BRPI1011979A2 - métodos para avaliação de risco de câncer de mama. - Google Patents

Abstract

MÉTODOS´PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE CÂNCER DE MAMA. A presente invenção refere-se aos métodos e sistemas para avaliar o risco global de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama. Em particular, a presente invenção refere-se á combinação de avaliação do risco clínico e a avaliação do risco genético para melhorar a análise de risco.

Description

| Dn" iv] sÓ er C2“SºÕúÀIie?t“-SO-* : ' MÉTODOS PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE CÂNCER DE MAMA ae CAMPO DA INVENÇÃO ; A presente invenção refere-se aos métodos e sistemas - para avaliar o risco global de um indivíduo humano do sexo feminino desenvolver um fenótipo de câncer de mama. Em particular, a presente invenção refere-se à combinação de avaliação de risco clínico e avaliação de risco genético para melhorar a análise de risco.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Câncer de mama, assim como outros cânceres comuns, apresenta agrupamento familial. Diversos estudos epidemiológicos têm demonstrado que, em geral, a doença é | aproximadamente duas vezes mais comum em parentes de primeiro grau de pacientes com câncer de mama. Estudos familiares e, particularmente, estudos em gêmeos, sugerem que a maior parte, se não todo esse agrupamento, tem uma base genética. Por exemplo, Peto e Mack (2000) estimaram que o risco de câncer de mama em gêmeos MZ de uma mulher | afetada foi aproximadamente quatro vezes maior do que o risco de uma irmã de um caso.

Vários genes de suscetibilidade ao câncer de mama já foram identificados, o mais importante sendo BRCAl e BRCA2. Mutações nestes genes conferem um alto risco de câncer de mama (da ordem de 65% e 45%, respectivamente, aos 70 anos).

O rastreamento de mutações de série de base populacional de câncer de mama demonstrou que apenas cerca de 15% do risco familiar de câncer de mama pode ser explicado por mutações nestes genes. Os outros genes de suscetibilidade ao câncer de mama conhecidos (TP53, PTEN, ATM, CHEK2) fazem apenas pequenas contribuições para o risco familiar (porque as

E Sm :! Z»)?,.!..AA apa po S5! 5 PRRÊ??,!---or Ê,A52 -A=),. "o unnr)-BEAA a a ihiqiga=2º21522 5% a 7ºPi)AâNn0âPeÚÚÔoº Ia 2 ' mutações predisponentes são raras e/ou conferem apenas es pequenos riscos). No total, portanto, os genes de . suscetibilidade de câncer de mama conhecidos foram - estimados para responder por no máximo 20% do risco | 5 familiar.

Variação genética no risco pode resultar de raras mutações altamente penetrantes (tais como aquelas em BRCAL | e BRCA2) ou de variantes que conferem mais riscos | moderados.

Diversas linhas de evidência sugerem fortemente que mutações de alta penetrância não são grandes contribuintes para o risco familiar residual de câncer de mama.

Em primeiro lugar, à varredura de mutação das famílias de caso múltiplo verificou que a grande maioria dos casos com histórico familiar muito forte (por exemplo, quatro ou mais parentes afetados) abriga mutações em BRCA1l ou BRCA2. Em segundo lugar, apesar dos grandes esforços nos últimos nove anos, estudos de ligação genética não identificaram quaisquer loci relacionados adicionais.

Em terceiro lugar, a análise de segregação de uma grande série de famílias de câncer da mama não verificou, após o ajuste para BRCAl e BRCA2, evidências por um alelo de suscetibilidade de câncer de mama dominante principal adicional.

Em uma análise geral, Antoniou et al. (2009) constatou que o modelo mais parcimonioso para o câncer de mama foi um modelo poligênico, o equivalente a um grande número de loci de pequeno efeito combinando de capacidade multiplicativa.

O que é necessário na técnica, portanto, são outros métodos para avaliar a suscetibilidade ao câncer de mama em indivíduos do sexo feminino.

po EÁÁA“S%º»à.II—il>6 2 ,. (221% 2Â$ 5 “20 Ú o =.0 anAô AE a a a = 0m “ASAE mM e 3 | ' RESUMO DA INVENÇÃO “ A presente invenção refere-se a um método para avaliar . . o risco global de um indivíduo humano do sexo feminino para . o desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama. | 5 Surpreendentemente, os autores descobriram que a combinação de polimorfismos de nucleotídeo único com uma avaliação de risco clínico fornece uma vantagem em relação ao uso da avaliação de risco clínico isoladamente.

Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para avaliar o risco global de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama compreendendo: realizar uma avaliação de risco clínico da mulher; realizar uma avaliação de risco genético da mulher, em que a avaliação de risco genético envolve a detecção, em uma amostra biológica, derivada da mulher, a presença de pelo menos, dois polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associados à um fenótipo de câncer de mama; e combinar a avaliação do risco clínico com à avaliação de risco genético para obter o risco total de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama.

A presente invenção também é útil para reclassificar os indivíduos que foram analisados por meio de uma avaliação de risco clínico.

Assim, em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se o risco global de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama analisado por avaliação de risco clínico deve ser reclassificado, o método compreendendo combinar a avaliação de risco clínico com uma avaliação de risco genético para obter o risco total de uma j MM 4 : mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama, em que a SE avaliação de risco genético envolve a detecção, em uma . amostra biológica derivada da mulher, a presença de pelo . menos dois polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associados a um fenótipo de câncer de mama, e determinar se a combinação de avaliação. de risco clínico com os resultados de avaliação de risco genético em uma reclassificação do risco do indivíduo para oO desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama.

Em uma modalidade, a melhoria de reclassificação líquida (NRI) do método é maior do que 0,01, mais preferivelmente maior do que 0,05, e ainda mais preferivelmente maior do que 0,08. Em uma modalidade adicional, a NRI é de cerca de 0,09.

Em uma modalidade, o risco de 5 anos determinado pela avaliação de risco clínico está entre cerca de 1,5% até cerca de 2%. Nesta modalidade, é preferível que a melhoria de reclassificação líquida (NRI) do método seja maior do que 0,1, de preferência maior do que 0,12, e ainda mais preferivelmente maior do que 0,15. Em uma modalidade adicional, a NRI é de cerca de 0,195.

Exemplos de procedimentos adequados de avaliação de risco clínica incluem, mas não estão limitados ao Modelo de Gail, modelo de Claus, Tabelas de Claus, BOADICEA, Modelo de Jonker, fórmula estendida de Claus, modelo de Tyrer- Cuzick e o Sistema de Pontuação de Manchester. De preferência, a avaliação de risco clínico é obtida utilizando o Modelo de Gail.

Em uma modalidade, a avaliação de risco clínico inclui a obtenção de informações da mulher em um ou mais dos

" seguintes: histórico médico de câncer de mama, carcinoma .“. ductal ou carcinoma lobular, idade, idade da primeira . menstruação, idade em que ela primeiro deu à luz, histórico - de câncer de mama, resultados das biópsias de mama 5 anteriores e raça/etnia. ] Preferivelmente, o método compreende detectar a presença de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez polimorfismos de nucleotídeo únicos conhecidos por estarem associados a um fenótipo de câncer de mama.

Mais preferivelmente, o método compreende detectar ; a presença de sete, oito, nove ou dez polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associado a um fenótipo de câncer de mama.

Em uma modalidade preferida, os polimorfismos de nucleotídeo único são selecionados a partir de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rs889312, rsl3387042, rS13281615, rs4415084 e rs3817198, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

Em uma modalidade preferida adicional, os polimorfismos de nucleotídeo único são selecionados a partir de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rs889312, rsl3387042, rsl3281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950 e rsl1249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

Com relação a essas duas modalidades, é preferível que o método compreenda detectar a presença de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez dos polimorfismos de nucleotídeo único, mais preferivelmente sete, oito, nove ou dez dos polimorfismos de nucleotídeo único.

| 1 6 | 1 Em uma modalidade, os polimorfismos de nucleotídeo Í ”” único são testados individualmente quanto à associação com . câncer de mama por meio de regressão logística sob um - modelo aditivo logarítmico sem covariáveis.

Em outra modalidade, os polimorfismos de nucleotídeo único são testados em combinação para a associação com câncer de mama.

De preferência, a combinação da avaliação do risco clínico com a avaliação do risco genético compreende a multiplicação das avaliações de risco.

A mulher pode ser de qualquer raça, como caucasiana, negroide, australoide ou mongoloide.

Em uma modalidade ! preferida, a fêmea é caucasiana.

De preferência, a fêmea é ' pós-menopausa.

Surpreendentemente, os inventores verificaram que a combinação da análise de polimorfismo de nucleotídeo único com a avaliação de risco clínico fornece um benefício claro | nas mulheres que tiveram uma biópsia prévia da mama.

Assim, | em uma modalidade preferida, a mulher teve uma biópsia da mama.

Os inventores também verificaram que a combinação da análise de polimorfismo de nucleotídeo único com a | avaliação de risco clínico fornece um benefício claro na possível reclassificação das mulheres cuja avaliação de risco clínico indica que elas têm um risco de desenvolver j câncer de mama.

Assim, em outra modalidade preferida, os | resultados da avaliação de risco clínico indicam que a ! mulher deve ser submetida a triagens mais frequentes e/ou terapia anticâncer de mama profilática.

Em uma modalidade adicional, se for determinado que a

É MM 7 ' indivídua tem um risco de desenvolver câncer de mama *. utilizando um método da invenção, a indivídua é mais | . suscetível de ser responsiva à inibição do estrogênio do . que não responsiva.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um sistema para avaliar o risco global de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama compreendendo: instruções do sistema para a realização de uma avaliação de risco clínico da mulher; instruções do sistema para a realização de uma avaliação de risco genético da mulher; e instruções do sistema para combinar a avaliação do risco clínico com a avaliação de risco genético para obter o risco global de uma mulher para o desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama. De preferência, o sistema é um sistema implementado por computador. Em uma modalidade, o sistema compreende ainda: um conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores configurados para detectar, em uma amostra biológica derivada da mulher, a presença de pelo menos dois | polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer de mama; um detector que é configurado para detectar uma ou mais saídas de sinal a partir do conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores, ou um amplicon produzido a partir do conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores, deste modo identificando a presença ou ausência de, pelo menos, dois polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associados à um fenótipo de câncer de mama.

| MM 8 . Em uma modalidade, oO detector detecta uma ou mais .” emissões de luz, em que a emissão de luz é indicativa da ' presença ou ausência do polimorfismo de nucleotídeo único. - Em uma modalidade adicional, o sistema compreende uma amostra biológica derivada da mulher. Em uma modalidade adicional, à amostra compreende DNA genômico, DNA genômico amplificado, CDNA, CDNA amplificado, RNA ou RNA | amplificado. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um Kkit compreendendo pelo menos dois grupos de iniciadores para amplificar dois ou mais ácidos nucléicos, em que os dois ou mais ácidos nucléicos compreendem um polimorfismo de nucleotídeo único selecionado de um grupo consistindo de rs2981582, Trs3803662, rs889312, rsl3387042, +YSsS13281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950 é rs11249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

Exemplos de iniciadores adequados para um kit da invenção são fornecidos na Tabela 6.

