료는 양수 천자 또는 융모막 융모 채취법(chorionic villus sampling)과 같은 적합한 방법에 의해 수득될 수 있다. 그 후, DNA, RNA, 또는 cDNA 시료가 검사된다. 특정한 마커 대립인자의 존재는 상기 특정한 대립인자에 대해 특이적인 핵산 프로브의 서열-특이적 혼성화에 의해 표시될 수 있다. 각각 특정한 대립인자에 대해 특이적인, 여러 개의 서열-특이적 핵산 프로브를 사용하는 것에 의해, 하나 이상의 특정한 마커 대립인자 또는 하나 이상의 특정한 일배체형의 존재가 표시될 수 있다. 일 구체예에서, 일배체형은 특정한 일배체형에 대해 특이적인(즉, 상기 일배체형의 특징적인 특정한 마커 대립인자를 포함하는 DNA 가닥에 특이적으로 혼성화하는) 단일 핵산 프로브에 의해 표시될 수 있다. 서열-특이적 프로브는 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA에 혼성화되도록 지시될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "핵산 프로브(nucleic acid probe)"는 상보적 서열에 혼성화되는 DNA 프로브 또는 RNA 프로브일 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 테스트 시료로부터의 게놈 서열에 특정한 대립인자가 존재하는 경우에만 서열 특이적 혼성화가 일어나도록 그와 같은 프로브를 설계하는 방법을 알 것이다.

유방암에 대한 감수성을 진단하기 위해, 유방암과 연관된 핵산을 포함하는 테스트 시료, 예를 들면, 게놈 DNA 시료를 하나 이상의 핵산 프로브와 접촉시키는 것에 의해 혼성화 시료가 형성된다. mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하기 위한 프로브의 비-한정적인 예는 본 명세서에 기재된 mRNA 또는 게놈 DNA 서열에 혼성화될 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 상기 핵산 프로브는 예를 들면, 전장(full-length) 핵산 분자, 또는 그의 일부, 예를 들면, 적합한 mRNA 또는 게놈 DNA에 엄격한(stringent) 조건 하에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 15개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 250개 이상, 또는 500개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 프로브는 선택적으로 본 명세서에 기재된 마커의 하나 이상의 대립인자, 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 마커 또는 일배체형(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)을 포함한, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오티드 서열, rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭, 및/또는 STEAP3/TSAP 유전자의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있거나, 또는 상기 프로브는 그와 같은 서열의 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 핵산 프로브는 선택적으로 본 명세서에 기재된 마커의 하나 이상의 대립인자(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들) 또는 본 명세서에 기재된 일배체형에 포함된 하나 이상의 대립인자를 포함한, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에 표시된 뉴클레오티드 서열; 또는 본 명세서에 기재된 rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭, rs3803662 LD 블럭 및/또는 STEAP3/TSAP6 유전자의 뉴클레오티드 서열의 일부이거나, 또는 상기 프로브는 그와 같은 서열의 상보적인 서열일 수 있다. 본 발명의 진단 분석법에서 이용하기 위한 다른 적합한 프로브가 본 명세서에 기재된다. 혼성화는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, 모든 보충물을 포함한, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons 참조). 일 구체예에서, 혼성화는 특이적 혼성화, 즉, 불일치를 포함하지 않는 혼성화(정확한 혼성화)를 의미한다. 일 구체예에서, 상기 특이적 혼성화를 위한 혼성화 조건은 높은 엄격성이다.

존재하는 경우, 특이적 혼성화는 표준 방법을 이용하여 검출된다. 핵산 프로브와 테스트 시료 내의 유방암 연관 핵산 간에 특이적 혼성화가 일어나면, 상기 시료는 상기 핵산 프로브에 존재하는 뉴클레오티드에 상보적인 대립인자를 포함한다. 본 발명의 다른 마커, 또는 본 발명의 일배체형을 구성하는 마커에 대해, 상기 방법이 반복될 수 있거나, 또는 한번에 하나 이상의 마커 대립인자를 검출하기 위해 복수 개의 프로브가 동시에 이용될 수 있다. 특정한 일배체형의 둘 이상의 마커 대립인자를 포함하는 단일 프로브를 설계할 수 있다(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 특정한 일배체형을 구성하는 모든 마커에 상보적인 대립인자를 포함하는 프로브). 시료에서 일배체형의 특정한 마커의 검출은 상기 시료의 원천이 특정한 일배체형(예를 들면, 일배체형)을 가지며 따라서, 유방암에 대해 감수성을 갖는다는 것을 나타낸다.

하나의 바람직한 구체예에서, Kutyavin et al. (Nucleic Acid Res. 34:e128 (2006))에 기재된 바와 같이, 그의 3' 말단에 있는 형광 모이어티(fluorescent moiety) 또는 그룹 및 그의 5' 말단에 있는 퀀처(quencher)를 포함하는 검출 올리고뉴클레오티드 및 인핸서 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법이 적용될 수 있다. 형광 모이어티는 Gig Harbor Green 또는 Yakima Yellow, 또는 다른 적합한 형광 모이어티일 수 있다. 검출 프로브는 검출대상 SNP 다형성을 포함하는 짧은 뉴클레오티드 서열에 혼성화되도록 설계된다. 바람직하게는, 상기 SNP는 검출 프로브의 말단 잔기부터 3' 말단으로부터의 -6 잔기까지 중에 존재한다. 인핸서는 검출 프로브에 대해 3'인 DNA 주형에 혼성화되는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 상기 프로브들은 검출 프로브와 인핸서 뉴클레오티드 프로브가 모두 주형에 결합된 경우, 상기 검출 프로브와 인핸서 뉴클레오티드 프로브 간에 단일 뉴클레오티드 갭이 존재하도록 설계된다. 상기 갭은 엔도뉴클레아제 IV와 같은, 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 합성 탈염기 부위(synthetic abasic site)를 생성한다. 상기 효소는 완전히 상보적인 검출 프로브로부터 염료를 절단하나, 불일치를 포함하는 검출 프로브는 절단할 수 없다. 따라서, 방출된 형광 모이어티의 형광을 측정하는 것에 의해, 검출 프로브의 뉴클레오티드 서열에 의해 정의된 특정한 대립인자의 존재의 평가가 수행될 수 있다.

검출 프로브는 임의의 적합한 크기일 수 있으나, 바람직하게는 프로브는 비교적 짧다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 5개 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 10개 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성되고, 또 다른 구체예에서, 상기 프로브는 길이가 12개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 다른 길이의 프로브들도 가능하고 본 발명이 속하는 기술 분야의 평균적인 당업자의 기술의 범위 내에 속한다.

바람직한 구체예에서, SNP 다형성을 포함하는 DNA 주형은 검출 전에 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭된다. 그와 같은 구체예에서, 증폭된 DNA가 검출 프로프 및 인핸서 프로브에 대한 주형으로 기능한다.

검출 프로브, 인핸서 프로브, 및/또는 PCR에 의한 주형의 증폭을 위해 이용되는 프라이머의 특정한 구체예는 변형된 A 및 변형된 G를 포함한, 변형된 염기의 이용을 포함한다. 변형된 염기의 이용은 주형 DNA에 대한 뉴클레오티드 분자(프로브 및/또는 프라이머)의 용융점을 조정하기 위해, 예를 들면, 상보적인 T와 세개의 수소 결합을 형성할 수 있는 능력을 갖는 변형된 A가 이용될 수 있는, 낮은 비율의 G 또는 C 염기를 포함하는 영역에서 용융점을 높이기 위해, 또는 예를 들면, 상보적인 C와 두 개의 수소 결합만을 형성하는 변형된 G 염기를 이용하는 것에 의해, 높은 비율의 G 또는 C 염기를 포함하는 영역에서 용융점을 낮추기 위해 유용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 검출 뉴클레오티드 프로브의 설계에서 변형된 염기들이 이용된다. 당업자에게 알려진 임의의 변형된 염기가 이 방법에서 선택될 수 있고, 적합한 염기의 선택은 본 명세서의 교시 및 당업자에게 알려진 상업적 출처로부터 이용가능한 공지된 염기에 근거하여 당업자의 범위 내에 속한다.

또 다른 혼성화 방법에서, 유방암과 연관된 다형성의 존재를 확인하기 위해 노던 분석이 이용된다(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, supra 참조). 노던 분석의 경우, RNA의 테스트 시료가 적합한 수단에 의해 개체로부터 수득된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 개체로부터의 RNA에 대한 핵산 프로브의 특이적 혼성화는 상기 프로브에 상보적인 특정한 대립인자를 나타낸다. 핵산 프로브의 용도의 대표적인 예를 위해, 예를 들면, 미국특허 제5,288,611호 및 제4,851,330호를 참조한다.

추가적으로, 또는 대안적으로, 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)이 본 명세서에 기재된 혼성화 방법에서 핵산 프로브에 추가하여, 또는 핵산 프로브 대신에 이용될 수 있다. PNA는 유기 염기 (A, G, C, T 또는 U)가 메틸렌 카르보닐 링커를 통해 글리신 질소에 결합된, N-(2-아미노에틸)글리신 유닛과 같은, 펩티드-유사 무기 백본(peptide-like inorganic backbone)을 갖는 DNA 모방체(mimic)이다(예를 들면, Nielsen, P., et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994) 참조). PNA 프로브는 유방암과 연관된 하나 이상의 마커 대립인자 또는 일배체형을 포함하는 것으로 사료되는 시료 내의 분자에 특이적으로 혼성화하도록 설계될 수 있다. 따라서, PNA 프로브의 혼성화는 유방암 또는 유방암에 대한 감수성을 진단할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 개체로부터 수득된 게놈 DNA를 포함하는 테스트 시료가 수집되고 본 발명의 하나 이상의 마커 또는 일배체형을 포함하는 단편을 증폭시키기 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 이용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유방암과 연관된 특정한 마커 대립인자 또는 일배체형의 확인은 다양한 방법(예를 들면, 서열 분석, 제한효소 처리에 의한 분석, 특이적 혼성화, SSCP(single stranded conformation polymorphism), 전기영동 분석 등)을 이용하여 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 진단은 정량적 PCR(kinetic thermal cycling)을 이용한 발현 분석에 의해 수행된다. 이 기법은 예를 들면, TaqMan^®(Applied Biosystems, Foster City, CA)과 같은 상업적으로 이용가능한 기술을 이용할 수 있다. 상기 기법은 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 스플라이싱 변이(splicing variant)의 발현 또는 조성의 변화의 존재를 평가할 수 있다. 또한, 변이의 발현은 물리적으로 또는 기능적으로 상이한 것으로 정량될 수 있다.

본 발명의 또 다른 방법에서, 특정한 대립인자가 기준 서열 대비 제한효소 인식 부위의 생성 또는 제거를 초래하는 경우, 제한효소 처리(restriction digestion)에 의한 분석이 상기 특정한 대립인자를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 게놈 DNA를 포함하는 테스트 시료가 개체로부터 수득된다. RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 분석은 예를 들면, 전술된 Current Protocols in Molecular Biology에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 관련된 DNA 단편의 제한효소 처리의 결과 패턴(digestion pattern)이 시료 중의 특정한 대립인자의 존재 또는 부재를 나타낸다.

유방암과 연관된 다형성 부위의 특정한 대립인자(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및/또는 표 22에 열거된 다형성 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)을 검출하기 위해, 서열 분석이 또한 이용될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 특정한 마커 대립인자 또는 일배체형의 존재 또는 부재의 결정은 서열 분석을 포함한다. 예를 들면, DNA 또는 RNA의 테스트 시료가 테스트 개체로부터 수득될 수 있다. PCR 또는 다른 적합한 방법이 유방암과 연관된 핵산의 일부를 증폭시키기 위해 이용될 수 있고, 그 후, 특정한 대립인자의 존재가 직접 시료 중의 게놈 DNA의 다형성 부위(또는 복수 개의 다형성 부위들)의 서열을 결정하는 것에 의해 검출될 수 있다.

대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드가 또한 대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 프로브에 의한 증폭된 올리고뉴클레오티드의 도트-블롯 혼성화를 통해 유방암-연관 핵산(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 다형성 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들)에서 특정한 대립인자의 존재를 검출하기 위해 이용될 수 있다(예를 들면, Saiki, R. et al., Nature, 324:163-166 (1986) 참조). "대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드(allele-specific oligonucleotide)"(본 명세서에서 "대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브"로도 지칭됨)는 유방암-연관 핵산에 특이적으로 혼성화하고, 다형성 부위(예를 들면, 본 명세서에 기재된 마커 또는 일배체형)에 특이적 대립인자를 포함하는, 약 10-50 bp(base pairs) 또는 약 15-30 bp의 올리고뉴클레오티드이다. 하나 이상의 특정한 유방암-연관 핵산에 대해 특이적인 대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드는 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, supra 참조). 원하는 영역을 증폭시키기 위해 PCR이 이용될 수 있다. 증폭된 영역을 함유한 DNA가 표준 방법(예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, supra 참조)을 이용하여 도트-블롯팅될 수 있고, 상기 블롯이 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉될 수 있다. 그 후, 상기 프로브의 증폭된 영역에 대한 특이적 혼성화의 존재가 검출될 수 있다. 개체로부터의 DNA에 대한 대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 특이적 혼성화는 유방암과 연관된 다형성 분위에 특이적 대립인자를 나타낸다(예를 들면, Gibbs, R. et al., Nucleic Acids Res., 17:2437-2448 (1989) 및 WO 93/22456 참조).

LNA(locked nucleic acid)와 같은 유사체의 첨가로, 프라이머 및 프로브의 크기가 8개의 염기까지 감소될 수 있다. LNA는 푸라노오스 고리의 2' 및 4' 위치가 O-메틸렌(옥시-LNA), S-메틸렌(티오-LNA), 또는 아미노 메틸렌(아미노-LNA) 모이어티를 통해 연결되는 것인 이중고리형(bicyclic) DNA 유사체의 신규한 종류이다. 모든 이 LNA 변이에 공통된 것은 상보적 핵산에 대한 친화도이고, 이는 DNA 유사체에 대해 보고된 가장 높은 친화도이다. 예를 들면, 특정한 모든 옥시-LNA 노나머(nonamer)는 상응하는 DNA 노마머에 대한 DNA 및 RNA 모두에 대한 28℃ 대비, 64℃ 및 74℃의 용융점(T_m)을 갖는 것으로 확인되었다. T_m의 실질적인 증가는 또한 LNA 단량체가 표준 DNA 또는 RNA 단량체와 조합되어 이용되는 경우 수득된다. 프라이머 및 프로브의 경우, LNA 단량체가 포함되는 위치(예를 들면, 3' 말단, 5' 말단, 또는 중간)에 따라, T_m은 상당히 증가될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 개체로부터의 표적 핵산 서열 세그먼트에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브의 어레이(array)가 유방암과 연관된 핵산에서 다형성을 식별하기 위해 이용될 수 있다(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 2의 다형성 마커 및 일배체형, 및 이들과 연관 불균형인 마커들). 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 어레이가 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 일반적으로 상이한 공지된 위치에 있는 기판(substrate)의 표면에 결합된 복수 개의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. "Genechips™"에도 기재된, 이 올리고뉴클레오티드 어레이들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 설명된다(예를 들면, 미국특허 제5,143,854호, PCT 특허출원 공개 WO90/15070 및 92/10092 참조). 이 어레이들은 일반적으로 포토리소그래피 방법과 고상 올리고뉴클레오티드 합성 방법의 조합을 포함하는 기계적 합성 방법, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 생산된다(각각의 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Fodor, S. et al., Science, 251:767-773 (1991); Pirrung et al., 미국특허 제5,143,854호(또한, 공개된 PCT 출원 WO 90/15070 참조); 및 Fodor. S. et al., 공개된 PCT 출원 WO 92/10092 및 미국특허 제5,424,186호 참조). 기계적 합성 방법을 이용한 이 어레이들의 합성을 위한 기법들이 예를 들면, 미국특허 제5,384,261호에 기재되며, 그 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

올리고뉴클레오티드 어레이가 제조되면, 목적 핵산(nucleic acid of interest)이 상기 어레이와 혼성화될 수 있게 된다. 혼성화의 검출은 목적 핵산 중의 특정한 대립인자의 검출이다. 혼성화 및 스캐닝(scanning)은 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 다른 방법, 예를 들면, 각각의 전체 교시가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, PCT 출원공개 WO 92/10092 및 WO 95/11995, 및 미국특허 제5,424,186호에 기재된 방법에 의해 수행된다. 요약하면, 하나 이상의 이전에 확인된 다형성 마커를 포함하는, 표적 핵산 서열이 잘-알려진 증폭 기법(예를 들면, PCR)에 의해 증폭된다. 통상적으로 이는 다형성 부위로부터 상류 및 하류인 표적 서열의 두 가닥에 상보적인 프라이머 서열의 이용을 포함한다. 비대칭 PCR(asymmetric PCR) 기법도 이용될 수 있다. 증폭된 표적, 일반적으로 표지를 포함하는 증폭된 표적은 그 후, 서열-특이적 혼성화를 가능하게 하는 적합한 조건 하에 어레이와 혼성화될 수 있게 된다. 혼성화 및 어레이의 세척 후에, 표적 서열이 혼성화된 어레이 상의 위치를 결정하기 위해 어레이가 스캐닝된다. 스캔으로부터 수득된 혼성화 데이터는 통상적으로 어레이 상의 위치의 함수인 형광 강도의 형태이다.

주로 단일 검출 블럭, 예를 들면, 단일 다형성 부위를 검출하기 위한 단일 검출 블럭의 측면에서 설명되나, 어레이는 복수의 검출 블럭을 포함할 수 있고, 따라서, 복수 개의 특정한 다형성(예를 들면, 특정한 일배체형의 복수개의 다형성)을 포함할 수 있다. 대안적인(alternate) 배열로, 일반적으로 검출 블럭은 단일 어레이 또는 복수의 별개의 어레이 내에서 그룹핑될 수 있어서 표적의 어레이로의 혼성화동안 다양한, 최적 조건들이 이용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, A-T 풍부(rich) 세그먼트에 속하는 스트레치(stretch)에 속하는 다형성들과 별개로, 게놈 서열의 G-C 풍부 스트레치에 속하는 다형성의 검출을 제공하는 것이 종종 바람직할 것이다. 이는 각 상황에 대한 혼성화의 별개의 최적화를 가능하게 한다.

다형성의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드의 용도의 추가적인 설명이 예를 들면, 참조에 의해 전체 교시가 본 명세서에 포함된, 미국특허 제5,858,659호 및 제5,837,832호에서 확인될 수 있다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 이용가능한 핵산 분석의 다른 방법들이 유방암과 연관된 다형성 부위(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22의 다형성 마커 및 일배체형 및 이들과 연관 불균형인 마커들)에서 특정한 대립인자를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 대표적인 방법들은 예를 들면, 직접적인 수동 서열결정(direct manual sequencing) (Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 (1988); Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977); Beavis, et al., U.S. Patent No. 5,288,644); 자동화된 형광 서열결정(automated fluorescent sequencing); 단일가닥 구조 다형성(SSCP) 분석; CDGE(clamped denaturing gel electrophoresis); DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) (Sheffield, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236 (1989)), 운동성 변화 분석(mobility shift analysis)(Orita, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766-2770 (1989)), 제한효소 분석(Flavell, R., et al., Cell, 15:25-41 (1978); Geever, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085 (1981)); 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분석; 화학적 불일치 절단(chemical mismatch cleavage, CMC) (Cotton, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985)); RNase 보호 분석(Myers, R., et al., Science, 230:1242-1246 (1985); E. coli mutS 단백질과 같은, 뉴클레오티드 불일치를 인식하는 폴리펩티드의 이용; 및 대립인자-특이적 PCR을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 유방암 또는 유방암에 대한 감수성의 진단은 본 발명의 유전적 마커(들) 또는 일배체형(들)이 폴리펩티드의 조성 또는 발현의 변화를 초래하는 경우들에서, 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현 및/또는 조성을 조사하는 것에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 유방암에 대한 감수성의 진단은 본 발명의 유전적 마커 또는 일배체형이 폴리펩티드의 조성 또는 발현의 변화를 초래하는 경우, 이들 중 하나의 폴리펩티드, 또는 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 또 다른 폴리펩티드의 발현 및/또는 조성을 조사하는 것에 의해 수행될 수 있다. 유방암에 대해 연관을 보이는 본 발명의 일배체형 및 마커들은 하나 이상의 인접 유전자(nearby gene)에 대한 효과를 통해 역할을 수행한다. 이 유전자들에 영향을 미치는 가능한 메카니즘은 예를 들면, 전사에 대한 효과, RNA 스플라이싱에 대한 효과, mRNA의 대안적인 스플라이스(alternative splice) 형태의 상대적 양의 변화, RNA 안정성에 대한 효과, 핵으로부터 세포질로의 이동에 대한 효과, 및 번역의 효율성 및 정확성에 대한 효과를 포함한다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 유방암에 대한 연관을 보이는 본 발명의 변이(마커 또는 일배체형)가 인접 유전자의 발현에 영향을 미친다. 유전자 발현에 영향을 미치는 조절성 요소(regulatory element)가 유전자의 프로모터 영역으로부터 멀리 떨어져서, 수십 킬로베이스 또는 심지어 수백 킬로베이스 떨어져서 위치할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명의 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 분석하는 것에 의해, 따라서, 그와 같은 인접한 유전자의 발현 수준을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 마커 또는 일배체형의 검출이 하나 이상의 STEAP3/TSAP6, LOC643714, 및 TNRC9 유전자의 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있다.

ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침전(immunoprecipitation) 및 면역형광(immunofluorescence)을 포함한 다양한 방법들이 단백질 발현 수준을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 개체로부터의 테스트 시료가 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 변화 및/또는 그의 조성의 변화의 존재에 대해 평가된다. 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 변화가 예를 들면, 정량적인 폴리펩티드 발현(즉, 생성되는 폴리펩티드의 양)의 변화일 수 있다. 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 조성의 변화는 정성적 폴리펩티드 발현의 변화(예를 들면, 돌연변이 폴리펩티드의 발현 또는 상이한 스플라이싱 변이의 발현)이다. 일 구체예에서, 유방암에 대한 감수성의 진단은 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 특정한 스플라이싱 변이, 또는 스플라이싱 변이의 특정한 패턴을 검출하는 것에 의해 수행된다.

또한, 그와 같은 변화(정량적 및 정성적 변화)가 모두 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 폴리펩티드 발현 또는 조성의 "변화(alteration)"는 대조군 시료에서 상기 폴리펩티드의 발현 또는 조성 대비, 테스트 시료 중의 발현 또는 조성의 변화를 의미한다. 대조군 시료는 테스트 시료에 상응하는 시료(예를 들면, 동일한 종류의 세포로부터 유래된 시료)이고, 유방암에 의해 영향받지 않고 및/또는 유방암에 대한 감수성을 갖지 않는 개체로부터 유래된다. 일 구체예에서, 대조군 시료는 본 명세서에 기재된 유방암과 연관된 마커 대립인자 또는 일배체형을 갖지 않는 개체로부터 유래된다. 유사하게, 대조군 시료 대비, 테스트 시료 중에 하나 이상의 상이한 스플라이싱 변이의 존재, 또는 대조군 시료 대비, 테스트 시료 중의 상이한 스플라이싱 변이의 유의성 있게 상이한 양의 존재는 유방암에 대한 감수성을 나타낼 수 있다. 대조군 시료 대비, 테스트 시료 중의 폴리펩티드의 발현 또는 조성의 변화는 특정한 대립인자가 대조군 시료 중의 기준 대비 스플라이스 위치를 변화시키는 경우, 상기 특정한 대립인자를 나타낼 수 있다. 분광분석법, 비색법(colorimetry), 전기영동, 등전점 전기영동법(isoelectric focusing), 및 면역블롯팅(immunoblotting)(예를 들면, 전술된 바와 같은, Current Protocols in Molecular Biology, 특히, 챕터 10 참조)과 같은 면역분석법(immunoassays)(예를 들면, David et al., 미국특허 제4,376,110호)을 포함한, 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현 또는 조성을 조사하는 다양한 수단이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고, 이용될 수 있다.

예를 들면, 일 구체예에서, 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체(예를 들면, 검출가능한 표지를 갖는 항체)가 이용될 수 있다. 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 완전한 항체, 또는 그의 단편(예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂)이 이용될 수 있다. 프로브 또는 항체에 대해, 용어 "표지된(labeled)"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 결합(즉, 물리적 연결)시키는 것에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화, 및 직접적으로 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 표지화를 포함하도록 의도된다. 간접적 표지화의 예는 표지된 이차 항체(예를 들면, 형광-표지된 이차 항체)를 이용한 일차 항체의 검출 및 형광-표지된 스트렙타비딘에 의해 검출될 수 있는, 비오틴에 의한 DNA 프로브의 말단-표지화(end-labeling)를 포함한다.

이 방법의 일 구체예에서, 테스트 시료 중의 유방암과 연관된 핵산(예를 들면, STEAP3/TSAP6, LOC64371 또는 TNRC9 유전자를 코딩하는 핵산)에 의해 코딩된 폴리펩티드의 수준 또는 양이 대조군 시료 중의 유방암과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 수준 또는 양과 비교된다. 대조군 시료 중의 폴리펩티드의 수준 또는 양보다 더 높거나 또는 더 낮고, 그 차이가 통계적으로 유의성이 있는, 테스트 시료 중의 폴리펩티드의 수준 또는 양은 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 변화를 나타내고 발현의 차이를 유발하는 특정한 대립인자 또는 일배체형의 존재를 나타낸다. 대안적으로, 테스트 시료 중의 폴리펩티드의 조성이 대조군 시료 중의 상기 폴리펩티드의 조성과 비교된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 수준 또는 양과 조성이 모두 테스트 시료 및 대조군 시료에서 평가될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 유방암에 대한 감수성의 진단은 추가적인 단백질-기반 분석법, RNA-기반 분석법 또는 DNA-기반 분석법과 조합하여, 하나 이상의 본 발명의 마커 대립인자 또는 일배체형(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21, 및 표 22의 마커 및 일채체형 및 이들과 연관 불균형인 마커의 연관된 대립인자)을 검출하는 것에 의해 수행된다. 본 발명의 방법은 또한 대상 개체의 가족력 및 위험 인자(예를 들면, 환경적 위험 인자, 생활방식 위험 인자)의 분석과 조합되어 이용될 수 있다.

키트

본 발명의 방법에서 유용한 키트는 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 성분들, 예를 들면, 혼성화 프로브, 제한효소(예를 들면, RFLP 분석용 제한효소), 대립인자-특이적 올리고뉴클레오티드, 본 명세서에 기재된 본 발명의 핵산(예를 들면, 본 발명의 하나 이상의 다형성 마커 및/또는 일배체형을 포함하는 게놈 단편)에 의해 코딩된 변화된 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 본 명세서에 기재된 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 변화되지 않은(원형의) 폴리펩티드에 결합하는 항체, 유방암과 연관된 핵산의 증폭을 위한 수단, 유방암과 연관된 핵산의 핵산 서열을 분석하기 위한 수단, 유방암과 연관된 핵산에 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 분석하기 위한 수단, 등을 포함한다. 본 발명의 키트는 예를 들면, 필요한 완충액, 본 발명의 핵산(예를 들면, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 핵산 세그먼트)을 증폭하기 위한 핵산 프라이머, 및 그와 같은 프라이머 및 필요한 효소(예를 들면, DNA 중합효소)를 이용하여 증폭된 단편의 대립인자-특이적 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 추가적으로, 키트는 본 발명의 방법과 조합되어 이용될 수 있는 분석법을 위한 시약들, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 유방암 진단 분석법에서 이용되는 시약을 제공할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 유방암, 또는 유방암에 대한 감수성을 검출하기 위해, 개체로부터의 시료를 분석하는 키트로서, 상기 키트는 상기 개체의 게놈에서 본 발명의 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자를 선택적으로 검출하기 위해 필요한 시약들을 포함하는 것인 키트에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 상기 시약은 본 발명의 하나 이상의 다형성을 포함하는 개체의 게놈의 단편에 혼성화하는 하나 이상의 연속적인 올리고뉴클레오티드(contiguous oligonucleotide)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 시약은 개체로부터 수득된 게놈 세그먼트의 반대쪽 가닥에 혼성화하는 한 쌍 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 하나 이상의 다형성을 포함하는 개체의 게놈의 단편을 선택적으로 증폭시키도록 설계되며, 상기 다형성은 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 열거된 다형성 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 단편은 크기가 20 bp 이상이다. 그와 같은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산(예를 들면, 올리고뉴클레오티드 프라이머)은 유방암을 나타내는 다형성(예를 들면, SNP 또는 마이크로새틀라이트)을 둘러싼(flanking) 핵산 서열의 부분을 이용하여 설계될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 유방암과 연관된 하나 이상의 특정한 다형성 마커 또는 일배체형을 대입인자-특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 표지된 핵산, 및 상기 표지의 검출을 위한 시약을 포함한다. 적합한 표지는 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 표지, 효소 표지, 효소 보조-인자(co-factor) 표지, 자성 표지(magnetic label), 스핀 표지(spin label), 에피토프 표지(epitope label)를 포함한다.

특정한 구체예에서, 본 발명의 키트의 시약에 의해 검출될 다형성 마커 또는 일배체형은 표 10, 표 15, 표19, 표 20, 표 21 및 표 22에 표시된 마커들로 구성된 군으로부터 선택된, 하나 이상의 마커, 두개 이상의 마커, 세개 이상의 마커, 네개 이상의 마커, 또는 다섯개 이상의 마커를 포함한다. 일 구체예에서, 검출될 마커는 표 10, 표 15 또는 표 19에 열거된 마커들로부터 선택된다. 일 구체예에서, 검출될 마커는 표 10에 열거된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커는 표 15에 열거된 마커들로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커는 표 19에 열거된 마커들로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 검출될 마커는 rs4848543, rs13387042 및/또는 rs3803662이다. 다른 바람직한 구체예는 마커 rs4848543을 검출하기 위한 시약을 포함하는 것, 마커 rs13387042를 검출하기 위한 시약을 포함하는 것 및 마커 rs3803662를 검출하기 위한 시약을 포함하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커 또는 일배체형은 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22에 표시된 마커들에 표시된 마커들로 구성된 마커들의 군으로부터의 하나 이상의 마커와 0.2보다 큰 r² 값에 의해 정의된 강한 연관 불균형인 마커들의 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 검출될 마커 또는 일배체형은 마커 rs4848543, rs13387042 및 rs3803662, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 마커들의 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다.

그와 같은 구체예 중 하나에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 유방암에 대한 감수성(증가된 감수성 또는 감소된 감수성)을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커는 rs4848543 대립인자 A, rs13387042 대립인자 A, 및/또는 rs3803662 대립인자 T이고, 이들의 존재는 유방암(예를 들면, All BC 및/또는 MedPre 유방암)의 증가된 위험도를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 유방암 치료제에 대한 반응을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 유방암 예후를 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형의 존재는 유방암 치료의 진행을 나타낸다. 그와 같은 치료는 수술에 의한 개입, 투약, 방사선요법 또는 기타 수단(예를 들면, 생활방식 변화)을 포함할 수 있다.

본 발명의 다형성과 연관된 유방암의 진단

본 발명의 진단 방법은 전반적으로 유방암에 대한 감수성을 진단하는 것과 관련하여 설명되었으나, 본 발명의 방법은 또한 본 발명의 다형성 마커와 연관된 유방암을 진단하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 유방암을 갖거나 또는 유방암과 연관된 위험 인자를 갖는 개체는 상기 개체에서 본 발명의 다형성 또는 일배체형의 존재가 유방암에 대한 기여 인자(contributing factor)였을 수 있는지 여부를 결정하기 위해 평가될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형과 연관된 유방암의 확인은 치료 계획을 촉진한다. 예를 들면, 개체가 유방암을 발병하는 비율을 최소화하기 위한 예방적 치료가 적용될 수 있다. 그와 같은 예방적 치료는 또한 개체가 본 발명의 위험 변이에 대해 이형접합형인지 또는 동형접합형인지 여부의 평가를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 다형성 및/또는 일배체형과 연관된 적합한 유전자 또는 단백질을 표적화하도록 치료법이 설계되고 치료제가 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 개체에서, 본 발명에서 상세하게 설명된 바와 같은 본 발명의 다형성 마커 또는 일배체형의 존재를 확인하는 것에 의해, 개체에서 본 발명의 다형성과 연관된 유방암을 진단하고 확인하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 다형성 마커 및/또는 일배체형은 유방암에 걸리지 않은 개체에서보다 유방암에 걸린 개체에서 보다 빈번하게 발견된다. 따라서, 이 마커들 및/또는 일배체형은 유방암을 진단하기 위한 예측적 가치를 갖는다. 일 구체예에서, 유방암을 검출하기 위한 예측적 가치를 갖는 마커 또는 일배체형은 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21 및 표 22의 마커들로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 유방암을 진단하기 위한 예측적 가치를 갖는 마커들은 마커 rs4848543, rs13387042 및 rs3803662, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택된다.

또 다른 구체예에서, 유방암을 진단하기 위한 예측적 가치를 갖는 마커 대립인자는 rs4848543 대립인자 A, rs13387042 대립인자 A, 및 rs3803662 대립인자 T, 및 이들과 연관 불균형인 마커들을 포함한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 방법들은 개체로부터의 시료에서 마커 또는 일배체형의 특정한 대립인자의 존재 또는 부재를 평가하기 위해 이용될 수 있고, 상기 마커 또는 일배체형의 특정한 대립인자의 존재 또는 부재는 유방암의 감수성을 나타낸다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 다형성 및/또는 일배체형과 연관된 유방암의 진단은 본 발명의 다형성을 검출하는 것에 의해 수행된다. 특정한 다형성이 본 명세서에 기재된다(예를 들면, 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21, 및 표 22, 및 이들과 연관 불균형인 마커들 참조). 유방암이 본 발명의 하나 이상의 다형성과 연관되는지 여부를 결정하기 위해 유방암을 갖는 개체로부터 게놈 DNA, RNA 또는 cDNA의 시료가 수득된다. 그 후, 상기 시료에 본 발명의 다형성의 특정한 대립인자 또는 본 발명의 특정한 일배체형이 존재하는지 여부를 결정하기 위해 상기 DNA, RNA 또는 cDNA 시료가 검사된다. 상기 핵산 시료가 본 발명의 다형성의 대립인자 또는 일배체형을 포함하는 것으로 확인되는 경우, 상기 대립인자 또는 일배체형의 존재는 상기 다형성 및/또는 일배체형과 연관된 유방암을 나타낸다.

서던 분석(Southern analysis), 노던 분석(Northern analysis), 및/또는 인-시투 혼성화(in situ hybridization), 제한효소 처리(restriction digestion) 또는 서열 분석과 같은 혼성화 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법이 다형성을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 다형성과 연관된 유방암의 진단은 또한 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함한 다양한 방법을 이용하여, 본 발명의 다형성과 연관된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현 및/또는 조성을 검사하는 것에 의해 수행될 수 있다.

치료제

본 발명의 변이(예를 들면, 본 발명의 마커 및/또는 일배체형, 예를 들면, 표 10, 표 15 및 표 19에 열거된 마커들)는 유방암에 대한 신규한 치료제 표적을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 유방암과 연관된 변이(마커 및/또는 일배체형)를 포함하는 유전자 또는 상기 변이와 연관 불균형인 유전자(예를 들면, 하나 이상의 STEAP3/TSAP6 유전자, LOC643714 유전자, 및/또는 TNRC9 유전자), 또는 그들의 산물, 및 이 변이 유전자들 또는 그들의 산물에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 조절되거나 또는 이들과 상호작용하는 유전자 또는 그들의 산물이 유방암을 치료하는 치료제의 개발을 위해 표적화될 수 있다. 치료제는 하나 이상의, 예를 들면, 표적 유전자 또는 그들의 유전자 산물의 기능 및/또는 수준을 조절할 수 있는, 작은 비-단백질(non-protein) 및 비-핵산 분자, 단백질, 펩티드, 단백질 단편, 핵산(DNA, RNA), PNA(peptide nucleic acid), 또는 그들의 유도체 또는 모방체(mimetics)를 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 및/또는 변이, 또는 그들의 상보적 서열을 포함하는 핵산이 세포, 조직 또는 기관에서 유전자 발현을 조절하기 위한 안티센스 구조물(antisense construct)로서 이용될 수 있다. 안티센스 기법과 연관된 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, AntisenseDrug Technology: Principles, Strategies, and Applications, Crooke, ed., Marcel Dekker Inc., New York (2001)에서 설명되고 검토된다. 일반적으로, 안티센스 핵산 분자는 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 영역에 상보적이도록 설계되어, 상기 안티센스 분자가 mRNA에 혼성화되고, 따라서, 상기 mRNA의 단백질로의 번역을 차단한다. 절단제(cleaver) 및 차단제(blocker)를 포함한, 여러 종류의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 전자, 즉, 절단제는 표적 RNA 부위에 결합하고, 상기 표적 RNA를 절단하는, 세포내 뉴클레아제(예를 들면, RnaseH 또는 Rnase L)를 활성화시킨다. 차단제는 표적 RNA에 결합하고, 리보좀의 입체 장애(steric hindrance)에 의해 단백질 번역을 저해한다. 차단제의 예는 핵산, 모르폴리노 화합물, LNA(locked nucleic acid) 및 메틸포스포네이트를 포함한다(Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917 (2002)). 안티센스 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 치료제로서 유용하고, 또한 예를 들면, 유전자 넉-아웃(knock-out) 또는 유전자 넉-다운 실험에 의해, 유전자 기능을 결정하고 검증하기 위해 유용하다. 안티센스 기술은 Lavery et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569 (2003), Stephens et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5:118-122 (2003), Kurreck, Eur. J. Biochem. 270:1628-44 (2003), Dias et al., Mol. Cancer Ter. 1:347-55 (2002), Chen, Methods Mol. Med. 75:621-636 (2003), Wang et al., Curr. Cancer Drug Targets 1:177-96 (2001), 및 Bennett, Antisense Nucleic Acid Drug.Dev. 12:215-24 (2002)에 더 설명된다.

본 명세서에 기재된 변이는 특정한 변이에 특이적인 안티센스 시약의 선택 및 설계를 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변이에 대한 정보를 이용하여, 하나 이상의 본 발명의 변이를 포함하는 표적 mRNA를 특이적으로 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 다른 안티센스 분자들이 설계될 수 있다. 이 방식으로, 본 발명의 하나 이상의 변이(마커 및/또는 일배체형)를 포함하는 mRNA 분자의 발현이 저해되거나 또는 차단될 수 있다. 일 구체예에서, 안티센스 분자는 표적 핵산의 특정한 대립인자 형태(즉, 하나 또는 수개의 변이(대립인자 및/또는 일배체형))에 특이적으로 결합하여, 이 특정한 대립인자 또는 일배체형으로부터 기원된 산물의 번역을 저해하나, 상기 표적 핵산 분자의 특정한 다형성 부위에서 다른 변이 또는 대안적인 변이에는 결합하지 않도록 설계된다.

안티센스 분자는 유전자 발현을 저해하고, 따라서, 단백질 발현을 저해하기 위해 mRNA를 불활성화시키기 위해 이용될 수 있기 때문에, 안티센스 분자는 유방암을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 mRNA가 번역되는 능력을 약화시키는, mRNA의 하나 이상의 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리보자임(ribozyme)에 의한 절단을 포함할 수 있다. 그와 같은 mRNA 영역은 예를 들면, 단백질-코딩 영역, 특히, 촉매 활성, 기질 및/또는 리간드 결합 부위, 또는 단백질의 다른 기능성 도메인에 상응하는 단백질-코딩 영역을 포함한다.

C. elegans (Fire et al.,Nature 391:806-11 (1998))에서의 최초의 발견 이후, 지난 10년간 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상이 활발하게 연구되었고, 최근년에, 인간 질병의 치료에서 RNAi의 잠재적 용도가 활발히 탐구되고 있다(reviewed in Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204 (2007)). 유전자 침묵(gene silencing)으로도 불리는, RNA 간섭(RNAi)은 특정한 유전자를 중지(turn off)시키기 위해 이중-가닥 RNA 분자(dsRNA)를 이용하는 것에 기반한다. 세포에서, 세포질 이중가닥-RNA 분자(dsRNA)는 세포성 복합체(cellular complex)에 의해 작은 간섭 RNA(siRNA)로 가공된다. siRNA는 단백질-RNA 복합체를 표적 mRNA 상의 특정한 부위로 표적화되게 하여, 상기 mRNA의 절단을 초래한다(Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917 (2002)). siRNA 분자들은 통상적으로 길이가 약 20개, 21개, 22개 또는 23개의 뉴클레오티드로 구성된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 분리된 핵산 분자, 및 상기 분자들의 RNA 간섭을 위한 용도, 즉, 작은 간섭 RNA 분자(siRNA)로서의 용도에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 길이가 18개 내지 26개의 뉴클레오티드로 구성되고, 바람직하게는 19개 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되며, 보다 바람직하게는 20개 내지 24개의 뉴클레오티드로 구성되고, 보다 바람직하게는, 21개, 22개 또는 23개의 뉴클레오티드로 구성된다.

RNAi-매개 유전자 침묵을 위한 또 다른 경로는 세포에서 전구체 miRNA(precursor microRNA, pri-miRNA)를 생성하기 위해 가공되는, 내재적으로 코딩된 일차 마이크로RNA(endogenously encoded micorRNA)(pri-miRNA) 전사체에서 기인한다. 이 miRNA 분자들은 핵으로부터 세포질로 유출되고, 세포질에서 성숙 miRNA 분자(mature miRNA)를 생성하기 위해 가공을 거치고, 상기 miRNA는 mRNA의 3' 비번역 영역(untranslated region, UTR) 내의 표적 부위를 인식하는 것에 의해 번역 저해(translational inhibition)를 주도하고, 뒤이어 P-바디(P-body)를 가공하는 것에 의해 mRNA 분해를 주도한다(reviewed in Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204 (2007)).

RNAi의 임상적 적용은 바람직하게는 크기가 약 20 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되고, 바람직하게는 2개의 뉴클레오티드로 구성된 3' 오버랩(overlap)을 갖는 것인 합성 siRNA 듀플렉스의 내포(incorporation)를 포함한다. 유전자 발현의 넉다운은 표적 mRNA에 대한 서열-특이적 설계에 의해 확립된다. 그와 같은 분자의 최적 설계 및 합성을 위한 여러 상업적 사이트들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다.

