EA019953B1 - Генетические варианты chr2 и chr16 в качестве маркеров для применения при оценке риска, диагностировании, прогнозировании и лечении рака молочной железы - Google Patents

Abstract

Изобретение касается определенных генетических вариантов на Chr2q14, Chr2q35 и Chr16q12, являющихся маркерами подверженности раку молочной железы. Описываются способы оценки риска и диагностики повышенной и/или пониженной подверженности раку молочной железы с применением таких вариантов. Изобретение также относится к наборам для диагностики подверженности раку молочной железы.

Description

Данное изобретение касается способов оценки риска развития рака молочной железы. Они включают способы определения повышенной подверженности индивида к развтиию рака молочной железы, а также способы определения пониженной подверженности к развитию рака молочной железы или диагностирования устойчивости индивида к раку молочной железы путем определения конкретных маркеров или гаплотипов, для которых обнаружена ассоциация с раком молочной железы, по данному описанию.

В первом аспекте изобретение касается способа определения подверженности к развитию рака молочной железы у человеческого индивида, включающего определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида или в массиве данных генотипа, полученном у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из полиморфных маркеров, указанных в любой из табл. 10, 15 и 19, и маркеров, находящихся в неравновесии по сцеплению с ними, и где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на подверженность индивида к развитию рака молочной железы. В одном вопощении способ может касаться определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклиновой кислоты, взятом у индивида. В другом воплощении способ касается определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в массиве данных генотипа, полученном у индивида. Массив данных генотипа может, в определенных воплощениях, быть получен у конкретного индивида на основе информации, содержащейся в массиве данных генотипа, относящегося к матрице определенной нуклеиновой кислоты образца, где образец нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту одного индивида.

Определение наличия конкретного алалеля подверженности полиморфного маркера напрямую указывает на существование определенной подверженности, обуславливаемой этим аллелем. С другой стороны, определение отсутствия такого аллеля подверженности указывает на отсутствие определенной подверженности у индивида, у которого получен образец генетического материала или массив данных генотипа. В конкретных случаях, когда у полиморфного маркера, например, ОНП или полиморфизма вызванного инсерцией/делецией, существует два возможных алелля, выявление отсутствия конкретного аллеля означает наличие у индивида двух копий варианта аллеля (за исключением случаев, когда определенный регион генома индивида содержит делецию или дупликацию, когда может существовать либо единственная копия или более двух копий определенного региона генома индивида).

Во втором аспекте данное изобретение касается способа диагностирования подверженности человеческого индивида к развитию рака молочной железы, включающего определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, ассоциированных с блоком неравновесия по сцеплению т§4848543, блоком неравновесия по сцеплению т§3803662 и блоком неравновесия по сцеплению Г513387042. где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на подверженность к развитию рака молочной железы. В одном воплощении маркеры, ассоциированные с блоком неравновесия по сцеплению га4848543, блоком неравновесия по сцеплению т§3803662 и/или блоком неравновесия по сцеплению Щ13387042 ЬЭ являются маркерами, находящимися в неравновесии по сцеплению по меньшей мере с одним маркером в составе одного или более из этих блоков.

В следующем аспекте изобретение касается способа диагностирования подверженности человеческого индивида к развитию рака молочной железы, включающего определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, состоящей из маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В одном конкретном воплощении маркеры, находящиеся в неравновесии по сцеплению с маркерами, указанными в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, являются маркерами со значениями г² выше 0,2. В другом воплощении маркеры, находящиеся в неравновесии по сцеплению с маркерами, указанными в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, являются маркерами со значениями г² выше 0,2 в европеоидной популяции, такой как популяции НарМар СЕРН.

В другом аспекте изобретение относится к способу выявления маркера для использования в оценке подверженности к развитию рака молочной железы, способ включает:

а) выявление по меньшей мере одного полиморфного маркера, находящегося в неравновесии по сцеплению по меньшей мере с одним из маркеров в составе геномного сегмента, последовательность которого приведена в 8ЕЦ Ш N0:4, 8ЕЦ Ш N0:5 и 8ЕЦ Ш N0:6;

б) определение генотипического статуса в выборке индивидов с диагностированным раком молочной железы или подверженными к нему; и

в) определение генотипического статуса в выборке контрольных индивидов, где достоверная разница в частоте по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфизма у индивидов с диагностированным раком молочной железы или подверженных к нему, по сравнению с частотой по

- 3 019953 меньшей мере одного аллеля в контрольной выборке указывает на то, что по меньшей мере один полиморфизм может применяться для оценки подверженности к развитию рака молочной железы. В другом воплощении пониженная частота по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфизма у индивидов с диагностированным раком молочной железы или подверженных к нему, по сравнению с частотой по меньшей мере одного аллеля в контрольной выборке указывает на то, что полиморфизм может применяться для оценки пониженной подверженности, или устойчивости к раку молочной железы. В одном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер, находящийся в неравновесии по сцеплению по меньшей мере с одним полиморфным маркером в составе геномных сегментов, имеющих последовательность, приведенную в 8ЕО ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:5 и 8Е0 ГО N0:6, выбран из тк4848543 (5ЕО ГО N0:1), тк3803662 (8Ер ГО N0:3) и тк13387042 (5ЕО ГО N0:2).

Изобретение также касается способа генотипирования образца нуклеиновой кислоты, взятого у человеческого индивида, имеющего риск развития или с диагностированным раком молочной железы, включающего определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце, где по меньшей мере один маркер выбран из группы, состоящей из маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров, находящихся в неравновесии по сцеплению с ними, и где наличие или отсутствие по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера указывает на подверженность к раку молочной железы. В одном воплощении по меньшей мере один маркер выбран из тк4848543 (8Е0 ГО N0:1), тк3803662 (8Е0 ГО N0:3) и ТК13387042 (8Е0 ГО N0:2). В другом воплощении генотипирование включает амплификацию сегмента нуклеиновой кислоты, включающего по меньшей мере один полиморфный маркер, в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением пары нуклеотидных праймеров, фланкирующих по меньшей мере один полиморфный маркер. В другом воплощении генотипирование проводится посредством процесса, выбранного из аллель-специфической гибридизации зондов, аллель-специфического удлинения праймеров, аллель-специфической амплификации, секвенирования нуклеиновых кислот, расщепления 5'экзонуклеазами, использования молекулярных маячков (молекулярных беконов), лигирования олигонуклеотидов, анализа размера фрагментов и анализа однонитевой конформации. В одном предпочтительном воплощении процесс включает аллель-специфическую гибридизацию зондов. В другом предпочтительном воплощении процесс включает секвенирование ДНК. В особо предпочтительном воплощении способ включает этапы:

1) инкубации копий нуклеиновой кислоты с детектирующим олигонуклеотидным зондом и усиливающим олигонуклеотидным зондом в условиях для специфической гибридизации олигонуклеотидного зонда с нуклеиновой кислотой; где

а) детектирующий олигонуклеотидный зонд имеет длину 5-100 нуклеотидов и специфически гибридизуется с первым сегментом нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой представлена в 5ЕО ГО N0:4, 5ЕО ГО N0:5 ог 5ЕО ГО N0:6;

б) детектирующий олигонуклеотидный зонд содержит детектируемую метку на своем 3' конце и гасящий компонент на своем 5' конце;

в) усиливающий олигонуклеотид имеет длину 5-100 нуклеотидов и является комплементарным второму сегменту нуклеотидной последовательности, расположенному в положении 5' по отношению к олигонуклеотидному зонду, так что усиливающий олигонуклеотид располагается в положении 3' по отношению к детектирующему олигонуклеотидному зонду, когда оба олигонуклеотида гибридизованы с нуклеиновой кислотой; и

г) между первым сегментом и вторым сегментом существует пробел в одно основание, так что когда олигонуклеотидный зонд и усиливающий олигонуклеотидный зонд оба гибридизованы с нуклеиновой кислотой, между олигонуклеотидами существует пробел в одно основание;

2) обработки нуклеиновой кислоты эндонуклеазой, которая будет отщеплять детектируемую метку от 3' конца детектирующего зонда с высвобождением свободной детектируемой метки при гибридизации детектирующего зонда с нуклеиновой кислотой; и

3) измерения свободной детектируемой метки, когда присутствие свободной детектируемой метки указывает на то, что детектирующий зонд специфически гибридизован с первым сегментом нуклеиновой кислоты и указывает на то, что последовательность полиморфного сайта комплементарна детектирующему зонду

Следующий аспект изобретения касается способа оценки у индивида возможности ответа на терапевтический агент для лечения рака молочной железы, включающему: определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы, состоящей из полиморфных маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, где определение наличия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного маркера указывает на вероятность благоприятного ответа на терапевтический агент. В одном воплощении терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент или агент для гормональной терапии. В одном воплощении агент для гормональной терапии представляет собой селективный модулятор эстрогеновых рецепторов или ингибитор ароматазы. В предпочтительных воплоще

- 4 019953 ниях селективный модулятор эстрогеновых рецепторов выбран из тамоксифена и ралоксифена. В определеннных воплощениях ингибитор ароматазы выбран из экземестана, анастразола и летрозола. В других воплощениях селективный модулятор эстрогеновых рецепторов вводят в комбинации с ингибитором ароматазы.

Следующий аспект изобретения касается способа определения прогноза у индивида с диагностированным раком молочной железы, способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы, состоящей из полиморфных маркеров, приведенных в табл. 10, 15 и 19, и маркеров, находящихся в неравновесии по сцеплению с ними, где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на неблагоприятный прогноз рака молочной железы у индивида. Прогноз у индивида может в принципе касаться любого характера прогрессирования заболевания, включая формирование вторичной опухоли, быстрого распространения опухоли, степени злокачественности опухоли (от стадии 0 до стадии IV) и рецидивирования опухоли, но не ограничиваться ими.

Изобретение также касается способа мониторинга за ходом лечения у индивида, которому проводится лечение рака молочной железы, способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на исход лечения у индивида. Лечение может представлять собой хирургическое лечение, химиотерапевтическое лечение, радиотерапию, генную терапию или иммунотерапию. Любой из этих способов лечения может применяться самостоятельно или в комбинации. Например, после хирургического лечения может следовать химиотерапевтическое лечение и/или радиотерапевтическое лечение. Исход лечения индивида касается прогрессирования опухоли у индивида в конце лечения. Показатели такого исхода включают степень или возможность рецидивирования опухоли, распространение опухоли и формирование вторичной опухоли, но не ограничиваются ими.

Следующий аспект изобретения относится к набору для оценки подверженности к раку молочной железы у человеческого индивида, набор включает реагенты для селективной детекции по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в геноме индивида, где полиморфный маркер выбран из маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, и где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на подверженность к раку молочной железы. В одном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер представляет собой Т84848543 (8Ер ГО N0:1), га3803б62 (8Ер ГО N0:3) или Щ13387042 (5ЕО ГО N0:2). В другом воплощении реагенты включают по меньшей мере один примыкающий нуклеотид, гибридизующийся с фрагментом генома индивида, содержащим по меньшей мере один полиморфный маркер, буфер и детектируемую метку. В другом воплощении реагенты включают по меньшей мере одну пару олигонуклеотидов, гибридизующихся с противоположными нитями сегмента геномной нуклеиновой кислоты, полученной у субъекта, где каждая пара олигонуклеотидных праймеров создана для селективной амплификации фрагмента генома индивида, включающего один полиморфный маркер, и где фрагмент имеет размер по меньшей мере 30 пар оснований. В следующем воплощении по меньшей мере один олигонуклеотид является полностью комплементарным геному индивида. В другом воплощении олигонуклеотид имеет размер от 18 до 50 нуклеотидов. В другом воплощении олигонуклеотид имеет размер от 20 до 30 нуклеотидов. В предпочтительном воплощении набор содержит:

а) детектирующий олигонуклеотидный зонд, имеющий длину 5-100 нуклеотидов;

б) усиливающий олигонуклеотидный зонд, имеющий длину 5-100 нуклеотидов; и

в) фермент эндонуклеазу;

где детектирующий олигонуклеотидный зонд специфически гибридизуется с первым сегментом нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой приведена в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:5 или 5ЕО ГО N0:6, и где детектирующий олигонуклеотидный зонд содержит детектируемую метку на своем 3' конце и гасящий компонент на своем 5' конце;

где усиливающий олигонуклеотид имеет длину 5-100 нуклеотидов и является комплементарным второму сегменту нуклеотидной последовательности, расположенному в положении 5' по отношению к олигонуклеотидному зонду, так что усиливающий олигонуклеотид располагается в положении 3' по отношению к детектирующему олигонуклеотидному зонду, когда оба олигонуклеотида гибридизованы с нуклеиновой кислотой;

где между первым сегментом и вторым сегментом существует пробел в одно основание, так что когда олигонуклеотидный зонд и усиливающий олигонуклеотидный зонд оба гибридизованы с нуклеиновой кислотой, между олигонуклеотидами существует пробел в одно основание; и где при обработке нуклеиновой кислоты эндонуклеазой от 3' конца детектирующего зонда будет отщепляться детектируемая метка, так что высвобождение свободной детектируемой метки будет иметь место при гибридизации детектирующего зонда с нуклеиновой кислотой.

- 5 019953

Следующий аспект изобретения касается устройств для определения у человеческого индивида генетического индикатора рака молочной железы, включающих компьютерную память и программы, хранящиеся в компьютерной памяти;

где программы адаптированы для выполнения на процессорах для анализа информации о маркерах и/или гаплотипах по меньшей мере для одного человеческого индивида в отношении по меньшей мере одного полиморфного маркера, выбранного из маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, и для генерирования выходных данных на основании информации о маркере или гаплотипе, где выходные данные включают показатель риска по меньшей мере по одному маркеру или гаплотипу в качестве генетического индикатора рака молочной железы у человеческого индивида. В одном воплощении программа также включает показатель риска развития рака молочной железы, ассоциированный с по меньшей мере одним аллелем маркера и/или гаплотипом, где показатель риска основан на сравнении частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера и/или гаплотипа у большинства индивидов с диагностированным раком молочной железы и индикатора частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера и/или гаплотипа у большинства референсных индивидов, и где индивидуальный риск для человеческого индивида основан на сравнении статуса носительства индивидом по меньшей мере одного аллеля маркера и/или гаплотипа и показателя риска по меньшей мере для одного аллеля маркера и/или гаплотипа. В одном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из гк4848543 (8ЕО ΙΌ N0:1), тк3803662 (8Е0 ГО N0:3) или тк13387042 (8Е0 ГО N0:2) и маркеров, находящихся в неравновесии по сцеплению с ними.

Изобретение также касается применения олигонулеотидного зонда в производстве реагента для диагностирования и/или оценки подверженности к развитию рака молочной железы у человеческого индивида, где зонд гибридизуется с сегментом нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которого приведена в 8Е0 ГО N0:4, 8Е0 ГО N0:5 или 8Е0 ГО N0:6, где зонд имеет длину 15-500 нуклеотидов.

Изобретение также касается компьютерных носителей, на которых хранится:

а) идентификатор по меньшей мере для одного полиморфного маркера;

б) индикатор частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного указанного полиморфного маркера у большинства индивидов с диагностированным раком молочной железы и

в) индикатор частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного указанного полиморфного маркера у большинства референсных индивидов;

где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из полиморфных маркеров, приведенных в табл. 10, табл. 15 и табл. 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними.

В определенных воплощениях изобретения также оценивается частота по меньшей мере одного гаплотипа у индивида, где гаплотип включает по меньшей мере два маркера, и где наличие по меньшей мере одного гаплотипа указывает на подверженность к развитию рака молочной железы. В одном воплощении гаплотип представляет собой гаплотип, связанный с риском рака молочной железы, т.е. гаплотип обусловливает повышенный риск развития рака молочной железы. В одном воплощении гаплотип выбран из группы гаплотипов, указанных в табл. 7, табл. 8, табл. 9, табл. 13, табл. 14 и табл. 18.

В другом воплощении изобретения по меньшей мере один аллель по меньшей мере одного полиморфного маркера присутствует в составе гаплотипа, выбранного из группы состава гаплотипов, определенного гаплотипами, указанными в табл. 9 и 13. В другом воплощении способ по данному изобретению касается также выполнения этапа оценки высоко пенетрантных генетических факторов, связанных с раком молочной железы. Таким высоко пенетрантным генетическим фактором в одном воплощении является ВКСЛ2 999бе15. Недавно полученные свидетельства позволяют предположить, что риск, ассоциированный с вариантами ВК.СЛ1 и ВКСА2, в некоторых случаях модифицирован другими генетическими факторами или факторами окружающей среды, которые концентрируются в семьях (Ап1ошои А.С., е! а1. Ат 1 Нит Оепе! 2008 Маг 18 (ЕриЬ айеаб оГ ρτίηΐ)). Так, в определенных воплощениях, другие мутации с высокой пенетрантностью, связанные с раком молочной железы, такие как, обнаруженные в генах ВК.СА1 и ВК.СА2, которые хорошо документированы и известны специалистам (см, например, Втеак! Сапсег Ми1а1юп Эа1а Ваке а!: й11р://гекеагсй.пйдгЕшй.доу/Ь1с/; см. также Еаскеп1йа1. 1ГО. & 01орабе, 0.1., №11иге Веу1е\\ъ Сапсег 7:937-48 (2007) и ссылки, приводимые здесь) могут также оцениваться и использоваться в сочетании с вариантами по данному описанию ассоциированными с раком молочной железы.

В одном воплощении изобретения также выполняется этап оценки статуса эстрогеновых рецепторов или прогестероновых рецепторов индивида. В одном таком воплощении положительный эстрогеновый статус или положительный прогестероновый статус ассоциирован с повышенным риском, ассоциированным с аллелем А тк13387042 и аллелем Т гк3803662 и ассоциированными с ними маркерами, например, маркерами, приведенными в табл. 15 и 19.

В другом аспекте данное изобретение касается способа оценки риска развития по меньшей мере второй первичной опухоли у индивида с диагностированным ранее раком молочной железы, способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного

- 6 019953 полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, ассоциированных с блоком неравновесия по сцеплению Г84848543, блоком неравновесия по сцеплению г§13387042 и блоком неравновесия по сцеплению Г83803662, где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на риск развития по меньшей мере второй первичной опухоли. В одном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из маркеров, приведенных в любой из табл. 10, 15 и 19. В другом воплощении по меньшей мере один маркер ассоциирован с блоком неравновесия по сцелпению г§4848543. В одном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы, состоящей из полиорфных маркеров, указанных в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В другом воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению, характеризуемом значениями г² выше 0,2, с маркером г§4848543. В следующем воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, указанных в табл. 7, 8 и 10. В следующем воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, указанных в табл. 10. В следующем воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер ассоциирован с геном 8ТЕАР3/Т8АР6. В предпочтительном воплощении маркером является г§4848543. В других воплощениях выполняются дополнительные этапы оценки частоты по меньшей мере одного гаплотипа индивида. Этот по меньшей мере один гаплотип в одном воплощении выбран из группы гаплотипов, указанных в табл. 7, 8 и 9. В других воплощениях также проводится оценка факторов риска рака молочной железы, имеющих высокую пенетрантность, таких как ВК.СА2 999бс15.

Фенотип рака молочной железы, по изобретению, согласно данному описанию, в определенных воплощениях может быть выбран из всех форм рака молочной железы всех форм, первичномножественного рака молочной железы, рака молочной железы с ранним началом заболевания или другого принятого в медицине определения рака молочной железы. В другом воплощении фенотипом, ассоциированным с раком молочной железы, является суммарный семейный анамнез (от англ. ыцпшсб ГашПу Ыйогу).

В конкретных воплощениях способов, применений, наборов или устройств по изобретению, по данному описанию, человеческим индивидом, которому проводится оценка, является женщина.

Все маркеры по данному описанию, подходящие для оценки предрасположенности к раку молочной железы, могут применяться в различных способах, наборах, устройствах и применениях по данному описанию. Таким образом, в определенных воплощениях по меньшей мере один полиморфный маркер, подходящий для осуществления изобретения, может быть выбран из группы, состоящей из полиморфных маркеров, указанных в табл. 20, 21 и 22, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В другом воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, указанных в табл. 10, 15 и 19, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В определенных воплощениях по меньшей мере один полиморфный маркер расположен в составе геномного сгемента с последовательностью, приведенной в любой из 8ЕО ΙΌ N0:4, 8ЕО ΙΌ N0:5 и 8Е0 ΙΌ N0:6. В одном предпочтительном воплощении по меньшей мере один маркер в составе 8Е0 ГО N0:4 выбран из маркеров, приведенных в табл. 20. В другом предпочтительном воплощении по меньшей мере один маркер в составе 8Е0 ГО N0:5 выбран из маркеров, приведенных в табл. 21. В следующем предпочтительном воплощении по меньшей мере один маркер в составе 8Е0 ГО N0:6 выбран из маркеров, приведенных в табл. 22. В следующем воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, указанных в табл. 7, 8, 10, 14, 15, 18 и 19. В другом воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению, характеризуемом значениями г² выше 0,2, с маркером щ4848543 (8Ер ГО N0:1), щ3803662 (8Ер ГО N0:3) или Щ13387042 (δΙΤ) ГО N0:2). В предпочтительном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из г§4848543 (8Е0 ГО N0:1), Г53803662 (8Е0 ГО N0:3) и Щ13387042 (8Е0 ГО N0:2). В другом предпочтительном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер представляет собой г§4848543 (8Е0 ГО N0:1). В другом предпочтительном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер представляет собой Е Г53803662 (8Е0 ГО N0:3). В следующем предпочтительном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер представляет собой 13387042 (8Е0 ГО N0:2). В следующем воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер ассоциирован (т.е. находится в неравновесии по сцеплению) с геном 8ТЕЛР3/Т8ЛР6, геном Б0С643714 и/или геном ТNΚС9. В одном таком воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер расположен в составе гена 8ТЕАР3/Т8АР6, гена Б0С643714 и/или гена ТNΚС9. В другом предпочтительном воплощении по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из Г54848543, Щ13387042, Щ3803662, Щ12922061, Щ4784227 и Г817271951.

В определенных способах, применениях, наборах или устройствах по изобретению наличие по меньшей мере одного аллеля или гаплотипа указывает на повышенную предрасположенность к раку молочной железы. В других способах по изобретнию наличие по меньшей мере одного гаплотипа указывает на пониженную предрасположенность к раку молочной железы. Повышенная предрасположенность к раку молочной железы в одном воплощении обусловлена составом гаплотипа, выбранного из группы состава гаплотипов, состоящей из:

(ί) щ8955398 аллель 2, г§4848543 аллель 1, г§6759589 аллель 1, г§838066 аллель 2, г§838100 аллель 3,

- 7 019953 гк838086 аллель 1, гк12711924 аллель 1 и гк3731603 аллель 4;

(ίί) гк8955398 аллель 4, гк4848543 аллель 1, гк6759589 аллель 1, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 3, гк838086 аллель 1, гк12711924 аллель 1 и гк3731603 аллель 4;

(ίίί) гк8955398 аллель 4, гк4848543 аллель 1, гк6759589 аллель 1, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 3, гк838086 аллель 2, гк12711924 аллель 1 и гк3731603 аллель 4;

(ίν) гк8955398 аллель 2, гк4848543 аллель 1, гк6759589 аллель 1, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 3, гк838086 аллель 2, гк12711924 аллель 1 и гк3731603 аллель 3;

(ν) гк8955398 аллель 4, гк4848543 аллель 1, гк6759589 аллель 1, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 3, гк838086 аллель 1, гк12711924 аллель 1 и гк3731603 аллель 3;

(νί) гк8955398 аллель 2, гк4848543 аллель 1, гк6759589 аллель 1, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 3, гк838086 аллель 1, гк12711924 аллель 1 и гк3731603 аллель 4.

В другом воплощении повышенная предрасположенность к раку молочной железы обусловлена составом гаплотипа, выбранного из группы состава гаплотипов, состоящей из:

(ί) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель 3, гк6716542 аллель 1, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 1, гк13011060 аллель 3;

(ίί) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель 3, гк6716542 аллель 3, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 2, гк6435959 аллель 4, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 3, гк13011060 аллель 3;

(ίίί) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 2, гк10171745 аллель 3, гк6716542 аллель 3, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 2, гк6435959 аллель 4, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 3, гк13011060 аллель 3;

(ίν) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель З, гк6716542 аллель 3, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 3, гк13011060 аллель 3;

(ν) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель 1, гк6716542 аллель 3, гк4491709 аллель 2, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 1, гк13011060 аллель 3;

(νί) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель З, гк6716542 аллель 3, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 2, гк6435959 аллель 4, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 3, гк13011060 аллель 1;

(уИ)гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель З, гк6716542 аллель 1, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 1, гк13011060 аллель 1;

(νίίί) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 2, гк10171745 аллель 3, гк6716542 аллель 1, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 1, гк13011060 аллель 3;

(ίχ) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 4, гк10171745 аллель 3, гк6716542 аллель 1, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 3, гк13011060 аллель 1;

(χ) гк10191184 аллель 3, гк6435957 аллель 2, гк10171745 аллель 3, гк6716542 аллель 3, гк4491709 аллель 4, гк12621130 аллель 1, гк6735174 аллель 1, гк6435959 аллель 2, гк2372943 аллель 3, гк13387042 аллель 1, гк10490444 аллель 1, гк13011060 аллель 3.

В предпочтительном воплощении по меньшей мере один аллель или гаплотип, обусловливающий повышенный риск рака молочной железы, представляет собой аллель 1 гк4848543. В следующих воплощениях повышенный риск характеризуется значениями относительного риска или отношения шансов по меньшей мере 1,2, включая риск по меньшей мере 1,25, риск по меньшей мере 1,3, риск по меньшей мере 1,4, риск по меньшей мере 1,5, риск по меньшей мере 1,6, риск по меньшей мере 1,7 и риск по меньшей мере 2,0.

В других определенных воплощениях изобретения наличие по меньшей мере одного аллеля или гаплотипа указывает на пониженную предрасположенность (пониженный риск) к раку молочной железы. По меньшей мере один аллель или гаплотип может, например, быть выбран из группы аллелей маркеров и гаплотипов, указанных в табл. 8, 9, 13, 14 и 18, имеющих значения относительного риска (ВВ) или отношения шансов (ОВ) менее одного. В одном воплощении по меньшей мере один аллель указывающий на пониженную предрасположенность к раку молочной железы, представлен в составе гаплотипов, выбранном из группы состава гаплотипов, состоящей из:

(ί) гк895398 аллель 2, гк4848543 аллель 2, гк6759589 аллель 3, гк838066 аллель 4, гк838100 аллель 1, гк838086 аллель 1, гк12711924 аллель 3 и гк3731603 аллель 3;

(ίί) гк895398 аллель 2, гк4848543 аллель 2, гк6759589 аллель 3, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 1, гк838086 аллель 1, гк12711924 аллель 3 и гк3731603 аллель 3;

(ίίί) гк895398 аллель 2, гк4848543 аллель 2, гк6759589 аллель 1, гк838066 аллель 2, гк838100 аллель 3, гк838086 аллель 2, гк12711924 аллель 3 и гк3731603 аллель 3;

- 8 019953 (ίν) Γδ895398 аллель 2, г§4848543 аллель 2, г§6759589 аллель 3, г§838066 аллель 4, г§838100 аллель 3, Г5838086 аллель 2, г§12711924 аллель 3 и г§3731603 аллель 3;

(ν) г§895398 аллель 2, г§4848543 аллель 2, г§6759589 аллель 3, г§838066 аллель 2, г§838100 аллель 3, г§838086 аллель 2, г§12711924 аллель 3 и г§3731603 аллель 3;

(νί) г§895398 аллель 2, г§4848543 аллель 2, г§6759589 аллель 1, г§838066 аллель 2, г§838100 аллель 3, Г5838086 аллель 1, Г812711924 аллель 1 и г§3731603 аллель 4;

(νίί)Γ§895398 аллель 2, г§4848543 аллель 2, г§6759589 аллель 3, г§838066 аллель 4, г§838100 аллель 3, г§838086 аллель 1, г§12711924 аллель 1 и г§3731603 аллель 4;

(νίίί) г§895398 аллель 2, г§4848543 аллель 2, г§6759589 аллель 1, г§838066 аллель 2, г§838100 аллель 3, г§838086 аллель 1, г§12711924 аллель 3 и г§3731603 аллель 3; и (ίχ) г§895398 аллель 2, г§4848543 аллель 2, г§6759589 аллель 3, г§838066 аллель 2, г§838100 аллель 1, Г5838086 аллель 1, Г812711924 аллель 1 и г§3731603 аллель 4.

В другом воплощении пониженная предрасположенность к раку молочной железы обусловлена составом гаплотипа, выбранного из группы состава гаплотипов, состоящей из:

(ί) Г510191184 аллель 3, г§6435957 аллель 2, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 2, Г812621130 аллель 3, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 2, г§2372943 аллель 3, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 1, Г813011060 аллель 3;

(ίί) Г810191184 аллель 3, г§6435957 аллель 4, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 4, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1,

Г86435959 аллель 4, г§2372943 аллель 1, г§13387042 аллель 3, г§10490444 аллель 3, Г813011060 аллель 1;

(ш) Г510191184 аллель 1, г§6435957 аллель 4, Щ10171745 аллель З, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 4, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 4, г§2372943 аллель 1, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 3, Г813011060 аллель 1;

(ΐν)Γ810191184 аллель 3, г§6435957 аллель 2, Щ10171745 аллель З, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 2, Г812621130 аллель 3, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 2, г§2372943 аллель 3, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 1, Г813011060 аллель 1;

(ν) Г510191184 аллель 1, г§6435957 аллель 2, Щ10171745 аллель 1, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 2, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 2, г§2372943 аллель 3, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 3, Г813011060 аллель 3;

(νΐ)Γ810191184 аллель 3, г§6435957 аллель 4, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 4, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 4, г§2372943 аллель 1, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 3, Г813011060 аллель 3;

(νΐΐ)Γ810191184 аллель 1, г§6435957 аллель 2, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 4, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 4, г§2372943 аллель 1, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 3, Г813011060 аллель 1;

(νίίί) Г510191184 аллель 3, г§6435957 аллель 4, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 4, Щ12621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 2, г§2372943 аллель 3, Щ13387042 аллель 3, Щ10490444 аллель 1, Г813011060 аллель 3;

(ίχ) Г810191184 аллель 3, г§6435957 аллель 2, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 2, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 2, г§2372943 аллель 3, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 1, Г813011060 аллель 3;

(χ) Г510191184 аллель 1, г§6435957 аллель 2, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 2, Г812621130 аллель 3, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 2, г§2372943 аллель 3, Щ13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 1, Г813011060 аллель 3;

(χί) Г810191184 аллель 3, г§6435957 аллель 4, Щ10171745 аллель 3, г§6716542 аллель 3, г§4491709 аллель 4, Г812621130 аллель 1, г§6735174 аллель 1, г§6435959 аллель 4, г§2372943 аллель 3, г§13387042 аллель 3, Г810490444 аллель 3, Г813011060 аллель 1.

В определенных воплощениях пониженная подверженность характеризуется значениями риска (относительного риска или отношения шансов) менее 0,9, включая риск менее 0,8, а риск менее 0,7, риск менее 0,6 и риск менее 0,5.

В принципе, оценка маркеров и гаплотипов, для которых здесь была показана ассоциация с раком молочной железы, может использоваться в комбинации с анализом образца, содержащего геномную ДНК человеческого индивида или массива данных генотипа, полученного у человеческого индивида, на наличие или отсутствие по меньшей мере одного связанного с риском алелля по меньшей мере одного варианта, связанного с риском рака молочной железы, не находящегося в неравновесии по сцеплению с каким-либо из маркеров, приведенных в табл. 10, 15 и 19. Другими словами, генетические факторы риска, не сцепленные с какими-либо факторами риска, описываемыми здесь, могут использоваться в комбинации с факторами риска по данному изобретению для получения оценки совокупного риска индивида на основании множества факторов риска. Более того, анализ более чем одного фактора риска, ассоциированного по данному описанию с раком молочной железы, может использоваться в комбинации для получения совокупного общего риска. В одном таком воплощении анализ г§4848543 (ЗЕО Ш N0:1), Г53803662 (ЗЕО Ш N0:3) и Щ13387042 (ЗЕО Ш N0:2) выполняется для индивида или образца, взятого у

- 9 019953 индивида и производится анализ совокупного риска. В другом воплощении производится анализ Г53803662 (8ЕЦ ΙΌ N0:3) и ^13387042 (8ЕЦ ΙΌ N0:2).

Способы, применения, наборы и устройства по изобретению могут в некоторых воплощениях также включать анализирование информации, не относящейся к генетической, для оценки риска, диагностики или определения прогноза у индивида. Подобная информация, не относящаяся к генетической, в определенных воплощениях может включать возраст, пол, этническую принадлежность, социоэкономический статус, предшествующий диагноз заболевания, медицинский анамнез субъекта, семейный анамнез рака молочной железы, биохимические показатели и/или клинические показатели. Оценка общего риска по генетическим и негенетическим факторам риска может осуществляться с применением способов, известных специалистам.

Неравновесие по сцеплению (НС) между сегментами генома (например, маркерами) в определенных воплощениях изобретения характеризуется определенными значениями показателя неравновесия по сцеплению. Согласно описанию ниже, неравновесие по сцеплению может характеризоваться конкретными численными значениями показателей НС, г² и |Ό'|. В одном предпочтительном воплощении неравновесие по сцеплению характеризуется значениями г² выше 0,1. В другом предпочтительном воплощении неравновесие по сцеплению характеризуется значениями г² выше 0,2. Также возможны другие пороговые значения г², включая 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99, но не ограничиваясь ими. В другом предпочтительном воплощении неравновесие по сцеплению характеризуется значениями |Ό'| выше 0,5. В другом предпочтительном воплощении неравновесие по сцеплению характеризуется значениями |Ό'| выше 0,8. Также возможны другие пороговые значения |Ό'|, включая 0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 и 0,99, но не ограничиваясь ими. В определенных воплощениях неравновесие по сцеплению характеризуется численными пороговыми значениями либо для |Ό'|, либо для г². В одном таком воплощении неравновесие по сцеплению характеризуется численными пороговыми значениями выше 0,8 для |Ό'| и выше 0,2, для г² или обоими. В определенных воплощениях НС определяется в конкретной популяции. В некоторых таких воплощениях популяция выбрана из европеоидной, китайской, японской и африканской популяций. В одном воплощении популяцией является европеоидная популяция СЕРН.

В некоторых других воплощениях способов, применений, устройств или наборов по изобретению индивид имеет определенное происхождение. В одном воплощении происхождение выбрано из черного африканского происхождения, европеоидного происхождения и китайского происхождения. В другом воплощении происхождение представляет собой происхождение от черных африканцев. В другом воплощении происхождение представляет собой происхождение от афроамериканцев. В другом воплощении происхождение представляет собой европеоидное происхождение. В определенном воплощении происхождение указывается самостоятельно индивидом, проходящим генетический анализ или генотипирование. В других воплощениях происхождение определяется с помощью генетического тестирования, включающего определение по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты индивида, где наличие или отсутствие аллеля указывает на происхождение индивида.

Краткое описание графических материалов

Описанные выше и другие объекты, признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего далее более подробного описания предпочтительных воплощений данного изобретения

Фиг 1 отображает геномную структуру региона хромосомы 2, включающего маркер г§4848543, который, как здесь показано, ассоциирован с раком молочной железы. Маркеры в неравновесии по сцеплению с г§4848543 также находятся в составе этого региона, обозначаемого здесь как блок неравновесия по сцеплению г§4848543. Регион характеризуется выраженным неравновесием по сцеплению (высокое НС), а его границы характеризуются участками с высокой рекомбинацией. Маркеры в неравновесии по сцеплению с г§4848543, характеризуемом значениями показателя НС г² выше 0,2 в европеоидной популяции СЕи НарМар, охватывают позиции 120,023,583 - 120,117,062 на хромосоме 2 в N031 Вш1б 34, и позиции 119,644,908-119,738,387 пн в NСВI Вш1б 36. В обоих этих формах последовательностей, регион, охватываемый этими маркерами, составляет 93,479 пн.

Фиг. 2 отображает геномную структуру региона на хромосоме 2, включающего маркер г§13387042. Маркеры в неравновесии по сцеплению с г§13387042 также находятся в составе данного региона, обозначаемого здесь как блок неравновесия по сцеплению г§13387042. Регион характеризуется выраженным неравновесием по сцеплению (высокое НС), а его границы характеризуются участками с высокой рекомбинацией. Маркеры в неравновесии по сцеплению с г§13387042, характеризуемом значениями показателя НС г² выше 0,2 в европеоидной популяции СЕИ НарМар, охватывают позиции 218,059,508 -218,141,061 на хромосоме 2 в NСВI Вш1б 34, и позиции 217,565,211-217,646,764 пн в NСВI Вш1б 36. В обоих этих формах последовательностей, регион охватывает 81,553 пн.

Фиг. 3 отображает геномную структуру региона хромосомы 16, включающего маркер г§3803662. Маркеры в неравновесии по сцеплению с г§3803662 также находятся в составе данного региона, обозначаемого здесь как блок неравновесия по сцеплению г§3803662. Регион характеризуется выраженным не

- 10 019953 равновесием по сцеплению (высокое НС), а его границы характеризуются участками с высокой рекомбинацией. Маркеры в неравновесии по сцеплению с гз3803662, характеризуемом значениями показателя НС г² выше 0,2 в европеоидной популяции СЕИ НарМар, охватывают позиции 52,314,403 - 52,413,602 на хромосоме 16 в ЫСВ1 ВшМ 34 и позиции 51,093,311-51,192,501 пн в ЫСВ1 ВшМ 36. В обеих этих формах последовательностей регион охватывает 99,190 пн.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Ниже следует описание предпочтительных воплощений изобретения.

Данное изобретение описывает полиморфные варианты и гаплотипы, для которых была обнаружена ассоциация с раком молочной железы. Было установлено, что определенные аллели конкретных полиморфных маркеров (например, маркера гз4848543, маркера Г813387042 и маркера гз3803662, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, маркеров, ассоциированных с блоком неравновесия по сцеплению Γδ4848543, блоком неравновесия по сцеплению Г813387042 и блоком неравновесия по сцеплению Γδ3803662, маркеры по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, например, маркеры, указанные в таблице 10, 15 и 19) и гаплотипы, включающие такие аллели, ассоциированы с раком молочной железы. Такие маркеры и гаплотипы могут применяться для контроля за риском рака молочной железы, как будет более подробно описано далее. Следующие воплощения изобретения включают наборы для оценки наличия или отсутствия определенных аллелей данных маркеров.

Определения

Последовательности нуклеиновых кислот изображены слева направо в направлении от 5' к 3', если не указано иначе. Численные диапазоны, перечисленные в спецификации, включают значения, определяющие диапазон, и включают каждое целое значение или дробное значение в составе определенного диапазона. Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, в котором они обычно используются специалистами в области, к которой относится изобретение.

Следующие термины будут в настоящем контексте иметь указанные значения:

Полиморфный маркер, иногда обозначаемый как маркер в данном описании, относится к полиморфному сайту генома. Каждый полиморфный маркер имеет по меньшей мере две разновидности последовательности, характерные для определенных аллелей полиморфного сайта. Таким образом, генетическая ассоциация с полиморфным маркером подразумевает, что существует ассоциация по меньшей мере с одним специфическим аллелем этого конкретного полиморфного маркера. Маркер может включать любой аллель любого вида варианта, обнаруженного в геноме, включая ОНП, микросателлиты, инсерции, делеции, дупликации и транслокации.

Аллель относится к нуклеотидной последовательности заданного локуса (позиции) на хромосоме. Аллель полиморфного маркера таким образом относится к составу (т.е. последовательности) маркера на хромосоме. Геномная ДНК индивида содержит два аллеля (например, аллель-специфичные последовательности) для любого заданного полиморфного маркера, репрезентативного для каждой копии маркера на каждой хромосоме. Коды нуклеотидов, используемые здесь в последовательностях, следующие: А = 1, С = 2, С = 3, Т = 4. Для аллелей микросателлитов в качестве референсной использована выборка СЕРН (Сеп1ге б'ЕШбез би Ро1утогрЫзше Ниташ, генобанк, выборка СЕРН 1347-02), наиболее короткий аллель каждого микросателлита в данной выборке обозначен как 0, а все другие аллели в других выборках пронумерованы относительно данной последовательности. Так, например, аллель 1 является на 1 пн длиннее, чем самый короткий аллель в выборке СЕРН, аллель 2 является на 2 пн длиннее, чем самый короткий аллель в выборке СЕРН, аллель 3 является на 3 пн длиннее, чем самый короткий аллель в выборке СЕРН, и т.д., а аллель -1 является на 1 пн короче, чем самый короткий аллель в выборке СЕРН, аллель -2 является на пн короче, чем самый короткий аллель в выборке СЕРН и т.д.

Возможные вариации в последовательности, приведенные здесь, находятся в соответствии с предложенными ШРАС-ШВ. Данные коды совместимы с кодами, используемыми в базах данных ЕМВЕ, СепВапк и Р!К

- 11 019953

νν	А или Т
в	С С или Т
ϋ	А С или Т
н	А С или Т
V	А С или 6
N	А С С или Т (любое основание)

Позиция нуклеотида, по которой возможно существование более одной последовательности в популяции (либо в естественной популяции, либо в искусственной популяции, например библиотеке синтетических молекул), обозначается здесь как полиморфный сайт.

Однонуклеотидный полиморфизм или ОНП представляет собой вариацию последовательности ДНК, возникающую, когда единичный нуклеотид в определенном положении в геноме отличается между представителями вида или между парами хромосом у индивида. Большинство ОНП имеют два аллеля. Каждый индивид в этом отношении является либо гомозиготным по одному аллелю полиморфизма (т.е. обе хромосомные копии индивида имеют одинаковые нуклеотиды в месте ОНП) или индивид является гетерозиготным (т.е. две сестринские хромосомы индивида содержат разные нуклеотиды). Номенклатура ОНП по данному описанию соответствует официальным идентификационным кодам (от англ. ВеГегепсе 8ΝΡ (гз) ΙΌ хбепИйсайоп !а§), приписанным каждому уникальному ОНП Национальным Центром по Биотехнологической Информации (от англ. Ыайопа1 Сеп1ег Гог ВЫ^сйпоЬдхса! 1пГогта!1оп, ЫСВ1).

Вариант по данному описанию относится к сегменту ДНК, отличающемуся от референсной ДНК. Маркер или полиморфный маркер по данному описанию представляет собой вариант. Аллели, отличающиеся от референсных, обозначаются здесь как аллели вариантов.

Микросателлит является полиморфным маркером, имеющим множественные малые повторы длиной от 2 до 8 нуклеотидов (например, повторы СА) в конкретном сайте, у которых число повторяющихся мотивов варьирует в общей популяции.

Индели представляют собой распространенную форму полиморфизма, включающую небольшую инсерцию или делецию, которая обычно имеет длину всего несколько нуклеотидов.

Гаплотип в данном описании относится к сегменту геномной ДНК, в пределах одной ната-ДНК, характеризующемуся специфической комбинацией последовательно расположенных аллелей. У диплоидных организмов, таких как человек, гаплотип включает одного представителя из пары аллелей по каждому полиморфному маркеру или локусу. В определенном воплощении гаплотип может включать два или более аллелей, три или более аллелей, четыре или более аллелей, или пять или более аллелей. Гаплотипы описываются здесь в контексте названия маркера и аллеля маркера в данном гаплотипе, например 1 гз4848543 или 1-гз4848543 означает 1 аллель (аллель А) маркера гз4848543, входящего в гаплотип, и является эквивалентом аллель 1 гз4848543 или аллель А гз4848543). Кроме того, коды аллелей в гаплотипе являются такими же, как в отдельных маркерах, т.е. 1 =А, 2 = С, 3 = О и 4 = Т.

Термин подверженность по данному описанию относится к индивиду (или группе индивидов), склонных к развитию рака молочной железы или способных в меньшей степени противостоять развитию рака молочной железы по сравнению со среднестатистическим индивидом. Термин включает как повышенную подверженность, так и пониженную подверженность. Так, определенные полиморфные маркеры и/или гаплотипы по изобретению в данном описании могут быть характерны для повышенной подверженности (т.е. повышенного риска) раку молочной железы, характеризуемой относительным риском (ОР) более одного или отношением шансов (ОШ) более одного. Возможно, маркеры и/или гаплотипы по изобретению характерны для пониженной подверженности (т.е. пониженного риска) сердечнососудистых заболеваний, характеризуемых относительным риском менее одного.

Термин и/или в данном контексте следует трактовать как указание на то, что подразумеваются либо один, либо оба из пунктов, соединенных таким термином. Другими словами, данный термин здесь нужно воспринимать в значении один или другой, или оба.

Термин ассоциированный с в данном описании сцепления генетических элементов (генов и/или маркеров) означает элементы, находящиеся в неравновесии по сцеплению. Предпочтительно термин должен использоваться для обозначения элементов, нахдящихся в неравновесии по сцеплению, характеризуемом значениями показателя неравновесия по сцеплению г² выше 0,2.

Термин переводная таблица в данном описании означает таблицу, приводящую в соответствие одну форму данных с другой или одну или более форм данных с прогнозируемым исходом, к которому относятся данные, например фенотип или признак. Например, переводная таблица может включать соответствие между аллельными данными по меньшей мере для одного маркера и определенным признаком или фенотипом, например диагнозом определенного заболевания, которое вероятно проявится у индивида, имеющего определенные аллельные данные или которое может проявиться у него с большей вероятностью, чем у индивида, не имеющего определенные аллельные данные. Переводные таблицы могут быть многомерными, т.е. они могут содержать информацию одновременно по нескольким аллелям отдельных маркеров или они могут содержать информацию о множестве маркеров, и они также могут включать другие факторы, например подробности о диагнозе заболеваний, информацию о расовой при

- 12 019953 надлежности, биомаркерах, биохимических показателях, способах терапии или лекарственных препаратах и т.д.

Компьютерные носители представляют собой носители для хранения информации, к которой можно получить доступ при помощи компьютера с использованием коммерчески доступных или созданных по заказу программ. Примеры компьютерных носителей включают блоки памяти (например, КАМ, КОМ, флэш-память, и т.д.), оптические носители информации (например, СИ-КОМ), магнитные носители (например, компьютерные жестие диски, гибкие диски и т.д.), перфокарты или другие коммерчески доступные носители. Для хранения или доступа к хранящейся информации, информация может быть перенесена между системой, представляющей интерес, и носителем, между компьютерами, либо между компьютерами и компьютерными носителями. Такое перенесение может быть электронным или с помощью других доступных методов, например ИК-связи, беспроводных соединений и т.д.

Образец нуклеиновой кислоты представляет собой образец, полученный у индивидов и содержащий нуклеиновую кислоту. В определенных воплощениях, т.е. для определения конкретных полиморфных маркеров и/или гаплотипов образец нуклеиновой кислоты содержит геномную ДНК. Такой образец нуклеиновой кислоты может быть получен из любого источника, содержащего геномную ДНК, включая как образец крови, образец амниотической жидкости, образец спинномозговой жидкости или образец ткани кожи, мышцы, буккальной слизистой или конъюнктивы, плаценты, желудочно-кишечного тракта или других органов.

Термин препарат, используемый при раке молочной железы в данном описании означает агент, который может применяться для облегчения или предупреждения симптомов, ассоциированных с раком молочной железы.

Термин нуклеиновая кислота, ассоциированная с раком молочной железы в данном описании означает нуклеиновую кислоту, которая, как было показано, ассоциируется с раком молочной железы. Термин включает описанные здесь маркеры и гаплотипы, а также маркеры и гаплотипы в сильном неравновесии по сцеплению (НС) с ними, но не ограничивается ими. В одном воплощении нуклеиновая кислота, ассоциированная с раком молочной железы, относится к определенному региону генома, например, блоку неравновесия по сцеплению, для которого обнаружена ассоциация с раком молочной железы по меньшей мере по одному полиморфному маркеру, расположенному в составе региона или ассоциированному (т.е. находящемуся в неравновесии по сцеплению) с регионом.

Термин все формы рака молочной железы или все формы РМЖ относится к индивидам с диагностированным раком молочной железы, независимо от конкретного подтипа рака молочной железы.

Термин умеренная предрасположенность к раку молочной железы или рак молочной железы УмерПред (от англ. Мебшт РгеФзрозйюп) относится к подтипу рака молочной железы. Чтобы фенотип подходил под это определение, требуется соответствие пробанда по меньшей мере одному из следующих критериев:

1. Пробанд является представителем группы случаев рака молочной железы, объединяющей 3 или более пораженных родственников, находящихся на генетическом расстоянии не более 3 мейотических делений (3М).

2. Пробанд является одним из пары пораженных родственников, находящихся на расстоянии не более 3М, у одного из которых диагноз был поставлен в возрасте 50 лет или младше.

3. Пробанд является одним из пары пораженных родственников, находящихся на расстоянии не более 3М, у одного из которых была диагностирована вторая первичная опухоль любого типа.

4. У пробанда была диагностирована вторая первичная опухоль любого типа.

Из 1600 исландских пациентов, вошедших в представленное здесь исследование, 653 отвечают критериям УмерПред (40,8%).

Термин первично-множественные опухоли молочной железы, или ПМ ОМЖ в данном описании означает случаи, когда наряду с постановкой первого диагноза рака молочной железы диагностируется по меньшей мере еще одна первичная опухоль, и как клинически, так и гистологически подтверждается, что две опухоли являются независимыми первичными опухолями, развивающимися одновременно или последовательно с первоначально диагностированной опухолью молочной железы, и возникают контралатерально или ипсилатерально.

Термин индекс семейного анамнеза (ИСА) в данном описании определяется по количеству имеющих рак молочной железы родственников у пробанда с заболеванием. Для каждого пробанда индекс, равный 1, присваивается за каждого пораженного родственника первой степени, 0,5 за каждого пораженного родственника второй степени и 0,25 за каждого родственника третьей степени. Общая сумма, полученная таким образом, по всем пораженным родственникам, представляет суммированный индекс семейного анамнеза, или ИСА.

Термин блок НС гз4848543 или блок неравновесия по сцеплению гз4848543 в данном описании означает регион генома на хромосоме 2 между позициями 119,987,002 и 120,129,001 по ΝΟΒΙ (Иа11опа1 Сеп1ег £ог Вю1еейпо1о§у 1п£огта1юп) Вш1б 34, и между позициями 119,608,327 и 120,129,001 по ΝΟΒΙ Вш1б 36. Блок НС Г84848543 имеет размер 141,999 пн.

Термин ген БТЕАР3 или ген ТБАР6 в данном описании означает ген 6-трансмембранного эпи

- 13 019953 телиального антигена простаты 3 (от англ. 81х-1гап8тетЬгапе ΕρίΐΗοΙίαΙ Лпйдеп оГ Йе Рго51а1с или 8ТЕЛР3), также обозначаемый геном пути активации опухолевых супрессоров 6 (от англ. Титог 8ирргс55ог Ас1|уа1ей Райгау 6 или Т8ЛР6). Ген располагается на хромосоме 2с.|14.2 и охватывает позиции с 120076561 по 120118373 (N031 ВшИ 34).

Термин блок НС г§13387042, или блок неравновесия по сцеплению г§13387042 в данном описании означает блок неравновесия по сцеплению (НС) на хромосоме 2 между позициями 218,062,001 и 218,141,002 по NСВI (№йопа1 СегИег Гог Вю1ес11по1оду 1пГогта1юп) Βυίΐά 34. Блок НС охватывает 79,001 пар оснований (ВшИ 34).

Термин блок НС г§3803662, или блок неравновесия по сцеплению г§3803662 в данном описании означает блок неравновесия по сцеплению (НС) на хромосоме 16 между позициями 52,291,041 и 52,436,127 по NСВI (№1Бопа1 Сейег Гог Вю1есБпо1о§у 1пГогтаБоп) ВшИ 34. Блок НС охватывает 145,086 пар оснований (ВшИ 34).

Термин гаплотип Эа1у в данном описании означает 2-маркерные гаплотипы в составе заданного блока НС (регион высокого НС), которые идентифицированы в качестве хороших суррогатов (г>0.8) для дополнительного набора ОНП, типированных в проекте НарМар. Эти дополнительные ОНП имеют частоту минорного аллеля >5% в выборках ИТАН СЕРН (СЕИ) НарМар, и они не представлены в составе чипа Нар300 8ИР и также они не маркируются ОНП, имеющимися на чипе [Ре'ег, е1 а1., (2006), №11 СепеР 38, 663-7].

Термин рак молочной железы, позитивный по эстрогеновым рецепторам, или ЭР-позитивный рак молочной железы, в данном описании относится к образцу ткани опухоли молочной железы, который считается положительным по экспрессии эстрогенового рецептора. Экспрессия эстрогенового рецептора может, например, определяться в радиоиммуном анализе или методом иммуногистохимии. Положительным считается уровень > 10 фмоль/мг, определенный радиоиммунометрически или > 10% ядер, оцененных положительными при иммуногистохимическом определении.

Термин рак молочной железы, позитивный по прогестероновым рецепторам или ПР-позитивный рак молочной железы в данном описании относится к образцу ткани опухоли молочной железы, который считается положительным по экспрессии прогестеронового рецептора. Экспрессия прогестеронового рецептора может, например, определяться в радиоиммуном анализе или методом иммуногистохимии. Положительным считается уровень > 10 фмоль/мг, определенный радиоиммунометрически или > 10% ядер, оцененных положительными при иммуногистохимическом определении.

В ходе ассоциативного анализа популяции индивидов с диагностированным раком молочной железы было обнаружено, что конкретные аллели конкретных полиморфных маркеров ассоциированы с раком молочной железы. Общегеномный анализ вариантов, ассоциированных с раком, выявил ассоциацию рака молочной железы с двумя различными регионами на хромосоме 2 в составе сегментов С11г2с|14 и ΟΐΓ2ς35, а также в составе региона на хромосоме 16 (С11г16с|12). Для определенных маркеров и гаплотипов в этих регионах была обнаружена ассоциация с повышенным риском рака молочной железы.

Как показано в табл. 1, было обнаружено, что аллель А маркера г§4848543 на хромосоме 2с.]14.2 (также обозначаемый аллель Л г§4848543 или 1 аллель г§4848543 или Л-г§4848543) ассоциирован с повышенным риском рака молочной железы. При анализе фенотипа рака молочной железы УмерПред у 1598 пациентов в сравнении с 4477 популяционными контролями, не имеющими рака, оцениваемое значение относительного риска (ВВ) составило 1,42, при значении р 8,3 х10^-8. После коррекции на множественность сравнений (317 089 ОНП маркеров, протестированных при помощи чипа для общегеномного сканирования, использованного в эксперименте, значение р составило 0,026, т.е. ассоциация является достоверной на общегеномном уровне. Ассоциация с более общим фенотипом все формы РМЖ несколько слабее, значение ВВ составляет 1,16 (см. Табл. 1). Данные результаты были воспроизведены на независимой исландской когорте лиц с раком молочной железы.

Маркер г§4848543 расположен в составе региона, обозначаемого здесь как блок НС г§4848543. Данный маркер ОНП и маркеры, сцепленные с данным маркером (например, маркеры, указанные в табл. 10), могут применяться в способах по данному изобретению. Благодаря существованию паттерна локального неравновесия по сцеплению в человеческом геноме, существует множество полиморфных маркеров, находящихся в сильном НС с г§4848543, для которых здесь была продемонстрирована ассоциация с раком. Эти сцепленные маркеры (например, маркеры, указанные в табл. 10), включая известные ОНП или другие полиморфные маркеры, например, микросателлиты или индели, а также другие сцепленные ОНП или другие полморфные маркеры могут, таким образом, применяться поодиночке или в комбинации, в качестве суррогатных маркеров для выявления ассоциации с раком молочной железы, по данному описанию. В частности, ожидается, что другие полиморфные маркеры, расположенные в составе блока НС г§4848543, могут применяться в качестве суррогатных маркеров в способах по изобретению.

Второй регион на хромосоме 2 (2с|35) был идентифицирован в ходе общегеномного ассоциативного исследования. Было обнаружено, что аллель А маркера г§13387042 (также обозначаемый аллель Л Г513387042 или 1 аллель г§13387042 или Л-г§13387042) ассоциирован с повышенным риском рака молочной железы (см. табл. 11). Данный ОНП расположен на хромосоме 2с.|35, на определенном расстоянии от

- 14 019953 локуса 8ТЕЛР3/Т8ЛР6. Анализ 2181 индивида с раком молочной железы (все формы РМЖ) и 12 441 популяционного контроля, показал, что аллель А т§13387042 обусловливает риск, равный 1,19, со значением р 4,0х10^-5. Риск (ПК) при раке молочной железы УмерПред оказался сравнимым с таковым при Апу ВС. Суррогатные маркеры, которые также могли применяться для выявления ассоциации с Т513387042, указаны в табл. 15.

Данные результаты были воспроизведены на второй независимой выборке из населения Исландии (583 случая и 7966 контролей), и была получена оценка значения относительного риска КК для аллеля А Т513387042, ассоциированного с фенотипом все формы РМЖ в этой второй группе, равная 1,20 (значение Р_со1Т = 3,8х10^-3). Таким образом, исходные результаты были достоверно воспроизведены на независимой исландской выборке с очень близкой точечной оценкой относительного риска КК, и совокупным значением Р_со1Т 2,0х 10^-7, что очень близко к уровню значимости после коррекции Бонферрони на 317089 протестированных ОНП. Наблюдаемая частота и относительный риск для варианта аллели А Т513387042 соответствует оцененному популяционному атрибутивному риску в исландской популяции, равному 15,6%.

Исследование по воспроизведению на испанской и шведской выборках подтвердило данные результаты. При анализе 446 случаев с раком молочной железы и 977 контрольных образцов из Испании было получено значение КК, равное 1,21 (значение Р 1,8х10^-2; табл. 11). Частота варианта А-Щ13387042 была выше в контрольных образцах Испании, что позволило предположить, что более широкая распространенность варианта способствует большему генетическому грузу в отношении рака молочной железы в популяциях испанского происхождения. Кроме того, были проанализированы две шведские когорты шведская семейственная и шведская консекутивная. В шведской консекутивной когорте был продемонстрирован значимый КК рака молочной железы, составлявший 1,31 (значение Р= 2,0х10^-4), тогда как в шведской семейственной когорте оценка относительного риска составила 1,11, что было статистически недостоверно. Тем не менее, в совокупности на объединенных шведских когортах была получена значимая оценка относительного риска, равная 1,22 (значение Р= 8,1х10^-4).

Оценки у исландской, испанской и шведской когорт были объединены при совместном анализе, по методу Мантеля-Хензеля. В результате был получена оценка относительного риска, равная 1,20, и значение Р, равное 3,8х10^-11. Это значительно ниже порогового уровня значимости на уровне генома при использовании метода Бонферрони для коррекции на 317 089 протестированных ОНП. Таким образом, было сделано заключение, что аллель А т§13387042 обусловливает достоверный и воспроизводимый риск рака молочной железы в нескольких популяциях европейского происхождения. Совокупный популяционный атрибутивный риск был оценен как равный 16,4%.

Последующий общегеномный анализ ОНП по данным, полученным для 1600 пациентов с раком молочной железы и 11563 контролей, обнаружил, что аллель Т ОНП т§3803662 (Т-щ3803662; т§3803662 аллель Т) обусловливает 1,23-кратное оцениваемое повышение риска для Апу ВС (табл. 16). Данные результаты были подтверждены на второй независимой когорте 594 исландских пациентов с раком молочной железы и 1433 контролей. При объединении данных по этим двум исландским выборкам была получена оценка относительного риска 1,23 и начение Р 2,8х10^-7 при коррекции на родство между индивидами. Это соответствовало оцениваемому популяционному атрибутивному риску, равному 10,1% (табл. 16).

Суррогатные маркеры, которые могут применяться для выявления ассоциации с т§3803662 указаны в табл. 19.

Был проведен анализ воспроизводимости данных результатов в шведской и испанской когортах, описанных выше, а также анализ 558 случаев с раком молочной железы и 1384 контролей из г. Неймеген, Голландия. Как показано в табл. 16, достоверно повышенный риск для алелля Т т§3803662 наблюдался во всех трех из перечисленных дублирующих когорт. При совместном анализе этих трех не-исландских дублирующих когорт оценка совокупного относительного риска составила 1,35, а значение Р 5,1х10^-12. При совместном анализе исландской и дублирующих когорт оценка совокупного относительного риска составила 1,28 при значении Р 2,7х10^-17. Это значительно ниже порогового уровня значимости на уровне генома при коррекции на количество протестированных ОНП. Соответствующая оценка совокупного популяционного атрибутивного риска составила 13,4% (табл. 16).

Была изучена ассоциация между аллелем А Щ13387042 и аллелем Т га3803662, статусом по эстрогеновым рецепторам (ЭР) и прогестероновым рецепторам (ПР). Значительный риск рака молочной железы, связанный с аллелем А Щ13387042 и аллелем Т га3803662, наблюдался в пределах группы пациентов с диагностированными ЭР-позитивными опухолями и разница между значениями отношения шансов ОК для ЭР-позитивных и ЭР-негативных опухолей также была достоверной (табл. 25). Также наблюдалась тенденция к существованию риска рака молочной железы преимущественно среди пациентов с диагностированными ПР-позитивными опухолями.

Биология 8ТЕАР3/Т8АР6

ДНК 8ТЕАР3/Т8АР6 была впервые получена из одной из мРНК, индуцированных активацией р53 в клетках линии миеломы грызунов ЬТК6, содержащих температуро-чувствительный ген р53 |Лш50п. с1 а1., (1996), Ргос Ν;Π1 Асаб 8с1 И8А, 93, 3953-7]. Данная форма у грызунов получила название гена пути

- 15 019953 активации опухолевых супрессоров (от англ. Титоиг §иррге88ог Асйуа!ей РаШхтау 6 или Т8АР6). Позднее было подтверждено, что данный ген включается при активации р53 в клетках ЬТК6 [Раккег е! а1., (2003), Ргос №111 Асай δα И8А, 100, 2284-9]. Его аналог у крыс, обозначенный рНуйе, был выделен из клеточной линии опухоли простаты в ходе экспериментов, проводимых с целью выявления генов, поразному экспрессируемых в двух клеточных линиях с различной склонностью к метастазированию [Κίпа1йу и 8(е1пег, (1999), ЭНА Се11 ΒίοΙ, 18, 829-36]. Было показано, что кДНК рНуйе вызывает апоптоз в клеточных линиях простаты крысы и человека и ксенотрансплантатах [Ктпа1йу е! а1., (2000), Сап То Кадаки Куоко, 27 8ирр1 2, 215-22; 81етет е! а1., (2000), Сапсег Кек, 60, 4419-25]. Позже было показано, что апоптоз, вызванный рНуйе, запускается через путь каспазы-3 [2йапд е! а1., (2001), 0псодепе, 20, 5982-90]. Подавление 8ТЕАР3/Т8АР6 также было связано с прогрессированием гепатоцеллюлярной карциномы [Сои1оиагп, е! а1., (2005), I Нера!о1, 42, 860-9].

Раккег е! а1. выделили кДНК человеческого аналога 8ТЕАР3/Т8АР6 и показали, что мРНК можно было индуцировать при активации р53 в клетках линии карциномы молочной железы МСЕ7 [Раккег е! а1., (2003), Ргос №111 Асай δα И8А, 100, 2284-9]. Индукция р53 происходит на уровне транскрипции и опосредуется консервативным р53-отвечающим элементом в промоторе 8ТЕАР3/Т8АР6 между нуклеотидами -478 и -357 (последовательность получила кодом доступа АУ214461)[Раккет е! а1., (2003), Ргос Асай δα ИЗА, 100, 2284-9]. Белок был охарактеризован как состоящий из 488 аминокислот, имеющий размер 50-55кДа, 6-кратно пронизывающий мембрану трансмембранный белок [Раккег е! а1., (2003), Ргос

Асай δα ИЗА, 100, 2284-9]. Антисенсовая РНК, прицельно воздействующая на δТЕАР3/ТδАР6, ингибировала р53-зависимый апоптоз, что также свидетельствовало в пользу того, что δТЕАР3/ТδАР6 действует как эффектор апоптоза [Раккег е! а1., (2003), Ргос Асай δ^ υδΛ. 100, 2284-9]. δТЕАР3/ТδАР6 физически взаимодействует с двумя белками, задействованными в регуляции клеточного цикла и апоптоза; №х и Му!1 [Раккег е! а1., (2003), Ргос ^ΐΐ Асай δα ^А, 100, 2284-9]. №.х (также обозначаемый ВК^Ь) является митохондриальным проапоптотическим белком, связанным с Вс12. №.х и δТЕΛР3/ТδΛР6 усиливают проапоптотические эффекты друг друга [Раккег е! а1., (2003), Ргос №11 Асай δα ИЗА, 100, 2284-9]. Му!1 обладает двойной специфичностью (Жег/Т11г и Туг) киназы, блокирующей клеточный цикл в переходе С2/М путем фосфорилирования и таким образом, ингибирования циклинзависимой киназы р34^сйс2. Взаимодействие между Му!1 и ТδΛР6 способствует Му!1-зависимому фосфорилированию р34^сйс2 путем поддержания Му!1 в его фосфорилированном активированном состоянии [Раккег е! а1., (2003), Ргос №11 Асай δ^ ^А, 100, 2284-9].