O kit pode compreender ainda outros reagentes necessários para realizar uma reação de amplificação, como um tampão, nucleotídeos e/ou uma polimerase, bem como reagentes para a extração de ácidos nucléicos de uma amostra.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um arranjo genético compreendendo pelo menos dois ácidos nucleicos que compreendem de forma independente um único polimorfismo de nucleotídeo selecionado de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rs889312, rs13387042, rs13281615, rs4415084, rYrs3817198, rs4973768, rs6504950 e

| ; 9 7 rs11249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em .. desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos. . De preferência, o arranjo compreende ácidos nucléicos . que representam cada alelo conhecido de cada SNP. | Em outro aspecto, a presente invenção fornece um | método para determinar a necessidade de testes de diagnóstico de rotina de uma mulher para o câncer de mama compreendendo a avaliação do risco geral do indivíduo para o desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama utilizando um método da invenção.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método de triagem para o câncer de mama em uma mulher, o método compreendendo a avaliação do risco global da mulher | desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método da invenção, e rotineiramente fazer a triagem para o câncer de mama na mulher, se elas forem avaliadas como tendo um rísco de desenvolver câncer de mama.

Exemplos de métodos adequados de rastreamento do câncer de mama incluem, mas não estão limitados, ao exame de mama manual e mamografia.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para determinar a necessidade de uma mulher da | terapia anticâncer de mama profilática compreendendo a | avaliação do risco geral da mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método da invenção. i Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um | método para prevenção do câncer de mama em uma mulher, o método compreendendo a avaliação do risco global da mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método da invenção, e a administração de uma terapia

| Oo MEM 10 ? anticâncer de mama à mulher, se forem avaliadas como tendo .“” um risco para desenvolver câncer de mama. . Exemplos de terapias anticâncer de mama adequadas . incluem, mas não estão limitadas, à administração de tamoxifeno ou raloxifeno.

Em uma modalidade, a terapia inibe o estrogênio.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para estratificar um grupo de mulheres para um ensaio clínico de uma terapia candidata, o método compreendendo à avaliação do risco global individual dos indivíduos para desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método da invenção, e usando os resultados da avaliação para selecionar indivíduos mais propensos a serem ' responsivos à terapia.

Como será evidente, pelo menos algumas características dos métodos, kits e sistemas podem ser usadas em conjunto em combinação. Por exemplo, sistemas para detectar moduladores podem ser usados para a prática dos métodos de detecção moduladora. Sistemas para identificar correlações entre o fenótipo de câncer de mama e os polimorfismos podem ser utilizados para praticar os métodos da presente invenção. Kits podem ser usados para praticar os métodos da presente invenção. Deste modo, características descritas dos sistemas, métodos e kits podem ser aplicadas aos diferentes sistemas, métodos e kits da presente invenção.

Em todo este relatório descritivo, a palavra “compreende” (comprise), ou variações como “compreende” (comprises) ou “compreendendo”, serão entendidas como implicando na inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa estabelecida, ou grupo de elementos, números inteiros

| d' 11 :' ou etapas, porém não a exclusão de qualquer outro elemento, Go número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números : . inteiros ou etapas. . A invenção é doravante descrita a título dos Exemplos não limitativos a seguir e com referência às figuras em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS EM ANEXO ! A figura 1 mostra os resultados de um teste de Hosmer- Lemeshow para avaliar a calibração das pontuações de risco | 10-SNP. A figura 2 mostra as curvas características de operação do receptor para as pontuações de risco 7-SNP e 10-SNP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas Gerais e Definições A menos que seja especificamente definido de outra | forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento devem ser considerados como tendo o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa normalmente versada na técnica (por exemplo, em cultura de células, análise de câncer de mama, genética molecular, imunologia, imunoistoquímica, química de proteínas e bioquímica). | Salvo indicação em contrário, as técnicas de proteína j recombinante, cultura de células e imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tais como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al.,

À 12 : Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour o Laboratory Press (1989), T.A.

Brown (editor), Essential . Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL . Press (1991), D.M.

Glover e B.D.

Hames (editors), DNA | Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), e F.M.

Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.

Associates and | Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o momento), Ed Harlovwv e David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E.

Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o momento). Deve ser compreendido entender que essa invenção não se limita às modalidades particulares que podem, obviamente, variar.

Também deve ser compreendido que a terminologia utilizada aqui é com a finalidade de apenas descrever modalidades particulares, e não se destina a ser um fator limitante.

Conforme utilizado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, os termos nas formas no singular e plural “um”, “uma” e “o”, por exemplo, opcionalmente incluem referências no plural, a menos que o conteúdo claramente estabeleça de outra maneira.

Deste modo, por exemplo, a referência a uma “sonda” opcionalmente | inclui uma pluralidade de moléculas de sonda; da mesma : forma, dependendo do contexto, o uso do termo “um ácido nucleico” opcionalmente inclui, como uma questão prática, muitas cópias daquela molécula de ácido nucleico,. Como usado aqui, “fenótipo de câncer de mama” se refere a um fenótipo que apresenta uma predisposição para

| o 13 : desenvolver câncer de mama em um indivíduo. Um fenótipo que ” apresenta uma predisposição para o câncer de mama pode, por . exemplo, apresentam uma maior probabilidade de que o câncer . vai se desenvolver em um indivíduo com o fenótipo do que em membros de uma população geral relevante sob um dado conjunto de condições ambientais (dieta, regime de | atividade física, localização geográfica, etc.). Como usado aqui, “amostra biológica” se refere a qualquer amostra que pode ser de ou derivada de um paciente humano, por exemplo, fluidos corporais (sangue, urina, | saliva, etc.), biópsia, tecidos e/ou resíduos do paciente. Deste modo, biópsias de tecidos, fezes, escarro, saliva, sangue, linfa, lágrimas, suor, urina, secreções vaginais ou similares podem ser facilmente rastreadas para SNPs, assim como essencialmente qualquer tecido de interesse que contenha os ácidos nucléicos apropriados. Estas amostras são tipicamente tomadas, após consentimento informado, de um paciente por métodos de laboratório médico padrão. A amostra pode estar na forma tomada diretamente do paciente, ou pode ser pelo menos parcialmente processada (purificada) para remover pelo menos parte do material que não é ácido nucleico.

Um “polimorfismo” é um locus que é variável; isto é, | dentro de uma população, a sequência de nucleotídeos em um polimorfismo tem mais do que uma versão ou alelo. Um | exentlo de um polimorfismo é um “polimorfismo de | nucleotídeo único”, que é um polimorfismo em uma posição de nucleotídeo única em um genoma (o nucleotídeo na posição especificada varia entre indivíduos ou populações). Como usado aqui, o termo “SNP“ ou “polimorfismo de

| MM l 14 ' nucleotídeo único" se refere a uma variação genética entre | SS os indivíduos; por exemplo, uma única posição de base . nitrogenada no DNA de organismos que é variável. Como usado . aqui, “SNPsS” é o plural de SNP. Obviamente, quando for feita referência ao DNA neste documento, tal referência pode incluir derivados do DNA, tais como amplicons, transcrições de RNA dos mesmos, etc.

O termo “alelo” se refere a uma ou duas ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que ocorrem ou são codificadas em um locus específico, ou duas ou mais sequências de polipeptídeos diferentes codificadas por tal locus. Por exemplo, um primeiro alelo pode ocorrer em um cromossomo, enquanto um segundo alelo ocorre em um segundo cromossomo —."homólogo, Ppor exemplo, como ocorre para diferentes cromossomos de um indivíduo heterozigoto, ou entre diferentes indivíduos homozigóticos ou heterozigóticos em uma população. Um alelo se correlaciona “positivamente” com uma característica quando é ligado a ela e quando a presença do alelo é um indicador de que a característica ou forma da característica irá ocorrer em um indivíduo compreendendo o alelo. Um alelo se correlaciona “negativamente” com uma característica quando ele está ligado a ela e quando a presença do alelo é um indicador de que uma característica ou forma da característica não irá ocorrer em um indivíduo compreendendo o alelo.

Um polimorfismo marcador ou alelo é “correlacionado” ou “associados” com um fenótipo especificado (susceptibilidade ao câncer de mama, etc.) quando ele pode ser estatisticamente ligado (positiva ou negativamente) com o fenótipo. Métodos para determinar se um polimorfismo ou

| 15 ! " alelo é estatisticamente ligado são conhecidos pelas Vs pessoas versadas na técnica. Isto é, o polimorfismo . especificado ocorre mais comumente em uma população de caso . (por exemplo, pacientes com câncer de mama) do que em uma população de controle (por exemplo, indivíduos que não têm câncer de mama). Essa correlação é comumente inferida como sendo causal na natureza, mas não precisa ser ligação 1 genética simples a (associação com) um locus para uma característica que subjacente ao fenótipo é suficiente para ocorrer a correlação/associação.