다른 적용들은 보다 긴 siRNA 분자(통상적으로 25 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된 길이, 바람직하게는 약 27개의 뉴클레오티드로 구성된 길이), 및 작은 헤어핀 RNA(small hairpin, sh RAN; 통상적으로 약 29개의 뉴클레오티드로 구성된 길이)를 제공한다. 후자는 Amarzguioui et al. (FEBS Lett. 579:5974-81 (2005))에 기재된 바와 같이, 자연적으로 발현된다. 화학적으로 합성된 siRNA 및 shRNA는 인 비보 가공을 위한 기질이며, 일부 경우에, 보다 짧은 설계의 경우보다 더 강력한 유전자 침묵을 제공한다(Kim et al., Nature Biotechnol. 23:222-226 (2005); Siolas et al., Nature Biotechnol. 23:227-231 (2005)). 일반적으로, siRNA의 세포내 농도가 후속 세포 분열에 의해 희석되기 때문에, siRNA는 유전자 발현의 일시적 침묵을 제공한다. 대조적으로, 발현된 shRNA는 shRNA의 전사가 일어나는 동안은, 표적 전사체(target transcript)의 장기적이고 안정적인 넉다운을 매개한다(Marques et al., Nature Biotechnol. 23:559-565 (2006); Brummelkamp et al., Science 296: 550-553 (2002)).

siRNA, miRNA 및 shRNA를 포함하는 RNAi 분자들은 서열-의존적 방식으로 작용하기 때문에, 본 발명의 변이(예를 들면, 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커 및 일배체형)는 특정한 대립인자 및/또는 일배체형(예를 들면, 본 명세서에 기재된 마커 및 일배체형)을 포함하는 특이적 핵산 분자를 인식하나, 다른 대립인자 또는 일배체형을 포함하는 핵산 분자는 인식하지 않는 RNAi 시약을 설계하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 이 RNAi 시약은 표적 핵산 분자를 인식하고 파괴시킬 수 있다. 안티센스 시약의 경우와 같이, RNAi 시약은 치료제로서(즉, 질병-연관 유전자 또는 질병-연관 유전자 변이의 중지(turnoff)를 위해) 유용할 수 있으나, 또한 유전자 기능을 규명하고 검증하기 위해 유용할 수 있다(예를 들면, 유전자 넉-아웃 또는 유전자 넉-다운 실험에 의해).

RNAi의 전달은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 비-바이러스 전달(non-viral delivery)을 이용하는 방법은 콜레스테롤, 안정한 핵산-지질 입자(stable nucleic acid-lipid particle, SNALP), 중쇄 항체 단편(Fab), 앱타머(aptamer) 및 나노입자를 포함한다. 바이러스에 의한 전달 방법(viral delivery method)은 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)의 이용을 포함한다. 일부 구체예에서, siRNA 분자는 그들의 안정성을 증가시키기 위해 화학적으로 변형된다. 이는 2'-O-메틸푸린 및 2'-플루오로푸린을 포함한, 리보오스의 2' 위치에서의 변형을 포함하고, 이 변형들은 Rnase 활성에 대한 내성을 제공한다. 다른 화학적 변형이 가능하며 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다.

하기의 참조문헌들이 RNAi, 및 RNAi를 이용한 특정한 유전자의 표적화 가능성의 추가적인 요약을 제공한다: Kim & Rossi, Nat. Rev. Genet. 8:173-184 (2007), Chen & Rajewsky, Nat. Rev. Genet. 8: 93-103 (2007), Reynolds, et al., Nat. Biotechnol. 22:326-330 (2004), Chi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6343-6346 (2003), Vickers et al., J. Biol. Chem. 278:7108-7118 (2003), Agami, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:829-834 (2002), Lavery, et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569 (2003), Shi, Trends Genet. 19:9-12 (2003), Shuey et al., Drug Discov. Today 7:1040-46 (2002), McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3:737-747 (2002), Xia et al., Nat. Biotechnol. 20:1006-10 (2002), Plasterk et al., curr. Opin. Genet. Dev. 10:562-7 (2000), Bosher et al., Nat. Cell Biol. 2:E31-6 (2000), 및 Hunter, Curr. Biol. 9:R440-442 (1999).

유방암의 발병에 대한 증가된 소인(predispotion) 또는 위험도를 초래하는 유전적 결함, 또는 유방암을 유발하는 결함이 유전적 결함을 갖는 개체에게 상기 유전적 결함의 부위에 정상/야생형 뉴클레오티드를 공급하는 복구 서열(repair sequence)을 내포하는 핵산 단편을 투여하는 것에 의해 영구적으로 정정될 수 있다. 그와 같은 부위-특이적 복구 서열은 개체의 게놈 DNA의 내재적 복구를 촉진하기 위해 작용하는 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드를 포함(concompass)할 수 있다. 복구 서열의 투여는 음이온성 리포좀 내에 캡슐화된, 폴리에틸렌이민과의 복합체, 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 또는 투여되는 핵산의 세포내 흡수를 촉진하기에 적합한 다른 약제학적 조성물과 같은, 적합한 비히클에 의해 수행될 수 있다. 그 후, 키메라 올리고뉴클레오티드가 개체의 게놈으로 정상적인 서열의 내포를 유도하여, 정상/야생형 유전자 산물의 발현을 유도하기 때문에, 유전적 결함이 극복될 수 있다. 상기 교체(replacement)가 유전되고, 따라서, 질환 또는 상태와 연관된 증상의 영구적인 치유 및 경감을 가능하게 한다.

본 발명은 유방암을 치료 및/또는 예방하기 위해 이용될 수 있는 화합물 또는 작용제를 확인(식별, identify)하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 변이는 치료제의 확인 및/또는 개발을 위한 표적으로 유용하다. 특정한 구체예에서, 그와 같은 방법은 작용제 또는 화합물이 본 발명의 하나 이상의 변이(마커 및/또는 일배체형)를 포함하는 핵산, STEAP3/TSAP6 유전자, LOC643714 유전자, 및/또는 TNRC9 유전자 중 하나 이상, 또는 상기 핵산의 코딩된 산물의 활성 및/또는 발현을 조절하는 능력을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 또한 코딩된 핵산 산물의 원치않는 활성 또는 발현을 저해 또는 변화시키는 작용제 또는 화합물을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 실험을 수행하기 위한 분석법은 당업자에게 공지된 바와 같이, 세포-기반 시스템 또는 세포-불포함 시스템(cell-free system)에서 수행될 수 있다. 세포-기반 시스템은 본래 목적 핵산 분자를 발현하는 세포, 또는 특정한 원하는 핵산 분자를 발현하도록 유전적으로 변형된 재조합 세포를 포함한다.

환자에서 변이 유전자 발현이 변이-함유 핵산 서열의 발현(예를 들면, 하나 이상의 변이를 함유하는 RNA로 전사되고, 뒤이어 단백질로 번역될 수 있는, 본 발명의 하나 이상의 변이를 포함하는 유전자), 또는 정상적인 전사체의 발현 수준 또는 패턴에 영향을 미치는 변이, 예를 들면, 유전자의 조절 또는 제어 영역의 변이에 따른, 정상/야생형 핵산 서열의 변화된 발현에 의해 평가될 수 있다. 유전자 발현에 대한 분석법은 직접적인 핵산 분석법(mRNA), 발현된 단백질 수준에 대한 분석법, 또는 경로, 예를 들면, 신호 경로(signal pathway)에 관여된 부수적(collateral) 화합물의 분석을 포함한다. 또한, 신호 경로에 대응하여 상향-조절 또는 하향-조절되는 유전자의 발현이 분석될 수 있다. 일 구체예는 루시페라아제와 같은 리포터 유전자를 목적 유전자의 조절 영역에 작동가능하게 연결하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 세포가 후보 화합물 또는 작용제와 접촉되고, mRAN의 발현이 결정되는 경우, 유전자 발현의 조절제(modulator)가 확인될 수 있다. 후보 화합물 또는 작용제의 존재 하의 mRNA의 발현 수준이 상기 화합물 또는 작용제의 부재 하의 발현 수준에 비교될 수 있다. 이 비교에 근거하여, 유방암을 치료 및/또는 예방하기 위한 후보 화합물 또는 작용제가 변이 유전자의 유전자 발현을 조절하는 화합물 또는 작용제로 확인될 수 있다. mRNA의 발현 또는 코딩된 단백질이 후보 화합물 또는 작용제의 부재시보다 존재 시에 통계적으로 유의성 있게 더 높은 경우, 상기 후보 화합물 또는 작용제는 상기 핵산의 발현의 촉진제 또는 상향-조절제(up-regulator)로 확인된다. 핵산 발현 또는 단백질 수준이 후보 화합물 또는 작용제의 부재시 보다 존재 시에 통계적으로 유의성 있게 더 낮은 경우, 상기 후보 화합물은 상기 핵산의 발현의 저해제 또는 하향-조절제(down-regulator)로 확인된다.

본 발명은 또한 약물(화합물 및/또는 작용제) 스크리닝을 통해 확인된 화합물을 유전자 조절제(즉, 유전자 발현의 촉진제 및/또는 저해제)로 이용한 치료 방법을 제공한다.

치료제에 대한 반응의 확률을 평가하는 방법, 치료의 진행을 모니터링하는 방법 및 유방암의 치료 방법

본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 개체들은 특정한 치료(예를 들면, 본 명세서에서 더 설명되는, 치료제 또는 치료 방법)에 대해 차등적 반응을 가질 수 있다. 차등적 반응의 근거는 부분적으로 유전학적으로 결정될 수 있다. 약물유전학(Pharmacogenomics)은 유전적 변이(예를 들면, 본 발명의 변이(마커 및/또는 일배체형))가 변화된 약물 소인(drug disposition) 및/또는 약물의 비정상적인 또는 변화된 작용 때문에, 약물 반응에 어떻게 영향을 미치는지의 문제를 다룬다. 따라서, 차등적 반응의 근거(basis)가 부분적으로 유전학적으로 결정될 수 있다. 약물 반응에 영향을 미치는 유전적 변이에 따른 임상적 결과는 일부 개체(본 발명의 유전적 변이의 보인자 또는 비-보인자)에서 약물의 독성, 또는 약물의 치료적 실패(therapeutic failure)를 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이는 치료제 및/또는 방법이 신체에 대해 작용하는 방식, 또는 신체가 치료제를 대사하는 방식을 결정할 수 있다.

따라서, 일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 다형성 부위에서 특정한 대립인자 또는 일배체형의 존재는 특정한 치료 방식(treatment modality)에 대한 상이한 반응,을 나타낸다. 이는 유방암으로 진단되고, 본 발명의 다형성 부위에 특정한 대립인자 또는 일배체형(예를 들면, 본 발명의 위험 대립인자 및/또는 일배체형)을 갖는 환자가 유방암을 치료하기 위해 이용된 특정한 치료제, 약물 및/또는 다른 치료법에 대해 보다 유리하게 또는 보다 불리하게 반응할 것이라는 것을 의미한다. 따라서, 상기 마커 대립인자 또는 일배체형의 존재 또는 부재는 환자에 대해 어떤 치료가 이용되어야 하는지를 결정하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들면, 새로 진단된 환자의 경우, 본 발명의 마커 또는 일배체형의 존재가 (예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 게놈 DNA를 포함하는 혈액 시료 또는 기타 시료로부터 유래된 DNA의 테스트를 통해) 평가될 수 있다. 환자가 마커 대립인자 또는 일배체형에 대해 양성인 경우(즉, 마커의 하나 이상의 특정한 대립인자 또는 일배체형이 존재하는 경우), 의사는 하나의 특정한 치료(예를 들면, 하나의 특정한 치료제 또는 치료제의 조합)를 권고하고, 환자가 마커의 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형에 대해 음성인 경우, 다른 코스의 치료(즉각적인 치료가 아닌, 질병의 진행에 대한 지속적인 모니터링이 수행될 것을 권고하는 것을 포함할 수 있음)가 권고될 수 있다. 따라서, 환자의 보인자 상태가 특정한 치료 방식이 적용되어야 하는지 여부를 결정하는 것을 보조하기 위해 이용될 수 있다. 그 가치는 질병을 조기에 진단하고, 임상의에게 가장 적합한 치료를 적용할 수 있도록 질병의 예후/공격성에 대한 정보를 제공할 수 있다는 가능성에 있다.

본 명세서에서 더 설명되는 바와 같이, 현재 유방암의 임상적인 예방 옵션은 주로 화학적 예방(화학요법 또는 호르몬 요법) 및 예방적 수술이다. 가장 일반적인 화학적 예방제는 타목시펜 및 랄록시펜이다; 다른 옵션은 아로마타아제 저해제를 포함한다. 치료 옵션은 또한 방사선 요법을 포함하고, 방사선 요법의 경우, 일부 환자들이 심각한 증상을 경험한다. 본 명세서에 기재된, 본 발명의 마커들은 이 치료 옵션에 대한 반응을 평가하기 위해 또는 이 치료 옵션들 중 하나를 이용한 치료법의 진행을 예측하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 개체의 유전적 상태(genetic status)에 기반하여 적합한 치료 전략을 선택하기 위해 유전적 프로파일링이 이용될 수 있거나, 또는 특정한 치료 옵션의 결과를 예측하기 위해 유전적 프로파일링이 이용될 수 있어서, 치료 옵션 또는 이용가능한 치료 옵션의 조합의 전략적 선택에서 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 유방암에 대한 치료의 진행 또는 효과를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 이는 본 발명의 마커 및 일배체형의 유전형 및/또는 일배체형 상태에 근거하여 수행되며, 즉, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 부재 또는 존재를 평가하거나, 또는 본 발명의 변이(마커 및 일배체형)와 연관된 유전자의 발현을 모니터링하는 것에 의해 수행될 수 있다. 조직 시료(예를 들면, 말초 혈액 시료, 또는 생검 시료)에서 위험 유전자 mRNA 또는 코딩된 폴리펩티드가 측정될 수 있다. 따라서, 치료 효과를 모니터링하기 위해 발현 수준 및/또는 mRNA 수준이 치료 전 및 치료 동안 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 동시에, 치료 효과를 모니터링하기 위해 본 명세서에 개시된 유방암에 대한 하나 이상의 위험 변이의 유전형 및/또는 일배체형 상태가 치료 전 및 치료 동안 측정될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 마커 및 일배체형과 관련된 생물학적 네트워크 또는 대사 경로는 mRNA 및/또는 폴리펩티드 수준을 결정하는 것에 의해 모니터링될 수 있다. 이는 예를 들면, 치료 전과 치료 동안 채취된 시료에서, 상기 네트워크 및/또는 경로에 속하는 여러 유전자들의 발현 수준 또는 폴리펩티드를 모니터링하는 것에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 생물학적 네트워크 또는 대사 경로에 속하는 대사산물은 치료 전 및 치료 동안 결정될 수 있다. 치료의 효과는 건강한 개체로부터의 상응하는 데이터 대비, 치료 동안 발현 수준/대사산물 수준의 관찰된 변화를 비교하는 것에 의해 결정된다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 마커는 임상 시험의 검정력(power) 및 효과를 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 위험 변이의 보인자인 개체, 즉, 유방암을 발병할 증가된 위험도를 부여하는 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 보인자인 개체가 특정한 치료 방식(treatment modality)에 반응할 가능성이 더 높을 수 있다. 일 구체에에서, 특정한 치료(예를 들면, 소형 분자 약물)가 표적화하는 경로 및/또는 대사 네트워크 내의 유전자에 대한 위험 변이를 갖는 개체는 상기 치료에 대해 반응을 보일 가능성이 더 높다. 또 다른 구체예에서, 그 발현 및/또는 기능이 위험 변이에 의해 변화되는 것인 유전자에 대한 위험 변이를 갖는 개체는 상기 유전자, 그의 발현 또는 그의 유전자 산물을 표적화하는 치료 방식에 반응할 가능성이 더 높다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 마커 및 일배체형은 특정한 개인을 위한 약제학적 작용제의 선택을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 치료 방식의 맞춤화된 선택(personalized seleciton), 생활방식 변화(예를 들면, 식단의 변화, 운동, 체중 감량 프로그램, 금연, 스트레스를 저하시킨 생활방식 등) 또는 상기 두가지의 조합이 본 발명의 위험 변이의 이용에 의해 실현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정한 마커에 대한 개체의 상태의 지식은 본 발명의 위험 변이에 의해 영향받은 유전자 또는 유전자 산물을 표적화하는 치료 옵션의 선택을 위해 유용할 수 있다. 변이의 특정한 조합이 하나의 치료 옵션의 선택을 위해 적합할 수 있고, 다른 유전자 변이 조합은 다른 치료 옵션을 표적화할 수 있다. 그와 같은 변이의 조합은 임상적으로 신뢰성있는 정확도로 치료 모듈의 선택을 결정하기 위해 필요한 경우, 하나의 변이, 두개의 변이, 세개의 변이, 또는 네개 또는 그 이상의 변이를 포함할 수 있다.

컴퓨터-구현 양태(Computer-implemented aspects)

본 발명은 또한 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 기재된 다형성 마커 및 일배체형의 컴퓨터-구현 응용(computer-implemented applicatoin)에 관한 것이다. 그와 같은 응용은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 유용한 유전형 데이터를 저장, 처리(manipulate)하거나 또는 분석하기 위해 유용할 수 있다. 하나의 예는 개인으로부터 유래된 유전형 정보를 판독가능한 매체(readable media) 상에 저장하여, 제3자(예를 들면, 개인)에게 유전형 정보를 제공할 수 있거나, 또는 유전형 데이터로부터 정보를 수득하기 위해, 예를 들면, 상기 유전형 데이터를 유방암에 대한 증가된 감수성에 기여하는 유전적 위험 인자에 대한 정보에 비교하고, 그와 같은 비교에 근거한 결과를 보고하는 것에 관한 것이다.

하나의 그와 같은 양태는 컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable media)에 관한 것이다. 일반적으로, 그와 같은 매체는 (i) 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형에 대한 식별자(identifier) 정보; (ii) 유방암을 갖는 개체에서, 상기 하나 이상의 마커의 하나 이상의 대립인자의 빈도, 또는 일배체형의 빈도의 지표(indicator); 및 기준 집단(reference population)에서 상기 하나 이상의 마커의 하나 이상의 대립인자의 빈도, 또는 일배체형의 빈도의 지표를 저장하는 능력을 갖는다. 기준 집단은 질병-불포함(disease-free) 개인의 집단일 수 있다. 대안적으로, 기준 집단은 일반적인 집단으로부터의 랜덤 표본이고, 따라서, 전반적으로 상기 집단을 대표한다. 빈도 지표는 계산된 빈도, 대립인자 및/또는 일배체형 카피의 계수(count), 또는 특정한 매체를 위해 적합한 실제 빈도의 정규화된(normalized) 또는 달리 처리된(manipulated) 값일 수 있다.

선조 정보(ancestry informaton), 성별, 신체적 특성 또는 특징(신장 및 체중 포함)에 대한 정보, 생화학적 측정값, 치료 적용, 치료 결과, 투약, 또는 특정한 개인의 유전형 상태에 관하여 저장 또는 처리되는 것이 바람직한 다른 유용한 정보와 같은, 개인에 대한 추가적인 정보가 상기 매체에 저장될 수 있다.

본 발명은 또한 개인에서 유방암에 대한 감수성을 결정하기 위해 유용한 유전적 데이터의 결정 또는 처리를 위해 적합한 장치에 관한 것이다. 그와 같은 장치는 컴퓨터-판독가능한 메모리, 컴퓨터-판독가능한 메모리 상에 저장된 데이터를 처리하기 위한 루틴(routine), 및 유전적 데이터의 척도를 포함한 결과물(output)을 생성하기 위한 루틴을 포함할 수 있다. 그와 같은 척도는 대립인자 빈도 또는 일배체형 빈도, 유전형 계수(genotype count), 성별, 연령, 표현형 정보, 오즈비(OR) 값 또는 상대적 위험도(RR), 집단 귀속 위험도(PAR), 또는 본래의 유전형 데이터의 직접적인 통계값이거나 또는 유전적 데이터에 근거한 계산에 기반한 다른 유용한 정보를 포함할 수 있다.

특정한 구체예에서, 본 명세서에서 유방암의 증가된 감수성(예를 들면, 증가된 위험도)과 연관된 것으로 확인된 마커들 및 일배체형들은 유전형 데이터의 해석 및/또는 분석을 위해 유용하다. 따라서, 특정한 구체예에서, 본 명세서에서 입증된 바와 같은, 유방암에 대한 위험 대립인자, 또는 위험 일배체형, 또는 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 입증된 마커들 및/또는 일배체형 중 하나와 LD인 다형성 마커의 대립인자 또는 일배체형의 확인은 해당 유전형 데이터가 기원한 개체가 유방암의 증가된 위험을 갖는다는 것을 나타낸다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 유전형 데이터는 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 확인된 하나 이상의 다형성 마커, 또는 이들과 연관 불균형인 마커에 대해 생성된다. 유전형 데이터는 뒤이어 질병(예를 들면, 유방암)에 대한 위험 척도의 형태(예를 들면, 절대 위험도(AR), 위험도 비(risk ratio, RR), 또는 오즈비(odds ratio, OR))인 유전형 데이터의 해석과 함께, 해당 데이터가 기원한 개체에게 예를 들면, 인터넷을 통해 접근가능한 사용자 인터페이스를 통해 이용가능하다. 또 다른 구체예에서, 개체로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 확인된 위험 마커가 평가되고 상기 데이터세트에서 그와 같은 위험 변이의 존재에 의해 부여된 위험도의 평가로부터의 결과가, 예를 들면, 안전한 웹 인터페이스를 통해, 또는 다른 통신 수단에 의해 상기 개체에게 이용가능하다. 그와 같은 위험도 평가의 결과가 수치 형태(예를 들면, 절대 위험도, 상대적 위험도 및/또는 오즈비와 같은 위험도 값, 또는 기준 대비 위험도의 백분율 증가), 그래프 수단에 의해, 또는 해당 유전형 데이터가 유래된 개체에 대한 위험도를 보여주기에 적합한 다른 수단에 의해 보고될 수 있다. 특정한 구체예에서, 위험도 평가의 결과가 제3자, 예를 들면, 의사, 기타 의료인 또는 유전 상담가에게 이용가능하다.