Несколько неожиданно было обнаружено, что δТЕΛР3/ТδΛР6 является геном, отвечающим за микроцитарную гипохромную анемию у мышей мутантной линии пт1054 [0йдат1 е! а1., (2005), №! Сепе!, 37, 1264-9]. Внеклеточное железо переносится трансферрином (ТР) из кишечника, ретикулоэндотелиальной системы и печени ко всем пролиферирующим клеткам организма. ТР-связанное железо поступает внутрь клетки посредством эндоцитоза, опосредованного рецептором к трансферрину (ТРК1). Железо высвобождается из комплекса с ТР в эндосомах при окислении и затем доставляется в цитоплазму переносчиком двухвалентных ионов металлов Эт11. ТР и ТРК1 затем возвращаются во внеклеточное пространство. В окружающей среде и в связанном с ТР виде железо преимущественно находится в окисленном состоянии Ее³⁺ (трехвалентном) и должно быть восстановлено до Ее²⁴ (двухвалентного) состояния для транспортировки через цитоплазматическую мембрану. Благодаря наличию ассоциации с анемией, δТЕΛР3/ТδΛР6 был идентифицирован в качестве основной редуктазы железа, осуществляющей эту реакцию в клетках эритроидного ряда, что подразумевает его важное значение в поступлении железа |0Ндат1 е! а1., (2005), №! Сепе!, 37, 1264-9]. δТЕΛР3/ТδΛР6 также обладает способностью восстанавливать ионы меди, и такая металлоредуктазная активность свойственна и другим представителям семейства δТЕΛР: δТЕΛР2 и δТЕΛР4 [0йдат1, е! а1., (2006), В1оой, 108, 1388-94].

Было также показано, что δТЕΛР3/ТδΛР6 участвует в стимуляции секреции белков альтернативным путем. Классическая секреция белков опосредована через NН₂-концевую сигнальную последовательность на белках, подлежащих секреции. Сигнальная последовательнсть направляет белок через эндоплазматический ретикулум/аппарат Гольджи с последующим транспортом через плазматическую мембрану в секреторных везикулах. После слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной секретированный белок высвобождается во внеклеточное пространство. Секреция белков может также осуществляться альтернативным путем, в ходе которого внутриклеточные везикулы отпочковываются в просвет эндосом, образуя так называемые мультивезикулярные тельца. Слияние мультивезикулярных телец с плазматической мембраной приводит к выбросу таких мембрано-инкапсулированных везикул во внеклеточное пространство. Такие везикулы известны как экзосомы. Было показано, что δТЕΛР3/ТδΛР6 стимулирует образование экзосом р53-зависимым способом [Ат/аПад е! а1., (2004), I Вю1 Скет, 279, 46104-12; Уи е! а1., (2006), Сапсег Кек, 66, 4795-801]. Экзосомы могут быть вовлечены в противоопухолевый ответ, имеющий важное значение. Одним из белков, секретируемых в экзосомах в ответ на активацию пути р53-δТЕΛР3/ТδΛР6, является маспин (Макр1п, от англ. таттагу кеппе рго!еаке шЫЬйог), обладающий ингибиторным эффектом в отношении ангиогенеза, опухолевой инвазии и метастазирования клеток опухоли молочной железы ^йепд е! а1., (1996), Ргос Асай δ^ ^А, 93, 11669-74; δΐιτ е! а1., (2001), Сапсег Кек, 61, 6945-51; /№пд е! а1., (1997), Мо1. Мей., 3, 49-59; 2ои е! а1., (1994), δα^'ΐ^χ 263,

- 16 019953

526-9]. Экзосомы могут содержать провоспалительные факторы, такие как опухолевый белок, регулируемый на уровне трансляции/фактор высвобождения гистамина (от англ. ТгапзкШопаПу Соп1го11еб Титоиг Ргокеш (ТСТР)/Н1зкатше Ке1еазшд Еаског) и опухоле специфичные антигены, такие как Нег2/№и и Магй |Λιηζα11;·ΐβ. е! а1., (2004), 1 Βίο1 СЬет. 279, 4610412; Иге е1 а1., (2002), Ьапсек, 360, 295-305]. Предполагается, что 8ТЕАР3/Т8АР6-опосредованное формирование эндосом может отвечать за так называемый «эффект постороннего», при котором клетки, в которых индуцирована экспрессия р53, могут вызывать остановку клеточного цикла, проапоптотический ответ и гибель соседних клеток [Уи ек а1., (2006), Сапсег Вез, 66, 4795-801].

Почти ничего не известно о взаимоотношениях между возможными генетическими вариантами 8ТЕАР3/Т8АР6 и риском рака. Скрининг мутаций в клеточных линиях карциномы простаты, ксенотрансплантатах и образцах опухолевой ткани позволил обнаружить 2 миссенс-мутации (А1а184ТЬг и 11е305Т11г) в ксенотрансплантатах при исследовании всего 4 клеточных линий, 8 ксенотрансплантатов и 56 образцов опухолей (всего 68 образцов). Авторы пришли к выводу, что 8ТЕАР3/Т8АР6 не является классическим геном супрессии опухолей при раке простаты. До настоящего времени не было описано других исследований генетических вариантов 8ТЕАР3/Т8АР6 при какой-либо другой форме рака.

Возможность применения пути 8ТЕАР3/Т8АР6 для разработки усовершенствованных способов лечения рака молочной железы

Наше наблюдение позволяет предположить, что генетический вариант блока НС 8ТЕАР3/Т8АР6 представляет собой распространенный фактора риска развития карциномы молочной железы. Таким образом, способы лечения, направленно воздействующие на 8ТЕАР3/Т8АР6, его гомологи и другие компоненты пути 8ТЕАР3/Т8АР6, могут считаться кандидатами для лечения или предупреждения рака молочной железы. Такие мишени включают: сам 8ТЕАР3/Т8АР6 (ОМ1М# 609671); его гомологи 8ТЕАР1 (ОМ1М# 604415), 8ТЕАР2/Т1АВР/8ТАМР1 (ОМ1М# 605094), и 8ТЕАР4 (ΝΜ_024636); взаимодействующие с ним белки Νίχ/ΒΝΙΓ3Ε (ОМ1М# 605368), Му!1 (ОМ1М# 602474), ТСТР/фактор высвобождения гистамина (ОМ1М# 600763); белки пути р34^с<1с2 (ОМ1М# 116940), циклин В1 (ОМ1М# 123836), НЕИ2/\ен (ОМ1М# 164870), маспин (ОМ1М# 154790); и другие представители пути 8ТЕР3/Т8АР6, которые будут идентифицированы или о вовлечении которых станет известно. Способы лечения могут включать малые молекулы, являющиеся агонистами или антагонистами 8ТЕАР3/Т8АР6, его гомологов или компонентов пути; макромолекулярные агенты, являющиеся агонистами или антагонистами 8ТЕАР3/Т8АР6, его гомологов или компонентов пути; или применение 8ТЕАР3/Т8АР6, гомологов или компонентов пути в качестве трансгенов в протоколах генной терапии или иммунотерапии. 8ТЕАР3/Т8АР6, его гомологи или компоненты пути и/или молекулы, воздействующие на их активность, могут также быть использованы в качестве адъювантов для цитостатической или цитотоксической терапии (химиотерапии, радиотерапии, генной или иммунной терапии) посредством потенциации их эффекта постороннего.

Оценка маркеров и гаплотипов

Когда проводится сравнение индивидов, геномная последовательность в популяциях оказывается не идентичной. Скорее, геном отражает вариабельность последовательности между индивидами во многих участках генома. Такие вариации в последовательности обычно обозначаются как полиморфизмы, и в геноме существует множество таких сайтов. Например, человеческий геном имеет вариации последовательности, которые появляются в среднем на каждые 500 пар оснований. Наиболее распространенный вариант последовательности представляет собой вариации оснований по одной позиции в геноме, и такие варианты последовательности, или полиморфизмы, обычно называют однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП). Полагают, что данные ОНП появились в результате единственной мутации, таким образом, обычно существует два возможных аллеля в каждом сайте ОНП; исходный аллель и мутировавший аллель. Благодаря естественному генетическому дрейфу и, возможно, также благодаря давлению отбора исходная мутация превратилась в полиморфизм, характеризующийся определенной частотой его аллелей в любой заданной популяции. В человеческом геноме найдены многие другие виды вариантов последовательностей, включая микросателлиты, инсерции, делеции, инверсии и вариации числа копий. Полиморфный микросателлит имеет множество коротких повторов оснований (таких как СА повторы, или ТС на комплементарной цепи) в определенном участке, число повторяющихся мотивов варьирует в общей популяции. В общих терминах, каждая версия последовательности полиморфного сайта представляет собой определенный аллель полиморфного сайта. Такие варианты последовательностей могут все обозначаться полиморфизмами, возникающими в определенных полиморфных сайтах, характерных для обсуждаемого варианта последовательности. В общих терминах полиморфизмы могут включать любое число определенных аллелей. Так, в одном воплощении изобретения полиморфизм характеризуется наличием двух или более аллелей в любой заданной популяции. В другом воплощении полиморфизм характеризуется наличием трех или более аллелей. В других воплощениях полиморфизм характеризуется четырьмя или более аллелями, пятью или более аллелями, шестью или более аллелями, семью или более аллелями, девятью или более аллелями или десятью или более аллелями. Все такие полиморфизмы могут применяться в способах и наборах по данному изобретению, и таким образом находятся в рамках изобретения.

В некоторых случаях делается ссылка на разные аллели в полиморфных сайтах без выбора рефе

- 17 019953 ренсного аллеля. В других случаях для конкретного полиморфного сайта может быть обозначена референсная последовательность. Референсный аллель в некоторых случаях обозначается как аллель дикого типа и обычно выбирается либо как первый секвенированный аллель или как аллель не пораженного индивида (например, индивида, не имеющего признаков или фенотипа заболевания).

Аллели маркеров ОНП в данном описании означают основания А, С, С или Т, обнаруживаемые в полиморфных сайтах в ходе детекции ОНП. В данном описании использовали следующие коды аллелей ОНП: 1 = А, 2=С, 3=С, 4=Т. Специалисту очевидно, что при исследовании или чтении противоположной цепи ДНК можно в каждом случае определить комплементарный аллель. Следовательно, для полиморфного сайта (полиморфного маркера), характеризуемого полиморфизмом А/С, проводимый анализ может быть использован для специфической детекции наличия как одного из двух возможных оснований, так и обоих, т.е. А и С. Также возможно, что в ходе анализа, разработанного для детекции противоположной цепи ДНК-матрицы, может быть определено наличие комплементарных оснований Т и С. В количественном отношении (например, в терминах относительного риска) идентичные результаты будут получены при определении любой из цепей ДНК (+ цепи или - цепи).

Обычно референсная последовательность относится к определенной последовательности. Аллели, отличающиеся от референсного, иногда обозначаются как варианты аллелей. Вариант последовательности в данном описании означает последовательность, отличающуюся от референсной последовательности, но в остальном существенно схожую. Аллели полиморфных генетических маркеров, описываемые здесь, являются вариантами. Другие варианты могут включать изменения, затрагивающие полипептид. Отличия в последовательностях при сравнении с референсной нуклеотидной последовательностью могут включать инсерции или делеции единичного нуклеотида, или более чем одного нуклеотида, приводящие к сдвигу рамки считывания; замену по меньшей мере одного нуклеотида, приводящую к замене кодируемой аминокислоты; замену по меньшей мере одного нуклеотида, приводящую к образованию преждевременного стоп-кодона; делецию нескольких нуклеотидов, приводящую к делеции одной или более аминокислот, кодируемых нуклеотидами; инсерции одного или нескольких нуклеотидов, такие как при неравной рекомбинации или конверсии генов, приводящие к прерыванию кодирующей последовательности рамки считывания; дупликации всей или части последовательности; транспозиции; или перестройки нуклеотидной последовательности. Такие изменения последовательности могут изменять полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой. Например, если изменения в последовательности нуклеиновых кислот вызывают сдвиг рамки считывания, сдвиг рамки считывания может привести к изменению кодируемых аминокислот и/или привести к образованию преждевременного стоп-кодона, вызывая образование укороченного полипептида. Возможно, что полиморфизм, ассоциированный с заболеванием или его признаками, может быть молчащей заменой одного или нескольких нуклеотидов (т.е. замена, которая не приводит к изменению аминокислотной последовательности). Такой полиморфизм может, например, изменять сайты сплайсинга, влиять на стабильность транспортной мРНК или иначе влиять на транскрипцию или трансляцию кодируемого полипептида. Он может также изменять ДНК, так что увеличивается вероятность появления на соматическом уровне таких структурных изменений, таких как амплификации или делеции. Полипептид, кодируемый референсной нуклеотидной последовательностью является референсным полипептидом с определенной референсной последовательностью аминокислот, а полипептиды, кодируемые вариантами аллелей обозначаются вариантными полипептидами с вариантами последовательности аминокислот.

Гаплотип означает сегмент ДНК, характеризующийся специфический комбинацией последовательно расположенных аллелей. У диплоидных организмов, таких как человек, гаплотип включает одного представителя из представителя пары аллелей по каждому полиморфному маркеру или локусу. В определенном воплощении гаплотип может включать два или более аллелей, три или более аллелей, четыре или более аллелей, или пять или более аллелей, каждый аллель соответствует определенному полиморфному маркеру в составе сегмента. Гаплотипы могут включать комбинацию различных полиморфных маркеров, например, ОНП и микросателлиты, имеющие конкретные аллели в полиморфных сайтах. Гаплотипы таким образом включают комбинацию аллелей различных генетических маркеров.

Детекция специфических полиморфных маркеров и/или гаплотипов может выполняться известными способами детекции последовательностей в полиморфных сайтах. Например, могут использоваться такие стандартные способы генотипирования наличия ОНП и/или микросателлитных маркеров, как флуоресцентные методики (Сйеи X. е! а1., Сепоше Кек. 9(5): 492-98 (1999)), применяющие ПЦР, ЛЦР, гнездной ПЦР и другие методики амплификации нуклеиновых кислот. Определенные методики, используемые для генотипирования ОНП, включают генотипирующие системы ТацМап и платформы §№1ех (Аррйеб Вюкук1ешк), масс-спектрометрию (например, систему МаккАККАУ от Зециепош), методы минисеквенирования, ПЦР в реальном времени, систему Вю-Р1ех (ВюКаб), системы СЕР и 8№к1геаш (Вескшап), технологию Мо1еси1аг 1пуегкюп РгоЬе аггау (например, АГГушейлх СепеСЫр), и технологии ВеабАггау (например, 111иш1па Со1бепСа!е и 1пйшиш аккаук), но не ограничиваются ими. С помощью этих или других методов, используемых специалистами, можно идентифицировать один или более аллелей полиморфных маркеров, включая микросателлиты, ОНП или другие виды полиморфных маркеров.

В некоторых из описанных здесь методов индивид с повышенной подверженностью (т.е. с повы

- 18 019953 шенным риском) к любому исследуемому определенному заболеванию или его признакам (например, раком молочной железы), является индивидом, у которого идентифицирован по меньшей мере один специфический аллель одного или более полиморфных маркеров или гаплотипов, обусловливающих повышенную подверженность к заболеванию или его признакам (т.е. связанный с риском аллель маркера или гаплотип). В одном аспекте, связанный с риском маркер или гаплотип является тем, который обусловливает достоверно повышенный риск (или подверженность) к раку молочной железы. В одном воплощении достоверность, ассоциированная с маркером или гаплотипом, измеряется относительным риском (ЯК). В другом воплощении достоверность, ассоциированная с маркером или гаплотипом, измеряется/выражается отношением шансов (ОК). В следующем воплощении достоверность выражается в процентах. В одном воплощении достоверно повышенный риск выражается как риск (относительный риск и/или отношение шансов) равный по меньшей мере 1,2, что включает, но не ограничивается значениями по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2,0, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3,0, по меньшей мере 4,0 и по меньшей мере 5,0. В конкретном воплощении достоверным является риск (относительный риск и/или отношение шансов) по меньшей мере 1,2. В другом конкретном воплощении достоверным является риск по меньшей мере 1,3. В еще одном воплощении достоверным является риск по меньшей мере 1,4. В следующем воплощении достоверным является относительный риск по меньшей мере около 1,5. В следующем воплощении достоверным увеличением риска является по меньшей мере 1,7. Однако также рассматриваются и другие пороговые значения, например, по меньшей мере 1,15, 1,25, 1,35, и так далее, и такие пороговые значения также находятся в рамках данного изобретения. В других воплощениях достоверным является увеличение риска по меньшей мере около 20%, включая, но не ограничиваясь значениями 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 300 и 500%. В одном конкретном воплощении достоверным является увеличение риска по меньшей мере на 20%. В других воплощениях достоверным является увеличение риска по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% и по меньшей мере на 100%. Другие пороговые значения или диапазоны, которые специалисты сочтут подходящими для характеристики изобретения, также рассматриваются, и они также находятся в рамках данного изобретения. В определенных воплощениях достоверное увеличение риска характеризуется значением р, например значением р менее 0,05, менее 0,01, менее 0,001, менее 0,0001, менее 0,00001, менее 0,000001, менее 0,0000001, менее 0,00000001 или менее 0,000000001.

Связанный с риском полиморфный маркер или гаплотип по данному изобретению представляет собой по меньшей мере один аллель по меньшей мере одного маркера или гаплотип, встречающийся более часто у индивида с риском рака молочной железы (пораженного), по сравнению с частотой его встречаемости в группе сравнения (в контроле), и где наличие маркера или гаплотипа указывает на подверженность к заболеванию или его признакам. Контрольная группа в одном воплощении может быть популяционной выборкой, т.е. случайной выборкой из общей популяции. В другом воплощении, контрольная группа представлена группой индивидов, не имеющих заболевания. Такие не имеющие заболевания контроли могут в одном воплощении характеризоваться отсутствием одного или более специфических симптомов, ассоциированных с заболевнием. В другом воплощении контрольная группа лиц, не имеющих заболевания, характеризуется отсутствием одного или более факторов риска, специфических для заболевания. Такие факторы риска в одном воплощении представляют собой по меньшей мере один фактор риска окружающей среды. Примерами факторов окружающей среды являются натуральные продукты, минералы или химические вещества, для которых известна или предполагается способность влиять на риск развития определенного заболевания или его признаки. Другие факторы риска окружающей среды являются факторами риска, относящимися к образу жизни, включая особенности питания и питья, географическое расположение места проживания, и профессиональные факторы риска, но не ограничиваются ими. В другом воплощении факторы риска представляют собой по меньшей мере один генетический фактор риска.

Примером простого теста на корреляцию может быть точный тест Фишера в таблице два на два. Для заданной когорты хромосом таблица два на два строится исходя из числа хромосом, которые включают оба маркера или гаплотипа, один из маркеров или гаплотипов, но не хромосом, которые не включают ни один из маркеров или гаплотипов или хромосом, которые включают другие маркеры или гаплотипы. Другие статистические тесты на ассоциацию, известные специалистам, также рассматриваются и находятся в рамках изобретения.

В других воплощениях по изобретению индивид с пониженной подверженностью (т.е. со сниженным риском) к заболеванию или его признакам является индивидом, у которого идентифицирован по меньшей мере один специфический аллель одного или более полиморфного маркера или гаплотипа, обусловливающий пониженную предрасположенность к заболеванию или его признакам. Аллели маркеров и/или гаплотипы, обусловливающие пониженный риск, также называются протективными. В одном аспекте протективный маркер или гаплотип - это тот, который обусловливает достоверно пониженный риск (или подверженность) заболевания или его признаков. В одном воплощении достоверно понижен

- 19 019953 ный риск выражается как относительный риск менее, чем 0,9, включая, но не ограничиваясь значениями менее чем 0,9, менее чем 0,8, менее чем 0,7, менее чем 0,6, менее чем 0,5, менее чем 0,4, менее чем 0,3, менее чем 0,2 и менее чем 0,1. В одном конкретном воплощении достоверно пониженный риск составляет менее 0,7. В другом воплощении достоверно пониженный риск составляет менее 0,5. В еще одном воплощении достоверно пониженный риск составляет менее 0,3. В другом воплощении снижением риска (или подверженности) является снижение по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% и по меньшей мере на 98%. В одном конкретном воплощении достоверным снижением риска является снижение по меньшей мере около 30%. В другом воплощении достоверным является снижение риска по меньшей мере около 50%. В другом воплощении снижением риска является снижение по меньшей мере около 70%. Другие пороговые значения или диапазоны, которые специалисты сочтут подходящими для характеристики изобретения, также находятся в рамках данного изобретения.

Специалистам в данной области известно, что для маркеров, присутствующих в исследуемой популяции в двух аллелях, при обнаружении одного аллеля в популяции в группе индивидов с признаками заболевания или заболеванием с повышенной частотой по сравнению с контролем, другой аллель или маркер будет обнаруживаться в группе индивидов с признаками заболевания или заболеванием с пониженной частотой по сравнению с контролем. В таком случае один аллель маркера (тот, что обнаруживается с повышенной частотой среди индивидов с признаками заболевания или заболеванием) будет аллелем, связанным с риском, а другой аллель будет протективным аллелем.

Генетический вариант, ассоциированный с заболеванием или признаком заболевания (например, раком молочной железы), может применяться самостоятельно для прогнозирования риска заболевания по данному фенотипу. Для биаллельных маркеров, таких как ОНП, существует 3 возможных генотипа: гомозиготный по связанному с риском варианту, гетерозиготный и не несущий варианта, связанного с риском. Риск, ассоциируемый с вариантами по множеству локусов, может применяться для оценки совокупного риска. При множестве вариантов ОНП возможное число генотипов к определяется формулой к = 3^п х 2^р; где η является числом аутосомных локусов, а р является числом гоносомных локусов (на половой хромосоме). При оценке совокупного риска, как правило, принимается, что относительные риски по разным генетическим вариантам мультиплицируются, т.е. совокупный риск (например, ОР или ОШ), ассоциированный с определенной комбинацией генотипа, является производным от значений риска для генотипа по каждому локусу. Если представленный риск является относительным риском для одного лица или для определенного генотипа лица, в сравнении с референсной популяцией, сопоставимой по полу и возрасту, то общий риск является производным значений риска, характерных для определенных локусов, и соответствует оценке совокупного риска в сравнении с популяцией. Если риск для одного лица основан на сравнении с лицами, не являющимися носителями связанного с риском аллеля, то общий риск соответствует оценке, которая сравнивает это лицо с заданной комбинацией генотипов по всем локусам с группой индивидов, которые не имеют связанных с риском вариантов по какому-либо из этих локусов. Группа лиц, не являющихся носителями какого-либо из связанных с риском вариантов, имеет наименьший оцениваемый риск и имеет общий риск равный 1,0 при сравнении с самой собой (т.е. с группой не являющихся носителями), но имеет совокупный риск менее 1,0 при сравнении с популяцией. Следует отметить, что группа лиц, не являющихся носителями, потенциально может быть очень малой, особенно по большому числу локусов, и в этом случае ее значимость, соответственно, небольшая.

Мультипликативная модель представляет собой простую модель, которая, как правило, достаточно хорошо описывает данные по сложным признакам. Отклонения от мультипликативности для часто встречающихся вариантов для распространенных заболеваний описываются редко, а если описываются, то, как правило, являются только предположительными, т.к. для демонстрации статистически достоверных взаимосвязей между локусами требуются очень большие размеры выборок.

Для рассмотрения одного примера примем, что с раком простаты была описана ассоциация всего с 8 вариантами (Сибтипбккоп Е е! а1., №11 Сепе! 39: 631-7 (2007), Сибтипбккоп Е е! а1., №11 Сепе! 39:977-83 (2007); Уеадег М. е! а1, N1! Сепе! 39: 645-49 (2007), Атипбабойг Ь. е1 а1., N1! Сепе! 38:652-8 (2006); На1тап С.А. е! а1., Ма! Сепе! 39:638-44 (2007)). Семь из этих локусов находятся на аутосомах, а оставшийся один локус находится на хромосоме X. Общее число теоретически возможных генотипических комбинаций составляет 3⁷ х 2¹ = 4374. Некоторые из этих классов генотипов являются очень редкими, но все же возможными и должны учитываться при оценке совокупного риска. Вероятно, что мультипликативная модель, применяемая в случае множества генетических вариантов, будет также валидна при сочетании с вариантами, не являющимися генетическими, при предположении, что генетические варианты не имеют четкой корреляции с факторами окружающей среды. Другими словами, при мультипликативной модели для оценки общего риска должны оцениваться как генетические, так и негенетические варианты, связанные с риском, при предположении, что между негенетическими и генетическими факторами риска

- 20 019953 отсутствует взаимодействие.

Используя аналогичный количественный подход, можно оценивать общий или совокупный риск, ассоциированный с множеством вариантов, ассоциированных с раком молочной железы. В одном из таких воплощений, исследуются маркеры г§4848543, г§13387042 и г§3803662 или суррогатные маркеры, находящиеся в неравновесии по сцеплению с ними, и подсчитывается риск для различных комбинаций генотипов (3³ = 27 возможных комбинаций). В другом воплощении совокупный риск определяется для комбинации генотипов двух маркеров (например, маркеров г§13387042 и г§3803662). В других воплощениях исследуются дополнительные маркеры, известные способностью предрасполагать к раку молочной железы, (например, такие факторы риска с высокой пенетрантностью, как ВКСЛ1, ВКСЛ2, ВАКЭ1) в сочетании с одним или более факторами риска, описываемыми здесь.

Неравновесие по сцеплению

Естественный феномен рекомбинации, происходящей в каждой паре хромосом в среднем один раз во время каждого мейоза, представляет один из способов, с помощью которого природой обеспечиваются вариации последовательностей (и вследствие этого, биологической функции). Обнаружено, что рекомбинация в геноме происходит не случайным образом, а скорее существуют большие вариации в частотах рекомбинации, что обусловливает существование небольших участков с высокой частотой рекомбинации (также называемых горячими точками рекомбинации) и больших участков с низкой частотой рекомбинации, обычно обозначаемыми блоками неравновесия по сцеплению (Муегк 8. е! а1., Вюсйет 8ос. Тгапк 34: 526-530 (2006); .Тейгеук ЛЭ. е! а1., №11иге Сеие! 29: 217-222 (2001); Мау С.А. е! а1., №11иге Сеие! 31: 272-275(2002)).

Неравновесие по сцеплению (НС) относится к неслучайному распределению двух генетических элементов. Например, если конкретный генетический элемент (например, аллели полиморфного маркера) встречается в популяции с частотой 0,50 (50%) и другой элемент встречается с частотой 0,50 (50%), то расчетная встречаемость обоих элементов у человека составит 0,25 (25%), учитывая случайное распределение элементов. Однако, если обнаружится, что оба элемента встречаются вместе с частотой выше, чем 0,25, то говорят, что элементы находятся в неравновесии по сцеплению, т.к. они имеют тенденцию наследоваться совместно с более высокой частотой, чем можно ожидать при независимости частот их встречаемости. Грубо говоря, НС обычно коррелирует с частотой рекомбинации между двумя элементами. Частота аллеля или гаплотипа в популяции может быть определена путем генотипирования индивидов в популяции и определения встречаемости в популяции каждого аллеля или гаплотипа. В популяциях диплоидных организмов, например, человеческой популяции, индивиды обычно имеют по два аллеля для каждого генетического элемента (например, маркера, гаплотипа или гена).

Для оценки силы неравновесия по сцеплению (НС) были предложены различные показатели. Большинство из них оценивают силу ассоциации между парами диаллельных сайтов. Двумя важными попарными показателями НС являются г² (иногда изображаемый как Δ²) и |Ό'|. Оба показателя изменяются от 0 (отсутствие неравновесия) до 1 (полное неравновесие), но их интерпретация несколько различается. |Ό'| определяется таким образом, что он равен 1, только если существуют два или три из возможных гаплотипов и он <1 если существуют все четыре возможных гаплотипа. Таким образом, значение |Ό'| <1 указывает на то, что в ходе эволюции между двумя сайтами могла произойти рекомбинация (повторная мутация также может обусловливать значения |Ό'| <1, но для однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) это обычно считается менее вероятным, чем рекомбинация). Показатель г² отражает статистическую корреляцию между двумя сайтами и принимает значение 1, только если существуют два гаплотипа.

Показатель г², возможно, является наиболее подходящим показателем картирования сцепления, поскольку существует простое обратное отношение между г² и размером выборки, необходимым для обнаружения ассоциации между подверженность к заболеванию и ОНП. Эти показатели определяются для двух сайтов, но в некоторых случаях может требоваться определение того, насколько сильным является НС по всему участку, содержащему множество полиморфных сайтов (например, определение достоверно ли отличается сила НС между локусами или между популяциями, или является ли НС в участке более сильным или слабым по сравнению с предсказанным по определенной модели). Измерение НС в участке не является простым, одним из подходов является применение разработанного в популяционной генетике показателя г. Грубо говоря, г показывает, какой должна быть рекомбинация в конкретной популяционной модели для возникновения НС, наблюдаемого в результатах. Данный способ дает возможность использования статистического подхода для оценки того, что данные НС демонстрируют свидетельства существования горячих точек рекомбинации. Для описанных здесь способов значимой величиной г² может быть по меньшей мере 0,1, например, по меньшей мере 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 или по меньшей мере 0,99. В одном предпочтительном воплощении значимой величиной г² может быть по меньшей мере 0,2. Кроме того, неравновесие по сцеплению в данном описании означает неравновесие по сцеплению, характеризуемое значениями |Ό'| по меньшей мере 0,2, например, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 или по меньшей мере 0,99. Таким образом, неравновесие по сцеплению отражает корреляцию между аллелями отдельных маркеров. Оно измеряется коэффициентом корреляции или |Ό'| (г² до 1,0 и |Ό'| до

- 21 019953

1,0). В определенных воплощениях неравновесие по сцеплению определяется в терминах значений обоих показателей, как г² так и |Ό'|. В одном из таких воплощений достоверное неравновесие по сцеплению определяется значениями г² > 0,1 и |Ό'| >0,8. В другом воплощении достоверное неравновесие по сцеплению определяется значениями г² > 0,2 и |Ό'| >0,9. Другие сочетания и перестановки значений г² и |Ό'| для определения неравновесия по сцеплению также рассматриваются и находятся в рамках изобретения. Неравновесие по сцеплению может быть определено в одной человеческой популяции, согласно данному описанию, или оно может быть определено в нескольких выборках, составленных из индивидов, происходящих более чем из одной человеческой популяции. В одном воплощении изобретения НС определяется в выборке из одной или более популяций НарМар (европеоидной, африканской, японской, китайской), согласно описанию (ййр://те^ет.йартар.огд). В одном из таких воплощений НС определяется в популяции СЕЙ выборок НарМар. В другом воплощении НС определяется в популяции ΎΚΙ. В еще одном воплощении НС определяется в выборках исландской популяции.

Если бы все полиморфизмы в геноме были идентичными на уровне популяции, то в ассоциативных исследованиях необходимо было бы изучать каждый из них. Однако, благодаря существованию неравновесия по сцеплению между полиморфизмами, между тесно связанными полиморфизмами наблюдается сильная корреляция, что сокращает число полиморфизмов, которые требуется изучить в ассоциативном исследовании для обнаружения достоверной ассоциации. Другим следствием существования НС является то, что между многими полиморфизмами прослеживается ассоциативный сигнал, поскольку между этими полиморфизмами существует сильная корреляция.

Были разработаны генетические карты НС в геноме, и такие карты НС были предложены для использования в качестве основы для картирования генов, связанных с заболеваниями (Кгксй N. & МегИапдак К, 8аепсе 273:1516-1517 (1996); Машайк N. е! а1., Ргос ЫаЙ Асаб 8с1 И8А 99: 2228-2233 (2002); КеюЬ 1)Е е! а1., \а1иге 411:199-204 (2001)).

На данный момент установлено, что многие части человеческого генома могут быть разбиты на серии отдельных блоков гаплотипов, содержащих несколько общих гаплотипов; в этих блоках данные неравновесия по сцеплению не демонстрируют значительных свидетельств рекомбинации (см., например, ^а11., ΕΌ. и Ргйсйагб БК., №1иге Кеу1е^к Оепейск 4:587-597 (2003); Ба1у М. е! аБ, №11иге Оепе!. 29: 229232 (2001); ОаЬпе1 8.В. е! а1., 8аепсе 296: 2225-2229 (2002); Рай1 N. е! а1., 8с1епсе 294: 1719-1723 (2001); Ба\\ъоп Е. е! а1., №1иге 478: 544-548 (2002); РЫШрк М.8. е! аБ, №11иге Оепе!. 33:382-387 (2003)). Существует два основных способа определения таких блоков гаплотипов: блоки могут быть определены как участки ДНК, имеющие ограниченное разнообразие по гаплотипам (см., например, Оа1у. М. е! аБ, №11иге Оепе!. 29:229-232 (2001); Рай1 N. е! а1., 8аепсе 294: 1719-1723 (2001); Оаикоп Е. е! а1., \а1иге 478: 544-548 (2002); 2йапд К. е! а1., Ргос. Ка!1. Асаб. 8сЕ И8А 99:7335-7339 (2002)), или как участки между зонами с интенсивным темпом обмена, демонстрирующими значительную рекомбинацию в истории человечества, на что указывает неравновесие по сцеплению (см., например, ОаЬпе1 8.В. е! аБ, 8аепсе 296: 2225-2229 (2002); РЫШрк М.8. е! а1., \а1иге Оепе!. 33:382-387 (2003); \\апа N. е! а1., Ат. 1. Нит. Оепе!. 77: 12271234 (2002); 8!итрГ М.Р. и Оо1бк!ет Ό.Β., Сигг. Вю1. 73:1-8 (2003)). Недавно была разработана подробная карта частот рекомбинации и соответствующих горячих точек в человеческом геноме (Муегк 8. е! аБ, 8с1епсе 310:321-32324 (2005); Муегк 8. е! аБ, Вюсйет 8ос Тгапк 34:526530 (2006)). Карта отражает огромную вариацию по рекомбинации в геноме, с частотами рекомбинации, доходящими до 10-60 сМ/Мб в горячих точках и приближающимися к 0 в участках между ними, что таким образом отражает участки ограниченного разнообразия по гаплотипам и высокое НС. Следовательно, карта может быть использована для определения блоков гаплотипов/блоков НС как участков, ограниченных горячими точками рекомбинации. В данном описании термин блок гаплотипа или блок неравновесия по сцеплению включает блоки, определенные согласно любым из вышеописанных характеристик или другими альтернативными способами, применяемыми специалистами для определения таких участков.

Некоторые репрезентативные методы для идентификации блоков гаплотипов приведены, например, в опубликованных патентных заявках и.8. №№ 20030099964, 20030170665, 20040023237 и 20040146870. Блоки гаплотипов могут использоваться для картирования ассоциации между фенотипом и генотипическим статусом, с применением одиночных маркеров или гаплотипов, включающих множество маркеров. В каждом блоке гаплотипов могут быть выделены основные гаплотипы, а затем может быть выбран ряд ОНП или маркеров, выполняющих роль ярлычков (наименьший набор ОНП или маркеров, необходимый для идентификации гаплотипов). Такие ОНП или маркеры - ярлычки могут затем применяться для оценки образцов, полученных у групп индивидов, для выявления ассоциации между фенотипом и гаплотипом. При желании соседствующие блоки гаплотипов могут оцениваться параллельно, поскольку между блоками гаплотипов может также существовать неравновесие по сцеплению.

Известно, что неравновесие по сцеплению может варьировать в различных популяциях из-за различных степеней расхождения генов в ходе эволюции в различных популяциях. В некоторых воплощениях данного изобретения неравновесие по сцеплению относится к неравновесию по сцеплению, определенному в европеоидных популяциях. В конкретном воплощении неравновесие по сцеплению определяется в европеоидных выборках СЕРН консорциума НарМар (согласно описанию на

- 22 019953 й!!р://тетете.йартар.огд). В других воплощениях НС определяется в африканской популяции, африканоамериканской популяции, латиноамериканской популяции, японской популяции, китайской популяции. В некоторых воплощениях НС определяется в выборках НарМар из Китая, Японии, Африки, согласно описанию (й!!р://тете^.йартар.огд).

Таким образом, очевидно, что при наличии какой-либо ассоциации с полиморфным маркером генома вероятно, что ассоциация обнаружится и между дополнительными маркерами генома. Это является естественным следствием неравного распределения НС по геному, что выражается в виде большой вариации частот рекомбинации. Маркеры, использованные для выявления ассоциации, таким образом являются метками для участка генома (т.е. блока гаплотипа или блока НС), для которого обнаружена ассоциация с заданным заболеванием или признаком заболевания. Внутри участка, имеющего ассоциацию с заболеванием или признаком заболевания, может существовать один или более причинных (функциональных) вариантов или мутаций. Такие варианты могут обусловливать более высокий относительный риск (ОР) или отношение шансов (ОШ) по сравнению с маркерами - ярлычками, использованными для обнаружения ассоциации. Данное изобретение таким образом касается маркеров, применяемых для обнаружения ассоциации с заболеванием, по данному описанию, а также маркеров в неравновесии по сцеплению с маркерами. Так, в определенных воплощениях изобретения маркеры, находящиеся в НС с маркерами и/или гаплотипами по изобретению, согласно данному описанию могут использоваться как суррогатные маркеры. Суррогатные маркеры в одном воплощении имеют значения относительного риска (ОР) и/или отношения шансов (ОШ) меньше, чем для маркеров или гаплотипов, для которых исходно была обнаружена ассоциативная связь с заболеванием, по данному описанию. В других воплощениях суррогатные маркеры имеют показатели ОР или ОШ выше тех, что были исходно обнаружены для маркеров, для которых исходно была обнаружена ассоциативная связь с заболеванием, по данному описанию. Примером такого воплощения может быть редкий или относительно редкий (например, с частотой аллеля в популяции < 10%) вариант в НС с более распространенным вариантом (частота встречаемости в популяции > 10%), для которого исходно была обнаружена ассоциативная связь с заболеванием, например, с описанными здесь вариантами. Идентификация и использование таких маркеров для выявления ассоциации, обнаруженной авторами изобретения, согласно данному описанию, может выполняться с помощью рутинных методов, хорошо известных специалистам, и, таким образом, находится в рамках данного изобретения.

Определение частоты гаплотипа

Частоты гаплотипов в контрольной группе и группе пациентов могут быть оценены с применением алгоритма максимизации ожидания (Эетрз!ет А. е! а1., 1. В. 8!а!. 8ос. В, 39:1-38 (1977)). Применение данного алгоритма позволяет работать при отсутствующих генотипах и неопределенности гаплотипа. При нулевой гипотезе принимается, что пациенты и контроли имеют одинаковые частоты. С помощью метода правдоподобия проверяется альтернативная гипотеза, при которой допускается, что связанный с риском кандидатный гаплотип, который может включать описанные здесь маркеры, может иметь более высокую частоту у пациентов по сравнению с контролями, в то время как соотношения частот других гаплотипов в обоих группах считаются одинаковыми. Максимизация правдоподобия проводится раздельно для обеих гипотез, и статистическая достоверность оценивается с помощью соответствующей статистики отношения правдоподобия с 1 степенью свободы.

Для рассмотрения связанных с риском и протективных маркеров и гаплотипов в составе региона сцепления, например, исследуется ассоциация всех возможных комбинаций генотипированных маркеров, при условии, что эти маркеры охватывают настоящий регион. Объединенные группы пациентов и контролей могут быть случайным образом поделены на две группы, равные по размеру исходным группам пациентов и контролей. Затем повторяется анализ маркеров и гаплотипов и определяется наиболее статистически достоверное значение Р из всех определенных. Такая процедура рандомизации может быть повторена, например, более 100 раз для получения эмпирического распределения значений Р. В предпочтительном воплощении значение Р<0,05 указывает на достоверную ассоциацию маркера и/или гаплотипа.

Анализ гаплотипов

Один из общих подходов к анализу гаплотипов включает их выведение, основанное на правдоподобии, которое применяется в ЫЕз!еб МОбе1з (Оте!атзбо!йг 8. е! а1., Ыа!. Оепе!. 35:131-38 (2003)). Данный способ используется в программе ЫЕМО, позволяющей анализировать множество полиморфных маркеров, ОНП и микросателлитов. Способ и программное обеспечение специально разработаны для исследований случай-контроль, целью которых является идентификация групп гаплотипов, которые обусловливают различный риск. Он также является инструментом для изучения структур НС. В ЫЕМО оценки максимального правдоподобия, отношения правдоподобия и значения Р подсчитываются напрямую при обработке имеющихся данных с помощью алгоритма максимизации правдободобия (от англ. Ехрес!айоп Махти/аиом, ЕМ), позволяющего решить проблему недостающих данных.

Несмотря на то, что тест отношения правдоподобия, основанный на правдоподобии, подсчитанном напрямую для наблюдаемых данных, зафиксировавших потерю информации из-за неопределенности

- 23 019953 гаплотипов и пропусках генотипов, достаточно надежен для получения достоверных значений Р, все же представляет интерес узнать, какое количество информации было потеряно из-за неполноты информации. Измерение количества информации для анализа гаплотипа описано у №со1ае и Копд (Тес11шса1 Верой 537, Берайтеп! оГ 8!айкйск, Ипгуегкйу оГ 8!айкйск, Ипгуегкйу оГ СЫсадо; Вютейтск, 60(2): 368-75 (2004)) как естественное обобщение определения мер количества информации, используемого при анализе сцепления, и применяется в ΝΕΜΟ.

В случае ассоциации с заболеванием одного маркера для расчета двусторонних значений Р для каждого отдельного аллеля может применяться точный тест Фишера. Обычно, при отсутствии специальных оговорок, все значения Р представлены без коррекции на множественность сравнений. Представленные частоты (для микросателлитов, ОНП и гаплотипов) являются частотами аллелей, а не частотами носителей. Для уменьшения возможной систематической ошибки, обусловленной родством пациентов, рекрутированных для анализа сцепления целыми семьями, из списка пациентов могут быть исключены родственники первой и второй степени. Кроме этого, тест может быть повторен для корректирования ассоциации, обусловленной возможно оставшимися родственными связями между пациентами, путем применения процедуры уточнения дисперсии, описанной В1кеп, Ν. & Тепд, 1. (Сепоте Век., 8:1273-1288 (1998)) при пулировании ДНК (там же) родных братьев и сестер, для родственных связей вообще и получения как скорректированных, так и нескорректированных значений Р для сравнения. Как и предполагается, разница обычно бывает очень малой. Для оценки значимости ассоциации одного маркера, скорректированной на большое количество тестов, можно провести рандомизирующий тест с использованием тех же генотипических данных. Когорты пациентов и контролей могут быть рандомизированы и ассоциативный анализ проведен заново множество раз (например, до 500000 раз), тогда значение Р будет долей реплик, давших значение Р для некоторого аллеля маркера, меньшее или равное значению Р, наблюдавшемуся в исходных когортах пациентов и контролей.

Как для анализа одиночных маркеров, так и гаплотипов можно подсчитать относительный риск и (ОР) популяционный атрибутивный риск (ПАР) с применением мультипликативной модели (модели относительного риска гаплотипов) (ТегМШдег ГБ. & Ой ί., Нит. Негеб. 42:337-46 (1992) и Еа1к СТ. & ВиЬтк!ет Р., Апп. Нит. Сепе!. 51 (Р! 3): 227-33 (1987)), т.е. о том, что при носительстве двух аллелей/гаплотипов, риск мультиплицируется. Например, если риск А по сравнению с а равен ВВ, то риск у гомозиготного АА человека будет в ВВ раз больше по сравнению с гетерозиготой Аа и в ВВ² раз больше по сравнению с гомозиготой аа. Мультипликативная модель имеет допущение, которое упрощает анализ и подсчеты - о том, что гаплотипы независимы, т.е. соответствуют равновесию ХардиВайнберга как в популяции пораженных, так и в контрольной популяции. В результате, частоты гаплотипов пораженных и контролей имеют мультиномиальное распределение, но при альтернативных гипотезах частоты гаплотипов различаются. В частности, для двух гаплотипов, и 11,, риск(й_|)/риск(й|) = (Г_|/р_|)1(Г_|/р_|), где £ и р обозначают, соответственно частоты в популяции пораженных и в популяции контролей. Хотя в случае, если истинная модель не является мультипликативной, происходит некоторое снижение мощности, это снижение оказывается умеренным, за исключением некоторых крайних случаев. Наиболее важно то, что значения Р всегда валидны, поскольку они подсчитаны для нулевой гипотезы.

Оценка неравновесия по сцеплению с применением ΝΕΜΟ

НС между парами маркеров может быть рассчитано с применением стандартного определения Б' и г² (ЕеиопНп В., Сепейск 49:49-67 (1964); Н111 А.С. & ВоЬейкоп, А. Тйеог. Арр1. Сепе!. 22:226-231 (1968)). С применением ΝΕΜΟ частоты комбинаций аллелей двух маркеров оцениваются по максимальному правдоподобию, а отклонение от равновесия по сцеплению оценивается по тесту отношения правдоподобия. Определения Б' и г² обобщены для включения микросателлитов путем усреднения значений всех возможных комбинаций аллелей двух маркеров, взвешенных предельными вероятностями аллелей. При изображении всех комбинаций маркеров для выяснения структуры НС в определенном участке, мы откладываем Б' в верхнем левом углу, а значения Р в правом нижнем углу. На картах НС при желании маркеры могут быть нанесены равноудалено, а не исходя из их физического расположения.

Оценка риска и диагностика

В составе любой заданной популяции существует абсолютный риск развития заболевания или признака, определяемый как вероятность развития у лица определенного заболевания или признака за определенный промежуток времени. Например, для женщины абсолютный пожизненный риск развития рака молочной железы составляет 1 из 9. То есть, у одной женщины из 9 в какой-то момент их жизни разовьется рак молочной железы. Риск обычно определяется при рассмотрении очень большого количества людей, а не отдельных индивидов. Риск чаще всего выражается в терминах Абсолютного Риска (АР) и Относительного Риска (ОР). Относительный риск используется для сравнения рисков, ассоциированных с двумя вариантами, или рисков по двум различным группам людей. Например, он может применяться для сравнения группы людей с конкретным генотипом и другой группы людей, имеющих отличный генотип. В случае заболевания относительный риск, равный 2, означает, что в одной группе вероятность развития заболевания в два раза выше, чем в другой группе. Представленный риск, как правило, является относительным риском для лица, или для определенного генотипа лица, в сравнении с популяцией, со

- 24 019953 поставимой по полу и возрасту. Риск для двух индивидов одного пола и возраста можно сравнить простым способом. Например, если при сравнении с популяцией первый индивид имеет относительный риск 1,5, а второй индивид имеет относительный риск 0,5, то риск первого индивида по сравнению со вторым индивидом составляет 1,5/0,5 = 3.

Согласно данному описанию, определенные полиморфные маркеры и гаплотипы, включающие такие маркеры, могут применяться для оценки риска рака молочной железы. Оценка риска может включать применение маркеров для диагностики подверженности раку молочной железы. Определенные аллели полиморфных маркеров обнаруживаются у индивидов с раком молочной железы чаще, чем у индивидов без диагностированного рака молочной железы. Следовательно, эти аллели маркеров имеют прогностическую значимость для выявления у индивида рака молочной железы или подверженности раку молочной железы. Маркеры - ярлычки в составе блоков гаплотипов или блоков НС, включающие связанные с риском маркеры, такие как маркеры по данному изобретению, могут применяться в качестве суррогатов для других маркеров и/или гаплотипов в составе блока гаплотипов или блока НС. Маркеры со значениями г² равными 1 являются идеальными суррогатами для связанных с риском вариантов, т.е. генотипы одного маркера позволяют идеально спрогнозировать генотипы другого. Маркеры со значениями г² менее 1 также могут служить суррогатами для связанных с риском вариантов, или, кроме того, представлять варианты с такими же высокими значениями относительного риска или возможно даже более высокими, чем у связанного с риском варианта. Идентифицированный связанный с риском вариант сам по себе может не быть функциональным вариантом, но в этом случае может находиться в неравновесии по сцеплению с истинно функциональным вариантом. Данное изобретение включает оценку таких суррогатных маркеров для маркеров по данному описанию. Такие маркеры описаны, картированы и приведены в общедоступных базах данных, известных специалистам, или могут быть легко идентифицированы путем секвенирования участка или его части, идентифицированного маркерами по данному изобретению у группы индивидов, и идентифицировать полиморфизмы в полученной группе последовательностей. В результате, специалисты могут легко и без чрезмерных усилий генотипировать суррогатные маркеры, находящиеся в неравновесии по сцеплению с маркерами и/или гаплотипами по данному описанию. Маркеры - ярлычки, или суррогатные маркеры, находящиеся в НС с обнаруженными связанными с риском вариантами в составе гаплотипа или блока НС, также имеют прогностическое значение для выявления ассоциации с раком молочной железы или подверженности индивида раку молочной железы. Такие маркеры - ярлычки, или суррогатные маркеры, находящиеся в НС с маркерами по данному изобретению, могут также включать и другие маркеры, которые характеризуют гаплотипы, поскольку они также имеют прогностическое значение для выявления подверженности раку молочной железы.

Данное изобретение в некоторых воплощениях может осуществляться посредством оценки образца, содержащего геномную ДНК индивида, на наличие вариантов, согласно данному описанию ассоциированных с раком молочной железы. Такая оценка включает этапы определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного маркера, с помощью способов, хорошо известных специалистам и описываемых здесь, и определения на основе такой оценки существования повышенного или пониженного риска (повышенной или пониженной подверженности) раку молочной железы у индивида, от которого получен образец. Кроме того, изобретение может осуществляться с применением массива данных, содежащего информацию о генотипическом статусе по меньшей мере одного полиморфного маркера, согласно данному описанию ассоциированного с раком молочной железы (или маркерами, находящимися в неравновесии по сцеплению с по меньшей мере одним маркером, который, как здесь показано, ассоциирован с раком молочной железы). Другим словами, массив данных, содержащий информацию о таком генетическом статусе, например, в форме частот генотипа по определенному полиморфному маркеру или множеству маркеров (например, указания на наличие или отсутствие определенных связанных с риском аллелей), или реальные генотипы по одному маркеру или более, могут быть исследованы на наличие или отсутствие определенных связанных с риском аллелей определенных полиморфных маркеров, для которых авторами изобретения продемонстрирована ассоциация с раком молочной железы. Положительный результат по варианту (например, аллелю маркера), ассоциированному с раком молочной железы согласно данному описанию, указывает на то, что индивид, для которого получен массив данных, имеет повышенную подверженность (повышенный риск) раку молочной железы.

В определенных воплощениях изобретения корреляция полиморфного маркера с раком молочной железы выявляется при сравнении данных генотипа полиморфного маркера с переводной таблицей, показывающей корреляцию между по меньшей мере одним аллелем полиморфизма и раком молочной железы. В некоторых воплощениях таблица показывает корреляцию по одному полиморфизму. В других воплощениях таблица показывает корреляцию по множеству полиморфзимов. В обоих случаях, по ссылкам на переводную таблицу, указывающую на наличие корреляции между маркером и раком молочной железы, для индивида, у которого получен образец, можно определить риск развития рака молочной железы или подверженность раку молочной железы. В некоторых воплощениях корреляция отражена в виде статистического показателя.

Статистический показатель может быть выражен в виде показателя риска, например, относительного риска (ОР), абсолютного риска (АР) или отношения шансов (ОШ).

- 25 019953

Маркеры и галпотипы по изобретению, например, полиморфные маркеры и гаплотипы на хромосоме 2с.|14.2. хромосоме 2с.|35 и хромосоме 16ц12, например, маркеры, представленные в табл.10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними, например маркеры т§4848543, Щ13387042 и Г53803662 могут применяться для оценки риска и для диагностических целей, как по-отдельности, так и в комбинации. Так, даже в случаях, когда увеличение риска по отдельным маркерам относительно умеренное, т.е. порядка 10-30%, ассоциация может иметь существенное значение. Так, относительно распространенные варианты могут вносить существенный вклад в совокупный риск (иметь высокий популяционный атрибутивный риск), либо комбинация маркеров может применяться для выделения групп индивидов, которые в случае комбинации риска по маркерам, будут иметь значительный суммарный риск развития заболевания.

Так, в одном воплощении изобретения для оценки совокупного риска применяется несколько вариантов (маркеров и/или гаплотипов). В одном воплощении эти варианты выбирают из вариантов по данному описанию. Другие воплощения включают применение вариантов по данному изобретению в комбинации с другими вариантами, применяющимися в диагностике подверженности раку молочной железы. В таких воплощениях у индивида определяется генотипический статус нескольких маркеров и/или гаплотипов и статус индивида сравнивается с популяционной частотой ассоциированных вариантов или с частотой вариантов у клинически здоровых лиц, например, лиц сопоставимых по полу и возрасту. Известные способы, например, многофакторный анализ или анализ общего риска, могут применяться для определения совокупного риска, обусловленного генотипическим статусом по множественным локусам. Оценка риска на основании такого анализа может впоследствии использоваться в способах и наборах по изобретению, согласно данному описанию.

Согласно вышеописанному структура блока гаплотипа человеческого генома имеет особенность, что большое число вариантов (маркеров и/или гаплотипов) в неравновесии по сцеплению с вариантом, для которого исходно была отмечена ассоциация с заболеванием или признаком заболевания, может использоваться в качестве суррогатных маркеров для оценки ассоциации с заболеванием или признаком заболевания. Количество таких суррогатных маркеров будет зависеть от таких факторов, как интенсивность рекомбинации в участке в ходе истории человечества, частота мутаций в участке (т.е. число полиморфных сайтов или маркеров в участке) и степенью НС (размером блока НС) в участке. Эти маркеры обычно располагаются внутри физических границ изучаемого блока НС или блока гаплотипов, что определяется с помощью описываемых здесь способов или с помощью других способов, известных специалистам. Однако иногда ассоциация маркеров и гаплотипов оказывается выходящей за пределы физических границ блока гаплотипов согласно определению. Такие маркеры и/или гаплотипы могут в таких случаях использоваться также в качестве суррогатных маркеров и/или гаплотипов для маркеров и/или гаплотипов, физически находящихся в составе блока гаплотипов согласно определению. Вследствие этого маркеры и гаплотипы в НС (обычно характеризующиеся г² более 0,1, например, г² более 0,2, включая г² более 0,3, а также включая г² более 0,4) с маркерами и гаплотипами по данному изобретению, также находятся в рамках данного изобретения, даже если они физически располагаются вне границ блока гаплотипов согласно определению. Сюда входят описанные здесь маркеры (например, в табл. 10, 15 и 19), но могут также входить и другие маркеры, находящиеся в сильном НС (характеризующемся г² более 0,1 или г² более 0,2 и/или |Ό'| >0,8) с одним маркером или более, приведенными в табл. 10, 15 и 19.

В случае описываемых здесь маркеров ОНП, аллель противоположный аллелю, частота которого превышена у пациентов (связанному с риском аллелю), обнаруживается с пониженной частотой у пациентов с раком молочной железы. Следовательно, такие маркеры и гаплотипы в НС и/или включающие такие маркеры являются протективными в отношении рака молочной железы, т.е. они обусловливают пониженный риск или подверженность индивидов, несущих такие маркеры и/или гаплотипы, к развитию рака молочной железы.

Определенные варианты по данному изобретению, в том числе определенные гаплотипы, включают, в некоторых случаях комбинации нескольких генетических маркеров, например, ОНП и микросателлиты. Таким образом, детектирование гаплотипов может проводиться способами определения последовательностей полиморфных сайтов, известными в данной области техники, и/или описываемыми здесь. Кроме того, корреляция между определенными гаплотипами или группами маркеров и фенотипом заболевания может быть верифицирована с помощью стандартных методик. Репрезентативным примером простого теста на корреляцию является точный тест Фишера в таблице два на два.

В определенных воплощениях аллель маркера или гаплотип, ассоциированный с раком молочной железы (например, аллели, маркеров, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними), представляет собой аллель маркера или гаплотип, встречающийся у индивидов с риском развития рака молочной железы (пораженных) чаще по сравнению с частотой его встречаемости у здоровых индивидов (контроль), и наличие аллеля маркера или гаплотипа указывает на рак молочной железы или подверженность раку молочной железы. В других воплощениях связанные с риском маркеры, находящиеся в неравновесии по сцеплению с одним или более маркерами, ассоциированными с раком молочной железы (например, маркеры, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними), являются маркерами-ярлычками, встречающимися у индиви

- 26 019953 дов с риском развития рака молочной железы (пораженных) чаще по сравнению с частотой их встречаемости у здоровых индивидов (контроль), и наличие маркеров-ярлычков указывает на повышенную подверженность раку молочной железы В следующем воплощении связанные с риском аллели маркеров (т.е. обусловливающие повышенную подверженность), находящиеся в неравновесии по сцеплению с одним или более маркерами, ассоциированными с раком молочной железы (например, аллели маркеров, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними), являются маркерами, включающими один или более аллелей, которые встречаются у индивидов с риском развития рака молочной железы чаще по сравнению с частотой их встречаемости у здоровых индивидов (контроль), и наличие маркеров указывает на повышенную подверженность раку молочной железы.

Исследуемая популяция

Исландская популяция представляет собой европеоидную популяцию северо-европейского происхождения. За последние годы было опубликовано большое число исследований, представляющих результаты генетического сцепления и ассоциации в Исландской популяции. Многие исследования демонстрируют воспроизведение вариантов, первоначально идентифицированных на исландской популяции как ассоциированных с определенным заболеванием, и в других популяциях (8!ассу 8.Ν. с! а1., Ναι Сспс1. Мау 27 2007 (ЕриЬ аНсаб о£ рпп!; Нс1дабо!йг А., с! а1., 8с1спсс 316:1491-93 (2007); 8!с1п!йог5бо!бг V., с! а1., №11 Сспс!. 39:770-75 (2007); бибтцпбккоп ί., с! а1. №11 Сспс!. 39:631-37 (2007); Атипбабойп Ь.Т. с! а1., №11 Сспс!. 38:652-58 (2006); Сгап!, 8.Е., с! а1., №а! Сспс!. 38:320-23 (2006)). Таким образом, генетические находки в исландской популяции в общем были воспроизведены в других популяциях, включая популяции из Африки и Азии.

Считается, что маркеры по данному изобретению, для которых была обнаружена ассоциация с раком молочной железы, демонстрируют схожую ассоциацию в других человеческих популяциях. Определенные воплощения, включающие отдельные человеческие популяции, также рассматриваются и находятся в рамках изобретения. Такие воплощения касаются человеческих субъектов, происходящих более чем из одной человеческой популяции, включая европеоидные популяции, популяции Европы, популяции Америки, популяции Евразии, популяции Азии, популяции Центральной и Южной Азии, популяции Восточной Азии, популяции Среднего Востока, популяции Африки, популяции Латинской Америки и популяции Океании, но не ограничиваются ими. Популяции Европы включают шведскую, норвежскую, финскую, русскую, датскую, исландскую, ирландскую, кельтскую, английскую, шотландскую, голландскую, бельгийскую, французскую, немецкую, испанскую, португальскую, итальянскую, польскую, болгарскую, славянскую, сербскую, боснийскую, чешскую, греческую и турецкую популяции, но не ограничивается ими. Коме того, в других воплощениях изобретение может осуществляться на определенных человеческих популяциях, включая банту, манденка, иоруба, сан, пигмеев мбути, жителей оркнейских островов, адыгов, русских, сардинцев, тосканцев, мозабитов, бедуинов, друзов, палестинцев, белуджей, брагуев, макрани синдхов, пуштунов, буришей, хазарейцев, уйгуров, калашей, хань, дай, дауров, хэчже, лаху, мяо, орочонов, шэ, туцзя, ту, сибо, и, монголов, наси, камбоджийцев, японцев, якутов, меланезийцев, папуасов, каритиана, суруи, колумбийцев, майя и пима.

В одном предпочтительном воплощении изобретение касается популяций, имеющих происхождение от черных африканцев, например, популяций, включающих лиц с африканским происхождением или родословной. Происхождение от черных африканцев может определяться при обозначении себя африкано-американцами, афро-американцами, черными американцами, принадлежности к черной расе или принадлежности к негроидной расе. Например, африкано-американцы или черные американцы - это люди, живущие в Северной Америке и происходящие из любой группы черной расы из Африки. В другом примере лица, сообщившие о происхождении от черных африканцев, могут иметь по меньшей мере одного родителя черного африканского происхождения или по меньшей мере дедушку или бабушку черного африканского происхождения.

Расовый вклад индивидов может также определяться с помощью генетического анализа. Генетический анализ происхождения можно провести с помощью несцепленных микросателлитных маркеров, например, как описано у 8ιηί11ι с! а1. (Ат ί Нит Сспс! 74, 1001-13 (2004)).

В определенных воплощениях изобретение относится к маркерам и/или гаплотипам, идентифицированным в конкретных популяциях, согласно описанию выше. Специалистам известно, что показатели неравновесия по сцеплению (НС) могут дать различные результаты на разных популяциях. Это объясняется различиями в популяционной истории у разных человеческих популяций, а также различным давлением отбора, которое могло привести к различиям в НС в определенных участках генома. Специалистам также хорошо известно, что определенные маркеры, например маркеры ОНП, являются полиморфными в одной популяции, но не в другой. Специалисты будут использовать доступные и рекомендуемые здесь способы для применения данного изобретения в любой заданной человеческой популяции. Сюда может входить оценка полиморфных маркеров в участке НС по данному изобретению для идентификации тех маркеров, которые имеют наиболее сильную ассоциацию в определенной популяции. Так, связанные с риском варианты по данному изобретению в различных человеческих популяциях могут встречаться в различных гаплотипах и с различной частотой. Однако, используя способы, известные в данной области техники, и маркеры по данному изобретению, изобретение можно применять в любой данной человече

- 27 019953 ской популяции.

Применение генетического тестирования

Специалистам известно и понятно, что описанные здесь варианты, как правило, сами по себе не позволяют абсолютно точно идентифицировать индивидов, у которых разовьется рак молочной железы. Тем не менее, описанные здесь варианты указывают на повышенную и/или пониженную вероятность того, что у индивидов, имеющих связанные с риском или протективные варианты по изобретению, разовьется рак молочной железы. Такая информация чрезвычайно ценна сама по себе, как это будет подробно продемонстрировано ниже, поскольку она может применяться для контролирования заболевания и выбора соответствующих вариантов лечения.

Знание генетических вариантов, обусловливающих риск развития заболевания (например, рака молочной железы), дает возможность применения генетических тестов для дифференцирования между индивидами с повышенным риском развития заболевания (т.е. носителей, связанных с риском вариантов) и тех, у кого риск развития заболевания понижен (т.е. носителей протективных вариантов). Основными достоинствами генетического тестирования индивидов, относящихся к обеим вышеупомянутым группам, является возможность диагностирования заболевания или предрасположенности к заболеванию на ранней стадии и получение клиницистом информации о прогнозе/агрессивности заболевания для возможности применения наиболее подходящего лечения.

Модели, позволяющие прогнозировать риск рака молочной железы, обусловленный наследственностью

Оценка риска рака молочной железы осуществляется для того, чтобы обосновать разработку персонализированного подхода в лечении всех женщин с целью увеличения продолжительности и качества жизни у женщин, имеющих высокий риск, при одновременной минимизации расходов, ненужных вмешательств и обеспокоенности у женщин, имеющих более низкий риск. В моделях, прогнозирующих риск, производится попытка оценить риск рака молочной железы у индивида, имеющего определенный набор наследственных характеристик риска (например, семейный анамнез, имевшееся ранее доброкачественное поражение молочной железы, имевшаяся ранее опухоль молочной железы). Наиболее часто применяющиеся в клинической практике модели оценки риска рака молочной железы, учитывают наследственные факторы риска, принимая во внимание семейный анамнез. Оценки риска основываются на обнаружении повышенного риска у индивидов, имеющих одного или более близких родственников с ранее диагностированным раком молочной железы. Они не учитывают сложные структуры родословных. Еще один недостаток таких моделей - это невозможность отличить носителей генов с мутациями, предрасполагающими к раку молочной железы, от лиц, не являющихся носителями.

Более сложные модели оценки риска имеют усовершенствованные подходы, позволяющие учитывать определенный семейный анамнез, и способны принимать в расчет статус носительства мутаций ВВСЛ1 и ВВСА2. Например, алгоритм Вгеай и 0тапап Лпа1у818 оГ О|5еа5е 1пс1Йепсе и Сатег Екйтайоп А1доп111т (В0Л01СЕЛ) (Лп1ошои е1 а1., 2004) учитывает семейный анамнез, основанный на индивидуальных структурах родословных, с помощью программы анализа родословных МЕИВЕЬ. Кроме того, учитывается и информация об известном статусе по ВВСЛ1 и ВВСЛ2. Основными недостатками В0ЛЭ1СЕА и других моделей оценки риска рака молочной железы, применяемых в настоящее время, является то, что они не включают информацию по другим генам предрасположенности. Существующие в настоящее время модели в значительной степени используют семейный анамнез в качестве суррогата для того, чтобы компенсировать отсутствие сведений о генетических детерминантах риска, отличных от ВВСЛ. Таким образом, существующие модели привязаны к ситуациям, когда известен семейный анамнез заболевания. Гены, предрасполагающие к раку молочной железы, имеющие более низкую пенетрантность, могут быть довольно распространенными в популяции, но могут не обладать такой способностью вызывать семейную концентрацию, как гены ВВСЛ1 и ВВСА2. Пациенты с относительно большим генетическим грузом аллелей предрасположенности могут иметь слабо выраженный семейный анамнез заболевания или не иметь его. Таким образом, существует необходимость создания моделей, которые бы учитывали данные о наследственной предрасположенности, полученные непосредственно при генетическом тестировании. Кроме того, что такой подход позволит сделать модели более точными, он также уменьшит зависимость от параметров семейного анамнеза и поможет определять риск в приложении к более широким популяциям, в которых семейный анамнез не является ключевым фактором.