A frase “desequilíbrio de ligação” (LD) é usada para descrever a correlação estatística entre dois genótipos polimórficos — vizinhos. Normalmente, LD refere-se à correlação entre os alelos de um gameta aleatório nos dois Jloci, assumindo o equilíbrio Hardy-Weinberg (independência estatística) entre os gametas. LD é quantificado com o | parâmetro de Lewontin da associação (D') ou com o coeficiente de correlação de Pearson (r) (Devlin e Risch, 1995). Dois loci com um valor LD de 1 são considerados como estando no LD completo. No outro extremo, dois loci com um valor de LD 0 são considerados como estando em equilíbrio de ligação. O desequilíbrio de ligação é calculado mediante a aplicação do algoritmo de maximização esperado (EM) para a estimativa das frequências de haplótipo (Slatkin e Excoffier, 1996). Os valores LD de acordo com a presente invenção para genótipos/loci vizinhos são selecionados acima de 0,1, de preferência acima de 0,2, mais preferivelmente acima de 0,5, mais preferivelmente acima de 0,6, ainda mais preferivelmente acima de 0,7, acima de 0,8, mais preferivelmente acima de 0,9, idealmente em cerca de k 16 ' 1,0. ”Ú” “Frequência dos alelos" refere-se à frequência . (proporção ou porcentagem) em que um alelo está presente em “ um locus em um indivíduo, em uma linhagem ou em uma população de linhagens. Por exemplo, para um alelo “A”, indivíduos diploides do genótipo “AA”, “Aa” ou “aa” têm | frequências alélicas de 1,0, 0,5, ou 0,0, respectivamente. Pode-se estimar a frequência do alelo em uma linhagem ou | população (por exemplo, casos ou controles) pela média das frequências alélicas de uma amostra de indivíduos daquela linhagem ou população. Da mesma forma, pode-se calcular a frequência do alelo dentro de uma população de linhagens pela média das frequências alélicas de linhas que compõem a população.

Um indivíduo é “homozigoto” se o indivíduo tem apenas um tipo de alelo em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus para cada um dos dois cromossomos homólogos). Um indivíduo é “heterozigótico” se mais de um tipo de alelo estiver presente em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia de cada um dos dois alelos diferentes). O termo “homogeneidade” indica que os membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos. Ao contrário, o termo “heterogeneidade” é | 25 usado para indicar que os indivíduos dentro do grupo diferem no genótipo em um ou mais loci específicos.

Um “locus” é uma posição ou região cromossômica. Por exemplo, um locus polimórfico é uma posição ou região onde | um ácido nucléico polimórfico, determinante da característica, gene ou marcador está localizado. Em mais

DM 17 ' um exemplo, um “locus gênico” é um local de cromossomo "o específico (região) no genoma de uma espécie em que um gene . específico pode ser encontrado.

. Um “marcador”, “marcador molecular” ou “ácido nucleico marcador” se refere à uma sequência de nucleotídeo ou seus produtos codificados (por exemplo, uma proteína), utilizada como ponto de referência na identificação de um locus ou um locus ligado. Um marcador pode ser derivado da sequência nucleotídica genômica ou de sequências de nucleotídeo expressas (por exemplo, de um RNA, nRNA, mRNA, CDNA, etc.) ou de um polipeptídeo codificado. O termo também se refere às sequências de ácidos nucleicos complementares a ou flanqueando as sequências marcadoras, tais como ácidos nucléicos usados como sondas ou pares de iniciadores capazes de amplificar a sequência marcadora. Uma “sonda marcadora”" é uma sequência de ácido nucleico ou molécula que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucléico que é complementar a uma sequência de locus marcador. Os ácidos nucleicos são “complementares” quando hibridizam especificamente em solução, por exemplo, de acordo com as regras de emparelhamento de base de Watson-Crick. Um “locus marcador” é um locus que pode ser usados para rastrear a presença de um segundo locus ligado, por exemplo, um locus ligado ou correlacionado que codifica ou contribui para a variação populacional de uma característica fenotípica. Por exemplo, um locus marcador pode ser usado para monitorar a segregação de alelos em um locus, como um QTL, que são geneticamente ou fisicamente ligados ao locus marcador.

Assim, um “alelo marcador", alternativamente um “alelo de

' um locus marcador” é um de uma pluralidade de sequências de ”V nucleotídeo polimórficas encontradas em um locus marcador . em uma população que é polimórfica para o locus marcador. . Em um aspecto, a presente invenção fornece loci marcadores que se correlacionam com um fenótipo de interesse, por exemplo, suscetibilidade;resistência ao câncer de mama. Espera-se que cada um dos marcadores identificados esteja ! em estreita proximidade física e genética (resultando em | ligação física e/ou genética) com um elemento genético, por | | 10 exemplo, OTL, que contribui para o fenótipo relevante.

Marcadores correspondendo aos polimorfismos genéticos entre os membros de uma população podem ser detectados por métodos bem estabelecidos na técnica. Estes incluem, por exemplo, métodos de amplificação específicos de sequência à base de PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), detecção de marcadores de | isoenzima, detecção de hibridização alelo específica (ASH), detecção de extensão de nucleotídeo único, detecção de hibridização alelo específica, detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma, detecção de replicação de sequência autossustentada, detecção de repetições sequência simples (SSR), detecção de polimorfismos de nucleotídeo únicos (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPsS).

O termo “amplificando” no contexto da amplificação de ácidos nucleicos, é qualquer processo por meio do qual cópias adicionais de um ácido nucléico selecionado (ou uma forma transcrita deste) são produzidas. Métodos de amplificação típicos incluem vários métodos de replicação baseados em polimerase, incluindo a reação em cadeia da

A o 19 : polimerase (PCR), os métodos mediados por ligase como a o reação em cadeia da ligase (LCR) e os métodos de . amplificação à base de RNA polimerase (por exemplo, por bi transcrição). Um “amplicon” é um ácido nucléico amplificado, por exemplo, um ácido nucléico que é produzido pela amplificação de um ácido nucléico molde por qualquer método de amplificação disponível (por exemplo, PCR, LCR, ; transcrição ou similar). | Um ácido nucléico especificado é “derivado de” um dado | ácido nucléico quando ele é construído usando a dada ! sequência de ácido nucléico, ou quando o ácido nucléico especificado é construído usando o dado ácido nucléico.

Um “gene” é uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo(s) em um genoma que juntos codificam uma ou mais moléculas expressas, por exemplo, um RNA, ou polipeptídeo.

O gene pode incluir sequências codificadoras que são transcritas em RNA que pode então ser traduzido em uma sequência de polipeptídica, e pode incluir sequências estruturais Ou regulatórias associadas que ajudam na replicação ou | expressão do gene.

Í Um “genótipo” é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos.

Genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais loci conhecidos do indivíduo, tipicamente, a | compilação de alelos herdados de suas origens.

Um “haplótipo” é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de loci genéticos em uma fita de DNA simples. | Tipicamente, os loci genético descritos por um haplótipo são fisicamente e geneticamente ligados, ou seja, na mesma pp aa sÀoógó á | 20 ' fita cromossômica. ”V Um “conjunto” de marcadores, sondas ou iniciadores . refere-se à uma coleção ou grupo de marcadores, sondas, . iniciadores ou dados derivados desses, usada para um propósito comum, por exemplo, identificação de um indivíduo com um genótipo específico (por exemplo, o risco de desenvolver câncer de mama) . Frequentemente, dados ' correspondentes aos marcadores, sondas ou iniciadores, ou | derivados de seus usos, são armazenados em um meio i eletrônico.

Embora cada um dos membros de um conjunto possua utilidade no que diz respeito à finalidade especificada, marcadores individuais selecionados do conjunto, bem como subconjuntos incluindo alguns, porém não todos os marcadores, também são eficazes para atingir a finalidade especificada.

Os polimorfismos e genes, e sondas marcadoras correspondentes, amplicons ou iniciadores descritos acima podem ser incorporados em qualquer sistema da presente invenção, seja na forma de ácidos nucléicos físico ou na forma de instruções do sistema que incluem informações de sequências para os ácidos nucléicos.

Por exemplo, o sistema pode incluir iniciadores ou amplicons correspondentes a (ou que amplificam uma parte de) um gene ou polimorfismo aqui descrito.

Como nos métodos acima, o conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores opcionalmente detecta uma pluralidade de polimorfismos em uma pluralidade dos ditos genes ou loci genético.

Assim, por exemplo, o conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores detecta pelo menos um polimorfismo em cada um desses polimorfismos ou genes, ou qualquer outro polimorfismo, gene ou locus definido aqui. |

E TEEN o 21 " Qualquer tal sonda ou iniciado pode incluir uma sequência ” nucleotídica de qualquer tal polimorfismo ou gene, ou um R ácido nucléico complementar do mesmo, ou um produto . transcrito do mesmo (por exemplo, uma forma nRNA ou mRNA produzida à partir de uma sequência genômica, por exemplo, por transcrição ou união).

Como usado aqui, “regressão logística” refere-se aos métodos para prever a probabilidade de ocorrência de um evento por ajuste de dados a uma curva logística. Uma pessoa versada na técnica vai entender como empregar tais métodos no contexto da invenção.

Como usado aqui, “teste Hosmer-Lemeshow' se refere a um método estatístico para medir a falta de ajuste. Métodos de tal uso são bem conhecidos na técnica (Hosmer DW, Lemeshow S. Applied Logistic Regression Nova Iorque: Wiley, 1989: Seção 5.2.2).

Como usado aqui, “Curvas características de operação do receptor” refere-se a uma plotagem gqráfica da sensibilidade vs. (1-especificidade) para um sistema classificador binário, conforme o seu limiar de discriminação varia. A ROC também pode ser representada de forma equivalente plotando a fração de verdadeiros positivos (TPR = taxa positiva verdadeira) versus a fração de falsos positivos (FPR = taxa de falso positivo). Também conhecido como curva Característica de Operação Relativa, | devido ao fato de ser uma comparação de duas | características operacionais (TPR e FPR), conforme o critério muda. A análise ROC fornece ferramentas para possivelmente selecionar modelos ótimos e para descartar os subótimos independentemente de (e antes de especificar) o |

CS 22 ' contexto de custo ou a distribuição de classes. A análise Co ROC está relacionada de forma direta e natural com à | . análise de custo/benefício da realização da decisão de . diagnóstico. A curva ROC foi desenvolvida por engenheiros “5 eletricistas e engenheiros de radar durante a Segunda Guerra Mundial para detectar objetos inimigos em campos de batalha, também conhecida como à teoria de detecção de sinais, e logo foi introduzida em psicologia para explicar a detecção de percepção de sinais. A análise ROC, desde então, tem sido usada na medicina, radiologia e outras áreas por muitas décadas, e foi introduzida recentemente em outras áreas como aprendizado de máquinas e mineração de dados. Métodos de uso no contexto da invenção serão claros para as pessoas versadas na técnica. Como usado aqui, o termo “combinação da avaliação do | risco clínico com a avaliação de risco genético para obter o risco global" refere-se a qualquer análise matemática adequada se baseando nos resultados das duas avaliações. Por exemplo, os resultados da avaliação de risco clínico e da avaliação de risco genético podem ser adicionados, ainda mais preferivelmente multiplicados.