본 발명의 다양한 양태에서 유용한 마커

전술된 방법 및 응용은 모두 본 명세서에서 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위해 유용한 것으로 일반적인 용어로 보다 상세하게 설명된 본 발명의 마커 및 일배체형에 의해 실시될 수 있다. 따라서, 이 응용은 일반적으로 표 10, 15, 19, 20, 21 및 22 중 하나에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들을 이용하여 실시될 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형은 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 표시된 서열의 게놈 세그먼트 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 마커는 rs4848543 LD 블럭, rs13387042 LD 블럭 또는 rs3803662 LD 블럭 내에 존재한다. 특정한 구체예에서, 상기 마커들은 표 10에 표시된 마커들로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 마커들은 표 15에 표시된 마커들로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 마커들은 표 19에 표시된 마커들로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 마커들은 표 7 및 8에 표시된 마커들로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 마커들은 표 14에 표시된 마커들로부터 선택된다. 일부 다른 구체예에서, 상기 마커들은 표 18에 표시된 마커들로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 마커들은 선택적으로 이들과 연관 불균형인 마커들을 포함한, rs4848543 (서열번호 1), rs13387042 (서열번호 2), 또는 rs3803662 (서열번호 3) 중 하나이다. 일 구체예에서, 상기 마커들은 rs4848543 (서열번호 1), rs13387042 (서열번호 2), 및 rs3803662 (서열번호 3) 중 하나이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 마커는 rs4848543 (서열번호 1)이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 마커는 rs13387042 (서열번호 2)이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 마커는 rs3803662 (서열번호 3)이다. 특정한 구체예에서, 연관 불균형은 0.2보다 큰 r²의 수치값에 의해 정의된다. 또 다른 구체예에서, 상기 마커 또는 일배체형은 rs4848543 대립인자 A, rs13387042 대립인자 A, 및 rs3803662 대립인자 T로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함한다.

핵산 및 폴리펩티드

본 명세서에 기재된 핵산 및 폴리펩티드는 본 발명의 방법 및 키트에서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, "분리된(isolated)" 핵산 분자는 (게놈 서열에서와 같이) 정상적으로 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 둘러싸는(flank) 핵산으로부터 분리되고 및/또는 (예를 들면, RNA 라이브러리에서와 같이) 다른 전사된 서열들로부터 완전하게 또는 부분적으로 정제된 핵산이다. 예를 들면, 본 발명의 분리된 핵산은 핵산이 원래 존재하는 복잡한 세포 매질(cellular milieu), 또는 재조합 기법에 의해 생성되는 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질들에 대해 실질적으로 분리될 수 있다. 일부 경우에, 분리된 물질은 조성(예를 들면, 다른 물질을 포함하는 조 추출물), 완충 시스템 또는 시약 혼합물(reagent mix)의 부분을 형성할 것이다. 다른 상황들에서, 상기 물질은 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 또는 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, HPLC)에 의해 결정되는 바와 같이, 필수적인 균질성(essential homogeneity)까지 정제될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상(몰 기준)을 구성할 수 있다. 게놈 DNA에 대해, 용어 "분리된(isolated)"은 또한 본래 게놈 DNA가 결합되어 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 예를 들면, 분리된 핵산 분자는 핵산 분자가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 상기 핵산 분자를 플랭킹(flank)하는 뉴클레오티드의 약 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만을 포함할 수 있다.

핵산 분자는 다른 코딩 서열 또는 조절 서열에 융합될 수 있고, 여전히 분리된 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 벡터 내에 포함된 재조합 DNA는 본 명세서에서 사용된 "분리된"의 정의에 포함된다. 또한, 분리된 핵산 분자는 이종(heterologous) 숙주 세포 또는 이종 개체 내의 재조합 DNA 분자, 및 용액 중의 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함한다. "분리된" 핵산 분자는 또한 본 발명의 DNA 분자의 인 비보 및 인 비트로 RNA 전사체를 포함한다. 분리된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 수단에 의해 생산된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그와 같은 분리된 뉴클레오티드 서열이 예를 들면, 코딩된 폴리펩티드의 제조에서, 상동성 서열(예를 들면, 다른 포유동물 종으로부터)의 분리를 위해, 유전자 맵핑을 위해(예를 들면, 염색체와의 인 시투 혼성화에 의해), 또는 예를 들면, 노던 블롯 분석 또는 기타 혼성화 기법과 같은 조직 (예를 들면, 인간 조직) 중의 유전자의 발현을 검출하기 위해, 프로브로서 유용하다.

본 발명은 또한 높은 엄격성(stringency)의 혼성화 조건, 예를 들면, 선택적 혼성화를 위한 조건 하에, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 핵산 분자(예를 들면, 본 명세서에 기재된 일배체형과 연관된 다형성 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 핵산 분자)에 관한 것이다. 그와 같은 핵산 분자는 대립인자-특이적 혼성화 또는 서열-특이적 혼성화(예를 들면, 높은 엄격성(stringency) 조건 하에)에 의해 검출 및/또는 분리될 수 있다. 핵산 혼성화를 위한 엄격성 조건 및 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, 전체 교시에 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al, John Wiley & Sons, (1998), 및 Kraus, M. and Aaronson, S., Methods Enzymol., 200:546-556 (1991) 참조).

두 개의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성(percent identity)은 최적의 비교 목적을 위해 서열들을 정렬시키는 것에 의해(예를 들면, 제1 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있음) 결정될 수 있다. 상응하는 위치의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 비교되고, 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 상기 서열들 간에 공유된 동일한 위치의 갯수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 갯수(#)/위치의 총 갯수(#) x 100). 특정한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이다. 두 서열의 실제적인 비교는 잘 알려진 방법, 예를 들면, 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 그와 같은 수학적 알고리즘의 비-한정적인 예가 Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)에 기재된다. 그와 같은 알고리즘이 Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)에 기재된 바와 같이, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 구현된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별적인 프로그램(예를 들면, NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. ncbi.nlm.nih.gov에서 월드 와이드 웹의 웹사이트를 참조한다. 일 구체예에서, 서열 비교를 위한 파라미터는 score=100, wordlength=12로 설정되거나, 또는 변할 수 있다(예를 들면, W=5 또는 W=20).

다른 예는 Myers and Miller, CABIOS (1989), Torellis, A. and Robotti, C., Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994)에 기재된 ADVANCE and ADAM; 및 Pearson, W. and Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988)에 기재된 FASTA 알고리즘을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열간의 퍼센트 동일성(percent identity)은 GCG 소프트웨어 패키지 (Accelrys, Cambridge, UK) 중의 GAP 프로그램을 이용하여 수득될 수 있다.

본 발명은 또한 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21, 및 표 22에 열거된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 및 STEAP3/TSAP6, LOC643714 및 TNRC9 유전자의 뉴클레오티드 서열, 또는 표 10, 표 15, 표 19, 표 20, 표 21, 및 표 22에 열거된 다형성 마커들을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 상보체를 포함하거나, 또는 이들로 구성된 뉴클레오티드 서열, 및 이들과 연관 불균형인 마커들, 및 STEAP3/TSAP6, LOC643714 및 TNRC9 유전자, 또는 이들의 단편의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성된 핵산에 높은 엄격성 조건 하에 혼성화하는 단편 또는 일부를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 기재된 마커 및 일배체형에 포함된 하나 이상의 다형성 대립인자를 포함하는 것인 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 단편은 약 15개 이상, 약 18개 이상, 20개, 23개 또는 25개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이고, 30개, 40개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 10,000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이일 수 있다.

본 발명의 핵산 단편은 본 명세서에 기재된 바와 같은 분석법에서 프로브 또는 프라이머로서 이용된다. "프로브(probe)" 또는 "프라이머(primer)"는 핵산 분자의 상보적 가닥에 염기-특이적 방식으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다. DNA 및 RNA 외에, 그와 같은 프로브 및 프라이머는 Nielsen, P. et al., Science 254:1497-1500 (1991)에 기재된 바와 같은 PNA(polypeptide nucleic acid)를 포함한다. 프로브 또는 프라이머는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커 또는 하나 이상의 일배체형의 하나 이상의 대립인자, 또는 그의 상보체(complement)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 100개 또는 그 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 예를 들면, 특정한 구체예에서, 6개 내지 50개의 뉴클레오티드, 또는 예를 들면, 12개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 연속적인 뉴클레오티드 서열 또는 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보체에 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 동일하다. 또 다른 구체예에서, 프로브 또는 프라이머는 연속적인 뉴클레오티드 서열 또는 상기 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보체에 선택적으로 혼성화될 수 있다. 종종, 프로브 또는 프라이머는 표지, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 표지, 효소 표지, 효소 보조-인자 표지, 자성 표지(magnetic label), 스핀 표지, 에피토프 표지를 더 포함한다.

전술된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 분자생물학 기법을 이용하여 확인되고 분리될 수 있다. 증폭된 DNA는 표지되고(예를 들면, 방사성 표지되고), 인간 세포로부터 유래된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로서 이용될 수 있다. 상기 cDNA는 mRNA로부터 유래되고 적합한 벡터에 담길 수 있다. 상응하는 클론들이 분리되고, 인 비보 절제(in vivo excision)에 따라 DNA가 수득되고, 적합한 분자량의 폴리펩티드를 코딩하는 올바른 해독 프레임을 확인하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 인정되는 방법에 의해 클로닝된 삽입물이 한 방향으로 또는 양 방향으로 서열분석될 수 있다. 이 방법들 또는 유사한 방법들을 이용하여, 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 분리되고, 서열결정되고, 그 특성이 더 규명될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 단리된 핵산 서열은 서던 겔(Southern gel) 상에서 분자량 마커, 및 관련된 유전자 위치를 맵핑하기 위해 표지된 염색체 마커로 이용될 수 있다. 상기 핵산 서열은 또한 유방암 또는 유방암에 대한 감수성을 확인하기 위해 환자에서 내재적 DNA 서열과 비교하기 위해 이용될 수 있고 관련된 DNA 서열을 혼성화하고 발견하기 위해 또는 시료로부터 공지된 서열을 제거하기 위해(예를 들면, 공통 유전자 제거 혼성화법(subtractive hybridization)) 프로브로서 이용될 수 있다. 핵산 서열은 유전자 지문법(genetic fingerprinting)을 위한 프라이머를 수득하기 위해, 면역화 기법을 이용하여 항-폴리펩티드 항체를 생성하기 위해, 및/또는 항-DNA 항체를 생성시키기거나 또는 면역 반응을 유발하기 위해 항원으로서 이용될 수 있다.

항체

유전자 산물의 하나의 형태에 특이적으로 결합하나, 상기 유전자 산물의 다른 형태에는 결합하지 않는 다중클론 항체 및/또는 단일클론 항체가 또한 제공된다. 변이, 또는 다형성 부위 또는 부위들을 포함하는 기준 유전자 산물의 일부에 결합하는 항체도 제공된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체(antibody)"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분자는 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하나, 자연적으로 상기 폴리펩티드를 포함하는 시료, 예를 들면, 생물학적 시료 중의 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는 분자이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 펩신과 같은 효소에 의해 항체를 처리하는 것에 의해 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')₂ 단편을 포함한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "단일클론 항체 조성물(monoclonal antibody composition)"은 본 발명의 폴리펩티드의 특정한 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 단 하나의 종만을 포함하는 항체 분자의 집단을 의미한다. 따라서, 단일클론 항체 조성물은 일반적으로 그와 면역반응하는 본 발명의 특정한 폴리펩티드에 대한 단일 결합 친화도를 보인다.

다중클론 항체는 적합한 개체를 원하는 면역원(immunogen), 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편으로 면역화시키는 것에 의해 전술된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 개체에서 항체 역가(antibody titer)는 시간의 경과에 대해, 표준 기법, 예를 들면, 고정화된 폴리펩티드를 이용한, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)에 의해 모니터링될 수 있다. 필요한 경우, 폴리펩티드에 대한 항체 분자가 포유동물(예를 들면, 혈액)로부터 분리되고, IgG 분획을 수득하기 위힌 단백질 A 크로마토그래피와 같은, 잘 알려진 기법에 의해 더 정제될 수 있다. 면역화 후 적절한 시점에, 예를 들면, 항체 역가가 최고인 시점에, 항체-생성 세포들이 개체로부터 수득되고, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)에 의해 최초로 개시된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)), EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,1985, Inc., pp. 77-96) 또는 트리오마(trioma) 기법과 같은 표준 기법에 의해 단일클론 항체를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마를 생성하는 기술이 잘 알려져 있다(일반적으로, Current Protocols in Immunology (1994) Collgan et al., (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY 참조). 요약하면, 불멸 세포주(immortal cell line)(일반적으로, 골수종(myeloma))가 전술된 바와 같이 면역원에 의해 면역화된 포유동물로부터의 림프구(일반적으로, 비장림프구(splenocyte))에 융합되고, 결과물인 하이브리도마 세포의 배양 상층액이 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기 위해 스크리닝된다.

림프구와 불멸화된 세포주를 융합시키기 위해 이용되는 다수의 잘 알려진 프로토콜이 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체를 생성할 목적으로 적용될 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Immunology, supra; Galfre et al., Nature 266:55052 (1977); R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 및 Lerner, Yale J. Biol. Med. 54:387-402 (1981) 참조). 또한, 통상적인 당업자는 역시 유용할, 그와 같은 방법의 다양한 변형이 존재한다는 것을 이해할 것이다.

단일클론 항체-분비 하이브리도마 제조의 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체가 상기 폴리펩티드로 재조합 조합적 면역글로불린 라이브러리(recombinant combinatorial immunoglobulin library)(예를 들면, 항체 파아지 표시(phage display) 라이브러리)를 스크리닝하고, 그에 의해 상기 폴리펩티드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성물을 분리하는 것에 의해 식별되고 분리될 수 있다. 파아지 표시 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트가 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 Stratagene Surf ZAP™ Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 추가적으로, 항체 표시 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 이용할 수 있는 특히 유용한 방법 및 시약의 예를, 예를 들면, 미국특허 제5,223,409호; PCT 공개 WO 92/18619; PCT 공개 WO 91/17271; PCT 공개 WO 92/20791; PCT 공개 WO 92/15679; PCT 공개 WO 93/01288; PCT 공개 WO 92/01047; PCT 공개 WO 92/09690; PCT 공개 WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); 및 Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)에서 찾을 수 있다.

추가적으로, 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조될 수 있는, 인간 부분 및 비-인간(non-human) 부분을 모두 포함하는, 키메라 단일클론 항체 및 인간화(humanized) 단일클론 항체와 같은 재조합 항체가 본 발명의 범위에 속한다. 그와 같은 키메라 항체 및 인간화 단일클론 항체는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 항체(예를 들면, 단일크론 항체)는 친화도 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 분리하기 위해 이용될 수 있다. 폴리펩티드-특이적 항체는 세포로부터 천연 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 재조합기법에 의해 생산된 폴리펩티드의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체는 폴리펩티드의 양(abundance) 및 발현 패턴을 평가하기 위해 (예를 들면, 세포 용해액, 세포 상층액, 또는 조직 시료에서) 폴리펩티드를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 항체는 임상 테스트 절차의 일부로서, 예를 들면, 주어진 치료 계획(treatment regime)의 효능을 결정하기 위해, 조직에서 단백질 수준을 진단 목적으로 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 그의 검출을 촉진하기 위해 항체는 검출가능한 물질에 결합될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보조 그룹(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하고; 적합한 보조 그룹 복합체(prothetic group complex)의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물발광 물질의 예는 루시페라아제, 루시페린, 및 에쿼린(aequorin)을 포함하고, 및 적합한 방사성활성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

항체는 또한 약물유전학 분석에서 유용할 수 있다. 그와 같은 구체에에서, 본 명세서에 따른 핵산에 의해 코딩되는 변이 단백질에 대한 항체, 예를 들면, 하나 이상의 본 발명의 다형성 마커를 포함하는 핵산에 의해 코딩된 변이 단백질에 대한 항체가 변형된 치료 방식을 필요로 하는 개체를 식별하기 위해 이용될 수 있다.

항체는 또한 질병의 활성 단계(active stage)와 같은 질병 상태에서, 또는 단백질의 기능과 관련된 질병, 특히, 유방암에 대한 소인을 갖는 개인에서 변이 단백질의 발현을 평가하기 위해 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다형성 마커 또는 일배체형을 포함하는 핵산에 의해 코딩된 본 발명의 변이 단백질에 특이적인 항체가 상기 변이 단백질의 존재를 스크리닝하기 위해, 예를 들면, 상기 변이 단백질의 존재에 의해 표시된 바와 같이, 유방암에 대한 소인을 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.

항체는 다른 방법들에서 이용될 수 있다. 따라서, 항체는 전기영동 이동성(electrophoretic mobility), 등전점, 트립신 또는 기타 단백질분해효소에 의한 처리와 함께 본 발명의 변이 단백질과 같은 단백질을 평가하기 위한 진단 도구로서, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 다른 물리적 분석법(physical assay)에서 이용하기에 유용하다. 항체는 또한 조직형 검사(tissue typing)에서 이용될 수 있다. 하나의 그와 같은 구체예에서, 특정한 변이 단백질이 특정한 조직형에서의 발현과 상관되며, 상기 변이 단백질에 대한 특이적 항체가 상기 특이적 조직형을 식별하기 위해 이용될 수 있다.

변이 단백질을 포함한, 단백질의 세포내 국재화(subcellular localization) 가 또한 항체를 이용하여 결정될 수 있고, 다양한 조직의 세포에서 단백질의 비정상적인 세포내 국재화를 평가하기 위해 적용될 수 있다. 그와 같은 용도는 유전적 테스트에 적용될 수 있으나, 또한, 특정한 치료 방식을 모니터링하기 위해 적용될 수 있다. 치료가 변이 단백질의 발현 수준 또는 존재, 또는 변이 단백질의 비정상적인 조직 분포 또는 발생에 따른 발현(developmental expression)을 정정하는 것을 목적으로 하는 경우, 상기 변이 단백질 또는 그의 단편에 대해 특이적인 항체가 치료 효능을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.

항체는 또한, 예를 들면, 변이 단백질이 결합 분자 또는 파트너에 결합하는 것을 차단하는 것에 의해 변이 단백질 기능의 저해를 위해 유용하다. 그와 같은 용도는 또한 치료가 변이 단백질의 기능을 저해하는 것을 포함하는 치료적 상황에 적용될 수 있다. 항체는 예를 들면, 결합을 차단하거나 또는 경쟁적으로 저해하여, 그에 의해, 단백질의 활성을 조절(즉, 촉진 또는 길항)하기 위해 이용될 수 있다. 특정한 기능을 위해 요구되는 부위를 포함하는 특정한 단백질 단편에 대한 항체, 또는 세포 또는 세포막과 결합된 완전한 단백질에 대한 항체가 제조될 수 있다. 인 비보 투여를 위해, 항체는 방사성 핵종(radionuclide), 효소, 면역원성 에피토프, 또는 세균성 독소를 포함한 세포독성제(디프테리아 또는 리신(ricin)과 같은 식물 독소)와 같은 추가적인 치료적 유효탑재물(therapeutic payload)과 결합될 수 있다. 항체 또는 그의 단편의 인 비보 반감기는 폴리에틸렌 글리콜로의 접합을 통한 페길화(pegylation)에 의해 증가될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법에서 항체를 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 이는 테스트 시료에서 변이 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 구체예는 표지된 또는 표지가능한 항체 및 생물학적 시료에서 변이 단백질을 검출하기 위한 화합물 또는 작용제, 상기 시료 중의 변이 단백질의 양 또는 존재 및/또는 부재를 결정하기 위한 수단, 및 상기 시료 중의 변이 단백질의 양과 표준을 비교하기 위한 수단, 및 키트의 사용 설명서를 포함한다.

이하, 본 발명은 하기의 비-한정적인 실시예에 의해 예시될 것이다.

본 발명의 전술된 것들 및 기타 목적, 특징 및 장점이 하기에 기재된 본 발 명의 바람직한 구체예의 보다 구체적인 설명으로부터 명확할 것이다.

도 1은 본 명세서에서 유방암과 연관된 것으로 확인된 마커 rs4848543을 포함하는 염색체 2 상에 있는 영역의 게놈 구조를 보여준다. rs4848543과 연관 불균형인 마커들도 이 영역 내에서 발견되며, 이 영역은 본 명세서에서 rs4848543 LD 블럭으로도 지칭된다. 상기 영역은 광범위한 연관 불균형(높은 LD)을 특징으로 하고, 그의 경계는 높은 재조합의 영역을 특징으로 한다. 코카서스계 CEU HapMap 집단에서 rs4848543과, 0.2보다 큰 LD 척도 r²의 값에 의해 정의된 연관 불균형인 마커들이 NCBI Build 34의 염색체 2 상에 있는 위치 120,023,583 - 20,117,062 및 NCBI Build 36의 위치 119,644,908 - 119,738,387 bp에 걸친다. 상기 두 개의 서열 Build에서, 이 마커들에 의해 걸쳐진 영역은 93,479 bp이다.