Внедрение усовершенствованных моделей оценки генетического риска при проведении первичной профилактики рака молочной железы в клинической практике

Существующие в клинике варианты первичной профилактики можно подразделить на проведение превентивной химиотерапии (или гормональной терапии) и превентивного хирургического вмешательства. Пациентам, у которых выявлен высокий риск, могут быть предписаны длительные курсы превентивной химиотерапии. Такой подход широко применяется в области сердечно-сосудистой медицины, но только начинает внедряться в клинической онкологии. Наиболее широко применяемым в онкологии агентом для превентивной химиотерапии является Тамоксифен, селективный модулятор эстрогеновых рецепторов (СМЭР). Используемый изначально в качестве адьювантной терапии, направленной против рецидивирования рака молочной железы, в настоящее время тамоксифен доказал свою эффективность в

- 28 019953 качестве превентивного агента при раке молочной железы (Ο’ιιζίοΚ с1 а1. 2003; МагПпо с1 а1. 2004). Агентство по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами ΡΌΆ одобрило применение тамоксифена в качестве агента для превентивной химиотерапии у некоторых женщин с высоким риском.

К сожалению, длительное применение тамоксифена повышает риск развития рака эндометрия приблизительно в 2,5 раза, риск венозного тромбоза приблизительно в 2 раза. Риск развития легочной эмболии, инсульта и катаракты также повышаются (ΟϊιζίοΚ с1 а1., 2003). Следовательно, благоприятный эффект от применения тамоксифена для снижения заболеваемости раком молочной железы не обусловливает соответствующего снижения общей смертности. Другой селективный модулятор эстрогеновых рецепторов, ралоксифен, может оказаться более эффективным для профилактики, и он не связан с таким риском рака эндометрия. Однако у пациентов, принимающих длительное время ралоксифен, риск тромбоза остается повышенным (Сиаск с1 а1. 2003; Магйпо с1 а1. 2004). Более того, с приемом тамоксифена и ралоксифена связаны проблемы, касающиеся качества жизни. Для проведения разумного анализа соотношения риска и пользы применения СМЭР в качестве превентивной химиотерапии, в клинике существует необходимость выявления индивидов, имеющих наиболее высокий риск рака молочной железы. Учитывая тот факт, что генетическая составляющая риска рака молочной железы является весьма значительной, в клинической практике существует явная необходимость проведения генетического тестирования для измерения подобного риска у индивидов. Можно предвидеть, что аналогичные проблемы возникнут в отношении любой химиотерапии для предупреждения рака, которая может появиться в будущем, например, в отношении ингибиторов ароматазы. Более того, по мере того как превентивная химиотерапия становится более безопасной, нарастает необходимость выявления пациентов, имеющих генетическую предрасположенность, но не имеющих значительно повышенный риск, ассоциированный с носительством ВКСА1 & 2.

Для пациентов, у которых выявлен высокий риск развития рака молочной железы, рассматривается возможность проведения превентивного хирургического вмешательства; двусторонней мастэктомии или овариэктомии, или и того, и другого. Очевидно, что подобные решительные меры рекомендуются только тем пациентам, у которых риск оценивается как чрезвычайно высокий. На практике, в настоящее время такой риск выявляется только у индивидов, имеющих мутации в генах ВКСА1, ВКСА2 или генах, задействованных в редких синдромах с предрасположенностью к раку молочной железы, например, р53 при синдроме Ли-ФРомени, ΡΤΕΝ при синдроме Коудена.

Оценки пенетрантности мутаций ВКСА1 и ВКСА2 оказываются более высокими, когда их получают для семей, в которых имеется несколько случаев рака молочной железы, чем оценки, полученные для популяции. Это объясняется тем, что в различных семьях с носительством мутаций отмечается различная пенетрантность в отношении рака молочной железы (для примера см. ТРог1асш§ е£ а1., 1997). Одним из основных факторов, вносящих вклад в подобную вариацию, является действие до сих пор не известных генов предрасположенности, эффект которых модифицирует пенетрантность мутаций ВКСА1 и ВКСА2. Следовательно, абсолютный риск для индивида, имеющего мутации в генах ВКСА1 и ВКСА2, невозможно определить точно при отсутствии сведений о существовании и действии модифицирующих генов. Поскольку варианты лечения для носителей ВКСА1 и ВКСА2 могут быть агрессивными, важно проводить количественную оценку рисков у отдельных носителей ВКСА с максимально возможной точностью. Таким образом, существует необходимость выявления генов предрасположенности, эффект которых изменяет степень пенетрантности рака молочной железы у носителей ВКСА1 и ВКСА2, и разработки усовершенствованных моделей оценки риска, основанных на использовании этих генов.

Кроме того, существуют индивиды, у которых риск развития рака молочной железы расценивается как очень высокий, возможно из-за наличия выраженного семейного анамнеза рака молочной железы, но у которых не удалось выявить мутаций в известных генах предрасположенности. В таких случаях сложно рассматривать возможность проведения превентивного хирургического вмешательства, поскольку невозможно провести тестирование индивида для выяснения, унаследовала ли она ген предрасположенности, имеющий высокую пенетрантность. Соответственно, невозможно с точностью оценить риск индивида. Таким образом, в клинической практике существует очевидная необходимость идентификации генов предрасположенности с высокой пенетрантностью, которые остаются неизвестными, и разработки связанных с ними генетических тестов для применения в целях первичной профилактики.

Ранняя диагностика

Скрининг рака молочной железы в клинической практике большинства западных стран представляет собой периодическое клиническое обследование молочной железы и маммографию с помощью рентгеновского излучения. Существуют веские доказательства того, что клиническое обследование молочной железы имеет мало дополнительных преимуществ при использовании в сочетании с хорошей программой маммографического скрининга. В Великобритании женщинам в возрасте от 50 до 70 лет предлагается пройти скрининговую маммографию каждые три года. В Соединенных Штатах ситуация различается в зависимости от организаций, обеспечивающих медицинское обслуживание, но, тем не менее, Американское Общество Рака (Атепсап Сапсег Бос1е1у) рекомендует проводить ежегодный маммографический скрининг начиная с 40 лет. Доказана эффективность маммографического скрининга в снижении смертности среди прошедших скрининг женщин в возрасте старше 50 лет.

- 29 019953

Маловероятно, что генетическое тестирование когда-либо будет применяться в качестве средства, сокращающего доступ к существующим программам маммографического скрининга. Однако маммографический скрининг не лишен недостатков, и подразумевается, что генетическое тестирование должно применяться для отбора людей, нуждающихся в более интенсивных программах скрининга. Одним из недостатков маммографического скрининга является то, что до сих пор не удалось продемонстрировать значимый эффект на повышение выживаемости у женщин, проходящих скрининг в возрасте до 50 лет.

Одной из причин, объясняющей меньшую эффективность маммографии у женщин в возрасте до 50 лет, может быть более высокая плотность тканей молочной железы у молодых женщин, что затрудняет выявление опухолей при маммографии. Тем не менее, рак молочной железы у предрасположенных индивидов имеет тенденцию развиваться в более молодых возрастных группах и существует четкая зависимость между высокой плотностью ткани молочной железы и риском рака молочной железы. Следовательно, существуют затруднения с простой интенсификацией маммографического скрининга у индивидов с высокой предрасположенностью, поскольку к ним будет применяться технология, показывающая не самые оптимальные результаты в группе наиболее высокого риска. Последние исследования показали, что магнитно-резонансная маммография с контрастным усилением (МРМ-КУ) является более чувствительным методом и позволяет детектировать опухоли на более ранних стадиях в данной группе высокого риска по сравнению с маммографическим скринингом (^агпег еЕ а1., 2004; Ьеасй е! а1., 2005). Методика МРМ-КУ дает наилучшие результаты в комбинации с обыкновенной маммографией, использующей рентеновское излучение (Ьеасй е! а1., 2005). Поскольку для проведения МРМ-КУ требуются специализированные центры, что связано с высокими затратами, скрининг индивидов моложе 50 лет может быть ограничен теми, у кого риск наиболее высокий. В проводимых в настоящее время испытаниях МРМ-КУ набор пациентов ограничен индивидами, имеющими мутации ВЕСА1, ВЕСА2 или р53, либо имеющими очень выраженный семейный анамнез заболевания. Применению данной скрининговой тактики к более широкому кругу пациентов, имеющих высокий риск, будет значительно способствовать создание средств для определения профиля риска, основанных на генетической информации.

Существуют убедительные доказательства в пользу точки зрения, что рак молочной железы с ранним началом и рак, возникающий у женщин с генетической предрасположенностью, прогрессирует быстрее, чем у женщин старшего возраста и с меньшей предрасположенностью. Об этом свидетельствует обнаружение более высоких показателей межскринингового рака у молодых женщин, т.е. рак, развивающийся в промежутках между скрининговыми визитами в популяциях, где проводится хороший скрининг, чаще наблюдается у молодых женщин. Вследствие этого предлагается сокращение интервалов скрининга, проводимого любым способом, для молодых женщин. В этой связи возникает парадокс, поскольку оказывается, что наиболее частый скрининг с применением более дорогих методик необходимо проводить в возрастной группе, в которой совокупные показатели рака молочной железы сравнительно низкие. В клинической практике существует очевидная необходимость выявления тех молодых индивидов, у которых имеется наибольшая предрасположенность к раннему развитию заболевания, и направления их в более дорогие и подробные скрининговые программы.

Лечение

В настоящее время в лечении рака молочной железы используются хирургическое вмешательство, адьювантная химиотерапия, радиотерапия, с последующей длительной гормональной терапией. Зачастую применяются комбинации трех или четырех способов лечения.

Пациенты с раком молочной железы, имеющие одинаковые стадии заболевания, могут по-разному отвечать на адьювантную химиотерапию, что приводит к большой вариации общего исхода лечения. Для определения того, подходит ли пациентам с раком молочной железы лечение с помощью адьювантной химиотерапии, были разработаны консенсусные рекомендации (критерии Сен-Галлен и Национального института здоровья). Однако даже наиболее выраженные клинические и гистологические предикторы метастазирования не позволяют с точностью предсказать клинический ответ при наличии опухолей молочной железы (Со1бЫтксй е! а1., 1998; Е1Ее1 е! а1., 2001). Химиотерапия или гормональная терапия сокращает риск метастазирования приблизительно только на 1/3, однако 70-80% пациентов, получающих такое лечение, выжили бы и без него. Таким образом, большинство пациентов с раком молочной железы в настоящее время получают лечение, которое является либо неэффективным, либо ненужным. В клинической практике существует очевидная необходимость разработки усовершенствованных прогностических показателей, которые позволили бы клиницистам назначать лечение, предназначенное для тех, кому оно принесет наибольшую пользу. Следует ожидать, что определение генетической предрасположенности у индивидов может выявить информацию, имеющую значение для исхода лечения и, таким образом, способствовать рациональному планированию лечения.

Примерами данной концепции могут служить несколько предыдущих исследований: пациенты с раком молочной железы, являющиеся носителями мутации ВЕСА, демонстрируют лучшие степени клинического ответа и выживаемость при применении адьювантной химиотерапии [Сйарршк е! а1., (2002), ί Меб Сепе!, 39, 608-10; СоЕйп е! а1., (2003), Сапсег 97, 527-36]. Носители мутации ВЕСА отвечают на химиотерапевтическое лечение рака яичников препаратами платины лучше чем лица, не являющиеся носителями [Сакк е! а1., (2003), Сапсег 97, 2187-95]. Аналогичные соображения могут касаться пациентов,

- 30 019953 имеющих предрасположенность, у которых задействованные при этом гены не известны. Например, известно, что при инфильтрующей дольковой карциноме молочной железы (ИДК МЖ) существует значимый наследственный компонент, но задействованные в нем генетические варианты до сих пор не идентифицированы. Пациенты с ИДК МЖ хуже отвечают на общепринятые режимы химиотерапии [Ма!Ыеи е! а1., (2004), Еиг 1 Сапсег, 40, 342-51].

Модели генетической предрасположенности могут не только способствовать выбору стратегий лечения, но могут играть важную роль в разработке таких стратегий. Например, было обнаружено, что клетки опухолей при мутациях ВКСА1 и ВКСА2 очень чувствительны к ингибиторам поли-(АДФрибоза)-полимеразы (от англ. ро1у (АЭР-пЬоке) ро1утегаке, или РАКР) вследствие дефекта их пути репарации ДНК [Еагтег, е! а1., (2005), ЫаЩге, 434, 917-21]. Это способствовало разработке препаратов малых молекул, направленно воздействующих на РАКР с целью их специфического применения у пациентов с носительством ВКСА. Из данного примера следует, что информация о генетической предрасположенности может идентифицировать мишени для лекарственных препаратов, что позволит разработать индивидуальные режимы химиотерапии для применения в сочетании с определением профиля генетического риска.

Химиотерапия рака имеет хорошо известные ограничивающие дозировку побочные эффекты на нормальные ткани, особенно на интенсивно пролиферирующие гемопоэтические и эпителиальные клетки отделов кишечника. Можно ожидать, что в чувствительности нормальных тканей к цитотоксическим препаратам существуют индивидуальные различия, обусловленные генетически. Понимание этих факторов может способствовать рациональному планированию лечения и разработке лекарственных препаратов, предназначенных для защиты нормальных тканей от побочных эффектов химиотерапии.

Изучение генетического профиля может также способствовать совершенствованию методов радиотерапии: в составе группы пациентов с раком молочной железы, которым радиотерапия проводится в стандартном режиме, часть пациентов будет иметь побочные эффекты в ответ на дозы радиации, которые обычно переносятся. Острые реакции включают эритему, влажную десквамацию, отек и радиационную пневмонию. Отдаленные реакции, включая телеангиэктазии, отек, фиброз, легочный фиброз и фиброз молочной железы могут развиваться много лет спустя после радиотерапии. Как острые, так и отдаленные реакции поражают значительный процент пациентов и могут вызывать летальный исход. В одном исследовании у 87% пациентов были обнаружены некоторые отрицательные побочные эффекты на радиотерапию, тогда как 11% имели серьезные побочные реакции (ЬЕЫТ/^ОМА Огабе 3-4); [Ное11ег е! а1., (2003), Ιη! 1 Каб1а! Опсо1 Вю1 Рйук, 55, 1013-8]. Вероятность развития неблагоприятной реакции в ответ на радиотерапию обусловлена прежде всего конститутивными индивидуальными различиями в реакциях нормальной ткани и существует подозрение, что они имеют существенный генетический компонент. Ряд известных генов предрасположенности к раку молочной железы (например, ВКСА1, ВКСА2, АТМ) затрагивают пути репарации повреждений двойной цепи ДНК. Повреждения двойной цепи ДНК представляют собой первичные цитотоксические повреждения, вызываемые радиотерапией. Это вызвало беспокойство по тому поводу, что индивиды, генетически предрасположенные к раку молочной железы за счет носительства вариантов генов, принадлежащих этим путям, могут также иметь повышенный риск избыточного повреждения нормальных тканей при радиотерапии.

Существование в популяции индивидов с конститутивной чувствительностью к облучению означает, что для большей части пациентов дозы радиации при радиотерапии должны быть ограничены для подержания частоты побочных реакций на приемлемом уровне. Таким образом, в клинической практике существует потребность в надежных тестах, которые позволили бы выявлять индивидов, имеющих повышенный риск развития побочных реакций в ответ на радиотерапию. Такие тесты позволили бы назначать консервативное или альтернативное лечение индивидам с чувствительностью к облучению и в то же время увеличивать дозы при радиотерапии большинству пациентов, являющимся относительно устойчивыми к облучению. Согласно расчетам, увеличение дозы, возможное на основании простого разделения пациентов на категории чувствительных к облучению, устойчивых к облучению и имеющих промежуточную чувствительность, позволило бы добиться улучшения локального контроля над опухолями на 35% и в результате повысить показатели выживаемости (Вите! е! а1., 1996).

Воздействие ионизирующей радиации является известным фактором, способствующим онкогенезу молочной железы (ЭнтЦгекси и Со!аг1а 2005). Известные гены предрасположенности раку молочной железы кодируют компоненты пути клеточного ответа на повреждение ДНК, индуцированное радиацией (Нагоб и Еои1кек 2004). В этой связи существует обеспокоенность по поводу того, что риск развития второй первичной опухоли молочной железы может повышаться при воздействии радиации на нормальные ткани в ходе радиотерапии. По-видимому, не существует какого-либо измеримого повышения риска для носителей ВКСА при радиотерапии, однако риск развития у них второй первичной опухоли уже чрезвычайно высок. Существуют основания полагать, что риск развития второй первичной опухоли повышен среди носителей аллелей генов АТМ и СНЕК2, предрасполагающих к раку молочной железы, которым проводится радиотерапия (Вегпйеш е! а1., 2004; Вгоекк е! а1., 2004). Предполагается, что риск развития вторых первичных опухолей на фоне радиотерапии (и, возможно, на фоне интенсивного маммографического скрининга) будет возможно лучше рассчитать при получении точного профиля генетического рис

- 31 019953 ка у пациентов на этапе планирования лечения.

Вторичная профилактика

Приблизительно у 30% пациентов, у которых была диагностирована 1 или 2 стадия рака молочной железы возникает либо локо-региональный, либо дистантный метастатический рецидив их первоначальной опухоли. Пациенты, имевшие первичный рак молочной железы, имеют также значительно повышенный риск обнаружения второй первичной опухоли либо в контралатеральной молочной железе, либо в ипсилатеральной молочной железе в случае проведения органно-сохраняющей операции. Вторичная профилактика касается способов, применяемых для предупреждения рецидивов или развития вторых первичных опухолей. Способы, применяемые в настоящее время, включают долгосрочное лечение тамоксифеном или другим СМЭР, либо отдельно, либо при чередовании с ингибитором ароматазы, снижающую риск мастэктомию контралатеральной молочной железы и снижающую риск овариэктомию (у пациентов, имеющих риск развития семейного рака молочной железы и яичников). Мнения насчет применения тамоксифена были изложены выше. При проведении снижающего риск хирургического вмешательства очевидно, что для выполнения квалифицированного анализа соотношения затрат и пользы, необходимо максимально точно проводить количественную оценку риска.

Существуют некоторые данные, указывающие на то, что качество жизни у пациентов, имеющих генетическую предрасположенность к раку молочной железы, оказывается хуже, чем у основной массы пациентов. Пациенты с носительством варианта 1100бе1С гена СНЕК2 имеют риск развития дистантных метастазов, в 2,8 раза выше и риск рецидивирования заболевания в 3,9 раза выше, чем при отсутствии носительства (бе Воск е! а1., (2004), ί Меб Сенек 41, 731-5). Пациенты с носительством ВВСА1 с опухолями без поражения лимфатических узлов имеют риск метастазирования выше, чем такие же пациенты, не являющиеся носителями мутации ВВСА1 (СоГПн е! а1., (2003), Сапсег, 97, 527-36; Мо11ег е! а1., (2002), 1пк ί Сапсег, 101, 555-9; Еего1а е! а1., (2001), 1пк ί Сапсег, 93, 368-72). Определение генетического профиля, таким образом, может применяться для оценки риска местного рецидивирования и метастазирования, таким образом, направляя выбор мер вторичной профилактики.

В целом, пациенты с диагнозом первичной опухоли имеют риск развития второй первичной опухоли с ежегодной частотой возникновения новых случаев 0,7% (Реко и Маск 2000). Пациенты с мутациями ВВСА имеют значительно более высокий риск развития вторых первичных опухолей, чем большинство пациентов с раком молочной железы, абсолютный риск у них находится в пределах 40-60% (Еазкоп 1999). Носители мутаций ВВСА имеют значительно более высокий риск развития вторых первичных опухолей (8касеу ек а1., (2006), РЬо8 Меб, 3, е217; Мекса1Ге ек а1., (2004), 1 С1ш Опсо1, 22, 2328-35). Пациенты с мутациями гена СНЕК2 имеют оцениваемый риск рака противоположной молочной железы в 5,7 раза выше (бе Воск, ек а1., (2004), 1 Меб Сепек, 41, 731-5). Носители варианта ВАКЭ1 Суз5578ег имеют в 2,7 более высокую вероятность диагностирования второй первичной опухоли (8касеу ек а1., (2006), РЬо8 Меб, 3, е217). Определение профиля генетического риска может применяться для оценки риска развития второй первичной опухоли у пациентов и принятия взвешенного решения о том, насколько агрессивными должны быть меры профилактики.

Способы по изобретению

Здесь описываются способы оценки риска рака молочной железы и они находятся в рамках изобретения. Изобретение также включает способы оценки возможности ответа индивида на терапевтический агент, применяемый при раке молочной железы, а также способы прогнозирования эффективности терапевтического агента, применяемого при раке молочной железы. Наборы для изучения образца, взятого у пациента для определения подверженности к сердечно-сосудистому заболеванию, также находятся в рамках изобретения.

Диагностические способы и скрининговые тесты

В определенных воплощениях данное изобретение относится к способам диагностики или помощи в диагностике рака молочной железы или подверженности раку молочной железы путем детектирования конкретных аллелей генетических маркеров, которые наиболее часто встречаются у субъектов, имеющих рак молочной железы или субъектов, предрасположенных к раку молочной железы. В конкретном воплощении изобретение представляет собой способ диагностики подверженности раку молочной железы путем детектирования по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера (например, описанных здесь маркеров). Данное изобретение описывает способы, при которых детектирование конкретных аллелей конкретных маркеров или гаплотипов указывает на подверженность раку молочной железы. Такие прогностические или прогнозирующие тесты могут также проводиться для выбора мер профилактики для пациента до того, как у него возникнут симптомы рака молочной железы. Данное изобретение в некоторых воплощениях относится к способам клинического применения диагностики, например диагностике, проводимой медицинскими сотрудниками. В других воплощениях изобретение относится к способам диагностики или определения подверженности, проводимой неспециалистом. Последние технологические достижения в технологиях генотипирования, включая высокопроизводительное генотипирование маркеров ОНП, например, технология Мо1еси1аг 1пуегзюп РгоЬе аггау (например, в системе СепеСЫр компании АГГутекпх) и технологии ВеабАггау (например, в системах Со1беп Саке и Шашит компании 111ит1па) обеспечили возможность проведения индивидам оценки их генома

- 32 019953 одновременно по одному миллиону ОНП по относительно небольшой стоимости. Полученная информация о генотипе, выдаваемая пациенту, может сравниваться с информацией по риску заболевания или признаках заболевания, ассоциированном с различными ОНП, находящейся в открытом доступе в научной литературе. Диагностическую информацию по ассоциированным с заболеванием аллелям по данному описанию, таким образом, могут получать либо индивиды, путем анализа данных его/ее генотипа, либо медицинские сотрудники на основании результатов клинического теста. Другими словами, диагностика, или оценка подверженности, основанная на генетическом риске, может выполняться медицинскими сотрудниками, генетическими консультантами или неспециалистами на основе информации о генотипе человека и публикаций по различным факторам риска. В данном контексте термин диагностика, диагностировать подверженность и определить подверженность используются в отношении любого диагностического способа, включая те, которые были упомянуты выше.

Кроме того, в других конкретных воплощениях данное изобретение относится к способам диагностики, или помощи в диагностике пониженной подверженности раку молочной железы путем детектирования определенных аллелей генетических маркеров или гаплотипов, которые встречаются у пациентов с диагностированным раком молочной железы реже, чем у индивидов, у которых не диагностирован рак молочной железы, либо в общей популяции.

Согласно данному описанию и примерам, определенные аллели маркеров или гаплотипы (например, маркеры, расположенные в составе блока НС гк4848543, блока НС гк13387042, блока НС гк3803662, гена §ТЕΛР3/Т§ΛР6, маркеры и гаплотипы, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними) ассоциированы с раком молочной железы (например, рак молочной железы с фенотипом все формы РМЖ и/или УмерПред). В одном воплощении аллель маркера или гаплотип обусловливает существенный риск или подверженность раку молочной железы. В другом воплощении изобретение касается способа диагностики подверженности раку молочной железы у человеческого индивида, способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятого у индивида или массиве данных генотипа, полученного для индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из группы, состоящей из полиморфных маркеров, расположенных в составе блока НС гк4848543, блока НС гк13387042, блока НС гк3803662, гена §ТЕΛР3/Т§ΛР6, маркеров и гаплотипов, приведенных в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними (например, характеризуемом г² > 0,2). В другом воплощении изобретение относится к способам диагностики подверженности раку молочной железы у человеческого индивида путем скрининга по меньшей мере одного аллеля маркера или гаплотипа, например, маркеров, расположенных в составе блока НС гк4848543, блока НС гк13387042, блока НС гк3803662, гена §ТЕΛР3/Т§ΛР6, маркеров и гаплотипов, приведенных в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В другом воплощении аллель маркера или гаплотип встречаются у лиц, имеющих или подверженных раку молочной железы (пораженных, например, с фенотипов РМЖ все формы РМЖ и/или УмерПред) чаще по сравнению с частотой их встречаемости у здоровых лиц (в контроле, например, в популяционном контроле). В другом воплощении изобретение относится к способу диагностики подверженности раку молочной железы у человеческого индивида, способ включает определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивида, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из маркера гк4848543, маркера гк13387042, маркера гк3803662 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В определенных воплощениях достоверность ассоциации по меньшей мере одного аллеля маркера или гаплотипа характеризуется значением Р <0,05. В других воплощениях достоверность ассоциации характеризуется меньшими значениями Р, такими как <0,01, <0,001, <0,0001, <0,00001, <0,000001, <0,0000001, <0,00000001 или <0,000000001.

В данных воплощениях наличие по меньшей мере одного аллеля маркера или гаплотипа указывает на подверженность раку молочной железы. Данные диагностические способы включают детекцию наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля маркера или гаплотипа, ассоциированного с раком молочной железы. Гаплотипы по данному описанию включают комбинации аллелей по разным генетическим маркерам (например, ОНП, микросателлитам). Детекция конкретных аллелей генетических маркеров, составляющих определенные гаплотипы, может выполняться при помощи разнообразных методов, описываемых здесь и/или известных в данной области техники. Например, генетические маркеры можно детектировать на уровне нуклеиновых кислот (например, с помощью прямого секвенирования нуклеотидов или с помощью других средств, известных специалистам) или на уровне аминокислот, если генетический маркер затрагивает кодирующую последовательность для белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы (например, путем секвенирования белка или с помощью иммунологических тестов с применением антител, распознающих такой белок). Аллели маркеров или гаплотипы по данному изобретению соответствуют фрагментам последовательности геномной ДНК, ассоциированной с раком молочной железы. Такие фрагменты включают последовательность ДНК обсуждаемого полиморфного маркера или гаплотипа, но также могут включать сегменты ДНК в сильном НС (неравновесии по сцеплению) с маркером или гаплотипом (например, характеризуемому значениями

- 33 019953 г² выше 0,2 и/или |Ό'| > 0,8).

В одном воплощении диагностика подверженности раку молочной железы может осуществляться с помощью методов гибридизации, например Саузерн анализу, Нозерн анализу, и/или гибридизации ш к1!и (см. Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, АикиЬе1 Е. е! а1., ейк., 1ойп ^11еу & δοпк, включая все приложения). Биологический образец тестируемого субъекта или индивида («тестируемый образец») геномной ДНК, РНК или кДНК получают у субъекта с подозрением на наличие, предрасположенность или подверженность раку молочной железы (тестируемого субъекта).Субъект может быть взрослым, ребенком или плодом. Тестируемый образец может быть получен из любого источника, содержащего геномную ДНК, например, образца крови, образца амниотической жидкости, образца цереброспинальной жидкости, или образца ткани кожи, мышцы, буккальной слизистой или конъюнктивы, плаценты, желудочнокишечного тракта или других органов. Тестируемый образец ДНК из фетальных клеток или тканей может быть получен с помощью соответствующих способов, например, амниоцентеза или обследование хорионических ворсинок. Затем проводится тестирование образца ДНК, РНК или кДНК. Наличие конкретного аллеля маркера может быть обнаружено при помощи специфической гибридизации зонда нуклеиновой кислоты, специфического в отношении определенного аллеля. Наличие более одного аллеля специфического маркера или специфического гаплотипа может быть обнаружено с помощью нескольких последовательность-специфических зондов нуклеиновых кислот, каждый из которых специфичен в отношении конкретного аллеля. В одном воплощении гаплотип может быть идентифицирован с помощью единственного зонда нуклеиновой кислоты, специфичного в отношении определенного гаплотипа (т.е. специфически гибридизующегося с нитью ДНК, содержащей аллели определенных маркеров, характерных для гаплотипа). Зонд, специфичный в отношении последовательности, может быть предназначен для гибридизации с геномной ДНК, РНК или кДНК. Зонд нуклеиновой кислоты в данном описании может представлять собой зонд ДНК или зонд РНК, который гибридизуется с комплементарной последовательностью. Специалистам известно, как создать такой зонд, чтобы гибридизация, специфичная в отношении последовательности, имела место только при наличии конкретного аллеля в геномной последовательности из тестируемого образца.

Для диагностики подверженности раку молочной железы гибридизованный образец формируется при инкубации тестируемого образца, содержащего нуклеиновую кислоту, ассоциированную с раком молочной железы, например, образца геномной ДНК, с по меньшей мере одним зондом нуклеиновой кислоты. Нелимитирующим примером зонда для детекции мРНК или геномной ДНК является меченый зонд нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с описанными здесь последовательностями мРНК или геномной ДНК. Зонд нуклеиновой кислоты может быть, например, целой молекулой нуклеиновой кислоты или ее частью, например, олигонуклеотидом с длиной по меньшей мере 15, 30, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов, достаточной для специфической гибридизации с соответствующей мРНК или геномной ДНК в строгих условиях. Например, зонд нуклеиновой кислоты может включать нуклеотидную последовательность, приведенную в δΞΟ ΙΌ N0:4, δΞΟ ГЫ N0:5 ог δΞΟ ΙΌ N0:6, или ее часть, нуклеотидную последовательность блока НС гк4848543, блока НС гк13387042, блока НС гк3803662 и/или гена δТЕΛР3/ТδΛР или ее часть, возможно, включая по меньшей мере один аллель маркера по данному описанию или по меньшей мере один маркер или гаплотип по данному описанию (например, маркеры и гаплотипы, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними) или по меньшей мере один аллель, входящий в состав гаплотипов по данному описанию, или зонд может быть комплементарной последовательностью к такой последовательности. Здесь описываются и другие зонды, подходящие для применения в диагностических тестах по изобретению. Гибридизация может проводиться с помощью способов, хорошо известных специалистам (см., например, Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, АикиЬе1 Е. е! а1., ейк., Йо1т \УПеу & δοпк, включая все приложения). В одном воплощении гибридизация означает специфическую гибридизацию, т.е. гибридизацию без несовпадений (точную гибридизацию). В одном воплощении условия гибридизации при специфической гибридизации являются строгими.

Специфическая гибридизация, если она имеет место, определяется с помощью стандартных методов. Если специфическая гибридизация происходит между зондом нуклеиновой кислоты и ассоциированной с раком молочной железы нуклеиновой кислотой в тестируемом образце, значит образец содержит аллель, комплементарный нуклеотиду, присутствующему в зонде нуклеиновой кислоты. Процесс можно повторить для других маркеров по данному изобретению или маркеров, составляющих гаплотип по данному изобретению, или несколько зондов можно использовать параллельно для детекции аллелей более чем одного маркера одновременно. Возможно также создать единый зонд, содержащий аллели более чем одного маркера определенного гаплотипа (например, зонд, содержащий аллели, комплементарные к 2, 3, 4, 5 или всем маркерам, составляющим конкретный гаплотип). Детектирование конкретных маркеров гаплотипа в образце указывает на то, что источник, у которого был взят образец, имеет конкретный гаплотип (например, гаплотип) и таким образом является подверженным раку молочной железы.

В одном предпочтительном воплощении способ, в котором применяется детектирующий олигонуклеотидный зонд, включающий флуоресцентный компонент или группу на своем 3' конце и гаситель на

- 34 019953 своем 5' конце, и усиливающий олигонуклеотид, применяется согласно описанию у ΚιιΙνηνίΐ'ΐ е! а1. (Νυс1ею Ас1б Кек. 34:е128 (2006)). Флуоресцентным компонентом может служить Οίβ НагЬог Сгееп или Уайта Уе11о\\·, или другой подходящий флуоресцентный компонент. Детектирующий зонд создается для гибридизации с короткой нуклеотидной последовательностью, содержащей однонуклеотидный полиморфизм, подлежащий определению. Предпочтительно, однонуклеотидный полиморфизм находится в любом положении от концевого остатка до -6 остатка с 3' конца детектирующего зонда. Усилитель представляет собой короткий олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с ДНК-матрицей в 3' положении относительно детектирующего зонда. Зонды создаются таким образом, что, когда детектирующий зонд и усиливающий нуклеотидный зонд оба связаны с матрицей, между ними существует однонуклеотидный пробел. Этот пробел приводит к появлению искусственного сайта в виде остатка дезоксирибозы, лишенного азотистого основания, распознаваемого эндонуклеазой, например, эндонуклеазой IV. Фермент отщепляет краситель от полностью комплементарного детектирующего зонда, но не может расщепить детектирующий зонд, содержащий несовпадение. Таким образом, путем измерения флуоресценции высвобожденного флуоресцентного компонента может проводиться оценка наличия конкретного аллеля, определяемого нуклеотидной последовательностью детектирующего зонда.

Детектирующий зонд может быть любого подходящего размера, хотя предпочтительно зонды бывают относительно короткими. В одном воплощении зонд имеет длину 5-100 нуклеотидов. В другом воплощении зонд имеет длину 10-50 нуклеотидов, а в другом воплощении зонд имеет длину 12-30 нуклеотидов. Другие размеры зондов также возможны и находятся в рамках компетенции специалиста в данной области.

В предпочтительном воплощении ДНК-матрица, содержащая однонуклеотидный полморфизм, перед детекцией амплифицируется в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В таким воплощении амплифицируемая ДНК служит матрицей для детектирующего зонда и усиливающего зонда.

Определенные воплощения детектирующего зонда, усиливающего зонда, и/или праймеров, используемых для амплификации матрицы в ПЦР, включают применение модифицированных оснований, включая модифицированные А и модифицированные С. Применение модифицированных оснований может использоваться для подгонки температур плавления нуклеотидной молекулы (зонда и/или праймера) и ДНК-матрицы, например, для повышения температуры плавления в участках с низким процентным содержанием оснований С или С, в которых могут применяться модифицированные А, со способностью формировать три водородные связи со своими комплементарными Т, или для понижения температуры плавления в участках с высоким процентным содержанием оснований С или С, например, при применении модифицированных оснований С, формирующих только две водородные связи с комплементарными им основаниями С в двунитевой молекуле ДНК. В предпочтительном воплощении модифицированные основания применяются для создания детектирующего нуклеотидного зонда. Любое модифицированное основание, известное специалистам, может быть выбрано в этих методах, и выбор подходящих оснований находится в рамках компетенции специалиста и основывается на приведенных здесь сведениях и имеющихся в распоряжении специалиста основаниях, доступных из коммерческих источников.

При другом способе гибридизации, для идентификации наличия полиморфизма, ассоциированного с раком молочной железы, используется Нозерн анализ (см. Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, АикиЬе1 Р. е! а1., ебк., Ьойп \УПеу & 8опк, кирга). Для Нозерн-анализа тестируемый образец РНК получают у субъекта соответствующими способами. Согласно данному описанию, специфическая гибридизация зонда нуклеиновой кислоты с РНК субъекта указывает на наличие конкретного аллеля, комплементарного к зонду. Репрезентативные примеры применения зондов нуклеиновых кислот приведены, например, в И8 Ра!еп! Ναι. 5288611 и 4851330.

Кроме того, в описываемых здесь гибридизационных методах в дополнение к зонду нуклеиновой кислоты или вместо него можно использовать зонд пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК). ПНК представляет собой ДНК, имитирующую наличие пептидоподобного неорганического скелета, например, единиц №(2-аминоэтил)глицина с органическими основаниями (А, С, С, Т или и), присоединенных к атому азота глицина через метиленовый карбонильный линкер (см, например, №е1кеп Р. е! а1., Вюсопщд. Сйет. 5:3-7 (1994)). Зонд ПНК может быть специально сконструирован для специфической гибридизации в образце с молекулой, предположительно содержащей одну или более аллелей маркера или гаплотипа, ассоциированных с раком молочной железы. Таким образом, гибридизация зонда ПНК будет диагностичной в отношении рака молочной железы или подверженности раку молочной железы.

В одном воплощении изобретения у субъекта берется тестируемый образец, содержащий геномную ДНК, и для амплификации фрагмента, содержащего один или более маркеров или гаплотипов по данному изобретению применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Согласно данному описанию, идентификация конкретного аллеля маркера или гаплотипа, ассоциированного с раком молочной железы, может проводиться с помощью разнообразных методов (например, анализа последовательности, анализа с помощью рестрикционного расщепления, специфической гибридизации, анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (от англ. 8тд1е 8!тапбеб СопЕоттайоп Ро1утотрЫкт, 88СР), электрофоретического анализа и т.д. В другом воплощении диагностика выполняется путем анализа экспрессии с помощью количественной ПЦР (кинетический термоциклер). Для такой методики, например, могут

- 35 019953 применяться коммерческие доступные системы, такие как ТацМаи® (Аррйеб Вюзуз!етз, Еоз!ег Сйу, СА). Методика позволяет оценить наличие изменения в экспрессии или составе полипептида или варианта (вариантов) сплайсинга, кодируемых нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы. Кроме того, экспрессия варианта (вариантов) может расцениваться как физическое или функциональное отличие.

В другом способе по изобретению для детектирования определенного аллеля может применяться рестрикционный анализ, в том случае, если аллель обусловливает образование или исчезновение рестрикционного сайта референсной последовательности. Может быть проведен анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (от англ. Вез!пс!юп Егадтеп! Ьепд!й Ро1утогрЫзт, ВЕЬР), например, согласно описанию в Сиггеп! Рго!осо1з т Мо1еси1аг Вю1оду, зирга. Профиль расщепления соответствующего фрагмента ДНК указывает на присутствие или отсутствие конкретного аллеля в образце.

Анализ последовательности может также применяться для детекции определенных аллелей полиморфных сайтов, ассоциированных с раком молочной железы (например, полиморфных маркеров и гаплотипов по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и/или 22 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними). Так, в одном воплощении определение наличия или отсутствия конкретных аллелей маркеров или гаплотипов включает анализ последовательности тестируемого образца ДНК или РНК, полученного у субъекта или индивида. Для амплификации части нуклеиновой кислоты, ассоциированной с раком молочной железы, может применяться ПЦР или другой соответствующий метод, а наличие определенного аллеля затем может определяться непосредственно путем секвенирования полиморфного сайта (или множества полиморфных сайтов в гаплотипе) геномной ДНК в образце.

Аллель-специфические олигонуклеотиды могут также применяться для детекции наличия конкретного аллеля нуклеиновой кислоты, ассоциированной с раком молочной железы (например, полиморфных маркеров и гаплотипов по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и/или 22 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними), с помощью дот-блот гибридизации амплифицированных олигонуклеотидов с аллельспецифическими олигонуклеотидными зондами (от англ. Аллель-8рес1йс О1|допис1ео1|бе, А8О) (см. для примера 8а1к1 В. е! а1., Ыа!иге, 324:163-166 (1986)). Аллель-специфический олигонуклеотид (также обозначаемый здесь как аллель-специфический олигонуклеотидный зонд) представляет собой олигонуклеотид состоящий примерно из 10-50 пар оснований или примерно из 15-30 пар оснований, который специфически гибридизуется с нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы, содержащей определенный аллель полиморфного сайта (например, маркер или гаплотип, согласно данному описанию). Аллель-специфический олигонуклеотидный зонд, специфичный к одной или более конкретной нуклеиновой кислоте, ассоциированной с раком молочной железы, может быть создан с применением стандартных способов (см., например, Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, зирга). Для амплификации желаемого участка может использоваться ПЦР. Можно провести дот-блоттинг ДНК, содержащей амплифицированный участок, с помощью стандартных методов (см., например, Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, зирга), и блот может быть инкубирован с олигонуклеотидным зондом. Затем можно определить наличие специфической гибридизации зонда с амплифицированным участком. Специфическая гибридизация аллель-специфическиго олигонуклеотидного зонда с ДНК субъекта указывает на наличие определенного аллеля полиморфного сайта, ассоциированного с раком молочной железы (см., например, О1ЬЬз В. е! а1., Ыис1ею Аабз Вез., 77: 2437-2448 (1989) и АО 93/22456).

С добавлением таких аналогов, как закрытые нуклеиновые кислоты (от англ. Ьоскеб Ыис1ею Ас1бз, ЬЫАз), размер праймеров и зондов может быть уменьшен всего до 8 оснований. ЬЫАз являются новым классом бициклических аналогов ДНК, в которых 2' и 4' положения фуранозного кольца связаны через О-метиленовые (окси-ЬЫА), 8-метиленовые (тио-ЬЫА), или амино-метиленовые (амино-ЬЫА) группировки. Общим для всех этих вариантов ЬЫА является аффинность к комплементарным нуклеиновым кислотам, которая является наиболее высокой среди всех известных аналогов ДНК. Например, было показано, что определенные нонамеры окси-ЬЫА имеют температуры плавления (Т_т) 64 и 74°С будучи в комплексе, соответственно, с комплементарной ДНК или РНК, в противоположность 28°С для ДНК и РНК в случае соответствующего нонамера ДНК. Существенное повышение Тт также происходит, когда мономеры ЬЫА используются в комбинации с мономерами стандартной ДНК или РНК. Т_т для праймеров и зондов может быть существенно повышена в зависимости от того, куда включаются мономеры ЬЫА (например, на 3' конце, на 5' конце или в середине).

В другом воплощении, панели олигонуклеотидных зондов, комплементарных к целевым сегментам последовательности нуклеиновой кислоты субъекта, могут применяться для идентификации полиморфизмов в нуклеиновой кислоте, ассоциированной с раком молочной железы (например, полиморфные маркеры и гаплотипы по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и/или 22 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними).

Например, могут быть использованы нуклеотидные панели. Олигонуклеотидные панели обычно содержат множество различных олигонуклеотидных зондов, связанных с поверхностью субстрата в разных известных положениях. Такие олигонуклеотидные чипы, также обозначаемые как ОепесЫрз™, широко описаны в данной области техники (см. например, и.8. Ра!еп! Ыо. 5143854, РСТ Ра!еп! РиЬ11са!юп

- 36 019953

N08. \¥0 90/15070 и 92/10092). Эти чипы обычно производятся с помощью механических методов синтеза, включающих сочетание фотолитографических методов и методов твердофазного синтеза олигонуклеотидов, или с помощью других методов, известных специалистам (см., например, Робот 8. е! а1., 8с1еисе, 251: 767-773 (1991); Ритиид е! а1., и.8. Ра!еи! N0. 5143854 (см. также опубликованную заявку РСТ N0. \У0 90/15070); и Робот. 8. е! а1., опубликованная заявка РСТ N0. \¥0 92/10092 и и.8. Ра!еи! N0. 5424186, описания которых включены сюда во всей их полноте путем ссылок). Технологии синтеза этих чипов с применением методов механического синтеза описаны, например, в и.8. Ра!еи! N0. 5,384,261; описания которых включены сюда во всей их полноте путем ссылок. В другом примере могут применяться линейные чипы.

После получения олигонуклеотидного чипа производится гибридизация нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, с чипом. Детекция гибридизации представляет собой детекцию определенного аллеля нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Гибридизация и сканирование как правило проводятся при помощи способов, описываемых здесь или при помощи других способов, известных специалистам, например, согласно описанию в опубликованных патентных заявках \¥0 92/10092 и \У0 95/11995, и патенте и.8. Ра!еи! N0. 5424186 описания которых включены сюда во всей их полноте путем ссылок. Коротко, последовательность нуклеиновой кислоты - мишени, включающая один или более идентифицированных ранее полиморфных маркеров, амплифицируют при помощи хорошо известных методов амплификации (например, ПЦР). Обычно при этом применяют праймеры, последовательность которых комплементарна двум цепочкам последовательности - мишени, как выше, так и ниже полиморфного сайта. Также могут применяться методики асимметричной ПЦР. Амплифицированная мишень, как правило, инкорпорирующая метку, затем гибридизуется с чипом при соответствующих условиях, при которых возможна последовательность-специфическая гибридизация. После окончания гибридизации и отмывки чипа, чип сканируют для определения участка чипа, с которым гибридизуется последовательность - мишень. Данные о гибридизации, полученные при сканировании, обычно бывают представлены в форме интенсивностей флуоресценции, указанных для позиций чипа.

Несмотря на то, что чипы изначально были описаны для одиночного детектируемого блока, например, для детекции одиночного полиморфного сайта, они могут включать множество детектируемых блоков, и таким образом позволять анализировать множественные специфические полиморфизмы (например, множественные полиморфизмы определенного гаплотипа). Возможны компоновки, в которых детектируемые блоки могут быть сгруппированы в пределах одного чипа или нескольких отдельных чипов таким образом, что можно варьировать оптимальные условия для гибридизации мишени с чипом. Например, зачастую бывает желательно провести детекцию тех полиморфизмов, которые приходятся на участки геномной последовательности, богатые С-С, в отдельности от тех полиморфизмов, которые приходятся на сегменты, богатые А-Т. Таким образом оказывается возможным отдельно оптимизировать условия гибридизации для каждой ситуации.

Дополнительные описания применений олигонуклеотидных чипов для детекции полиморфизмов можно найти, например, в патенах США И8 5858659 и 5837832, описания которых включены сюда во всей их полноте путем ссылок.

Для детекции конкретного аллеля полиморфного сайта, ассоциированного с раком молочной железы (например, полиморфных маркеров по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними), могут применяться другие методы анализа нуклеиновых кислот, доступные специалистам. Репрезентативные методы включают, например, прямое секвенирование вручную (Сйитсй и СПЬеП, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сЕ И8А, 81: 1991-1995 (1988); 8аидег, Р. е! а1., Ргос. ЦаИ. Асаб. 8сЕ И8А, 74: 5463-5467 (1977); Веау18 е! а1., патент США И8 5,288,644); авоматизированное секвенирование с использованием флуоресценции; анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (81ид1е 8!гаибеб соиГоппабои ро1утотй18т а88ау8, 88СР); электрофорез в денатурирующем геле с фиксацией СС (с1атреб беиаШгшд де1 е1ес1торйоге818, СЭСЕ); электрофорез в градиентном денатурирующем геле (беиа!игтд дгаб1еи! де1 е1ес1гор11оге818, ОССЕ) (8йеГДе1б V. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А, 86: 232-236 (1989)), анализ по сдвигу электрофоретической подвижности (тоЬййу 81ιίΠ аиа1у818) (0п!а М. е! а1., Ргос. №И1. Асаб. 8сЕ И8А, 86: 2766-2770 (1989)), рестрикционный анализ (Е1ауе11 К. е! а1., Се11, 15:25-41 (1978); Сееуег, К., еГ а1., Ргос. №ι!1. Асаб. 8с1. И8А, 78:5081-5085 (1981)); гетеродуплексный анализ; химическое расщепление некомплементарных сайтов (сйетюа1 т18та!сй с1еауаде, СМС) (Со!!ои К. е! а1., Ргос. №-Н1. Асаб. 8сЕ И8А, 85: 4397-4401 (1985)); анализ с помощью защиты от рибонуклеазы (К№18С рто!ес!юи а88ау8) (Муег8 К. е! а1., 8с1еисе, 230: 1242-1246 (1985); применение полипептидов, распознающих нуклеотидные несовпадения, таких, как белок Е. сой ти!8; и аллель-специфическую ПЦР.

В другом воплощении изобретения диагностика рака молочной железы или подверженности раку молочной железы может проводиться при изучении экспрессии и/или состава полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы в тех случаях, когда генетический маркер (маркеры) или гаплотип (гаплотипы) по данному изобретению приводят к изменению состава или экспрессии полипептида. Так, диагностика подверженности раку молочной железы может проводиться при изучении экспрессии и/или состава одного из указанных полипептидов или другого полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы в тех случаях, когда

- 37 019953 генетический маркер или гаплотип по данному изобретению приводит к изменению состава или экспрессии полипептида. Гаплотипы и маркеры по данному изобретению, ассоциированные с раком молочной железы, могут оказываеть эффект на один или более близкорасположенных генов (например, ген ΡΙΤΧ2). Возможный механизм влияния на эти гены включает, например, влияние на транскрипцию, влияние на сплайсинг РНК, изменения в относительном количестве форм альтернативного сплайсинга мРНК, влияние на стабильность РНК, влияние на транспорт из ядра в цитоплазму и влияние на эффективность и точность трансляции.

Так, в другом воплощении варианты (маркеры или гаплотипы) по изобретению, демонстрирующие ассоциацию с раком молочной железы, влияют на экспрессию близкорасположенного гена. Известно, что регуляторные элементы, влияющие на экспрессию генов, могут располагаться за десятки и даже сотни килобаз от участка промотора гена. Оценивая наличие или отсутствие по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера по данному изобретению, возможно оценить уровень экспрессии таких близрасположенных генов. Предполагается, что детекция маркеров или гаплотипов по данному изобретению может применяться для оценки экспрессии одного или более генов 8ΤΕΛΡ3/Τ8ΛΡ6, БОС643714 и ΤΝΚΤ9.

Для определения уровня экспрессии белков могут применяться различные методы, включая иммуноферментный анализ, Вестерн блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Тестируемый образец субъекта оценивается на наличие изменения в экспрессии и/или изменения в составе полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы. Изменения в экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы могут, например, представлять собой изменения в количестве экспрессируемого полипептида (т.е. количество продуцируемого полипетида). Изменения в составе полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы представляют собой качественные изменения в экспрессии полипептида (например, экспрессия мутантного полипептида или другого сплайсингового варианта). В одном воплощении диагностика подверженности раку молочной железы производится путем детекции определенного сплайсингового варианта, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы, или определенного профиля сплайсинговых вариантов.

Могут иметь место оба вида таких нарушений (количественные и качественные). Изменение в экспрессии или составе полипептида, по данному описанию, относится к изменению экспрессии или состава тестируемого образца, по сравнению с экспрессией или составом полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы, в контрольном образце. Контрольным образцом является образец, соответствующий тестируемому образцу (например, происходит из того же типа клеток) и забирается у субъекта, который не поражен или который не подвержен раку молочной железы. В одном воплощении контрольный образец берется у субъекта, который не имеет аллеля маркера или гаплотипа по данному описанию. Также наличие одного или более различных вариантов сплайсинга в тестируемом образце или присутствие значительно различающегося количества разных вариантов сплайсинга в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом может указывать на подверженность раку молочной железы. Изменения экспрессии или состава полипептида в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом может указывать на наличие определенного аллеля в случае, когда аллель приводит к изменению сайта сплайсинга относительно референсного в контрольном образце. Могут применяться различные способы изучения экспрессии или состава полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы, включая спектроскопию, колориметрию, электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и иммунологические методы (например, Όανίά е! а1., И.8. Ра!. Νο. 4376110), такие как иммуноблоттинг (см., например, Сиггеи! РгсИосоЕ ίη Мо1еси1аг В1о1оду, особенно главу 10, кирга).

Например, в одном воплощении может использоваться антитело (например, антитело с детектируемой меткой), способное связываться с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Может использоваться интактное антитело или его фрагмент (например, Εν, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂). Термин меченое в отношении зонда или антитела применяется для обозначения прямого мечения зонда путем сшивания (т.е. физического связывания) детектируемого вещества с зондом или антителом, а также непрямого мечения зонда или антитела по его способности реагировать с другим реагентом, меченым напрямую. Примеры непрямого мечения включают детекцию первичного антитела с помощью меченого вторичного антитела (например, вторичное антитело с флуоресцентной меткой) и концевое мечение ДНК-зонда биотином, что позволяет его детектировать флуоресцентно-меченым стрептавидином.

В одном воплощении данного метода уровень или количество полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы (например, нуклеиновой кислотой, кодирующей гены 8ΤΕΛΡ3/Τ8ΛΡ6, БОС643714 или ΤΝΚΥ9), в тестируемом образце сравнивается с уровнем или количеством полипептида в контрольном образце. Количество или уровень полипептида в контрольном образце, которое выше или ниже уровня или количества полипептида в контрольном образце настолько, что различие статистически достоверно, указывает на изменение экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, и является диагностическим в отношении конкретного аллеля или

- 38 019953 гаплотипа, ответственного за различие в экспрессии. В альтернативном варианте, состав полипептида в тестируемом образце сравнивается с составом полипептида в контрольном образце. В другом воплощении могут оцениваться как уровень или количество, так и состав полипептида в тестируемом образце и в контрольном образце.

В другом воплощении диагностика подверженности раку молочной железы проводится по детектированию по меньшей мере одного маркера или гаплотипа по данному изобретению (например, ассоциированных аллелей маркеров и гаплотипов, приведенных в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними) в сочетании с дополнительным исследованием белков, РНК или ДНК. Способы по изобретению могут также использоваться в сочетании с анализом семейного анамнеза субъекта и факторов риска (например, факторов риска внешней среды, факторов риска образа жизни).

Наборы

Наборы, применяемые в способах по изобретению, включают компоненты, применяемые в любых описываемых здесь способах, включая, например, гибридизационные зонды, рестрикционные ферменты (например, для анализа ВЕЬР), аллель-специфические олигонуклеотиды, антитела, связывающиеся с измененными полипептидами, кодируемыми нуклеиновой кислотой по изобретению согласно данному описанию (например, сегментом генома, содержащим по меньшей мере один полиморфный маркер и/или гаплотип по данному изобретению) или с неизмененным (нативным) полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по изобретению согласно данному описанию, средства для амплификации нуклеиновой кислоты, ассоциированной с раком молочной железы, средства для анализа нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, ассоциированной с раком молочной железы, средства для анализа аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с раком молочной железы и т.д. Наборы могут, например, содержать необходимые буферы, праймеры нуклеиновых кислот для амплификации нуклеиновых кислот по изобретению (например, одного или более полиморфных маркеров по данному описанию) и реагенты для аллельспецифической детекции амплифицируемых фрагментов с применением таких праймеров и необходимых ферментов (например, ДНК-полимеразы). Кроме того, наборы могут иметь реагенты для тестов, для применения в сочетании со способами по данному изобретению, например, реагенты для применения в тестах для диагностики рака молочной железы.

В одном воплощении изобретение представляет собой набор для тестирования образца, взятого у субъекта, для детекции наличия у субъекта рака молочной железы или подверженности раку молочной железы, когда набор включает реагенты, необходимые для избирательного детектирования по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфизма по данному изобретению в геноме индивида. В конкретном воплощении реагенты включают по меньшей мере один примыкающий олигонуклеотид, гибридизующийся с фрагментом в геноме индивида, содержащим по меньшей мере один полиморфизм по данному изобретению. В другом воплощении реагенты включают по меньшей мере одну пару олигонуклеотидов, гибридизующихся с противоположными нитями сегмента генома, полученного у субъекта, когда каждая пара олигонуклеотидных праймеров создана для селективной амплификации фрагмента генома индивида, содержащего по меньшей мере один полиморфизм, когда полиморфизм выбран из группы, состоящей из полиморфизмов, приведенных в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и полиморфных маркеров в неравновесии по сцеплению с ними. В другом воплощении фрагмент имеет длину по меньшей мере 20 пар оснований. Такие олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты (например, олигонуклеотидные праймеры) могут быть созданы с применением части последовательностей нуклеиновых кислот, фланкирующих полиморфизмы (например, ОНП или микросателлиты), указывающие на рак молочной железы. В другом воплощении набор включает одну или более меченых нуклеиновых кислот, пригодных для аллель-специфической детекции одного или более определенных полиморфных маркеров или гаплотипов, ассоциированных с раком молочной железы, и реагентами для детекции метки. Подходящие метки включают, например, радиоизотоп, флуоресцентную метку, ферментную метку, метку в виде кофактора фермента, магнитную метку, спин-метку, эпитоп-метку.

В конкретных воплощениях полиморфный маркер или гаплотип, подлежащий определению реагентами по набору, включает один или более маркеров, два или более маркеров, три или более маркеров, четыре или более маркеров или пять или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из маркеров по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22. В другом воплощении маркер, подлежащий определению, выбран из маркеров, приведенных в табл. 10, 15 или 19. В одном воплощении маркер, подлежащий определению, выбран из маркеров, приведенных в табл. 10. В другом воплощении маркер, подлежащий определению, выбран из маркеров, приведенных в табл. 15. В другом воплощении маркер, подлежащий определению, выбран из маркеров, приведенных в табл. 19. В предпочтительном воплощении маркер, подлежащий определению, является гк4848543, гк13387042 и/или гк3803662. Другие предпочтительные воплощения включают те, что включают реагенты для детекции маркера гк4848543, те, что включают реагенты для детекции маркера гк13387042 и те, что включают реагенты для детекции маркера гк3803662. В другом воплощении маркер или гаплотип, подлежащий определению, включает по меньшей мере один маркер из группы маркеров в сильном неравновесии по сцеплению, которое описывается значениями г² выше 0,2, с по меньшей мере одной из групп маркеров, состоящей из маркеров, приведенных в табл. 10, 15, 19,

- 39 019953

20, 21 и 22. В другом воплощении маркер или гаплотип, подлежащий определению, включает по меньшей мере один маркер, выбранный из группы маркеров, состоящей из маркеров гк4848543, гк13387042 и гк3803662, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними.

В одном таком воплощении наличие маркера или гаплотипа указывает на подверженность (повышенную подверженность или пониженную подверженность) раку молочной железы. В другом воплощении маркером является аллель А гк4848543, аллель А гк13387042 и/или аллель Т гк3803662, наличие которого указывает на повышенный риск рака молочной железы (например, с фенотипами РМЖ все формы РМЖ или УмерПред). В следующем воплощении наличие маркера или гаплотипа указывает на ответ на терапевтический агент, применяемый при раке молочной железы. В другом воплощении наличие маркера или гаплотипа указывает на прогноз рака молочной железы. В еще одном воплощении наличие маркера или гаплотипа указывает на успешность лечения рака молочной железы. Такое лечение может включать хирургическое вмешательство, радиотерапию или другие способы (например, изменение образа жизни).

Диагностика рака молочной железы, ассоциированного с полиморфизмами по изобретению

Несмотря на то, что способы диагностики были в общем описаны в контексте диагностики подверженности раку молочной железы, способы могут также использоваться для диагностики рака молочной железы, ассоциированного с полиморфными маркерами по данному изобретению. Например, индивид, имеющий рак молочной железы или факторы риска, ассоциированные с раком молочной железы, может обследоваться для определения, может ли наличие у индивида полиморфизма или гаплотипа по данному изобретению являться фактором, способствующим развитию у индивида рака молочной железы. В одном воплощении выявление рака молочной железы, ассоциированного с маркерами и/или гаплотипами по данному изобретению, облегчает планирование тактики лечения. Например, могут проводиться профилактические мероприятия для минимизации возникновения у индивида рака молочной железы. Такие превентивные мероприятия также включают определение, является ли индивид гетерозиготным или гомозиготным в отношении связанных с риском вариантов по изобретению. В других воплощениях по изобретению может быть разработано лечение и выбраны препараты для целенаправленного воздействия на соответствующий ген или белок, ассоциированный с полиморфизмом и/или гаплотипом по данному изобретению.

В других воплощениях изобретение касается способа диагностики и выявления у субъекта рака молочной железы, ассоциированного с полиморфизмами по изобретению, путем выявления наличия полиморфного маркера или гаплотипа по изобретению, согласно подробному описанию здесь. Например, описываемые здесь полиморфные маркеры и/или гаплотипы чаще обнаруживаются у субъектов с раком молочной железы, чем у субъектов, не пораженных раком молочной железы. Таким образом, данные маркеры и/или гаплотипы имеют прогностическое значение для диагностики рака молочной железы. В одном воплощении маркеры или гаплотипы, имеющие прогностическое значение для выявления рака молочной железы, включают один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из маркеров по табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22. В другом воплощении маркеры, имеющие прогностическое значение для диагностики рака молочной железы, выбраны из маркеров гк4848543, гк13387042 и гк3803662 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними.

В другом воплощении аллели маркеров, имеющих прогностическое значение для диагностики рака молочной железы, включают аллель А гк4848543, аллель А гк13387042 и аллель Т гк3803662 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними.

Таким образом, описываемые здесь способы могут применяться для обследования образца, взятого у субъекта, на наличие или отсутствие определенного аллеля маркера или гаплотипа; наличие или отсутствие определенного аллеля маркера или гаплотипа указывает на подверженность раку молочной железы.

В одном воплощении изобретения диагностика рака молочной железы, ассоциированного с полиморфизмами и/или гаплотипами по данному изобретению, осуществляется путем детекции полиморфизмов по данному изобретению. Здесь описываются конкретные полиморфизмы (см, например, табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22 и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними). Тестируемый образец геномной ДНК, РНК или кДНК получают у субъекта, имеющего рак молочной железы, для определения, связано ли заболевание с одним или более полиморфизмами по изобретению. Затем образец ДНК, РНК или кДНК исследуется для определения, присутствует ли в образце определенный аллель полиморфизма или определенный гаплотип по изобретению. Если обнаруживается, что образец нуклеиновой кислоты содержит определенный аллель полиморфизма или гаплотип, то наличие аллеля или гаплотипа указывает на то, что рак молочной железы ассоциирован с полиморфизмом и/или гаплотипом.

Для детекции полиморфизма могут применяться способы, известные специалистам, включающие методы гибридизации, такие как Саузерн-анализ, Нозерн-анализ, количественную ПЦР, гибридизацию ΐπ к1!и, рестрикционное расщепление или анализ последовательности, но не ограничивающиеся ими. Диагностика рака молочной железы, ассоциированного с полиморфизмами по изобретению, может также проводиться путем изучения экспрессии и/или состава полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, ассоциированной с полиморфизмами по изобретению, при помощи различных способов, включая

- 40 019953 иммуноферментный анализ (ИФА), Вестерн блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию, или другие способы, известные специалистам.

Терапевтические агенты

Варианты по данному изобретению (например, маркеры и/или гаплотипы по изобретению, например, маркеры, приведенные в любой из табл. 10, 15 и 19), могут применяться для идентификации новых терапевтических мишеней при раке молочной железы. Например, гены, содержащие варианты или находящиеся в неравновесии по сцеплению с вариантами (маркерами и/или гаплотипами), ассоциированными с раком молочной железы, или их продукты (например, один или более из генов 8ТЕАР3/Т8АР6, Ь0С643714 и/или ТИВС9), а также гены или их продукты, прямо или косвенно регулируемые этими вариантами генов или их продуктами, или взаимодействующие с ними, могут быть мишенями для разработки терапевтических агентов для лечения рака молочной железы. Терапевтические агенты могут включать одну или более молекул, например, малых молекул, не относящихся к белкам и нуклеиновым кислотам, белков, пептидов, белковых фрагментов, нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), ПНК (пептидных нуклеиновых кислот) или их производных или миметиков, способных модулировать функцию и/или уровень генов-мишеней или их генных продуктов.

Нуклеиновые кислоты и/или варианты по изобретению или нуклеиновые кислоты, содержащие комплементарную им последовательность, могут применяться как анти-сенс конструкции для контроля экспрессии генов в клетках, тканях или органах. Методики, связанные с техникой анти-сенс, хорошо известны специалистам и их описание и обзор приводятся в АпПкепзеОгид Тескпо1оду: Ргтс1р1е8, 81га1ед1е5, и АррНсайопк, Сгооке, ей., Магсе1 Эеккег 1пс., №\ν Уогк (2001). В общем, анти-сенс молекулы нуклеиновых кислот создаются комплементарными к участку мРНК, экспрессируемой геном, так что анти-сенс молекула гибридизуется с мРНК и таким образом блокирует трансляцию белка мРНК. Специалистам известно несколько классов анти-сенс олигонуклеотидов, включая расщепляющие и блокирующие. Первые связываются с сайтами-мишенями РНК, активируют внутриклеточные нуклеазы (например, Рнказу Н или Рнказу Ь), которые расщепляют РНК-мишень. Блокаторы связываются с РНК-мишенью, ингибируют трансляцию белка путем стерического блокирования рибосом. Примерами блокаторов могут быть нуклеиновые кислоты, морфолиновые соединения, закрытые нуклеиновые кислоты и метилфосфонаты (ТНотрюп, Эгид 0|5соуегу Тойау, 7:912-917 (2002)). Анти-сенс олигонуклеотиды применяются непосредственно в качестве терапевтических агентов, а также применяются для определения и подтверждения функции гена, например, в экспериментах с нокаутом гена или нокдауном гена. Техника анти-сенс также описана Ьауегу е! а1., Сигг. 0ρίπ. Эгид Эйсом. Эеуе1. 6: 561-569 (2003), 8!еркеп5 е! а1., Сигг. 0ρίπ. Мо1. Ткег. 5:118-122 (2003), Киггеск, Еиг. I. Вюскет. 270: 1628-44 (2003), Ωιηδ е! а1., Мо1. Сапсег Тег. 1: 347-55 (2002), Скеп, Мейой Мо1. Мей. 75:621-636 (2003), А апд е! а1., Сигг. Сапсег Эгид Тагде18 1: 177-96 (2001) и ВеппеЦ, Апйкепке №с1ею Аай Эгид. Эеу. 12: 215-24 (2002).

Описываемые здесь варианты могут использоваться для выбора и создания анти-сенс реагентов, специфических для конкретных вариантов. Используя информацию об описываемых здесь вариантах, можно создать анти-сенс олигонуклеотиды или другие анти-сенс молекулы, специфически взаимодействующие с молекулами мРНК, содержащими один или более вариантов по данному изобретению. В этом случае экспрессия молекул мРНК, содержащих один или более вариантов по данному изобретению (маркеры и/или гаплотипы), может быть подавлена или блокирована. В одном воплощении анти-сенс молекулы созданы для специфического связывания определенной аллельной формы (т.е. одного или нескольких вариантов (аллелей и/или гаплотипов)) нуклеиновой кислоты - мишени, и, таким образом, подавления трансляции продукта, производимого этим определенным аллелем или гаплотипом, без связывания других или альтернативных вариантов в специфических полиморфных сайтах молекулы нуклеиновой кислоты - мишени.