Como usado aqui, os termos “rotineiramente fazendo a triagem para o câncer de mama” e “triagem mais frequente” são termos relativos, e são baseados em uma comparação com o nível de triagem recomendado para um indivíduo que não tem risco identificado de desenvolver câncer de mama.

Avaliação do Risco Clínico Qualquer procedimento de avaliação de risco clínico adequado pode ser usado na presente invenção. De preferência, a avaliação do risco clínico não envolve a

2 ' ' - 23 : genotipagem da mulher em um ou mais Jloci.

Em uma v . modalidade, o processo de avaliação de risco clínico inclui : . a obtenção de informações da mulher em um ou mais dos | - seguintes: histórico médico de câncer de mama, carcinoma ductal ou carcinoma lobular, idade, idade da primeira menstruação, como à idade do primeiro período menstrual, idade em que ela primeiro deu à luz, histórico familiar de câncer de mama ou outro câncer incluindo a idade do parente e no momento do diagnóstico, resultados das biópsias de mama anteriores, uso de contraceptivos orais, índice de massa ! corporal, histórico de consumo de álcool, histórico de tabagismo, histórico de exercício, dieta e raça/etnia.

Exemplos de procedimentos de avaliação de riso clínico incluem, mas não estão limitados ao Modelo de Gail (Gail et al, 1989, 1999 e 2007; Costantino et al., 1999; Rockhill et al., 2001.), O modelo Claus (Claus et al., 1994 e 1998), Tabelas de Claus, BOADICEA (Antoniou et al., 2002 e 2004), o Modelo Jonker (Jonker et al., 2003), a Fórmula Estendida ! de Claus (van Asperen et al., 2004), o modelo de Tyrer- i Cuzick (Tyrer et al,, 2004), o Sistema de Pontuação | Manchester (Evans et al., 2004), e similares.

Em uma modalidade preferida, o processo de avaliação de risco clínico é o Modelo de Gail.

O modelo de Gail é um modelo estatístico que constitui a base de uma ferramenta de avaliação de risco de câncer de mama, em homenagem ao Dr.

Mitchell Gail, Pesquisador Sênior do Ramo de Bioestatística da Divisão de Epidemiologia de Câncer e Genética do NCT.

O modelo usa o histórico médico pessoal da própria mulher (número de biópsias de mama | 30 anteriores e à presença de hiperplasia atípica em qualquer o | 24 . espécime de biópsia de mama anterior), sua própria história Ex reprodutiva (idade no início da menstruação e idade no primeiro parto de uma criança) e o histórico de câncer de - mama entre seus parentes de primeiro grau (mãe, irmãs, j filhas) para estimar o seu risco de desenvolver câncer de ! mama invasivo em períodos específicos de tempo. Dados do : Projeto de Demonstração de Detecção de Câncer de Mama | (BCDDP), que foi um estudo de varredura de câncer de mama conjunto da American Cancer Society e do NCI que envolveu

280.000 mulheres com idades entre 35 a 74 anos, e do Programa de Sobrevivência, Epidemiologia e Resultados Finais (SEER) do NCI foram utilizados no desenvolvimento do modelo. Estimativas para as mulheres americanas africanas foram baseadas em dados do Estudo das Experiências contraceptivas e reprodutivas de mulheres (CARE) e dos dados SEER. Participantes do CARE incluíram 1.607 mulheres com e 1,637 sem câncer de mama invasivo. O modelo de Gail foi testado em grandes populações de mulheres brancas e demonstrou fornecer estimativas precisas para o risco de câncer de mama. Em outras palavras, O modelo foi “validado” para as mulheres brancas. Ele também foi testado em dados da Women's Health Initiative para | | mulheres americanas africanas, e o modelo funciona bem, mas pode subestimar o risco em mulheres americanas africanas com biópsias anteriores. O modelo ainda precisa ser validado para mulheres hispânicas, mulheres asiáticas e outros subgrupos, e os resultados devem ser interpretados por um prestador de cuidados de saúde para mulheres com fatores de risco especiais, tais como mulheres tratadas para doença de Hodgkin com radiação no peito e portadores

So. )oê,) SSíUÊPAÁAAAOA 25 ' de mutações gênicas que aumentam o risco de câncer de mama.

Vs Os pesquisadores estão realizando estudos adicionais, t . incluindo estudos com populações minoritárias, para . recolher mais dados e para testar e melhorar o modelo.

Avaliação de Risco Genético A avaliação de risco genético é realizada através da análise do genótipo do indivíduo em dois ou mais loci para os polimorfismos de nucleotídeo únicos conhecidos por | estarem associados com um fenótipo de câncer de mama.

Como Í oO destinatário qualificado irá perceber, cada SNP tem uma razão de probabilidade de associação com o câncer de mama maior do que 1,0, mais preferivelmente maior que 1,02. Exemplos de tais SNPs incluem, mas não estão limitados, àqueles designados rs2981582, rs3803662, rs889312, rs513387042, xrs13281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950, RS1 1249433, Yrsl0941679, rs2180341, rs3744448, rs16943468, rsl011970, rs2380205, rsl10995190, rs704010 e rs614367 (ver Tabela 1), ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos. | Tabela 1. Exemplos de SNPs associados com um fenótipo de câncer de mama. dbSNP 1,30) 2007 1,24) 2007 —.—— o e 1,16) 2007 pc 26 | o 2 ) 1,26) 2007 . 5 ) 1,11) 2007 mm o is 1,21) 2008 1,11) 2007 1,13) 2 1,09) 3 1,19) 2009 eee do e 9 1,50) 2009 8 1,80) 2009 1,12) 2010 1,30) 2010 o 1,16) 2010 Te eis cimo 1,17) 2010 [essiaset | Jangas nao coslmunmbna, et aa]

a Bão ” Em uma modalidade preferida, os polimorfismos de . nucleotídeo único são selecionados a partir de um grupo . composto de rs2981582, rs3803662, rs889312, rsl3387042, rs13281615, rs4415084, rs3817198 ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos. Em uma modalidade preferida adicional, os polimorfismos de nucleotídeo único são selecionados de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rs889312, rs13387042, rsl3281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950 e rs11249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

A pessoa versada na técnica pode prontamente identificar SNPs em desequilíbrio de ligação com aquelas especificamente mencionadas aqui. Exemplos de tais SNPs incluem rsl219648 e rs2420946, que estão em desequilíbrio de ligação forte com a rs2981582 (exemplos possíveis adicionais fornecidos na Tabela 2), rs12443621 e rs8051542, que estão em desequilíbrio de ligação forte com SNP rs3803662 (exemplos possíveis adicionais fornecidos na Tabela 3), e rsl0941679, que está em desequilíbrio de ligação forte com o SNP rs4415084 (exemplos possíveis adicionais fornecidos na Tabela 4). Além disso, exemplos de SNPs em desequilíbrio de ligação com rs13387042 são fornecidos na Tabela 5.

Tabela 2. Marcadores substitutos para SNP rs2981582. Marcadores com um r2 maior que 0,05 para o rs2981582 no conjunto de dados HAPMAP (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov) em um intervalo de 1Mbp flanqueando o marcador foram

CS 28 . selecionados.

É mostrado o nome do SNP correlacionado, os ” valores para r2 e D' para rs2981582, e o valor LOD correspondente, bem como a posição do marcador substituto . no NCB Build 36. rsID Posição |SNP Local LOD DbSNP correlacionad o 2 7 6 8 2 2 7 8 3 2 7 1 8 6 2 7 2 3 2 7 4 8 1 2 7 5 6 4 bs pt] 2 7 4 6 8 2 7 8 5 2 7 4 5 2 7 6 5 2 7 5 2

RN o 29 , rs298158 [12334230 |r9rs2935717 12342623 |0,92 [0,16 |7,3 Cs 2 7 6 6 5 ] 2 7 5 1 2 7 4 6 2 7 o 6 8 2 7 2 3 2 7 2 6 2 7 3 2 7 pr A 2 7 o 8 2 7 7 2 sp pote 2 7 9 6 Tabela 3. Marcadores substitutos para SNP rs3803662. Marcadores com um r2 maior do que 0,05 para rs3803662 no conjunto de dados HAPMAP (http://hapmap.ncbi.nlim.nih.gov) em um intervalo de 1Mbp flanqueando o marcador foi selecionado.

É mostrado o nome do SNP correlacionado, os valores para r2 e D' para rs3803662 e o valor LOD correspondente, bem como a posição do marcador substituto no NCB Build 36. [ppswe — Jposição [mr = Ínocar >' | = lxoo | oi A%.A)5l$ZAETTAEZHY “<"-")=4 2"

ELE . o . 2 9 8 1 8 FF: 2 8 FrF FA: 2 5

FFF FE 2 o o Fr: 2 o FFF EA: 2 4 o 2 o o 5 2 6 o 9 — Ferri 2 8 8 : mel 2 4 o 5 2 8 o 5 2 6 6 9

O 31 ' 2 9 6 7 . 2 3 1 8 | pe 2 4 6 5 2 3 1 8 2 6 1 8 sb pe 2 8 6 7 ep piel] 2 5 6 7 2 5 6 2 5 1 4 2 1 2 1 4 ep 2 5 1 4 2 6 6 7 br oo 2 1 1 4 2 mb eo 803662 2 4 6 7 esteios pente 2 7 5

' rs3803662 |5114384 |r9s3112609 5120623 [0,59 [0,16 |4,86 o 2 2 9 3 ' 2 9 1 6 2 6 2 4 2 o 2 5 803662 2 5 8 2 2 4 8 9 2 4 2 7 2 6 2 7 2 2 4 2 Tabela 4. Marcadores substitutos para SNP rs4415084, Marcadores com um r2 maior do que 0,05 para rs4415084 no conjunto de dados HAPMAP (http://hapmap.ncbi,.nlim.nih.gov) em um intervalo de 1Mbp flanqueando oO marcador foram selecionados.