도 2는 마커 rs13387042를 포함하는 염색체 2 상에 있는 영역의 게놈 구조를 보여준다. rs13387042와 연관 불균형인 마커들도 이 영역 내에서 발견되며, 이 영역은 본 명세서에서 rs13387042 LD 블럭으로도 지칭된다. 상기 영역은 광범위한 연관 불균형(높은 LD)을 특징으로 하고, 그의 경계는 높은 재조합의 영역을 특징으로 한다. 코카서스계 CEU HapMap 집단에서 rs13387042와, 0.2보다 큰 LD 척도 r²의 값에 의해 정의된 연관 불균형인 마커들이 NCBI Build 34의 염색체 2 상에 있는 위치 218,059,508 - 218,141,061 및 NCBI Build 36의 위치 217,565,211-217,646,764 bp에 걸친다. 상기 두 개의 서열 Build에서, 이 마커들에 의해 걸쳐진 영역은 81,553 bp이다.

도 3은 마커 rs3803662를 포함하는 염색체 16 상에 있는 영역의 게놈 구조를 보여준다. rs3803662와 연관 불균형인 마커들도 이 영역 내에서 발견되며, 이 영역은 본 명세서에서 rs3803662 LD 블럭으로도 지칭된다. 상기 영역은 광범위한 연관 불균형(높은 LD)을 특징으로 하고, 그의 경계는 높은 재조합의 영역을 특징으로 한다. 코카서스계 CEU HapMap 집단에서 rs3803662와, 0.2보다 큰 LD 척도 r²의 값에 의해 정의된 연관 불균형인 마커들이 NCBI Build 34의 염색체 16 상에 있는 위치 52,314,403 - 52,413,602 및 NCBI Build 36의 위치 51,093,311-51,192,501 bp에 걸친다. 상기 두 개의 서열 Build에서, 이 마커들에 의해 걸쳐진 영역은 99,190 bp이다.

환자 및 대조군 선택: 본 연구의 허가는 아이슬란드의 국가 생명윤리 위원회(the National Bioethics Committee) 및 아이슬란드 데이터 보호국(the Icelandic Data Protection Commission) 에 의해 허여되었다. 유방암 진단의 기록은 아이슬란드 암 등록부(Icelandic Cancer Registry, ICR)로부터 수득하였다. 기록은 1955년 1월 1일부터 2005년 12월 31일까지 아이슬란드에서 침윤성 유방암 및 유관내암(ductal carcinoma in situ) 또는 소엽내암(lobular carcinoma in situ)으로 진단된 모든 케이스를 포함했다. ICR은 이 기간동안 진단된 4603명의 개인의 기록을 포함했다. 모든 생존하는 환자(약 2840명)를 포함하는 유병 코호트(prevalence cohort)는 본 연구로의 동원에 적격이었다. 본 발명자들은 2210명의 환자로부터 고지된 동의, 혈액 시료, 및 임상 정보를 수득했고, 이는 약 78%의 수율이었다. 초기의 대조군은 다른 진행중인 deCODE Genetics 게놈-전체 연관 연구에 참여하고 유방암 환자군의 유전형이 분석될 때까지 Illumina SNP 칩 상에서 유전형이 분석된 모든 개인들을 포함했다. 아이슬란드 암 등록부에 2005년말까지 유방암, 전립선암, 또는 대장암 진단을 나타내는 입력을 갖는 개인들은 대조군으로부터 제외시켜, 4477명의 대조군 세트를 준비했다. 대조군의 독립적인 재현 세트는 상기 4477명의 세트 후에 유전형이 분석된 비-유방암 프로젝트로부터의 추가적인 7406명의 개인들로 구성되었다. 본 발명자들은 대상이 되는 SNP의 빈도가 전립선암 및 대장암 환자군에서 대조군과 상이하지 않다는 것을 나타내는 중간 데이터를 수득했기 때문에, 이 7406명의 세트에서 전립선암 환자 및 대장암 환자를 제외시키지 않았다. 각각의 대조군 세트에서, 하기의 표 8, 9 및 14에 열거된 SNP의 빈도에서 성별 간의 차이는 없었다. 따라서, 이 대조군 그룹들은 조사대상 SNP의 집단 빈도의 적절하게 대표했다.

가계(genealogical) 데이터베이스: deCODE Genetics는 아이슬란드인들의 가계의 전산화된 데이터베이스를 관리한다. 기록은 지난 200년 동안 아이슬란드에서 태어난 거의 모든 개인을 포함하며, 상기 기간에 대해, 약 95%의 동안 부모 관계(parental connection)가 알려져 있다[Sigurdardottir, et al., (2000), Am J Hum Genet, 66, 1599-609]. 또한, 거주지 식별자(residence identifier)의 카운티가 인구통계조사 및 교구 기록에 근거하여, 대부분의 개인에 대해 기록되어 있다. 정보는 생물학적 시료 및 ICR 기록에 대해 사용된 개인 식별자(personal identifier)와 일치하는 암호화된 개인 식별자로 관계 데이터베이스에 저장되어, 본 연구 참여자의 유전형 및 표현형을 그들의 가계와 교차-참조(cross-reference)할 수 있다.

시료 처리: 혈액 시료는 EDTA 중에 -20℃에서 보관하였다. DNA는 Qiagen (http://www.quiagen.com) 추출 컬럼 방법을 이용하여 전혈로부터 분리하였다. DNA는 4℃에서 보관하였다.

유전형분석(genotyping): 그 후, 1600명의 환자 시료의 세트를 무작위로 선택하고 International HapMap 프로젝트의 Phase I으로부터 유래된 317,511개의 SNP를 포함하는 Illumina Infinium Hap300 SNP 비드 마이크로어레이(Illumina, San Diego, CA, USA) 상에서 유전형 분석하였다. 4480명의 암-불포함 대조군 시료를 동일한 플랫폼 상에서 유전형 분석하였다. 상기 칩 상에 있는 전체 SNP 중에서, 170개는 유전형을 생성하지 않았고 추가적인 24개의 SNP는 80% 미만의 수율을 보였다. 추가적인 61개의 SNP는 대조군에서 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)으로부터 매우 유의성 있는 편향을 보였다(p < 1x10^-10). 104개의 SNP는 단형성(monomorphic)이었고, 58개의 SNP는 거의 단형성이었다(즉, 환자와 대조군의 통합된 코호트에서 소수 대립인자 빈도는 0.001 미만이었다). 마지막으로, 5개의 마커는 여러 개의 진행중인 상이한 사내 게놈전체 연관 연구에서 특정한 영역 및 가능한 신호의 조사 후에 유전형분석 문제를 갖는 것으로 판단되었다. 상기 문제를 갖는 SNP는 모두 분석에서 제외시켰다. 따라서, 본문에 제시된 최종 연구는 317,089개의 SNP를 이용했다. 98% 미만의 콜 레이트(call rate)를 갖는 칩도 분석에서 배제시켰다.

본 연구에서 조사된 3개의 주요한 SNP의 서열(sequence context)이 하기에 기재된다:

본 발명자들은 rs4848543 LD 블럭에서 다수의 SNP를 검출하기 위한 분석법을 설계하고 테스트하였다. 이 분석법들은 [Kutyavin, et al., (2006), Nucleic Acids Res, 34, e128]에 개시된 Centaurus SNP 분석 기술에 근거했다. 분석법 및 프라이머는 하기와 같다:

SG02S733

rs895398

(Build 34) chr2:120,058,180

정방향 프라이머: TTGGAACCTCCCACTGCCACA

역방향 프라이머: ACAGCCCAGGTTTCAGGTTGGCAT

VIC-프로브: AGCGACACTG

FAM-프로브: GCGACACCG

인핸서: CCTG*AGATCCAGGCA

SG02S738

rs4848543

(Build 34) chr2:120,061,096

정방향 프라이머: AGGGAGCCCTCGCTTTAAGCATTA

역방향 프라이머: TTTGGGCACATCTAGGAAGACCTC

VIC- 프로브: GAT*CAATACCC

FAM- 프로브: CGAT*CAATACCA

인핸서: TTAATAATTACAGGACATG

SG02S739

rs6759589

(Build 34) chr2:120,064,976

정방향 프라이머: TCAGCAGCCTCTTGTCTCACTAAT

역방향 프라이머: CTTCTTGCCCAGGCAGGACAGA

VIC-프로브: TAGACTGAGCC

FAM-프로브: AAT*AGACTAAGCC

인핸서: CCATCCCCAACTAA

SG02S753

rs895397

(Build 34) chr2:120,072,400

정방향 프라이머: CACTACTAGATCATGGGAGATGCCT

역방향 프라이머: GTTTCCTCAGTTGTAATGTAGACC

VIC-프로브: TT*T*A*ACCCTT

FAM-프로브: GTTTTAACCCCT

인핸서: GCTGCTCGGAAG

SG02S740

rs838102

(Build 34) chr2:120,079,878

정방향 프라이머: GGTTTTGCATCCTTGCTCACTCACAT

역방향 프라이머: GTGCCCTCTGCGTACTTGCGAAT

VIC-프로브: TACTGCCACC

FAM-프로브: CTTACTGCCACT

인핸서: TGTCTCCTCACTC

SG02S741

rs838100

(Build 34) chr2:120,083,710

정방향 프라이머: ACTTACCAACAGCAGGCTGGTG

역방향 프라이머: CCAGAAAGGGTGGCTCACCTCA

VIC-프로브: GTCTGAGGCT

FAM-프로브: GGTCTGAGGTT

인핸서: TCAGGTCACTCG

SG02S734

rs12711924

(Build 34) chr2:120,107,316

정방향 프라이머: AACGCTTATCACAGAGCCAGGTAG

역방향 프라이머: GGAAAACCATGAACACTGTGGCAA

VIC-프로브: CCCGCCGT

FAM-프로브: GCCCGCCAT

인핸서: TTGTCTTTCTTGTGTC

SG02S742

rs3731603

(Build 34) chr2:120,117,062

정방향 프라이머: AACA*CTCTAGGGAGTAAAGCTC

역방향 프라이머: GAGGA*CATTTGGAGTCCCCAAT

VIC-프로브: GACTGTCTTCAA

FAM-프로브: ACTGT*CT*TCAC

인핸서: AAGTCAGTCCTGAG

SG02S728

rs13387042

(Build 34) chr2:218,108,374

정방향 프라이머: CCACTAGTGTGGTGA*AGGAAGATT

역방향 프라이머: GCTACATGA*AGAA*CAGCTAAACC

VIC-프로브: TTTCTGTAGCCT

FAM-프로브: TT*T*CTGTAGCT*T

인핸서: CATTTGCCTTCTTTC

* 는 [Kutyavin, et al., (2006), Nucleic Acids Res, 34, e128]에 기재된 바와 같이, 변형된 염기를 나타낸다.

BRCA2 유전자의 단일 시조(founder) 돌연변이(999del5)는 일반 아이슬란드 집단에서 0.6%-0.8%의 보인자 빈도(carrier frequency)로 존재하고, 여성 유방암 환자에서 7.7%-8.6%의 보인자 빈도로 존재한다[Thorlacius, et al., (1997), Am J Hum Genet, 60, 1079-84; Gudmundsson, et al., (1996), Am J Hum Genet, 58, 749-56]. BRCA2 999del5 돌연변이의 가능한 존재는 DG13S3727로 지정된, 마이크로새틀라이트-타입 PCR 분석법을 이용하여 1499명의 환자에서 결정하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같았다:

정방향: TGTGAAAAGCTATTTTTCCAATC

역방향: ATCACGGGTGACAGAGCAA

DG13S3727에 의해 증폭된 서열은 하기와 같다:

DG13S3727 위치=chr13:30703058-30703261

tgtgaaaagctatttttccaatcatgatgaaagtctgaagaaaaatgata

gatttatcgcttctgtgacagacagtgaaaacacaaatcaaagagaagct

gcaagtcatggtaagtcctctgtttagttgaactacaggtttttttgttg

ttgttgttttgattttttttttttgaggtggagtcttgctctgtcacccg

tgat

통계적 방법: 승법(multiplicative) 모델을 가정하여, 본 발명자들은 SNP 대립인자의 상대적 위험도(RR)를 RR=[p/(1-p)]/[s/(1-s)]로 계산하였고, 상기에서 p 및 s는 각각 환자 및 대조군에서 변이의 빈도이다. RR과 연관된 P-값은 표준 가능성 비 카이-스퀘어 통계값(standard likelihood ratio Chi-squared statistic)에 근거하여 계산하였다. 신뢰 구간은 RR의 추정값이 로그-노말(log-normal) 분포를 갖는 것으로 가정하여 계산하였다.

일배체형 빈도는 최대 가능성(maximum likelihood)을 이용하여 추정하고 일반화된 가능성 비 테스트(generalized likelihood ratio test)를 이용하여 케이스와 대조군 간의 차이의 테스트를 수행하였다. NEsted Models을 의미하는 NEMO라 불리는 일배체형 분석 프로그램을 이용하여 모든 일배체형 결과를 계산하였다. 상태(phase) 및 결실된 유전형에 따른 불확실성을 다루기 위해, NEMO는 일배체형 계수(haplotype count)가 EM 알고리즘을 이용하여 먼저 추정되고, 그 후, 추정된 계수를 진정한 계수인 것처럼 다루어 테스트가 수행되고, 종종 문제를 유발할 수 있으며 통계적 유의성을 적절하게 평가하기 위해 랜덤화를 필요로 할 수 있는 것인, 연관 테스트에 대한 일반적인 2-단계 접근방법을 이용하지 않는다는 것을 강조한다. 대신에, NEMO에서는, 최대 가능성 추정값, 가능성 비 및 p-값이 관찰된 데이터로부터 직접 계산되고, 따라서, 상태 및 결실된 유전형에서의 불확실성에 따른 정 보 손실이 가능성 비에 의해 자동적으로 포착된다.

일부 아이슬란드 환자들 및 대조군은 그룹 내 및 그룹 간 모두에서 관계된다. 혈연관계(relatedness)에 대해 연관 결과를 보정하기 위해, 본 발명자들은 아이슬란드 가계를 통해 대립인자를 유전(propagate)시키는 것에 의해 유전형을 시뮬레이션하였다. 각 시뮬레이션을 위해, 본 발명자들은 실제의 유전형에 대한 것과 동일한 방식으로 케이스-대조군 연관 테스트(case-control association test), 즉, 카이-스퀘어 가능성 비 테스트를 수행하였다. 본 발명자들은 N회의 시뮬레이션에 대한 카이-스퀘어 통계값의 평균(상응하는 Z-스코어의 분산과 동일함)을 계산하였고, 상기 값은 귀무 가설(null hypothesis) 하에 독립적인 개인에 대해서 1이어야 하고, 혈연관계의 개인(related individual)에 대해서는 약간 더 클 것으로 예상된다. 그 후, 실제 연관에서의 카이-스퀘어 통계값을 시뮬레이션으로부터 수득된 평균에 의해 나누는 것에 의해 혈연관계에 대한 보정을 적용하였다.

그룹들이 대립인자, 일배체형 및 유전형에 대해 상이한 집단 빈도를 가질 수 있으나, 공통된 상대적 위험도를 갖는 것으로 가정하는 것인 Mantel-Haenszel 모델을 이용하여 복수 개의 케이스-대조군 재현 그룹의 결합 분석을 수행하였다.

모든 P-값은 양측(two-sided) P-값으로 보고된다.

다발성 원발성 유방암의 분석: 다발성 원발성 유방암(MPBC)의 진단 기록을 ICR로부터 수득하였다. 제1 유방암 진단 외에 진단된 원발성 종양들은 임상적으로 및 조직학적으로 반대쪽 유방 또는 같은쪽 유방에서 상기 제1 유방암과 동시에 또 는 그에 뒤이어 발생한 독립적인 원발성 종양으로 확인되었다. 임상적으로 및 조직학적으로 최초 종양의 재발 또는 다발성 단일 원발성 종양(multifocal single primary tumor)으로 분류된 종양들은 배제시켰다. 2005년말까지 ICR 데이터에 2개 이상의 독립적인 원발성 종양의 진단을 갖는 환자들은 MPBC로 간주되었다. 2005년 12월 31일까지 ICR에서 제2의 원발성 종양의 진단을 갖지 않는 환자들은 단일 원발성 유방암(Single Primary Breast Cancer, SPBC)으로 분류하였다. SPBC 대비 MPBC의 위험도는 제1 유방암 진단으로부터 후속 시간(follow up time)까지의 년수를 공변량(covariate)으로 고려하여 로지스틱 회귀(logistic regression)에 의해 결정하였다. NEMO 소프트웨어를 이용한 선형 회귀에 의해 발병 연령 비교를 평가하였다.

가족력 분석: 각각의 영향받은 발단자(affected proband)에 대해, Genealogical Database 및 ICR 기록을 이용하여 가족력 점수(family histroy score)를 부여하였다. Genealogical Database를 참조하여 발단자 주위의 1촌 내지 3촌 친척의 원을 결정하였다. 그 후, 친척들의 질병영향(affection) 상태를 ICR 기록으로부터 결정하였다. 발단자에게 영향받은 1촌 친척 1인당 1점, 영향받은 2촌 친척 1인당 0.5점, 및 영향받은 3촌 친척 1인당 0.25점의 가족력 점수를 부여하였다. 그 후, 각 발단자에 대해 총점을 계산하였다. SNP 마커 유전형과 가족력 점수 간의 잠재적인 관계를 JMP v4 소프트웨어(S.A.S. Institute Inc.) 상에서 Wilcoxon 검정 수행에 의해 테스트하였다.

연관 분석 표현형: 본 발명자들은 연관 분석을 위해 두 개의 관련된 표현형을 이용하였다. 제1 표현형은 유방암으로 진단된 총 1600명의 개인을 포함했다. 이 표현형은 "모든 유방암(All Breast Cancer)"(All BC)로 표시하였다. 제2 표현형은 중간 수준 내지 높은 수준의 소인(predisposition) 특성을 갖는 개인들을 선택하고 "중간 소인(Medium Predisposition)"(MedPre)으로 표시하였다. 이 표현형의 정의는 발단자가 하기 기준 중 하나를 충족시킬 것을 요구했다:

1. 시발자는 3M(meiotic event)의 유전적 거리 내에 3명 이상의 영향받은(affected) 친척을 포함하는 유방암 케이스의 클러스터의 구성원이다.

2. 시발자는 3M 내의 혈연관계의 영향받은 쌍 중 일 구성원이고, 상기 쌍 중 1인은 50세 이전에 진단받았다.

3. 시발자는 3M 내의 혈연관계의 영향받은 쌍 중 일 구성원이고, 상기 쌍 중 1인은 임의의 종류의 2차 원발성 종양을 진단받았다.

4. 시발자는 임의의 종류의 원발성 종양을 진단받았다.

Illumina Hap300 칩 상에서 분석된 1600명의 환자들 중에서, 653명이 MedPre 기준을 충족시켰다(40.8%).

결과

섹션 1: 염색체 2q14.2 상의 rs4848543

rs4848543 대립인자 A는 유방암에 대한 증가된 위험도와 연관된다:

게놈 전체 연관 분석은 rs4848543 대립인자 A가 MedPre 유방암과 연관된다는 것을 보여주었다. 이 SNP에 대한 Illumina 칩 데이터는 1598명의 환자(그 중 653명은 MedPre 표현형 기준을 충족시킴) 및 4477명의 암-불포함(cancer-free) 대조군으로부터 수득하였다. MedPre 유방암과 연관된 rs4848543 대립인자 A에 대한 RR 추정값은 케이스 및 대조군에서 개인들간의 혈연관계에 대해 보정된 경우, 1.42였고, P-값은 8.3x10^-8이었다(표 1). 테스트된 317,089개의 SNP에 대한 Bonferroni 보정 후에, 전체 보정된 P-값은 0.026이었다. rs4848543의 A 대립인자는 또한 1.16의 상대적 위험도 추정값으로, AllBC 표현형과 명목적으로 유의성있는(nominally significant) 연관을 보였다(표 1). 아이슬란드 집단으로부터의 독립적인 표본에서 이 결과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 rs4848543 SNP에 대해 테스트하기 위해 Centaurus SNP 분석법, SG02S738을 설계하고 검증하였다. SG02S738 분석법을 추가적인 573명의 BC 환자에 대해 수행했고, 이들 중 198명은 MedPre 표현형 정의를 충족시켰다. 이 환자들은 Illumina 칩 또는 SG02S738 분석법을 이용하여 rs4848543에 대해 분석된 7406명의 개인으로 구성된 독립적인 대조군에 대비하여 테스트하였다. 이 제2 그룹에서 MedPre 유방암과 연관된 rs4848543 대립인자 A에 대한 RR 추정값은 1.26(p-값=3.4x10^-2)이었다. 따라서, 최초의 발견이 독립적인 아이슬란드 표본에서 명목적 유의성(nominal significance)까지 재현되었다. 최초의 1598명의 환자와 573명의 재현 환자 세트가 통합되고 11883명의 대조군과 비교된 것인 결합 분석(joint analysis)의 결과가 표 1에 표시된다. 상기 결합 분석은 AllBC 표현형에 대한 명목적으로 유의성 있는 위험도를 보이고, MedPre 유방암 표현형에 대해 게놈 -전체적으로 유의성 있는 위험도를 보여주었다. MedPre 유방암에 대한 전체 Bonferroni 보정된 P-값은 0.0095(317,089개의 SNP에 대해 보정됨)였다. AllBC 및 MedPre의 두 개의 표현형의 테스트를 고려해도, 이 값은 게놈-전체적으로 유의했다.