Поскольку молекулы анти-сенс могут применяться для инактивации мРНК для ингибирования экспрессии генов и, следовательно, экспрессии белков, молекулы могут использоваться для лечения рака молочной железы. Методика может включать расщепление с помощью рибозимов, содержащих нуклеотидные последовательности, комплементарные к одному или более участкам мРНК, что изменяет способность мРНК к трансляции. Такие участки мРНК включают, например, белок-кодирующие участки, в частности белок-кодирующие участки, соответствующие каталитической активности, сайтам связывания субстрата и/или лиганда, или другим функциональным доменам белка.

Феномен РНК интерференции (КИА1) активно изучался на протяжении последних 10 лет с момента его первоначального открытия у С. е1едап§ (Иге е! а1., №1иге 391: 806-11 (1998)), и в последние годы активно обсуждалось его возможное применение в лечении заболеваний человека (см. обзор К1т & Вока, №1111гс Веу. Сепе!. 8: 173-204 (2007)). РНК интерференция также обозначаемая сайленсингом генов, основана на применении двунитевых молекул РНК (йкВИА) для выключения определенных генов. В клетке молекулы цитоплазматической двунитевой РНК (й^ВКА) подвергаются процессингу клеточными комплексами в малые интерферирующие РНК (мВКА, от англ. 5та11 1п(егГег1пд ВNЛ). 5|ВКА направляют комплексы протеин-РНК к специфическим сайтам на мРНК-мишени, приводя к расщеплению мРНК (Ткотркоп, Эгид Эйсоуегу Тойау, 7:912-917 (2002)). Молекулы аВИА обычно бывают длиной 20, 21, 22 или 23 нуклеотида. Таким образом, один аспект изобретения касается изолированных молекул

- 41 019953 нуклеиновых кислот и применения этих молекул для РНК интерференции, т.е. в качестве малых интерферирующих молекул РНК (δίΚΝΑ). В одном воплощении изолированные молекулы нуклеиновых кислот имеют размер 18-26 нуклеотидов, предпочтительно 19-25 нуклеотидов, более предпочтительно 2024 нуклеотида, и более предпочтительно 21, 22 или 23 нуклеотида.

Другой путь ΚΝΑί-опосредованного подавления генов берет начало от эндогенно кодируемых первичных транскриптов микро РНК (рптагу т^с^оΚNΑ, ρή^ΚΝΑ), которые подвергаются процессингу в клетках и образуют предшественник ιηίΚΝΑ (ргесигког, рге-ιηίΚΝΑ). Эти молекулы ιηίΚΝΑ транспортируются из ядра в цитоплазму, где они подвергаются процессингу и образуют зрелые молекулы ιηίΚΝΑ (ιηίΚ,ΝΑ). которые управляют ингибированием процесса трансляции путем распознавания сайтовмишеней в 3' нетранслируемых участках мРНК, и последующей деградации мРНК Р-тельцами (см. обзор К1т & Ко§81, №11иге Кеу. Сепе!. 8: 173-204(2007)).

Клинические применения ΚΝΑί включают получение искусственно синтезированных дуплексов δίΚΝΑ, которые предпочтительно имеют размер 20-23 нуклеотидов и предпочтительно имеют выступающие 3' концы в 2 нуклеотида. Нокдаун экспрессии генов вызывают за счет создания последовательности, специфической к мРНК-мишени. Специалистам известно несколько коммерческих сайтов для оптимизации разработки и синтеза таких молекул.

Другие применения связаны с более длинными молекулами δίΚΝΑ (обычно 25-30 нуклеотидов длиной, предпочтительно около 27 нуклеотидов), а также малыми РНК, образующими шпильку (АтаШ Ьапрт ΚΝΑδ, δΙιΚ,ΝΑδ; обычно около 29 нуклеотидов длиной). Последние экспрессируются естественным путем, что описано Αта^ζди^ои^ е! а1. (РЕВ8 Ьей. 579:5974-81 (2005)). Химически синтезированные δίΚΝΑδ и δΡΚΝΑδ являются субстратами для процессинга т угуо и в некоторых случаях обеспечивают более сильное подавление генов по сравнению с более короткими аналогами (К1т е! а1., №11иге Вю!есЬпо1. 23:222-226 (2005); 8ю1аз е! а1., №11иге Вю1есЬпо1. 23:227-231 (2005)). Как правило, δίΚΝΑδ обеспечивают транзиторное подавление экспрессии генов, поскольку их внутриклеточная концентрация снижается при последующих делениях клетки. Напротив, экспрессируемые δ1ΚΝΑδ опосредуют длительно существующий и стабильный нокдаун транскриптов-мишеней, поскольку имеет место транскрипция δ1ΚΝΑ (Ма^^иеδ е! а1., №11иге Вю!есЬпо1. 23: 559-565 (2006); Вгитте1катр е! а1., 8с1епсе 296: 550-553 (2002)).

Поскольку функционирование молекул ΚΝΑί, включая δίΚΝΑ, ιηίΚΝΑ и δίΚΝΑ является зависимым от последовательности, варианты по данному изобретению (например, маркеры или гаплотипы, приведенные в табл. 10, 15 и 19) могут быть использованы для создания реагентов ΚΝΑί, распознающих определенные молекулы нуклеиновых кислот, содержащих определенные аллели и/или гаплотипы (например, аллели и/или гаплотипы по данному изобретению), при этом не распознающих молекулы нуклеиновых кислот, содержащих другие аллели или гаплотипы. Эти реагенты ΚΝΑί могут таким образом распознавать и разрушать молекулы нуклеиновых кислот - мишеней. Как и в случае реагентов анти-сенс, реагенты ΚΝΑί могут применяться в качестве терапевтических агентов (например, для выключения генов, ассоциированных с заболеванием или вариантов генов, ассоциированных с заболеванием), но могут также применяться для характеристики или подтверждения функции гена (например, в экспериментах с нокаутом или нокдауном генов).

Введение ΚΝΑί в клетку может осуществляться с помощью ряда методик, известных специалистам. Способы с применением невирусного внесения включают холестерин, стабилизированные микрочастицы, содержащие комплекс коротких интерференционных рибонуклеиновых кислот и липидов (δΝΑΓΡ, от англ. δΙηόΚ пис1ею-ас1й-Ьр1й рагйс1е), фрагменты тяжелых цепей антител (РаЬ), аптамеры и наночастицы. Способы вирусного внесения включают применение лентивирусов, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов. Молекулы δίΚΝΑ в некоторых воплощениях являются химически модифицированными для повышения их стабильности. Сюда входят модификации по положению 2' рибозы, включая 2'-0-метилпурины и 2'-флуоропиримидины, которые обеспечивают устойчивость к рибонуклеазной активности. Возможны и другие химические модификации, и они известны специалистам.

Обзор информации по ΚΝΑί и возможностям направленного воздействия на специфические гены с помощью ΚΝΑί можно получить в следующих источниках: К1т & ^δδί, №11. Гет. Сепе!. 8: 173-184 (2007), СЬеп & Цетеку, ΝηΙ. Гет. Сепе!. 8: 93-103 (2007), Иеупо1^ е! а1., №11. Вю!есЬпо1. 22: 326-330 (2004), СЬ1 е! а1., Ргос. Να!1. Αсай. 8οΐ. υδΑ 100: 6343-6346 (2003), Уюкеге е! а1., I. Вю1. СЬет. 278: 71087118 (2003), Αβηιηί Сигг. Орт. СЬет. Вю1. 6: 829-834 (2002), Ьауегу е! а1., Сигг. Орт. Эгид Όίδ^ν. Оете1. 6:561-569 (2003), 8Ь1, Тгепйз Сепе!. 19:9-12 (2003), БЬиеу е! а1., Пгид Όίδ^ν. Тойау 7:1040-46 (2002), МсМапш е! а1., Να!. Гет. Сепе!. 3:737-747 (2002), Х1а е! а1., Να!. Вю!есЬпо1. 20:1006-10 (2002), Р№1егк е! а1., сигг. Орт. Сепе!. Эеу. 10:562-7 (2000), ВоδЬе^ е! а1., Να!. Се11 Вю1. 2: Е31-6 (2000) и Нип!ег, Сигг. Вю1. 9: Κ440-442(1999).

Генетический дефект, приводящий к повышенной предрасположенности или риску развития рака молочной железы, или генетический дефект, вызывающий рак молочной железы, может подвергаться постоянной коррекции путем введения субъекту, являющемуся носителем дефекта, фрагмента нуклеиновой кислоты, несущей репарирующую последовательность, доставляющей нормальный нуклеотид (нуклеотиды), т.е. нуклеотид (нуклеотиды) дикого типа к участку генетического дефекта. Такая сайтспецифическая репарирующая последовательность может содержать олигонуклеотид РНК/ДНК, который

- 42 019953 способствует эндогенному исправлению повреждений геномной ДНК субъекта. Введение репарирующей последовательности может проводиться с применением соответствующего носителя, например, в комплексе с полиэтиленимином, в инкапсулированном в анионные липосомы виде, с помощью вирусного вектора, например, аденовирусного вектора, или других фармацевтических композиций, пригодных для облегчения поступления внутрь клетки вводимой нуклеиновой кислоты. В этом случае генетический дефект может быть исправлен, поскольку химерные олигонуклеотиды запускают инкорпорирование нормальной последовательности в геном субъекта, приводя к экспрессии нормального генетического продукта (дикого типа). Замещение распространяется, таким образом обеспечивая постоянное исправление дефекта и облегчение симптомов, ассоциирующихся с заболеванием или состоянием.

Данное изобретение обеспечивает способы идентификации соединений или агентов, которые могут использоваться для лечения и/или предупреждения рака молочной железы. Так, варианты по изобретению могут применяться как мишени для поиска и/или разработки терапевтических агентов. В определенных воплощениях такие способы включают оценку способности агента или соединения модулировать активность и/или экспрессию нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере один из вариантов (маркеров и/или гаплотипов) по данному изобретению, или продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой, например, один или более из генов §ТЕЛР3/Т§ЛР6, БОС643714 и/или Т№КС9. Это в свою очередь может быть использовано для поиска агентов или соединений, подавляющих или нарушающих нежелательную активность или экспрессию продукта, кодируемого нуклеиновой кислотой. Как известно специалистам, тесты для проведения таких экспериментов могут проводиться в клеточных системах или бесклеточных системах. Клеточные системы включают клетки, которые естественным образом экспрессируют молекулы нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, или рекомбинантные клетки, генетически модифицированные для экспрессии молекул определенной требуемой нуклеиновой кислоты.

Экспрессия варианта гена у пациента может оцениваться по экспрессии вариант-содержащей последовательности нуклеиновой кислоты (например, гена, содержащего по меньшей мере один вариант по данному изобретению, который может транскрибироваться в РНК, содержащую по меньшей мере один вариант и, в свою очередь, транслироваться в белок), или по изменению экспрессии нормальной последовательности (дикого типа) нуклеиновой кислоты из-за влияния вариантов на уровень или профиль экспрессии номальных транскриптов, например, вариантов в регуляторных или контролирующих участках гена. Исследования экспрессии генов включают прямые исследования нуклеиновых кислот (мРНК), исследования уровня экспрессируемых белков, или исследования побочных продуктов, задействованных в пути, например, в сигнальном пути. Кроме того, можно оценивать экспрессию генов, которая претерпевает положительную или отрицательную регуляцию в ответ на сигнальный путь. Одно воплощение включает оперативное связывание репортерного гена, например, люциферазы с регуляторным участком гена (генов), представляющего интерес.

Модуляторы экспрессии генов в одном воплощении могут идентифицироваться, при контактировании клетки с соединением или агентом-кандидатом, и определении экспрессии мРНК. Уровень экспрессии мРНК в присутствии соединения или агента-кандидата сравнивается с уровнем экспрессии в отсутствии соединения или агента. На основании такого сравнения можно идентифицировать кандидатные соединения или агенты для лечения и/или предупреждения таких нарушений, как фибрилляция предсердий, трепетание предсердий и инсульт, по их способности модулировать генетическую экспрессию варианта гена. Если экспрессия мРНК или кодируемого белка статистически достоверно выше в присутствии соединения или агента-кандидата, чем в его отсутствии, то соединение или агент-кандидат считаются стимуляторами или положительными регуляторами экспрессии нуклеиновой кислоты. Если экспрессия нуклеиновой кислоты или уровень белка статистически достоверно ниже в присутствии соединения или агента - кандидата, чем в его отсутствии, то соединение или агент-кандидат считаются ингибиторами или отрицательными регуляторами экспрессии нуклеиновой кислоты.

Изобретение также обеспечивает способы лечения с применением соединения, идентифицированного при скрининге лекарств (соединений и/или агентов) в качестве модулятора гена (т.е. стимулятора и/или ингибитора экспрессии гена).

Способы оценки вероятности ответа на терапевтические агенты, способы мониторинга хода лечения и способы лечения рака молочной железы

Как известно, индивиды могут иметь различные ответы на определенное лечение (например, на терапевтический агент или способ лечения согласно данному описанию). Различия в ответах могут быть частично основаны на генетической детерминированности. Фармакогеномика занимается изучением того, как генетические вариации (например, варианты (маркеры и/или гаплотипы) по данному изобретению) влияют на ответ на лекарственные препараты, по причине изменения фармакокинетики и/или нарушения или изменения действия лекарственного препарата. Следовательно, в своей основе различия в ответах частично могут быть генетически детерминированы. Клинические исходы благодаря наличию генетических вариаций, оказывающих влияние на ответ на лекарства, могут выражаться в виде токсического эффекта препарата у некоторых индивидов (например, у носителей или лиц, не являющихся носителями генетических вариантов по данному изобретению), либо терапевтической неэффективности препарата. Следовательно, варианты по данному изобретению могут детерминировать характер воздействия

- 43 019953 терапевтического агента на организм или способ метаболизма терапевтического агента в организме.

Соответственно, в одном воплощении наличие определенного аллеля полиморфного сайта или гаплотипа указывает на различную степень ответа на определенный способ лечения. Это означает, что пациент с диагностированным раком молочной железы и являющийся носителем определенного аллеля полиморфного сайта или гаплотипа по данному изобретению (например, связанного с риском аллеля и/или гаплотипа по изобретению) будет отвечать лучше или хуже на определенное терапевтическое средство, лекарственный препарат и/или другое терапевтическое мероприятие, используемое для лечения заболевания. Таким образом, наличие или отсутствие аллеля маркера или гаплотипа может помочь в принятии решения, какое лечение нужно применить для пациента. Например, для вновь диагностированного пациента можно оценить наличие маркера или гаплотипа по данному изобретению (например, по анализу ДНК, полученной из образца крови, согласно данному описанию). Если пациент позитивен в отношении аллеля маркера или гаплотипа (что означает наличие по меньшей мере одного определенного аллеля маркера или гаплотипа), то врач назначает один способ лечения (например, один определенный терапевтический агент или комбинацию терапевтических агентов), а если пациент негативен в отношении по меньшей мере одного аллеля маркера или гаплотипа, то может быть назначен другой курс лечения (который может подразумевать рекомендации вести мониторинг прогрессирования заболевания без начала незамедлительного лечения). Таким образом, статус носительства пациента может помочь в определении того, следует ли применять конкретный способ лечения. Ценность такого подхода заключается в возможности диагностировать заболевание на ранней стадии, выбрать наиболее подходящее лечение и дать врачу информацию о прогнозе/агрессивности заболевания для выбора наиболее подходящего лечения.

Согласно следующему ниже описанию существующие в клинике варианты профилактики рака молочной железы в основном представляют собой хемопревентивную терапию (химиотерапию или гормональную терапию) и превентивную хирургию. Наиболее распространенными хемопревентивными агентами являются тамоксифен и ралоксифен; другие варианты включают ингибиторы ароматазы. Варианты лечения также включают радиотерапию, при которой часть пациентов испытывает неблагоприятные симптомы. Маркеры по изобретению согласно данному описанию могут применяться для оценки ответа на данные варианты лечения или для прогнозирования хода лечения при помощи одного из таких вариантов лечения. Таким образом, определение генетического профиля может применяться для выбора соответствующей тактики лечения, основанной на генетическом статусе индивида, или может применяться для прогнозирования исхода определенного варианта лечения и, таким образом, применяться при стратегическом выборе вариантов лечения или комбинации доступных вариантов лечения.

Данное изобретение также касается способов мониторинга эффективности лечения рака молочной железы. Это может быть осуществлено на основании генотипического и/или гаплотипического статуса маркеров и гаплотипов по данному изобретению, т.е. путем оценки отсутствия или наличия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера согласно данному описанию или путем мониторинга экспрессии генов, ассоциированных с вариантами (маркерами и гаплотипами) по данному изобретению. мРНК связанного с риском гена или кодируемый полипептид могут быть измерены в образце ткани (например, образце периферической крови или биопсийном образце). Уровни экспрессии и/или уровни мРНК могут, таким образом, быть определены до и во время лечения для мониторинга его эффективности. Кроме того, до и во время лечения для мониторинга его эффективности проводится определение генотипического и/или гаплотипического статуса по меньшей мере одного варианта, связанного с риском рака молочной железы, как представлено здесь.

Кроме того, биологические цепочки и метаболические пути, относящиеся к маркерам и гаплотипам по данному изобретению, можно отслеживать путем определения уровня мРНК и/или полипептидов. Это может быть осуществлено, например, путем отслеживания уровня экспрессии или уровня полипептидов по нескольким генам, принадлежащим цепочке и/или пути, в образцах, взятых до и во время лечения. Кроме того, до и во время лечения можно определять метаболиты, принадлежащие биологической цепочке или метаболическому пути. Эффективность лечения определяется путем сравнения наблюдаемых во время лечения изменений в уровнях экспрессии/уровнях метаболитов с соответствующими показателями для здоровых субъектов.

В дальнейшем аспекте маркеры по данному изобретению могут использоваться для повышения статистической чувствительности и эффективности клинических испытаний. Так, индивиды, являющиеся носителями связанных с риском вариантов по данному изобретению, т.е. индивиды, являющиеся носителями по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера, обусловливающего повышенный риск развития рака молочной железы, могут с большей вероятностью отвечать на определенные способы лечения. В одном воплощении индивиды, являющиеся носителями связанных с риском вариантов гена (генов) пути и/или метаболической цепочке, на которые направлено определенное лечение (например, препарат малых молекул), с большей вероятностью будут отвечать на лечение. В другом воплощении индивиды, являющиеся носителями связанных с риском вариантов гена, экспрессия и/или функция которого изменена связанным с риском вариантом, с большей вероятностью будут отвечать на способ лечения, направленный на данный ген, его экспрессию или его генный продукт.

- 44 019953

В дальнейшем аспекте маркеры и гаплотипы по данному изобретению могут применяться для прицельного выбора фармацевтических агентов для отдельных индивидов. Персонализированный выбор схем лечения, изменения образа жизни или комбинация обоих могут выполняться с учетом связанных с риском вариантов по данному изобретению. Таким образом, знание статуса индивида по определенным маркерам по данному изобретению может использоваться для выбора вариантов лечения, направленно воздействующих на гены или генные продукты, находящиеся под влиянием связанных с риском вариантами по изобретению. Определенные комбинации вариантов могут подходить для выбора одних способов лечения, тогда как на другие комбинации вариантов генов могут обусловливать другие способы лечения. Подобные комбинации вариантов могут включать один вариант, два варианта, три варианта или четыре или более вариантов, в зависимости от необходимости выбора схемы лечения с клинически надежной точностью.

Аспекты, связанные с компьютерными технологиями

Данное изобретение таке относится к связанному с компьютерными технологиями применению полиморфных маркеров и гаплотипов, которые по данному описанию ассоциированы с раком молочной железы. Данные приложения могут применяться для хранения, обработки или же анализа данных генотипа, что может использоваться в способах по изобретению, согласно данному описанию. Один пример относится к хранению информации о генотипе, полученной у индивида, на компьютерных носителях, таким образом, что информация о генотипе становится доступна третьим лицам (например, индивиду) или получения информации о данных генотипа, например, путем сравнения данных генотипа с информацией о генетических факторах риска, которые способствуют повышенной подверженности раку молочной железы и представления результатов, основанных на подобном сравнении.

Один из таких аспектов относится к компьютерным носителям. В общих терминах подобные носители способны хранить (1) информацию, позволяющую выявить по меньшей мере один полиморфный маркер или гаплотип; (2) индикатор частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного указанного маркера или частоты гаплотипа у индивида с раком молочной железы; и индикатор частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного указанного маркера или частоты гаплотипа в референсной популяции. Референсной популяцией может быть популяция инидвидов, не имеющих заболевания. Кроме того, референсной популяцией может быть случайная выборка из общей популяции, таким образом являющаяся репрезентативной для популяции в целом. Индикатором частоты может быть расчетная частота, частота аллелей и/или копий гаплотипов, или нормализованные или иным образом обработанные значения реальных частот, соответствующие определенному носителю.

Дополнительная информация об индивидах может храниться на носителях, например, информация о происхождении, информация о поле, физических признаках или характеристиках (включая рост и вес), биохимических показателях, проводимом лечении, исходе лечения, лекарственных препаратах или другой важной информации, которую желательно хранить или обрабатывать в контексте генотипического статуса определенного индивида.

Изобретение также относится к устройствам, которые могут использоваться для определения или обработки генетических данных с целью определения подверженности человеческого индивида раку молочной железы. Подобные устройства могут включать компьютерную память, программы для обработки данных, хранящихся в компьютерной памяти и программы для генерирования выходных данных, включающих показатели генетических данных. Подобные показатели могут включать такие значения, как частоты аллелей или гаплотипов, частоты генотипов, пол, возраст, информацию о фенотипе, значения отношения шансов (ОШ) или относительного риска (ОР), популяционный атрибутивный риск (ПАР) или иную важную информацию, которая представляет собой либо статистическую обработку исходных данных генотипа или основывается на расчетах с использованием генетических данных.

Маркеры и гаплотипы, которые, как здесь показано, ассоциированы с повышенной подверженностью (например, повышенным риском) раку молочной железы, в некоторых воплощениях могут применяться для интерпретации и/или анализа данных генотипа. Так, в некоторых воплощениях выявление аллеля или гаплотипа, связанного с риском рака молочной железы, как здесь показано, или аллеля полиморфного маркера или гаплотипа, находящегося в неравновесии по сцеплению с любым из маркеров и/или гаплотипов, которые, как здесь показано, ассоциированы с раком молочной железы, указывает на то, что индивид, у которого получены генетические данные, имеет повышенный риск рака молочной железы. В одном подобном воплощении генетические данные получены по меньшей мере для одного полиморфного маркера, который, как здесь показано, ассоциирован с раком молочной железы, или маркера, находящегося в неравновесии по сцеплению с ним. Генетические данные впоследствии становятся доступными для третьей стороны, например, для индивида, у которого получены эти данные, например, через пользовательский интерфейс, к которому можно получить доступ через Интернет, наряду с интерпретацией генетических данных, например в форме показателей риска (например, абсолютного риска (АР), относительного риска (ОР) или отношения шансов (ОШ)) заболевания (например, рака молочной железы). В другом воплощении проводится оценка связанных с риском маркеров, идентифицированных в массиве данных генотипа, полученного у индивида, и результаты оценки риска, обусловленного наличием в массиве данных подобных вариантов, связанных с риском, становятся доступными индивиду,

- 45 019953 например, через надежный вэб-интерфейс или с применением иных средств коммуникации. Результаты подобной оценки риска могут быть представлены в численном виде (например, в виде значений риска, таких как абсолютный риск, относительный риск и/или отношение шансов или в виде процентного увеличения риска по сравнению с референсным значением), в графическом виде или в другом виде, подходящем для иллюстрации риска для индивида, у которого получены генетические данные. В конкретных воплощениях результаты оценки риска становятся доступными для третьих лиц, например, врачей, других медицинских сотрудников или генетических консультантов.

Маркеры, применяемые в различных аспектах изобретения

Все вышеописанные способы и приложения могут осуществляться с маркерами и гаплотипами по изобретению, которые были более подробно описаны здесь в общих терминах в качестве подходящих для оценки подверженности раку молочной железы. Так, подобные приложения могут в целом осуществляться на практике с применением маркеров, приведенных в любой из табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеров, находящихся в неравновесии по сцеплению с ними. В определенных воплощениях маркеры или гаплотипы присутствуют в составе сегментов генома, последовательности которых приведены в 8ЕР Ш N0: 4, 8ЕР Ш N0: 5 или 8ЕЦ Ш N0: 6. В определенных воплощениях маркеры находятся в составе блока НС гк4848543, блока НС гк13387042, или блока НС гк3803662. В определенных воплощениях маркеры выбраны из маркеров, приведенных в табл. 10. В других воплощениях маркеры выбраны из маркеров, приведенных в табл. 15. В других воплощениях маркеры выбраны из маркеров, приведенных в табл. 19. В некоторых воплощениях маркеры выбраны из маркеров, приведенных в табл. 7 и 8. В некоторых других воплощениях маркеры выбраны из маркеров, приведенных в табл. 14. В некоторых других воплощениях маркеры выбраны из маркеров, приведенных в табл. 18. В других воплощениях маркеры являются одним из гк4848543 (8Ер ГО N0:1), гк13387042 (8Ер ГО N0:2) или гк3803662 (МТ) ГО N0:3), возможно включая маркеры в неравновесии по сцеплению с ними. В одном воплощении маркеры являются одним из гк4848543 (МТ) ГО N0:1), гк13387042 (МТ) ГО N0:2) или гк3803662 (МТ) ГО N0:3). В определенных предпочтительных воплощениях маркером является гк4848543 (БЕЦ Ш N0:1). В других предпочтительных воплощениях маркером является гк13387042 (БЕЦ Ш N0:2). В других предпочтительных воплощениях маркером является гк3803662 (БЕЦ Ш N0:3). В определенных воплощениях неравновесие по сцеплению определяется численными значениями г² выше 0,2. В другом воплощении маркеры или гаплотипы включают по меньшей мере один маркер, выбранный из аллеля А гк4848543, аллеля А гк13387042 и аллеля Т гк3803662.

Нуклеиновые кислоты и полипептиды

Описываемые здесь нуклеиновые кислоты и полипептиды могут применяться в способах и наборах данного изобретения, как описано выше. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты в данном описании представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, отделенную от нуклеиновых кислот, обычно фланкирующих ген или нуклеотидную последовательность (как в геномных последовательностях) и/или полностью или частично очищенную от других транскрибируемых последовательностей (например, как в библиотеке РНК). Например, выделенная нуклеиновая кислота по изобретению может быть фактически выделена из сложной клеточной среды, в которой она появляется естественным путем, или из культуральной среды, где она производится с помощью рекомбинантных технологий, или из химических предшественников или других химических соединений, если проводится ее химический синтез. В некоторых случаях выделенный материал может быть составной частью смеси (например, грубого экстракта, содержащего другие соединения), буферной системы или смеси реагентов. В других случаях материал может быть очищен до необходимой гомогенности, что, например, определяется при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) или колоночной хроматографии (например, ВЭЖХ). Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по определению может включать по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 80% или по меньшей мере около 90% (в молярном отношении) всех присутствующих видов макромолекул. В отношении геномной ДНК термин «выделенная» может также означать молекулы нуклеиновой кислоты, отделенные от хромосомы, с которой естественным образом связывается геномная ДНК. Например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты может содержать меньше чем примерно 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 кб нуклеотидов, фланкирующих молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена молекула нуклеиновой кислоты.

Молекула нуклеиновой кислоты может быть соединена с другими кодирующими или регуляторными последовательностями, но тем не менее считаться выделенной. Так, рекомбинантная ДНК, содержащаяся в векторе, подходит под определение выделенная согласно данному описанию. Кроме того, молекулы выделенной нуклеиновой кислоты включают молекулы рекомбинантной ДНК в гетерологичных клетках хозяина или гетерологичных организмах, а также частично очищенные или практически очищенные молекулы ДНК в растворе. Молекулы выделенной нуклеиновой кислоты также включают РНК-транскрипты молекул ДНК по данному изобретению, полученные т угуо и т νίΙΐΌ. Молекулы выделенной нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности могут включать молекулы нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеотидов, синтезированные химическим путем или с помощью рекомбинантных технологий. Такие выделенные нуклеотидные последовательности могут применяться, например, в производстве кодируемых полипептидов, в качестве зондов для выделения гомо

- 46 019953 логичных последовательностей (например, из других видов млекопитающих), для генного картирования (например, с помощью ίη δίΐιι гибридизации с хромосомами) или для определения экспрессии генов в тканях (например, в человеческих тканях), например, с помощью Нозерн анализа или других гибридизационных технологий.

Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации, например, как в случае селективной гибридизации, с описываемыми здесь нуклеотидными последовательностями (например, молекулам нуклеиновой кислоты, специфически гибридизующимся с нуклеотидными последовательностями, содержащими полиморфный сайт, ассоциированный с описываемым здесь маркером или гаплотипом). Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть детектированы и/или выделены путем аллель- или последовательность-специфической гибридизации (например, в жестких условиях). Жесткие условия гибридизации и способы гибридизации нуклеиновых кислот хорошо знакомы специалистам (см., например, СиггсгИ ΡΐΌΐοοοΙδ ίη Мо1еси1аг Βίοίο^ν. Аи8иЬе1 Р. е£ а1., Σοΐιη Айеу & 8οη§, (1998) и Кгаик М. и Λατοηκοη 8., Ме^ЙБ Εηζутο1., 200: 546-556 (1991), описания которых включены сюда во всей полноте путем ссылок.

Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей может быть определен при выравнивании последовательностей с целью удобства сравнения (например, в изображение первой последовательности можно вставить пробелы). Затем сравниваются нуклеотиды или аминокислоты в соответствующих позициях и процент идентичности между двумя последовательностями рассчитывается как функция количества идентичных позиций для обеих последовательностей (т.е. % идентичности = количество идентичных позиций/общее количество позиций х 100). В некоторых воплощениях длина последовательностей, выровненных с целью их сравнения, может быть по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от длины референсной последовательности. Реальное сравнение двух последовательностей может выполняться при помощи общеизвестных способов, например, с применением математического алгоритма. Нелимитирующий пример такого математического алгоритма описан Каг1т 8. и Л118сйи1 8., Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А, 90: 5873-5877 (1993). Такой алгоритм встроен в программы ΝΒΕΑ8Τ и ХВЬА8Т (версия 2.0), как описано А115с11и1 8. е1 а1., Шс1е1с Ас1йк Век., 25: 3389-3402 (1997). При использовании программ ВЬА8Т и Саррей ВЬА8Т могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, НВРА8Т). См. Веб-сайт в интернете по адресу ικΝ.η1ιη.ηί1ι.§ον. В одном воплощении параметры для сравнения последовательностей могут быть зафиксированы: 8οογο=100, ^οΜΚη§ΣΗ=12, или варьироваться (е.д., \ν=5 οτ ν=20).

Другие примеры включают алгоритм Муегк и М111ег, САВ108 (1989), АЭУАНСЕ и АЭАМ, как описано у ΤοΐΌ11ίδ, А. и Κ^οΐΣί, С, ί,’οιηριιΐ. Арр1. Вюксг 10:3-5 (1994); и РА8ТА, как описано у Реаггощ V. и □ртам, Ό., Ргос. №И. Асай. 8сг И8А, 85:2444-48 (1988). В другом воплощении процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с помощью программы САР в пакете программного обеспечения ССС (Ассе1гу§, СатЬпйде, иК).

Данное изобретение также относится к молекулам выделенной нуклеиновой кислоты, содержащим фрагмент или часть, гибридизующуюся в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая включает или состоит из нуклеотидной последовательности, содержащей полиморфные маркеры, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними, и нуклеотидной последовательности генов 8ТЕАР3/Т8АР6, Ь0С643714 и ТНРС9 или нуклеотидной последовательности, которая включает или состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, включающей полиморфные маркеры, приведенные в табл. 10, 15, 19, 20, 21 и 22, и маркеры в неравновесии по сцеплению с ними и нуклеотидной последовательности генов 8ТЕАР3/Т8АР6, Ь0С643714 и ТНРС9 или их фрагментов, где нуклеотидная последовательность включает по меньшей мере один полиморфный аллель, содержащийся в описываемых здесь маркерах и гаплотипах. Фрагменты нуклеиновых кислот по изобретению имеют размер по меньшей мере около 15, по меньшей мере около 18, 20, 23 или 25 нуклеотидов, и могут быть размером 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 нуклеотидов или более.

Фрагменты нуклеиновых кислот по изобретению применяются как зонды или праймеры в описываемых здесь тестах. Зонды или праймеры являются олигонуклеотидами, которые гибридизуются специфическим по отношению к основаниям образом с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме ДНК и РНК такие зонды и праймеры включают полипептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), как описано у Мекем Р. е! а1., 8аег1се 254:1497-1500 (1991). Зонд или праймер имеет участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется по меньшей мере приблизительно с 15, обычно с 20-25, а в некоторых воплощениях приблизительно с 40, 50 или 75 последовательными нуклеотидами в молекуле нуклеиновой кислоты. В одном воплощении зонд или праймер включает по меньшей мере один аллель по меньшей мере одного полиморфного маркера или по меньшей мере одного гаплотпа, описываемых здесь, или комплементарную им последовательность. В конкретных воплощениях зонд или праймер могут включать 100 или менее нуклеотидов, например, в некоторых воплощениях от 6 до 50 нуклеотидов, или, например, от 12 до 30 нуклеотидов. В других воплощениях зонд или праймер идентичен по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на

- 47 019953

90% или по меньшей мере на 95% примыкающей нуклеотидной последовательности или последовательности, комплементарной к примыкающей нуклеотидной последовательности. В другом воплощении зонд или праймер способны селективно гибридизоваться с примыкающей нуклеотидной последовательностью или с последовательностью, комплементарной примыкающей нуклеотидной последовательности. Зачастую зонд или праймер также включает метку, например, радиоизотоп, флуоресцентную метку, ферментативную метку, метку в виде кофактора фермента, магнитную метку, спин-метку, эпитоп-метку.

Молекулы нуклеиновых кислот по изобретению, такие как описываемые здесь, могут быть идентифицированы и выделены с помощью стандартных методов молекулярной биологии, хорошо известных специалистам. Амплифицированная ДНК может быть помечена (например, радиоактивно помечена) и использована в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК, полученной из клеток человека. кДНК может быть синтезирована на основе мРНК и содержаться в подходящем векторе. Могут быть выделены соответствующие клоны, ДНК может быть получена с помощью эксцизии ш у1уо, и клонированная вставка может быть секвенирована в одном или в обоих направлениях с помощью общеизвестных способов для определения точной рамки считывания, кодирующей полипептид соответствующего молекулярного веса. С помощью данных способов или аналогичных им, можно выделить полипептид и кодирующую полипептид ДНК, секвенировать их и охарактеризовать более подробно.

Как правило, последовательности выделенных нуклеиновых кислот по изобретению могут применяться в качестве маркеров молекулярного веса для Саузерн гелей и в качестве хромосомных маркеров, меченых для картирования позиций ассоциированных генов. Последовательности нуклеиновых кислот также могут применяться для сравнения с эндогенными последовательностями ДНК пациентов для выявления рака молочной железы или подверженности раку молочной железы, и в качестве зондов, например, для гибридизации и обнаружения ассоциированных последовательностей ДНК или для вычитания известных последовательностей из образца (например, вычитающая гибридизация). Последовательности нуклеиновых кислот могут быть в дальнейшем использованы для получения праймеров для генетической идентификации, для выработки антител к полипептидам с помощью методов иммунизации и/или в качестве антигенов для выработки антител к ДНК или для развития иммунного ответа.

Антитела

Поликлональные антитела и/или моноклональные антитела, специфически связывающие одну форму генного продукта, но не связывающие другую форму генного продукта, также рассматриваются в изобретении. Рассматриваются антитела, связывающие часть варианта или референсного генного продукта, содержащего полиморфный сайт или сайты. Используемый здесь термин антитело относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активных частей иммуноглобулиновых молекул, т.е. молекулам, содержащим антиген-связывающие сайты, специфически связывающие антиген. Молекула, специфически связывающая полипептид по изобретению, представляет собой молекулу, связывающуюся с этим полипептидом или его фрагментом, но не связывающуюся существенно с другими молекулами в образце, например, в биологическом образце, который естественным образом содержит полипептид. Примеры иммунологически активных частей молекул иммуноглобулина включают Е(аЬ) и Е(аЬ')₂, которые могут быть получены при обработке антитела таким ферментом, как пепсин. В изобретении также рассматриваются поликлональные и моноклональные антитела, связывающиеся с полипептидом по изобретению. Термин моноклональное антитело или композиция моноклональных антител в данном описании относится к группе молекул антител, содержащих только один вид антиген-связывающего сайта, способного к иммунному взаимодействию с определенным эпитопом полипептида по изобретению. Композиция моноклональных антител, таким образом, обычно проявляет одинаковую аффинность к определенному полипептиду по изобретению, с которым она взаимодействует.

Поликлональные антитела могут быть получены согласно описанию выше путем иммунизации подходящего организма необходимым иммуногеном, например, полипептидом по изобретению или его фрагментом. Титр антител в иммунизированном организме можно отслеживать во времени с помощью стандартных методик, таких как иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) с применением иммобилизованных полипептидов. При желании из организма млекопитающего (например, из крови) могут быть выделены молекулы антител, направленные против полипептида, и затем очищены для получения фракции 1дС с помощью общеизвестных методик, например, с помощью хроматографии на протеине А. Через определенное время после иммунизации, например, когда титр антител наиболее высокий, антителопродуцирующие клетки могут быть выделены из организма и использованы для получения моноклональных антител с помощью стандартных методик, например, гибридомной технологии, первоначально описанной КоЫег и Мйзкет, №11иге 256:495-497 (1975), технологии человеческих В-клеточных гибридом (КοζЬο^ ек а1., 1ттипо1. Тобау 4: 72 (1983)), технологии ЕВУ-гибридом (Со1е ек а1., Мопос1опа1 АпйЬоб1ез и Сапсег Тйегару, А1ап В. Ыз5,1985, 1пс., рр. 77-96) или триомной технологии. Технология получения гибридом хорошо известна ( см. Сиггепк Ргокосок ш 1ттипо1оду (1994) Сойдап ек а1., (ебз.) 1оЬп ^йеу & 8опз, 1пс., Νον Уогк, ΝΥ). Кратко, бессмертная клеточная линия (обычно, миелома) подвергается слиянию с лимфоцитами (обычно, спленоцитами) млекопитающего, иммунизированного иммуногеном, как описано выше, и проводится скрининг супернатантов культур полученных клеток гибридомы для выделения гибридом, продуцирующих моноклональное антитело, связывающее полипептид по изобретению.

- 48 019953

Для получения моноклональных антител к полипептидам по изобретению могут применяться любые из множества общеизвестных протоколов, используемых для слияния лимфоцитов и бессмертных клеточных линий (см, например, Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1оду, кирга; Сайге е! а1., Ыа!иге 266: 55052 (1977); К.Н. Кеппебг ίη Мопос1опа1 АпйЬоб1ек: А Ыете Оипепкюп Ιη Вю1одка1 Апа1укек, Р1епит РиЬйкйтд Согр., Ыете Уогк, Ыете Уогк (1980); и Ьетег, Уа1е I. В1о1. Меб. 54:387-402 (1981)). Кроме того, любому специалисту понятно, что существует множество вариаций таких методик, которые тоже могут использоваться.

Кроме получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, идентификация и выделение моноклонального антитела к полипептиду по изобретению может быть проведено путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов (например, библиотеки фаговых частиц, экспонирующих антитела) при помощи полипептидов для выделения таким образом представителей библиотеки иммуноглобулинов, связывающих полипептид. Наборы для генерирования и скрининга фаговых библиотек имеются на рынке (например, КесотЬтап! Рйаде АпйЬобу 8ук!ет, компании Рйагтас1а, каталоговый номер 27-9400-01; и 8иг12ЛР™ РНаде О1кр1ау Кй, компании 8!га!адеп, каталоговый номер 240612). Кроме того, примеры методик и реагентов, удобных для использования при генерировании и скрининге библиотеки антител, можно найти, например, в и.8. Ра!еп! Ыо. 5223409; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 92/18619; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 91/17271; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 92/20791; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 92/15679; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 93/01288; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 92/01047; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 92/09690; РСТ РиЫюайоп Ыо. АО 90/02809; Рисйк е! а1., ВюТесЬпо1оду 9: 1370-1372 (1991); Нау е! а1., Нит. АпйЬоб. НуЬпботак 3: 81-85 (1992); Нике е! а1., 8аепсе 246: 1275-1281 (1989); и Сггйййк е! а1, ЕМВО I. 12:725-734(1993).

Кроме того, рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие как человеческие, так и не принадлежащие человеку участки, которые могут быть получены с помощью стандартных технологий рекомбинантной ДНК, также находятся в рамках изобретения. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены с помощью известных специалистам технологий рекомбинантной ДНК.

В общих чертах, антитела по изобретению (например, моноклональные антитела) могут использоваться для выделения полипептидов по изобретению с помощью стандартных методик, таких как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Антитело, специфическое в отношении полипептида, может облегчить очистку естественного полипептида из клеток и полипептида, произведенного рекомбинантным способом, экспрессируемого в клетках хозяина. Кроме того, антитело, специфические в отношении полипептида по изобретению, может применяться для детекции полипептида (например, в клеточном лизате, клеточном супернатанте или образце ткани) для оценки содержания и характера экспрессии полипептида. Антитела могут применяться в диагностических целях для мониторирования уровня белков в тканях, как часть процесса клинического тестирования, например, для определения эффективности применяемого режима лечения. Антитело может быть связано с детектируемым соединением для облегчения его детекции. Примеры детектируемых соединений включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; примеры люминесцентных веществ включают люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и экворин, а 125 131 35 3 примеры подходящих радиоактивных веществ включают I, I, 8 или Н.

Антитела могут также применяться для фармакогеномного анализа. В таких воплощениях антитела против полиморфных вариантов белков, кодируемых нуклеиновыми кислотами по изобретению, например полиморфных вариантов белков, кодируемых нуклеиновыми кислотами, содержащими по меньшей мере один полиморфный маркер по изобретению, могут применяться для идентификации индивидов, нуждающихся в изменении схем лечения.

Кроме того, антитела могут применяться для оценки экспрессии полиморфных вариантов белков при заболеваниях, например, активных стадий заболевания или у индивидов с предрасположенностью к заболеванию, связанной с функцией белка, в частности, к раку молочной железы. Антитела, специфические в отношении полиморфного варианта белка по данному изобретению, кодируемого нуклеиновой кислотой, включающей по меньшей мере один полиморфный маркер или гаплотип согласно данному описанию, могут применяться для скрининга наличия полиморфного варианта белка, например, скрининга предрасположенности к раку молочной железы, на что будет указывать наличие полиморфного варианта белка.

Антитела могут применяться и в других методах. Так, антитела, могут использоваться в качестве диагностических средств для оценки белков, например, вариантов белков по изобретению, в ходе анализа по электрофоретической подвижности, изоэлектрической точки, расщепления трипсином или другими протеазами, или для применения в других физических тестах, известных специалистам. Антитела могут

- 49 019953 также применяться для типирования тканей. В одном воплощении определенный вариант белка коррелирует с экспрессией в определенном типе ткани, и анитела, специфические для варианта белка, могут применяться для идентификации определенного типа тканей.

С помощью антител можно также определять субклеточную локализацию белков, включая полиморфные варианты белков, что может использоваться для определения аномальной субклеточной локализации белков в клетках различных тканей. Такое применение может использоваться в генетическом тестировании, а также мониторинге определенных схем лечения. В случае, когда лечение нацелено на коррекцию уровня экспрессии или наличия полиморфного варианта белка или аномального распределения в тканях или экспрессии в процессе дифференцировки полиморфного варианта белка, антитела, специфические в отношении полиморфного варианта белка или его фрагментов, могут использоваться для мониторинга эффективности терапии.

Антитела также применяются для ингибирования функции полиморфного варианта белка, например, путем блокирования связывания варианта белка со связывающей молекулой или партнером. Подобные применения могут также использоваться терапевтическом контексте, когда лечение включает ингибирование функции полиморфного варианта белка. Например, антитело может применяться для блокирования или конкурентного ингибирования связывания, таким образом модулируя (т.е. выполняя роль агониста или антагониста) активности белка. Антитела можно получать против фрагментов определенного белка, содержащих сайты, необходимые для определенной функции или против интактного белка, ассоциированного с клеткой или клеточной мембраной. Для применения ш утуо, антитело может быть связанным с дополнительной функциональной частью с терапевтическими свойствами, например, радионуклидом, ферментом, иммуногенным эпитопом или цитотоксическим агентом, включая бактериальные токсины (дифтерийный или растительные токсины, например, рицин). Время полужизни ш утуо антитела или его фрагмента может быть увеличено при помощи пегилирования путем конъюгирования с полиэтиленгликолем.

Данное изобретение также относится к наборам для применения антител в описываемых здесь способах. Они включают наборы для детектирования наличия полиморфного варианта белка в тестируемом образце, но не ограничиваются ими. Одно предпочтительное воплощение включает антитела, такие как меченые или способные быть помеченными антитела, а также соединения или агенты для детектирования полиморфных вариантов белка в биологическом образце, средств для определения количества или наличия и/или отсутствия полиморфного варианта белка в образце и средств для сравнения количества полиморфного варианта белка в образце со стандартом, а также инструкции по применению набора.

Ниже будут описаны примеры осуществления изобретения, не являющиеся лимитирующими.

Описание примеров осуществления изобретения

Выбор пациентов и контролей.

Данное исследование было согласовано с Национальным Комитетом Исландии по Биоэтике и Комитетом Исландии по Защите Данных. Медицинская документация по пациентам с диагнозом рака молочной железы была получена из Исландского Реестра по Раку (от англ. !се1п1с Сапсег Кед1к!гу, ГСК). В документации описывались все случаи инвазивных опухолей молочной железы и протоковой или дольковой карциномы т-кйи, выявленные в Исландии с 1 января 1955 до 31 декабря 2005. В ГСК имелась документация по 4603 индивидов, которым за этот период был поставлен диагноз. Преобладающая часть пациентов, включающая всех живущих пациентов (приблизительно 2840), соответствовала критериям включения в исследование. Информированное согласие и образец крови и клинические данные были получены у 2210 пациентов, что составило приблизительно 78%. Исходная группа сравнения состояла из всех индивидов, участвующих в проводимых в беС0ЭЕ Оепейск общегеномных ассоциативных исследованиях и прошедших генотипирование с помощью чипов 11итта 8№ на тот момент, когда были генотипированы пациенты из группы с раком молочной железы. Индивиды, включенные в исландский реестр по раку с диагнозом рака молочной железы, рака простаты или колоректального рака на конец 2005 г, были исключены из контрольной группы, в которую в результате вошли 4477 контролей. Независимая дублирующая группа контролей состояла дополнительно из 7406 индивидов, участвовавших в проектах, не связанных с раком молочной железы, типированных после группы из 4477 человек. В этой группе из 7406 человек пациенты с раком простаты и колоректальным раком не исключались, поскольку были получены предварительные данные, указывающие на то, что частоты изучаемых ОНП в этих группах пациентов не отличались от контрольных. Ни в одной группе контролей не наблюдалось различий между полами по частотам ОНП, приведенных ниже в табл. 8, 9 и 14. Таким образом, данные контрольные группы были достаточно репрезентативными в отношении популяционных частот изучаемых ОНП.

Генеалогическая база данных.

В беС0ЭЕ Оепейск существует компьютеризированная база данных генеалогии исландцев. Имеются данные практически по всем индивидам, родившимся в Исландии на протяжении последних двух столетий и для 95% рождений за этот период известна информация о родителях [81дитбагбо!11г, е! а1., (2000), Ат 1 Нит Оепе!, 66, 1599-609]. Кроме того, для большинства индивидов указывается округ, в котором он проживает, по данным переписи и церковно-приходским записям. Информация содержится в реляционной базе данных с закодированными персональными идентификаторами, соответствующими тем, ко

- 50 019953 торые используются для биологических образцов и документации в 1СВ, что позволяет сопоставлять генотипы и фенотипы исследуемых пациентов с их генеалогией.

Обработка образцов.

Образцы крови хранили в ЭДТА при -20°С. ДНК выделяли из цельной крови при помощи колоночного метода выделения Р1адеп (1шр: \\-\\-\\-.с]и1адеп.сот). ДНК хранили при 4°С.

Г енотипирование.

Впоследствии с помощью микрочипов 111итта 1пйпшт Нар300 8NΡ (111итта, 8ап П1едо, СА, и8А), содержащих 317 511 ОНП, установленных в ходе I фазы международного проекта НарМар, были генотипированы образцы 1600 пациентов, выбранных случайным образом. Образцы контролей, не имеющих рака, были генотипированы с помощью той же платформы. Из всех ОНП, представленных на чипе, для 170 не удалось вывести генотип, а у других 24 ОНП выход был ниже 80%. Другие 61 ОНП имели высокозначимое отклонение от равновесия Харди-Вайнберга среди контролей (р < 1х10^-10). 104 ОНП были мономорфными и 58 ОНП были близки к тому, чтобы считаться мономорфными (т.е. частота минорного аллеля в объединенной когорте пациентов и контролей составляла менее 0,001). Наконец, после изучения определенных регионов и возможных сигналов в ходе нескольких общегеномных ассоциативных исследований, проводящихся в беСОЭЕ, оказалось, что 5 маркеров генотипировать невозможно. Все проблематичные ОНП были исключены из анализа. Таким образом, в итоговом анализе, описываемом в тексте, было использовано 317 089 ОНП. Любые чипы с уровнем сигнала ниже 98% также исключались из анализа.

Ниже представлены последовательности трех ключевых ОНП, изучавшихся в данном исследовании:

гк4848543(8Ер ΙΌ №:1): садда1аадайаШс1даддс1дс11сса1сад1ддис1д1дадс1ддссса1д1айсадссад1сад1аддсс а1саадса1дса1с1асдсааддсас1адаадддйаса1асаа1дддааас1даддсссадааддаддааада1да ад1дсссааадНааддада1аааадсадаад1дсадд1аададааддад1айса1айас1дсаддаа1ссааайс1 асаадааса1асдсйдисЖааадддадссс1сдс«1аадсайаШдссда1саа1асс[А/С]аиаа1аайасадд аса1дддсааа1аШЛадсааадд1сс1дадд1сйсс1ада1д1дсссаааа1аасааддас1ссссссдсадд1ддса ссаааад1сддадда1д1диддаадс1дассйссссасс1д1ссс1дсс1сасссасад1сасссасссс1с1адда1д1 аа1дд1даа1са11саасаса1дддссассНдддаад1сдсйаасс1с1с1ссс1ШсасдКа1аааа1дддса1ад1саН асасааа!дса1ааа1саасс1саа1Шс1са1с1 гк13387042(8Ер ΙΌ №:2): с1даса1адссдсс1д1дсаддШидддассадд1с1дсса1с1д1айсссаддс1дддс1ддадсасс1дад дс1ас1а1ддйасадаааддаасс!ддса1ссдаадд1а1аддс1сааа1сссадс1с1са1дайдс1адсН1даддй1с аддйсаШсКаад1дс1с1дадсй1дд1дссс1сс1с11саааа1дддаа1даддадса1д1с1адс1ссс1дШ1дйдсад 1даа1адс1аса1даадаасадс1ааассадаасадааадааддсааа1дда[А/(3]дс1асадааассааддаШс сидйдаа1сдаа1сйссисаа1сисс11сассасас1ад1дда1с1ссс1д1дддаддда1дНдадад1дс1ссд1д1ШШ 1дййШ1ШШ1Шйд1да1ддад1с1сас1с1д1сасссадас1ддаа1дсад1дд1дсда1с1сддс1сас1дсаасс1с1дс с1сссаддйсаад1даНс1сс1дсс1садсйсссаад1адссаддас!асаддса1а1дсса1сасасссадс1ааШи д!айШад1ад гк3803662 (8ΕΡ ΙΌ №:3): дс1ад1ссйддс1дис1д1да1сааа1дсааидШсссай1с11аадааасадаа1сШаНадас1садисйН с11ддКайШасааШ1айдПс1а1ддйайаааааа1ааса1д1са1а1ааа«аадсс1адаааса1дда1дН1а1сааа даааддаНд1са1ссааадсассаас1а1дадада1а1с1а1д1дсаа1дд1а1а1ада1с1д1са1адаадддШаа11а1 а1с1дсс1аа1даШ1с1с(ссиаа1дсс1с1а1адс1д1с[С/Т]сиадсдаадаа1аааас1д1ддас1дасссссассса Шдсдаадааад1ас1ддд1сйсадсШсаПдНсадссдд1дд1сШд1ддасаасассаддддсссс1сс1дс1даад ас1д1с1ддасйсс1да1П1сас1сс1д1а1ааассссс1сссссаКас1ассШд1с1ссйддддаааааааа1д1Ш1сас Иаадсаааа1аа1аас1асссад1аШдШс1ддад1дааайд1ааасйсайд1асаисйсс1ддсШда1дсйа1сд

Были разработаны и апробированы способы анализа для определения количества ОНП в блоке НС гк4848543. Данные способы анализа основаны на технологии анализа ОНП на платформе Сеп!аишк, описанной в |Ки1уаут, е! а1., (2006), №с1е1с Ас1бк Век, 34, е128]. Были использованы следующие анализы и праймеры для них:

- 51 019953

56025733

Г8895398 (ΒυΐΙά 34) сНг2:120,058,180

Прямой праймер: ТТ66ААССТСССАСТ6ССАСА

Обратный праймер: АСА6СССА66ТТТСА66ТТ66САТ

У1С-Зонд: А6С6АСАСТ6

РАМ-Зонд: 6С6АСАСС6

Энхансер: ССТ6*А6АТССА66СА

56023738

Г54848543 .

(ВиНс! 34) спг2:120,061,096

Прямой праймер: А6С6А6СССТСССТТТАА6САТТА

Обратный праймер: ТТТ666САСАТСТА66АА6АССТС νΐΟ-Зонд: 6АТ*СААТАССС

РАМ-Зонд: С6АТ*СААТАССА

Энхансер: ТТААТААТТАСА66АСАТ6

56025739

Г56759589 (ВиНО 34) сбг2:120,064,976

Прямой праймер: ТСА6СА6ССТСТТ6ТСТСАСТААТ

Обратный праймер: СТТСТТ6СССА66СА66АСА6А νΐΟ-Зонд: ТА6АСТ6А6СС

РАМ-Зонд: ААТ*А6АСТАА6СС

Энхансер: ССАТССССААСТАА

56025753

Г5895397 (Вина 34) сбг2:120,072,400

Прямой праймер: САСТАСТА6АТСАТ666А6АТ6ССТ

Обратный праймер: 6ТТТССТСА6ТТ6ТААТ6ТА6АСС νΐΟ-Зонд: ТТ*Т*А*АСССТТ

РАМ-Зонд: 6ТТТТААССССТ

Энхансер: 6СТ6СТС66АА6

56025740

Г5838102 (Вина 34) сИг2:120,079,878

Прямой праймер: 66ТТТТ6САТССТТ6СТСАСТСАСАТ

Обратный праймер: 6Т6СССТСТ6С6ТАСТТ6С6ААТ

- 52 019953 \/1С-Зонд: ТАСТ6ССАСС

ЕАМ-Зонд: СТТАСТ6ССАСТ

Энхансер: Т6ТСТССТСАСТС

36023741 гз838100 (ΒυϊΙό 34) сбг2:120,083,710

Прямой праймер: АСТТАССААСА6СА66СТ66Т6

Обратный праймер: ССА6ААА666Т66СТСАССТСА

У1С-Зонд: 6ТСТ6А66СТ

ЕАМ-Зонд: 66ТСТ6А66ТТ

Энхансер: ТСА66ТСАСТС6

86023734

Г312711924 (ΒυϊΙά 34) сНг2:120,107,316

Прямой праймер: ААС6СТТАТСАСА6А6ССА66ТА6

Обратный праймер: 66ААААССАТ6ААСАСТ6Т66САА νΐΟ-Зонд: ССС6СС6Т

ЕАМ-Зонд: 6ССС6ССАТ

Энхансер: ТТ6ТСТТТСТТ6Т6ТС

36025742

Г33731603 (ВиЛб 34) сПг2:120,117,062

Прямой праймер: ААСА*СТСТА666А6ТААА6СТС

Обратный праймер: 6А66А*САТТТ66А6ТССССААТ νΐΟ-Зонд: 6АСТ6ТСТТСАА

ЕАМ-Зонд: АСТ6Т*СТ*ТСАС

Энхансер: АА6ТСА6ТССТ6А6

36028728 гз13387042 (ΒιιϊΙά 34) спг2:218,108,374

Прямой праймер: ССАСТА6Т6Т66Т6А*А66АА6АТТ

Обратный праймер: 6СТАСАТ6А*А6АА*СА6СТАААСС νΐΟ-Зонд: ТТТСТ6ТА6ССТ

ЕАМ-Зонд: ТТ*Т*СТ6ТА6СТ*Т

Энхансер: САТТТ6ССТТСТТТС ^указывает модифицированное основание, согласно описанию [Ки1уаут е! а1., (2006), Хискмс АсМк Кек, 34, е128].

Единственная основополагающая мутация гена ВКСА2 депе (999йе15) представлена с частотой носительства 0,6-0,8% в общей исландской популяции и 7,7-8,6% среди женщин с раком молочной железы [Тког1асшк е! а1., (1997), Ат 1 Нит Сепе!, 60, 1079-84; Сийтипйккоп е! а1., (1996), Ат 1 Нит Сепе!, 58, 749-56]. Возможность наличия мутации ВКСА2 999йе15 определяли у 1499 случаев с применением анализа по технологии ПЦР-анализа микросателлитов, обозначенного Ι)('.'ι13δ3727. Использовали следующие праймеры:

Прямой: Т6Т6АААА6СТАТТТТТССААТС

Обратный: АТСАС666Т6АСА6А6САА

Последовательность, амплифицированная в ΙΧ.ΐ13δ3727, представляла собой:

- 53 019953

Расположение ϋΟ1383727 =сНг13:30703058-30703261

ЕдйдаааадсБаЪЬББЬссааБсаЪдаБдааадБсЪдаадаааааЪдаБа даЬБЪаБсдсББсЬдЪдасадасадЪдаааасасаааБсааададаадсЬ дсаадЪсаЪддБаадБссБсЬдЬБЪадББдаасЪасаддЬБЪЪЬЪЬдЬЪд ЬЕдЪЪдЕЪБЪдаБЬЬЕЕЕЪБЪБйБдаддЪддадЪсЪЪдсЪсБдЬсасссд ЬдаБ

Статистические методы.

Относительный риск (ВВ) для аллеля ОНП был подсчитан с применением мультипликативной модели следующим образом: ВВ=[р/(1-р)]/[з/(1-з)], где р и з представляют собой частоты варианта у пациентов и контролей, соответственно. Соответствующие значения Р для ВВ были рассчитаны на основании стандартной статистики хи-квадрат отношения правдоподобия. Доверительные интервалы рассчитывали, допуская, что оценки ВВ имеют логарифмически нормальное распределение.

Частоты гаплотипов оценивали при помощи максимального правдоподобия, а анализ различий между случаями и контролями выполняли при помощи обобщенного теста отношения правдоподобия. Для подсчета результатов для гаплотипов применяли программу анализа гаплотипов с названием ЫЕМО, от англ. ЫЕз1еб Мобе1з. Подчеркивается, что для решения проблемы неопределенности гаплотипов и пропусков генотипов в ЫЕМО не применяется традиционный двухэтапный способ исследования ассоциации, когда вначале оценивают частоты гаплотипов, возможно с применением алгортима максимизации правдоподобия, а затем выполняются тесты, в которых оценки частот принимают за истинные значения частот, поскольку данный способ иногда может вызывать затруднения и требовать рандомизации для того, чтобы корректно оценить статистическую достоверность. Вместо этого, в ЫЕМО оценки максимального правдоподобия, отношения правдоподобия и значения Р подсчитываются напрямую для имеющихся данных и, следовательно, потеря информации из-за неопределенности гаплотипов и пропусков генотипов автоматически фиксируется в отношении правдоподобия.

Некоторые пациенты и контроли из Исландии приходятся друг другу родственниками, как внутри групп, так и между группами. Для внесения поправки на наличие родства в результаты ассоциативного анализа, была проведена симуляция генотипов по распределению аллелей в генеалогии исландцев. По каждой симуляции тест на наличие ассоциации у случаев и контролей выполняли таким же образом, как и для реальных генотипов, т.е. тест хи-квадрат отношения правдоподобия. Для N числа симуляций было подсчитано среднее значение статистик хи-квадрат (что аналогично вариации соответствующего Ζзначения (Ζ-зсоге)), которое при нулевой гипотезе должно равняться 1 для индивидов, не состоящих в родстве, а для родственников должно быть несколько выше. Затем поправку на наличие родства учитывали путем деления статистики хи-квадрат истинных показателей ассоциации на среднее значение, полученное при симуляциях.

Совместный анализ множества групп случай-контроль проводили с применением метода МантеляХензеля, при котором предполагается, что у групп могут быть различные популяционные частоты аллелей, гаплотипов и генотипов, но они имеют одинаковый относительный риск.

Все приведенные значения Р являются двусторонними.

Анализ певично-множественных опухолей молочной железы

Документация по пациентам с диагнозом первично-множественного рака молочной железы (ПМ РМЖ) была получена в 1СВ. При диагностировании первичных опухолей после первоначального диагностирования рака молочной железы подтверждали как клинически, так и гистологически, что они являются независимыми первичными опухолями, развивающимися одновременно или последовательно с первоначально диагностированными опухолями молочной железы, и возникают контралатерально или ипсилатерально. Опухоли, классифицированные клинически или гистологически как рецидив первоначальной опухоли или как отдельные мультифокальные первичные опухоли, исключали из анализа. Пациентов с диагностированными двумя или более независимыми первичными опухолями, зарегистрированных в реестре на конец 2005 г включительно, считали имеющими ПМ РМЖ. Пациентов, не имеющих диагностированной второй первичной опухоли согласно 1СВ на 31 декабря 2005 г., считали случаями с одиночными первичными опухолями молочной железы (ОП ОМЖ). Риск ПМ РМЖ по отношению к ОП ОМЖ определяли при помощи логисиической регрессии, с учетом количества лет, прошедших после постановки первого диагноза рака молочной железы, в качестве ковариаты. Возраст при начале заболевания сравнивали с помощью линейной регрессии с применением программы NЕМО.

Анализ семейного анамнеза.

Для каждого пораженного пробанда определяли индекс семейного анамнеза с применением генеалогической базы данных и документации 1СВ. Круг родственников пробанда от первой до третьей степени определяли используя генеалогическую базу данных. Затем у родственников определяли статус поражения заболеванием согласно записям в 1СВ. Пробандам присваивали индекс семейного анамнеза, равный 1 для каждого пораженного родственника первой степени, 0,5 для каждого пораженного родственника второй степени и 0,25 для каждого пораженного родственника третьей степени. Затем для каждого

- 54 019953 пробанда подсчитывали общий индекс. Потенциальное взаимоотношение между генотипом ОНП маркера и индексом семейного анамнеза затем определяли при помощи критерия Вилкоксона, рассчитываемого в программе ДМР ν4 (8.А.8. БъШШе 1пс.).

Ассоциативный анализ фенотипов:

Для ассоциативного анализа использовали два родственных фенотипа. Первый фенотип включал всех 1600 индивидов с диагностированным раком молочной железы. Данный фенотип был обозначен Все формы рака молочной железы (все формы РМЖ). Ко второму фенотипу были отнесены индивиды с предрасположенностью от умеренной до высокой, обозначавшейся как Умеренная предрасположенность (УмерПред).

Чтобы фенотип подходил под это определение, требовалось соответствие пробанда по меньшей мере одному из следующих критериев:

1. Пробанд является представителем группы случаев рака молочной железы, объединяющей 3 или более пораженных родственников, находящихся на генетическом расстоянии не более 3 мейотических делений (ЗМ).

2. Пробанд является одним из пары пораженных родственников, находящихся на расстоянии не более 3М, у одного из которых диагноз был поставлен в возрасте 50 лет или младше.

3. Пробанд является одним из пары пораженных родственников, находящихся на расстоянии не более 3М, у одного из которых была диагностирована вторая первичная опухоль любого типа.

4. У пробанда была диагностирована вторая первичная опухоль любого типа.

Из 1600 исландских пациентов, вошедших в представленное здесь исследование, 653 отвечают критериям УмерПред (40,8%).

Результаты

Раздел 1: гк4848543 на хромосоме 2д14.2

Аллель А гк4848543 ассоциирован с повышенным риском рака молочной железы.

Общегеномный ассоциативный анализ показал, что аллель А гк4848543 был ассоциирован с раком молочной железы УмерПред. Данные по этому ОНП были получены с помощью чипа Шиш1па для 1598 пациентов (из которых 653 соответствовали критериям фенотипа УмерПред) и 4477 контролей, не имеющих рак. Оценки РК для аллеля А гк4848543 в случае ассоциации с раком молочной железы УмерПред составили 1,42 при значении Р, равном 8,3x10-8 после коррекции на наличие родства между индивидами в группах случаев и контролей (табл. 1). После применения поправки Бонферрони с учетом 317089 протестированных ОНП суммарное скорректированное значение Р составило 0,026. Для аллеля А гк4848543 также была обнаружена допустимо значимая ассоциация с фенотипом все формы РМЖ, с оценкой относительного риска, равной 1,16 (табл. 1). Для подтверждения этих результатов на независимой выборке из Исландской популяции была разработана и апробирована технология анализа ОНП на платформе Сеп!аиги8, 86028738, для исследования ОНП гк4848543. Анализ 86028738 был проведен дополнительно у 573 пациентов с раком молочной железы, из которых 198 удовлетворяли определению фенотипа

УмерПред. Этих пациентов сравнивали с независимой контрольной группой, включавшей 7406 индивидов, типированных в отношении гк4848543 при помощи чипа Шиш1па или анализа 86028738. Оценки КК для аллеля А гк4848543 в случае ассоциации с раком молочной железы УмерПред во второй группе составили 1,26 (значение р=3,4х10^-2). Таким образом, исходные результаты были воспроизведены с допустимым уровнем значимости на независимой исландской выборке. Результаты совместного анализа, при котором объединили 1598 пациентов из первоначальной группы и 573 пациентов из дублирующей группы и провели сравнение с 11883 контролями, показаны в табл. 1. Совместный анализ показал допустимый уровень значимости риска для фенотипа все формы РМЖ и риск, значимый на общегеномном уровне для фенотипа УмерПред. Суммарное значение Р для рака молочной железы УмерПред после поправки Бонферрони составило 0,0095 (коррекция на 317089 ОНП). Данный показатель является значимым на общегеномном уровне, даже с учетом того, что были протестированы два фенотипа все формы РМЖ и УмерПред.