É mostrado o nome do SNP correlacionado, os valores para r2 e D' para rs4415084 e o valor LOD correspondente, bem como a posição do marcador substituto em NCB Build 36. rsID Posição |SNP Local DbSNP Correlacionad o

º rs441508 4469827 |rs12522626 4472145 |1,00 |1,0 [47,3 o 4 2 5 o 7 | . 4 2 5 o 6 4 | 4 2 2 o 8 8 4 2 8 o 3 o ! 4 2 4 o 7 4 2 7 o 7 — Eee 4 2 8 8 6 4 2 7 8 7 9 4 2 6 2 5 1 4 2 4 2 8 9 4 2 3 8 9 6 | 4 2 2 8 6 9 | 4 2 5 2 8 9 4 2 2 9 8 4 j MD o 34 " 4 2 9 2 6 5 . 4 2 2 8 9 6 eb er 4 2 6 5 6 5

ED 4 2 3 8 9 4 2 3 7 4 8 4 2 7 1 5 o 4 2 3 3 4 4 4 2 6 2 5 1 4 2 3 8 8 6 | 4 2 3 8 2 o 4 2 8 8 4 6 4 2 o 3 5 9 4 2 3 8 E) 6 4 2 5 8 6 9 4 2 7 8 8 6

| MS o 35 ' rs441508 [4469827 |rs987394 4488213 [0,94 |0,74 |29,7 o 4 2 5 8 9 6 ] 4 2 9 8 8 6 4 2 5 8 9 6 4 2 7 2 7 2 | 4 2 8 1 4 2 Tabela 5. Marcadores substitutos para SNP rs13387042. Marcadores com um r2 maior do que 0,05 para rsl3387042 no conjunto de dados HAPMAP (http://hapmap.ncbi.nim.nih.gov) em um intervalo de 1Mbp flanqueando o marcador foram selecionados.

É mostrado o nome do SNP correlacionado, os valores para r2 e D' para rsl3387042 e oO valor LOD correspondente, bem como a posição do marcador substituto no NCB Build 36. rsID Posição |SNP Local LOD DbSNP Correlacionad | o 2 7 o 5 4 2 7 8 9 6 2 7 9 5 4 2 7 8 1 2

NO 36 ' rs1338704 [21761407 |rsl17835044 21763185 |1 0,35 [16,1 -º 2 7 o 1 2 . 2 7 1 3 2 7 6 3 3 2 7 9 9 7 2 7 3 3 2 2 7 2 5 8 2 7 4 3 1 2 7 6 1 1 2 7 4 2 9 2 7 6 3 7 e 2 7 9 9 4 2 7 8 9 9 2 7 2 6 2 1 2 7 4 2 7

| MD 37 . 2 7 9 2 6 5 . 2 7 1 3 2 2 7 o 8 8 2 7 8 6 2 2 7 o 6 2 | 2 7 6 5 2 2 7 7 5 2 2 7 2 8 3 Em uma modalidade preferida, dois ou mais SNPs, pelo menos, incluem rs2981582, ou um SNP em desequilíbrio de ligação com ele, como rxsl219648 Ou rYs2420946, Mais preferivelmente, os dois ou mais SNPs, pelo menos, incluem adicionalmente rs3803662 e rs889312, ou SNPs em desequilíbrio de ligação com eles.

Ainda mais | preferivelmente, os dois ou mais SNP, pelo menos ainda | adicionalmente incluem rs13387042 e rs4415084, ou SNPs em desequilíbrio de ligação com eles.

Estratégias de Amplificação de Marcador Os iniciadores de amplificação para marcadores de amplificação (por exemplo, marcador loci) e sondas adequadas para detectar tais marcadores ou para genotipar uma amostra com relação a alelos marcadores múltiplos pode ser usada na invenção.

Por exemplo, a seleção de o Li 38 ' iniciadores para PCR de longa faixa é descrita em US 10/042.406 e em US 10/236.480; para curta faixa, US . 10/341.832 fornece orientação em relação à seleção de . iniciador. Além disso, existem programas disponíveis publicamente como "“Oligo”, disponível para design de iniciadores. Com tal seleção de iniciador disponível e design de software, a sequência do genoma humano publicamente disponível e os locais de polimorfismo, uma pessoa versada na técnica pode construír iniciadores para amplificar os SNPs para praticar a invenção. Além disso, será percebido que a sonda precisa para ser usada para a detecção de um ácido nucléico compreendendo um SNP (por exemplo, um amplicon compreendendo o SNP) pode variar, por exemplo, qualquer sonda que pode identificar a região de um amplicon marcador a ser detectada pode ser usada em conjunto com a presente invenção. Além disso, a configuração das sondas de detecção pode, obviamente, variar. Deste modo, a invenção não se limita às sequências citadas aqui.

De fato, será percebido que a amplificação não é um requisito para a detecção do marcador, por exemplo, uma pessoa pode detectar diretamente DNA genômico não amplificado simplesmente realizando um Southern blot em uma amostra de DNA genômico. Procedimentos para a realização de Southern blotting, amplificação padrão (PCR, LCR, Ou similares) e muitos outros métodos de detecção de ácidos nucleicos são bem estabelecidos e são ensinados, por exemplo, em Sambrook et al. (Supra).

Sondas de detecção separadas também podem ser omitidas nos métodos de amplificação/detecção, por exemplo, |

Po NE 39 : realizando uma reação de amplificação em tempo real que | - detecta a formação do produto por modificação do iniciador ! ' de amplificação relevante na incorporação em um produto, . incorporação de nucleotídeos marcados em um amplicon, Ou monitoramento de mudanças nas propriedades de rotação molecular de amplicons em comparação com precursores não amplificados (por exemplo, por polarização de fluorescência). Tipicamente, os marcadores moleculares são detectados por qualquer método estabelecido disponível na técnica, incluindo, sem limitação, hibridização específica de alelo (ASH), detecção de extensão de nucleotídeo único, hibridação de arranjo (opcionalmente incluindo ASH), ou outros métodos para a detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), detecção do polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), detecção de sequência variável amplificada, DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD), detecção de polimorfismo de crescimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de replicação de sequência autossustentada, detecção de repetição de sequência simples (SSR), polimorfismos de conformação de fita simples (SSCP), detecção de marcadores de isozima, análise northern (onde os níveis de expressão são utilizados como marcadores), amplificação quantitativa de mRNA ou CcDNA, ou similares. | Exemplos de iniciadores de oligonucleotídeos úteis para amplificar ácidos nucléicos compreendendo SNPs conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer : de mama são fornecidos na Tabela 6. Conforme a pessoa | 30 versada na técnica vai perceber, a sequência da região

NEN 40 * genômica para a qual esses oligonucleotídeos hibridizam . pode ser usada para projetar iniciadores que são mais ' longas na extremidade 5' e/ou 3', possivelmente mais curtos . em 5' e/ou 3' (contanto que a versão contada ainda possa ser usada para a amplificação), que tem uma ou algumas diferenças de nucleotídeos (mas mesmo assim ainda pode ser usada para amplificação), ou que não compartilhe nenhuma similaridade de semelhança com aquelas fornecidas, mas que são projetadas com base em sequências genômicas perto de onde os oligonucleotídeos especificamente fornecidos hibridizan e que ainda podem ser usados para a amplificação.

Técnicas Exemplares para Detecção do Marcador

Marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre os membros de uma população podem ser detectados por vários métodos bem estabelecidos na técnica (por exemplo, amplificação específica de sequência à base de PCR, polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), marcadores isoenzimáticos, análise northern, hibridização alelo específica (ASH), hibridização à base de arranjo, sequências variáveis amplificadas do genoma, replicação de sequência autossustentada, repetição de sequência simples (SSR), polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (“RAPD”) ou polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLP). Em uma modalidade adicional, a presença ou ausência de um marcador molecular é determinada simplesmente através do sequenciamento de nucleotídeos da região marcadora polimórfica.

Qualquer um desses métodos é prontamente adaptado para a análise de alta produtividade.

' Tabela 6. Exemplos de iniciadores de oligonucleotídeo o úteis para a invenção. o free sega = | : Algumas técnicas para detectar marcadores genéticos utilizam a hibridação de uma sonda de ácido nucléico para ácidos nucléicos correspondendo ao marcador genético (por exemplo, ácidos nucléicos amplificados produzidos usando DNA genômico como um molde). Formatos de hibridização, incluindo, mas sem se limitar, a: ensaios de hibridização

|

. em fase de solução, fase sólida, fase mista, ou em ensaios + de hibridização são úteis para a detecção de alelos. Um , guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é . encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier, Nova Iorque, assim como em Sambrook et al. (Supra).

Por exemplo, os marcadores que compreendem polimorfismos de comprimento de fragmento (RFLP) são detectados, por exemplo, por hibridização de uma sonda que é tipicamente um subfragmento (ou um oligonucleotídeo sintético correspondente a um subfragmento) do ácido nucléico a ser detectado ao DNA genômico digerido por restrição. A enzima de restrição é selecionada para fornecer fragmentos de restrição de pelo menos dois comprimentos alternativos (ou polimórficos) em diferentes indivíduos ou populações. Determinar uma ou mais enzimas de restrição que produzem fragmentos informativos para cada alelo de um marcador é um procedimento simples, bem conhecido na técnica. Após a separação por comprimento em uma matriz apropriada (por exemplo, agarose ou poliacrilamida) e transferir para uma membrana (por exemplo, nitrocelulose, náilon, etc.), a sonda marcada é hibridizada sob condições que resultam em equilíbrio de ligação da sonda ao alvo seguido pela remoção do excesso de sondas por lavagem.

Sondas de ácidos nucléicos para os loci marcadores podem ser clonados e/ou sintetizados. Qualquer marcador adequado pode ser usado com uma sonda para uso na invenção.

Marcadores detectáveis adequados para uso com sondas de

| - ácido nucléico incluem, por exemplo, qualquer composição : detectável .por técnicas de meios espectroscópicos, ' radioisotópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, " elétricos, óticos ou químicos.

Marcadores úteis incluem biotina para a coloração com conjugado de estreptavidina | marcado, pérolas .— magnéticas, corantes fluorescentes, | radiomarcadores, enzimas e marcadores calorimétricos. | Outros marcadores incluem ligantes que se ligam aos | anticorpos marcados com fluoróforos, agentes | quimiluminescentes e enzimas.

Uma sonda também pode constituir iniciadores de PCR que são usados para gerar um amplicon radiomarcado.

Estratégias de marcação para a marcação de ácidos nucléicos e estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, por exemplo, em Haugland (2003) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Nona Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene Oreg.). Detalhes adicionais sobre estratégias de detecção de marcador são encontrados abaixo.

Métodos de Detecção à base de Amplificação PCR, RT-PCR e LCR são particularmente de uso amplo como métodos de amplificação e detecção por amplificação para amplificar ácidos nucléicos de interesse (por exemplo, aqueles compreendendo loci marcadores), facilitando a detecção de ácidos nucleicos de interesse.