ICR 기록은 1955년부터 시작되기 때문에, 본 발명자들이 동원한 환자들 중 일부는 장기적인 암 생존자였다. rs4848543 대립인자 A 변이를 갖는 환자가 비-보인자와 상이한 장기-생존 확률을 갖는다면, 유병 케이스들 중에서 상기 변이의 빈도가 영향을 받을 수 있다. 이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 2000년 1월 1일 이후에 진단받고, 진단으로부터부터 동원까지 5년 미만의 시간을 갖는 833명의 개인들로 구성된 환자의 서브세트를 확인했다. 최근에 진단된 환자들의 이 코호트에서, rs4848543 대립인자 A의 빈도는 0.372945였다. 본 발명자들은 또한 2000년 1월 1일 전에 진단받고 동원시까지 생존한 1338명의 환자들의 그룹을 확인하였다. 이 그룹에서 rs4848543 대립인자 A의 빈도는 0.372749였고, 이는 최근에 진단된 환자들 중의 빈도와 유의성있게 상이하지 않았다(P 값 = 0.99). 따라서, 상이한 생존(survivorship)이 표 1에 표시된 위험도 추정값에 영향을 미쳤다는 강력한 증거는 없다.

본 발명자들은 추가적으로 MedPre 표현형을 갖지 않는 유방암 환자들은 rs4848543 대립인자 A의 증가된 빈도를 보이지 않는다는 것에 주목했다(표 1). 이 관찰의 영향은 하기에서 더 검토된다. 본 발명자들은 rs4848543 대립인자 A와 MedPre 표현형 정의의 다양한 성분들 간의 관계를 조사했다:

rs4848543 대립인자 A는 조기 발병 유방암과 유의성있게 연관되지 않는다:

낮은 진단 연령은 MedPre 표현형의 정의에서 이용되는 기준 중 하나이기 때문에, 본 발명자들은 진단시 연령과 rs4848543 유전형 간의 연관을 조사하였다. Illumina 칩 상에서 분석된 1598명의 환자들 중에서, rs4848543 유전형과 진단 연령 간의 유의성있는 연관은 없었다(표 2).

rs4848543 대립인자 A로부터의 위험도는 유방암의 가족력과 연관된다:

본 연구에서 각 환자 발단자에 대해 가족력 점수를 계산하였다. Genealogical Database를 이용하여, 본 발명자들은 각 발단자의 1촌 내지 3촌 친척의 원을 확인하였다. 그 후, ICR 기록을 참조하여, 본 발명자들은 유방암으로 진단받은 친척을 모두 확인하였다. 그 후, 본 발명자들은 영향받은 1촌 친척 1인당 1점, 영향받은 2촌 친척 1인당 0.5점, 및 영향받은 3촌 친척 1인당 0.25점의 점수를 부여하여, 각 발단자에 대해 합산된 가족력 점수(FHS)를 생성하였다. FHS와 rs4848543 유전형 간의 연관을 조사하기 위해 Illumina 칩 상에서 분석되었던 1598명의 발단자들을 평가하였다. 표 2에 표시된 바와 같이, 증가된 FHS에 대한 경향은 rs4848543의 대립인자 A의 보유(carriage)와 연관되었다. 이 결과는 rs4848543 대립인자 A 변이가 AllBC 환자들 중에서 1.16에 불과한 상대적 위험도를 갖는다는 관찰에만 근거해서는 예상되지 않았다; 이 상대적 위험도 단독으로는 유방암 케이스의 가족성 클러스터링을 생성할 수 없었다[Stacey, et al., (2006), PLoS Med, 3, e217]. 그러나, rs4848543 대립인자 A는 MedPre 표현형을 이용하여 발견되었고, 상기 표현형은 그의 정의에서 가족력의 실질적인 요소를 갖는다. 이 관찰은 rs4848543 대립인자 A가 덜 일반적이고, 보다 높은 침투성의 변이와 연관 불균형일 수 있다는 것을 시사한다. 대안적으로, rs4848543 대립인자 A는 또 다른 고 침투성 소인 결정인자(high penetrance predisposition determinant)와 상호작용을 보여서, 그들의 침투성을 증가시키고, 그에 의해 유방암의 가족력과의 연관을 증가시킬 수 있다.

rs4848543 대립인자 A와 유방암의 가족력 간의 연관은 BRCA2 999del5 돌연변이를 갖는 가족에 의해 (완전히는 아니나) 부분적으로 설명된다:

rs4848543 대립인자 A와 유방암의 가족력 간의 관계를 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 잘 규명된 아이슬란드인의(Icelandic) BRCA2 999del5 돌연변이를 갖는 가족들이 rs4848543 대립인자 A를 갖는 환자들이 보이는 가족성 클러스터링을 유발하는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 1600명의 세트에서 1499명의 환자를 BRCA2 999del5 돌연변이에 대해 분석하였다. 본 발명자들은 전술된 바와 같이, FHS를 재-계산하였고, 이때 BRCA2 999del5 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 모든 발단자들을 제외시켰다. 표 2에 표시된 바와 같이, 999del5 돌연변이 보인자의 제거 후에도, rs4848543 대립인자 A와 FHS 간의 연관은 여전히 유의성이 있어서, 상기 연관이 BRCA999del5 돌연변이 가족에 의해 완전히 설명될 수 없다는 것을 시사했다. 그러나, P-값은 999del5 보인자가 배제되지 않은 경우보다 상당히 더 높아서, 본 발명자들이 BRCA2 999del5가 rs4848543 대립인자 A에 의해 보여지는 가족성 클러스터링의 일부에 관여될 수 있다는 것을 추측하게 하였다.

rs4848543 대립인자 A로부터의 위험도는 BRCA2 999del5 돌연변이의 보인자까지 확장된다:

BRCA2 999del5 돌연변이는 아이슬란드에서 가족성 유방암에 대해 그와 같은 상당한 영향을 가지기 때문에, 본 발명자들은 상기 돌연변이와 rs4848543 대립인자 A 변이의 관계를 고려하였다. 한때 가능한 시나리오는 CHEK2와 BRCA 돌연변이 간의 상호작용에 대해 시사되었던 것과 같이, rs4848543 대립인자 A 변이가 BRCA2 999del5 보인자에게 무시할 수 있는 정도의 추가적인 위험도를 부여한다는 것이었다[(2004), Am J Hum Genet, 74, 1175-82; Meijers-Heijboer, et al., (2002), Nat Genet, 31, 55-9]. 상기 시나리오의 경우라면, 영향받은 BRCA2 999del5 보인자들 중에서 rs4848543 대립인자 A 변이의 빈도는 대조군 빈도와 거의 같을 것이다. 반대로, 영향받은 BRCA2 999del5 보인자 중에서 rs4848543 대립인자 A 변이의 빈도가 집단 대조군에서보다 더 높은 경우, rs4848543 대립인자 A가 999del5 돌연변이에 의해 부여된 위험도 외에 BRCA2 보인자에 위험도를 부여한다는 것을 의미할 것이다. BRCA2 999del5 보인자의 수를 최대화하기 위해, 결합 아이슬란드 Illumina 및 재현 환자 세트에 대해 하기 분석을 수행하였다. 데이터의 조사는 rs4848543 대립인자 A 변이의 빈도는 유방암을 갖는 BRCA2 999del5 보인자에서 0.463이었고, 이는 대조군 빈도보다 훨씬 높고, 1.65의 RR에 해당한다는 것을 보여주었다(표 3). 따라 서, BRCA2 999del5 보인자(이미 유방암의 높은 위험도를 가짐)의 경우, 그들의 위험도에 보유한 각각의 rs4848543 대립인자 A 당 1.65의 추정된 인자(estimated factor)가 곱해지게 된다. rs4848543 유전형의 승법 모델로부터의 편향에 대한 증거는 없었다. 이 관찰은 rs4848543 대립인자 A 변이에 의해 부여된 유방암의 증가된 위험도가 BRCA2 999del5 보인자까지 확장된다는 것을 보여준다. BRCA2 999del5는 비-기능성(non-functional) 단백질을 생성하는 널 돌연변이(null mutation)이기 때문에, 이 결과들은 rs4848543 대립인자 A에 의해 부여된 위험도가 상기 돌연변이가 단백질을 비-기능성이 되게 하는 BRCA2 돌연변이 보인자 모두에게 확장된다는 것을 시사한다.

rs4848543 대립인자 A는 BRCA2 999del5와 상승적으로 상호작용할 수 있다:

rs4848543 대립인자 A로부터의 위험도가 BRCA2 999del5 보인자까지 확장된다는 관찰은 상기 변이가 999del5 비-보인자(non-carrier)에게 부여하는 것과 동일한 상대적 위험도를 999del5 보인자에게 부여하는지의 문제를 제기한다. 본 발명자들은 BRCA2 999del5 보인자에서 rs4848543 대립인자 A에 대한 상대적 위험도 추정값(1.65)이 BRCA2 돌연변이의 비-보인자에서 rs4848543 대립인자 A에 대한 상대적 위험도 추정값(1.13, 표 3)보다 약간 더 높다는 것에 주목했다. 따라서, 본 발명자들은 rs4848543 대립인자 A에 의해 부여된 상대적 위험도가 BRCA2 999del5 배경에서 비-999del5 배경에서와 상이한지 여부를 테스트하였다. 표 3에 표시된 바와 같이, rs4848543 대립인자 A에 의해 부여된 상대적 위험도는 비-보인자와 비교하여, 999del5 보인자에서 약 1.46-배 더 높았다. 이 관찰은 rs4848543 대립인자 A가 BRCA2 999del5와 상승적 방식으로 상호작용한다는 해석과 일치한다. BRCA2 999del5는 비-기능성 단백질을 생성하는 널 돌연변이이기 때문에, 이 결과들은 rs4848543 대립인자 A가 BRCA2 단백질을 비-기능성이 되게 하는 모든 BRCA2 돌연변이와 상승적으로 상호작용한다는 것을 시사한다.

BRCA2 999del5와의 잠재적 상호작용은 또한 환자들 중에서 rs4848543의 변이 대립인자의 수와 환자에 의해 보유된 999del5의 수 간에 유의성있는 상관관계가 있는지 여부를 평가하는 것에 의해 조사하였다. 표 4에 표시된 바와 같이, 환자에서 보유된 rs4848543 대립인자 A의 갯수와 BRCA2 999del5 대립인자의 보유 간의 유의성 있는 상관관계가 있었다. 환자에서 rs4848543 대립인자 A와 BRCA2 999del5 대립인자 간의 상관관계가 근본적인 집단 계층화(underlying population stratification) 때문에 일어날 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 상관관계가 대조군 집단에 존재하는지 여부를 조사하였다. 두 변이에 대해 테스트된 5938명의 대조군에서 상관관계는 없었다. 유방암 환자들은 이 5938명의 대조군의 그룹으로부터 배제시켰다. BRCA2 999del5는 유방암에 대한 강력한 위험 인자이기 때문에, 대조군에서 999del5 보인자가 고갈된 것으로 주장될 수 있다(비교적 작은 수의 여성 보인자들이 유방암에 의해 영향받지 않을 수 있기 때문에). 따라서, 본 발명자들은 두 변이 모두에 대해 테스트되었던 2925명의 남성으로 구성된 대조군을 이용하여 상기 테스트를 반복하였다. 이 그룹에서 rs4848543 대립인자 A와 999del5 보유 간의 상관관계에 대한 증거는 없었다. 따라서, 본 발명자들은 환 자들 중에서 rs4848543 대립인자 A와 999del5의 동시-유전(co-inheritance)을 설명할 수 있는 근본적인 집단 계층화의 증거가 없는 것으로 결론지었다. 따라서, 가장 타당한 설명은 rs4848543 대립인자 A와 999del5가 상승적 방식으로 상호작용한다는 것이다.

그 후, 본 발명자들은 공지된 BRCA2 999del5 환자들이 분석으로부터 제외된 경우 rs4848543 대립인자 A가 가족력과의 연관을 보인다는 관찰로 되돌아갔다(표 2). 본 발명자들은 BRCA2 999del5 보인자가 아니나, MedPre 표현형 기준을 충족시키는 고 위험 환자들이 rs4848543 대립인자 A의 증가된 빈도를 보이는지 여부를 조사하였다. 상기 빈도는 대조군에서보다 이 환자들에서 더 높았고, 1.35의 상대적 위험도에 해당했다(표 3). 따라서, rs4848543 대립인자 A와의 위험도 연관은 999del5 보인자가 아니나, 그럼에도 불구하고 MedPre 특징을 갖는 환자들에까지 확장된다.

표 1에 표시된 바와 같이, MedPre 표현형 정의에 맞지 않는 환자에서 rs4848543 대립인자 A와 연관된 검출가능한 위험도는 없었다. 이는 rs4848543 대립인자 A만이 MedPre 표현형 배경에서 위험도를 부여한다는 것을 시사한다. 이는 rs4848543 대립인자 A 변이의 배경에 비교적 드문, 고 침투성 돌연변이가 존재하는 경우 일어날 수 있다. 대안적으로, rs4848543 대립인자 A 변이는 BRCA2 및 가족성 연관(familiar association)을 갖는 다른, 확인되지 않은 고 침투성 위험도 결정인자의 침투성을 변형시키는 보다 일반적인 대립인자를 나타낼 수 있다. 그와 같은 확인되지 않은 위험도 결정인자는 다른 유전자의 고 침투성 변이, 변이의 다유전 자(polygenic) 조합 또는 심지어 가족에서 집적하는 환경적 위험 인자들일 수 있다. 편의를 위해, 본 발명자들은 그와 같은 가상의(hypothetical) 고 침투성 위험도 결정인자를 BRCAx로 지칭한다. rs4848543 대립인자 A가 변형자 유전자(modifier gene)으로 작용할 수 있다는 견해를 더 조사하기 위해, 본 발명들은 rs4848543 대립인자 A가 MedPre에 걸린, 비-BRCA 보인자에서와 동일한 빈도로 영향받은 BRCA2 999del5 보인자 중에 일어나는지 여부를 연구하였다. 이는 사실상 rs4848543 대립인자 A 변이가 BRCAx를 갖는 개인에 대한 것과 유사한 위험도를 999del5의 보인자에게 부여하는지 여부를 조사하는 것이다. 표 3에 표시된 바와 같이, 이 그룹들 간에 rs4848543 대립인자 A 변이의 빈도의 유의성 있는 차이는 없었다. 그러나, 상대적 위험도의 점 추정값(point estimate)은 1.22여서, 그 효과가 999del5 보인자에서 더 클 수 있다는 것을 시사한다.

rs4848543 대립인자 A 및 rs4848543 LD 블럭 내의 (rs4848543과 연관 불균형인)다수의 다른 마커의 보인자는 다발성 원발성 유방암의 증가된 위험도를 갖는다:

다발성 원발성 유방암의 발생율은 유전적 소인의 지표(indicator)이고 임상적 중요성을 갖는다. 유방암을 앓았던 환자들은 제2의 원발성 종양의 발병에 대해 크게 증가된 위험도를 갖는다. 유전적 소인은 이 증가된 위험의 실질적인 성분을 구성할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 다발성 원발성 유방암(MPBC)이 비-보인자에서보다 rs4848543 대립인자 A 보인자에서 기대되는 것보다 높은 빈도로 나타나는지 여부를 조사하였다. Illumina 칩으로부터의 데이터는 rs4848543 LD 블럭 내의 다른 마커들이 적어도 rs4848543만큼 MPBC를 잘 예측할 수 있다는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명자들은 상기 블럭 내의 마커들에 대해 8개의 분석법을 설계하고 테스트하였다. 로지스틱 회귀를 이용한 MPBC에 대한 위험도의 평가 및 환자 추적(follow-up) 시간의 길이를 보정한 후, 8개의 SNP 중 7개가 단일 원발성 유방암(SPBC) 진단만을 경험한 환자 대비 보인자에서 MPBC의 증가된 위험도를 보였다(표 5). 본 발명자들은 이 7개의 SNP 분석법이 환자가 MPBC의 증가된 위험도를 갖는지 여부를 결정할 수 있는 것으로 결론지었다.

하나의 연관 불균형 블럭 내의 복수 개의 SNP가 All BC 및 MedPre 유방암 표현형과의 연관을 보인다:

SNP rs4848543 대립인자 A는 NCBI Build 34에 근거한 경계 좌표(delimiting coordinate)가 표 6에 표시된 연관 불균형(LD) 블럭에서 발견된다. 상기 LD 블럭은 [McVean, et al., (2004), Science, 304, 581-4; Winckler, et al., (2005), Science, 308, 107-11]에 기재된 가능성 비 테스트를 이용하여 옥스포드 대학교의 수학 유전학 그룹(the Mathematical Genetics Group at the University of Oxford)에 의해 정의된 재조합 핫스팟(recombination hotspot) 간에 전개되는 것으로 정의되었다. Illumina Hap300 칩으로부터의 데이터는 rs4848543 대립인자 A와 동일한 연관 불균형 블럭 내에 존재하고 테스트된 두 개의 유방암 소인과 명목적으로 유의성있는 연관을 보인 다수의 SNP를 밝혔다. 표 7 및 표 8은 Illumina Hap300 칩 상에 존재하는 LD 블럭 내의 모든 SNP의 목록 및 두 개의 표현형에 대해 그들로부터 수득된 연관 값(association value)을 표시한다. 본 발명자들은 또한 HapMap 프로젝트(HapMap 데이터에 대한 모든 참조는 release 20에 대한 것임)에서 분석된 추가적인 세트의 SNP에 대한 효율적인 대리물(r²>0.8)로 확인된 상기 블럭 내의 2-마커 일배체형(two-marker haplotype)을 고려했다. 이 추가적인 SNP는 UTAH CEPH (CEU) HapMap 표본에서 5%보다 높은 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency)를 가졌고 그들은 Hap300 SNP 칩 상에 존재하지 않았고 상기 칩 상에 존재하는 SNP에 의해 효율적으로 태깅되지도 않았다[Pe'er, et al., (2006), Nat Genet, 38, 663-7]. 이와 같은 소위 "Daly" 일배체형에 대한 결과가 또한 표 7 및 표 8에 표시된다. MedPre 유방암에 대해, 29개의 개별적인 SNP 또는 2-점(two-point) "Daly" 일배체형이 명목적으로 유의성 있는 p-값을 보였다.

rs4848543 대립인자 A-연관 위험도가 복수 개의 일배체형 배경 상에 존재한다.

rs4848543 대립인자 A가 비교적 드문, 고 침투성 변이를 태깅하는지 또는 다른 고 침투성 결정인자들의 공통된 변형자(common modifier)로 작용하는지 여부를 구별하기 위하여, 본 발명자들은 rs4848543 대립인자 A가 나타나는 일배체형 배경의 다양성을 조사하였다. rs4848543 LD 블럭은 비교적 높은 재조합의 영역을 포함하며, 그의 원위 말단(distal end)은 뉴클레오티드 120034174 주위에 존재했다. 명목적으로 유의성 있는 유방암 위험도를 부여하는 SNP는 이 재조합의 영역에서 (우 측) 말단에 위치한다. 따라서, 본 발명자들은 일배체형 다양성의 분석을 우측 서브-블럭 영역(right-hand sub-block region)에 한정했다. 본 발명자들은 Illumina 칩 상에서 분석된 시료 및 SNP를 이용하여 정의된 영역(nt 120034174 내지 nt 120129001) 내에서 일배체형을 확인하기 위해 NEMO 소프트웨어를 이용하였다. 일배체형을 구별하기 위해 필요하지 않은 중복적인 SNP는 제거하고, 남은 일배체형 각각에 대해 상대적 위험도 및 빈도를 평가하였다. 결과가 표 9에 표시된다. rs4848543 A 대립인자를 갖는 모든 확인된 일배체형은 1보다 큰 상대적 위험도 추정값을 가졌고, 대부분의 경우, RR 추정값은 1보다 유의성있게 더 컸다. 반대로, rs4848543 C 대립인자를 갖는 일배체형은 어느 것도 1보다 큰 RR 추정값을 갖지 않았고, 모든 유의성 있는 추정값은 1 미만이었다(즉, 그들은 보호적(protective)임). 따라서, 본 발명자들은 rs4848543 대립인자 A-포함(bearing) 일배체형으로부터 위험도를 분리시킬 수 없었다. 이는 발병성(pathogenic) 변이(즉, 기계적으로 위험도를 부여하는 변이)는 rs4848543 대립인자 A 또는 rs4848543 대립인자 A와 강한 연관 불균형인 변이라는 것을 시사한다. 복수의 일배체형 배경 상에 발병성 변이의 존재는 그의 빈도가 rs4848543 대립인자 A의 빈도와 근접하게 유사할 수 있다(즉, rs4848543 대립인자 A와 발병성 변이 간의 r² 값은 높다)는 것을 시사한다. 이 관찰은 rs4848543 대립인자 A가 rs4848543 LD 블럭 내에서 드문, 고 침투성 변이의 존재를 나타내지 않으나, 오히려 상기 대립인자가 BRCA2 및 앞서 정의된 BRCAx와 같은 고 침투성 결정인자의 다소 공통된 변형자라는 견해를 지지한다.

다수의 마커들이 rs4848543 대립인자 A와의 상관관계를 통해 BC 위험도 연관을 보일 수 있다:

HapMap 프로젝트 데이터 (release 20)에 대한 참조는 CEU 백인 유럽계 집단 표본에서 rs4848543과 0.2보다 큰 r² 값의 상관관계를 갖는 다수의 공지된 SNP를 밝혔다. 이 SNP들은 rs4848543과 유의성있게 상관되기 때문에, rs4848543 자체에 의해 측정되는 것과 동일한 BC 위험도를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 이 SNP들은 표 10에 열거된다.