Поскольку документацию в 1СК начали вести с 1955 г, некоторые из пациентов, вошедших в исследование, имели большую продолжительность выживания после обнаружения рака. Если пациенты с носительством вариантного аллеля А гк4848543 имели бы иную вероятность длительного выживания, чем лица, не несущие его, то частота варианта среди распространенных случаев могла бы различаться. Для изучения этой возможности была выделена подгруппа пациентов, состоявшая из 833 индивидов, которым диагноз был поставлен после 1 января 2000 г и у которых время от постановки диагноза до включения в исследование составило менее 5 лет. В этой когорте пациентов, которым диагноз был поставлен недавно, частота аллеля А гк4848543 составила 0,372945. Также была выделена группа из 1338 пациентов, которым диагноз был поставлен после 1 января 2000 г и которые дожили до включения в исследование. Частота аллеля А гк4848543 в этой группе составила 0,372749, что достоверно не отличалось от частоты среди недавно диагностированных пациентов (значение Р = 0,99). Таким образом, нет очевидных доказательств того, что различная выживаемость оказывает влияние на оценки риска, приведенные в

- 55 019953 табл. 1.

Кроме того, было отмечено, что у пациентов с раком молочной железы, не имеющих фенотипа УмерПред, не обнаруживалось повышенной частоты аллеля А г§4848543 (табл. 1). Значение этого наблюдения будет обсуждаться ниже. Были также изучены взаимоотношения между аллелем А г§4848543 и различными слагаемыми определения фенотипа УмерПред:

Аллель А г§4848543 не имеет достоверной ассоциации с ранним возникновением рака молочной железы.

Поскольку молодой возраст при постановке диагноза был одним из критериев, использованных в определении фенотипа УмерПред, была рассмотрена ассоциация между возрастом при постановке диагноза и генотипом г§4848543. Для 1598 пациентов, которым был проведен анализ с помощью чипов 111ит1па, не было обнаружено достоверной ассоциации между генотипом г§4848543 и возрастом при постановке диагноза (табл. 2).

Риск, обусловленный аллелем А г§4848543, ассоциирован с семейным анамнезом рака молочной железы.

Индекс семейного анамнеза подсчитывали для каждого пробанда, включенного в исследование. С применением генеалогической базы данных для каждого пробанда был определен круг родственников от первой до третьей степени. Затем, при обращении к данным 1СК, были идентифицированы все родственники, у которых также был диагностирован рак молочной железы. Затем для каждого пробанда был подсчитан суммарный индекс семейного анамнеза (ИСА), когда за каждого пораженного родственника первой степени присваивали 1 балл, за каждого пораженного родственника второй степени присваивали 0,5 балла и за каждого родственника третьей степени присваивали 0,25 балла. Затем 1598 пробандов, типированных с применением чипов Шитта, исследовали на наличие ассоциации между ИСА и генотипом г§4848543. Как показано в табл. 2, при носительстве аллеля А т§4848543 наблюдалась тенденция к увеличению ИСА. Данные результаты было бы невозможно ожидать только на том основании, что вариантный аллель А т§4848543 обусловливает относительный риск среди пациентов с фенотипом все формы РМЖ, равный всего лишь 1,16; такой относительный риск сам по себе не мог бы обусловливать в семьях концентрации случаев с раком молочной железы |81ассу, с! а1., (2006), РЬо8 Мсб, 3, с217]. Тем не менее, аллель А Т54848543 был обнаружен у лиц с фенотипом УмерПред, в определении которого важным слагаемым является наличие семейного анамнеза. Данные наблюдения позволяют предположить, что аллель А Т54848543 может находиться в неравновесии по сцеплению с менее распространенным вариантом, имеющим высокую пенетрантность. Возможно также, что аллель А т§4848543 может взаимодействовать с другими предрасполагающими факторами, имеющими высокую пенетрантность, повышая их пенетрантность и, следовательно, ассоциацию с семейным анамнезом рака молочной железы.

Ассоциация между риском, обусловленным аллелем А т§4848543 и семейным анамнезом рака молочной железы, частично (но не полностью) объясняется семейным носительством мутации ВКСА2 999бс15.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между аллелем А т§4848543 и семейным анамнезом рака молочной железы было исследовано, объясняется ли семейная концентрация, характерная для пациентов с носительством аллеля А т§4848543, существованием в семьях носительства хорошо охарактеризованной в Исландии мутации ВКСА2 999бс15. Из группы 1600 пациентов, 1499 было типировано на наличие мутации ВКСА2 999бс15. ИСА был пересчитан согласно описанию выше, на этот раз все пробанды, несущие мутацию ВКСА2 999бс15, были исключены. Как показано в табл. 2, ассоциация между аллелем А Т54848543 и ИСА после исключения носителей мутации 999бс15 оставалась достоверной, что позволяло предположить, что наличие ассоциации невозможно полностью отнести на счет семей с мутацией ВКСА999бс15. Однако значение Р было существенно выше, чем без исключения носителей 999бс15, что дало основания предположить, что ВКСА2 999бс15 может в некоторой степени обусловливать семейную концентрацию, характерную для аллеля А т§4848543.

Риск, обусловленный носительством аллеля А т§4848543, распространяется на носителей мутации ВКСА2 999бс15.

Поскольку мутация ВКСА2 999бс15 имеет столь важный эффект при семейном раке молочной железы в Исландии, была исследована ее взаимосвязь с вариантным аллелем А т§4848543. Одним из возможных сценариев было бы то, что вариантный аллель А т§4848543 обусловливает незначительный дополнительный риск носителям ВКСА2 999бс15, как это было предположено в случае взаимодействия между мутациями СНЕК2 и ВКСА [(2004), Ат ί Нит Сспс1, 74, 1175-82; Мсусга-НсуЬосг, с! а1., (2002), №а! Сспс1, 31, 55-9]. В таком случае частота вариантного аллеля А т§4848543 среди пораженных носителей ВКСА2999бс15 приблизительно соответствовала бы его частоте среди контролей. Напротив, если бы частота вариантного аллеля А т§4848543 у пораженных носителей ВКСА2 999бс15 была выше, чем среди популяционных контролей, это бы означало, что аллель А т§4848543 обусловливает у носителей ВКСА2 риск, превышающий риск, обусловленный мутацией 999бс15. Для проведения анализа на максимально большом числе носителей ВКСА2 999бс15, группу исландских пациентов Шитта объединили с дублирующей группой. Изучение данных показало, что частота вариантного аллеля А т§4848543 среди носителей ВКСА2 999бс15, имеющих рак молочной железы, составила 0,463, что было достоверно выше, чем

- 56 019953 частота среди контролей и соответствовало ВВ, равному 1,65 (табл. 3). Таким образом, у носителей ВВСА2 999йе15 (уже имеющих высокий риск рака молочной железы) риск мультиплицируется на коэффициент, равный по оценкам 1,65 для каждого имеющегося аллеля А г§4848543. Данных, указывающих на то, что генотип г§4848543 отклоняется от мультипликативной модели, получено не было. Данные наблюдения свидетельствуют о том, что повышенный риск рака молочной железы, обусловленный вариантным аллелем А г§4848543 распространяется на носителей ВВСА2 999йе15. Поскольку ВВСА2 999йе15 представляет собой нуль-мутацию, при которой образуется нефункциональный белок, эти результаты позволяют предположить, что риск, обусловленный аллелем А г§4848543, распространяется на всех носителей мутаций ВВСА2, когда из-за мутации белок превращается' в нефункциональный.

Аллель А г§4848543 может обладать синергичным действием с ВВСА2 999йе15.

Наблюдение за тем, что риск, обусловленный аллелем А г§4848543, распространяется на носителей ВВСА2 999йе15, заставляет задаться вопросом, обусловливает ли варинат такой же риск у носителей 999йе15, как и у лиц, не являющихся носителями 999йе15. Было отмечено, что оценки относительного риска, обусловленного аллелем А т§4848543 у носителей ВВСА2 999йе15 (1,65) были несколько выше, чем оценки относительного риска, обусловленного аллелем А т§4848543 у лиц, не являющихся носителями мутации ВВСА2 (1,13, табл. 3). Поэтому было исследовано, отличается ли относительный риск, обусловленный аллелем А т§4848543 в составе генотипа ВВСА2 999йе15, от обусловленного в составе генотипа с отсутствием 999йе15. Как показано в табл. 3, относительный риск, обусловленный аллелем А Т54848543, оценивался в 1,46 раза выше у носителей 999йе15 по сравнению с лицами, не являющимися носителями. Данные наблюдения согласуются с мнением, согласно которому аллель А т§4848543 обладает синергичным действием с ВВСА2 999йе15. Поскольку ВВСА2 999йе15 представляет собой нульмутацию, при которой образуется нефункциональный белок, эти результаты позволяют предположить, что аллель А т§4848543 обладает синергизмом со всеми мутациями ВВСА2, когда из-за мутации белок превращается в нефункциональный.

Возможное взаимодействие с ВВСА2 999йе15 было также исследовано путем оценки того, наблюдается ли у пациентов достоверная корреляция между количеством вариантных аллелей т§4848543 и 999йе15. Как показано в табл. 4, у пациентов отмечалась достоверная корреляция между количеством имеющихся вариантных аллелей А т§4848543 и носительством аллелей ВВСА2 999йе15. Для исследования возможности того, что корреляция между аллелем А т§4848543 и аллелями ВВСА2 999йе15 у пациентов возникла вследствие стратификации популяции, существование корреляции было изучено в контрольной популяции. У 5938 контролей, прошедших тестирование на наличие обоих вариантов, корреляции не было отмечено. Из данной группы 5938 контролей были исключены пациенты с раком молочной железы. Поскольку ВВСА2 999йе15 является очень выраженным фактором риска рака молочной железы, может возникнуть предположение, что контрольная группа была истощена по носителям 999йе15 (поскольку не страдать раком молочной железы могло относительно небольшое количество женщинносителей). Поэтому эксперимент был повторно проведен на контрольной группе, состоявшей из 2925 мужчин, которые прошли тестирование на наличие обоих вариантов. В этой группе не было получено данных, свидетельствующих о корреляции между аллелем А т§4848543 и носительством 999йе15. Таким образом, было сделано заключение о том, что свидетельств стратификации популяции, которая могла бы быть причиной совместного наследования у пациентов аллеля А т§4848543 и 999йе15, обнаружено не было. Следовательно, наиболее вероятным объяснением является то, что аллель А т§4848543 и 999йе1 5 обладают синергичным действием.

Затем мы вновь вернулись к рассмотрению того, что аллель А т§4848543 обнаруживал ассоциациию с семейным анамнезом после исключения из анализа пациентов с известным носительством ВВСА2 999йе15 (табл. 2). Было исследовано, обнаруживается ли повышенная частота аллеля А т§4848543 у пациентов с высоким риском, не являющихся носителями ВВСА2 999йе15, но соответствующих критериям фенотипа УмерПред. У данных пациентов частота была выше, чем у контролей и соответствовала относительному риску 1,35 (табл. 3). Таким образом, ассоциация риска и аллеля А т§4848543 распространяется на пациентов, не являющихся носителями 999йе15, но, тем не менее, имеющих характеристики УмерПред.

Как показано в табл. 1, у пациентов, не соответствующих определению фенотипа УмерПред, не было обнаружено риска, ассоциированного с аллелем А т§4848543. Это позволяет предположить, что аллель А т§4848543 обусловливает риск исключительно в составе фенотипа УмерПред. Это может иметь место при существовании относительно редкой мутации с высокой пенетрантностью на фоне вариантного аллеля А т§4848543. Возможно также, что вариантный аллель А т§4848543 может указывать на существование другого более распространенного аллеля, влияющего на пенетрантность ВВСА2, а также других, еще не обнаруженных факторов риска с высокой пенетрантностью, ассоциированных с наследственностью. Такие неизвестные факторы риска могут представлять собой варианты других генов с высокой пенетрантностью, полигенные сочетания вариантов, или факторы риска окружающей среды, концентрирующиеся в семьях. Для удобства подобные гипотетические факторы риска с высокой пенетрантностью будут обозначаться ВВСАх. Для дальнейшего изучения возможности аллеля А т§4848543 действовать в качестве гена-Модификатора, было исследовано, обнаруживается ли аллель А т§4848543 среди

- 57 019953 пораженных носителей ВЕСА2 999бе15 с той же частотой, как и у пораженных пациентов с фенотипом УмерПред, не являющихся носителями ВЕСА. Действительно, это подвергает сомнению представление о том, что аллель А гк4848543 обусловливает у носителей 999бе15 такой же риск, как и у индивидов с ВЕСАх. Как показано в табл. 3, между этими группами не наблюдалось достоверной разницы в частотах вариантного аллеля А гк4848543. Тем не менее, точечная оценка относительного риска составляла 1,22, что позволяло предположить, что эффект может быть более выраженным у носителей 999бе15.

Носители аллеля А гк4848543 и ряда других маркеров в составе блока НС гк4848543 (в неравновесии по сцеплению с гк4848543) имеют повышенный риск развития первично-множественного рака молочной железы:

Возникновение множественных первичных опухолей молочной железы является индикатором наследственной предрасположенности и имеет важное клиническое значение. Пациенты, у которых был выявлен рак молочной железы, имеют существенно больший риск развития второй первичной опухоли. Генетическая предрасположенность может являться значительным слагаемым такого повышенного риска. По этой причине было исследовано развивался ли первично-множественный рак молочной железы (ПМ РМЖ) с частотой, превышающей ожидаемую, у носителей аллеля А гк4848543 по сравнению с лицами, не являющимися носителями. Данные, полученные с помощью чипов 111ит1па, указывали на возможность прогнозирования ПМ РМЖ с помощью других маркеров в блоке НС гк4848543 по меньшей мере с таким же успехом, как и с помощью гк4848543. Поэтому была разработана и апробирована панель, состоящая из 8 тестов на маркеры в составе этого блока. При оценке риска ПМ РМЖ с помощью логистической регрессии и коррекции на продолжительность ведения пациентов, для 7 из 8 ОНП был продемонстрирован повышенный риск ПМ РМЖ у носителей при сравнении с пациентами, у которых были диагностированы только одиночные первичные опухоли молочной железы (ОП ОМЖ) (табл. 5). Было сделано заключение, что с помощью анализа данных 7 ОНП возможно определить, имеется ли у пациента повышенный риск ПМ РМЖ.

Несколько ОНП в составе одного блока неравновесия по сцеплению ассоциированы с фенотипами рака молочной железы все формы РМЖ и УмерПред.

Аллель А гк4848543 находится в составе блока неравновесия по сцеплению (НС), который ограничивается координатами, приведенными в табл. 6, в соответствии с NСВI Вш1б 34. Блок НС был определен как участок, располагающийся между горячими точками рекомбинации в соответствии с определением Группы Математической Генетики университета Оксфорда с применением теста отношения правдоподобия, описанного в [МсУеап, е! а1., (2004), ЗсЬепсе, 304, 581-4; \Утск1ег, е! а1., (2005), ЗсЬепсе, 308, 107-11]. Данные, полученные с помощью чипа Шитта Нар300 позволили обнаружить несколько ОНП, находящихся в том же блоке неравновесия по сцеплению, что и аллель А гк4848543, имевших допустимо значимый уровень ассоциации с двумя исследованными факторами, предрасполагающими к раку молочной железы. В табл. 7 и 8 приведен список всех ОНП в блоке НС, представленных в составе чипа 111ит1па Нар300, и показатели ассоциации, полученные по ним для двух фенотипов. Кроме того, были рассмотрены 2-маркерные гаплотипы в составе блока, которые были идентифицированы в качестве хороших суррогатов (г²>0,8) для дополнительной группы ОНП, типированных в ходе проекта НарМар (все ссылки на данные НарМар приведены в соответствии с 20 версией). Эти добавочные ОНП имели частоту минорного аллеля >5% в выборках ИТАН СЕРН (СЕИ) НарМар, и они не были представлены ни в составе чипа Нар300 ЗЖ и не маркировались ОНП, представленными в составе чипа [Ре'ег, е! а1., (2006), N3! Сепе!, 38, 663-7]. Результаты по так называемым гаплотипам Эа1у также приведены в табл. 7 и 8. В случае рака молочной железы УмерПред для 29 отдельных ОНП или 2-точечных гаплотипов Эа1у были показаны допустимо значимые значения р.

Риск, ассоциированный с аллелем А гк4848543, прослеживается в составе нескольких гаплотипов.

Для выяснения, маркирует ли аллель А гк4848543 относительно редкий вариант с высокой пенетрантностью или обладает свойствами распространенного модификатора других факторов с высокой пенетрантностью, было исследовано все разнообразие гаплотипов, в составе которых появляется аллель А гк4848543. Блок НС гк4848543 ЬЭ содержит участок с достаточно высокой частотой рекомбинации, дистальный конец которого располагается вблизи нуклеотида 120034174. ОНП, обусловливающие допустимо значимый риск рака молочной железы, расположены дистально (правее) от этого участка рекомбинации. Таким образом, анализ разнообразия гаплотипов был ограничен этой зоной в правой части блока. Для идентификации гаплотипов в составе указанного региона (между нуклеотидами 120034174 и 120129001) с применением ОНП и образцов, типированных с помощью чипов 111ит1па, применяли программу NЕМ0. Лишние ОНП, которые не были необходимыми для идентификации гаплотипов, были исключены, а затем для каждого полученного гаплотипа были оценены относительные риски и частоты. Результаты приведены в табл. 9. Очевидно, что во всех идентифицированных гаплотипах, несущих аллель А гк4848543, оценка относительного риска составляла более 1 и, в большинстве случаев, оценка относительного риска ЕЕ значительно превышала 1. Наоборот, ни один гаплотип, несущий аллель С гк4848543, не имел оценки относительного риска ЕЕ выше 1, и все значимые оценки были менее 1 (т.е. они являлись протективными). Таким образом, разделить риск и гаплотипы, несущие аллель А

- 58 019953 гк4848543, оказалось невозможно. Это позволяет предположить, что патогенным вариантом (т.е. вариантом, который механистически обусловливает риск) является аллель А гк4848543 или вариант, находящийся в сильном неравновесии по сцеплению с аллелем А гк4848543. Наличие патогенного варианта в составе множества гаплотипов позволяет предположить, что его частота может приблизительно равняться частоте аллеля А гк4848543 (т.е. значение г² для аллеля А гк4848543 и патогенного варианта является высоким. Данное наблюдение свидетельствует в пользу точки зрения, что аллель А гк4848543 не указывает на существование редкого варианта с высокой пенетрантностью в составе блока НС гк4848543, а скорее маркирует достаточно распространенный модификатор факторов с высокой пенетрантностью, таких как ВКСА2 и ВКСАх, которому было дано определение выше.

Многочисленные маркеры могут быть ассоциированы с риском рака молочной железы при их корреляции с аллелем А гк4848543.

Ссылки на данные проекта НарМар (20 выпуск) позволили обнаружить в выборке белой европейской популяции СЕЙ ряд известных ОНП, сцепленных с гк4848543 со значениями г² выше 0,2. Поскольку эти ОНП имеют достоверную корреляцию с гк4848543, их можно использовать для определения риска рака молочной железы наряду с самим гк4848543. Данные ОНП приведены в табл. 10.

Ген 8ТЕАР3/Т8АР6 является предполагаемым геном, обусловливающим риск рака молочной железы.

На настоящий момент известно три гена в регионе блока НС гк4848543.

Это:

1) ген 2 подобного суб-компоненту 1с.| компонента комплемента (от англ. Сотр1етеп! Сотропеп! 1с.| 8иЬсотропеп!-11ке 2 депе, или СЩП), (ИМ_182528)

2) ген 6-трансмембранного эпителиального антигена простаты 3 (8ТЕАР3), известный также под названиями гена пути активации опухолевых супрессоров 6 (Т8АР6), рНубе и Пиби1т-2. Известно три основных альтернативных транскрипта данного гена, обозначаемых в КеГ8ес.| под номерами ИМ_018234 (изоформа Ь), ИМ_182915 (изоформа а) и ИМ_001008410 (также обозначаемый АР262322). Был описан четвертый транскрипт этого гена, получивший идентификатор АК024163.

3) транскрипт АК127773, перекрывающийся с геном 8ТЕАР3 и транскрибируемый с противоположной цепи (левее). Этот ген был обозначен как Гипотетический белок РЫ45874.

Блок НС гк4848543 содержит регион с относительно высокой частотой рекомбинации, дистальный конец которого располагается вблизи нуклеотида 120034174. Большинство ОНП и 2-точечные гаплотипы Эа1у, обусловливающие допустимо значимый уровень риска рака молочной железы, расположены дистально (правее) от этого участка рекомбинации. Это позволяет предположить, что варианты в составе ί.ΊΟΙ2 и вблизи него не могут быть источником ассоциативного сигнала. Варианты, в значительной мере ассоциированные с риском, расположены в положении 5' по отношению к гену 8ТЕАР3/Т8АР6 и в его составе. Действительно, два из ОНП, имеющих допустимый уровень значимости, гк838100 и гк3731603, расположены в составе транскрибируемых последовательностей гена, а другие два, гк838102 и гк12711924, расположены в составе интронов 8ТЕАР3/Т8АР6. Последний из этих двух ОНП расположен вблизи 3' сайта сплайсинга гена Ιν84. С учетом данных наблюдений и сведений о биологии гена 8ТЕАР3/Т8АР6 (см. ниже), геном, с наибольшей вероятностью задействованным в наблюдающемся повышении риска рака молочной железы, является 8ТЕАР3/Т8АР6.

Раздел 2: гк13387042 на хромосоме 2с.|35

Аллель А гк13387042 ассоциирован с повышенным риском рака молочной железы в Исландии:

Общегеномный ассоциативный анализ показал, что аллель А гк13387042 ассоциирован с фенотипом Апу ВС (табл. 11). Этот ОНП расположен на хромосоме 2с.|35, на определенном расстоянии от локуса 8ТЕАР3/Т8АР6. Данные по этому ОНП были получены с помощью чипов Шитша у 1598 пациентов и 4475 контролей, не имеющих рака. Оценки относительного риска КК для А-гк13387042 составили 1,19, а значение Р после коррекции на наличие родства между индивидами в группе случаев и контролей составило 4,0х10^-5. В группе рака молочной железы УмерПред относительный риск КК был аналогичным, а значение Р составило 4,4х10^-3.

Сами по себе данные результаты не достигали уровня значимости, который бы считался достоверным на уровне генома после применения поправки Бонферрони, с учетом 317 089 протестированных ОНП. Поэтому была предпринята попытка подтвердить результаты на независимой выборке из исландской популяции, как это было сделано для аллеля А гк4848543. Для исследования ОНП гк13387042 был разработан и апробирован анализ ОНП на платформе Сеп!аигик, обозначенный 80028728. Анализ 8О028728 был проведен дополнительно у 583 пациентов и независимой контрольной группе, состоявшей из 7966 индивидов, типированных по аллелю А гк13387042 либо с помощью чипов Шитта, либо с помощью методики Сеп!аигик. В контрольную группу вошли 7966 индивидов с диагностированным раком простаты или колоректальным раком, но не индивиды с диагностированным раком молочной железы. Такой выбор был основан на предварительном наблюдении, свидетельствовавшем, что аллель А гк13387042 не обусловливал сколько-нибудь измеримого риска в отношении этих форм рака (данные не приводятся). Оценки относительного риска КК для аллеля Агк13387042, ассоциированного с фенотипом

- 59 019953

АпуВС в этой второй группе составили 1,20 (значение Р_корр = 3,8х10^-3). Таким образом, исходные результаты были достоверно воспроизведены на независимой исландской выборке, с очень близкими точечными оценками КК. Результаты совместного анализа, при котором 1598 исходных и 583 дублирующих образцов объединили и сравнили с 12441 контролями, приведены в табл. 11. Совместный анализ показал значимую оценку относительного риска, составившую 1,20 (значение Р_корр = 2,0х10^-7), что близко к уровню значимости после коррекции Бонферрони на 317 089 протестированных ОНП. Наблюдавшаяся частота и относительный риск для вариантного аллеля А Г813387042 соответствует оцененному популяционному атрибутивному риску в исландской популяции, равному 15,6%.

Поскольку документацию в 1СК начали вести с 1955 г, некоторые из пациентов, вошедших в исследование, имели большую продолжительность выживания после обнаружения рака. Если пациенты с носительством вариантного аллеля А Г813387042 имели бы иную вероятность длительного выживания, чем лица, не несущие его, то частота варианта среди распространенных случаев могла бы различаться. Для изучения этой возможности была выделена подгруппа пациентов, состоявшая из 837 индивидов, которым диагноз был поставлен после 1 января 2000 г, и у которых время от постановки диагноза до включения в исследование составило менее 5 лет. В этой когорте пациентов, которым диагноз был поставлен недавно, частота аллеля А Г813387042 составила 0,498. Также была выделена группа из 1344 пациентов, которым диагноз был поставлен после 1 января 2000 г и которые дожили до включения в исследование. Частота аллеля А Г813387042 в этой группе составила 0,492, что достоверно не отличалось от частоты среди недавно диагностированных пациентов (значение Р = 0,71). Таким образом, нет очевидных доказательств того, что различная выживаемость отражается на оценках риска, приведенных в табл. 11.

Аллель АГ813387042 ассоциирован с повышенным риском рака молочной железы в испанской выборке случай/контроль.

Для дальнейшего изучения роли аллеля А Г813387042 при раке молочной железы была исследована независимая серия образцов, полученных в Испании у случаев с раком молочной железы и контролей. Испанская исследуемая популяция состояла из 446 случаев с раком молочной железы, рекрутированных в онкологическом отделении больницы Сарагоса в г. Сарагоса, Испания. Группа сравнения состояла из 977 индивидов, обратившихся в больницу университета Сарагоса, Испания, у которых было подтверждено отсутствие рака молочной железы до включения их в исследование. Все субъекты подписали информированное согласие.

Испанские случаи и контроли были генотипированы по Г813387042 при помощи анализа 8С028728 на платформе Сеи!аиги8. Результаты представлены в табл. 11. Для аллеля А Г813387042 в данной популяции была обнаружена достоверная ассоциация с риском рака молочной железы, с точечной оценкой относительного риска КК, равной 1,21 (значение Р составило 1,8х10^-2). Частота вариантного аллеля А Г813387042 в испанских контрольных образцах была выше, что позволяло предположить, что вариант может иметь большую распространенность и, таким образом, обусловливать больший генетический груз в отношении рака молочной железы в популяциях испанского происхождения.

Аллель А Г813387042 ассоциирован с повышенным риском рака молочной железы в шведской выборке случай/контроль:

Для дальнейшего подтверждения роли вариантного аллеля А Г813387042 в отношении риска рака молочной железы, ОНП был типирован в двух шведских когортах: шведская семейственная когорта включала 346 пациентов с раком молочной железы, обратившихся в онкогенетическое консультационное отделение института Каролинска в Стокгольме, для исследования семейного анамнеза рака молочной железы. Каждый пациент относился к отдельной семье. Шведская консекутивная когорта включала 482 последовательно рекрутированных пациентов с раком молочной железы, посещавших клинику для пациентов с раком молочной железы с институте Каролинска. При отборе этой второй когорты семейный анамнез не принимался во внимание. Контролями были 1300 доноров крови в районе Стокгольма и 434 не имеющих рака супруга пациентов с колоректальным раком. Среди контролей не отмечалось достоверной разницы между полами по частоте А-Г813387042, так же как и достоверной разницы между группами доноров крови и не имеющих рака контролей.

Как показано в табл. 11, в шведской семейственной был отмечен значимый относительный риск рака молочной железы, равный 1,31 (значение Р= 2,0х10^-4). В шведской консекутивной когорте оценка относительного риска, равная 1,11, не была значимой, возможно по причине того, что в этой группе могло иметь место носительство генов с высокой пенетрантностью, маскирующих эффект А-Г813387042. В сумме, в объединенной шведской когорте была получена значимая оценка относительного риска, составившая 1,22 (значение Р= 8,1х10^-4).

Оценки, полученные на исландской, испанской и шведской когортах, были объединены в ходе совместного анализа по методу Мантеля-Хензеля. В результате оцениваемый относительный риск составил 1,20 при значении Р, равном 3,8х10^-11. Это существенно ниже порогового уровня общегеномной значимости после применения метода Бонферрони для коррекции на 317 089 исследованных ОНП. Таким образом, было сделано заключение, что А-Г813387042 обусловливает значимый и воспроизводимый риск рака молочной железы в нескольких популяционных выборках европейского происхождения. Совокуп

- 60 019953 ный популяционный атрибутивный риск по оценкам составил 16,4%.

Риск, ассоциированный с аллелем А гз13387042, прослеживается в составе нескольких гаплотипов.

ОНП Г513387042 находится в составе блока неравновесия по сцеплению (НС), который ограничивается координатами, приведенными в табл. 12, в соответствии с NСΒI Вш1б 34. Блок НС был определен как участок, расположенный между горячими точками рекомбинации, в соответствии с определением Группы Математической Генетики университета Оксфорда с применением теста отношения правдоподобия, описанного в [МсУеап ек а1., (2004), 8с1епсе, 304, 581-4; \Утск1ег ек а1., (2005), 8с1епсе, 308, 10711]. Для выяснения, маркирует ли аллель А гз13387042 относительно редкий высокопенетрантный вариант или более распространенный низкопенетрантный вариант, были исследованы различные составы гаплотипов, в составе которых появляется аллель А гз13387042. Для идентификации гаплотипов в составе блока НС с применением ОНП и образцов, типированных с помощью чипов Шитта, применяли программу NЕМО. Лишние ОНП, которые не были необходимыми для идентификации гаплотипов, были исключены, а затем для каждого полученного гаплотипа были оценены относительные риски и частоты. Результаты приведены в табл. 13. Очевидно, что несколько идентифицированных гаплотипов, несущих аллель А гз! 3387042, обусловливают относительный риск, по оценкам составляющий более 1, и в нескольких случаях оценка относительного риска ВВ значительно превышала 1. Напротив, только для одного редкого гаплотипа, несущего аллель С гз13387042, оценка относительного риска ВВ превышала 1, а две допустимо значимых оценки относительного риска ВВ для гаплотипов, содержащих аллель С гз13387042, составили менее 1 (т.е. они являлись протективными). Для двух гаплотипов, несущих аллель А гз13387042, не были получены оценки относительного риска ВВ, превышающие 1, и одна из этих оценок была допустимо значимой. Вместе данные наблюдения позволяют предположить, что патогенный вариант (т.е. вариант, который механистически обусловливает риск) находится в сильном НС с аллелем А гз13387042, но может не являться самим аллелем А гз13387042.

Несколько ОНП в блоке НС гз13387042 ассоциированы с риском рака молочной железы.

Данные, полученные с помощью чипа Шитта Нар300 позволили обнаружить несколько ОНП, находящихся в том же блоке неравновесия по сцеплению, что и гз13387042. В табл. 14 приведен список всех ОНП в блоке НС, представленных в составе чипа Шит1па Нар300, и показатели ассоциации, полученные для них в ходе анализа по одной точке и анализа по двум точкам гаплотипа Оа1у. Можно заметить, что для 21 ОНП или гаплотипов Оа1у были зарегистрированы допустимо значимые значения Р после коррекции на наличие родства среди субъектов.

Многочисленные маркеры могут быть ассоциированы с риском рака молочной железы при их сцеплении с аллелем А гз13387042:

Ссылки на данные проекта НарМар (20 выпуск) позволили обнаружить в выборке белой европейской популяции СЕЙ ряд известных ОНП, сцепленных с гз13387042 со значениями г² выше 0,2. Поскольку эти ОНП имеют значимое сцепление с гз13387042, их можно использовать для определения риска рака молочной железы наряду с самим гз13387042. Данные ОНП приведены в табл. 15.

Раздел 3: гз3803662 на хромосоме 16η12

ТЬе Т аллель оГ гз3803662 15 аззоаакеб \\Ш1 пзк Гог Вгеазк Сапсег: При последующем общегеномном анализе ОНП с применением данных, полученных на 1600 пациентах с раком молочной железы и 11563 контролях, было установлено, что аллель Т ОНП гз3803662 обусловливает 1,23-кратное повышение оцениваемого риска рака молочной железы для фенотипа Апу ВС (табл. 16). Данный результат был подтвержден на второй независимой когорте 594 исландских пациентов с раком молочной железы и 1433 контролей. Объединенные данные по этим двум исландским выборкам позволили получить оценку относительного риска, равную 1,23 и значение Р 2,8х10^-7 после коррекции на наличие родства между индивидами. Это соответствовало оцениваемому популяционному атрибутивному риску, равному 10,1% (табл. 16).

Ассоциация аллеля Т гз3803662 с риском рака молочной железы воспроизводится на независимых шведской, испанской и голландской когорте с раком молочной железы: контроли.

Для подтверждения ассоциации аллеля Т гз3803662 с риском рака молочной железы была предпринята попытка воспроизвести результаты на трех независимых когортах из других стран. Были генотипированы индивиды из шведской и испанской когорт, описанных выше. Кроме того, были генотипированы 558 случаев с раком молочной железы и 1384 контролей из г. Неймеген, Голландия. Данная когорта была отобрана из популяционного ракового реестра, содержащего информацию о пациентах из восточной части Голландии с раком молочной железы, диагностированным в 2005-2006 гг. Всем пациентам, у которых за это период рак молочной железы был диагностирован в возрасте ранее 70 лет, было предложено принять участие в исследовании. Контрольная группа была набрана в ходе опроса, проведенного в 2002-2003 гг. (Неймегенское Биомедицинское Исследование), на основании случайной выборки из списков населения. Как показано в табл. 16, достоверно повышенный риск, обусловливаемый аллелем Т гз3803662, наблюдался во всех трех дублирующих когортах. При совместном анализе этих трех дублирующих неисландских когорт совокупная оценка относительного риска составила 1,35, а значение Р составило 5,1 х 10¹² При совместном анализе исландской и дублирующих когорт была получена суммарная оценка отно

- 61 019953 сительного риска, равная 1,28, и значение Р, равное 2,7х10^-17. Эти показатели существенно ниже порогового уровня для достоверности на общегеномном уровне после коррекции на количество протестированных ОНП. Соответствующая оценка совокупного популяционного атрибутивного риска составила 13,4% (табл. 16).

Определение блока НС, содержащего гк3803662 и идентификация возможных кандидатных генов

ОНП гк3803662 находится в составе блока неравновесия по сцеплению (НС), который ограничивается координатами, приведенными в табл. 17, в соответствии с NСВI Вш1б 34. Блок НС был определен как участок, располагающийся между горячими точками рекомбинации, в соответствии с определением Группы Математической Генетики университета Оксфорда с применением теста отношения правдоподобия, описанного в [МсУеаи, е! а1., (2004), 8с1епсе, 304, 581-4; \Утск1ег е! а1., (2005), 8с1епсе, 308, 10711]. гк3803662 представлен в составе транскрипта гипотетического белка, обозначенного Ь0С643714. Этот гипотетический белок, таким образом, заключает в себе возможный ген предрасположенности к раку. В блок также входит 5' конец известного гена ТNКС9. ТNКС9 является членом семейства ассоциированных с хроматином белков с высокой подвижностью (от англ. сНгошаНп аккоаа!еб Ιιίβΐι шоЬййу дгоир, или НМС), группы белков, в которую входят факторы транскрипции и агенты, вызывающие ремоделирование хроматина. При раке молочной железы с метастазами наблюдалась пониженная экспрессия белка ТNКС9 по сравнению с первичными опухолями молочной железы (01епйгоге11/, С. 2006, ВасНе1ог оГ 8с1епсе ВютГогшаНск ТНек1к, Сйагйе-ип1уегк11а!кшеб171п, ВегНп). Выявление варианта ОНП вблизи 5' конца этого гена позволяет предположить, что вариант может находиться в неравновесии по сцеплению с генетическими факторами, изменяющими экспрессию или функцию белка ТМЕС9, что приводит к повышению риска рака молочной железы.

Несколько ОНП в блоке НС гк3803662 ассоциированы с риском рака молочной железы.

Данные, полученные с помощью чипа 111иш1па Нар300 позволили обнаружить несколько ОНП, находящихся в том же блоке неравновесия по сцеплению, что и гк3803662. В табл. 18 приведен список всех ОНП в блоке НС, представленных в составе чипа Ι11ιιιηίπ;·ι Нар300, и показатели ассоциации, полученные для них в ходе анализа по одной точке и анализа по двум точкам гаплотипа Эа1у. Можно заметить, что для 80 ОНП или гаплотипов Эа1у были зарегистрированы допустимо значимые значения Р.

Многочисленные маркеры могут быть ассоциированы с риском рака молочной железы при их корреляции с аллелем Т гк3803662:

Ссылки на данные проекта НарМар (20 выпуск) позволили обнаружить в выборке белой европейской популяции СЕЙ ряд известных ОНП, сцепленных с гк3803662 со значениями г² выше 0,2. Поскольку эти ОНП имеют значимое сцепление с гк3803662, их можно использовать для определения риска рака молочной железы наряду с самим гк3803662. Данные ОНП приведены в табл. 19.

Аллель Т гк3803662 и/или связанные с ним ОНП обусловливают риск рака молочной железы в нескольких различных этнических группах.

Для исследования универсальности характера данных, полученных для аллеля Т гк3803662, у пациентов с различным этническим происхождением было исследовано наличие ассоциации ОНП в выборке пациентов с раком молочной железы и контролей из мультиэтнического когортного исследования (от англ. МиШеШтс СоНоП к!ибу, или МЕС). В МЕС вошли более 215 000 мужчин и женщин из Гавайских островов и Лос Анжелеса (а также американцы африканского происхождения из других регионов Калифорнии), подробное описание представлено в [Ко1опе1 е! а1., (2000), Аш 1 Ер|йе1пю1, 151, 346-57]. Когорта состоит преимущественно из американцев африканского происхождения, коренных жителей Гавайских островов, американцев японского происхождения, латиноамериканцев и американцев европейского происхождения, которые были включены в исследование между 1993 и 1996 гг. после заполнения 26страничного опросника, в котором требовалось указать подробные сведения о характере питания, демографических факторах, личном поведении, предшествующих заболеваниях в анамнезе, семейном анамнезе распространенных форм рака, и для женщин - о репродуктивной истории и применении экзогенных гормонов. При включении в исследование участники имели возраст от 45 до 75 лет. Случаи рака в МЕС идентифицировали путем привязки когорты к популяционным раковым реестрам по выживаемости, эпидемиологии и конечным результатам (от англ. 8итуеШапсе, ЕрИешю1о§у, и Епб Кеки1!к, или 8ЕЕК), охватывающим Гавайи и Лос Анжелес, а также Реестру по Раку Штата Калифорния, охватывающему всю Калифорнию. Начиная с 1994 образцы крови брали у пациентов с раком молочной железы и у случайной выборки участников МЕС, служивших контрольным пулом для генетического анализа в когорте. Подходящие случаи в гнездовом исследовании случай-контроль были представлены женщинами с инвазивным раком, диагностированным после включения в МЕС и до 31 декабря 2002. Контроли были участниками, не имеющими рака молочной железы, соответственно, до включения в когорту и без диагностированного рака молочной железы на 31 декабря 2002. Контроли имели сопоставимую частоту со случаями по расовой/этнической принадлежности и возрасту (в интервалах 5 лет). Исследование было согласовано с Институтскими Наблюдательными Комитетами университета Южной Калифорнии и Университета штата Гавайи.

Была предпринята попытка исследовать риск, ассоциированный с гк3803662 у американцев европейского происхождения, латиноамериканцев и американцев африканского происхождения из МЕС. По

- 62 019953 скольку корреляция между ОНП гк13387042 и другими ОНП могла различаться в различных этнических группах, для исследования на этой выборке был выбран ряд ОНП. ОНП, их значения г² и Ό', полученные по данным проекта НарМар (20 выпуск) для американцев европейского происхождения и Йоруба (африканцев) приведены в табл. 23. Для этих ОНП были разработаны анализы на платформе Сеп!аигик и для образцов из МЕС было проведено генотипирование. Для удобства сравнения результатов по ОНП был использован тест обобщенного отношения правдоподобия, учитывающий отсутствующие генотипы при анализе гаплотипов. Это позволило уравновесить количество случаев и контролей по различным ОНП, и позволило легче проводить сравнение между ними. Результаты приведены в табл. 24. Прежде всего, очевидно, что риск, обусловленный аллелем Т гк3803662, достоверно воспроизводится у американцев европейского происхождения. Два из взаимосвязанных ОНП, аллель Т гк4784227 и аллель С гк17271951, имеют более высокий относительный риск при допустимом уровне значимости и более низкие значения Р, чем аллель Т гк3803662 у американцев европейского происхождения. Этот пример свидетельствует в пользу концепции, согласно которой взаимосвязанные с исходно выявленным ОНП, могут обусловливать более высокий относительный риск и таким образом служить лучшими маркерами заболевания.

Сигнал, обусловленный аллелем Т гк3803662, также с достоверностью воспроизводится среди латиноамериканцев. У американцев африканского происхождения результаты по аллелю Т маркера гк3803662 с достоверностью не воспроизводились, в действительности, аллель Т оказался достоверно протективным в выборке американцев африканского происхождения. Это позволяет предположить, что взаимоотношения между аллелем Т гк3803662 и предполагаемой патогенной мутацией значительно отличаются у американцев африканского происхождения. Было отмечено, что три взаимосвязанных аллеля ОНП; аллель Т гк12922061, аллель Т гк4784227 и аллель С гк17271951 имеют сильную корреляцию с аллелем Т гк3803662 у европейцев, однако данная корреляция не прослеживается у африканцев Йоруба (табл. 24). Однако, в отличие от аллеля Т гк3803662, все аллели взаимосвязанных ОНП, аллель Т гк12922061, аллель Т гк4784227 и аллель С гк17271951, имеют повышенный относительный риск рака молочной железы при допустимом уровне значимости, и два из них достигают статистической достоверности на с 1сторонними значениями Р (табл. 24). Это показывает, что при использовании групп, взаимосвязанных ОНП, можно получить маркеры риска, которые можно применять в различных этнических группах.

Аллель А гк13387042 и аллель Т гк3803662 обусловливают повышенный риск при раке молочной железы, позитивный по эстрогеновым рецепторам.

При наличии документации по пациентам, включенным в исследование, проводили ее анализ. На объединных группах образцов была исследована ассоциация между аллелем А гк13387042 и аллелем Т гк3803662, возрастом при постановке диагноза, статусом по эстрогеновым рецепторам (ЭР) и прогестероновым рецепторам (ПР). Ни для одного из вариантов не была обнаружена ассоциация с возрастом при постановке диагноза. Достоверный риск рака молочной железы, обусловленный аллелем А гк 13387042 и аллелем Т гк3803662, наблюдался исключительно у пациентов с диагностированными ЭР-позитивными оухолями и разница между отношениями шансов при ЭР-позитивных и ЭР-негативных опухолях была достоверной (табл. 24). Аналогично, наблюдалась тенденция к выявлению риска рака молочной железы преимущественно у пациентов с диагностированными ПР-позитивными опухолями, однако разница между отношениями шансов у ПР-позитивных и ПР-негативных была недостоверна. Это позволяет предположить, что ЭР-позитивные и негативные опухоли могут иметь в некоторой степени различную генетическую этиологию.

Таблицы

Таблица 1. Ассоциация аллеля А ОНП 8О028738 (гк4848543) с риском рака молочной железы

	Р	р_корр*	Г	95%С1	#пораж	Част пораж	#конт	Част конт
«УмерПред» Шигтипа	6.70Е-09	8, ЗОЕ-08	1,42	(1,25,1,62)	653	0,423	4477	0,341
«УмерПред» Исландия дублир.	2,90Е-02	3.40Е-02	1,26	(1,02,1,55)	198	0,399	7406	0,346
«УмерПред» объед.	9,70Е-10	3.00Е-08	1,37	(1,23,1,53)	851	0,418	11883	0,344
«Все формы РМЖ» Митта	7.10Е-04	1.10Е-03	1,16	(1,06,1,26)	1598	0,374	4477	0,341
«Все формы РМЖ» Исландия дублир.	9.70Е-02	1.00Е-01	1,11	(0,98,1,26)	573	0,37	7406	0,346
«Все формы РМЖ» объед.	2.20Е-04	3.50Е-04	1,14	(1,06,1,22)	2171	0,373	11883	0,344
не-«УмерПред» в сравн с Конт	9.80Е-01		1		1320	0,344	11883	0,344

*после коррекции на наличие родства между индивидами

Таблица 2. Ассоциация ОНП 8О028738 (гк4848543) с возрастом при постановке диагноза и семейным анамнезом рака молочной железы

Сравнение	Значение Р (Вилкоксон)
Генотип Г54848543 и Возраст при постановке диагноза	0,5139
Генотип гз4848543 и Индекс семейного анамнеза	<0,001
Генотип отличный от ВНСА2 Г54848543 и Индекс семейного анамнеза	0,0044

- 63 019953

Таблица 3. Ассоциация ОНП 8С028738 (Γδ4848543) с риском рака молочной железы среди носителей ВΚСΑ2 999йе15

	Р—КОРР*	Р	г	95%С1	#пораж	Част пораж	#конт	Част пораж
Носители ВКСА2 в сравн с Контр	3.67Е-03	8,02Е- 04	1,65	(1.18,2,30)	94	0,463	9452	0,344
Без носительства ВЯСА2 в сравн с Контр	2.95Е-03	2,19Е- 03	1,13	(1.04,1,22)	1621	0,371	9452	0,344
Носители ВКСА2 в сравн с не имеющими носительства ВЯСА2	3.06Е-02	1.29Е- 02	1,46	(1,04,2,05)	94	0,463	1621	0,371
Без носительства «УмерПред» ВКСА2 в сравн с Контр	4,71 Е-06	5,92Е- 07	1,35	(1,19,1,55)	622	0,414	9452	0,344
Носители ВВСА2 в сравн с не имеющими носительства «УмерПред» ВКСА2	Не опр	2.08Е- 01	1,22	Не опр	94	0,463	622	0,414

*после коррекции на наличие родства между индивидами

Таблица 4. Корреляция между аллелем Α Γδ4848543 и генотипом ВΚСΑ2 999йе15

Корреляция генотип; (тест Пир
	Значение Р
Пациенты с раком молочной железы	1,4Е-02
контроли	8,0Е-01
Контроли мужчины	6,7Е-01

а ВКСА2 - 5ТЕАРЗ эсона)
Коэф коррел.	#индив
0,059	1715
-0,0033	5938
-0,0079	2925

Таблица 5. Ассоциация ОНП с риском первично-множественного рака молочной железы

#ПМ РМЖ	Част ПМ РМЖ	#оп омж	Част ОП ОМЖ	Р носит	КК носит	Аллель маркера	гз 8ΝΡ	Полож в 5βς Ю 4
128	0,258	1566	0,189	0,0111	1,615	4 5С023733	Г3895398	34898
160	0,409	2010	0,370	0,0433	1,419	1 56025738	Г34848543	37814
160	0,547	2019	0,488	0,0438	1,498	1 86025739	гз6759589	41694
163	0,414	2001	0,371	0,0389	1,427	4 5 6025753	гз895397	49118
162	0,645	2020	0,575	0,0072	1,928	3 5 6025740	Г3838102	56596
160	0,650	2014	0,575	0,0050	2,012	3 5 6025741	гз838100	60428
127	0,445	1565	0,380	0,0176	1,602	1 56025734	Г312711924	84034
159	0,387	2004	0,343	0,1741	1,258	4 8 6025742	Г83731603	93780

Таблица 6. Определение блока НС Γδ4848543 на Хромосоме 2

1ЧСВ1 ΒιιϊΙά Начало Окончание

119,987,002 120,129,001

119,608,327 119,750,326

Таблица 7. Ассоциация ОНП маркеров и 2-маркерных гаплотипов в блоке НС Γδ4848543 с риском рака молочной железы (фенотип все формы РМЖ):

Приведены следующие коды аллелей: 1=А, 2=С, 3=С, 4=Т.

- 64 019953

Значение р	кк	#пораж	Част пораж	#конт	Част конт	Част НО	Х2	инфо	аллель	Маркер	аллель	Маркер
0,0000825	1,1852	1557	0,377649	4626	0,33863	0,348455	15,5001	1	1	Г34848543
0,00015	0,8545	1558	0,498176	4627	0,537411	0,527529	14,3718	0,999171	2	гз895398	3	гз6759589
0,0001842	1,1677	1558	0,500642	4626	0,461954	0,471701	13,9859	1	1	гз6759589
0,0004919	1,2131	1558	0,18702	4627	0,159399	0,166396	12,1462	0,966913	2	Г34849765	4	га895398
0,0006022		1,1539	1558	0,560738	4627	0,525225	0,534172	11,7693	0,994181	2	Г54849760	3	гз838102
0,0006816		1,1529	1558	0,587612	4625	0,552757	0,56154	11,5388	1	3	Г5838102
0,0007483		1,1517	1556	0,587082	4622	0,552466	0,561185	11,3653	1	3	Г5838100
0,0007856		0,8681	1558	0,401958	4627	0,436379	0,427706	11,2749	0,995483	3	Г36759589	1	Г3838102
0,0009395		1,1929	1557	0,196853	4626	0,17045	0,177098	10,9433	1	4	гз895398
0,0009835		1,1959	1556	0,204802	4619	0,177192	0,184711	10,8584	0,936107	2	Г34849765	4	гз2084154
0,0019878		1,1829	1558	0,187099	4626	0,162884	0,168984	9,5608	1	4	гз935361
0,0039725		1,3609	1558	0,067214	4627	0,050286	0,054483	8,2963	0.668984	2	гз838086	1	Г312711924
0,0044063		1,1296	1558	0,387356	4627	0,358872	0,366047	8,1083	1	1	Г312711924
0,0053777		1,1574	1558	0,202503	4627	0,179922	0,18561	7,7478	1	2	Г37564432	2	гз11680207
0,0076689		1,1238	1558	0,349807	4627	0,323752	0,330315	7,1092	1	4	Г83731603
0,0092636		0,895	1558	0,58833	4626	0,614901	0,608199	6,7713	0,984119	2	гз6542504	2	га12711923
0,0119574		1,1118	1557	0,418433	4626	0,392888	0,399321	6,3172	1	4	Г31530561
0,0120093		1,1289	1558	0,253591	4627	0,231338	0,236949	6,3095	0,998425	1	гз745888	2	гз838087
0,0127242		1,1276	1558	0,253851	4625	0,231784	0,237344	6,2071	1	1	Г3745888
0,0140734		0,8975	1554	0,330746	4621	0,355095	0,348951	6,0289	0,987772	3	Г32084154	4	гз838066
0,0143097		0,8986	1558	0,337519	4627	0,361823	0,355701	5,9995	0,993263	3	гз6759589	4	гз838066
0,0158735		0,9024	1558	0,586151	4627	0,610816	0,60459	5,8168	0,983893	2	гз6542504	2	гз4849760
0,0166389		1,1057	1558	0,432285	4627	0,407824	0,413985	5,7341	1	3	Г3838069
0,0199778		' 1,1096	1558	0,332002	4626	0,309345	0,315063	5,4138	0,982361	4	Г36542504	2	Г312711923
0,02322		0,9	1558	0,716624	4627	0,737523	0,732257	5,152	0,999896	2	Г34849760	3	Γ3745888
0,0234152		0,9054	1558	0,339147	4627	0,361769	0,356092	5,1374	0,982618	2	Г3895398	4	15838066
0,0236887		1,1011	1555	0,397106	4610	0,374295	0,380049	5,1173	1	4	Г36542504
Значение р	кк	#пораж	Част пораж	#конт	Част конт	Част НО	Χ2	инфо	аллель	Маркер	аллель	Маркер
0,0346288	1,0972	1522	0,658673	4559	0,63753	0,642822	4,4634	1	2	гз838066
0,0376797	0,9131	1558	0,444559	4627	0,467115	0,461494	4,3194	0,903903	1	гз838086	1	гз838069
0,0612227	0,9009	1558	0,161601	4627	0,176246	0,172556	3,5039	0,98925	3	гз6759589	2	ге838066
0,0675678	1,0805	1558	0,403402	4627	0,384915	0,389572	3,3411	1	2	гз11680207
0,0742724	1,1028	1558	0,20821	4627	0,192542	0,196469	3,186	0,887553	3	гз1867750	2	гз11680207
0,1275005	1,0674	1511	0,527134	3962	0,510853	0,515348	2,3227	1	4	Г32084154
0,1817962	0,9326	1558	0,209889	4627	0,221696	0,218727	1,7829	0,931297	1	га10496555	3	Г3745888
0,2193745	1,056	1542	0,679313	4602	0,667319	0,670329	1,5085	1	2	Г34849765
0,2349078	1,0589	1548	0,251292	4614	0,240681	0,243346	1,4109	1	2	гз838086
0,2688289	0,9532	1558	0,456896	4627	0,468807	0,465537	1,2227	0,919405	3	гз7562894	3	Г32084154
0,2941036	0,9538	1558	0,331602	4627	0,342173	0,339281	1,1007	0,945087	4	Г32084154	2	га895398
0,455931	1,0331	1558	0,354244	4627	0,346821	0,34869	0,5559	0,98416	2	Г8330763	3	га725346
0,4591499	1,033	1558	0,358115	4627	0,350681	0,352554	0,548	0,971987	3	гз 1439945	3	Г3725346
0,4793247	1,0562	1557	0,079641	4622	0,075725	0,076711	0,5004	1	1	Г312711923
0,497656	1,03	1558	0,356544	4627	0,349799	0,351497	0,4599	0,989528	2	Г5330763	3	га10496556
0,5015258	0,9669	1558	0,216303	4627	0,222066	0,220614	0,4517	1	2	гз11680207	2	ГЗЭ35361
0,5315142	1,0273	1553	0,370573	4610	0,364317	0,365893	0,3915	1	3	Г3725346
0,5977098	1,0229	1557	0,376365	4619	0,371076	0,372409	0,2785	1	3	га10496556
0,6233236	1,0256	1558	0,799101	4627	0,795007	0,796039	0,2412	1	2	га7564432
0,7140552	1,0158	1558	0,33668	4627	0,333192	0,334071	0,1343	1,054416	3	га10496555	3	Г3725346
0,7338904	0,9756	1558	0,084777	4627	0,086711	0,086224	0,1156	1,040852	3	Г312711924	3	га838069
0,7373932	1,0483	1554	0,977479	4049	0,976416	0,976709	0,1124	1	2	Г3838087
0,7425392	1,0407	1558	0,970475	4627	0,96931	0,969604	0,1079	1	2	гз4849760
0,8144482	1,01	1558	0,341581	4627	0,339335	0,339901	0,0551	1,052093	3	га10496555	3	гз10496556
0,8352386	0,9855	1558	0,092358	4627	0,093587	0,093277	0,0433	1,03608	4	га330773	3	га745888
0,8666485	1,0069	1558	0,421023	4627	0,419347	0,419769	0,0282	1,049887	3	га10496555	1	гз725346
0,8876881	1,0095	1558	0,106083	4627	0,10519	0,105415	0,0199	1,01195	1	гз 1867750	2	га7564432
0,915614	1,0149	1557	0,977521	4626	0,977194	0,977276	0,0112	1	3	гз1545360
0,9646863	0,998	1558	0,700899	4627	0,701318	0,701213	0,002	1	3	гз1867750
0,9767802	0,9959	1558	0,021916	4627	0,022003	0,021981	0,0008	1,023095	1	гз1545360	1	гз10165398

Таблица 8. Ассоциация ОНП маркеров и гаплотипов из 2 маркеров в блоке НС гк4848543 ЬБ с риском рака молочной железы (фенотип умеренная предрасположенность к РМЖ):

Приведены следующие коды аллелей: 1=А, 2=С, 3=С, 4=Т.

Значение р	кк	#пораж	Част по раж	#конт	Част конт	Част НО	Х2	инфо	аллель	Маркер	аллель	Маркер
9.40Е-10	1,4567	632	0,427215	4626	0,33863	0,349277	37,4465	1	1	Г54848543
1.33Е-06	0,748	632	0,464983	4627	0,537453	0,528745	23,3794	0,999257	2	Г5895398	3	Г36759589
1.51Е-06	1,3348	632	0,534019	4626	0,461954	0,470616	23,1368	1	1	гз6759589
1.62Е-06	1,3411	632	0,428798	4627	0,358872	0,367275	22,9946	1	1	гз12711924
2.57Е-06	1,4384	632	0,214003	4627	0,159157	0,165836	22,1127	0,970516	2	Г34849765	4	Г3895398
4,01 Е-06	1,4104	632	0,224684	4626	0,17045	0,176968	21,2621	1	4	Г5895398
1.00Е-05	1,3099	632	0,61788	4622	0,552466	0,560335	19,5116	1	3	гз838100
0,0000125	1,3136	632	0,386076	4627	0,323752	0,331242	19,0859	1	4	гз3731603
1.398Е-05	1,3039	632	0,617089	4625	0,552757	0,560491	18,8713	1	3	Г5838102
0,0000142	0,7657	632	0,37216	4627	0,43636	0,428644	18,8419	0,995144	3	гз6759589	1	Г3838102
1.579Е-05	1,388	632	0,230115	4619	0,177183	0,184123	18,6401	0,943665	2	Г54849765	4	Г32084154
0,0000258	1,2911	632	0,588229	4627	0,525264	0,532825	17,7045	0,993478	2	гз4849760	3	гз838102
0,0004697	1,2366	631	0,444533	4626	0,392888	0,399087	12,2324	1	4	гз1530561
0,0007986	0,7553	632	0,139112	4627	0,176242	0,171752	11,2444	0,995218	3	Г36759589	2	Г3838066
0,0025521	1,2002	632	0,452532	4627	0,407824	0,413196	9,1029	1	3	Г3838069
0,0027736	1,2608	632	0,196994	4626	0,162884	0,166984	8,9507	1	4	ГЭ935361
0,0038501	1,5279	632	0,074928	4627	0,050342	0,053363	8,3532	0,690307	2	Г3838086	1	Г312711924
0,0086964	0,8452	631	0,317499	4621	0,355011	0,350481	6,8841	0,989658	3	Г32084154	4	13838066
0,0109182	1,1925	632	0,264011	4627	0,231241	0,235192	6,4786	0,998578	1	Г3745888	2	Г3838087
0,0116941	1,1903	632	0,264241	4625	0,231784	0,235686	6,3567	1	1	13745888
0,0125611	0,8469	632	0,704114	4627	0,737523	0,733507	6,2299	0,99995	2	Г34849760	3	Г3745888
0,0140093	0,8557	632	0,326665	4627	0,361823	0,357582	6,037	0,997006	3	Г36759589	4	Г3838066
0,0167713	1,1975	632	0,20807	4627	0,179922	0,183305	5,7202	1	2	Г37564432	2	гз11680207
0,0206458	0,8629	632	0,328408	4627	0,36172	0,357717	5,3565	0,986182	2	ГЭ895398	4	Г3838066
0,0250242	0,8675	632	0,431088	4627	0,466247	0,462051	5,0222	0,905031	1	Г3838086	1	Г3838069
0,0262532	0,772	632	0,068325	4627	0,086756	0,084542	4,9393	0,958473	3	гз12711924	3	гз838069
0,0331553	1,1454	621	0,668277	4559	0,63753	0,641216	4,5377	1	2	Г3838066

Значение р	кк	#пораж	Част пораж	#конт	Част конт	Част НО	Х2	инфо	аллель	Маркер	аллель	Маркер
0,0420433	0,8752	632	0,312809	4627	0,342145	0,33827	4,1335	0,956363	4	Г52084154	2	гз895398
0,0490954	1,1279	632	0,413766	4627	0,384915	0,388382	3,8721	1	2	гз11680207
0,0545878	1,1328	625	0,6944	4602	0,667319	0,670557	3,6946	1	2	Г34849765
0,0565963	1,1614	632	0,216878	4627	0,19254	0,195451	3,6344	0,887609	3	гз1867750	2	гз 11680207
0,1002333	1,1066	609	0,536125	3962	0,510853	0,51422	2,7018	1	4	Г32084154
0,1098139	1,4252	630	0,983333	4049	0,976414	0,977346	2,5569	1	2	Г3838087
0,2444521	0,9299	632	0,450621	4627	0,46866	0,466267	1,3547	0,930417	3	гз7562894	3	Г32084154
0,2972591	1,0681	632	0,36608	4627	0,350928	0,352761	1,0865	0,9763	3	ГЭ1439945	3	Г3725346
0,324048	0,9409	632	0,600571	4626	0,615101	0,613351	0,9725	0,985757	2	Г36542504	2	Г312711923
0,3389162	1,0619	632	0,363391	4627	0,349623	0,351284	0,9145	0,992987	2	Г8330763	3	гз 10496556
0,3390482	0,9427	632	0,596933	4627	0,611053	0,609353	0,914	0,984363	2	Г36542504	2	Г34849760
0,3489783	1,0609	632	0,360144	4627	0,346646	0,348274	0,8772	0,98708	2	ГЭ330763	3	гз725346
0,363347	1,0608	632	0,321891	4626	0,309141	0,310678	0,8263	0,984258	4	Г36542504	2	Г312711923
0,4496627	0,9444	632	0,212841	4627	0,222576	0,221424	0,5715	0,927154	1	гз10496555	3	Г3745888
0,457771	1,047	631	0,385103	4610	0,374295	0,375596	0,5513	1	4	Г36542504
0,4606554	0,9296	632	0,098529	4627	0,105201	0,104399	0,5443	1,01297	1	гз1867750	2	гз7564432
0,47764	1,0451	630	0,374603	4610	0,364317	0,365553	0,5042	1	3	Г3725346
0,4879223	1,1566	632	0,980221	4626	0,977194	0,977558	0,4811	1	3	гз 1545360
0,498098	1,045	632	0,343589	4627	0,333725	0,334913	0,459	0,948386	3	гз10496555	3	гз725346
0,5144968	1,0412	632	0,380538	4619	0,371076	0,372215	0,4249	1	3	гз10496556
0,5466543	1,0398	632	0,348742	4627	0,339941	0,341001	0,3633	0,950967	3	гз10496555	3	гз 10496556
0,5484699	0,8812	632	0,019407	4627	0,021965	0,021657	0,3601	1,017257	1	гз1545360	1	ГЗЮ165398
0,6700167	0,9696	632	0,216772	4627	0,222066	0,22143	0,1816	1	2	гз 11680207	2	Г3935361
0,7411272	0,9806	632	0,413979	4627	0,41875	0,418177	0,1091	1,048229	3	гз10496555	1	гз725346
0,7734425	0,971	632	0,090995	4627	0,093457	0,093161	0,0829	1,032733	4	Г5330773	3	Г3745888
0,8205628	1,0258	632	0,07753	4622	0,075725	0,075942	0,0514	1	1	Г312711923
0,8541421	0,9688	632	0,968355	4627	0,969313	0,969196	0,0338	1	2	Г34849760
0,9360615	0,9944	628	0,23965	4614	0,240681	0,240557	0,0064	1	2	15838086
0,9536622	0,9957	632	0,794304	4627	0,795007	0,794923	0,0034	1	2	гз7564432
0,9754573	1,002	632	0,70174	4627	0,701318	0,701369	0,0009	1	3	гз1867750

Таблица 9. Гаплотипы в правой части блока гз4848543: (Приведены следующие коды аллелей: 1=А, 2=С, 3=С, 4=Т)

- 66 019953

Значение Р	-	#пораж	Част пораж	#конт	X о δ то	инфо
2.65Е-02	1,23	653	0,131	4480	0,109	0,96	2 гз895398 1 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 1 ге838086 1 гз12711924 4 гз3731603
1.51Е-02	1,26	653	0,123	4480	0,100	0,94	4 Г5895398 1 га4848543 1 Г36759589 2 гз838066 3 гз838100 1 Г5838086 1 гз12711924 4 гз3731603
1.70Е-02	1,43	653	0,051	4480	0,036	0,90	4 Г3895398 1 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 2 гз838086 1 гз12711924 4 гз3731603
2.97Е-01	1,17	653	0,043	4480	0,037	0,99	2 гз895398 1 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 1 гз838086 1 гз12711924 3 гз3731603
1.19Е-02	1,55	653	0,039	4480	0,026	0,89	4 Г3895398 1 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 га838100 2 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
3.10Е-01	1,36	653	0,015	4480	0,011	0,76	2 гз895398 1 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 2 гз838086 1 гз12711924 4 гз3731603
2.08Е-02	0,85	653	0,244	4480	0,274	0,97	2 Г3895398 2 гз4848543 3 гз6759589 4 гз838066 1 гз838100 1 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
6.56Е-03	0,77	653	0,107	4480	0,134	0,96	2 гз895398 2 гз4848543 3 гз6759589 2 гз838066 1 гз838100 1 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
5.95Е-02	0,81	653	0,072	4480	0,088	0,96	2 Г3895398 2 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 2 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
3.91Е-01	0,88	653	0,043	4480	0,049	0,90	2 Г3895398 2 гз4848543 3 гз6759589 4 гз838066 3 гз838100 2 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
3.00Е-02	0,59	653	0,014	4480	0,024	0,83	2 Г3895398 2 гз4848543 3 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 2 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
8.84Е-01	1,03	653	0,022	4480	0,021	0,91	2 гз895398 2 Г54848543 1 ге6759589 2 ге838066 3 Г5838100 1 гз838086 1 гз12711924 4 Г83731603
8.33Е-01	1,05	653	0,022	4480	0,021	0,91	2 Г5895398 2 гз4848543 3 гз6759589 4 ге838066 3 гз838100 1 гз838086 1 гз12711924 4 гз3731603
7.42Е-01	1,09	653	0,015	4480	0,013	0,88	2 гз895398 2 гз4848543 1 гз6759589 2 гз838066 3 гз838100 1 гз838086 3 гз12711924 3 гз3731603
6.26Е-01	0,86	653	0,010	4480	0,012	0,91	2 Г3895398 2 гз4848543 3 гз6759589 2 гз838066 1 гз838100 1 гз838086 1 гз12711924 4 гз3731603

Таблица 10. ОНП маркеры НарМар, сцепленные с г§4848543 с показателем г² выше 0,2

ОНП суррогат	Реф ОНП	О'	к2	Значение Р	Положение в ВиНс! 34	Положение в ВшШ 36	Положение в 5Е<2 Ю 4
Г511680207	Г54848543	0,653174	0,309094	4,55Е-09	120023583	119644908	301
Г57583824	Г54848543	0,655931	0,322684	3,29Е-09	120027724	119649049	4442
Г54848541	Г54848543	0,656671	0,243502	8,45Е-06	120032169	119653494	8887
Г51446128	Г54848543	0,628705	0,317935	8,08Е-09	120032378	119653703	9096
Г54849766	Г54848543	0,851071	0,31689	7Д6Е-09	120034354	119655679	11072
Г56715243	Г54848543	0,923886	0,362632	3,83Е-10	120034730	119656055	11448
Г54142753	Г54848543	0,934092	0,413776	2,96Е-12	120051961	119673286	28679
Г510188745	Г54848543	0,934092	0,413776	2,96Е-12	120057058	119678383	33776
Г5895398	Г54848543	0,934092	0,413776	2,96Е-12	120058180	119679505	34898
Г54848543	Г54848543	1	1	0	120061096	119682421	37814
Г511684731	Г54848543	1	0,319149	2,08Е-12	120062319	119683644	39037
Г512464139	Г54848543	1	0,294118	1,69Е-11	120062996	119684321	39714
Г56754664	Г54848543.	1	0,963415	4.90Е-33	120063070	119684395	39788
Г56754799	Г54848543	1	0,673648	6,09Е-22	120063176	119684501	39894
Г56759589	Г54848543	1	0,534483	2,36Е-19	120064976	119686301	41694
Г51562256	Г54848543	0,951061	0,50597	1,ОЗЕ-15	120066318	119687643	43036
Г51446125	Г54848543	1	1	4,29Е-31	120066620	119687945	43338
Г51446124	Г54848543	1	0,963415	4,90Е-33	120066705	119688030	43423
Г511677262	Г54848543	1	0,30137	6,60Е-12	120067290	119688615	44008
Г57565771	Г54848543	1	0,307692	2,81Е-12	120070400	119691725	47118
Г37595954	Г54848543	1	0,289474	5Д9Е-12	120070666	119691991	47384
Г5838066	Г34848543	1	0,3	2,40Е-12	120071508	119692833	48226
Г5895397	Г54848543	1	1	4,32Е-35	120072400	119693725	49118

ОНП суррогат	Реф ОНП	Э*	К2	Значение Р	Положение в ΒιιϊΙά 34	Положение в ΒυίΙά 36	Положение в 5Е(} Ю 4
Г5838059	Г54848543	0,841262	0,353861	2,97Е-10	120075395	119696720	52113
Г5838102	Г54848543	1	0,321918	4,92Е-13	120079878	119701203	56596
гв3769659	Г54848543	0,849119	0,718225	2,57Е-20	120081128	119702453	57846
Г5865108	Г54848543	1	0,376923	4,62Е-14	120081529	119702854	58247
Г5708670	Г54848543	1	0,302817	4,27Е-12	120082382	119703707	59100
Г5708672	г$4848543	1	0,632075	3,65Е-22	120082499	119703824	59217
Г5708673	Г54848543	1	0,3125	1ДЗЕ-12	120082871	119704196	59589
Г5838100	ГЭ4848543	1	0,3	2,40Е-12	120083710	119705035	60428
Г5838098	Г54848543	1	0,3125	1,13Е-12	120084226	119705551	60944
Г5838096	Г54848543	1	0,310811	1,10Е-12	120084741	119706066	61459
Г5838092	Г54848543	1	0,321918	4,92Е-13	120091298	119712623	68016
Г5838090	Г34848543	0,780443	0,224773	5,57Е-06	120092304	119713629	69022
Г512467944	Г54848543	0,865803	0,535809	9,44Е-15	120094306	119715631	71024
Г510196144	Г54848543	0,84638	0,686857	4,46Е-19	120095312	119716637	72030
Г56728660	Г54848543	0,872481	0,70845	3,68Е-18	120095756	119717081	72474
Г510188946	Г54848543	0,74499	0,446479	2,07Е-12	120098925	119720250	75643
Г5895406	Г54848543	0,790753	0,304687	1,52Е-09	120104365	119725690	81083
Г5708675	Г54848543	0,707874	0,418005	1,81Е-11	120104502	119725827	81220
Г51867856	Г54848543	0,77707	0,512514	2,87Е-13	120104672	119725997	81390
Г53754847	Г54848543	0,717855	0,22469	4,70Е-07	120105720	119727045	82438
Г512711924	гз4848543	0,792931	0,561965	3,43Е-15	120107316	119728641	84034
Г51867749	Г34848543	0,75345	0,214069	6,37Е-07	120109057	119730382	85775
Г5838073	Г54848543	0,709981	0,247536	5,75Е-07	120109754	119731079	86472
Г53731603	Г54848543	0,784597	0,392356	2,49Е-10	120117062	119738387	93780

Таблица 11. Ассоциация аллеля А ОНП 8С028728 (г§13387042) с риском рака молочной железы

Значение р

Когорта

«УмерПред» Шип-ппа	4.4Е-03	2.1Е-03	1,20		652	0,496	4475	0,451
«УмерПред» Исландия дублир.	2,ЗЕ-ОЗ	1,8Е-03	1,37		200	0,528	7966	0,449
«УмерПред» Исландия объед.	8.5Е-05	1,5Е-05	1,24	(1,12,1,38)	852	0,504	12441	0,449
«любой РМЖ» 1Пит1па	4.0Е-05	2.1Е-05	1,19		1598	0,494	4475	0,451
«любой РМЖ» Исландия дублир.	3.8Е-03	3,ЗЕ-ОЗ	1,20		583	0,493	7966	0,449
«любой РМЖ» Исландия объед.	2.0Е-07	5.0Е-08	1,20	(1,12,1,28)	2181	0,494	12441	0,449
Испанская когорта		1,8Е-02	1,21	(1,03,1,42)	446	0,581	977	0,533
Шведская семейственная когорта		2.2Е-01	1,11		346	0,516	1734	0,490
Шведская консекутивная когорта		2.0Е-04	1,31		482	0,558	1734	0,490
Все шведские когорты		8.1Е-04	1,22	(1,09,1,37)	828	0,540	1734	0,490
Все когорты	3.8Е-11		1,20	(1,14,1,27)	3455	0,516	15152	0,460

*после коррекции на родство между индивидами

Таблица 12. Границы блока НС г§13387042 на хромосоме 2

ΝΟΒΙ ΒιιϊΙά Начало Окончание

218,062,001 218,141,002

217,567,902 217,646,679

Таблица 13. Разнообразие гаплотипов блока НС г§13387042 Приведены следующие коды аллелей: 1=А, 2=С, 3=С, 4=Т.