Detalhes sobre o uso desses e de outros métodos de amplificação podem ser encontrados em qualquer um de uma variedade de textos padrão, incluindo, por exemplo, Sambrook et al. (supra). Muitos textos de biologia disponíveis também ampliaram as discussões sobre métodos de PCR e de amplificação relacionados.

Uma pessoa versada na técnica vai perceber

RD 44 . que essencialmente qualquer RNA pode ser convertido em um | . DNA de dupla fita adequado para a digestão de restrição, Í , expansão de PCR e sequenciamento usando transcriptase : - reversa e uma polimerase (“Transcriptase Reversa-PCR, ou RT-PCR"). Amplificação em Tempo Real/Métodos de Detecção Em um aspecto, LCR ou PCR em tempo real é realizada | nas misturas de amplificação aqui descritas, por exemplo, | usando guias moleculares ou sondas TaqgMan". Uma quia molecular (MB) é um oligonucleotídeo ou PNA, que, sob condições apropriadas de hibridização, se autoibridiza para formar uma estrutura de haste e alça.

A MB tem um marcador e um supressor no terminais do oligonucleotídeo ou PNA; | deste modo, sob condições que permitam a hibridização | 15 intramolecular, o marcador é tipicamente suprimido (ou pelo menos alterado em sua fluorescência) pelo supressor.

Sob condições onde a MB não exibe hibridização intramolecular (por exemplo, quando ligado a um ácido nucléico alvo, por exemplo, a uma região de um amplicon durante à amplificação), o marcador MB é suprimido.

Detalhes sobre os métodos padrão de fazer e usar MBs são bem estabelecidos na literatura, e MBs estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes de reagentes comerciais (ver também, por exemplo Leone et al., 1995; Tyagi e Kramer, 1996; Blok e Kramer, 1997; Hsuih et al., 1997; Kostrikis et al., 1998; Sokol et al., 1998; Tyagi et al., 1998; Bonnet et al,., | 1999; Fang et al., 1999; Marras et al., 1999; e Vet et al., 1999). Detalhes adicionais sobre a construção MB e a utilização são encontrados na literatura de patentes, por exemplo, US 5.925.517, US 6.150.097 e US 6.037.130.

PR " 45 7 A detecção por PCR utilizando sondas de | o oligonucleotídeo fluorogênicas de dupla marcação, comumente , referidas “como sondas “TaqMan”, também “podem ser . desempenhadas de acordo com a presente invenção.

Estas sondas são compostas de oligodesoxinucleotíeos curtos (por exemplo, de 20 a 25 bases) que são marcados com dois diferentes corantes fluorescentes.

No terminal 5' de cada sonda está um corante repórter, e no terminal 3' de cada | sonda, um corante de supressão é encontrado.

A sequência de sonda de oligonucleotídeo é complementar a uma sequência alvo interna presente no amplicon de PCR.

Quando a sonda é intacta, a transferência de energia ocorre entre os dois fluoróforos e a emissão do repórter é suprimida pelo supressor por FRET.

Durante a fase de extensão da PCR, a sonda é clivada pela atividade da nucleasse 5' da polimerase utilizada na reação, liberando assim o repórter do oligonucleotídeo-supressor e produzindo um aumento na intensidade de emissão de repórter.

Deste modo, as sondas TaqMan" são oligonucleotídeos que têm um marcador e um | 20 supressor, onde o marcador é liberado durante a | amplificação pela ação da exonuclease da polímerase utilizada na amplificação.

Isso fornece uma medida em tempo real de amplificação durante a síntese.

Uma variedade de reagentes TaqMan" estão disponíveis comercialmente, por ' exemplo, junto à Applied Biosystems (Sede da Divisão em Foster City, Califórnia), bem como de uma variedade de fornecedores especializados, como Biosearch Technologies (por exemplo, sondas supressoras de orifício preto). Mais detalhes sobre as estratégias de sonda de duplo marcador podem ser encontradas, por exemplo, em WO 92/02638.

MEN o 46 - Outros métodos semelhantes incluem, por exemplo, . transferência de energia de ressonância de fluorescência ' entre duas sondas adjacentemente hibridizadas, por exemplo, . usando o formato “LightCyclerº" descrito em US 6.174.670. Detecção do Marcador à Base de Arranjo

Detecção baseada em arranjo pode ser realizada utilizando arranjos comercialmente disponíveis, por exemplo, de Affymetrix (Santa Clara, Califórnia) ou de outros fabricantes.

Comentários em relação ao funcionamento dos arranjos de ácido nucléico incluem Sapolsky et al.,

1999; Lockhart., 1998; Fodor, 1997a; Fodor, 1997b e Chee et al, 1996.. A detecção à base de arranjo é um método preferido para a identificação dos marcadores de

| identificação da invenção em amostras, devido à natureza

| 15 intrinsecamente de alto rendimento da detecção à base de | arranjo,

Uma variedade de arranjos de sonda foi descrita na literatura e pode ser usada no contexto da presente invenção para a detecção de marcadores que podem ser correlacionados com os fenótipos aqui mencionados.

Por exemplo, os chips de arranjo de sonda de DNA ou wafers de arranjo de sonda de DNA maiores (dos quais chips individuais seriam, de outro modo, obtidos por quebra do wafer) são utilizados em uma modalidade da invenção.

Wafers de arranjo de sonda de DNA geralmente compreendem wafers de vidro, em que os arranjos de alta densidade das sondas de DNA (curtos segmentos de DNA) foram colocados.

Cada um destes wafers podem reter, por exemplo, aproximadamente 60 milhões de sondas de DNA que são usadas para reconhecer sequências de DNA de amostras mais longas (por exemplo, de

| DP SS *ɺ?"ºº oO NM A ó A EIA Aa A Aa Zã na a aaÀ:'Ó:Z121=4TWTHTÃA-=aAA PH 47 - indivíduos ou populações, por exemplo, que compõem os . marcadores de interesse). O reconhecimento do DNA da amostra pelo conjunto de sondas de DNA no wafer de vidro . ocorre através de hibridização de DNA. Quando uma amostra ; de DNA hibridiza com um arranjo de sondas de DNA, a amostra | liga-se àquelas sondas que são complementares à sequência de DNA da amostra. Através da avaliação a que as sondas do DNA da amostra para um indivíduo hibridizan mais | | fortemente, é possível determinar se uma sequência conhecida de ácido mnucléico está presente ou não na amostra, deste modo determinando se um marcador encontrado no ácido nucléico está presente. Uma pessoa também pode usar essa abordagem para realizar ASH, controlando as condições de hibridização para permitir a discriminação de nucleotídeo único, por exemplo, para identificação de SNP e para genotipagem de uma amostra para um ou mais SNPs. Arranjos fornecem uma modalidade conveniente para a detecção de marcadores polimórficos múltiplos simultaneamente (ou em série). Por exemplo, arranjos de detecção de suscetibilidade ao câncer de mama podem ser construídos em que qualquer ou todos os polimorfismos aqui mencionados (ou polimorfismos relacionados a esses) são |

Í detectados simultaneamente para atribuir um fenótipo de suscetibilidade ao câncer de mama. É claro que qualquer tecnologia de detecção (PCR, LCR, PCR em tempo real, etc.) podem ser igualmente utilizada, por exemplo, com reações de amplificação/detecção multiíplex, ou simplesmente realizando várias reações separadas, por exemplo, simultaneamente ou em série. O uso de arranjos de sonda de DNA para obter

: 48 1 informações de alelo tipicamente envolve as seguintes o etapas gerais: design e fabricação de matrizes de sonda de . DNA, preparação da amostra, hibridização de DNA da amostra . para a matriz, detecção de eventos de hibridação e de análise de dados para determinar a sequência. Wafers preferidos são fabricados usando um processo adaptado da fabricação de semicondutores para alcançar a eficácia de | custo e de alta qualidade, e estão disponíveis, por exemplo, de Affymetrix, Inc. de Santa Clara, Califórnia.

Por exemplo, arranjos de sonda podem ser fabricados por processos de síntese química direcionado por luz, que combinam síntese química em fase sólida com técnicas de fabricação fotolitográficas, conforme empregado na indústria de semicondutores. Usar uma série de máscaras fotolitográficas para definir sítios de exposição de chip, seguido por etapas de síntese química específicas, oO processo constrói arranjos de alta densidade de oligonucleotídeos, com cada sonda em uma posição predefinida no arranjo. Múltiplos arranjos de sonda podem ser sintetizados Simultaneamente em um grande wafer de vidro. Este processo paralelo aumenta a reprodutibilidade e ajuda a alcançar economia de escala. Uma vez fabricadas, os arranjos de sonda de DNA podem ser usados para obter dados sobre a presença e/ou níveis de expressão para os marcadores de interesse. As amostras de DNA podem ser marcadas com biotina e/ou um grupo repórter fluorescente por métodos bioquímicos padrão, As amostras marcadas são incubadas com um arranjo, e segmentos das amostras se ligam, ou hibridizam, com sequências complementares no arranjo. O arranjo é a seguir testado e

. l . os padrões de hibridização são detectados por emissão de . luz dos grupos repórter fluorescentes. Detalhes adicionais sobre estes procedimentos são encontrados nos exemplos . abaixo. Devido ao fato de a identidade e a posição de cada sonda no arranjo ser conhecida, a natureza das sequências | de DNA na amostra aplicado ao arranjo pode ser determinada. Quando esses arranjos são utilizados para experimentos de genotipagem, eles podem ser referidos como matrizes de genotipagem.

A amostra de ácido nucléico a ser analisada é isolada, amplificada e, tipicamente, marcada com biotina e/ou um grupo repórter fluorescente. A amostra de ácido nucleico marcada é a seguir incubada com o arranjo usando uma estação de fluidos e um forno de hibridização. O arranjo pode ser lavado e/ou corado ou contracorado, conforme apropriado para o método de detecção. Após a hibridização, lavagem e coloração, o arranjo é inserido em um scanner, onde os padrões de hibridização são detectados. Os dados de hibridização são coletados como luz emitida a partir dos grupos repórteres fluorescentes já incorporados ao ácido nucléico marcado, que agora está ligado ao arranjo de | sonda. Sondas que mais claramente se equiparam com o ácido nucléico marcado produzem sinais mais fortes do que aquelas que têm maus emparelhamentos. Uma vez que a sequência e posição de cada sonda no arranjo são conhecidos, por complementaridade, a identidade da amostra de ácido nucleico aplicada ao arranjo de sonda pode ser identificada.