STEAP3/TSAP6 유전자는 유방암에 대한 관찰된 위험도에 관여될 가능성이 가장 높은 유전자이다:

rs4848543 LD 블럭 영역 내에 현재 3개의 알려진 유전자가 있다. 이들은 하기와 같다;

1. 보체 성분 1q 서브성분-유사 2(Complement Component 1q Subcomponent-like 2) 유전자 C1Ql2 (NM_182528)

2. TSAP6(Tumour Suppressor Activated Pathway 6), pHyde, 및 Dudulin-2로도 알려진 STEAP3(The Six Transmembrane Epithelial Antigen of Prostate 3) 유전자. RefSeq 번호 NM_018234 (이소형 b), NM_182915 (이소형 a), 및 NM_001008410 (AF262322로도 표시됨)에 의해 식별된 이 유전자의 3개의 주요한 공지된 대안적인 전사체가 있다. 이 유전자의 제4 전사체가 개시되었고 식별자 AK024163이 부여되었다.

3. 전사체, AK127773는 STEAP3 유전자와 중첩되고 반대쪽(좌향) 가닥으로부터 전사된다. 이 유전자는 가상 단백질(hypothetical protein) FLJ45874로 표시되었다.

rs4848543 LD 블럭은 비교적 높은 재조합의 영역을 포함하고, 그의 원위 말단은 뉴클레오티드 120034174 주변에 위치한다. 명목적으로 유의성 있는 유방암 위험도를 부여하는 SNP 및 Daly 2-점 일배체형의 대다수는 이 재조합의 영역에서 말단에(우향) 위치한다. 이는 C1Q12 내 및 그 주변의 변이가 연관 신호의 출처가 아니라는 것을 시사한다. 위험도와 강하게 연관된 변이는 STEAP3/TSAP6 유전자의 5' 및 그 내부에 위치한다. 실제로, 명목적으로 유의성 있는 SNP 중 2개, rs838100 및 rs3731603은 상기 유전자의 전사된 서열 내에 존재하고 또 다른 두개, rs838102 및 rs12711924는 STEAP3/TSAP6 인트론 내에 위치한다. 이 두 개의 SNP 중 후자는 IVS4 유전자의 3' 스플라이싱 부위 부근에 위치한다. 이 관찰들, 및 STEAP3/TSAP6 유전자(하기 참조)의 공지된 생물학적 특성(biology)을 고려할 때, 유방암에 대한 관찰된 증가된 위험도에 관여될 가능성이 가장 높은 유전자는 STEAP3/TSAP6이다.

섹션 2: 염색체 2q35 상의 rs13387042

rs13387042 A 대립인자는 아이슬란드에서 유방암에 대한 증가된 위험도와 연관된다:

게놈-전체 연관 분석은 rs13387042 대립인자 A가 Any BC 표현형과 연관된다는 것을 보여주었다(표 11). 이 SNP는 STEAP3/TSAP6 유전자 좌로부터 별개의 위치에 염색체 2q35에 위치한다. 1598명의 환자 및 4475명의 암-불포함 대조군에 대해 이 SNP에 대한 Illumina 칩 데이터를 수득하였다. A-rs13387042에 대한 RR 추정값은 케이스 및 대조군에서 개체들 간의 혈연관계에 대해 보정된 경우, 4.0x10^-5의 P-값으로 1.19였다. RR은 MedPre 유방암에서 유사했고, P-값은 4.4x10^-3이었다.

그 자체로, 이 결과는 테스트된 317,089개의 SNP에 대한 Bonferroni 보정 후 게놈-전체적으로 유의성있는 것으로 간주될 수준에 도달하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 rs4848543 대립인자 A에 대해서 수행한 바와 같이, 아이슬란드 집단으로부터의 독립적인 표본에서 상기 결과를 확인하고자 하였다. 본 발명자들은 rs13387042 SNP에 대해 테스트하기 위해, SG02S728로 명명된, Centaurus SNP 분석법을 설계하고 테스트하였다. SG02S728 분석법을 추가적인 583명의 환자들 및 Illumina 칩 또는 Centaurus 방법에 의해, rs13387042 대립인자 A에 대해 분석되었던 7966명의 개인들로 구성된 독립적인 대조군에 대해 수행하였다. 7966명의 대조군은 전립선암 또는 대장암으로 진단받은 개인을 포함하나, 유방암으로 진단되었던 개인은 포함하지 않았다. 이는 rs13387042 대립인자 A가 이 암들에 대한 검출가능한 위험도를 부여하지 않는다는 중간 관찰에 의해 정당화되었다(데이터는 제시되지 않음). 이 제2 그룹에서 AnyBC와 연관된 rs13387042의 대립인자 A 에 대한 RR 추정 값은 1.20 (P-value_corr = 3.8x10^-3)이었다. 따라서, RR의 매우 유사한 점 추정치로, 최초의 발견이 독립적인 아이슬란드 표본에서 유의성있게 재현되었다. 최초의 1598명과 583명의 재현 표본이 통합되고 12441명의 대조군과 비교된 것인 결합 분석의 결과가 표 11에 표시된다. 결합 분석은 테스트된 317,089개의 SNP에 대한 Bonferroni 보정 후 유의성의 수준에 근접한, 1.20의 유의성있는 상대적 위험도 추정값(P-value_corr = 2.0x10^-7)을 보였다. rs13387042 대립인자 A 변이의 관찰된 빈도 및 상대적 위험도는 아이슬란드 집단에서 15.6%의 추정된 집단 귀속 위험도에 해당한다.

ICR 기록은 1955년부터 시작되므로, 본 발명자들이 동원한 환자들 중 일부는 장기적인 암 생존자였다. rs13387042 대립인자 A 변이를 갖는 환자가 비-보인자와 상이한 장기-생존 확률을 갖는다면, 유병 케이스들 중에서 상기 변이의 빈도가 영향을 받을 수 있다. 이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 2000년 1월 1일 이후에 진단받고, 진단으로부터부터 동원까지 5년 미만의 시간을 갖는 837명의 개인들로 구성된 환자의 서브세트를 확인했다. 최근에 진단된 환자들의 이 코호트에서, rs13387042 대립인자 A의 빈도는 0.498이었다. 본 발명자들은 또한 2000년 1월 1일 전에 진단받고 동원시까지 생존한 1344명의 환자들의 그룹을 확인하였다. 이 그룹에서 rs13387042 대립인자 A의 빈도는 0.492였고, 이는 최근에 진단된 환자들 중의 빈도와 유의성있게 상이하지 않았다(P 값 = 0.71). 따라서, 상이한 생존 율(survivorship)이 표 11에 표시된 위험도 추정값에 영향을 미쳤다는 강력한 증거는 없다.

rs13387042 A 대립인자는 스페인 케이스:대조군 표본에서 유방암에 대한 증가된 위험도와 연관된다:

유방암 위험도에서 rs13387042 대립인자 A의 역할을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 스페인에서 수집된 BC 케이스:대조군 표본의 독립적인 세트를 검사하였다. 스페인 연구 집단은 스페인 자라고자(Zaragoza)에 있는 자라고자 병원의 종양학과로부터 동원된 446명의 유방암 케이스로 구성되었다. 977명의 대조군 세트는 스페인, 자라고바에 있는 대학교 병원에서 수집되고 본 연구에 포함시키기 전에 유방암에 걸리지 않았다는 것을 확인했다. 모든 개인들은 고지된 동의서를 제출했다.

스페인 케이스 및 대조군 시료를 대상으로 SG02S728 Centaurus 분석법을 이용하여 rs13387042에 대해 유전형 분석을 수행하였다. 결과가 표 11에 제시된다. rs13387042의 대립인자 A는 이 집단에서 유방암 위험도와 1.21의 점 추정값으로 유의성 있는 연관을 보였다(P-값 1.8x10^-2). rs13387042 대립인자 A 변이의 빈도는 스페인 대조군 표본에서 더 높아서, 상기 변이가 보다 우세하고 따라서 스페인 추출(extraction) 집단에서 보다 높은 유방암 부하(burden)에 기여할 수 있다는 것을 시사했다.

rs13387042 A 대립인자는 스웨덴 케이스/대조군 표본에서 유방암에 대한 증가된 위험도와 연관된다:

유방암의 위험도에서 rs13387042 변이의 A 대립인자의 역할의 추가적인 확인을 추진하기 위해, 본 발명자들은 2개의 스웨덴 코호트에서 SNP를 분석하였다: "스웨덴 가족성(Sweden Familial)" 코호트는 스톡홀름, 카롤린스카 연구소(Karolinska Institute)의 종양유전학 카운셀링 클리닉에 유방암의 가족력 조사를 위해 위임된 346명의 BC 환자들로 구성되었다. 각 환자는 별개의 가족으로부터 유래되었다. "스웨덴 순차적(Sweden Consecutive)" 코호트는 카롤린스카 연구소 유방암 클리닉에 다녔던 482명의 순차적으로 동원된 BC 환자들로 구성되었다. 가족력은 이 제2의 코호트의 선택에서 고려되지 않았다. 대조군은 스톡홀름 지역으로부터 1300명의 수혈자 및 대장암 케이스의 434명의 암-불포함 배우자였다. 대조군에서 A-rs13387042의 빈도에서 성별간에 유의성 있는 차이는 없었고, 수혈자와 암-불포함 대조군 세트 간에 유의성 있는 차이도 없었다.

표 11에 표시된 바와 같이, "스웨덴 순차적" 코호트는 1.31의 유의성 있는 유방암에 대한 상대적 위험도를 보였다(P-값= 2.0x10^-4). "스웨덴 가족성" 코호트의 1.11의 상대적 위험도 추정값은 유의성이 없었으며, 아마도 이 그룹은 A-rs13387042의 효과를 무색하게 하는 고-침투성 유전자를 가질 수 있기 때문이다. 전체적으로, 통합된 스웨덴 코호트는 1.22의 유의성있는 상대적 위험도 추정값을 가져왔다(P-값= 8.1x10^-4).

아이슬란드 코호트, 스페인 코호트 및 스웨덴 코호트에 대한 추정값은 Mantel-Haenszel 모델을 이용하여 결합 분석에서 통합되었다. 상기 결과는 3.8x10^-11의 P-값으로 1.20의 추정된 상대적 위험도였다. 이는 조사된 317,089개의 SNP에 대해 보정하기 위한 Bonferroni 방법을 이용한 게놈-전체 유의성에 대한 역치보다 훨씬 더 낮다. 따라서, 본 발명자들은 A-rs13387042는 유럽 후손의 여러 집단 표본에서 유방암에 대한 유의성있고 재현가능한 위험도를 부여하는 것으로 결론지었다. 전체 집단 기인 위험도는 16.4%였다.

rs13387042 대립인자 A - 연관 위험도가 복수 개의 일배체형 배경에 존재한다:

rs13387042 SNP는 표 12에 NCBI Build 34에 근거한, 경계 좌표가 표시된 연관 불균형(LD) 블럭에서 발견된다. 상기 LD 블럭은 [McVean, et al., (2004), Science, 304, 581-4; Winckler, et al., (2005), Science, 308, 107-11]에 기재된 가능성 비 테스트를 이용하여 옥스포드 대학교의 수학 유전학 그룹에 의해 정의된 재조합 핫스팟 간에 전개되는 것으로 정의되었다. 마커 rs13387042의 대립인자 A가 비교적 드문, 고 침투성 변이 또는 보다 일반적이고 더 낮은 침투성 변이를 태깅하는지 여부를 구분하기 위해, 본 발명자들은 rs13387042 대립인자 A가 나타나는 일배체형 배경의 다양성을 조사하였다. 본 발명자들은 Illumina 칩 상에서 분석된 SNP 및 표본을 이용하여 LD 블럭 내에서 일배체형을 확인하기 위해 NEMO 소프트웨 어를 이용했다. 일배체형을 구별하기 위해 필요하지 않은 중복적인 SNP는 제거하고, 남은 일배체형 각각에 대해 상대적 위험도 및 빈도를 평가하였다. 결과가 표 13에 표시된다. rs13387042 A 대립인자를 갖는 수개의 확인된 일배체형은 1보다 큰 상대적 위험도 추정값을 가졌고, 일부 경우, RR 추정값은 1보다 유의성있게 더 컸다. 반대로, rs13387042 C 대립인자를 갖는 단 하나의 드문 일배체형은 1보다 큰 RR 추정값을 보였고, rs13387042 대립인자 C-포함(bearing) 일배체형에 대한 2개의 명목적으로 유의성 있는 RR 추정값은 1 미만이었다(즉, 그들은 보호성임). rs13387042의 대립인자 A를 갖는 두 개의 일배체형은 1보다 큰 RR 추정값을 생성하지 않았고, 이 추정값들 중 하나는 명목적으로 유의성이 있었다. 정리하면, 이 관찰들은 발병성 변이(즉, 기계적으로 위험도를 부여하는 변이)는 rs13387042 대립인자 A와 강한 연관 불균형이나, rs13387042 대립인자 A 자체는 아닐 수 있다는 것을 시사한다.

rs13387042 LD 블럭 내의 복수 개의 SNP가 BC 위험도와 연관을 보인다:

Illumina Hap300 칩으로부터의 데이터는 rs13387042와 동일한 LD 블럭에 존재하는 다수의 SNP를 밝혔다. 표 14는 llumina Hap300 칩 상에 존재하는 상기 LD 블럭 내에 존재하는 모든 SNP의 목록 및 그들로부터 수득된 단일-점(single-point) 분석 및 2-점 "Daly" 일배체형 분석에 대한 연관 값(association value)을 보여준다. 21개의 SNP 또는 Daly 일배체형이 개체들 간의 가족 관계에 대해 보정된 경우 명목적으로 유의성 있는 P-값을 보였다는 것을 알 수 있다.

다수의 마커들이 rs13387042 대립인자 A와의 상관관계를 통해 BC 위험도 연관을 보일 수 있다:

HapMap 프로젝트 데이터 (release 20)에 대한 참조는 CEU 백인 유럽계 집단 표본에서 rs13387042와 0.2보다 큰 r² 값의 상관관계를 갖는 다수의 공지된 SNP를 밝혔다. 이 SNP들은 rs13387042와 유의성있게 상관되기 때문에, rs13387042 자체에 의해 측정되는 것과 동일한 BC 위험도를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 이 SNP들은 표 15에 열거된다.

섹션 3: 염색체 16q12 상의 rs3803662

rs3803662의 T 대립인자는 유방암에 대한 위험도와 연관된다:

1600명의 유방암 환자 및 11563명의 대조군으로부터의 데이터를 이용한 추가적인 게놈전체 SNP 분석은 SNP rs3803662의 대립인자 T가 Any BC에 대한 약 1.23-배 증가된 위험도를 부여한다는 것을 밝혔다(표 16). 이 결과는 594명의 아이슬란드 유방암 환자 및 1433명의 대조군의 제2의 독립적인 코호트에서 확인되었다. 이 두개의 아이슬란드 표본으로부터의 통합된 데이터는 개체들 간의 혈연관계에 대해 보정된 경우, 1.23의 상대적 위험도 추정값 및 2.8x10^-7 의 P-값을 생성했다. 이는 10.1%의 추정된 집단 귀속 위험도에 해당했다(표 16).

rs3803662 대립인자 T의 유방암에 대한 위험도와의 연관은 스웨덴, 스페인 및 네덜란드로부터의 독립적인 유방암 케이스:대조군 코호트에서 재현된다.

rs3803662 대립인자 T의 유방암 위험도와의 연관을 확인하기 위해, 본 발명자들은 3개의 독립적인, 외국 코호트에서 상기 발견을 재현하고자 시도하였다. 본 발명자들은 전술된 스웨덴 코호트 및 스페인 코호트로부터의 개인들의 유전형을 분석하였다. 본 발명자들은 또한 네덜란드, 네이메헌(Nijmegen)으로부터의 1384명의 대조군 및 558명의 유방암 케이스의 유전형을 분석하였다. 이 코호트는 2005-2006년에 네덜란드의 동부에서 진단된 유방암 환자들의 집단-기반 등록부 확인으로부터 모집되었다. 이 기간동안 70세 이전에 유방암으로 진단된 모든 환자들에게 본 연구에 참가하도록 요청하였다. 대조군은 집단 등록의 랜덤 표본에 기반하여 2002-2003년에 수행된 조사(survey)(네이메헌 생물의학 연구(Nijmengen Biomedical Study))에서 모집되었다. 표 16에 표시된 바와 같이, rs3803662 대립인자 T에 대한 유의성있게 증가된 위험도는 상기 3개의 재현 코호트 모두에서 관찰되었다. 상기 3개의 비-아이슬란드 재현 코호트의 통합 분석에서, 전체 상대적 위험도 추정값은 1.35였고, P-값은 5.1x10^-12였다. 아이슬란드 코호트 및 재현 코호트의 결합 분석은 2.7x10^-17의 P-값으로 1.28의 통합된 상대적 위험도 추정값을 보여주었다. 이는 테스트된 SNP의 갯수에 대해 보정된 경우, 게놈-전체 유의성에 대한 역치보다 훨씬 낮다. 상응하는 전체 집단 기인 위험도 추정값은 13.4%였다(표 16).

rs3803662를 포함하는 LD 블럭의 정의 및 잠재적인 후보 유전자의 확인.

rs3803662 SNP는 표 17에 NCBI Build 34에 근거한 경계 좌표가 표시된 연관 불균형(LD) 블럭에서 발견된다. 상기 LD 블럭은 [McVean, et al., (2004), Science, 304, 581-4; Winckler, et al., (2005), Science, 308, 107-11]에 기재된 가능성 비 테스트를 이용하여 옥스포드 대학교의 수학 유전학 그룹에 의해 명명된 재조합 핫스팟 간에 전개되는 것으로 정의되었다. rs3803662는 LOC643714로 표시된 가상(hypothetical) 단백질의 전사체에 존재한다. 따라서, 이 가상 단백질은 잠재적인 암 소인 유전자(cancer predisposition gene)로 관련된다. 공지된 유전자 TNRC9의 5' 말단도 이 블럭에 존재한다. TNRC9은 전사 인자 및 크로마틴 리모델링 작용제(chromatin remodeling agent)를 포함하는 것으로 알려진 일군의 단백질인 크로마틴 연관 HMG(high mobility group) 단백질 패밀리의 일원이다. 원발성 유방암 대비, 전이성 유방암에서 TNRC9 단백질의 감소된 발현이 관찰되었다(Olendrowitz, C. 2006, Bachelor of Science Bioinformatics Thesis, Charite-Universitatsmedizin, Berlin). 이 유전자의 5'말단 부근에 존재하는 SNP 변이의 확인은 상기 변이가 TNRC9 단백질의 기능의 발현을 변화시켜서, 증가된 유방암 위험도를 초래하는 유전적 인자와 연관 불균형일 수 있다는 것을 시사한다,

rs3803662 LD 블럭 내의 복수 개의 SNP가 BC 위험도와의 연관을 보인다:

Illumina Hap300 칩으로부터의 데이터는 rs3803662와 동일한 LD 블럭에 존재하는 다수의 SNP를 밝혔다. 표 18은 llumina Hap300 칩 상에 존재하는 상기 LD 블 럭 내에 존재하는 모든 SNP의 목록을 보여주며, 그들로부터 단일-점 "Daly" 일배체형 분석 및 2-점 "Daly" 일배체형 분석에 대한 연관 값을 수득하였다. 80개의 SNP 또는 Daly 일배체형이 명목적으로 유의성 있는 P-값을 보였다는 것을 알 수 있다.

다수의 마커들이 rs3803662 대립인자 T와의 상관관계를 통해 BC 위험도 연관을 보일 수 있다:

HapMap 프로젝트 데이터 (release 20)에 대한 참조는 CEU 백인 유럽계 집단 표본에서 rs3803662와 0.2보다 큰 r² 값의 상관관계를 갖는 다수의 공지된 SNP를 밝혔다. 이 SNP들은 rs3803662와 유의성있게 상관되기 때문에, rs3803662 자체에 의해 측정되는 것과 동일한 BC 위험도를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 이 SNP들은 표 19에 열거된다.

rs3803662 대립인자 T 및/또는 관련 SNP는 여러 상이한 민족에서 유방암에 대한 위험을 부여한다:

상이한 민족 배경으로부터의 환자에서 rs3803662 대립인자 T에 대한 발견의 일반성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 다민족 코호트 연구(Multiethnic Cohort study, MEC)로부터의 유방암 환자 및 대조군의 표본에서 연관에 대해 상기 SNP를 테스트하였다. MEC는 하와이 및 로스엔젤레스로부터의 215,000 명 이상의 남성 및 여성(캘리포니아의 다른 지역으로부터의 추가적인 아프리카계 미국인 포함)으로 구성되었고 다른 문헌에 상세하게 설명되었다[Kolonel, et al., (2000), Am J Epidemiol, 151, 346-57]. 상기 코호트는 주로 식습관, 인구통계적 인자, 개인적 거동(personal behavior), 과거의 병력(history of prior medical conditions), 일반적인 암에 대한 가족력, 및 여성의 경우, 임신 기록(reproductive history) 및 외래 호르몬 사용에 관한 상세한 정보를 묻는 26-페이지 자가-보고형 설문지(self-administered questionnaire)를 작성하는 것에 의해 1993년과 1996년 사이에 본 연구에 참여했던 아프리카계 미국인, 하와이 원주민, 일본계 미국인, 라틴계, 및 유럽계 미국인으로 구성되었다. 참가자들은 참여(enrolment) 당시 45세 내지 75세의 연령이었다. MEC에서 우발적 암(incident cancer)은 하와이 및 로스앤젤레스 카운티를 포함하는 집단-기반 암 SEER(Surveillance, Epidemiology, and End Results) 등록부 및 캘리포니아 전 지역을 포함하는 캘리포니아 주 암 등록부(California State Cancer Registry)에 대한 코호트 연결(cohort linkage)에 의해 확인되었다. 1994년부터 시작하여, 상기 코호트에서 유전적 분석을 위한 대조군 풀로 작용할 수 있도록 우발적 유방암 케이스 및 MEC 참가자들의 랜덤 표본에서 혈액 시료를 채취하였다. 네스티드 유방암 케이스-대조군 연구(nested breast cancer case-control study)에서 적격(eligible) 케이스들은 MEC 등록 후부터 2002년 12월 31일까지 우발적 침윤성 암으로 진단받은 여성들로 구성되었다. 대조군은 상기 코호트로의 참가 전 및 2002년 12월 31일까지 유방암으로 진단되지 않은, 유방암을 갖지 않는 참가자들이었다. 대조군은 (5-년 간격으로) 인종/민족 및 연령에 기반하여 케이스에 빈도 조화(frequency match)시켰다. 상기 연구는 서던 캘리포니아 대학교 및 하와이 대학교에서 연구기관 감독 위원회(Institutional Review Board)에 의해 허가되었다.