	част	част	Ό· во	г*	1Л «	N	СП	О м	«	σι	м	N 'Ο-	5 §
Р	г	#пораж	пораж	#конт	КОНТ	инфо
8,4Е-03	1,12	1599	0,283	11122	0,261	0,99	3	4	3	1	4	1	1	2	3	Ι	1	3
2,7Е-03	1,18	1599	0,144	11122	0,125	0,98	3	4	3	3	4	1	2	4	3	1	3	3
3,0Е-01	1,13	1599	0,031	11122	0,027	0,96	3	2	3	3	4	1	2	4	3	1	3	3
2,9Е-01	0,85	1599	0,014	11122	0,017	1,00	3	4	3	3	4	1	1	2	3	1	3	3
6,4Е-02	0,65	1599	0,006	11122	0,009	1,00	3	4	1	3	2	1	1	2	3	1	1	3
3,0Е-02	2,24	1599	0,005	11122	0,002	0,72	3	4	3	3	4	1	2	4	3	1	3	1
3,2Е-02	2,79	1599	0,004	11122	0,001	0,57	3	4	3	1	4	1	1	2	3	1	1	1
7,6Е-01	1,13	1599	0,003	11122	0,003	0,75	3	2	3	1	4	1	1	2	3	1	1	3
1,6Е-01	1,70	1599	0,003	11122	0,002	1,00	3	4	3	1	4	1	1	2	3	1	3	1
6,7Е-01	1,27	1599	0,001	11122	0,001	0,99	3	2	3	3	4	1	1	2	3	1	1	3
4,ЗЕ-02	0,91	1599	0,242	11122	0,258	0,99	3	2	3	3	2	3	1	2	3	3	1	3
8,1Е-02	0,91	1599	0,128	11122	0,139	0,99	3	4	3	3	4	1	1	4	1	3	3	1
1,4Е-01	0,88	1599	0,049	11122	0,055	0,98	1	4	3	3	4	1	1	4	1	3	3	1
Ι,ΙΕ-01	0,84	1599	0,031	11122	0,036	0,95	3	2	3	3	2	3	1	2	3	3	1	1
9,2Е-01	0,99	1599	0,016	11122	0,016	1,00	1	2	1	3	2	1	1	2	3	3	3	3
6,ЗЕ-01	0,93	1599	0,015	11122	0,016	0,96	3	4	3	3	4	1	1	4	1	3	3	3

	част	част	Ч· со	гч	л	гм	ф	О п	<	σι	м	(Ν ч-		о «о
Р	г	#пораж	пораж	#конт	КОНТ	инфо
6,ЗЕ-01	1,09	1599	0,012	11122	0,011	0,92	1	2	3	3	4	1	1	4	1	3	3	1
4,0Е-01	0,80	1599	0,005	11122	0,006	0,98	3	4	3	3	4	1	1	2	3	3	1	3
6,4Е-01	0,87	1599	0,004	11122	0,004	1,00	3	2	3	3	2	1	1	2	3	3	1	3
1,9Е-01	0,49	1599	0,001	11122	0,002	0,86	1	2	3	3	2	3	1	2	3	3	1	3
2,9Е-01	0,49	1599	0,001	11122	0,001	0,99	3	4	3	3	4	1	1	4	3	3	3	1

Таблица 14. Ассоциация ОНП маркеров и 2-маркерных гаплотипов в блоке НС гк13387042 с риском рака молочной железы (фенотип все формы РМЖ)

Приведены следующие коды аллелей: 1=А, 2=С, 3=С, 4=Т.

Р корр	г	#пораж	Част пораж	#конт	Част Конт	Аллель	Маркер	Аллель	Маркер
7.58Е-06	1,1913	1658	0,493969	11547	0,450377	1	ге13387042
8.59Е-04	1,1892	1660	0,178916	11556	0,154855	2	Г86735174
8.04Е-03	1,1216	1660	0,29247	11563	0,269307	1	гз6716542
1.17Е-02	1,1281	1660	0,796385	11561	0,776144	3	Г82372943
1.24Е-02	1,1214	1660	0,769879	11560	0,748962	3	гз13011060
1.54Е-02	1,1074	1659	0,6956	11560	0,673573	4	Г54491709
2.65Е-02	1,1007	1659	0,723026	11561	0,703399	1	гз12621130
1,ОЗЕ-01	1,0691	1660	0,655723	11563	0,640491	4	гз6435957
2.37Е-01	1,088	1659	0,920735	11560	0,91436	3	Г810191184
7.63Е-01	1,0122	1660	0,383133	11560	0,380277	4	Г36435959
7.74Е-01	1,0367	1660	0,975602	11555	0,974729	3	гз10171745
8.45Е-01	1,0078	1660	0,417169	11563	0,41529	3	гз10490444
9.54Е-06	0,8405	1660	0,489993	11563	0,533373	3	Г310171745	3	гз 13387042
4.24Е-03	0,8771	1659	0,22895	11562	0,25292	1	Г312621130	3	гз 13387042
6.79Е-03	1,1253	1660	0,288931	11563	0,265289	4	ГЭ6435957	1	Г36716542
7.96Е-03	1,1219	1660	0,29198	11563	0,268789	1	гз6716542	4	Г34491709
8.04Е-03	1,1216	1660	0,29247	11563	0,269307	1	Г36716542	2	гз6435959
8.04Е-03	1,1216	1660	0,29247	11563	0,269307	3	Г310171745	1	гз6716542
9.38Е-03	0,8938	1660	0,286833	11563	0,310333	2	Г34491709	1	гз10490444
1,03Е-02	1,118	1660	0,289694	11563	0,267286	1	гз6716542	1	гз 10490444
1.29Е-02	0,9003	1660	0,683133	11563	0,705426	3	Г310171745	3	Г36716542
1.80Е-02	0,8986	1660	0,304278	11563	0,327368	4	гз2705593	3	гз13387042

Р корр	Г	#пораж	Част пораж	#конт	Част Конт	Аллель	Маркер	Аллель	Маркер
2.92Е-02	1,0966	1660	0,315096	11562	0,295536	1	Г56735174	1	гз13387042
3.27Е-02	1,0947	1660	0,312348	11563	0,293242	4	Г54491709	2	гз6435959
3.40Е-02	0,9119	1660	0,275355	11563	0,294127	3	Г510191184	3	Г812621130
3.60Е-02	0,9128	1660	0,274287	11563	0,29282	4	Г82705593	3	Г812621130
6.69Е-02	1,0758	1660	0,405656	11563	0,388167	3	Г310171745	1	Г84674132
1.08Е-01	0,9339	1660	0,315371	11563	0,33033	3	Г310191184	2	Г86435957
1.27Е-01	1,0702	1660	0,293447	11563	0,279572	4	Г56435957	1	гз10490444
1.53Е-01	1,0653	1660	0,270411	11563	0,258112	4	гз2705593	4	гз6435957
3.74Е-01	1,0381	1660	0,335709	11563	0,327421	2	гз2705593	3	Г810191184
6.52Е-01	0,9825	1660	0,544171	11563	0,548548	1	гз12621130	1	Г86735174
6.88Е-01	0,984	1660	0,61747	11563	0,621271	1	Г86735174	3	гз2372943
7,59Е-01	0,958	1660	0,028119	11563	0,029317	1	гз10191184	2	Г86435957
8.45Е-01	0,9923	1660	0,582831	11563	0,58471	1	Г86735174	1	гз10490444
8;97Е-01	0,9947	1660	0,355026	11563	0,356245	2	гз2705593	3	гз10490444
9.07Е-01	0,9954	1660	0,403688	11563	0,404807	3	Г36716542	4	Г34491709
9,61 Е-01	1,0068	1660	0,026373	11563	0,026199	4	гз2705593	1	Г310191184

Таблица 15. ОНП маркеры НарМар, сцепленные с г§13387042 со значениями г² выше 0,2

ОНП суррогат	Реф ОНП	ϋ'	Я1	Р	Полож в ΒιιϊΙά 34	Полож в ΒιιϊΙά 36	Полож в 5Е<2 Ю 5
Г51882419	Г513387402	0,692153	0,331807	1,92Е- 09	218059508	217565211	301
Г52252488	Г513387402	1	0,258085	5,60Е- 11	218059992	217565695	785
Г52272525	Г513387402	0,849123	0,271771	1,07Е08	218061250	217566904	1994
Г54396687	Г513387402	1	0,268293	1,29Е- 10	218063010	217568713	3803
Г512614767	Г513387402	0,785371	0,245063	1,01Е- 07	218063508	217569211	4301
Г54571035	Г513387402	1	0,344501	1,ЭХЕ- 13	218064351	217570054	5144
Г510195963	Г513387402	1	0,324895	7,05Е- 13	218065238	217570941	6031
Г510207736	Г513387402	0,573221	0,236068	4,26Е07	218066096	217571799	6889
гз 12464018	Г513387402	0,847812	0,263762	1,ЗЗЕ- 08	218067143	217572846	7936
Г510932689	Г513387402	0,880377	0,389169	5,54Е- 12	218068532	217574235	9325
Г512613030	Г513387402	0,917661	0,281049	3,18Е09	218068906	217574609	9699
Г32888450	Г513387402	1	0,323308	4,19Е- 13	218069383	217575086	10176
Г54254482	Г513387402	1	0,304413	5,14Е- 12	218069959	217575662	10752
Г52372932	Г513387402	1	0,268293	2,98Е- 11	218069975	217575678	10768
Г34255939	Г513387402	1	0,300466	2,28Е- 12	218070431	217576134	11224
Г510192415	Г513387402	1	0,33518	1,75Е- 13	218073196	217578899	13989
Г57595393	Г513387402	1	0,319631	7,19Е- 13	218073796	217579499	14589
Г52372935	Г513387402	1	0,331897	4,68Е- 13	218076131	217581834	16924
Г56733648	Г513387402	1	0,318182	6,69Е- 13	218077438	217583141	18231
Г56435957	Г513387402	0,586033	0,244261	1,46Е07	218080751	217586454	21544
Г512614773	Г513387402	0,911373	0,292062	1,74Е- 08	218084485	217590188	25278
Г517833842	Г513387402	1	0,345455	5,50Е- 12	218087663	217593366	28456
Г510177578	Г513387402	1	0,331897	2,95Е- 13	218088201	217593904	28994
Г512623304	Г313387402	0,919746	0,300741	1,15Е- 09	218090342	217596045	31135
Г56716542	Г513387402	1	0,33518	1,75Е- 13	218093185	217598888	33978

- 70 019953

Г517777330	Г313387402	1	0,33518	1,75Е- 13	218094234	217599937	35027
Г510211546	ГЭ13387402	1	0,312977	1,07Е- 12	218094939	217600642	35732
Г52372937	Г313387402	0,818494	0,335949	6,72Е- 10	218095256	217600959	36049
Г54315498	Г513387402	1	0,345455	5,50Е- 12	218095412	217601115	36205
Г512998806	Г513387402	1	0,33395	1,54Е- 11	218096305	217602008	37098
Г312465515	Г313387402	1	0,347368	7,21Е- 14	218096945	217602648	37738
Г54491709	Г313387402	0,81627	0,334787	8,36Е- 10	218097298	217603001	38091
Г52372938	Г513387402	0,818494	0,335949	6,72Е- 10	218097651	217603354	38444
Г512621130	Г513387402	1	0,345455	5,ЗОЕ- 12	218098168	217603871	38961
Г513399995	Г313387402	1	0,321168	7,70Е- 13	218100083	217605786	40876
Г312052807	Г513387402	0,788298	0,255063	4,96Е08	218100783	217606486	41576
Г510199394	ГЭ13387402	1	0,347368	7,21Е- 14	218101273	217606976	42066
Г52372940	Г513387402	1	0,354179	2,00Е- 13	218101566	217607269	42359
Г54583440	Г513387402	0,818494	0,335949	6,72Е- 10	218101794	217607497	42587
Г52372941	ГЭ13387402	1	0,315673	1,25Е- 12	218101850	217607553	42643
Г56721811	ГЭ13387402	1	0,347368	7,21Е- 14	218102838	217608541	43631
Г512615418	Г513387402	1	0,345455	5,50Е- 12	218104345	217610048	45138
Г512621884	Г513387402	1	0,340033	2,71Е- 11	218104452	217610155	45245
Г52372943	Г513387402	1	0,345455	5,50Е- 12	218106318	217612021	47111
Г34522583	Г513387402	1	0,431818	1,56Е- 14	218106548	217612251	47341
Г32888451	Г513387402	1	0,33518	1,75Е- 13	218107055	217612758	47848
Г32270398	Г513387402	1	0,33395	1,84Е- 11	218107518	217613221	48311
Г313412666	Г513387402	1	1	5,65Е- 36	218108321	217614024	49114
Г513387402	Г313387402	1	1	0	218108374	217614077	49167
Г313426489	Г313387402	1	1	1,42Е- 35	218108788	217614491	49581
ГЭ6713249	Г313387402	1	0,345455	5,50Е- 12	218109630	217615333	50423
Г312620095	ГЭ13387402	1	0,863636	ЗД4Е- 29	218110056	217615759	50849
Г34621152	Г313387402	0,782931	0,262305	4,22Е09	218111527	217617230	52320
Г36721996	Г313387402	1	0,964912	4,45Е- 34	218112005	217617708	52798
Г312622764	Г513387402	1	0,345455	5,50Е- 12	218112403	217618106	53196

- 71 019953

Г56723013	Г513387402	1	0,331897	4,68Е- 13	218113452	217619155	54245
Г52372945	Г513387402	1	0,385965	4,45Е- 15	218116654	217622357	57447
Г512694403	Г513387402	0,934804	0,388184	4,75Е- 12	218117956	217623659	58749
Г512613955	Г513387402	1	0,863636	4,73Е- 29	218118594	217624297	59387
Г511894340	Г513387402	0,781203	0,257717	б,21Е- 09	218119709	217625412	60502
ГБ17778329	Г513387402	1	0,35514	5,16Е- 12	218122353	217628056	63146
Г34442975	Г513387402	1	0,964912	4,45Е- 34	218123311	217629014	64104
Г510932693	Г513387402	1	0,324895	7,05Е- 13	218123663	217629366	64456
Г517778427	Г313387402	1	0,345455	5,БОЕ- 12	218125555	217631258	66348
Г517835044	Г513387402	1	0,345455	5, БОЕ- 12	218125147	217631850	66940
Г57562029	Г513387402	1	0,33518	1,75Е- 13	218126803	217632506	67596
Г513000023	Г513387402	0,923607	0,31255	5,05Е- 10	218125936	217632639	67729
Г5735361	Г513387402	1	0,345455	5,БОЕ- 12	218127665	217633368	68458
Г313409592	Г513387402	1	0,210526	2,27Е- 09	218128870	217634573	69663
Г52287289	Г513387402	0,856459	0,284427	2,96Е- 09	218134039	217639742	74832
Г512329133	Г513387402	0,722969	0,239375	1,69Е07	218137658	217643361	78451
Г513022815	Г513387402	0,722969	0,239375	1,69Е07	218138666	217644369	79459
Г513011060	Г513387402	0,849849	0,279401	1,41Е08	218140719	217646422	81512
Г513011326	Г513387402	0,853195	0,289251	9,17Е- 09	218140952	217646655	81745
Г54674132	Г513387402	0,725082	0,249037	1,45Е- 07 .	218141061	217646764	81854

Таблица 16. Ассоциация ОНП 80168299 (гз3803662) алеля Т с риском молочной железы

Результаты исследования ассоциации аллеля Т ОНП гз3803662 на 16ς12. Исландия 1 представляет собой когорту, на которой были получены исходные результаты, а Исландия 2 представляет собой независимую дублирующую группу. Все значения Р являются двусторонними и скорректированы на наличие родства и другую возможную стратификацию популяции исландских случаев и контролей. Для объединенной когорты жителей других стран и для всех объединенных когорт значения ОК и Р подсчитаны с применением модели Мантеля-Хензеля, а приведенные частоты представляют собой простое (арифметическое) среднее значений частот в отдельных группах.

Г53803662(Т)	Частота
Когорта (Случаи/Контроли)	Случаи Контроли ОК (95% С1)	Р	РАК

Исландия 1

(1600/11563)	0,278	0,238	1,23	(1,13,1,34)	4,7Е-06
Исландия 2(594/1433)	0,274	0,227	1,28	(1,08,1,52)	4,9Е-03
Исландия объед
(2194/12996)	0,276	0,237	1,23	(1,14,1,33)	2,8Е-07 0,101

Швеция (819/1723)	0,333	0,250	1,50	(1,32,1,71)	8,ЗЕ-10	0,209
Испания (455/1002)	0,348	0,308	1,20	(1,02,1,42)	ЗДЕ-02	0,114
Голландия (558/1384)	0,306	0,255	1,29	(1,10,1,50)	1,4Е-03	0,131

Не-исландцы (1832/4109)	0,329	0,271	1,35	(1,24,1,47)	5,1Е-12	0,166
Все когорты
(4026/17105)	0,316	0,262	1,28	(1,21,1,36)	2,7Е-17	0,134

Таблица 17. Определение блока НС гз3803662 на хромосоме 16

1ЧСВ1 ΒιιίΙά Начало Окончание

52,291,041 52,436,127

51,069,957 51,215,026

- 72 019953

Таблица 18. Ассоциация ОНП маркеров и 2-маркерных гаплотипов в блоке НС гз3803662 с риском рака молочной железы (фенотип все формы РМЖ)

Приведены следующие коды аллелей: 1=А, 2=С, 3=С, 4=Т._______________

Р 2.46Е-06	Г 1,23	#пораж 1715	Част пораж 0,283	#конт 12971	Част КОНТ 0,242	инфо 1,00	О 00 £	Ν со N. СО ω	ю ю ю см о со О) 2	СО со Ю о см £ 1	о 00 N СО со N 2	СМ со со со о со со £	Г53104755	о со со 4	Г53112612
4.35Е-06	1,23	1715	0,267	12970	0,228	1,00				1			1
5,16Е-06	1,25	1715	0,234	12972	0,196	0,93		4				4
6.12Е-06	1,23	1715	0,274	12972	0,235	0,99						4		4
6,91 Е-06	1,22	1715	0,280	12971	0,241	0,99					2			4
7.39Е-06	1,23	1714	0,266	12967	0,228	0,98			4			4
8.18Е-06	1,23	1715	0,266	12970	0,228	0,99					2		1
8.36Е-06	1,23	1715	0,256	12973	0,218	0,95								4	4
9,1 ЗЕ-06	1,22	1713	0,273	12971	0,235	1,00				1		4
9.86Е-06	1,23	1713	0,244	12971	0,207	0,97						4			4
1.06Е-05	1,24	1715	0,240	12967	0,203	0,93	1					4
1.08Е-05	0,82	1712	0,725	12953	0,763	1,00						2
1.08Е-05	1,22	1712	0,275	12953	0,237	1,00						4
1.10Е-05	1,22	1715	0,266	12972	0,229	0,98						4	1
1,ЗОЕ-05	1,22	1712	0,271	12965	0,234	1,00					2	4
2.67Е-05	1,22	1715	0,254	12973	0,218	0,94							1		4
3,31 Е-05	1,21	1715	0,324	12971	0,284	0,87		4		1
6.62Е-05	1,20	1715	0,322	12971	0,283	0,86		4			2
							О со	О	ю ю	со со	О со	см со	ю 1П	О со	СМ
			Част		Част			со	см о	о СМ	со со	со о	5 О	3	см
Р	г	#пораж	пораж	#конт	КОНТ	инфо	ω	со	О) ω	ω		со 2	ω с»		со <0
1.04Е-04	1,18	1715	0,358	12970	0,321	0,98	1			1
1.05Е-04	1,20	1715	0,292	12973	0,255	0,86		4							4
2, ЗОЕ-04	1,17	1711	0,356	12952	0,321	0,98	1				2
5.78Е-04	0,87	1715	0,370	12972	0,404	0,94		2				2
1.24Е-03	1,15	1715	0,325	12973	0,295	0,94	1								4
1.39Е-03	1,14	1714	0,458	12972	0,426	0,96			4	1
1.89Е-03	1,14	1714	0,390	12971	0,360	0,95			4						4
1.99Е-03	1,13	1714	0,457	12962	0,426	0,96			4		2
2,01 Е-03	1,13	1714	0,588	12958	0,558	0,99	1		4
2.19Е-03	1,13	1715	0,585	12971	0,555	1,00	1	4
2.36Е-03	0,89	1715	0,415	12960	0,445	1,00		2
2.36Е-03	1,13	1715	0,585	12960	0,555	1,00		4
2.38Е-03	1,13	1715	0,585	12970	0,555	1,00		4	4
2.67Е-03	1,13	1715	0,545	12972	0,515	0,96			4					4
3,37Е-03	0,87	1715	0,272	12973	0,301	0,86		2							2
3.43Е-03	0,86	1715	0,238	12971	0,266	0,84		2			1
3.44Е-03	1,13	1715	0,496	12973	0,467	0,93		4						4
3.45Е-03	0,86	1715	0,239	12971	0,266	0,84		2		3
3.64Е-03	0,89	1713	0,541	12971	0,570	0,97						2			2
4,1 ЗЕ-ОЗ	1,12	1712	0,492	12956	0,463	1,00				1
4,1 ЗЕ-ОЗ	0,89	1712	0,508	12956	0,537	1,00				3
4,51 Е-03	0,89	1713	0,508	12970	0,536	1,00				3	1
4.58Е-03	0,89	1713	0,506	12971	0,534	1,00				3		2

- 73 019953

12973

12973

12972

12962

12970

12967

12973

12973

12972

12967

12965

12970

12970

12967

12967

12972

12970 #конт

12967

12970

12919

12919

- 74 019953

Таблица 19. ОНП маркеры НарМар, сцепленные с Г83803662 со .значениями г² выше 0,2

ОНП суррогат	Реф ОНП	ϋ'	К2	Значение Р	Полож в ΒιΓιΙά 34	Полож в ΒιιϊΙά 36	Полож в 5Е<2 Ю 6
Г54784220	Г53803662	0,675773	0,314847	8,65Е-09	52314403	51093311	301
Г312598982	Г53803662	0,939522	0,331013	2,84Е-11	52315478	51094386	1376
Г54784222	Г53803662	0,93875	0,331747	4,06Е-11	52316179	51095087	2077
Г517271951	Г53803662	0,959839	0,88572	9,27Е-27	52316633	51095541	2531
Г59933638	Г53803662	0,935921	0,321096	2,07Е-10	52318190	51097098	4088
Г59302556	Г53803662	0,936406	0,334336	1,07Е-10	52322238	51101146	8136
Г57190749	Г53803662	0,939522	0,331013	2,84Е-11	52322671	51101579	8569
Г512443621	Г53803662	0,939123	0,326882	4,01Е-11	52326630	51105538	12528
Г59933556	Г53803662	0,937324	0,325388	9,50Е-11	52326895	51105803	12793
Г51362546	Г53803662	0,935967	0,329172	9,67Е-11	52328528	51107436	14426
Г51075367	Г33803662	0,939522	0,331013	2,84Е-11	52333595	51112503	19493
Г58046979	Г53803662	0,932586	0,342705	3,56Е-10	52334335	51113243	20233
Г51420529	Г53803662	0,931004	0,310285	1,29Е-09	52337266	51116174	23164
Г511642645	Г53803662	0,936189	0,329297	5,09Е-11	52337500	51116408	23398
Г51420533	Г53803662	1	0,362637	3,83Е-14	52342219	51121127	28117
Г51362548	Г33803662	1	0,924812	8Д4Е-30	52342544	51121452	28442
Г52193094	Г33803662	1	0,362637	3,83Е-14	52345047	51123955	30945
Г54783780	Г33803662	1	0,362637	3,83Е-14	52350025	51128937	35927
Г53112581	Г53803662	1	0,358407	5,51Е-14	52350122	51129034	36024
Г53112580	гз3803662	1	0,370787	2,40Е-14	52350194	51129106	36096
Г59931232	Г53803662	1	0,362637	3,83Е-14	52351417	51130333	37323
Г51123428	Г33803662	1	0,366516	3,46Е-14	52356420	51135336	42326
Г53095604	Г53803662	1	1	9,56Е-34	52360562	51139480	46470
Г53803662	Г33803662	1	1	0	52364943	51143842	50832
Г54784227	Г53803662	1	0,812734	3,45Е-25	52377790	51156689	63679
Г512922061	Г53803662	0,813366	0,393164	1,28Е-08	52413602	51192501	99491

- 75 019953

Таблица 20. Перечень всех маркеров бЬ8№125в блоке неравновесия по сцеплению гз4848543 (приведены позиции в соответствии с NСВI Вш1б 34)

Название ΐθτϊζί Название

Вина 34

	119996150 119996950	Г510864979 Г513433007	120010592 120010654	Г53980308 Г51317848
		119996967	Г56748754	120010949	Г34643545
		119997458	Г528574898	120011133	Г56705476
		119998119	Г54848537	120011458	Г52121217
		119998463	Г513409086	120011699	Г55833777
		119998504	Г513411872	120011761	Г37600045
ΒυϊΙϋ 34	Название	119998551	Г513420759	120012134	Г57563952
119987193	Г511883887	119999028	Г511895163	120012410	Г54849761
119987218	Г57601379	119999114	Г57597287	120012531	Г51446130
119987236	Г510189928	120000098	Г513020121	120012783	Г51446129
119987488	Г517012230	120000215	Г59308770	120013821	Г54849762
119987701	Г517798163	120000292	Г513425098	120014233	Г36542508
119988214	Г56542503	120000559	Г5895404	120014416	Г511299793
119988417	Г57606204	120000798	Г510207133	120014424	Г56724034
119988662	Г517012243	120000837	Г510207198	120014425	Г56706020
119988746	Г510174027	120000969	Г511898182	120014553	Г36542509
119988777	Г517012263	120001134	Г59308771	120014683	Г36542510
119988845	Г512623644	120001139	Г59308772	120015600	Г51867750
119988905	Г510184937	120001461	Г56146899	120015668	Г55019100
119989602	Г57570704	120001581	Г517012317	120015928	Г31867751
119989690	Г57573686	120001748	Г59308773	120016277	Г57420091
119990027	Г36542504	120001768	Г59308774	120016397	Г54390775
119990110	Г57557802	120002407	Г510202747	120016788	Г56732650
119990364	Г512987676	120002993	Г517190912	120016904	Г56742613
119990863	Г512993619	120003189	Г511884636	120017026	Г37579840
119991237	Г56737956	120003199	Г34849760	120017542	Г52197539
119991499	Г310529569	120003758	Г37562612	120017573	Г510205385
119991618	Г36741215	120004530	Г5745884	120017765	Г36542511
119991739	Г511677153	120004532	Г3745885	120018695	Г36716071
119991908	Г36542505	120004821	Г3745886	120018841	Г510597874
119991993	Г56728751	120005202	Г3745887	120019534	Г513407241
119992039	Г56542506	120005459	Г5745888	120019716	Г54849763
119992209	Г511386094	120005770	Г513395242	120019836	Г34848539
119993577	Г56721529	120005783	Г57560869	120019839	Г54848540
119993825	Г56739574	120005868	Г311885255	120019852	Г51867752
119993914	Г512711922	120005995	Г517012332	120020267	Г510531839
119993983	Г513397501	120006051	Г511900137	120020619	Г32197540
119994264	Г512711923	120006067	Г511884243	120020703	Г56727359
119994321	Г513017443	120006186	Г52197538	120020806	Г52197541
119994574	Г56740231	120006239	Г511889299	120020814	Г56737324
119994784	Г510716622	120006306	Г5970013	120020831	Г32197542
119994803	Г51374121	120007130	Г57562248	120021103	Г57577922
119994954	Г51530522	120007189	Г512468740	120021157	Г37575097
119995078	Г510205049	120007959	Г36542507	120021526	Г56713238
119995182	Г51530523	120008874	Г54848538	120021548	Г57564432
119995238	Г55018771	120009246	Г36758051	120021672	Г511682799
119995420	Г513417283	120010134	Г57593041	120021695	Г511687834
119995638	Г52860753	120010278	Г511308896	120022550	Г52121218
119995975	Г54447611	120010394	Г57556873	120022556	Г52121219
119996042	Г54485581	120010590	Г53980309	120022644	Г513418186

- 76 019953

Полож в ВиЛс) 34

120022871 120022882 120022986 120023118 120023404 120023422 120023516 120023583 120024083 120024822 120024900 120025087 120025150 120026424 120026569 120026637 120026789 120027283 120027724 120028226 120028314 120028820 120028843 120029239 120029586 120029885 120030487 120030834 120030947 120031161 120031486 120031828 120032169 120032367 120032378 120033081 120033129 120033135 120033150 120033268 120033353 120033359 120033749 120034173 120034354 120034730 120036029 120036225 120036417 120036954 120037241

Название

Г52166408 гз2166409 Г56732687 Г512474874 Г56748897 Г54322838 Г52901763 Г511680207 Г56722032 гз7592528 Г56542512 Г57371346

Г510864980

Г510188216 Г52044428 Г511123503 Г52044427 Г510203658 Г57583824 Г510174654 Г510186930 Г56542513 Г56542514 Г36542515

Г510532262 Г54849764 Г517804511 Г5935362 гз935361 Г52860752 Г511893808 Г512623976 Г34848541

Г528653619 гз1446128 Г51838763 Г51470474 Г54528761 Г51838762 Г52121216 Г53980311 Г31446127

Г513024710

Г54849765

Г54849766

Г56715243 Г510166010 Г57561309

Г511886602

Г56542516

Г57601541

Полож в Ви|Щ 34

120037242 120037469 120037538 120037631 120037714 120037998 120038031 120038363 120038373 120038374 120038698 120038699 120039011 120039313 120039785 120040375 120040703 120040851 120040967 120041245 120041777 120041779 120041797 120041798 120041840 120041953 120041983 120042110 120042545 120042980 120042985 120043240 120044181 120044182 120044735 120045023 120045027 120045116 120045623 120046099 120046932 120047249 120047386 120047590 120048218 120048226 120048234 120048244 120048434 120048457 120048632

Название

Г57562256

Г57557444

Г56735202

Г57584874

Г57584975 гз7598853

Г511123504

Г511384356

Г511464659

Г511393319

Г51446126

Г510168744

Г54848542 гз4277535

Г513416713

Г513417356

Г512614389 гз2084154

Г512621053

Г510167806

Г510641092 Г5895400

Г57599963

Г510658512 гз7560645

Г510551390

Г57600179

Г513017664

Г510206284

Г53053193

Г55833778

Г513024716

Г57607939

Г513405317

Г513020459

Г513015999

Г512052957

Г512468083 Г5963662

Г512472931

Г57579602

Г55833779

Г513030441

Г5991844

Г513000062

Г513022674

Г528579959

Г528719630

Г513027917

Г513027932

Г512466475

Полож в Вина 34

120049031 120049111 120049158 120049468 120049808 120049895 120050448 120050503 120050761 120050907 120051111 120051961 120052171 120052802 120053731 120054452 120054477 120054484 120054490 120055083 120056573 120057058 120057116 120057332 120057333 120057493 120057623 120057815 120057816 120057829 120058071 120058160 120058174 120058180 120058601 120060148 120060448 120060852 120061012 120061029 120061096 120061139 120061708 120062319 120062891 120062996 120063070 120063176 120063963 120064284 120064289

Название

Г54849767 Г54849768 Г54849769 Г513017938 Г511680905 Г52028852 Г52028851 Г513410792

Г513402151 Г57586792 Г511675684 Г54142753 Г54849770 гз2084155 Г311691024 Г511681612

Г511692475 Г513400379 Г511692479 гз4142752 Г511695796 Г310188745 Г311685085 Г312475875

Г512463432 Г55833780 Г5746945 Г55833781 гз3053192 Г55833782 Г3876062 Г3895399

Г310186657 Г3895398 гз5833783 Г310181114 Г32860751

ГЭ11693876 Г311683050 Г310184332 гз4848543 Г310184438 Г311123505 Г311684731 гз6754436

Г312464139

Г36754664

Г36754799

ГЭ12997936

Г310206700

Г310194572

- 77 019953

Полож в Вийб 34	Название	Полож в ΒιιϊΙά 34	Название	Полож в ΒυϊΙϋ 34	Название
120064976	Г56759589	120077769	Г5838110	120090847	Г510182241
120065127	Г510221610	120077991	Г5838109	120091298	Г5838092
120065310	Г511689491	120078174	Г5838108	120091323	Г513401854
120066060	Г57560972	120078320	Г512373823	120091399	Г513386059
120066128	Г37558272	120078344	Г5838107	120091931	Г5838091
120066241	Г512463977	120078395	Г5865688	120092184	гз864505
120066318	Г51562256	120078483	Г512373677	120092304	Г5838090
120066453	Г51562255	120078615	Г57578870	120092610	Г57567193
120066620	Г51446125	120078754	Г5838106	120092737	Г5838089
120066705	Г51446124	120079222	Г5838105	120092937	Г3838088
120066972	Г51838761	120079745	Г5838104	120093034	Г510174436
120066974	Г57601127	120079819	Г5838103	120093360	Г5838087
120067290	Г511677262	120079878	Г5838102	120094306	Г512467944
120067736	Г510204391	120080519	Г510182677	120095038	Г517804991
120067927	Г56753314	120080542	Г510625730	120095312	Г510196144
120068051	Г56735649	120081128	Г53769659	120095426	Г513027072
120068477	Г528455610	120081529	Г5865108	120095756	Г56728660
120068761	Г56709777	120082110	Г5838101	120096263	Г513027293
120069635	Г510208455	120082382	Г5708670	120096647	Г5838086
120069642	Г5838067	120082432	Г5708671	120096791	Г5838085
120069925	Г54848544	120082499	Г5708672	120096949	Г510600943
120070154	Г512466050	120082585	Г56146900	120096982	Г510526493
120070400	Г57565771	120082871	Г5708673	120097896	Г510196222
120070666	Г57595954	120083300	Г51106771	120097915	Г5838084
120070908	Г5708666	120083710	Г5838100	120097952	Г53731606
120071508	Г5838066	120084104	Г53223О38	120098787	Г5838083
120071996	Г5708667	120084105	Г56146901	120098925	Г510188946
120072367	Г5708668	120084215	Г5838099	120099084	Г5838082
120072376	Г5708669	120084226	Г5838098	120099515	Г5838081
120072400	Г5895397	120084235	Г513410686	120099779	Г510202732
120072476	Г5838065	120084331	Г53769656	120099996	Г56738309
120072631	Г56755420	120084565	Г5838097	120100457	Г517013371
120072650	Г5838064	120084736	Г513400593	120100570	Г31665025
120072686	Г5838063	120084741	Г5838096	120100571	Г51624263
120072737	Г5838062	120084781	Г5838095	120100714	Г517805141
120073503	Г5838061	120085360	Г513425946	120100985	Г25833785
120073744	Г511683528	120085486	Г5838094	120100993	Г31530524
120073904	Г510209847	120085502	Г513010169	120101012	Г34592854
120074221	Г51562310	120085910	Г512470404	120101809	Г32592075
120074355	Г5838060	120086734	Г5895396	120102502	Г5838080
120074581	Г57557910	120086898	Г55833784	120102508	Г56735209
120075395	Г5838059	120086917	Г513432674	120102857	Г5838079
120075418	Г5838058	120086997	Г513408034	120103067	Г517013379
120076234	Г511676144	120087374	Г5708674	120103130	Г512990907
120076668	Г52289894	120087538	Г52121358	120103529	Г57561146
120076919	Г513003725	120087544	Г51963247	120103701	Г5734846
120076920	Г513034799	120087718	Г512465926	120103880	Г5734845
120077150	Г53795927	120088448	Г57577784	120104365	Г5895406
120077389	Г53795926	120088805	Г513391380	120104472	Г3895405
120077721	Г5838112	120089829	Г5838093	120104502	Г5708675
120077754	Г5838111	120090797	Г510190429	120104672	Г51867856

- 78 019953

Полож в ΒιιϊΙά 34	Название	Полож в ΒιιϊΙά 34	Название
120105219	Г5838078	120118405	Г511694139
120105720	Г53754847	120118612	Г511682650
120105721	Г512467089	120119587	Г31530561
120105810	Г511888609	120119648	Г56721852
120105981	Г5838077	120119899	Г513016861
120106044	Г37596511	120120260	Г513034803
120106433	Г5838076	120120268	Г513034810
120107316	Г512711924	120120378	Г513012570
120108033	Г5838075	120120617	Г56707849
120108409	Г5838074	120120725	Г512165162
120109057	Г51867749	120121081	Г56723312
120109148	Г512104548	120121286	Г53054836
120109236	Г51045623	120122044	Г31545360
120109381	Г53731604	120122260	Г36740573
120109485	Г512104639	120122331	Г36730921
120109754	Г5838073	120122555	Г313004570
120109782	Г512619779	120122566	Г35028235
120109902	гзб742425	120122626	Г311395093
120110130	Г5838072	120123526	Г32860792
120110342	Г56542517	120123689	Г31867855
120110521	Г5838071	120123862	ГЭ5833787
120111317	Г512991476	120124074	Г328497293
120111319	Г512991477	120124123	Г312990281
120111544	Г512105674	120124221	Г312995866
120111606	Г5838070	120125144	Г311692352
120111771	Г5838069	120125454	Г313402922
120111887	Г5838068	120126304	Г36729196
120112630	Г513400106	120126843	Г513034935
120112767	Г513388672	120127261	Г37599282
120112793	гз7575387	120127470	Г37582316
120113041	Г51610469	120127897	Г311123506
120113297	Г511891374	120128212	Г32084201
120114676	гз6720040	120128319	Г37592522
120114755	Г56723169	120128879	Г310864981
120115056	Г53054837	120128983	Г311123507
120115077	Г55833786
120115093	Г513014052
120115134	Г51374314
120115780	Г511885203
120116464	Г53769653
120116484	Г510171408
120116695	Г57590206
120116930	Г57581339
120117062	Г53731603
120117527	Г56753005
120117530	гз6753006
120117532	Г312476967
120117536	Г310571222
120117768	Г310204553
120118122	Г53731602
120118333	Г54849771

- 79 019953

Таблица 21. Перечень всех маркеров бЬ8ЫР125 в блоке неравновесия по сцеплению гк13387042 (приведены позиции в соответствии с ЫСВ1 Вш1б 34)

	Полож в ΒυϊΙϋ 34	Название	Полож в ΒιιϊΙά 34	Название
		218070106	Г56435956	218087900	Г513406843
		218070227	Г56713022	218088071	Г510198696
		218070431	Г54255939	218088201	Г510177578
		218070433	Г52372933	218088354	Г510177962
		218070638	Г510200456	218089512	Г54435428
		218071353	Г57426087	218089563	Г54276003
		218071353	Г54542823	218089745	Г513425828
		218071539	Г54456677	218089919	Г53084560
Полож в Βιι'ιΙά 34	Название	218071539	Г57422519	218089928	Г513414201
218062199	Г510191184	218071631	Г34264545	218090342	Г512623304
218063010	Г54396687	218071948	Г510169454	218091057	Г52372936
218063034	Г55838616	218073196	Г510192415	218092002	Г57425648
218063341	Г510932687	218073796	Г57595393	218092308	Г513410769
218063429	Г512614802	218073891	Г510169372	218092732	Г510191536
218063508	Г512614767	218074854	Г513430080	218092782	Г510203987
218063667	Г511889406	218075719	Г510175911	218093185	Г56716542
218063784	Г516856807	218075836	Г312165215	218093638	Г510207757
218064064	Г52888449	218076028	Г517833745	218093795	Г510173250
218064289	Г510192649	218076072	Г52372934	218094186	Г528525300
218064351	Г34571035	218076131	Г52372935	218094234	Г517777330
218064664	Г52372931	218076869	Г512612444	218094822	Г510211354
218065238	Г510195963	218076958	Г513423850	218094838	Г510187690
218065423	Г517833456	218077438	(-56733648	218094913	Г510211289
218065966	Г510207650	218077473	Г513389571	218094939	Г510211546
218066023	Г510932688	218077681	Г512165173	218095256	Г52372937
218066050	Г513403428	218077715	Г513389783	218095412	Г54315498
218066096	Г510207736	218078368	Г56737508	218096305	Г512998806
218066454	Г528663434	218078384	Г510209168	218096485	Г512999224
218067143	Г512464018	218079285	Г513383189	218096566	Г517833945
218067861	Г316856812	218079764	Г511884129	218096592	Г512465396
218068232	Г512477491	218080177	Г56714036	218096776	Г512465506
218068256	Г512477493	218080751	Г56435957	218096945	Г312465515
218068532	Г510932689	218081124	Г510192982	218097298	Г54491709
218068574	Г313413746	218082238	Г510932691	218097359	Г54674130
218068580	Г310932690	218082405	Г510932692	218097448	Г53084573
218068673	Г316856816	218082754	Г510188365	218097540	Г513417588
218068844	Г513414233	218083373	Г56723019	218097624	Г513392238
218068906	Г512613030	218083726	Г57349199	218097651	Г52372938
218069197	Г311903648	218083877	Г513404341	218098168	Г512621130
218069383	Г32888450	218084046	Г516856821	218098897	Г511387578
218069406	Г311688968	218084485	Г512614773	218099133	Г54471865
218069916	Г34994976	218086136	Г56732152	218099154	Г56435958
218069959	Г34254482	218086701	Г511677001	218099578	Г56722681
218069975	Г52372932	218086856	Г510171745	218100083	Г513399995
218070046	Г56723386	218087663	Г517833842	218100630	Г57564605
		218087886	Г513393574	218100783	Г512052807

- 80 019953

Полож в ΒιΗΙά 34

218101273 218101451 218101477 218101566 218101794 218101850 218101894 218101902 218102145 218102201 218102294 218102294 218102377 218102717 218102822 218102838 218102872 218102939 218103034 218103042 218103061 218103151 218103234 218103592 218104122 218104281 218104345 218104452 218104650 218104906 218105047 218105186 218105193 218105260 218105268 218105513 218105657 218105711 218105920 218106201 218106318 218106548 218106783 218107055 218107332 218107518

Название

Г510199394

Г510210524

Г52372939

Г52372940 гз4583440

Г52372941

Г510187530

Г56760041

Г510190181

Г510190349

Г517834221

Г510202715

Г56705818

Г56706491

Г56735174

Г56721811

Г56735190

Г56735298

Г517777767

Г512464375

Г512476702

Г56435959

Г56435960

Г52372942

Г54594417

Г510709272

Г512615418

Г512621884

Г57572103

Г57421376

Г511681010

Г55838617

Г53084579

Г55838618

Г56711784

Г59973728

Г59973894

Г59973730

Г513402323

Г55838619

Г52372943

Г54522583

Г513431146

Г52888451

Г513383392

Г52270398

Полож в ΒυίΙϋ 34	Название	Полож в ВыШ 34	Название
218107985	Г56734131	218113820	Г510192175
218108214	Г513386831	218113854	Г510192253
218108244	Г513412479	218113962	Г310192501
218108254	Г513412482	218114027	Г510204872
218108321	Г513412666	218114030	Г510192589
218108374	Г513387042	218114046	Г36708579
218108601	Г513426268	218114076	Г510192446
218108615	Г513387273	218114103	Г310192609
218108788	Г513426489	218114176	Г54672818
218108844	Г513413328	218114436	Г310195111
218108906	Г513413357	218114560	Г310171550
218108957	Г513387717	218114629	Г510195322
218108958	Г513426688	218114644	Г310195505
218109040	Г513413523	218114737	Г310195441
218109091	Г517777938	218114786	Г510207917
218109320	Г513416240	218115389	Г510198604
218109630	Г56713249	218115494	Г510198699
218109728	Г513391022	218115540	Г510198621
218109746	Г513416773	218115617	Г510174948
218109779	Г313416605	218115747	Г510175133
218109902	Г513430215	218115929	Г510198996
218109976	Г513416831	218116467	Г510167002
218109979	Г513416834	218116654	Г52372945
218110056	Г512620095	218116683	Г310201966
218110145	Г513433000	218116715	Г310201982
218110379	Г512327908	218116795	Г310178467
218110607	Г52372944	218117052	Г316856849
218110643	Г52888452	218117184	Г310204819
218110863	Г54618027	218117267	Г35838620
218111014	Г510490444	218117273	Г310566949
218111297	Г513397674	218117273	Г33084597
218111343	Г513423473	218117443	Г311901909
218111527	Г54621152	218117759	Г311901972
218111631	, Г513386262	218117956	Г312694403
218111703	Г512329160	218118356	Г311892687
218111876	Г512329163	218118594	Г312613955
218112005	Г56721996	218118809	Г310208746
218112094	Г512329172	218119095	Г310185401
218112403	Г512622764	218119709	Г511894340
218112445	Г510206095	218119744	Г36435961
218112816	Г510206577	218120136	Г310191172
218113130	Г517778091	218120424	Г32372946
218113325	гз 13411606	218120624	Г310168238
218113452	Г56723013	218120863	Г37586158
218113636	Г513386291	218121113	Г37600412
218113745	Г510685531	218121293	Г310183545

- 81 019953

Полож в ΒυϊΙά 34	Название	Полож в ΒιιϊΙά 34	Название
218121786	Г57589722	218134761	гз7598926
218122009	гз6740850	218134805	Г513018411
218122107	Г517778299	218134901	Г37599066
218122353	Г517778329	218135359	Γ513415Ί12
218123052	Г510198784	218135444	Г56754177
218123311	гз4442975	218135688	Г54361105
218123663	Г510932693	218135854	Г513025492
218124158	Г511291245	218136008	Г513025714
218124274	Г52888456	218137327	Г512328709
218124419	гз2372956	218137594	Г316825209
218124426	Г52888457	218137658	Г512329133
218125505	Г511674902	218137683	Г312329135
218125555	Г517778427	218137973	Г36734010
218126147	Г517835044	218138557	Г312622536
218126358	гз7588345	218138666	Г313022815
218126446	Г57561690	218138690	Г312996888
218126695	Г57561918	218138928	Г312997141
218126803	Г37562029	218139101	Г312328842
218126936	Г513000023	218139274	Г312328926
218127398	Г517835187	218139288	Г513002378
218127601	гз3085312	218139595	Г316856893
218127603	Г53085315	218140109	Г312478570
218127665	Г5735361	218140238	Г312467063
218128212	Г517835248	218140453	Г311690147
218128870	Г513409592	218140482	Г313010040
218129396	Г516856867	218140537	ГЭ12467163
218129599	Г52372957	218140719	Г313011060
218129616	Г52372958	218140839	Г54672819
218129746	Г55838621	218140888	Г34672820
218129748	гз3085335	218140952	Г513011326
218129820	Г516856873	218140976	Г511690464
218129963	Г517778798
218130041	Г316856877
218130142	Г57600279
218130798	Г511682933
218130803	гз4608489
218131549	Г513034362
218132117	Г510211044
218133211	Г516856888
218133717	гз5838622
218133723	гз5838623
218133948	Г52287288
218134039	Г52287289
218134273	Г316856890
218134618	Г57598618
218134620	Г37598805

- 82 019953

Таблица 22. Перечень всех маркеров άЬδNР125 в блоке неравновесия по сцеплению гк3803662 (позиции приведены в соответствии с NСΒI ВшМ 34)

Полож в Вила 34 52291041 52292193 52292669 52293212 52293398 52293430 52293504 52294560 52295118 52295192 52295650 52295682 52295683 52296050 52296074 52296100 52296956 52297566 52297574 52297595 52297649 52297698 52297718 52298081 52298807 52299817 52299822 52299825 52299952 52300224 52301045 52301313 52302076 52302193 52302954 52303160 52303163 52303361 52303886 52304653 52304699 52305016

Название гз 1076479

Г57188075

Г528720857

Г311642868 Г55816849

Г511454608

Г59937283

Г512921126 Г3189851 Г328558853 Г57198218 Г511337972 Г55816850 Г57203597 Г511304815 Г57203778 Г54784218

Г512444429 Г512447254 Г512447113 Г528689711 Г53095662 Г528493012 Г54493036 Г57205259 Г311464652 Г510641032 Г311427655

Г31111480

Г312447430 ГЭ43143 Г3187679 Г342542 Г34784219 Г311649553 Г33086679 Г59923098 Г38061425 Г51978343 гз3095595

Г312102837

Г310637120

Полож в ВиЛа 34	Название	Полож в ВиЛа 34	Название
52305075	Г59931647	52323870	Г57500427
52305085	Г528484983	52325826	Г516951223
52305086	Г510637121	52326630	Г512443621
52305875	Г57188610	52326776	Г59923558
52305996	Г57186907	52326895	Г59933556
52306637	Г59923960	52327297	Г51362545
52306726	Г52193092	52327389	Г54538010
52306777	Г52216188	52327503	Г312922895
52306900	Г59939506	52327601	Г512923628
52307320	Г59926539	52327690	Г511415785
52307440	Г59302555	52327938	Г57198754
52308124	Г512597838	52328239	Г59936081
52308541	Г528562017	52328264	Г58051286
52309356	Г58064219	52328472	Г510647102
52309429	Г511287146	52328482	Г35816851
52309445	Г58044985	52328483	Г310645216
52310401	Г59928129	52328493	Г53086690
52310846	Г53086687	52328528	Г51362546
52310948	Г51111481	52328629	Г52193093
52311095	г$2077653	52328900	Г52160474
52312052	Г58061860	52328944	Г512932707
52312760	Г58051542	52329434	Г59939775
52314189	Г511427470	52329968	Г58048043
52314348	Г516951213	52333201	Г53086693
52314403	Г54784220	52333595	Г51075367
52314941	Г58046985	52334335	Г58046979
52315230	Г528665779	52334886	Г51345388
52315478	Г512598982	52335310	Г59941100
52316033	Г310451108	52337266	Г51420529
52316119	Г54784221	52337322	Г51420530
52316179	Г54784222	52337427	Г51420531
52316601	Г57195542	52337486	Г510708737
52316633	Г517271951	52337500	Г511642645
52316669	Г512934513	52338806	Г512918816
52316689	Г512934308	52340832	Г54280232
52316930	Г57184835	52341080	Г57197481
52317345	Г310545412	52341404	Г512929984
52317493	Г512600239	52342090	Г51420532
52318190	Г59933638	52342219	Г51420533
52318304	Г528530752	52342476	Г51362547
52318333	Г57186498	52342544	Г51362548
52318957	Г513337151	52342856	Г510538952
52321003	Г58063421	52343467	Г328555277
52321733	Г511326759	52343743	Г57193453
52321900	Г54541074	52344234	Г59926163
52321923	Г54517793	52345047	Г52193094
52322238	Г59302556	52345209	Г528580623
52322671	Г57190749	52345455	Г33095598
52322726	Г516951220	52346438	Г312929605
52323043	Г51362544	52346440	Г512929606
52323132	Г51819860	52347923	Г528750243

- 83 019953

Полож в Ви»1с1 34

52349175 52349177 52349414 52349558 52350025 52350122 52350194 52350390 52350614 52351417 52352109 52353864 52354487 52354492 52355066 52355242 52355727 52355897 52356089 52356352 52356420 52356800 52357133 52358132 52358441 52358491 52358571 52358832 52358870 52359085 52359653 52360007 52360562 52360995 52361357 52361398 52361636 52361725 52362126 52362449 52362775 52362897 52363302 52364042 52364943 52365079 52365170 52365183 52365510 52365977 52366465

Название гз3112583 Г53112582

Г328435355 Г511648477 Г54783780 Г53112581 Г53112580

Г511431881 гз9921569

Г59931232

Г511075535

Г312597887

Г33112579

Г34784223

ГЭ9933351

Г31548910

Г38052175 Г328523905 Г31420534

Г37195388

Г31123428

Г31420535

Г31477074

Г33891563 Г513336638 Г38044585

Г38045285

Г34784224

ГЭ3095601

Г33095602

Г33095603 Г312930156 гз3095604 Г39921056 Г31362549

Г31362550 Г328463809 Г34784226

Г513335680

Г33095605

Г33095606

Г33095607 Г312926842

Г33112578

Г33803662 гз3803661

Г53803660 гз3803659 гз8053294

Г312446056

Г34322659

Полож в ВшШ 34

52366478 52367399 52367692 52367823 52367830 52368150 52369037 52369057 52369268 52369377 52369741 52370476 52370482 52370737 52370774 52371185 52371458 52372064 52372504 52372582 52372830 52373327 52373331 52373794 52373795 52373894 52374821 52375020 52375173 52375215 52375335 52375668 52375894 52376140 52376155 52376446 52376504 52376699 52377560 52377659 52377665 52377790 52377970 52377996 52378688 52378902 52378941 52379032 52379049 52379220 52379400

Название

Г528409238

Г513335398

Г57189773

Г57191347

Г513332085

Г53104771

Г528478483

Г328418561

Г58057406

Г57199494

Г528636082

Г311437687 Г53112577

Г528719661

Г528700577 Г53104808

Г328595571

Г53104812

Г516951246

Г57201350

Г53104818

Г316951251

Г53104827

Г328715219

Г328759054

Г528491753

Г528397852

Г328561462

Г528366779

Г528690015

Г528472996

Г528437002 гзЗ 104743 Г59922732 Г53112576 Γδ459425ί

Г528685217

Г53112575

Г33112574

ГЭ9937101

Г316951253

Г34784227 Г316951254 гзЗ104744

Г33104745

Г33112573

Г513334992

Г3285ОЗЗО1

ГЗЗ112572

Г34784228

Г312919508

Полож в ВЫШ 34 52379702 52379713 52380052 52380131 52380217 52380227 52380243 52380252 52380383 52380473 52380526 52380961 52380977 52381045 52381091 52381630 52381735 52381752 52381753 52381770 52381945 52382513 52382735 52382879 52382932 52383045 52383698 52383902 52384112 52384265 52384839 52385009 52386865 52387168 52387274 52387635 52387700 52388131 52388189 52388416 52388424 52388458 52388606 52389436 52389606 52390581 52390586 52390646 52390740 52391109 52391155

Название гзЗ 104746 гз3112571 Г511372822 Г511646414 Г58053784 Г511342984 гз3112570 Г59934281 Г53112569 Г53112568 Г53104747 гзЗ104748 Г53104749 гз3112567 Г53104750 Г53104751 Г53104752 Г33112566 гз3112565 гзЗ112564 Г35011736 гз3104753

Г311864809 Г316951272 Г311859735 Г316951279 Г53481

Г316951281 Г33104754 Г33112563 Г33104755 Г33104756 Г33112562 Г33104757 Г310521267 Г53104758 гз9921358 Г33104759 Г33112561 гз3104760 Г33104761 Г33112560 Г33112559 Г33104762 Г38055502 гз5816853 Г35816854 Г31109951 Г38061255

Г328636558 Г35816855

- 84 019953

Полож в ВиЛа 34 52391221 52391267 52391639 52392183 52393309 52394968 52395219 52395420 52395423 52395448 52396694 52396715 52396799 52397331 52397555 52398233 52398720 52398860 52399117 52399179 52399652 52399807 52399850 52399948 52400091 52400138 52400341 52400714 52401021 52401314 52402239 52402254 52402438 52402568 52403048 52403100 52403137 52403194 52403223 52403340 52403795 52403802 52404000 52404011 52404038 52404154 52404215 52404998 52405153 52405181 52405833

Название

Г53112638

Г59708611

Г512935019

Г53104763

Г35816856

Г35816857

Г35816858

Г511284113

Г311326465

Г56498958

Г53112637

Г54784230

Г513330592

Г35816859

Г511645620

Г53112636

Г53112635

Г53112634

Г516951316

Г53112633

Г528567699

Г53112632

Г53112631

Г55816861

ГЭ13335960

Г83112630

Г33104764

Г311640537

Г33112629

Г33112628

Г36498960

Г35816863

Г34262942

Г33104765 гз2335 Г310653756 Г33104766 Г37201410

Г812934093

Г33104767

Г328400414

Г33112626

Г37190208

Г328379686

Г3172924ОЗ

Г33112625 Г312920540 гзЗ 104768

Г33112624

Г35816864

Г33104769

Полож в ВиЛс! 34 52405970 52406122 52406128 52406232 52406857 52406859 52406869 52406870 52406881 52406905 52406977 52407020 52407095 52407116 52407139 52407166 52407928 52408038 52408105 52408239 52408304 52408429 52408504 52408747 52408951 52409006 52409053 52409255 52409498 52409610 52409628 52409779 52409788 52410064 52410319 52410349 52410566 52410952 52411233 52411546 52411635 52412049 52412254 52412259 52412298 52412310 52412516 52412602 52412765 52412855 52413602

Полож в Ви!1с1 34

52430198 52430316 52430713 52431082 52431277 52431322 52431382 52431582 52431715 52431739 52431878 52431941 52432313 52432373 52432387 52432454 52432459 52432718 52432830 52433165 52433198 52433468 52433888 52433897 52433898 52434496 52434497 52434960 52435190 52435864 52436127

Название

Г53104770

Г511645834

Г53112623

Г58046543

Г512930738

Г512926392

Г512926394

Г512930747

Г512102546

Г528642024

Г57198019

Г511860998

Г57192828

Г571935.15

Г511860769

Г511861036

Г53104772

Г53104773

Г53112622

Г510692294

Г53104774

Г53104775

Г57200735

Γ5720367Ϊ

Г53112621

Г57206289

Г57206313

Г57204612

Г53112620

Г53112619

Г58062962

Г512597100

Г53112618

Г53104776

Г53112617

Г53112616

Г311075551

Г53112615

Г53104777 Г512929797

Г53112614

Г57202142

Г53104778

Г53104779

Г58044824

Г510665605 гзЗ 104780

Г33104781

Г83112613

Г38044760

Г312922061

Название

Полож в ΒυϊΙά 34 52413719 52413766 52413932 52414779 52414844 52414967 52415402 52415965 52416037 52416145 52416382 52416795 52417105 52417150 52417212 52417265 52417361 52417477 52417564 52417836 52417838 52418217 52418357 52418357 52419612 52419788 52420562 52420628 52420979 52422526 52422537 52422543 52423052 52423497 52424706 52424978 52425772 52427035 52427036 52427156 52427333 52427444 52427468 52427539 52427910 52428293 52428649 52429238 52429511 52429906 52429965