Em uma modalidade, duas amostras de DNA podem ser diferencialmente marcadas e hibridizadas com um único

MN MD o 50 | conjunto de arranjos de genotipagem projetados.

Desta | ” forma, dois conjuntos de dados podem ser obtidos a partir dos mesmos arranjos físicos.

Marcadores que podem ser - usados incluem, mas não estão limitados, ao cicromo, fluoresceíina ou biotina (posteriormente —“corada com ficoeritrina-estreptavidina após hibridização). A marcação com duas cores é descrita em US 6.342.355. Cada arranjo pode ser testado de modo que o sinal de ambos os marcadores seja detectado simultaneamente, ou possa ser testado duas vezes para detectar cada sinal separadamente.

Dados de intensidade são coletados pelo scanner para todos os marcadores para cada um dos indivíduos que são testados quanto a presença do marcador.

As intensidades medidas são uma medida indicativa da quantidade de um marcador específico presente na amostra para um determinado indivíduo (expressão de nível e/ou número de cópias do alelo presente em um indivíduo, dependendo se os ácidos nucleicos genômicos ou expressos são analisados). Isto pode ser usado para determinar se o indivíduo é homozigoto ou heterozigoto para o marcador de interesse.

Os dados de intensidade são processados para fornecer informações de marcador correspondentes para as várias intensidades.

Detalhes adicionais em relação à Amplificação de Ácidos Nucléicos Como observado, as técnicas de amplificação de ácido nucleico, como PCR e LCR, são bem conhecidas na técnica e podem ser aplicadas à presente invenção para ampliar e/ou detectar ácidos nucleicos de interesse, tais como ácidos nucléicos “compreendendo marcadores loci.

Exemplos de técnicas suficientes para direcionar pessoas versadas

. através de tais métodos in vitro, incluindo a reação em . cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase . (LCR), amplificação por Qfb-replicase e outras técnicas . mediadas pela RNA polimerase (por exemplo, NASBA), são encontradas nas referências acima referidas, por exemplo, Sambrook et al. Detalhes adicionais são encontrados na US Í 4,683.202; Kwoh et al., 1989; Guatelli et al., 1990; Landegren et al., 1988; Van Brunt, 1990; Wu e Wallace, 1989; Barringer et al., 1990; e Sooknanan e Malek, 1995.

Métodos melhorados de amplificação de ácidos nucléicos grandes por PCR, que são úteis no contexto da clonagem posicional dos genes ligados aos polimorfismos da presente invenção, são adicionalmente resumidos em Cheng et al.

| (1994), e nas referências neste documento, em que amplicons | 15 de PCR de até 40 Kb são gerados. Métodos para PCR de longo alcance são divulgados, por exemplo, em US 10/042.406; US 10/236.480; e US 6.740.510. US 10/341.832 também fornece detalhes sobre métodos de escolha de iniciadores para a realização de PCR de curto alcance.

Antes da amplificação e/ou detecção de um ácido nucléico compreendendo um marcador, o ácido nucléico é opcionalmente purificado a partir das amostras por qualquer método disponível, por exemplo, aqueles ensinados em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., São Diego, Calif., Sambrook et al. (supra), e/ou Ausubel et al. (supra). Uma grande quantidade de kits também são disponíveis comercialmente para a purificação de ácidos nucléicos a partir de células ou de outras amostras (ver, por exemplo, EasyPrep", FlexiPrep", ambos da Pharmacia à Biotech; StrataClean", de Stratagene; e QIAprep" da . Qiagen). Alternadamente, as amostras podem simplesmente ser diretamente submetidas à amplificação ou detecção, por - exemplo, seguindo o aliquotamento e/ou diluição.

Exemplos de marcadores podem incluir polimorfíismos, polimorfismos de nucleotídeo único, a presença de um ou mais ácidos nucléicos em uma amostra, a ausência de um ou mais ácidos nucléicos em uma amostra, a presença de uma ou mais sequências de DNA genômico, ausência ou uma ou mais sequências de DNA genômico, presença de um ou mais mRNAs, ausência de um ou mais mRNAS, níveis de expressão de um ou mais mRNAS, presença de uma ou mais proteínas, níveis de expressão de uma ou mais proteínas e/ou dados derivados de qualquer um dos anteriores ou combinações dos mesmos.

Essencialmente qualquer número de marcadores pode ser detectado, através de métodos disponíveis, por exemplo, usando tecnologias de arranjo que fornecem alta densidade, | mapeamento de marcador de alto rendimento. Desse modo, pelo menos cerca de 10, 100, 1.000, 10.000 ou mesmo 100.000 ou mais marcadores genéticos podem ser testados, simultaneamente ou em série (ou uma combinação desses) para a correlação com um fenótipo relevante, na primeira e/ou segunda população. Combinações de marcadores também podem ser desejavelmente testadas, por exemplo, para identificar combinações genéticas ou combinações de padrões de expressão em populações que são correlacionadas com O fenótipo.

Métodos de Síntese de Sonda/Iniciador Em geral, os métodos sintéticos para fazer oligomucleotídeos que incluem sondas, iniciadores, guias

. moleculares, PNAs, LNAsS (ácidos nucléicos bloqueados), o etc., são bem conhecidos. Por exemplo, oligonucleotídeos . podem ser sintetizados quimicamente de acordo com o método . de fosforoamidita triéster em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers (1981), por exemplo, usando um sintetizador automatizado comercialmente disponível, por exemplo, como descrito em Needham-VanDevanter et al. (1984). Oligonucleotídeos, incluindo —oligonucleotídeos modificados, também podem ser encomendados de uma variedade de fontes comerciais conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. Há muitos fornecedores comerciais de serviços de ! oligossíntese e, portanto, esta é uma tecnologia amplamente acessível. Qualquer ácido nucléico podem ser encomendado a partir de qualquer de uma variedade de fontes comerciais, tais como The Midland Certified Reagent Company (merceoligos.com), The Great American Gene Company (Wwww.genco.com), ExpressGen Inc. (www. expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.), e muitas outras. Da mesma forma, PNAs podem ser encomendados a partir de qualquer de uma variedade de fontes, tais como PeptidoGenic (pkimeccnet.com), HTI Bioproducts, inc. (htibio.com), BMA Biomedicals Ltd (UK), Bio-Synthesis, Inc., e muitas outras.

Iniciadores de amplificação para Detecção de Marcador Em algumas modalidades preferidas, os SNPs são detectados usando um método de detecção adequados à base de PCR, onde o tamanho ou a sequência do amplicon de PCR é um indicativo da ausência ou presença do SNP. Nestes tipos de métodos, iniciadores de PCR são hibridiízados às regiões conservadas que flanqueiam a região polimórfica.

. Iniciadores adequados para serem utilizados com a ' . invenção podem ser projetados usando qualquer método | ' adequado. Não se pretende que a invenção se limite a ] . qualquer iniciador particular ou par de iniciador. Por | 5 exemplo, iniciadores podem ser projetados usando qualquer | | programa de software adequado, tal como LASERGENE?º, por exemplo, levando em conta as informações da sequência publicamente disponível. Sequências de flanqueamento para os polimorfismos aqui identificadas são publicamente disponíveis; e, desse modo, iniciadores de amplificação adequados podem ser construídos com base nas regras de pareamento de bases bem compreendidas. A sequência de qualquer amplicon pode ser detectada como já foi discutido acima, por exemplo, por hibridação, hibridização de arranjo, PCR, PCR em tempo real, LCR ou similares.

Em algumas modalidades, os iniciadores da invenção são radiomarcados, ou marcados por qualquer meio adequado (por exemplo, usando uma etiqueta fluorescente não radioativa) para permitir a rápida visualização de amplicons de diferentes tamanhos após uma reação de amplificação sem qualquer etapa de marcação ou etapa de visualização | adicional. Em algumas modalidades, os iniciadores não são marcados, e os amplicons são visualizados, por exemplo, após a sua resolução de tamanho, por exemplo, após eletroforese em gel de agarose ou acrilamida. Em algumas modalidades, a coloração com brometo de etídio dos amplicons de PCR seguido por resolução de tamanho permite a visualização dos amplicons de tamanhos diferentes.

Não se pretende que os iniciadores da invenção sejam limitados à geração de um amplicon de qualquer tamanho

| Ns 55 + particular.

Por exemplo, os iniciadores utilizados para . amplificar os loci marcadores e alelos da presente invenção . não estão limitados à amplificação de toda a região do - locus relevante, ou qualquer subregião do mesmo.

Os iniciadores podem gerar um amplicon de qualquer comprimento adequado para detecção.

Em algumas modalidades, a amplificação do marcador produz um amplicon de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, de pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento, ou, alternativamente, de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, ou, alternativamente, de pelo menos 200 nucleotídeos de comprimento.

Amplicons de qualquer tamanho podem ser detectados utilizando as várias tecnologias aqui descritas.

Diferenças na composição de base ou tamanho podem ser detectadas pelos métodos convencionais, tais como eletroforese.

Marcadores se correlacionando com os Fenótipos Essas correlações podem ser realizadas por qualquer método que possa identificar uma relação entre um alelo e um fenótipo, ou uma combinação de alelos e uma combinação | de fenótipos.

Por exemplo, os alelos nos genes ou loci definidos neste documento podem ser correlacionados com um ou mais fenótipos de câncer de mama.

Mais tipicamente, esses métodos envolvem referência a uma tabela de consulta | 25 que compreende correlações entre alelos do polimorfismo e o fenótipo.

A tabela pode incluir dados de múltiplas relações de alelo-fenótipo e pode responder por efeitos aditivos ou : de outra ordem superior de múltiplas relações alelo- fenótipo, por exemplo, através do uso de ferramentas estatísticas como análise de componentes de princípio,

- algoritmos heurísticos, etc. . A correlaão de um marcador com um fenótipo opcionalmente inclui a realização de um ou mais testes = estatísticos para correlação.

Muitos testes estatísticos são conhecidos, e a maioria são implementados por computador para facilidade de análise.

Uma variedade de métodos estatísticos para determinar as | associações/correlações entre as características fenotípicas e marcadores biológicos são conhecidos e podem ser aplicados na presente invenção.

Hartl (1981) A Primer of Population Genetics Washington University, Saint Louis Sinauer Associates, Inc.

Sunderland, Mass.

ISBN: 0-087893- 271-2. Uma variedade de modelos estatísticos apropriados são descritos em Lynch e Walsh (1998) Genetics and Analysis , of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Inc.