본 발명자들은 MEC로부터의 유럽계 미국인, 라틴계 및 아프리카계 미국인에서 rs3803662와 연관된 위험도를 조사하였다. rs13387042 SNP와 다른 SNP 간의 상관관계가 상이한 민족에서 다를 수 있기 때문에, 본 발명자들은 이 표본들에서 테스트하기 위해 일군의 SNP를 선택하였다. HapMap 프로젝트 데이터(release 20)로부터 유래된 유럽계 미국인 및 요루바(Yoruba)(아프리카인)에 대한 r² 및 D' 값이 표 23에 표시된다. 이 SNP들에 대해 Centaurus 분석법을 생성하고 MEC 표본에서 유전형분석을 수행하였다. SNP 간의 결과를 더 잘 비교할 수 있도록 하기 위해, 본 발명자들은 일배체형 분석에 의해 결실된 유전형을 고려하여, 일반화된 가능성 비 테스트(generalized likelihood ratio test)를 이용하였다. 이것은 상이한 SNP에 대한 케이스 및 대조군의 수를 동일하게 하는 효과를 가져서, 그들 간의 비교를 보다 용이하게 하였다. 결과가 표 24에 표시된다. 먼저, rs3803662 대립인자 T로부터의 위험도가 유럽계 미국인에서 유의성있게 재현된다는 것이 명백하다. 관련된 SNP들 중 두개, rs4784227 대립인자 T 및 rs17271951 대립인자 C는 유럽계 미국인에서 rs3803662 대립인자 T보다 명목적으로 더 높은 상대적 위험도 및 더 낮은 P-값을 보였다. 이는 최초에 확인된 SNP에 관련된 것이 더 높은 상대적 위험도를 가질 수 있고 따라서 탁월한 질병 위험도 마커를 제공한다는 개념을 예시한다.

rs3803662 대립인자 T 신호는 또한 라틴계 미국인(latina)에서 유의성있게 재현된다. 마커 rs3803662의 T 대립인자는 아프리카계 미국인에서 유의성있게 재현되지 않았고, 실제로, 상기 T-대립인자는 아프리카계 미국인 표본에서 보호성이었다. 이는 rs3803662 대립인자 T와 추정적 발병성 돌연변이(putative pathogenic mutation) 간의 LD 관계가 아프리카계 미국인에서 상당히 상이하다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 3개의 관련된 SNP 대립인자, rs12922061 대립인자 T, rs4784227 대립인자 T, 및 rs17271951 대립인자 C가 유럽인에서 rs3803662 대립인자 T와 강한 상관관계를 가지나, 이 상관관계는 요루바 아프리카인에서는 유지되지 않는다는 것에 주목했다(표 24). 그러나, rs3803662 대립인자 T와 달리, 관련된 SNP 대립인자, rs12922061 대립인자 T, rs4784227 대립인자 T, 및 rs17271951 대립인자 C는 모두 유방암에 대해 명목적으로 증가된 상대적 위험도를 보이고, 이들 중 2개는 일측 수준(1-sided level)에서 통계적 유의성을 달성했다(표 24). 이것은 관련된 SNP의 세트를 이용하는 것은 다양한 민족 그룹에서 사용하기에 적합한 위험 마커들을 제공할 수 있다는 것을 보여준다.

rs13387042 대립인자 A 및 rs3803662 대립인자 T는 에스트로겐 수용체 양성 유방암에 대한 증가된 위험도를 부여한다:

본 연구에서 환자들의 의료 기록은 그들이 이용가능한 경우 검토하였다. 통합된 표본 세트를 이용하여, 본 발명자들은 rs13387042 대립인자 A 및 rs3803662 대립인자 T, 진단시 연령(age at diagnosis), 에스트로겐 수용체(ER) 및 프로게스 테론 수용체(PR) 상태 간의 연관에 대해 조사하였다. 어느 변이도 진단시 연령과 연관을 보이지 않았다. rs13387042 대립인자 A 및 rs3803662 대립인자 T를 포함하는 유의성있는 유방암 위험도는 명백하게 ER 양성 종양으로 진단된 환자들에 한정되었고 ER 양성 종양과 ER 음성 종양에 대한 OR의 차이는 유의성이 있었다(표 24). 마찬가지로, PR 양성 종양으로 진단된 환자들에서 우선적으로 유방암 위험도에 대한 경향이 있었으나, PR 양성 OR과 PR 음성 OR 간의 차이는 유의성이 없었다. 이는 ER 양성 종양 및 ER 음성 종양이 다소 상이한 유전적 병인을 가질 수 있다는 것을 시사한다.

표

SEQUENCE LISTING <110> deCODE Genetics ehf <120> GENETIC VARIANTS ON CHR2 AND CHR16 AS MARKERS FOR USE IN BREAST CANCER RISK ASSESSMENT, DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND TREATMENT <130> 2506-PC00 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggataaga ttatttctga ggctgcttcc atcagtggtt ctgtgagctg gcccatgtat 60 tcagccagtc agtaggccat caagcatgca tctacgcaag gcactagaag ggttacatac 120 aatgggaaac tgaggcccag aaggaggaaa gatgaagtgc ccaaagttaa ggagataaaa 180 gcagaagtgc aggtaagaga aggagtattc atattactgc aggaatccaa attctacaag 240 aacatacgct tgttctttaa agggagccct cgctttaagc attatttgcc gatcaatacc 300 mattaataat tacaggacat gggcaaatat tctagcaaag gtcctgaggt cttcctagat 360 gtgcccaaaa taacaaggac tccccccgca ggtggcacca aaagtcggag gatgtgttgg 420 aagctgacct tccccacctg tccctgcctc acccacagtc acccacccct ctaggatgta 480 atggtgaatc attcaacaca tgggccacct tgggaagtcg cttaacctct ctcccttttc 540 acgttataaa atgggcatag tcattacaca aatgcataaa tcaacctcaa ttttctcatc 600 <210> 2 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgacatagc cgcctgtgca ggtttttggg accaggtctg ccatctgtat tcccaggctg 60 ggctggagca cctgaggcta ctatggttac agaaaggaac ctggcatccg aaggtatagg 120 ctcaaatccc agctctcatg attgctagct ttgaggtttc aggttcattt cttaagtgct 180 ctgagctttg gtgccctcct cttcaaaatg ggaatgagga gcatgtctag ctccctgttt 240 tgttgcagtg aatagctaca tgaagaacag ctaaaccaga acagaaagaa ggcaaatgga 300 rgctacagaa accaaggatt tccttgttga atcgaatctt ccttcaatct tccttcacca 360 cactagtgga tctccctgtg ggagggatgt tgagagtgct ccgtgttttt tttgtttttt 420 tttttttttt ttttgtgatg gagtctcact ctgtcaccca gactggaatg cagtggtgcg 480 atctcggctc actgcaacct ctgcctccca ggttcaagtg attctcctgc ctcagcttcc 540 caagtagcca ggactacagg catatgccat cacacccagc taatttttgt atttttagta 600 <210> 3 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gctagtcctt ggctgttctg tgatcaaatg caattgtttc ccatttctta agaaacagaa 60 tctttattag actcagttct tttcttggtt atttttacaa ttttattgtt ctatggttat 120 taaaaaataa catgtcatat aaattaagcc tagaaacatg gatgtttatc aaagaaagga 180 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Claims (56)

1. 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트(genotype dataset)에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인에서 유방암에 대한 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19 중 하나에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형(linkage disequilibrium)인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 상기 개인의 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내에 위치하는 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19 중 하나에 표시된 마커들로부터 선택되는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택되는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인에서 하나 이상의 일배체형의 빈도를 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재에 의해 부여된 감수성은 증가된 감수성인 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 마커 rs4848543의 대립인자 A, 마커 rs3803662의 대립인자 T 및/또는 마커 rs13387042의 대립인자 A의 존재는 유방암에 대한 증가된 감수성을 나타내는 것인 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재는 1.20 이상의 상대적 위험도(relative risk, RR) 또는 오즈비(odds ratio, OR)를 갖는 유방암에 대한 증가된 감수성을 나타내는 것인 방법.
9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재는 1.25 이상의 상대적 위험도(RR) 또는 오즈비(odds ratio, OR)를 갖는 증가된 감수성을 나타내는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 대립인자 또는 일배체형의 존재에 의해 부여된 감수성은 감소된 감수성인 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들 중 하나와 연관 불균형이 아닌, 유방암에 대한 하나 이상의 위험 변이의 하나 이상의 위험 대립인자의 존재 또는 부재에 대해 개인으로부터 수득된 게놈 DNA를 포함하는 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 두개 이상의 다형성 마커에서 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 두개 이상의 다형성 마커에서 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 유방암에 대한 증가된 감수성을 나타내는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 상기 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 유방암에 대한 하나 이상의 고 침투성 유전적 인자(high penetrant genetic factor)의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 고 침투성 유전적 인자는 BRCA2 999del5인 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 에스트로겐 수용체 또는 프로게스테론 수용체 상태에 대해 상기 개인을 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 개인에서 에스트로겐 수용체 양성 상태 또는 프로게스테론 수용체 양성 상태는 유방암의 증가된 위험도와 연관된 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 유방암의 증가된 위험도는 rs13387042 대립인자 A 및/또는 rs3803662 대립인자 T, 및 이들과 연관 불균형인 마커들과 연관된 것인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개인의 위험도 평가, 진단, 또는 예후의 판단을 수행하기 위해 비-유전적 정보(non-genetic information)를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 비-유전적 정보는 연령, 성별, 민족, 사회경제적 지위, 과거 질병 진단, 개인의 병력(medical history), 유방암의 가족력(family history), 생화학적 척도, 및 임상적 척도로부터 선택되는 것인 방법.
20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 통합 위험도(combined risk)를 계산하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
21. 개인으로부터 수득된 핵산 시료 또는 개인으로부터 유래된 유전형 데이터세트에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 이전에 유방암으로 진단되었던 개인에서 하나 이상의 제2 원발성 종양(second primary tumor)을 발병할 위험도를 결정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19 중 하나에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고,

    상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 하나 이상의 제2 원발성 종양을 발병할 위험도를 나타내는 것인 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), 및 그와 연관 불균형인 마커들인 것인 방법.
23. 개인에서 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위한 키트로서, 상기 키트는 상기 개인의 게놈에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자를 선택적으로 검출하는 시약을 포함하고, 상기 다형성 마커는 표 10, 15 및 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 유방암에 대한 감수성을 나타내는 것인 키트.
24. 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 또는 rs13387042 (서열번호 2)인 것인 키트.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 시약은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편에 혼성화하는 하나 이상의 연속된(contiguous) 올리고뉴클레오티드, 완충액 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 키트.
26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약은 상기 개인으로부터 수득된 게놈 핵산 세그먼트의 반대쪽 가닥에 혼성화하는 한 쌍 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 하나의 다형성 마커를 포함하는 상기 개인의 게놈의 단편을 선택적으로 증폭시키도록 설계되고, 상기 단편은 크기가 30 bp 이상인 것인 키트.
27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 상기 개인의 게놈에 완전히 상보적인 것인 키트.
28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는:

    d. 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된 검출 올리고뉴클레오티드 프로브;

    e. 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브; 및

    f. 엔도뉴클레아제 효소;를 포함하고,

    상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시된 뉴클레오티드 서열의 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고; 및

    상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 3' 말단에 검출가능한 표지를 포함하고 5' 말단에 퀀칭 모이어티(quenching moiety)를 포함하며;

    상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 길이가 5개 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'에 배열된 상기 뉴클레오티드 서열의 제2 세그먼트에 상보적이어서, 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 상기 두개의 올리고뉴클레오티드가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우 상기 검출 올리고뉴클레오티드에 대해 3'에 위치하며; 및

    상기 제1 세그먼트와 상기 제2 세그먼트 간에 단일 염기 갭이 존재하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 간에 단일 염기 갭이 존재하며; 및

    상기 핵산을 상기 엔도뉴클레아제에 의해 처리하는 단계는 상기 검출 프로브가 상기 핵산에 혼성화된 경우, 상기 검출 프로브의 3'말단으로부터 상기 검출가능한 표지를 절단하여 유리 상태의 검출가능한 표지를 방출시키는 것인 키트.
29. 개인에서 유방암에 대한 유전적 지표(genetic indicator)를 결정하는 장치로 서,

    컴퓨터 판독가능한 메모리; 및

    상기 컴퓨터 판독가능한 메모리 상에 저장된 루틴(routine)을 포함하고,

    상기 루틴은 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 마커에 대해 하나 이상의 다형성 마커 및/또는 일배체형 정보를 분석하고, 상기 마커 또는 일배체형 정보에 기반한 결과물(output)을 생성하기 위해 프로세서 상에서 실행되도록 개조되고, 상기 결과물은 상기 개인의 유방암의 유전적 지표로서 상기 하나 이상의 마커 또는 일배체형의 개별적인 위험도 척도(risk measure)를 포함하는 것인 장치.
30. 제29항에 있어서, 상기 루틴은 상기 하나 이상의 마커 대립인자 및/또는 일배체형과 연관된 유방암의 위험도 척도를 더 포함하고, 상기 위험도 척도는 유방암으로 진단된 복수의 개인에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자 및/또는 하나 이상의 일배체형의 빈도의 지표와 복수의 기준(reference) 개인에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자 및/또는 일배체형의 빈도의 지표의 비교에 기반하며, 상기 개인의 개별적인 위험도는 상기 하나 이상의 마커 대립인자 및/또는 일배체형에 대한 상기 개인의 보인자 상태(carrier status)와 상기 하나 이상의 마커 대립인자 및/또는 일배체형에 대한 위험도 척도의 비교에 기반하는 것인 장치.
31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 또는 rs13387042 (서열번호 2), 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 것인 장치.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 마커들 간의 연관 불균형은 r² 및/또는 |D'|의 특정한 수치값을 특징으로 하는 것인 방법, 키트, 또는 장치.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 연관 불균형은 0.2 이상의 r²값을 특징으로 하는 것인 방법, 키트, 또는 장치.
34. 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위해 이용될 마커를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은

    d. 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내의 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 하나 이상의 다형성 마커를 확인하는 단계,

    e. 유방암으로 진단되거나 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인의 시료의 유전형 상태(genotype status)를 결정하는 단계, 및

    f. 대조군 개인의 시료의 유전형 상태를 결정하는 단계를 포함하고,

    상기 대조군 시료에서의 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자의 빈도 대비, 유방암으로 진단되거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 유의성 있는 차이는 상기 하나 이상의 다형성이 유방암에 대한 감수성을 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 대조군 시료에서의 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자의 빈도 대비, 유방암으로 진단되거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 증가는 상기 하나 이상의 다형성이 유방암에 대한 증가된 감수성을 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 대조군 시료에서의 상기 하나 이상의 다형성의 하나 이상의 대립인자의 빈도 대비, 유방암으로 진단되거나, 또는 유방암에 대한 감수성을 갖는 개인에서 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 감소는 상기 하나 이상의 다형성이 유방암에 대한 감소된 감수성 또는 보호를 평가하기 위해 유용하다는 것을 나타내는 것인 방법.
37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 4 내의 하나 이상의 마커는 표 20에 표시된 마커들로부터 선택되는 것인 방법.
38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 5 내의 하나 이 상의 마커는 표 21에 표시된 마커들로부터 선택되는 것인 방법.
39. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 6내의 하나 이상의 마커는 표 22에 표시된 마커들로부터 선택되는 것인 방법.
40. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 표시된 서열을 갖는 게놈 세그먼트 내의 하나 이상의 마커와 연관 불균형인 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택되는 것인 방법.
41. 유방암에 대한 위험을 갖거나, 또는 유방암으로 진단된 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 개인으로부터 수득된 핵산 시료의 유전형을 분석하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 다형성 마커의 상기 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재는 유방암의 감수성을 나타내는 것인 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택되는 것인 방법.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 유전형 분석은 상기 하나 이상의 다형성 마커를 플랭킹(flanking)하는 뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해, 상기 하나 이상의 다형성 마커를 포함하는 핵산의 세그먼트를 증폭하는 단계를 포함하는 것인 방법.
44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 유전형 분석은 대립인자-특이적 프로브 혼성화, 대립인자-특이적 프라이머 연장(primer extension), 대립인자-특이적 증폭, 핵산 서열결정(nucleic acid sequencing), 5'-엑소뉴클레아제 처리(exonuclease digestion), 분자 표지 분석법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석, 및 단일 가닥 구조 분석(single-stranded conformation analysis)으로부터 선택된 방법을 이용하여 수행되는 것인 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 방법은 대립인자-특이적 프로브 혼성화를 포함하는 것인 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 방법은 DNA 서열결정을 포함하는 것인 방법.
47. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,

    3) 상기 핵산의 카피를 검출 올리고뉴클레오티드 프로브 및 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브와, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 핵산 간의 특이적 혼성화 조건 하에 접촉시키는 단계로서,

    a) 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 의해 주어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고,

    b) 상기 검출 올리고뉴클레오티드 프로브는 3' 말단의 검출가능한 표지 및 5' 말단의 퀀칭 모이어티(quenching moiety)를 포함하며,

    c) 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 길이가 5 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성되고 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 5'에 배열된 상기 뉴클레오티드 서열의 제2 세그먼트에 상보적이어서, 상기 두개의 올리고뉴클레오티드가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드는 상기 검출 올리고뉴클레오티드에 대해 3' 에 위치하며, 및

    d) 상기 제1 세그먼트와 상기 제2 세그먼트 간에 단일 염기 갭(single base gap)이 존재하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 상기 인핸서 올리고뉴클레오티드 프로브가 모두 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드 간에 단일 염기 갭이 존재하는 것인 단계,

    4) 상기 검출 프로브가 상기 핵산에 혼성화되는 경우, 상기 검출 프로브의 3' 말단으로부터 상기 검출가능한 표지를 절단하여 유리된 검출가능한 표지를 방출시키는 엔도뉴클레아제로 상기 핵산을 처리하는 단계, 및

    5) 유리된 검출가능한 표지를 측정하는 단계로서, 상기 유리된 검출가능한 표지의 존재는 상기 검출 프로브가 상기 핵산의 제1 세그먼트에 특이적으로 혼성화되고, 상기 다형성 부위의 서열이 상기 검출 프로브의 상보체(complement)라는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
48. 유방암 치료제에 대한 반응의 확률에 대해 개인을 평가하는 방법으로서, 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 마커의 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 상기 치료제에 대한 양성 반응의 확률을 나타내는 것인 방법.
49. 유방암으로 진단된 개인의 예후(prognosis)를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재는 상기 개인에서 유방암의 악화된 예후를 나타내는 것인 방법.
50. 유방암의 치료를 받는 개인의 치료의 진행을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개인으로부터 수득된 핵산 시료에서 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 대립인자의 존재가 상기 개인의 치료 결과를 나타내는 것인 방법.
51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2)로부터 선택되는 것인 방법.
52. 개인에서 유방암에 대한 감수성을 진단 및/또는 평가하기 위한 시약의 제조에서 올리고뉴클레오티드 프로브의 용도로서, 상기 프로브는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 세그먼트에 혼성화되고, 상기 프로브는 길이가 15 내지 500개의 뉴클레오티드로 구성되는 것인 용도.
53. a. 하나 이상의 다형성 마커에 대한 식별자(identifier);

    b. 유방암으로 진단된 복수의 개인에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 하나 이상의 대립인자의 빈도의 지표(indicator); 및

    c. 복수의 기준 개인(reference individual)에서 상기 하나 이상의 다형성 마커의 상기 하나 이상의 대립인자의 빈도의 지표;가 저장되고,

    상기 하나 이상의 다형성 마커는 표 10, 표 15 및 표 19에 표시된 다형성 마커들, 및 이들과 연관 불균형인 다형성 마커들로부터 선택되는 것인 컴퓨터-판독가능한 매체(computer-readable medium).
54. 제53항에 있어서, 상기 다형성 마커는 rs4848543 (서열번호 1), rs3803662 (서열번호 3) 및 rs13387042 (서열번호 2), 및 이들과 연관 불균형인 마커들로부터 선택되는 것인 매체.
55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 복수의 개인들의 선조에 대한 정보를 더 포함하는 것인 키트.
56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 연관 불균형은 0.2 이상의 r² 수치값 및/또는 0.8 이상의 |D'|의 값을 특징으로 하는 것인 매체.

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