Г53112604 Г511075561 Г512599215 Г54640177 Г35816867 гз4638564 Г511647405 Г511075562 Г53112603 гз4638563 Г34426347 Г53104801 Г53112602 Г511434012 Г56498968 Г53104802 гзЗ 104803 Г57198792 Г513338987 Г311643841 гзЗ 104804 Г33104805 Г33112601 Г312924424 Г312924425 ГЭ28680336 Г35816868 Г37202932 Г33112600 Г33104806 Г33104807

Название

Г328709052 Г53112612 Г39925692 Г33104782 Г33104783 Г33104784 Г33104785 гзЗ 104786 Г34578643 Г33104787 Г312597685 Г311374841 Г33104788 гзЗ 104789 Г312599893 гзЗ 104790 Г34290467 Г34467067 ГЭ3104791 Г34238749 ГВ4238750 гз8048809 Г34459541 Г31112135 гзЗ 104792 гзЗ 104793 Г33104794 Г33104795 гзЗ 104796 Г38046994 Г37193357 Г37186461 Г33104797 Г33104798 гэЗ 104799 гзЗ 104800 Г33112611 Г312921031 Г312921032 Г33112610 Г33112609 Г38045104 Г33112608 Г312921801 Г36498966 Г54488440 гз3112607 Г35816865 Г33112606 Г35002422 Г33112605

- 85 019953

Таблица 23. ОНП маркеры НарМар, использованные при исследовании мультиэтнической когорты

ОНП	Американцы европейского происхождения	Йоруба (африканцы)
	г2*	1 о	г2 1	0'
Г512922061	0,39	0,81	0,03	1
Г54784227	0,81	1	0,03	1
Г517271951	0,88	0,96	0,03	1

*значения г² и Ώ' по отношению к Γδ3 803662

Таблица 24. Данные по ассоциации с раком молочной железы, полученные на мультиэтнической когорте Американцы европейского происхождения

ОНП 2 г #пораж Част пораж #конт Част конт

Т-Г53803662	0,0214	1,23	534	0,3408	572	0,2951
Т-Г512922061	0,0724	1,19	534	0,2799	572	0,2462
Т-Г54784227	0,0036	1,32	534	0,3034	572	0,2480
С-Г317271951	0,0154		534	0,3096	572	0,2630

Латиноамериканцы	Г	пораж	Част пораж	конт	Част конт
ОНП	Р
Т-Г53803662	0,0498	1,22	425	0,4190	426	0,3723
Т-Г512922061	0,2487	1,13	425	0,3231	426	0,2972
Т-Г54784227	0,1373	1,17	425	0,3429	426	0,3091
С-Г517271951	0,4867	1,08	425	0,2905	426	0,2753

Американцы африканского происхождения

ОНП	Р	г	пораж	Част пораж	конт	Част конт
Т-Г53803662	0,0069	0,77	432	0,4747	457	0,5395
Т-Г512922061	0,0358	1,41	432	0,1065	457	0,0777
Т-Г54784227	0,0853	1,34	432	0,0972	457	0,0744
С-Г517271951	0,2060	1,24	432	0,0922	457	0,0755

Таблица 25. Риск рака молочной железы, ассоциированный с аллелем А Γδ13387042 и аллелем Т

Γδ3803662 при опухолях, позитивных по эстрогеновым рецепторам и прогестероновым рецепторам

Г513387042 (А) га3803662 (Т)

Случаи ОК_____Р Случаи ОК Р

Эстрогеновые рецепторы (ЭР)

ЭР-позит	2124	1,22	4,ЗЕ-09	2128	1,32	5,8Е-13
ЭР-негат	589	1,06	0,37	589	1,07	0,30
ЭР-позит в сравн с ЭР-негат	1,15	0,036		1,21	0,0098

Прогестероновые рецепторы (ПР)

ПР-позит	1802	1,23	2,8Е-08	1805	1,30 9,ЗЕ-11
ПР-негат	816	1,12	0,036	817	1,16	0,015
ПР-позит в сравн с ПР-негат	1,09	0,150		1,13	0,057

Таблица 26. Последовательности, фланкирующие Γδ4848543 и сцепленные ОНП маркеры НарМар с г²> 0,2 >гз4848543

ССАСТАСААСССТТАСАТАСААТСССАААСТСАСССССАСААССА6СААА

САТСААСТССССАААСТТААССАСАТААААССАСААСТССАССТААСАСА

А6САСТАТТСАТАТТАСТ6САССААТССАААТТСТАСААСААСАТАСССТ ТСТТСТТТАААСССАССССТСССТТТААССАТТАТТТССССАТСААТАСС [А/С]

АТТААТААТТАСАССАСАТССССАААТАТТСТАССАААССТССТОАССТ

СТТССТАСАТСТССССААААТААСААССАСТССССССССАС6ТСССАССА

АААСТСССАССАТСТСТТ6СААССТСАССТТССССАССТСТСССТСССТС АСССАСАСТСАСССАССССТСТАССАТСТААТССТСААТСАТТСААСАСАТ >Г51168О2О7

СТСАСАСТАСССАССТ6СССССААТССААСТС6СТССАСАССТ6С66ССС АССАСТССА6САССААС06СА6СССССССАТСА6АССТС6ССССС6АССС 6С6СССТ6АССТТ6СС6ТСССА6ТТТССССААС6САСТСТ6ТСТТССАСС САСССТССССССТСАТСССССТСТСССТССТСААСССАССА6ССАССАСС [С/Т]

СТСТСТСССАТСТССТТТТТАССССТСАССАТССААСААССТСАТССАС

АССА6ТСААСССССТСССАСАТАССАССТСССАСАСААСССТССТСААСТ

СТССССТАСАТСАСАСАТСАТТСАСССССТСТСТТААСТТССАТСААСАА САААТАСАСТСТТАТСАСТААСАТСАССААССТААССААССААССАСАСАТ >гз7583824

АААССАА66САТТТСТ666ССТСА6ААААССАСАТ6ССААС6САТ60СС6

ТАТТААС6АТАС6СССТСТТСААСССССАСССТССТААААТСТАСААССС

САСАСССАССАССССТААТТТТТСТССТТССТАСАААТАААСТССССАТС А66ААСАССАССАААСТСТСТССССАААССТ6АААСТСС6АСС6АССТТТ [С/Т]

СТСАААТССАСССТСААССТСАССТСТСАТТААТТСССАААСТССАСАС

ТСАСАТССТСТАААСАААСТССАААТАТТТСТТСТАААСААССССТСССА

ССТСССССТТТАССТСАСТСАТАААСАССССТТСАСССАСАААССАТССС

АСТССАССА6ТААСАСААСС6СТССАССАССАСАСССААТ6САСАСССААС

- 86 019953 >гз4848541

ТССССТАТАСТССАСТАСАТАСАСССАССССТСАТААСТААСТСАСТАСА АСАССАССТСССТСТСТААСССТТСТАССТТАТТТССАСАСТСТТСТССС АСАСАСАССТТСССАССССАССТССТАССАСССАСАССАСАТС6ААТ6ТС АССААТСАААТССАСААСАСТССААСССССТСССАСССТ6АССТТСССАС [А/6] '

ССССАСАССАССААССТ6А6СТССТСАСССААА6ССТСССАСТСССТАС СТСССАСТСАТТСССТТСТСААСАСАСТТСССАСТСССТТСТСТТССТСС АТТАТТААААССАА6ААССАААААСТТСАСТСА6СССАТАСААТСССАСТ ААТААССАТСТССАСССТТТСССТСАТСТТАСССССАСАСААААТСТСАСТ >Г51446128 САСАСАСТТТТСТСССТССССАААСТСАСАТАССТСАТТАСАССССАССТ ТСССССТССАСТСТСТСССАССААТААТА6СТСААСТТТСАТТСАТТССС ТААСССАССТСТСТТСТСА6СССССТСАССССАССАТ6ТТСАТС6СТССА СССТССААССААСТСАССТААТТСАСААСАААТСТССТСТСССТСАТССТ [А/С]

ТСССССАТАСТСАСАТПТСТСТСССССТААСАТСАСССАААСССТССА САТССТТАТТАСТСС6АТТСТАТССССТСАСТ6ААСТТТТТССТТСТТСС ТТТТААТААТССАССААСАСААСССА6ТСССААСТСТСТТСАСААСССАА ТСАСТСССАССТАСССАСТСССАСССТТТСССТСАССАССТСАССТТССТС >Г54849766 ССАСССТСААСАСАСАААСССАСАСССТСТСТССТТССАССТАССТСАСА САССССТСТССТСАССТСТСТСССТСАСАСАТСССССАСССААСТСССАС ТСАСТСССТТСТССАА6ССССАСССССТАТАААСАССТССССССССТСАС ТССТСССССТСССССТССАСАСАСССССТСАСТССААСАСААССАССССА [С/С] А6СТСАТСАССССАААСССАСССАССА6ТТСАССССССТС6СССТТТСС СССТССАСТСАССССАСТССТТСССТТСАСТССАСТТССТСССССАССТС АССССАССААСАТСААТСТСААССТТСТААССТСАССССАСАСССТСААС ССААСССТССССТ6ААСТСТТССАССТССССССССАССТСАСССССТСААС >Г5б715243

ТССССССССАССТСАСССССТСААСАСТТСТСТТТССТСААСССССАСАС АССТССТСАСАСССААССТТТАСТАССТАТТТССТТАС6ААСССААСТАТ СТСТССААСАТТТССТААТААААТССАААСССТСТТССАСССАСТССАСС ССССТСАТТТАССТСТСАССТСТААТТААТАСАТАААТТААССТССТССА [С/Т]

АСТСАСАААТСТССААСААААААААТСАААААТАТААТТАСТТТССССА ТСТСАСТССАТСТСТСАССТСТСАССТСААТССТСААС6ТАССАААТССТ САССССТТТССТСТСССАТТСССТСССССС6ССССТССТССТССССТССТ ССАСС0ААСТССССССТССССАССАССТССССАСАССССССССТСТ6САСТ >гз895398

ТТАССАССССТСТСТСТСССТТСТССССТТТСССТТССАСАСАСАСССТС ТТСТССАСССАСТСССТСТТССТССААСС6ССТТАСТСАСАСАСТССТСС 6САССССТСТСАССТССССАСАССТСТТАССААС6СССАСССССТССТТС АССССТТСАСССТСТСТТССААССТСССАСТСССАСАСССТСАСССАСАС [С/Т]

СТССТТАСАТССАСССАССТССССТСТСАСССС6САСТССАСТТТССАА ССССТТССТАТССТССТСТССССАТСТССТТСТССАСС6ССССАСССАТС ТССАСААССССАССААСАТСССААССТСАААССТССССТСТСТТТАТССС ССТ6ТАСТССАССТСССАТТТТСТССССССАТСССАТСААСАТСССТТССА >Г511684731

СССТААСССАСАССА6ССАС6АСССТТТАССССАССАСССААСААСТССТ

- 87 019953

ТТССАСАТССТСАСТ6ССАТССССААТААСССАААССССАТСТААСАТАС ААТСАССАССАСАТААСАСААСССТАСАААТААССААСАААССССАТТТС ТСТСА6АТСССТТТАСАССТССТСССА6ССАТТССТССССТСАСАТС6СТ [С/Т] АСАТСТСАТААТТТТТСССАА6ССС6ТТТСАСТСССАССАССАСССССС ТСАСССТССАСТСССТТСТССАСССАТСССТСТССССТСТААСТССССАС САТТТТАТАСССТАССААСААААСТА06СААТСТТААС6САСАС6САА6Т СААСТТСААСТТССААССАТСССАСААТСТССАССАССАААСССССАТССА >Г512464139 6АСАССТСАССТТСАСАСССАСССАССТСССАСТСТТСАСАААТСТТ6СТ ТТТСАССТТТАТСССАСССТАССАТССААСААССТСАТТСТТТААТСААА ААСААТОАААТТСТААААТАТСАСАТСТТАТТАСАТСТССТААСССТААС ТТТТАТСТСАТААСАСТТТТССТТСААТСАТСАСТ6ТАТААТТТСТАТТТ [С/Т] АТТТТСТСТСТАТССССТТАССТСТССААТСТАСААААССТТСААААСС АТТСССТТАТАСССАТТТСАААААТСААССАССАААСАААСССТТААААА САТСААТАТТТСТСААССААААССАСААСТССТСССССТССААСАААСАТ САССАТТСААСТССТССАССАССАААСААСТТСА6ССТССАТТТСТАТТСА >Г5б754664 ТССААСААССТСАТТСТТТААТСАААААСААТСАААТТСТААААТАТСА6 АТСТТАТТАСАТСТССТААСССТААСТТТТАТСТСАТААСАСТТТТССТТ СААТСАТСАСТСТАТААТТТСТАТТТСАТТТТСТ6ТСТАТССССТТАССТ СТССААТСТАСААААССТТ6ААААССАТТ6ССТТАТАСССАТТТСААААА [С/Т]

СААССАССАААСАААСССТТАААААСАТСААТАТТТСТСААССААААСС АСААСТССТСССССТССААСАААСАТСАССАТТСААСТССТССАССАССА ААСААСТТСАСССТ6САТТТСТАТТСАССТТСАСТСТТТСТАААССАССА ТССАССАТССААСТСССТТСАСТТСС1 I I I I I I I I 1СТТТС1 I I I I I I I I Г >Г56754799 .

ТСАСТСТАТААТТТСТАТТТСАТТТТСТСТСТАТССССТТАССТСТССАА ТСТАСААААССТТСААААССАТТСССТТАТАСССАТТТСАААААТСААСС АССАААСАААСССТТАААААСАТСААТАТТТСТСААССААААССАСААСТ ССТСС6ССГССААСАААСАТСАССАТТСААСТССТССАССАССАААСААС [С/Т]

ТСАСССТССАТТТСТАТТСАССТТСАСТСТТТСТАААССАССАТССАСС АТССААСТСССТТСАСТТСС1ТТТ1 I I I ГТСТТТС1 I I I I I I I I I I I I I I ТТТТТТСАСАТССАСТТТССТТСТТСТСССССАСССТССАСТССААТССС АСААТСТССССТСАСТССААТСТСССССТСССАССТТСААСАСАТТСТССТ >Г5б759589 СТССССССАССТССТТСТТТТСТТССТСАСТСТСАТТТТССААААСССАС АСААССССТСССССССТТАТССССАббССТСАСТССАСАССАТССТАСАС САССАССТСАССССАСССТССТСТССАААСТССАТТАССАСССССТСТСС ТАААТТТТТСАССА6ССТСТТСТСТСАСТААТССТССССС6АААТАСАСТ [А/6]

АСССТССАТССССААСТААСТССТСАС6ССТСССССАССТСТСТССТСС СТССССААСААССССАССССССССССАСА6СССАССТСТССАТССА6ССТ САССТСССАСТСССССТСТ6ССААССАСТТСССССТСТССАСТСССАТСС АСТСССТСАТТТТАТССАТААТТСТАССТССТСССТСТСТСАТСТСССССС >Г51562256

С6ССАСАССАСАСТСТСТССССТСТТС6САСТТСССТТТТСТТССТССАА ССААТАТАТСТТСТТТАА6ССА6ТСАТСТСССТТАААСАТССТААССТСА ССААТТАССС6АСССТТАТАСТТСАААСССАС6ТССССТТТСССССТСС6 САССАТТССТСТСААСССТСАССТАТССАССАТССАС6ААТАТСТ6СТСС

- 88 019953 [С/Т] САССАТТСАССТССААССТСССТССТТСССАСТСССАТСТТАСТСССТС СССССТТТАААААААТТТАТТТТАТТТТАТТТТТАТТТТТТААСАТАСАС ТТТСАСТСТТСТСАССТАС6СТССАССССААТСССТССАТСТССССТСАС ТССААТТТССАССТССТСССТТСААСТСАТТСТССТСССТТАСССТСССАА >Г51446125 ССТССТСТССАССТ6САСАССТСАССТСАТСТ6ССТСССТСССССТСССТ ААСТССТС6САТТАСА6СТ6АСАСССАСССС6СССА6СА6АССА6АСССТ ТТСТААТАССТТСТСАССССА6САСТСССССССАСССССАССТААСАТСС САСССТ6САТССАССТСТСТСТТССТАССССТС6ТСССТСССТСАСТААА [С/Т]

СI I I I I I I I I I IААТСАТТСАААССТСАТСТТТАТССТАСТТАААСТСТ СТТТСААТТАСТАА6ССТСТТТСТССС1 I I I I 1С1 IАССССАСАСТТСТС СА6СССАСАССАСАСТСТСТССССТСТТСССАСТТСССТТТТСТТССТСС ААССААТАТАТ6ТТСТТГААСССАСТСАТСТСССТТАААСАТССТААССТ6 >гз1446124

ССТ66СТСССАТТАСАССТССССАТСАСТАТССССААСТААТТТТТСТАТ ТТТТАСТАСАСАСС6ССТТТСАССАТСТТ6СССАСССТССТСТССА6СТС САСАССТСАССТСАТСТСССТСССТСССССТСССТААСТССТСбСАТТАС АССТ6АСАСССАСССС6СССАССА6АССАСАСССТТТСТААТАССТТСТС [А/Т] ССССАССАСТСС6ССССАСССССАССТААСАТСССАСССТС6АТССАСС

ТСАТТ6АААССТСАТСТТТАТС6ТАСТТАААОТСТСТТТСААТТАСТААС ССТСТТТСТСССТТТТТТСТТАССССАСАСТТСТССАС6ССАСАССАСАСТ >гз11677262 ТСАТАСАТТАТТТАТССАТСА6СТС6САСАССАТТССАСССАССАССАСС ССАААСАСАСТСТ6СААТСАСАСТС66ССА6С6ТТССАТС6САТТССССТ ТСТСССАССАСТСССТАТСТСАТССАААТСТАССАСАТСТСТССААСССТ ТССТСТССТСТТТТАТСАААТСА6САСАТТСТАСТСААТСАСАА66ТСТС [С/Т]

АСААТСССССТССАТСТСССТОСААТСТТССССТСТССТСТССССТСАА ТССССАТССТССТТССТССАСА6ССТСТАССАТАСТТССТТССТ6ТСТСС ТССТСААСССТ6СТСТСААСАСССАСТ6ТСТ6САССТААСССАСТССССС ТСТСССТСТСАССТССТСАССССССТСААСОСАААСТСАСААСТААААААА >гз7565771

ТСТТСТТСАбТАТТТСССТТССТСТСТСААСАСССТТТСТТТТССТТТСА САТТАТСТСАСАСССТТТТААТСААСАССТАСТААСТССССАССАСТТТС СТОССААСТТААТТСТТАСААССТСТТААСАССТСТАТАСАСТСАТТТТА САСТ6САССАААТССА0АСТТАССССАСАТСТСАААТТТ6ААССАССТСС [А/С] ТСТССТТТСАААСССТОСССАТбТТССТТТАСССТАТССААСССТССАС ААСССААССТСТСАТСТССССТСТТСССТССАССССССАААССТСС6ТА0 СТСТСССССТАСАССТТТСАСССАС66ТСТССАСССАТТАТСТСССТТАС СТТТТСТТ6САСТСАСТТСССТТСТСССА60СТССССТААССАССАААССС >гз838066 ТСАССТТТССТС6ТССТС6САССТССТСТССТССАТТТТТ6А6ССААССА САСА66СТТТ6ССАСАА6САССССТССТТССАСТТСТСССАС6АСТТАСТ СА0ААААСААААСССААССАССТССССС0ССАСТТС6ССССАААТСТ6СА СА66АТСТТСАСАСТСТСССССТСССТССТТСТТТССТСАСССССАСА6С [С/Т] САССТСААСАСАТСТССАСТСТА666ТСТТСТСТ6СССТ6ТСАСАССАС ТСТССАСАСАСАСССТСССССА6СААСААТ0ССАСАС0ТСССТССТССТС

- 89 019953

АСТСАССАСАССАССССТССТССАААСАСАСАТСТСАССТСАСССТТССС ТТСАССССАСССААСТСАСАСССААСТСАСАССССАССССАССАТАСССАА >Γδ895397

ТСААСССТСТТСССТТСТСАСТАСАССААСАТССССААССАСААТССАСС САСССТСАСССАССАСАТСССССААССАТТТАСАСАСССААОСААСАСАТ ТСТТСТТСССССТСТАТСАТААСАТТССАТТСССТТТСАССТСССССС6А ТТАСАААСССАСТСАСТАСТАСАТСАТСССАСАТ6ССТСССТТТТААССС [С/Т]

ТТССТ6СТСССААССТССТ6АТСАТСАТС6ССТСССАСССТТТТА6ААТ СССАСАСТСТСАССССАССССАААССТСССАААТТАСААТСССАТТТТАА СААСАСССССТАССАССТТСТАТАССТСТТТААСТТТСАСААССССТССТ СТАСАТТАСААСТСАССАААСТСАСТАСТСССТСААСАССТССАТСААССТ >гз838059 АТАА6САССТТСАС6ТТАТТТТТАССААСТСТААСААТССТСТТТТСТСС ССАСССАСССТСТСТТССССА6АТААСССТСС6СА6СССАСАС6САССАС СТСССССТСААССААССССССАСААСТССАССССАААССССАСССТСССС АССААСАСССАСАССТСТССТСТСССТСТССАСССАСТССТССТСТАААС [С/С] СССТТТСССТССАСССССААСТСССССССА6ААСССССССАССССС6СА СССА6ТТТССТТТСССССТССАСАССТТТССТССТАССССААТАСССАСС ТСССАССТСТСТССТСАСССАССССССААССССАСАСССТСТСТТСТСТТ ССААСААСТТТССТ6ТСССАССТТСССССА6СССААСАССТСТТАТСССАА >гз838102 СТААСТААСТСССАСАТТСТССТСТССАААТТСТСССТСАТСССТТАТТС АТТСААСАААСАСТТАСССАССАСТААСТТТСАСССАСССАСТСТААСАС САССТСАСТСССАСТТСТСССАССАТСАСТСТТСТТСТСАТСААССАССС САСАААСАССССТ6СССТСТСССТАСТТ6ССААТСТ6АСТСАССАСАСАС [А/6]

СТСССАСТАА6ССТСАССАССТАТАССТСАТ6ТСАСТСАССААССАТСС аааассааасасассссстсссстсасссастсаСстссасссатсаасс АСТСТСССТСССАТСАССССТСАТСССССАСТССТТСТССАТСАСАААСТ СТТСССТТСТСАСТТСААСССА6С6ССАСАСТСТСТТССТСТТСАССТСТС >Г53769659 ССССССАССАСТСТСТТССТТССТТСССТТССАСТТССАСССАССАССТТ СТТТСТССССАСТССАСАСАСАТСТССААСССССАСАСССТСАТСТССАС АСССССТССТСТСАСТТСССССАССТССТСТССССТТТСАСССАССТТСС ССССАТТТСАТССАСАСТССТСССТССССТСАААСТССАСТССАТТСАСС [С/Т]

ТССТАСТСАСТСАТСТССАССССТССССАСТСАСССАСАААСССССССТ ССАТСССАССААССССАСТСТСССААТСС6САССССАСАССТСАССТССА ССССССАССТСАСАСССАСТСТАТССТСТАССТСТ6САСССА6АСТТСАС СТТСАСАСАСАСАСТТССССТСАСТ6ССССТАТАСТСТТАСТСТСТСАА6С >гз865108

АССАСССАСАААТСАСССТСАТСССТСССТ6САСССССАСССАТСТС6СА ААССССТССССТССТССТСТТСССАСАТСТСААСССТССАСССТССАААС СТТСТСТСАССТСТССТ6СТСТСАСТТССАТТСССССТСССССТТАСССТ СССАТСАССТТТААСАТСТСССАТСССТТСТ66ССССТССТСАСАССА6С [А/6]

СААСТСТСАА6ССТСАСС6АССТСАС6СТАСАСССААССТСТСАСТ6АС ААССССАССССССАССТСТСАСАССТСАССТССА6СССТССАССААСССС ТАСТСТССАССТССТСТАСТСТСААААССААСАСАААССТТТССТТТССТ САССТССССТТТССТСАСАСТССАССТТСТССАААСАСАТСТССАСАСССС

- 90 019953 >гз708670

ССАСССАСТСАСТТССАСТАССССТССТТССАСТСССТССССАСТССАСС ССССАССАСАСССААТСССАТТСТТТССАТСТССААТСТТСАСААССТСС ТСССССАТСССААТСССССТТССТТАААСАТССАССССААССССТТ6ССС АСТТААСССАССТСССАТСТСССССААСССССАССССТСАСААТСТСТСС [С/Т]

СССТТТСААТТСАСАСАСССАССТСТСТТАСТТСССССАССТАССТССА САСАСАТСТСТСТСААТТССССТССАСССАТСТССТАССТСТСТСАССТТ СССТАССТТССТТТСССТСТСТСТССТСАТСАТТАААСАСТСААТАТСАА АССССТАААСАСАТСТСТТССТТАССАСТСТТСТТСТСТССАССТТТССТТ >гз708672 ССТСАТТСТТСТСТСАСТССТетбССССССТСССТСТССТСТСТТСТАСТ ССАСТСАААСССССТСТССССАССССТАСАТТССТСААТСТССССССАСТ СТААСАСАССССТСТАСССАСССАСТСАСТТССАСТАССССТССТТССАС ТСССТССССАСТССАССССССАССАСАСССААТСССАТТСТТТССАТСТС [А/С]

ААТСТТСАСААССТССТСССССАТСССААТСССССТТССТТАААСАТСС АССССААССССТТССССАСТТААСССАССТСССАТСТСССССААСССССА ССССТСАСААТСТСТССССССТТТСААТТСАСАСАСССАССТСТСТТАСТ ТСССССАССТАССТССАСАСАСАТСТСТСТСААТТССССТССАСССАТСТС >гз708673 АААСАСАТСАСАССАСТТСТСТССАССССАААССАТССАСССССССТСАА СААСАСАСАСССАТСТТТСТССТСССТССССАТСССТТТТСАСТССАССТ ТССАССССАСАСССССАССССАААССАСССТССАССТТТССААССТТТТС САТТСТТСААСТСААТТАТСТССААССССАТТСТТАСССАТААСТСТАТТ [С/С]

ТАТТСТТТТСААСТТСТТТССААССТАСССАТСТТССААТАССССАСАТ СТААСТАТСССССССАТСТТТАТСТСААССССАСАТССАСААССТСТТТТ ТСАСАТСССТСАССАТСТСАТАААСАССТТСТССССАССТТТССССТАТС АТСАССАААСАССААСССААССССТСАТТСТТСТСТСАСТССТСТСССССС >гз838100 .

АТСАСТСАССАСТСССССТССАСССССТСТССССААСАССТССССТССАС ССТСССССАСССАССТСССТСТССААСАСССТСССАССССССТССССТСС ТСАСАААСССАСАСТСАСААССАААСССАСССТСТССТССТТССАСАСТС АСССАСААА6ССТСССТСАССТСАСССТСАСССТСТССА6ТСАССТ6АСА [А/С]

ССТСАСАСССТСАССТСАСССССАТСТСССАССАСССТССТСТТССТАА СТСТСССТАССАСССАСАТССААССССССАТСССТССТСТССАААССССТ СССАССАССТСССТСАССАССТСАССССТССССТССТССАСССТСССССТ ТСААТСТССАССАССТСССАССААСТССАСАССТСССАСАСАТСТСТАСТС >гз838098 _: ·

АААТТТСАССССТТСААССАТТТАТСАСАСАСАСТТСССТСТСТ6ТСТСТ СТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТТТААССАТСТТААТСТТТАТ САТССАТТТСТСТССААТССАСССССАТТСССААТТСТАААТТТТТСТТА ТТССТААССАТТТСТССАТТССТТТАССАСССААСТССТССТССААСТАА [А/Т]

ТСААССАСАТТТТТСТССААТСАТТССААААТСТАССТСТТТСТААААА ССТСТСТАААТТАТТСАТТСАСТТТТАТТТТССАСАСТТСТСТСАСССТА ААСТСТТТТССАТСАСАССАААСТТССССССАССТСТАТТТСТССССССА ТТСССТССАСТСТССТТСАСТТТТСТСТАТТСТСТТТТСТАССААСТТСТС >гз838096

АТССССАСАСАСАААААТАСАААТСТАССААТТАСАТСТСТСТСССТАТА АСТСАССТТТТАААССАТСАТТТСАСАСТСССАТССТСТССССТСТСТСС

- 91 019953

ССТСАССТСАССТСТСССАСССТАССССТ6ССАТАССААААСССАССТСС САТСАССТСССССТТССТ6САССССАСССССАСТААСААТСААСССТАСС [А/С] СТТСТАССАТАССССССАССССТССАТТТССАСАААСАСССТСАСААТС АСССССТ6САААСТАТСАСТТ66АССАССТСАСТ6АССАСАСАСААААСТ СААССАСААСАААССАСААСАСАССАСАСТСТССТССТСАСТСССТСАСТ СССТСТТАСТСАСАТССТСАССААТСАСССАСАСАСССТССССАССССАСА >гз838092

САТТТСССТСАССССТААТСАТССТСААСАТСТТТТСАТСТССАТТТ6ТА ТАТСТТТТТТССАСААСТСТСТТТТССАСТСТТТТССССАСТТТАТСТАС СТТСТТТ6ТСТТТТТААТАСССАССТСТААСАСТТСТТСАСАТАТТТАСА ААСАССТССССТТАТСАСТТАТАТ6АТТТССТСААСТТТТСТССАТТСТС [А/Т]

СТТСССТТТССАСТТТСТССАТССТСТССТСТТТССАТТТССТСАССАС ССААТТАССАССАССТСССССССТТТААСАССТСАССАСССАСАСАСАСА 6С6СССАСААА6ТССТСАССАТСА6АСААСА6ССА6А0СТТАСАСАААСС СТСТСТСААААСТ6ААСАТССАССССАСССАССТТССС6ТСАТСССТСССС >гз838090

ТСАСССТССССАСТАССТСССАТТАСАСССАССТСССААСАСАСССАССТ ААТТТТТСТАТТТТТАСТАСАСАТССССТАТСАССАТСТТССССАСССТС ТСТССААСААТТТАТСТТТТСАСТТСТСССТТССТСАССССТССТССТСС СТСТССССАСАТАСТССТТСАСССАСССАСАТССАСТСТТСАТСССТССТ [С/Т]

ССАСТСТССССТАТСТТССССССССТТТССТСААТССАССССССТСТТТ СТСАА6СССТТТТСТТССССТСАСТСТСААТТССТСАААСТТССССТСАС ССССАССТССТССАССААТССТСССАСТССССССТСТСССААСТСАСТАС ССТТСТСАССАСАССТТАААСАСТТТАСТССАСТСССТСССССТСССАТСС >гз12467944 ____

ААСАСССССССТАСССАССАСТАСААСССАССАТТАСААССТСССАТТТТ ССТСТТССАСАСТССАТТТТССТСССААСАСААССТТТССАССТССТТАА ССТТТАСТТТССАТТТАТССТАССССТСААААССАСССАСССТТАССАСС АТААСТСТАССАСТТТТСАТАССАСССТАСАСТССТССССАТСАААССС6 [С/Т]

ТТССАССТСАССТССТССА6САССТССТСТТАСАСААСССАСССАСА6А 6ССССАСССАССТССТАТСТСССАСССССАСТТАССС6САСАССТСССАС САССТССССТССССТССАССС6ССТССАТАТСАССТСССТССААСССАСС АСАТСССААСТСАССТТСТСАССААСАСССТСААСССССАССССТСССААТ >гз10196144

САСТТСССССТССССАССАСАССАСААСАСССАТТТСААТТСАССТСССС ССАААТТССАСАТССТССССТСССАССССТСАССССАТСТССААСССТСС ТССССТСАСАТААСТСТСАСССАССТСТТСАТССТССТТСССССССССТС ААССС6ТСССТССАСССТСТТСТССССТСССТССАССТССССССТАСТСС [С/Т]

СССАСС6АССТТСАТТТСТСТТСССАСССАСТСТТТССТТАСТСАТТАС ТСААТССССТТТССТСССТССТТАТСАТСТССТСАССАСТ6ТТСТААСТС СТТТАСАСААТТ6АСТТАТТТАСТССТАСААССТССССАТААС6СААСТС СТСССАТССТСТСССТТТТАТАССТСАСААААСТСАСССАСАСАТАССТСС >Г5672866О АСССССАСТСССТССАСАСССССССТССТССАСССАССАСССТТСАСТАС ССАССТССТССАСАССССССТССССТССАСТСАСТАТАССАТСССТСАСС АССССССТТСТСАССТАСААААТСТАССССАССАСССАССАААСССТССС АСААССАСССАСААААТАСТСТСТССТАТТСАСАСССТСССТСТСССТСС [С/Т]

- 92 019953

СТСА6ТСТСТТССССССТСССТ6САТСТСТСТССАССАСТСССАССССС АТСТСТССАСТСССАААССАТСАТССССАСААААССААССССТСАСАСТС ТСА6СТСАСССААТСССТСТТАТССТСТСАСАСССАСССССАТСТТТСАА ААССАТСТТАААСАТСАССААСАСССТААС6ААСТТТСССАТССТСССАСА >Г51О188946

АТААТАСССАТССТААСААТАААТАТАААТСССТААТТТТСАТССАСТСС ТСССАССАТССТСТТТТТСАТАТСТТАТСАТААСТААТССТССАТСАСТС СААААТТССАТТТТАСАСААСАССАААТТСТСССТСАААСАСАТТААТСА ТСТТАСТСААААТТССАТАССТССТААСТТСССАТТТСААСССАСТТССТ [А/С]

ТССАТСТСАААСССАТСТТСТТТСТССТАТССТААСАСССТТТССТАСА СС6САА6САС6ААААССТТСАТС6СТТТТТССТАТТТССАСССААСААС6 АСАСАСАСТТСССТТТТА6ААТТ6САСТСАСААС6АССАААСТААСАСАС ТТАТСТАССССССССТСАССААСССАСССАТСТСТСАААТТТТАТССТАТТ >гз895406 АССАССААТАССАСТТТССААССТСТСААССТСТССТССССТСССССТТС СААССССА6АССААТСАССТСТССССАТТТАСАССАСАСТАТСССАСССА АСТСТТСАСАССТСАСАССАСААССССАСАТСАСССТ6СС6АСССАСТСТ АССТССАТАСТСАСССТТСТАССАТТАТСССААССАСАСТССССТСАСТС [А/С]

АТСТТТТСАССАСТСАСАТССТСАСАТСАСАСТТТСАСАССАТССТСТС ССАСССАТСТССАСАТСТАССТТССССТ6ААССТААТА6САСААСССССТ СААССТААСА66АСААСАСТСТССАССТТАААСАТТТСТТТСАТСТТСАТ СТТТСА6ТТТСАТСТТ6АААТСТСТАТТТССАСССАААТАСАСААССАААТ >гз708675 ТССАССТСТ6АСТССССТАТСААСТАСТСТСТААСАААААТААТАААААА СТАТТТАСААААТССААСАСАТТАСАСАСССАССТАТССССААСТААССС САТАСТСТСССССАССТТААСАСАССТАСССТТТТСААССАССААТАССА СТТТССААССТСТСААССТСТССТССССТ6С6ССТТССААССССАСАССА [А/С] ТСАССТСТССССАТТТАСАССАСАСТАТСССАСССААСТСТТСАСАССТ САСАССАСААССССАСАТСАСССТССССАС6САСТСТАССТССАТАСТСА СССТТСТАССАТТАТСССААССАСАСТССССТСАСТССАТСТТТТСАССА 6ТСАСАТССТСАСАТСАСАСТТТСАСАССАТССТСТСССАСССАТСТССАС >гз1867856 ССАТАСТСТССТСТАААТССССАСАССТСАТТССТСТССССТТССААССС ССАССССАССАСАССТТ6АСАССТТССАААСТССТАТТССТССТТСАААА СССТАССТСТСТТААССТСССССАСАСТАТССССТТАСТТССССАТАССТ СССТСТ6ТААТСТСТТ6САТТТТ6ТАААТАС1 1111 ГАТТАТН I I СТТА [С/Т]

АСАСТАСТТСАТАССССАСТСАСАССТССАТСАСТСССТСТТСТАСАСС ТТССССТССАТССТТССТААСАСАССТТСАСАСТССАТССТСАСТСАСТС АСТСАТТТТТАААТТССССАССАСАСАСССААТАТСАСССАТСТТААСАС САСТССАССТАСАССТТССАССААСААСТАСТСТААСТСССТТССТСССАС >гз12711924 ССТСАТСССАССТСТССАТСТСТТАССТАСАТСТСАССТТСССАААСТСА ТТТСАТСТТТСТСССТСАТТТССТССАТСТСТААААТС6ССТААТАСТСА ТСТСТАСТТТСТССС6ТССТТТТСАССАТТССАТ6АСТТААТСССТ6АСА ААС6СТТАТСАСАСАСССАССТАСССТСАССТССАСТСТСАССССССССС [А/С] .

ТСТТСТСТТТСТТСТСТССТТСАТСАТТССССТССССССССАССАСССТ ТТСССАСАСТСТТСАТССТТТТССТТССАТССАТСТСАССТСТТССССАА СААСАСССАССТСТС6СТС6А6САССАССТСТСССССАТССАСАТСТАСС

- 93 019953

ТСТСССТСССАСТССТС6СССТССССАССТТСТСССТССТСССССТ6АССТ >Г51867749

ССАСТСАСССАСАСТСАСАСССТААТССТСТТАССТААТССАААТТААТТ

ССТССТСАССАСССАТССТТСАСАТССАТТССААСААСАСАСАСТТСТАС СССТСТСТТТТТТАААСТСТСТСТСССТСТСААТСТСССТСССТСТССТС АТСТСАСААССТСССТССАС6АССССТСАТСССТСАСАСАТСТТАССАТА [С/С]

САСААССССААСААТТТТАТТТАТСТ6ССАСТААТССССАТСТСТСТСА ТАСССАААТСТАССАТТТТССТСТТСССАССТССАСТАТССССССТССАТ С6ТТТАТССАСААТТАААССАСАСТССАСССТССТССССТСАССАСАААС ССССТСССТТААССАСССАТАСАТТАСАТССССТСССТСТСССТСССАСАС >гз838073

ТССТССААСАСССТСАСТТТАСАССССТСАААААТССАСТТААТСССТТА САСССАТТТТАТСАСССАСАСТААСАСАТТАТСТСТСАААСАААААТААА ААССАТТТТССТАТТАТТСТТАСССТАТСТССССАСАТТТССАТТАТСТС ТСАСТААССТАССААССАСССАТТТСТСАСТТСАСТАССАСАСАСТСАСА [С/Т]

АСАССССААССААССССААСССТСССССТААААСТССТССАСТСАСТСТ ТТССАААСТСССССАСАСТСАСТАСТСССТСАТССААТТСАТТССАТССА ТСАСААССАССАТТТТАААААТСАААТААААТАСААТСАСАААСААААСА СТССАСТСТТТТССАТССТСТССССАТАСТТТТТСАСТТАТАТССААТТСС >гз838069 ' .

СТСАССТСАТСАТСССССТСССТСССССТТССАААСТССТСССАТТАТАС СССТСАСССАССССАСССАСССТТССТТТССТАТТТТТТТСТТАТТСТТТ ТССТТТССТТТСССТТСТССТААСТСТТТСААТТСАСССАСТТТТААСТС ССТСТТАСАТАТТАСАСТССААААТАСТССАСТСАСАССАССТСАССТСС [А/С]

СА6АААААТСАСССТТСАССТТТТАСААССТААСТТСТТТСССАСАСТТ

АСАССААСТСССТСТСАССТТССССАСТССАСССАССТСССТСАААТААТ

САСААСАССАСССТСАССССАССТТСАТСАССААТТСТССАААСССССТТ ТСТССССТА6ТААТТСАССАССА6САС6АССТАСААС6АССТСССТ6ТТТС >гз3731603

ТССТ6ТСССССССССССТССТСТТСССТСТТСТССТТТССС6САССАССА ТТТТАССТТТСТАССТТТССТССААААСТТССТССССАСТСТТТТСААСТ СТААТСССССАТСАССАССААСТТССА6ССАСТ6ТССТТТТСТСССТССТ СТСССАСАССАСАТТТССАСТССССААТАТТТТТССТСАССАСТСАСТТС [С/Т]

ТСААСАСАСТССТТСАССССАСССАССССТСААСТСТСАСССССССССА ССТТТАСТСССТАСАСТСТТТТСТСТТССТСТСССССТТССССТСАТТТС ТАААСССТСТССТСТАССССТТССТСССАСТСАТТСАААСТСААСАТССА ААСССТ6АСАА6ССАСАСТССТТТАААССАСССТСАТССССАССТТАААСС

Таблица 27. Последовательности, фланкирующие г§13387042 и сцепленные ОНП маркеры НарМар с г²> 0,2 >Г513387042

СТСССАТСССААССТАТАСССТСАААТСССАССТСТСАТСАТТССТАССТ ТТСАССТТТСАССТТСАТТТСТТААСТССТСТСАССТТТССТССССТССТ СТТСААААТСССААТСАССАССАТСТСТАССТСССТСТТТТСТТССАСТС ААТАССТАСАТСААСААСАССТАААССАСААСАСАААСААСССАААТССА [А/С]

ССТАСАСАААССААССАТТТССТТСТТСААТССААТСТТССТТСААТСТ

- 94 019953

ТССТТСАССАСАСТАСТС6АТСТСССТСТСССАСССАТСТТСАСАСТССТ СССТС1 ΙΤΊΊ I I ΙΟΙ I I I I I I I I I I I I I I I I I I IСТСАТССАСТСТСАСТ СТСТСАСССАСАСТССААТССАСТССТСССАТСТССССТСАСТССААССТС >[51882419

АСССАТС6СССТСАСАСАААСТССААСААССАССАСССТСАА6ТАСААСС ТААСТСАСССАССАСАСААААТААТТСТСТСААСТТААСТААТТТССТСС ТСТТСТСТССТААСТСАСАТСТСССТССТСССТСТССТТАССТСТТССТТ СААААА6СААТСААТСТТТТСТААСТСТАССТАССССТАСТТСТТСАССА [С/Т] СТСТСТС6СТСССТ6СТТСССАСССА6ССАТ6А6АС6АтеСТСТССТСТ СССАСТСССАСССТТСТССТАААСААТССАСССТСАСАААСАСТСТААСА ТТСАТАТТСАССАТСТТССАСТТССТССССААСССТААСАААСТСАТТТА АТСТТТАТТАСССТСССТТТССССТТСТСТААТАСТАССТСССТСАСАССС >[52252488 АСАСАТССТСАСССССТСАСАСССТСТСТСТССССАТТСАССТТТССССТ СТТСТСТССССАСАСТССАТССТСТААСТАСТСАССАСАТСТСТТАСААТ ССАСАССССАСАСАСТТАТССТСТСТСТССССАТСССС6ААТААССТСТС САСАААТСТСТТСАССТСТАААТССТТСАССАСАС6АССАССТСАСАССА [С/Т] СААТССАСАССССАСТССАСССАТСТССАССАТСААССАСАСССССАТС АСТСАСТТССАССАСАСТССАСТССТССССССТССТТСТАСАСАААТССС СТСААСТССТССАТАСАТССТАААТСТССТТАСТТСТСТТСАТТАСАААС АСАСТС6ААССТСАССТССАТССАСАТТААААСССТААССТСТАСАСТААТ >[52272525 ССАСССТССТСАСССТТААСАСАСССТСТСАТСАТСТСАААССТТТССАС АССТТТАТССАТААСААААТААСАССАААТТТТАТТТСАААСТАССАТСА АСТ6АТАТСССААСТСАСТТСААСАССАТСАСТАТТТТСТ6СТТСТСТТТ ТСТАСТТАСТТТТСАССТ6САССССССАТСТ6СААААТАССАСАААССАА [А/С]

АСТСАСТСАСАССААСТСТСССАТТСТСААССССАСАССАСТТТСТТСС ТССТТСССТСАААСАСАСТСАСТСТСТСТСАСТСТСТТСТСТТТСТСТСТ СТСТТТТТТСТСТТТСТТТСТСТСТСТСТСТСТСАССТССТСССССАСТС ТССАСАСАСТСТСААААССАТТСАССТАСАССААСТАССАСАСААТССААТ >[•54396687

ТТТССААССАСТТААССАААСАСАСТСААСТССТСТСТТТТССТТСТТТС ССТАТАТТТТТСААААТСТСТСТТСТТСТТТССТТТСАТТТАСАТТТТАС ССТТ6ТТТАТССАССТТТТССТСТТССТТСАААССТСТАСАССТСССТСС СТСССТСТТСТТАССССАСТТТТСАСАААССАСТТТССААССССАТССТС [С/С] ₍

АААССССАСССТСТСТСТССА6СССТССААСАСАСТТСТСААА6ААСАС СССТТССАССАТТСТСТСТТСТСТСТТТТСТСААСТССТСАААСАСТСАС АСАСТАСАСААТССТССАСАССССТТСС6АСАТАСТССААСТТТАСС6ТС 6ССАСС6ААТССТССАТТСТ66СТСТССАСАТАТТТСТТСТТССТТТАС6А >Г512614767 АСААСААААСССАСТСААСТСТСТ6СССТТТТТАААСТССТ6СТСССССС ССАТТАССАСАТАСССАСААССТСТСААСАТТССАААСАСТСТССТТТТС ТТТТСАСАСАТТАСАСТССААСАААА6АААСТСТАСТСТАТААСАСАССС ССТСТСТСААААТТТААСААСАТАААТАТТССССАААТСААСТТ6ТТТСТ [С/Т]

ТССТССТАТСТСААССТСССААТССАСАААТАТСТСАААААСТСААСАА ТТСАА6ССАТТАСТСАСАСАСАССАТССТАТ6ССАТССТ6АТССААААСА АСТАСАССТСТАССТТТТСССТТТСАСССССАААССССААААСАСТССАС ААТАТТСССССА6ССААССССССТСААТАССТСАССАСАССТССААСААСА

- 95 019953 >Γδ4571035

АААСССТТТСССАСТАСТССАССССТСТССТСССАААСТССТАСАСССАА ТТАСТСТСАААТАТССААСАААСАСССАСАТСТСААА6СССАСТ6СТСТС ТТСТТСТССТСАСАТСССТСАССАТСТСААССТСАСССТАСТАСАСССАТ Т6СТГТАССАТА6ТА6СААСТСАСС6ААТАТСТСТ66ААСТССАТТССТС [С/Т]

СААСТТССАСАСТТССТТТАТСССТССТА6АСССТСТСАСТАСТТАСАС ССАСАСАСТССТАТАСАТАСААСАААССТАСАСАСААССАССТСТСАСАС ТПТАТТТТАТАСАТССАСААССАААССССТСАААТССТС6АСТСАТТТС СТССССТССТАСАСТСАТТСТСАСААСТТАСАТТСТСАСАТССССТТСАТА >Г51О195963

САСААССААСССТТТСАСТТСАСТСТТТСАСТТСААСТСААСТССАТТТТ ССТСТТАСАСАСТАССССАСТССТТСТСАСАСТСААССААССАССАААСТ СССТС6АССАССССТСТАААТСААССАТССТААСССССАССТСАСАСАСА [С/Т] ТСАТССАСТАССТСССАССААТСТССАТСТТАААССАССТСТССАССТС АТТСТСАТССАССТСССССТТССАССАТССТТТСАСАААСТАТАТСТТСТ АТСССТССААСТСТСССТССАСААСАСССТСАСАТСССТСТТССАТССТТ ТСАССАТТТСССССТССАСАСТАСТСССТСАССТСССТСТТСТТСССАССА >гз10207736 ТСТСТААССССССТТТСАТСТССТТАТААТСААТСССАТТССТТСТСТАТ АСТТСССТАСАТТААТАСАСААСААТССААТАТТСТССТТАТССАААССС ТАССТАСАТТСССАСССАССАТСААСССАСТТТТТСТТСТТТСТССАТСТ СТАСССТСАТТАССАААСАТСТСТААТТАТТСТСАСТСССААССССАСТС [А/Т]

САТСАТТТТАТТСТТТТТССАСТАТСТАТССАСССААСССТСССАААСС СТТААСССАТССССТ6СС6ТСТАССАТСТСАССАССАТТТССААСТАТСС СССССАТАСТТТТСССАССТССТ6САТТТТСТССССАССТССТССАССАТ ААТТСАТСТССТТ6ТАТСАСТТТАССАСАААСАССССССАСТТСССТСТАА >Г512464018 СССАААТТТСАСТАТАСАТАСААСССТТААТТСААААТСАТАТААТСТСА АСАТТТССТАТААСАААТТАТТТАТСТСССАСААТАТАТАСТСАСАСАТ6 ТСААААТ666ТСТА6АСАСТАСАСААТ6САСССААТТАТССАСАСАСТСА 66СССАА6ССАСААТАСТТТТААСТААТСАТССССТСААСТСССАТТТСС [А/С]

ТАСТСТТААССССААААССАТТСССТССААССАТТСТАТААССАААССС ТСАССТАТСААААСААСТТТТААААТТСАСАТТСААААСАТААСАТСААС ААСАССТССССТТТССТТТССССАСТАССТСТСТТСТТСААААСТТССТТ 6ТСААТАТТТССТТТТСССАТТААТСТААТСАСАТТСТАААТАТААСАССС >Г510932689 СССТССААТТАТ6СТТССАСТСААСААСССТАСТСТААССТАТССААТТС СССТССТТСТТСАСТАСТТТСААСТСТАААСАААТАТСТСАССАТТАТСС СТАСААССАСССТТТАССССТТТТААСТТСААТАСТСТТСАССТСААСАА ААТССАТТААТСТССАСТТТТАТТСТТСА6ТТАССТТТСАААТСТАСАТТ [С/Т]

ССАСААТААТТАСТТТСССАТСТТТСААТТТТСТТТСАТСССТТТСТСТ ТСТАТСААССССАСАТСССТАСТТТАТССАТТТТССААТТТАСССТАСАА СТССААТСТССТСТССАТТССАССАСАСАСССТСТТТССТАТССАТТТТТ ААСАСТААААТТТТСАСААААТАСТТАААТТАААААСАТАСАТТТССАААС >Г512613030 ТТАААТТАААААСАТАСАТТТССАААССАТАТССААААТСТТССТТТСАА

- 96 019953

СТТСТТАТТСТССАСААТТССТССАСТССССАСААСССАТССССААСТАС

АСАТТССТТССАСТСССАССТССАААССААТССТССТССССАСТСТТССТ АТТАССТСССААСАССААТСАСТСССССССАТААТАСАСССАСССТСАТТ [А/6]

ТААААСАТСАТТАСАААССАТСАААТТААСТССТАТТААТСАААСССАС АААСАССТСАТТСАССАССТССААТСССТСССАТССААСАТАСАСССТТС ААТААТССТАССАСССТСССТТТССААТТАСААААСТСССАСАССААТСС ТАСТТСТССТАТСААТССАТТССААСТСАСТССССААСТТСТТССТСАСТС >гз2888450

САСАТСТСААТСССТСТТАТССТАСССТСТТССТСАССТСТАССТАСААС ААСАССААСССАСАССССССТССТТТТСАСААТССТААТССТТСССАССА ТТСТТСТССТССАССССАТСААСТАТАСТССТССАСААССАССАСССТСТ СТСАСТСССТААССТСАТССТТССТСАСТСАССТСТСТСТТАСТАССАСТ [А/Т]

ССТСССАТССТАССТАССТТТССТСССТСААСТСССТТСАСАТСТТААА АСССТТТСААСССТТТСТСТААТТААСАТССАСАААССАТАТАСТСАТТТ ТТАТТТТСАССАССАТСТАТСТСАСССССТАТТТТАТСССАТССАААССА ТСТСАТТТТТАТТТСААТТСТСТСТСТТСТААСТТТАААТСАСССТСАААТ >гэ4254482

ТТТТССССТТТСТСАСТТАССТТТТААТТТТССТСАТАААТТАСТТТТАА

СТТАСАСАТАСТААТАТТТТТСАААССТТАСАТТСАТСАСТСТТТСТАТТ

СТТАААААСАСТСТТТАТТСТТАТАСТТТТАААСТАССТТТТССАСТССТ АСТСАСАТАСТТТСАСАТАТААТАСТТСТСТАСТТТССТССТСААТТААТ [А/С]

СССАТТТАТТТТСССАТАТССТСТСААСТААСААССТАААТТСТТТТТС ТТТТСТСТССАТСАТСААТСАТСТСТТАСАСТСТТАААТАААСТАСТСТТ ТТССТТСТССТТТССАСАСССАТТТААССТАССССАСТСТТСАСАТССТС АСАСААААСТТТТСАТСАСАААСТСТСААСАССАСААТТАТАСТСТАТСАА >гз2372932 ТТАССТТТТААТТТТССТСАТАААТТАСТТТТААСТТАСАСАТАСТААТА

ТТТТТСАААССТТАСАТТСАТСАСТСТТТСТАТТСТТАААААСАСТСТТТ

АТТСТТАТАСТТТТАААСТАССТТТТССАСТССТАСТСАСАТАСТТТСАС АТАТААТАСТТСТСТАСТТТССТССТСААТТААТССССАТТТАТТТТССС [А/С]

ТАТССТСТСААСТААСААССТАААТТСТТТТТСТТТТСТСТССАТСАТС ААТСАТСТСТТАСАСТСТТАААТАААСТАСТСТТТТССТТСТССТТТССА САСССАТТТААССТАССССАСТСТТСАСАТССТСАСАСААААСТТТТСАТ САСАААСТСТСААСАССАСААТТАТАСТСТАТСААТССАССТТАААТТАСА >гз4255939 ТСАТСАТССАТАТАСАТСАТСТСАААААТТТСССТАТААСТСААСААТТТ

ТАСТААТТТАААСАТТТСАСААТТТАААТААТСАААТАТСТСАТАСАТТС

ААТТССАААТТТССТТСАСАТСАССТСАСТТСТТААТТССАСТТСАСТСА ТАААСАТТТСССТТААААТСТСТАСААТСТАААССАСССТАТАССТАСТА [С/Т]

СССАСТААСАСАТСАТТТСТССААТСААССССССТТТТСАСТСТТСАСС АСАТСТТТАТСАСТССАТССССАААТСССССААССАСТАТССТТСТСССТ ТСССТТАТТТСТТСТТААСССАСАТССАСТТССТТТСТТТСТСССТСССА СТСТССАССАТААСТССССТСССТССССАСАТАААСТСТСАСААССССАСС >гз10192415

ТТСТТТАТТСТАТССАСТАТААСАТАСТССААСАТСТАТАТАТАСАСАТА ТАТАСАТАТАСАААССАТСТАТАСАТСТАСАСАТСТАТАТАТАСАТАТАТ АТАТАСАСАСАССТАТАТАСТСТАСТТСААТСАТСТАТАТТАААТТСТСА ТААТАТСАСАТТАССАСАТСТТСАТСССАТТСТТСТААТСТСССТСАААТ

- 97 019953 [С/Т] САТСААААСАСАТССАСТССТСТСССТСАТСТТСТСТСАСССАСТ6САТ ТСТСССТСССАСТСАТСАТСААТТАСТТТТАТААААСТТСАССААТСАСТ ТСТТССТТТССССААААСАААТТТАААССАААСАТТАТТААТ6ТСАААСТ ТАСАСАТТТТССТТТСТССААТСААСТТТТТТАТТТТАААААТТСАСААТА >гз7595393

САСССТССАСССТСТССТТССТСТСССТСССТССССАСССТСАССАССАС СССССТССТССТАСАССАСТСССТТАСТСАСТССТСТАСАТСТТССАССА САСАСАСТСССТСССТТСТСААССССССАСССССАСССССТТСТСАССТС АТТТССССССТТАСАТСАССТССТАССТСТСТССАСАТССАССТСТСТТТ [С/С] '

ССАССАСТСССТТССТТТТССТССТСССССАСТССАТТТААТСАСТСТС АТААСАССАААСАААСАСССААССТСАТТССТСССАТТССТСТСААТСТТ САССАССААААТАТСТТСААТТСССТСССТСТССССАСССААСАТССССТ СТТССАСТССТАССТСТСССТСАСТССАСАТСАСССААСАСССАССААССА >гз2372935 СССАСССТААТСТСТАСТТТТААААССАСТТТТСАААТАСТТСАТСТТСТ ТТААТСТТСТТСССАСТТСТСТАААСТСТСААССАТТСТАСАААСТТААС ТСТСАТТАТТАТАТТССААСССАСССТТТТСАСАССАСААТССТСААССА САТАССССТТТССТСССТТСТССССАТАТААССТТСТССАТСССААСССА [С/С]

САААССАТТТТСАТСАСАСТСССАСАСССААСААААССТСАСТСССАСТ АТАСАТТСТТСТССАСТТСАСТСССААСТТСТСССАСТТСАСТТСТСССТ ТААТСТТТССАСАТСТССАСАТСТАТАСССТСССТССАТСАСССААААТС ААТТСААСССТАААСАССТСАССТСССТСАССССАТСССААССАТССТСАТ >гз6733648

ТССАСАААССААСАССТТСАТТТССТСАСССТТСААСАСАССТСАТССТС АССТСТСТАААССТСАССАСАААСАССАСАСТСССАССТАТСААААСАСС АССАСАТСССАССССТТСААТТССТААТССТАТАСССАТАССТСАТТСТС ССАТССТССТСТССАСССССААСАСССССААСАСТСАТССТСААССТСТС [А/С]

АСААТСТТСАТСТСССТСТСТССТТТСАССТТСТТТАСАСТСТСАТТСА ТАСССТТССТТТТТТСТАТАССТССАСТАТТСССАТТСССАТСАТАСССА ТТТААССАСАССССАСТТССТССТСАССАТААССААТАТТСТСССААТСТ ТСТССТСАТССАТАТТССАТСАСААТАССТСТССАААТСАААСАСАССААС >гз6435957 САСАСАСАТССАСАСТСАСАСААСССАСССАССТАССТАСССАСААСААТ САССААСАААССАААССАСТТСАСАСТСССААТССАСАСААССАААССТС ТАСАТССТСТСАТСТССССТТТСТАТСТТСССТСАТССАСССТССТСАСА ТСТТССССТАСТССССАСТССАТТСТААСТТТСТСТССАТСААССТСССА [С/Т]

АТАААТАСАТСТСТАААССТСТААСТССТССССАТТСТСССТСАААТТТ ТАСТСАТСТСТАСАТТСТАССТАТСССАТТАААТСССТССАСАТТТТСТС ТТГТТСТСАСТСАССААТТАСААСААААСТТССТСАТАТАСТТАТСССТА ТСТТААААААТААТТТАТТТТААТААААТААТААТААСССААСАААААААС >Г56723О19 ТСАТТАТСТССАСАААССТТТТССАССТТССАСТСАСТССТТСАСТССАС ТТТТСI I I СП СI I ГП IСАТСТТСССТТАТТТТАСТТСССТТСТАТССС САТСАСТАТСАСССТСААССАААСАСАСАСАСССТССААТССАССАСССА САСАСАТТТССССТТСААСССААТСССССТТССТТССТСТСТСАССТТТС [С/Т]

СААСТТАТТСТАТТСССТААТТТТТССССАТТСТАТТАТСТТАТСТТАС АТСТТАТСТТТТСТТАСАТСАТАТТСТСТТАТАТТАСТАТСТТСТТСАТС

- 98 019953

СТСТТАТТАТАТТАТТААСАТТСАТСАСАТААТСТСТСТСАСАТТТСТАС САССТТТСТТСССАТАТТССААССАССААТАСАСТСААСАТАТАСТСТСТА >Г512614773 ССАСАТСТТТСТСАТССТССТСССАССАТТАСТССССАССССААССАТСТ СТТТСТТСААААТСАТССТССАТАСАТААСАСАССААССАААААСАТАСА ТСССТТСТТСААССССАСССТТССААТТССТАТСССАТТССТТТТАСТСС ССААССААСТСАСАТСССТСССАТСАСССАТССССТТАТССАТСАТСТАС [С/Т]

СТСССАССАСТТТТСТААСТАТСАТСАССССАСАСАТАСАСССАССССТ САССАТТАССААСАТТААТСССААТССТССАСАСТСТСТТТСТТСАТСТС ССАССАСАСССТТСТСТСААССССАСТАСАССТТСАСТССТТССАААААА ССАТССТССССТСАССТАССТАСАСАСАСТТСАТСАССТСТАТСАТСАСТС >Г517833842 ТААСТТАТАААТТСАСТАСААТССТААТААТСАСАТТААААТТТТТТАТА СТСАААТТСАТАСТСААСТТАТАТССААААААТААСААТААСТАСАСААА ТАТТААСАААТТААААСАСАССТАСААТСАААСАТТААСТСТСССТАААТ ТТААААСССАТТСТАААСТТТСТСТСАТТСААСТАСТААСААССТТСТСС [А/С] ТААСТССАААСАССААСТААТСАААТААААТАТСАТСТСАААСАСАССС АТАТССАТСТСААААТТТАСТАТАТААТАААААТССААСТТСТААТСАСТ ТСАТАСТСАТТССТТТАААСАСАТАСААТСАААТССАТАССТТАААССАТ АТААААСААТАААССТСАААТСТАТСАААСАТАСТАТАТАТАСААААТААА >гз10177578 ТСАСТАССТАААСТТТАСАААСААСАААТТТСААТСТТСАААААТАТТАТ САССА СТАДА СТСААААСССААСТСАССААСТССТАСААААТСТТТСТАТ АТАТАТСАСАСАТАААААСТТААТСТССССАААСТАТАААСААТТТТТСА ААТТСАСААТААССССААААССАААААССААТАТАААТССССААААСАТА [С/Т]

СТТСАТАТААТТТААСТССТСССТАААТАТАТАААААТАТСТТСААСТТ ТСАААТАТССТТАААСАТАТАААСАТАСАТТСАААТАТСТТТСТТСТААТ ААСАССААТСААААТТАААТАТААТСАСАТАССАТТПТСАССТАТСАСА АТССТААААСААТТТТТТТТАААСТСТТААСАСАСТСТТСАСАААССТСТС >Г5126233О4 АААААААААСТАТСААААААТСАТССССАТАТАТСАААААСАСТСАССАТ ССАСТСТСАССАССТСТТАТТССССААСТСТТССАААТТТСААСААСААА АТСААСААСССТТАСТТАСАСАТТААСАТСТТТСАСААААТААСААТССА ТСАСТССАСАСТСАТАТАААТТААТСАСТСААТАААТСААТАССТСАТТС [А/С]

СААСАААССАААССТТСТСТТСАСААТАСААТСССААТТААСАААТАСА АААССААСААТССАСТТАСААААСАСТТАСААСАСТАССАТТТТССАССА АТТАСААТААТААТТАСТТТАССТААСААТСАТСААТСССТСАТАСАТТТ АСССАСАСТСТТТСАТСАССААСТССАТАТТАСАТАСССТСАСАСТСТТТС >гзб716542

АСААСАССТТССССАСААССТСГТСАААТАТСТСААСТТСТСТТТТССАС ТАТССТСТТССАСССТСТАСТСАААААТССАТСАСТТТССАСТСАААСАС АТТССССТТССАТТТСТССТТСТАТССТАТАТТАССАСТТССАСТТСТТС ССАСТСТТАССТСААСАСАССАСССААТТСТТТТТТТАСАСТСАСТСАСА [А/С]

АСАССТСАССААСАААТСТСАСТСТСТТАТТТАТТСССАСССССТСТАТ СТТААСТТСТТСААССТАААСАССАСТССАТСТСААТТТАСАТТАТТТАС ССТСССАТСТСТССССААСАСАСАСАССТССАСАСАСАСАССАСССТССА АТТТСТТСАСТТТСТТССТСССССТСТАСТСТАТАСТТСАТССААССТСАТ

- 99 019953 >Г517777330

АСТСАССААСАТСТСТССААТТААСАТСАСАСАТТТТТТССАССАСАСАТ СТСТТТОССААТСТТАТСТААССТСТСАААСТТСТСССТТААААААССТА САТАТТТААТТСТСТСТСТААТТТТАССАСТТСАСАТАТССССАААСАСС АТТСАТСАТССАССАСССТТАААСАСТТСТТТТААСТААА6ААААТАТТС [А/С] САСССТСТССАСТАСТАСАСАТСТССАСАСАААСТСТСССАТТСТТТСС ТААСТСАТСССАТТТАТТАСАТТАССТТТССАТССААСААСССССААССС ССААСТСТСАССАТСТССТТТСАТССТССТТССТТТССАТТТТСАСТСТС СТСТСТТССАТТСТАТСТАССАААААССТАССТТТТСТАСССТСАСАТСТС >гз10211546 АТАТТТСТАСССТАСТТТАССТААСАТАСААСТТТСТАССТСАССАСТСТ ТССААТСАСТАСАСТСТААСССССАТСТАСТСАСАСАСТСССТССТТТТА ТААТТСАТССССААСАССА6ССТАТТССАТААСАСАТТСТТАССАСССАС АССАТТТТСТТСАСТАААТСААТССАТССАТСААССААТСАСАССАТТСТ [А/С]

ТТСТСТАААТАААСТТТССАССТСАСТТАСТСТТСТСТТСССТСТСАТС СТТАСАТСТТСТТТАТСТСТСАСТТСААСАТАТАТТССТСАААТССТТСС ТАССТССААСССАТСТССААСТТАТТААААТСАААТАСАТТТТССАССАТ САССТТСАСАААТТАТСАТСТАСТАССАСАСАТААТАТССАААТСАСТАТА >Г52372937

СААСТТАТТААААТСАААТАСАТТТТССАССАТСАССТТСАСАААТТАТС АТСТАСТАССАСАСАТААТАТССАААТСАСТАТААТАСТАСАСАСАСАСТ АААААССААААА6АААТСТТТССАСТТААТААТТАТТССАССАТТ6ТТСС ААААСТТТСААТТАТАСССААСТААСТТССАСТАСТААТААААСТСААТА [С/Т]

ССАТТСТАТССТТАСТССАТССТАААТАТАТТАТСТСАТТАТААТАТТТ АТСТТСАССТСТАТАСТАТСАТТСТАТСТАТТТТАССАСААССАААТТСА СССТСАСАСАССТТАААСААСТТССТСААССТСАСАСАСССАСТАССТСС ТАСААСАААСАСТССТАСАТТСТСАССТАСТССАТАТСТААССАСАТТТАТ >Г54315498 ТТСААТТАТАСССААСТААСТТССАСТАСТААТААААСТСААТАСССАТТ СТАТССТТАСТССАТССТАААТАТАТТАТСТСАТТАТААТАТТТАТСТТС АССТСТАТАСТАТСАТТСТАТСТАТТТТАССАСААССАААТТСАСССТСА САСАССТТАААСААСТТССТСААССТСАСАСАСССАСТАССТССТАСААС [А/С]

ААСАСТССТАСАТТСТСАССТАСТССАТАТСТААССАСАТТТАТТССТА САААТАТСТТСАТСТТ6САТТСАААТСТСССТСТССТТАТТТТССАТТТС СААСТААТТССАСТСТССССАСССАСАААААССААСССТСТСАТТАСТТС АААААССААТТААТСАСТТАААТТАСАТСААСТТАСТТТААСАСТСАССАА >Г512998806

ТАССТААСТСТТСАСАСАСАААСТССТАТТАССССТААСАТСТАССССАС САСТАСССССТТТСТАСАСАСАСААТССАСССАС6АСАСТТСТСАСАСАС СААТСААСССТТСАССТСТСАСАСАССАТСТС6ТАСАССАТССАСС6ТТС АСССАСТТССА6САСТТСССТАТССССАСАААТАСАСАССАССТСТСАСА [А/С] ССТСССССАТСССТСОАСАССТАСССАСССССССССТТССАААССССТТ ТАССТСТСАТССТ6ААССССТААСТССТСТТСТССАСААТТТ6САСАССС АСТСААССТТТТСААССАТССТААТСТТАССАТТСАСТТСААСТТТТАСА ААСТТТАСТСТТТТ6ССТСААСССТССССАСССААТААААСААСССАСАСТ >гз12465515 САССТАСТСАССАСССТСААСССССАСААТСССТТСААССТСССАССССС АССТТССАСТСАССТСА6ТТСССАССАСТССАССССАСССТССССААААА

- 100 019953

САСТСАААСТСТСТСТСАТААТАААТАААТА6АСТ6САСААС6АААТАСТ САТСССССТСАСААААСААТТТСАСАСАСАТТТСАСААСТАСТСАСАТАА [С/С] АТТТССТТАСТСАТТСААТАТС6АСТСТТАССАТААСССТСССАТССТС АТТТТССССААТСАСАААССТАСТСССТАСАССААААССАССССААСААА АСТССТССТСССАСССАСССАТСАСАААТТТССТССТ66ССАТСТТААСС ТССАССТССТСТСАССААСТССТСАТССТСАССАСАТСТТТ6ТСТССАСАС >гз4491709 АССТССТСТСАССААСТССТСАТССТСАССАСАТСТТТСТСТССАСАССА ССАСАСТСАТСТСССТСССАССТТТАСАТСТСССТССТТССАТСТССССС ТССТТСТТТСССТССТСССТСТТТСТТТСТТТССТАСТТССТТТСТТСТС ТС1 I I 1СН I I IСТСССТТСТТП 6АСААТСАААССТААСАСТСТТТАТА [С/Т] СТАСАС6САААААСТССАССТАСААСТТТААСАСАСАССАААСССАССА ААААТСТССТАСТСТСАСАТТССААССАССААСААСССССАССАТААССТ ССССАСАСССАТСССТСТТТТССТСАТТСССТТТАТСТСТСТТТСТСТСТ ССТССАТТСАТТСТССТАТССТТТТСТТССАСТТССТ6ТСТТСТССССТАТ >гз2372938 ССАТТСАТТСТССТАТССТТТТСТТССАСТТССТСТСТТСТССССТАТТТ СТАСАСААСССАСАСТСАААТААСС6СТ6ССАССТССССАТСТТТСТССА САСАТСТСТСТССАСААССАТТСАСССАТССАСАССТССАСАСАССТТСТ АСАСССТСТАСТАССТСААСТСАСАТТТТТТСССАТТТССАСАТТСТААС [С/С] СТТАСТСАСССССАСАТСССАССТТСТСАСАССАААААСССТСАССТСА СССАСАААСАТСТСССССССАССТАСАААССААТСАТСТСТАСТСССААС АССССАССТСТТТССССТСССТСААССААСАССАСАСАТТТССТТАССТС ТСССАТССАТСТССТААТСТССТАТСАССАСАСААТСААТСААССТССССС >Г512621130 САТСССССТСТСАСССАСТТТССАТТТССССАССССАСТ6САААСАССТА СТСАСТСССССАСТСССТТСТТТССАААСААСАСТСААСААСАСТССТТТ ССССТАССТССССССАСССССТССТСССССААСААТСТСАСААССАААТС САССССТСССТССТССАСТАСТТССАСТАССАААСААСССССТАТСТССА [А/С] САСТСССАСААСССАТССТАААСАТСССААСААСАААСАССАААТТТСА АААСАТАСААСТАСТААТТАААТСАААССАСТССТТААССАССССТТТСА ТААТТАСАТСАТСТТСТССТАСААТСАСААССААТАТТАСТСТСАСТТТС СССТССАТАТССАСАААСАТСССАСССАСССТСТСТСТСССТССАСССТСТ >гз13399995 ,

СААССАСАСТССАСССААССТСАСССТСТСТССАССТСААСАСССАСАТТ ТАСТТСТССТТСТСАССССАААТАТТСТСАТСТСТТАТСССТСТАСССАС СААААСАТСТТТССАСТААААСАСТАТАСАСААТТССТТАТТТСТААССА СТСААТТСССААТСТТТТТССТСАССТТСТСТСТСААСАСАСААССАТТС [С/Т] СССТСАССАСААССССТСТТСАСАСААСТАССААССАТСТАСТСТТТТС ТСАТТСАААТССССТТТССТАТТСАССТСССТСТССТССААСАААТССАА АСТСАСССТТСТТТСТАССТСТСССССААТАТТССАААААТССТСАТСАА СТСАСССТССТТССАТТТТАСАССТСАСААААССААСТСАСАТСАСАСТСТ >гз12052807 .

ТССТСТСАТСТСТСТССАССАСАСТСТССССТСССТТАССТТААСАСТАС СААТСТССТСАСАССТСССААСАААСТСААААСААСССАТСССАТСТССТ ТАТССССССССАСССАССССТТССССССАСАССТССААССССТСАСАТСА ССТТССТСТССАТСССТССТТСССАСА6СТССССТСАТАССАСАСТСССА [А/С]

- 101 019953

СТССТССТАТССССТССССТСТССССААСССССТАСААТСТТСТТССАС СССАСАСССССТССССТАСТСАССАССААААСААААСАТААССТСССССС АААСТСССТААТАСАССААТТАССАСАСАСССТТСТССССТААСССАТСС 6ТСССАССАСССССТССТАСААСТАСАСАСАСА6ТААСТСТСАССТСТСАА >гз10199394 ССАААСТСАТСТСАТТТССТАСТТСТССТАТАССТААССАТССАСАССАА АСССАААСАСАСТТТТСССАТСТССАТАААААТТСААААСТТТСССТСТС АТТААТСССТТССАСААТАТА6САТСТССТТСАААСТ6САСТССТСТССТ ТСАТСССТТСТСТТГАССТСААААТАТСТТТСААССССТАССТСАТССТА [С/Т]

СТТССССАТАССААСТТТССТТАТСАССТССАТСААТССТСТТТСТССС ТССАСТАСААТСТТСТСТТТТССТАСТССТСТТАСТСАСССТСААСТТАА АТТТАТСТСТАСТССТТТТААССССАСТАСССАСТАААССТТСТСААТАС АССТ6АТСАААТААСТСТСТССТАТСССАТ6ССАССТАСТАТАССАТТТАС >гз2372940 ААСТТАААТТТАТСТСТАСТССТТТТААССССАСТАСССАСТАААССТТС ТСААТАСАССТСАТСАААТААСТСТСТССТАТСССАТСССАССТАСТАТА ССАТТТАСТТССТАТАСТААТТАТТАТААТТАССАТТТАТТАСССССТТА СТАТСТССАААСТСССАТТАТТССАТТТАТТАТТСАСАААААТАТТТАСТ [С/Т]

ТСТАСТАТТСТСТААТТТАТТАСАТААССТААТАТАААТСТТТТТТСТТ ТТСАТТСТТССТАССТСАТТСААССАААТАСААТТСТССТСТССТАСТАС СССАТСТТСАСТСАСТСТТССТСАТТСТТААТАТТТССТТССАСТАССАТ ААССССССТССССТСТСТТСАТСАССССАССАССАСТСАСТТСАТСТСАТА >Г5458344О

ССТААТАТАААТСПТТТТСТТТГСАТТСТТССТАССТСАТТСААССААА ТАСААТТСТССТСТССТАСТАССССАТСТТСАСТСАСТСТТССТСАТТСТ ТААТАТТТССТТССАСТАССАТААССССССТССССТСТСТТСАТСАСССС АССАССАСТСАСТТСАТСТСАТАСАТТСССААСССААААТСТТАСССАСТ [С/С]

ССТТСТСАСТССТСТТТСТСТТССАСССАССССАТСТСТССАССАСАТА САСТСТССССТССТССТСТАССТСТССАСТТСТСАССССААСССТТТССС СТСТААСАСАССТТСТССТТСТССАСТСАССССТСТСАСТС6СААСАТАА ТТСТСТАСАСТССТСССАТТСАААТТТАСАААССССАСТТСССССАТААТТ >гз2372941

ТСТССТСТССТАСТАССССАТСТТСАСТСАСТСТТССТСАТТСТТААТАТ ТТССТТССАСТАССАТААССССССТССССТСТСТТСАТСАССССАССАСС АСТСАСТТСАТСТСАТАСАТТСССААСССААААТСТТАСССАСТСССТТС ТСАСТССТСТТТСТСТТССАСССАССССАТСТСТ6САССАСАТАСАСТСТ [С/С] СССТССТССТСТАССТСТССАСТТСТСАССССААСССТТТССССТСТАА 6АСАССТТСТССТТСТССАСТ6АССССТСТСАСТСССААСАТААТТСТСТ АСАСТССТСССАТТСАААГТТАСАААССССАСТТСССССАТААТТААССС АСАТТСАССАССТТТААСААТСАСАСАССТСАТАТТСА6ТТСТССА6ТСАТ >Г5б721811

ТАССАССТССТТСАТТАТСАТАТТСТАСАСАТТСААААТСААССТААСАС АССААССААСТТССССТАСССТАСССАСССААТАСССАССАААСТСТССА ТТТСААССТАСТССТСССТСАСТСССААССССТСТТСТТТСТСТСАСССТ ССАССАТССАТСАС6СТ6ССАТС6СССАСТТАААА6ТТ6АССС6ТАТСТС [С/Т]

АССАСАААСАТСА6АСАСАТСАССАТТСССТСТААССАСССАСАСАСАС СССАТТ6ТСТСТСАСССТССАСАСССАА6СТТССТАСАСАСАСАССАТСС САТСАСАТСАСТТСТСССТСАСТСТСССТССТТСАССТСТТТАССАТССС

- 102 019953

СТССАСААТСТСССААААТСАТССТСАТТССАААСАСАСАСАССАСАТТСА >Γδ12615418 ТАСАСАТССССТТТСТССАТСТТССТСАСССТСТТСТСАААСТССССАСС ТСАСАТСАТССАССТСССТСАСССТСССАААСТССТСССАТТАСАССТСТ САСССАССАСАСССССССААI I I I I I I I I I I I IААААТАТСССАТТАААА ТССТАТТТАТСТТСАСТАСТСАСТПТТССТТААССССТТАСАТТТТСТС [С/Т] ССААСАСАТСТСАСТСАТСТТАТССТАСССССАССАТСССТССССТТСТ СТСТТАААТТСАААТТТТТАААТТТТТСАТТССТСАСССТТСТСАСТТСТ ААААТАСАААТААТААТАССАТСТСССССАСАССССТСТССТСАСАСТСА ААТСТСТТАСТАСАССТСССТСАССТТСАТТТТСААСАССАССТАТТСССА >Г512621884

САСАСССССССААI I I I I I I I ΓΤΊΊ IААААТАТСССАТТААААТССТАТТ ТАТСТТСАСТАСТСАСТТТТТССТТААССССТТАСАТТТТСТССССААСА САТСТСАСТСАТСТТАТССТАСССССАССАТСССТССССТТСТСТСТТАА АТТСААА1 I I I ΙΑΑΑΙ I I I IСАТТССТСАСССТТСТСАСТТСТААААТАС [А/С] ААТААТААТАССАТСТСССССАСАССССТСТССТСАСАСТСАААТСТСТ ТАСТАСАССТСССТСАССТТСАТТТТСААСАССАССТАТТСССАСТААСТ ССТССТТААТСТТАСССАТТАТТСТТСССАТТССТСТТСТТАТТАСТСТС АСССАТСАТТСТСТСАСССААСАСАТССТТССАСААСАСААСТТСТССАТС >гз2372943 СТТСАСТСТСААТТТСТТСААСТТСССААСАТТАСАТСАСАССАСАССАС

СТССССССАССАССАТССААССТССТТТТАТСТАСААТТТАТТТСТТТСС СТТСССАТСССТТСТСССТСТТТСААТААСТССТССААТСССТСТАСАСА [А/С] АТАААТССАСТАСАССААСАСТТТТАСТСАТТТТТАААСААТСТТСТАС СССАААТАСАТСССТАТСТТТАСАТАСТССАСАААСТСААААААТТАТСС ТАСТСАСТСТССАААСТСТСТТТТТССАСАССТССАААААСТСАСАТСАА СТТССАТАТТТССААСТТССАТАТТСССТТСАТСССТТААССТАССАСССА >гз4522583 АТТТТТАААСААТСТТСТАССССАААТАСАТСССТАТСТТТАСАТАСТСС АСАААСТСААААААТТАТССТАСТСАСТСТССАААСТСТСТТТТТССАСА ССТССАААААСТСАСАТСААСТТССАТАТТТССААСТТССАТАТТСССТТ САТСССТТААССТАССАСССАСАССАТСССАСАТААААТТТССССАТААА [С/Т]

ТТСТСАТСССТССАТСТТССТССТААТТАСААТТАТСТАСТТССТААТС САТТААСТССАТССАТАСАТАСТСТСАСССССТСААССССААСАСАТСАС ТТСТАССССТССАСССАТССАССССТСАСССАСССТТСТСАТАТАСАТТС САСАААССТСТССТСТСТСТААААСАСАТСААСТССАССАСАТССТТСТТТ >гб2888451 СТАСАСТТТСССАААТСАСТААСАТСТАСАТСТСТСААТАСАТАТСТСТС АССААССАССАСССАССССАААТАССТССТТССАССАССАСТТТСТССТС СССАССТСААТСТТСАССТТССТТСАССТААСССТТАССАСАССАСССТС САСАССТССТТТССТССАТСАТСТССТТТССССССССТСАСАСТАСААСТ [С/С] САССТССТСТСТАССТАССТСТСТССТССАСАСССТСССТСТССССТСС АСТСАТССССТСССТТСАСТССТСССТССТСТТСАСССТТССАССАССАС САТСААСТСАТССААТАСТСТССССАТССТССССТССАССТАСАСТТССТ ССТТСТСТАСТСААСАССССТСАСАССААСССТСТСТТАСАСССАСССТСТ >Г52270398 ,

- 103 019953

ТСАСАССАССАСАСАТСАТТТТСССТТААТТСТАТТСТ6ССТТСТААССС СТГТСТТАСАСТСТСТССТСАСТСТСТССТТАТСТСТТСССАТТССАТТС АТССАСАТССТТТАСССССАССТТСТССАССАТАСААСАТСАТСАСАСАС САСССАСССТАТССТСААТСАСТТСТСАСАССТССТААСТААСТТСТССС [С/Т] АСАТСААТСССТАСТСАССАСАТАССТАСТСАССААСССТАТССАСАСС ТСААААСТСАТАСССТСАСТТТСААСССАССССТТТСАААССАТССТССС АССССАААТААТСТАССТСАААСАСАССССТСТСССААСССТСССАССТС ССААССАТСАССССТСАСАААССАСССАССАСТССТССТСАССАСАТСАСС >Г513412666 ТАТТСССАСССТССССТССАССАССТСАСССТАСТАТССТТАСАСАААСС ААССТСССАТСССААССТАТАСССТСАААТСССАССТСТСАТСАТТССТА ССТТТСАССТТТСАССТТСАТТТСТТААСТССТСТСАССТТТССТССССТ ССТСТТСААААТСССААТСАССАССАТСТСТАССТСССТСТТТТСТТССА [А/С]

ТСААТАССТАСАТСААСААСАССТАААССАСААСАСАААСААСССАААТ ССААССТАСАСАААССААССАТТТССТТСТТСААТССААТСТТССТТСАА ТСТТССТТСАССАСАСТАСТССАТСТСССТСТСССАСССАТСТТСАСАСТ ССТСССТС 1111 ΙΊΊ IСI I I I ΙΤΠΊΊ I I I I ГТТП IСТСАТССАСТСТСА >гз13426489 СААСТСАТТСТССТСССТСАССТТСССААСТАСССАССАСТАСАСССАТА ТСССАТСАСАСССАССТААТТТТТСТАТТТТТАСТАСАСАСССССТТТСА ССАТСТТССССАССАТССТСТССАТТТСТТСАССТТСТСАТСТССССАСС ТСТСССТСССАААСТССТСССАТТАСАССТСТТАСССАССАСАССАСССТ [С/Т]

СТСТСТСТСТТТТТААТСААТАССААТАТСТАССАТАТТТАСТАСССАС ТАТАААСАААТТСТССТАСАААСАССТССТТАТТТТАСАСААСТТТСССА СТСАСТАСАААААТАТ6ССТАССССАСААССТСТСТССССТАСААААТАС СТССТСТСССТАСААТСАААТСССТАССТСТТСТТАССАТТСАТТАССАТТ >гз6713249

АТТАААССССТТССТТАТАСАТТАСССАСТСТСА6СТАСТТСТТТАТАСС АСТСТСААААСАСАСТААСАСАСТСТТААААСТАААТСТТАТТАСССАСС ТТТТАСАСАТТААСАААСТТААТАТТАСАТСААССААТТАСТТТАТАССА СТССАТСАТСТССССТСАААТСТССАСТСТСАТСАСТАТСААССТТТТСТ [С/С]

АСТСТАТСААСАСАСТТТТССТААСАААТСАТАА6АСАСААСТАСТТТС ТССААСТТААТСТАТТАТАСССАТААТТСАСТТСССТССАСССААААААА ТТАСАТСАААСАСАСТСТАСТСССТТТСТСТААААСАССАССТССАТТСС ТТТАССССТАТТСТААААСААТАСАССАТСТССТСАТАССТАССТААССТС >гз12620095 ССАТТТСТТССАААСАСАТТТТАСАТССАТТАТСССАТТТААТСТТТАСА СТАААСТАТААТАСТСТТАТТАССССАТТТТАААСААСАСААААСТСАСС САСАСТСАСАТТААССААТТСАТССАСТТТСТССТССААСТАСССТСССТ АССАТТСТААТСТССССАТТТСССАТСААССТСТССССТТААССАСТССА [С/С]

ТАТСТССТАТААССТССАССТСАСТТСАТССССССТААТТСААССАССС САСТСТССТСАТАТТААСАСАТСТСТСААСТСССТССТТТСТТТСТСАСА СААТТАТСТАТТТССТТАССТСААТСАСАССААТААТАСТТАТАССТССС АСТТАСТССАТ6ССТАСТТССТАССАТСТАССТССАСАСААССТТТТСАТТ >гз4621152 ССССТСАСССАСССССССТССТСССАТТССТСТАТТТАСТСТТААТАССС ТААСАСТССССАССТСАССАССАААТСТАСССАССТССАСССАСТСАССТ ССАССССССАСАТСТСТСАССТТСАСАААСАСАТТТТСТСТТСАТССТТТ

- 104 019953

ТТТТСАСТАТСАТСААСТАТТСТАСААСАСТСТСАТТСААССТТСТСАТА [С/Т] САСАТТСТААССАТТТАТАТААААСТСААААССТССТТСТСТТСАССАТ ТССААА0ТТСТТА6САСАААССТССАССАА6Т6ТСТСААТТСТТТССТСТ СТССТТСАСТАТССАТСТТССССТСССТСТТАСАСТТСАСАТАСААСАСС АААСАСАТСААТАСАСААТСАСАСАССТАСАСАААСТАССААСССТТСССА >Г512622764

ССТСТСАТСТССТСААТСССТСАССАСТССТТССТТСААСТТАСАТТАСА СТТТСАССТТТСТААСАТААСТССССТТСТСТСТСАТСААТСАААТСАСС САТАССТАСТТСССССАСАСТТАТСССАССТСССАТТТААССТСАСААСА ТССАТСТТСАСААССАСТССТСАСАСТТСАСААТТССТСАААССАСТАТТ [С/С] ТТССААСССТТСААТСТАССТТСТССАСТССАССАТСТССТСТСССААС ССТАСТАССАТСАТАТСААССТТСССТССАСАССТСССТТССААСТТТСТ САСАТАСССАТСАСССАСТСТТТСААТТТСТСАСААТСААСААСТАТСТС ССАССССААССССАТССААССТСАСССАТСТСААСССААТСАСАТСТТТТС >гз6723013 АСААСАСТССТТТСТСАСТСТСАТТСССТТТСТСАСТТССТТСССССТСС ТСТТССТСТСАСССТТСТСТСТСССАСТСАТССААААТСТСССТСССССА ТСТСССАССТТААСТОТССТТОТСААСССАСАССАТТСАСТСААСТТТСА ССАТССААСААТААТСАААТССАСТТТТАТССТТСАСАСАССССТССАСС [С/Т]

ТСАТСАТТТСАТТТСАТССТССТААСААСССТСССА6СТСА6А6АСАСТ ААССААСТТСТСТСАТАТСАСАТАСССАССАСТТСАСТССАССССАТСТС АТСССАССТТСТСТАССАССТСТССТССТССТСАТАСТАСАСТАААТААА АСАТААСТАСАСААСТАААТАТТТТСТАСАААСТААТСТССТАААААТСТ >гз2372945 САССАТТТТСТСТТССТААСТТСТСАТТТТСССТТААТСАТТАСААСАСА ССССАСАСТАААСОССАССТСАТСАССАСААСССТАСАТАСТТСТАТАСА ТСТСТСТССТТТТТТТСАСАССАСАСТТТСАТСААССААААТАСССАААС СТСТТТТААААСТАААСАССТТТТААСАСТАААСАААТТТААСААААААА [А/С]

САААААОААСТАААСАТССТТАССТСТССТСТТТССТСТССТТТТССАА ТСАСТСТСТСТСССТСТСТСАССТСАСТАТССТССАСАСТТТТСТТТТАС СТССАСССТТТСССТТСТАСССТТТСАСССТАСССССССССАСАСАОАСТ ТСАССССАССАСССАССАААСССТАТСТССАААСАССАТСТСТСААСАТТ >Г512694403 ТСАСТСТСТАССССТССТССССТСССААТССТСАССТССССССТАСАТТС АТССАСААСССАСССТСТТСТССТТСАТСАААСССССААТАССССТААТС ТСССАССТАТАСААТААААСССААССССАСАААСАСАСААСАААТААААС СААААССССТСТСТТСАССССАСТАСАТСАТАСАСТССТСТСССТССААС [А/С]

САСТАССАААСТТАТАСТСАСТССТТСАСТССАТТТССТСАААСАСТАТ ТСАТСТТСТТСАСТТТСТСАССТСАСТСТААСАССТСССТТСААСТТСТТ ТССТТСАСТАТТАТАТСССТАССТСАССАСААТСССТСССАСТТАСАССС ААССТСТСССАСТТСАССАССАТТСССААААТАСААСАААССАТТТСТТА >гз12613955 ТСАААТАТСССАСССАССТТАААТТАССАААССТССААСТСТСССАСААТ СААТАСССССТСТСТСА6ТСАСАСССААССАААСССТСТАСТСТСТСАТА СССААТССТТССАААСТАССАСТАССССССТАСТСТССТСАТСССТТСТС АТАТСТСААСААААОССАААААСТТСАТАТТТАТТТСАААТАТТСТСАТТ [С/Т]

ТАТАССТТССТСАТСААТТААААААСТААСАААТАСАСТТААСАААСАТ

- 105 019953

СТТТТААТССТТССАСАСАССАТССТТССТССССАТСТТТССССТТТСТС ТТТААТССААТТТССССТСССССАТААСАССССАСССТААССААААСТТС ТТТТСТСССТТТСТТТТАТАТТСТТТТТТАТССААТСТАСАСССАТТТТТ >гз11894340 СТССТТСТАТССТСТАТТСТАСТСАТТАААССАСАССАТСТСАСАСТСАА ССССАСАСАСТАСАСААСССАТАСТССТСССАТСССААСАСААССАТТАС САТСАТСССТТСАСССТТССТТСТТСАТАТТТСТТАСАСТТССТТТСТСА ССТАСАССАСССАСААССАСТТСССАСТТСТСАТАСССТССААТСССААС [А/С]

ААТСАСАССААТСААССААТТТТТАААААТТСААСТСАТГТСААСАСАС АСАСААААААТСАСАСААСТСАСТСААТТТСАСААСТСАААТТСТССТАС АСТТТТССССАСАСАСТАСААСССССАТСТТСАТСАСТАССААССАТАСА ТТСТСАСТСААТТССССАТСАААСТТТТТСТССТССТСТССССАТСТТСС >гз17778329 АТТСТСТТСССССААСССАСССТТСТСАСАСАСАССТСАСАСТССССАСС ААТСССАТСССТСССТТСТСССССАТСТСААТСССТТАСТСТТТСАТСТА АССААСАСАТСАССТССТССТСТТТСАСТТСССТТТССССТССТСССТСА ТТТСАСТТССТТСТСТСТССАСССТСТССССТСАТТТСССТССТСТСАСС [А/С] СТАТТСТТТТТСТСАСТТСААСАСТСАТССАСААААССТСАСТААТААС ССТТТТСТАТСАТТАТТТАСТТТССТААТТАТАТАТСТСТТТСССАТССС САСТССТТСААСАСАТСАААТТССАСТТСААСТААССССАСАСССААААС СААССССААСААСААСАААССАСТТСАСТССТСТСССТССАААСАТССАА >гз4442975 ААТТТТССТСАТСССАССТСТАСАСССТАААСТСТТСАТСАТАТСАТТТС ТСТАССТСССТССАСССАТСССТСААСТТТТСААТТАСТТ6АСССАСТАА АТТТССТТАТТСАТТТАААТСТТАСАСТТСАСТТТТСТСТСТТАТААСТС АААСАСТСАСАТСТСТТТАТАТТААСТССАССТСАСТААТАТАСТСТАТТ [С/Т]

СТТТССССАСССТТСТТСТССТТТТСТСАААТАССАСТСАТСАСАТАСТ ААСТССТССАТАССТСТАССАТАСАТААААСАССАААТСААСААССАССА ССАСАТАТССТСССТСАСССТТССАСТАТАА1 I I I I 1С11СА1III 1СТС АСТТТАТТТТСССТСТСАТСТАССААСТСАААТССАССТССТТСТАААСС >Г51О932693 .

ТТТАТТТТСССТСТСАТСТАССААСТСАААТССАССТССТТСТАААСССС ААТТТААСТСТСССТССТСАСССАСАТТТТСАСАТСТСАААТСАТСТСТА А6ТТТААСССАССАТСАТТССТСССТСТАСАСТСТСТСТСАСАСТТССТТ ТССААТАСТССТТТСАСААТСТАСАСССАСАСАССТААСТССАТТАСССА [С/С] ССССАСТССТТТТТТАТСААТССТАТТСААСАСАСТСААТССААССААТ ТСТСАССАСААСТСТТТТТССТСТСАТСТТТСАСССССТААСТТСАСАСТ АСААССААТСААТСАТСССТСААСТСССАСАААТСССТС6ССТТСССТСТ САТГТТТССТТСТССТССАСАТТТСААСАТСАСААТАТТСТТТТАААТТА >Г517778427

ТСАТССТСТТАТССАТААТСААССААСАТТТТАССАТАТТССАССТТАСА ТССАССТСТССССАССТТСТАТАСТСАСТСТСААСААСТСТАСТТТАТСТ АСТСТТТТТАСАССАТТТАТСССАТТТТССССАТТТСТСАААССААСАТС СТАСААСССАССССТСТТССААСААСТТССАССТАСАССАТТСАТАССАА [А/Т] АССТСАСАССТАСАААСССААСТСАСТТСТТСССАТССАСТСССТТТСС ССАСТСТААТТТААСАААССТСТТТТТТАСТТСТСТАААСТСАТСТССАТ ТССАСТТТТТТСТТССАСТСАТТСТААТТААСТССААССААТТСТТАТСА ТСАТТТАССАТТАТАСТТААААТАССССТСАААТТСТТТССАТТТССААТ

- 106 019953 >Γ517835044 ,

АААТАТТТСТСТТССТСАСТТСАСТСТАССАТСТААСТСАТАТААТССТА ТТАТАСССТТСТТТТССТТТТСАТТТАССТСАТАТСТТСТГТТТСТСАТС ТТТСТТАААСТСААСС6АССАТТТССТАТССТСАСАААААТТСТСААССС ТССААСТАСАССАТССТСТССТТТСТААСССАТАСАСАТССАССТАСААС [С/Т] СТСААТТТААТТСССААТСАТСТСАСССТТТТСТААСАСТСТТССТТАА СТТТСТТТСССАСТССАТСССААССААСТСАСТСАТССАТСААААТТТСТ СТТСТАСАСААСССАТАССТАСАСАСССАССАТТТССТТТАСТССАСАТС СТСАСТССТТСТСАТСССАСАСАТТССТТСТТАТТААТАТСССССТСССС >гз7562029 СААСАСТСАССАТТСТСТССССТТССССТССАСССТССАСТТСТСАССТС ААСАСАТААТТТАТСТСТСССАСААСАААСТАТАТСАСТТССААСААТСТ ТААА6АТСАА6ТССАССТТСТССТТ6ТАТТАТАТ66СТСТ6А6А6ССА6А 6АС6С6АССТ6АССТТСССАСААТ6Т6ААТСТССТАСАСССТАССТТАСА [А/6]

ТТСАТСТССААСТТАССТСТСААСТТСТАТСАСАСТАТССТССССТСТС ССТСАСААТССТТТСТСССАТСССАСАССАСССТСА6АС0ТАСАААССАС СТССАСАААСАСТСТСТСААССТАТТСАСТСТТССАТСАСААСААТТААТ СТТСААСТТСССТТТАСССССААСАТССАСТССАСАСАТСССТССАССТС >Г513000023 ТСССТСТ6АСА6ССАСАСАССССАССТСАССТТСССАСААТСТСААТСТС СТАСАСССТАССТТАСААТТСАТСТССААСТТАССТСТСААСТТСТАТСА САСТАТ6СТССССТСТСССТСАСААТ6СТТТСТСССАТ666АСА66АССС ТСАСА6СТАСАААССА6СТССАСАААСАСТСТСТСАА6СТАТТ6АСТСТТ [А/6] 6АТ6АСААСААТТААТ6ТТСААСТТ66СТТТАСССССААСАТ6САСТ6С АСА6АТ6ССТССА66ТСТАСААТ6СС6А6АССААСТТТ666666САТТТС С6СА6СТСТ6ТСТАТТ6ТССТССТТТССТСТТСТ6Т66ТСАТТСТТСССА А666АТА66ССТА6ТССА666Т66А6АААААСААТТСТТ66Т66ТА6666 >гз735361 66ТТТАТАА66СААСТСТТАССТТ6АСССАСТСТАСТССТССАТСААААТ ААА6АААТАААТААА6ТТТТСАААСТААА6А6САТТААА6ААТ6АТААСТ ТТТСТТТТТСТТ6СТАСТАТСТАТТ6АССТАТАССТ66ТТТТСАСТ0ТАА САСАТТТ6Т66ТАТ6АААААТ6АСААТАТ6АТ6ТСА6А6ААААТ6А6А6А [С/6] АСАТТТТА6ААТТТАТСА6ААТ6ТСАСТАТ66ТСАСТТААА6ТССААСТ ТТСТСАТ6Т666ТТТСА6ССТ6Т6СТ66АААСАААТА6ССТСТСТТАССТ СТААА6ТАСТТ66ТТСТ6Т6СТСААА6Т66САТАТТАА6ТТСТ6СТ6АТТ АСАТСА6ААТТТ66АТ66Т6ТСТСА66АТСТСА6ТТТССТАТСА6Т66АА >гз13409592 ТТА6ААТАА6АСТТСССТАА6САААТСААТСТ6АТ6АТТ6АТАСАААСА6 ССАТСАСТС6ССССТССТСТАТТТССААТСТСТТССТСАСТТТСССА6ТТ СТТТСАСААССТСАСТ6С6АА6ТТСА6С6АТАТАТ6ССТССАСССТСССС Т66С6СА6АТ6САТСАТ6АА666ТССТ6ССТТСАСТ6ТА666ТАСАСТСА [С/Т]

ТСТ6А6Т6СТТТССААСА6АСТ6ТАААТТААА6АСАСТССААААА6ССС СТ66Т6666АТА6АТ6666А6АА6666ТАТСАСТАА6ТСТТСАТСТТТТС ТТСТА666ССА666ТСА6Т66ТТСАААТАААСАТ66Т6ССССАСА6А6АТ С6ССТСТ66ССАА6ТА6СТСТСА6Т666ТТ6АСТСААА6ТСАССТ66АСА >гз2287289 САТСС66САТСТС6ТСАТССТССССА66АСААСТСАССАТТСТ6ТТС66Т

- 107 019953

ТССССССТТСССТССТСССССТСССТССАССТТСТСТСССТАСААТСААС ССТСТССССАТТСССТСАССТССССССССТССССТСАСАССТТССТСССС ССАСССТААСАСАТТССТСССТТССТТТТААССАСТСТТТАСАССТСССТ [А/Т] ССТСТАССАССТСССТТСТ6АТСААААСТСТССАСАСССТСТСССТССС СТСТААТТСАСАССССАССТСТССТССТТААААТТСТТТТАСССТАТТТТ ССАСААССАТСТССТТСТСТТСССАСТСССАТААСТСТСАТТСАТСТТТА ССАТААСТТССТТСААСТТТССТСТСАССТССАТССТААССТССССССАС >гз12329133

АААСТССАССССАСАСАСАССТТСАСССАССАСССССССТСССАССТСТС СТСАССАТССТССТСАССССССТССАС6АСТССТСАССТТТСТССТТТТА СССССАААСССАСАТТСАСТТТСССА6СССАТТСАСССТСТСАСССАССС САСТССССТТТСТССТТССТССТТССССААСССТСТСАСССССТССССАС [С/Т]

АТСАСААТТТСАСТТТСАТСТССТТТТСССТСССАСССАСААТАССТТА СТСТСТТСААААС6АСАСТТАСАААСТСТССССТТСАТСТААТАААААТТ ААСТССТСАСАСТТАТССААТСССААТАСАССТСАТТТСССТССАСССТА СССССАСТАССАААСАСАТТТТАССАСАТСА6САСАССТАААСАТСАСАС >Г513011060 ТАААТТТСАССАСАТССТАТАТАСТТТТСАССАТТАСТСССТСТСТАССТ АТТСАТСТСССССТССССССТССТТСССТСССАСССССТ60ТСАТССССА СТССССАСССАСАСАСАТТССАСССАСАССАСТСАСССССССАССССТТС СТССАСССТССССААСАТСССАТТСАТТТТТАААСТССАТТТАТТСТССА [А/С]

ТТСТТСАААСТСССАСАСАСАААТТТССАСТСАТАТСССТАССССАСАТ САСТАСТСАТТСССССАСССТАААТССАСТСТТТТТСТТСАТССАСААСС ТСТТТТСТССССССАССАСАААССААТССАТСТТСА6ТСТТААСАААТСС АТТСААААССАТССТТСТССАСТТТССССТСССТССТАССССААСАССТС >Г513О11326

АТАТСССТАССССАСАТСАСТАСТСАТТСССССАСССТАААТССАСТСТТ ТТТСТТСАТССАСААССТСТТТТСТССССССАССАСАААССААТССАТСТ ТСАСТСТТААСАААТССАТТСААААССАТССТТСТССАСТТТССССТССС ТССТАССССААСАССТССАААСССССТТАСАСТСТСАСТССТСТАССССС [С/Т]

СТТСТАССТСАТССТСААААСТТСААААССССТСТАСАСТСТССАСАСА ААТ6САТСАСААТТСАСТСТТСАААССТТССТССТТТСАСТТСТТТТААС ТТТСТСТАСАСТСАААТАТСААТААСАССАА6ССАТСАССССССТСТСАС ТТТАТ6САСССАТАССТССАААССТСССАСТТТССААСССАССААСССТС >гз4674132 АСАААТССАТТСААААССАТССТТ6Т6САСТТТССССТСССТС6ТАСССС ААСАССТССАААСССССТТАСАСТСТСАСТССТСТАСССССССТТСТАСС ТСАТССТСААААСТТСААААССССТСТАСАСТСТССАСАСАААТССАТСА СААТТСАСТСТТСАААССТТССТССТТТСАСТТСТТТТААСТТТСТСТАС [А/С]

СТСАААТАТСААТААСАССААСССАТСАССССССТСТСАСТТТАТССАС ССАТАССТССАААССТСССАСТТТССААСССАССААСССТСТСТСТССТА С6ААТТСТАСССССТСТСССАСААТССАААААТСАСТСТССТАСААСТСС ААААССАСАССССТСССТТТТСТАССАССАТСТТТАСТАААТАСАТТСАС

- 108 019953

Таблица 28. Последовательности, фланкирующие г§3803662 и сцепленные ОНП маркеры НарМар с г²> 0,2 >га3803662

ТТТТАТТ6ТТСТАТ6СТТАТТААААААТААСАТСТСАТАТАААТТААССС

ТАСАААСАТССАТСТТТАТСАААСАААССАТТСТСАТССАААССАССААС

ТАТСАСА6АТАТСТАТСТ6СААТССТАТАТАСАТСТ6ТСАТАСААСССТТ ТААТТАТАТСТСССТААТСАТТТТСТСТССТТААТСССТСТАТАССТСТС [С/Т]

СТТАСССААСААТААААСТСТССАСТСАСССССАСССАТТТСССААСАА

АСТАСТСССТСТТСАССТТТСАТТСТТСАСССССТССТСТТТСТССАСАА

САССАССССССССТССТССТ6ААСАСТСТСТССАСТТССТСАТТТТСАСТ

ССТСТАТАААСССССТСССССАТТАСТАССТТТСТСТССТТССССААААА >гз4784220

АСАСААТТАСТААТАТТТТСТТСТССААССТТААТССТСАСТСССТСАСС ТАТСТССАТТАТАСТАСТСАААСТАСТСССТТААСССАСТААТСТАААСА САТТССТТТТАА6ААСССТСССТАТССАСААТССТСТСТААСАСАСААСС АТСТСААСААСТАААСТТССТТСТСССТТСССТССТССССТССССТААСА [С/Т] ССАСССТТСТСАССАТТСССААТТАССТССАССААСССАССААСАСААТ АСА6ААССАСССТААСАСАСТТТССТСТАСТТТАААТАССТСССТСССТС СССААСТААААСТТСАСССАТСССААТСАСССАААААСТСССССС6АТТТ СССАССТ6ССТТАСТААТАСАСАСТТТТСТСАСАСАСТССААСТССАТТС >гз12598982 САСТАССАААТААТАТТССТТСТТССАТТААСТАТАССАТТССТТТССТА СААТААТССТААСААТСАСААТССААТСТАСТТТАААТТССССТСААААА АСТТТТТТСТТАААСТАССАСАТАСТСААССТТТТААССТСТАТСССТСА ТССАСАСАСАСАСТССААСТАТАСАААСТАТАТСАССССТСТТССААСТА [С/Т] АССААААССАС6АААССААССАСАСААСАСАСАСААТАСАТАААСАААТ САСТАТСАСТСТСТТССААТААСАТТТТАТТААТАААААСАСССААСТСС СССАТСССТССТААТТТССТСАААСТТССТТТАААТТАТТАТТАСТАТСТ АСС I I I I I I IААААСАТСАТСI I I I I IАСССТСТТТССАТСАТСААААТТ >гз4784222 ТААТСАТАСТАТАААААСАСССАССАТААССССАССАТААССАТСТСААТ СААТСАССАААТСАААССАСССАССССААТСССААААТТТТАССТТССТТ ТССААССТАААСТАТААССТСАСТТТТТТААТССТТТАСААААА6САААС ССААТСАСААССАТААТТААТАТТТААССТСТАСТСАСАССТТТТССАСС [С/<3]

ААААТТСТАТАСААСТТСТТАТТСТССААСТТССАААААТААССААТАА АТТТТТТТТАААСАССТСТТАТТТТААСАСТТТАТТТСААССАААСААТС ТСТТТАТССТААСААСАТАСАТСТТСТАААТТААТСАСТТТСААТСТТАТ ААААТААТАСТТССААСААТАААТСТАТСАТАТААТСТАТСТАССТСАТС >гз17271951 ТСАТТСТТТСТААААТССААТТСТСАТАСТСТССТАТТТСТТСТССАААА СААТСАТСАСТТТСАТАТТСАСТАСАССАТСАСАТСАСАТАТТТААТААА ТААТАССАСАТСАТААТССАСССАТТААСТАСТТТСТТТТАССААААТТТ ААТАТСАСССТАССАТАТСССАССССТТССТАСТТСАССААСААТТТСТС [С/Т]

СТТСССАСАССАТААСАААСССААСТАТТТТСССАТААСААСТТСАСАС ТСТААААССССАСССССССТ6ССТСАСАССТАТААТСССАССАСТТТССС

- 109 019953

ТСССТСАСССАСССССАТСАСТАССТСАССАСАТССАСАССАТССТСССТ ААСАСССТСАААСССССТСТСТАСТАААААТАСАААААААТТАСССАССС >гз9933638

ССААТААТТАСАСАТСАТССТАСССААТАТСАСТАСАТТСССТТТТСАТС ААССТССТСАСТССАТТТТСССАСАААААТСАСТААСТССТТТСССТТСС АСАСААТССССТСАТССАТААСССССААСТТССАААААСТАСААААТСТС ААААТСАСАТТСААСТААТТААТААТТТТАТСТСАСААТААСААТТАССА [А/С]

ТСТСТАСААСССТСССТАСАСТАССТСАТСТСТСТСАТСССАССАСТТТ СССАСАТССАСССАСССАСАТСАСТТААССССАССАСТТСААСАССАССС ТССССААСАТАСССАСАСССССТССТАСААААААТАТАААААТСАССТСС ССАТССТСССАСАТСССТСТАСТСССАССТАСССАССАСССТСАССТССС >гз9302556

ААСАСАТААСССАТТТТТТССАААССТАСАСАССТТТТСТСТАТССАССТ ТСТГТСАААТАТТТТАССТААСАСАСАСААТСТСАТАТТАААТТСААТТТ САСАСТТСССААТСАСАСАСССССАСТСАСААТТССТССАСАТСАТССАА ТСТССССТААТСТСТАТССТТАТСТАТСТАСАТСТССАСАСАСАААСАСС [А/С] АТААТСТТТАААТАСАТАТАААСАСАТТСАТТССТАССТАТТССТТААА АСАААСАСССТТАСАССАТАССААСТТАТТАААСАТААТСАТТСАТАТТА СТАСТТТСАТТААТСТААТТААССТТТАСАТТТСААТТАТСААСТТСААА СТСТААСАСССАСАССАСТССТТСТСАССССССТАСААТААТСССААСТС >гз7190749 САСТССТСССССТАССАСАААССАСАСАТАТТТССТССТССТААТААТСА ССАСССССТТТСТААСТАСААСАТСАССТСТАТТСТТТСАТТСССТССАА АТСТССССТССССТСТСАТАССТСААААААТАТСТСТТССАТТТССААСС САААСААСААТСАТАТАА6ССТТССТСТТАААААААААААААААААТССС [А/С]

СТАСТТАСААСАТААААСССААССТСТТТТСТТТТТТТССССТТТСТСТ ТАСАСТАСССАТ6ААТААТСТСААААТАТТТСТТТСТСААТАААСТСАТТ ААААТАААСТСАТАСАСААСАСАТААТСАТТАСАСАААТСААТСАААСТА АТАТТТСССАССАСССТСТТАСАААТСТАСАСТААСТАТСТТСАССАСАА >Г512443621

АСАТСААСАТСТСТАССАТААТТТСАААСТАТСТТТСТАТТТСАСА6ААА ССТТСССТТССААААСТТАААСТСТАААТАТТТСТАСАСАААСААСТАТТ СТСССТТТСАТТСАТТААААСТСАТТСАССАСТССАСААААСССАСАССА АСАСАТТТАСАТАТАТТТТТСТТСАССТТТТАТАТССАТТАССССТСССА [А/С]

ТСААСТТСАССТАССТАТТАСТАТСТССТТАТТТСТААСССААТСАСАА ТАСТСТАААСАААСАСАТССАССТАААТААТССАСТСАААТССТСССТТА СТАСССТССАСАТССАТСТТССТССАСТТАТСАСАСССССАСССАААСАТ АСААСТТТААСАААТТССАААТТАТТССССССТАААТАСАСАСТТТТТТС >гз9933556 САТССАССТАААТААТССАСТСАААТССТСССТТАСТАСССТССАСАТСС АТСТТССТССАСТТАТСАСАСССССАСССАААСАТАСААСТТТААСАААТ ТССАААТТАТТССССССТАААТАСАСАСТТТТТТСТТТСААТАТТССССТ ТСТТСССТТСТАТТСТСААТАТСАТСТСААССАТСААТСАТААСССААТС [С/Т]

ТТАСАААТТТААСТТСАСАТТАТСАСТТТТСАССССААСТСАТСССТАА ССАСТАААССАТТСАТАТААСАСАСТСААААСААСССАТТТААСАААТСА САААААТАССТАТТСТТТТСТСТСТАТСССТСТААААССТСАСАТААСАА САТТТТСССААСТТСААТАСАССССАААСССТТСТСААСССТАТСССАСС

- 110 019953 >гз1362546 ТССАСТАТТТССАСТАССАТТААТСААСАТССАААААСТСТАСАААТТАТ ТТТАТСТТТАТААТСААТСТТСТСАААТССТААСТТСААААТАТАААСАС

6ТСТСТСТСТСТСТСТАТСТСААТСТСТАСАТАТАААТСАААТАСАСАСА [С/Т]

АТАТАСТТСТТТТАААААААТССТСАААСААТСААТСАСАТАТТАСАСА АСТСААССААТАТТССАСТТСАТСТССТССАААСТСТТССТАТТСТАААА ТСАСТТТСАААТТТСАСАСТТАТССАААТССТААТСААТАТТААТАССТА АСААААТСААТСАААСАТТААСАТТААСАСАТТАСАТТТТАААААТСАТТ >Г51075367

1111 IАССТАСААССАТАТСI I I I IАААССАТАТТСААТТАСАТАСАААС САТТТССАТТТТССТТТСАСССТТТСТТАТТАСАТСАСТСАСААААТСТС АСТТТССТСССААТАТСТСТТТААСАССТААТАСТТССТААТСТСТТТТТ ТАССАСАСАСАТТСАСАСАСАТТАТАССССААСАСАСАСАСАСССАСАСА [С/Т] ССАССАСАТСАТАСАССАСССАСТТАСААСССТТСТСТАССТТТССТТТ ССТАСААТТАААТАСАТТАТТТТСТАТТТАТТСТАТТТАТТТТСАТАСТТ АТСТССТАТТТАТАСАААССААТАССАОПТТССАТСТАТСАААТАААСТ СТССТТТТСТТААСААААААССАТАТТААТТТТТАТССАААТССАТСААТ >гз8046979 САССТТСАСТССАТССААСТАТСАТСТСТСССАТСАТССТСССТСССТТС А6АССССТТТССАТССТТСТСАССАСТАСААСТСАААСТСТСАТСССАСС ААСССАССАТСАССАТСАССТАССААСТТСТТАСАААТССАААТТСТТСС ССССТАССССА6АССТАСТСААТСАСАААСТСТСССТСТ6СА6СС6СААС [А/С]

ТССАТТСТААСАА6СССТТСАССТСАСТСТСАТССТСАСТСААСТТТСА АААСССТСТСССТААССАССАСАСТСТСТССААССТСССТСТТСАТТТСА АССААТСССАСАТСААТСАССТССТСАССТСАСАСТТТСААСААСТТАТТ ТААТГТСАСССАТССТТССАТТТСССТТТСТСТТААСТСССАСАТТААТА >гз1420529 АТСААСТСТТСАСТССССТССССТТСССАСАСАСС6СТСАААСССАСТСА СТСТТСТТАСААСААСАСССССАСТССТСССТСТСТТССТСТТСССАСТС САТСССТСАССССА61ТТСАСССАССАТССАААААСАААТС6СА6САТС6 СССТТ6ААССАСАТТСАССТТААААСТСССТАСААСАТАААСССТАААСТ [С/Т]

САССАССАСАСССААСАССТТТСААААТСТ6СССТССАССАТССТСТСТ 6ССТСТССТТТСТ6АСААССССТАТТТТСТСССТТТТСАСААСТССАСАС ТТАТССАТСАТССТСТТТТСССТСССТСССТСАСССАССССАСТСТТСТТ СТТСТСТСАТССТААССТССССАСАААСТСТСТТСАССТАСАСТСАТСАТ >Г511642645 СТССАССАТССТСТСТСС6ТСТССТТТСТСАСААССССТАТТТТСТСССТ ТТТСАСААСТССАСАСТТАТССАТСАТССТ6ТТТТСССТСССТСССТСАС ССАССССАСТСТТСТТСТТСТСТ6АТССТААССТССССАСАААСТСТСТГ САССТАСАСТСАТСАТТАТТАААТТАААААААААААААТССТАСТТТСТТ [А/С]

ТАТТСТСАТТТСАААААССТСАААСССААСАТАТТТСАСССААААААСА СААТАТТСТТТТСТТССТТТТТААААААТАААТТТССАССТССТСАСААТ ССССТ6СТТТСТСТСТССТСАТСАСАСТССААТСТААТСАС6ТАСАСТАА АТААААТСАСТТСАСААССТТТСТСАССААТССАААСССТСАТСАТАТТТ >гз1420533 ТСТСАТТТТТААААССТААСТААСАССТСААТСАААССААССАААААСТА ААТТТСАСААААТААТАААСССТАСАТССССАССАСАСАССААТССАТАТ

- 111 019953

ССТАСТССССТАСАСАССТАСТАААТ6ССТТТССТСТТТСАСТССААССТ ТСТТССССАТСААТССАААСАААСААСААСААТССТААСАТТААТССССА [А/С] ТААСАТАСАСССААСТССАТТТТТТТСАСТТСТТСТТСАТАТАСТААСС ТААСААСАТТСТСТСТАААТСАТСАТТТАААААСАСАССАТСАССТСТАА ТСАССТАТАСАТТСТАААТАСААСТТПТААААААААТСАТС7ТСАССАА АСТАТТАСТСАТААТССТСТСААТАСАААСТСААСССТТААТСАСТСТСС >гз1362548

ТТТТААААААААТСАТСТТСАССАААСТАТТАСТСАТААТССТСТСААТА САААСТСААСССТТААТСАСТСТССААТТСААТАААССАСАСАСССССТС ТСААСССААСТСТСААСТССССТСССАСАТААТАТСССАТССТСАССАТТ САССТСТСТСАСААСТСТСССАСАААТСТСТТАТСАААТТАССТТАТСТС [С/С]

АТСААСССААССААССААСССАТСТТСТТСАТСССАТТСТССТТАСАТА ТАТТАТТТСТТССААСАСАТТТТАТТААСАСАААСТССССАССАСССАСТ ТСААСААССАСАААААТССТСТСТСААААССАТТАСАТАТСТТСССААСА ТТТАТСАТСАССААААСССТСССАССААСТТСААТТСТААТСТАТСТСТС >гз2193094 СТСССССТССАСТСААСССТТСТТСТСТАСТТТССТССТСТСССАААТАС ТСССАТСАТСААСААССССАСССТССССТССТССАССТСАААСАТАСАТС ССАСАСААСТСАСССАССССССТССАСАСССАСССААССТССТСААССАА АСССТСССТСССААТСТССАСТТСАСТССАААСАСАТААСАСАСССАСАА [С/Т]

АССАТААССАСТССССТТСТСАССССААССТАААТТССТСАСАТССАСА АТСАСАААСААААТАТСТСТТТТТСААСТСАСАААСТТТАСАСССССТТТ АТСАСТССССАТАСАТААСТССТАСАСАСААСАССССТСТСССТАСАААС ТСАААААСАТАССААСССААААСАСТААСАССТСААССТТТАССАССАТА >Г54783780

ТСТСАТАТССАТАСААТАТССАССТСАССТАТАССТТТСТТСААСССАСА ССАСАТССААТСТСАСССТСААСААСААСССССТТССТААТАТАААСААТ АТТТАТСАТАТТТАСАТТАСАТААССАСАСССТСАТТТТССТТТССАСАА АСААТААТААТАААСАТАСАСААТССАААТССТСАСАААТСТТСААААТС [А/С]

ТСААССТТСАСТССАСТТАССССТТТСААТССАСТТТССТТТССТАТСС ТАСАСССАСАТТСТСТСАТТСТСАСАТСАССАСТТТСТТТТТССТСССАА СААССАСТССТССАТАСТСТТАССТССТСТСССТТССААСААСАТСАСАС ТСТССАССТСССССАСТСССАТСССТАССТСССТАССАСССТССССАТСС >Г53112581

ТТАСАТТСТСАСАССТСАСССТСТТСААСАСССАСАСАТТСТТТСТТССА ТСТТТСАССАССТТТТСТССАТСААСТСТСАТТССАТАСАСТТСССТССС АТССССАСССТССТАСССАССТАСССАТСССАСТСССССАССТССАСАСТ СТСАТСТТСТТССААСССАСАССАССТААСАСТАТССАССАСТССТТСТТ [С/Т]

ССАССАААААСАААСТССТСАТСТСАСААТСАСАСААТСТСССТСТАСС АТАССАААССАААСТССАТТСАААССССТААСТССАСТСААССТТСАТСА ТТТТСААСАТТТСТСАССАТТТССАТТСТСТАТСТТТАТТАТТАТТСТТТ СТССАААССААААТСАСССТСТССТТАТСТААТСТАААТАТСАТАААТАТ >гз3112580

I I I I I I I I I I I I I I IАТСАТАТСАСССАСССТСТАСТСААСТАСТСССАА СТТСТССАССАССАССТССААСТТАСАТТСТСАСАССТСАСССТСТТСАА САСССАСАСАТТСТТТСТТССАТСТТТСАССАССТТТТСТССАТСААСТС ТСАТТССАТАСАСТТСССТСССАТССССАСССТССТАСССАССТАСССАТ

- 112 019953 [А/С] ССАСТ6ССССАБСТССАСАСТСТСАТСТТСТТССАА6ССАСАССАССТА АСА6ТАТССАССАСТССТТСТТСССА6САААААСАААСТССТСАТ6ТСАС ААТСАСАСААТСТСССТСТАССАТА6САААССААА6ТССАТТСАААСССС ТААСТССАСТ6ААССТТ6АТСАТТТТСААСАТТТСТСАССАТТТССАТТ6 >Г59931232 ТТСААТТААСАТТАААСАТАСААТСТТААТСАТАСААСААСССССАТТТТ ССАСССССТС6САТСТТТТАСАСААССАТСАААСАТАТТТААСАСААСАТ ССССТСССТСАССААСАСАТТААССАТАСАААССТАССАААСАААСАААА ТААААССАТСТАССТСАААСССАТААСАТТААССТСТСАСААССТСАТСС [А/С] САССТТАААТААААСССТСТАСТССТТАТАТТТТТАААСАССАТТТТТС I I I I I I I I I IАСАССАСТААТТССАССТТСААААТАТАТТТСАСТТТСТА АСТАТАСТСААСАААААТССТСТССТТТСТТАТТААССАТАСТСААААСА САТТСТСТААААТАСТТАТСАСАССАТТААСАТТТСАТСАААТССААААС >Г51123428 ССТ6ССТАТАТТТТАТТТСААСТТАТТСТССТАСТТССААССАСТТТТСА АСССАСААААСТСТТТСАТССАТТСТССАСАСАСАСАСТАСАСТТТСАТС А6САСТСАСАТТТСААААС6АТССАТАТАСТСАСАСААТСТАААСАТААТ АСАСАТССАТАТААТТСАТАСАААССАСТСТССТСАТТТСТТАААСАСАС [А/Т]

ААТСААТ6АААСССТАТТАТТСАСССТТТСТАААТАААТТТАААСАТАА ССССТААСТТТСАСТТСТТААСССТАСАСССАА6АСТТСССТСТТТСТТС ТАААСТТТСССАСАТССТСАТТААААСААСАСАСССААСАААСАТАСТТТ СТТТСАААТССАТСАТТТСССАТССАСАААСАТААТАСАТСТСАТСАААА >Г53095604 ТСАТТСАСТССТСТСССАСАСААААТСТСССТАТТТТССТААААССТССТ АССТСАТТААСТТССССАСТСТАСАСТСАСССАССССТСТТТАТТТСТТТ АТС I I I СI IААССТССАТСТТТТТАТТТААI I I I I I I IСТСАТС6ССТТТ АТТССТТТ6АСТТААТСТСАСАСТТТССССТТСАСССТТССССААСССАА [С/С] ССССТТТАТАСТАААТСССААССТТСТ6САСАСССССТСАСАТСТСССС ССТССССА6ТТТАСТТАТСТСССАССТАСТПААССАСАСТССССАСАТТ СТСАААТАТТТССТАТСАСАСТСССТААСАСТТТСАТССССТССТСАСАС СТТССТСССССАСССССТСАССТТТТТСАСАСААССАТСАСАТСССТТТТ >гз4784227 САСТТСАТСАСТАААТАТТТССТСААТСАААСААТАСАТСААТСАААА6Т САСА6СССТАТАССТСА6САТССАССССССТАААССААССТ6ССТСАССС ТСАААСАСААТСТ6АТСТААСАТТАААТССАССАТАТССТ6СТАААТСТТ ТААСАСССААСТСТТТССССАССААААААСТСССААТТТСТАСТСТТТСС [С/Т] . :

САТТАТТСТСАТСТАААТАСТСССАТСАТСАССААТТТСААССТАССАА САТССТСАСАСТСААСТТССАСТТССААССАСАТСААСАСССАТААТСАС СТСТССТСАСАТСССССААСССССССССАССАСТССАСТСТТАТАТАТСА СССТАСААТТАСТАСАТААСТССААТАССААСТТТСТССАССАТАТСССТ >Г5129220б1 АСТТСАТТТТСАССААААСААСАСТТАСТАССАТТСАТТСАТТСАСТСАТ САСАССААТАТТАСТСААТССТАСССТССАССАССАТТСТТАТССТАСАТ СТТСАТААТАТАСТСАСАСАСААТАССАТССТТСССАССАТТТАСАТАСТ АСАСТСССТСССССТСАТАСТСТАСТСАСАТСТСА6САСАТСАСАТАСТС [С/Т]

САТТАТСАСАТТСТСТТСТАТСТСТСТСАСАСССАСТСАСТСАССАССС АТС6АСААСТТААТССССАТТАССТТСТТААТССТССТСССТАТААТТСС

АСАТААССАСССТСССТСАСТСАССАСТАТАССАСССТАСТСАТССАТСА ТТТССТТАТТАСАССТААТСАСАСТСССССТТСТАТССТАААААССАСАС

- 113 019953

Таблица 29. Мультиэтнические когорты >гз4784227

СТАААТАТТТССТСААТСАААСААТАСАТСААТСААААСТСАСАССССТА ТАССТСАССАТССАССССССТАААССААССТСССТСАСССТСАААСАСАА ТСТСАТСТААСАТТАААТССАССАТАТССТССТАААТСТТТААСАСССАА СТСТТТССССАССААААААСТСССААТТТСТАСТСТТТСС [С/Т]

САТТАТТСТСАТСТАААТАСТСССАТСАТСАССААТТТСААССТАССАА САТССТСАСАСТСААСТТССАСТТССААССАСАТСААСАСССАТААТСАС СТСТССТСАСАТСССССААСССССССССАССАСТССАСТСТТАТАТАТСА СССТАСААТТАСТАСАТААСТССААТАССААСТТТСТССАС >гз17271951 ТААААТССААТТСТСАТАСТСТССТАТТТСТТСТССААААСААТСАТСАС ТТТСАТАТТСАСТАСАССАТСАСАТСАСАТАТТТААТАААТААТАССАСА ТСАТААТССАСССАТТААСТАСТТТСТТТТАССААААТТТААТАТСАССС ТАССАТАТСССАССССТТССТАСТТСАССААСААТТТСТС [С/Т]

СТТСССАСАССАТААСАААСССААСТАТТТТСССАТААСААСТТСАСАС ТСТААААССССАСССССССТСССТСАСАССТАТААТСССАССАСТТТССС ТСССТСАСССАСССССАТСАСТАССТСАССАСАТССАСАССАТССТСССТ ААСАСССТСАААСССССТСТСТАСТАААААТАСАААААААТ

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ определения подверженности раку молочной железы у человеческого индивидуума, включающий определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивидуума, или в массиве данных генотипа, полученном у индивида, где маркер выбран из полиморфных маркеров Г513387042, и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, и где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на подверженность индивидуума раку молочной железы.
2. 2. Способ по п.1, где по меньшей мере один полиморфный маркер расположен в составе сегмента генома с последовательностью, приведенной в 8Е0 Ш №О: 5.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где по меньшей мере один полиморфный маркер выбран из маркеров, приведенных в табл. 15.
4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где подверженность, обусловленная наличием по меньшей мере одного аллеля или гаплотипа, является повышенной подверженностью.
5. 5. Способ по п.4, где наличие аллеля А маркера Г513387042 указывает на повышенную подверженность раку молочной железы.
6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, также включающий этап определения наличия или отсутствия по меньшей мере одного генетического фактора с высокой пенетрантностью в отношении рака молочной железы в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивидуума, или в массиве данных генотипа, полученном у индивидуума.
7. 7. Способ определения риска развития по меньшей мере второй первичной опухоли у индивидуума с диагностированным ранее раком молочной железы, включающий определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивидуума, или в массиве данных генотипа, полученном у индивидуума, где маркер выбран из полиморфных маркеров Г513387042 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, и где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на риск развития по меньшей мере второй первичной опухоли.
8. 8. Устройство для выявления генетического индикатора рака молочной железы у человеческого индивидуума, включающее компьютерную память и программы, хранящиеся в компьютерной памяти, где программы адаптированы к выполнению на процессоре с целью анализа информации по маркеру и/или гаплотипу по меньшей мере для одного человеческого индивидуума в отношении по меньшей мере одного полиморфного маркера, выбранного из маркеров Г513387042 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, и генерирования выходных данных на основании информации по маркеру или гаплотипу, где выходные данные включают показатель индивидуального риска по меньшей мере по одному маркеру или гаплотипу в качестве генетического индикатора рака молочной железы у человеческого индивидуума.
9. 9. Способ идентификации маркера, пригодного для применения в оценке подверженности раку молочной железы, включающий:

   а) идентификацию по меньшей мере одного полиморфного маркера, находящегося в неравновесии по сцеплению с Г513387042;

   б) определение генотипического статуса в выборке индивидуумов с диагностированным раком мо

   - 114 019953 лочной железы или подверженных ему и

   в) определение генотипического статуса в выборке контрольных индивидуумов;

   где достоверное различие в частотах по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфизма у индивидуумов с диагностированным раком молочной железы или подверженных ему, в сравнении с частотой по меньшей мере одного аллеля в контрольной выборке указывает на то, что полиморфизм может применяться для оценки подверженности раку молочной железы.
10. 10. Способ по п.9, где увеличение частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфизма у индивидуумов с диагностированным раком молочной железы или подверженных ему, в сравнении с частотой по меньшей мере одного аллеля в контрольной выборке указывает на то, что полиморфизм может применяться для оценки повышенной подверженности раку молочной железы и где понижение частоты по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфизма у индивидуумов с диагностированным раком молочной железы или подверженных ему, в сравнении с частотой по меньшей мере одного аллеля в контрольной выборке указывает на то, что полиморфизм может применяться для оценки пониженной подверженности, или устойчивости к раку молочной железы.
11. 11. Способ определения прогноза у индивидуума с диагностированным раком молочной железы, включающий определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивидуума, где полиморфный маркер выбран из группы, состоящей из полиморфных маркеров г§13387042 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на менее благоприятный прогноз рака молочной железы у индивидуума.
12. 12. Способ мониторинга хода лечения индивида, проходящего лечение рака молочной железы, включающий определение наличия или отсутствия по меньшей мере одного аллеля по меньшей мере одного полиморфного маркера в образце нуклеиновой кислоты, взятом у индивидуума, где маркер выбран из маркеров г§13387042 и маркеров в неравновесии по сцеплению с ними, где наличие по меньшей мере одного аллеля указывает на исход лечения у индивидуума.
13. 13. Способ по любому из пп.1-7 или 9-12, где неравновесие по сцеплению характеризуется значениями г² по меньшей мере 0,2.
14. 14. Устройство по п.8, где неравновесие по сцеплению характеризуется значениями г² по меньшей мере 0,2.