Sunderland Mass.

ISBN 0-87893-481-2. Estes modelos podem, por exemplo, fornecer correlações entre os valores genotípicos e fenotípicos, caracterizar a influência de um locus em um fenótipo, classificar a relação entre meio ambiente e genótipo, determinar a dominância ou penetrância dos genes, determinar efeitos maternos e outros epigenéticos, determine componentes principais em uma análise (através da análise de componente de princípio, ou “PCA”), e similares.

As referências citadas nesses textos fornece detalhes adicionais consideráveis sobre modelos estatísticos para correlacionar marcadores e fenótipo.

Além dos métodos estatísticos padrão para determinação de correlação, outros métodos que determinam as correlações por reconhecimento e treinamento padrão, como O uso de algoritmos genéticos, podem ser usados para determinar as

. correlações entre os marcadores e fenótipos.

Isto é . particularmente útil na identificação de correlações de ordem “superior entre alelos múltiplos e fenótipos - múltiplos.

Para ilustrar, as abordagens de redes neurais podem ser acopladas à programação tipo algoritmo genético para o desenvolvimento heurístico de um modelo de espaço de dados de estrutura-função que determina as correlações entre as informações genéticas e os resultados fenotípicos.

Por exemplo, NNUGA (Rede Neural Utilizando Algoritmos Genéticos) é um programa disponível (por exemplo, no sítio da internet em cs.bgu.ac.il/.about.omri/NNUGA, que acopla redes neurais e algoritmos genéticos.

Uma introdução às redes neurais pode ser encontrada, por exemplo, em Kevin Gurney, An Introduction to Neural Networks, UCL Press | 15 (1999), e no sítio da internet em shef .ac .uk/psychology/gurney/notes/index.html.

Referências de rede neutral úteis adicionais incluem aquelas citadas acima em relação aos algoritmos genéticos e, por exemplo, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Oxford University Press (1995), e Ripley et al., Pattern Recognition and Neural Networks, Cambridge University Press

(1995). Referências adicionais que são úteis na compreensão das aplicações de análise de dados para uso e estabelecimento de correlações, componentes princípio de uma análise, modelagem de redes neurais e similares, incluem, por exemplo, Hinchliffe, Modelling Molecular Structures, John Wiley and Sons (1996), Gibas e Jambeck, Bioinformatics Computer Skills, O'Reilly (2001), Pevzner, Computational Molecular Biology and Algorithmic Approach,

” The MIT Press (2000), Durbin et al., Biological Sequence . Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press (1998), e Rashidi e - Buehler, Bioinformatic Basics: Applications in Biological Science and Medicine, CRC Press LLC (2000).

| Em qualquer caso, essencialmente qualquer teste estatístico pode ser aplicado em um modelo implementado por | computador, através de métodos de programação padrão, ou usando qualquer um de uma variedade de pacotes de software “comerciais” que realizam tais análises estatísticas incluindo, por exemplo, aquelas mencionadas acima e aquelas comercialmente disponíveis, por exemplo, de Partek Incorporated (St. Peters, Mo.; www. partek.com), por exemplo, que fornecem software para reconhecimento de padrões (por exemplo, que fornecen o software de reconhecimento de padrões Partek Pro 2000), que pode ser aplicado aos algoritmos genéticos para análise de dados multivariados, visualização interativa, seleção variável, a | rede neural e modelagem estatística, etc. As relações podem ser analisadas, por exemplo, por mapeamento de Análise de Componentes Principais (PCA), mapeamento por gráficos de espalhamento (scatterplots) e biplots, gráficos de espalhamento mapeados de Desenvolvimento Multi-Dimensional (MDS), gráficos de estrelas, etc. Software disponível para a realização de análise de correlação inclui SAS, R e Mathlab.

O(s) marcador(es), sejam eles de polimorfismos ou padrões de expressão, podem ser usados para qualquer uma de uma variedade de análises genéticas. Por exemplo, uma vez que os marcadores tenham sido identificados, como no

. presente caso, eles podem ser usados em vários ensaios . diferentes para estudos de associação.

Por exemplo, as sondas podem ser projetadas para microarranjos que . interrogam esses marcadores.

Outros ensaios exemplares incluem, por exemplo, os ensaios e ensaios de Taqman e ensaios de guias moleculares descritos acima, bem como PCR convencional e/ou técnicas de sequenciamento.

Detalhes adicionais sobre os estudos de associação podem ser encontrados em US 10/106.097, US 10/042.819, US 10/286.417, US 10/768.788, US 10/447.685, US 10/970.761 e | US 7.127.355. I Em algumas modalidades, os dados do marcador são usados para realizar estudos de associação para mostrar as correlações entre os marcadores e fenótipos.

Isso pode ser realizado pela determinação das características do marcador : em indivíduos com o fenótipo de interesse (isto é, | indivíduos ou populações que apresentam o fenótipo de interesse) e comparando a frequência do alelo ou outras | características (níveis de expressão, etc.) dos marcadores nesses indivíduos com a frequência do alelo ou outras características em um grupo de controle dos indivíduos.

Tais determinações de marcador podem ser realizadas com base no amplo genoma, ou podem ser focadas em regiões específicas do genoma (por exemplo, blocos de haplótipo de interesse). Em uma modalidade, os marcadores que são ligados aos genes ou loci aqui definidos são avaliados quanto à correlação com um ou mais fenótipos de suscetibilidade ao câncer de mama específicos.

Além da outras modalidades dos métodos da presente invenção divulgados neste documento, os métodos a adicionalmente permitem a “dissecação” de um fenótipo.

Isto 2 é, um fenótipo particular pode (e normalmente) resulta de ' duas ou mais diferentes bases genéticas.

Por exemplo, um ' . fenótipo de suscetibilidade em um indivíduo pode ser o resultado de um “defeito” (ou simplesmente um “defeito” de alelo em particular em relação ao fenótipo de ; suscetibilidade é dependente do contexto, por exemplo, se o fenótipo é desejável ou indesejável no indivíduo em um determinado ambiente) em um gene definido na Tabela 1, enquanto o mesmo fenótipo básico em um indivíduo diferente pode ser o resultado de vários “defeitos” em múltiplos genes.

Deste modo, a varredura de uma pluralidade de marcadores (por exemplo, como no genoma ou varredura de bloqueio de haplótipo) permite a dissecção de várias bases genéticas para fenótipos semelhantes (ou graduados). . Como descrito no parágrafo anterior, um método de realização de estudos de associação é comparar a frequência do alelo (ou nível de expressão) dos marcadores em indivíduos com um fenótipo de interesse (“grupo de caso”) com a frequência do alelo em um grupo controle de indivíduos.

Em um método, SNPs informativos são usados para fazer a comparação do padrão de haplótipo SNP (um "“SNP informativo” é o marcador SNP genético, como um SNP ou subconjunto (mais de um) dos SNPs no genoma ou um bloco haplótipo que tende a distinguir um SNP ou genoma ou padrão haplótipo de outros SNPs, genomas ou padrões de haplótipo). A abordagem do uso de SNPs informativos tem uma vantagem sobre outros métodos de varredura de genoma ou genotipagem conhecidos na técnica, para em vez de ler todos os 3 bilhões de bases do genoma de cada indivíduo - ou mesmo ler o ))º! .ZIT [”âUOÚ = “AA 61 , . os 3 a 4 milhões de SNPs comuns que podem ser encontrados - o somente SNPs informativos de uma população de amostra . precisam ser detectados.

A leitura desses SNPs informativos - particulares fornece informações suficientes para permitir que dados de associação estatisticamente precisos sejam extraídos de populações experimentais específicas, como descrito acima.

Deste modo, em uma modalidade de um método para determinar associações genéticas, a frequência do alelo de SNPs informativos é determinada para genomas de uma população de controle que não exibem o fenótipo.

A frequência do alelo de SNPs informativos também é determinada para genomas de uma população que exibe o fenótipo.

As frequências de alelos de SNP informativas são comparadas.

As comparações da frequência de alelos podem ser feitas, por exemplo, determinar a frequência do alelo (número de exemplos de um alelo particular em uma população dividida pelo número total de alelos) em cada local SNP informativo em cada população e comparando essas frequências de alelo.

Os SNPs informativos exibindo uma diferença entre à frequência do alelo da ocorrência no controle versus populações/grupos de caso são selecionados para análise.

Uma vez que SNPsS informativos são selecionados, o(s) bloco(s) de haplótipo de SNP que contêm | os SNPs informativos são identificados que, por sua vez, identifica uma região genômica de interesse que está correlacionada com o fenótipo.

As regiões genômicas podem ser analisadas por genética ou quaisquer métodos biológicos conhecidos na técnica, por exemplo, para uso como alvos de descoberta de fármaco ou marcadores de diagnóstico.

. Sistemas para realizar as correlações acima são também o uma característica da invenção. Tipicamente, o sistema irá . incluir instruções do sistema que se correlacionam com a - presença ou ausência de um alelo (seja detectado diretamente Ou, por exemplo, através de níveis de expressão) com um fenótipo previsto.

Opcionalmente, as instruções do sistema também podem incluir software que aceita informações de diagnóstico associadas com qualquer informação de alelo detectada, por exemplo, um diagnóstico que um indivíduo com o alelo relevantes tem um fenótipo particular. Este software pode ser de natureza heurística, utilizando tais associações alimentadas para melhorar a precisão das tabelas de | consulta e/ou à interpretação das tabelas de consulta pelo sistema. Uma variedade de tais abordagens, incluindo redes neurais, modelagem de Markov e outras análises estatísticas estão descritas acima.

A invenção fornece módulos de aquisição de dados para a detecção de um ou mais marcadores genéticos detectáveis (por exemplo, um ou mais arranjos compreendendo uma ou mais sondas biomoleculares, detectores, manipuladores de fluido ou similares). As sondas biomoleculares de tal módulo de aquisição de dados pode incluir qualquer uma que seja apropriada para a detecção do marcador biológico, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos, proteínas, aptâmeros, anticorpos, etc. Estes podem incluir manipuladores de amostra (por exemplo, manipuladores de líquidos), robótica, sistemas microfluídicos, módulo de purificação de ácido nucléico ou proteína, arranjos (por exemplo, arranjos de ácido nucléico), detectores, termocicladores Ou suas

- combinações, por exemplo, para a aquisição de amostras, - diluição ou aliquotar amostras, purificação de materiais ] marcadores (por exemplo, ácidos nucléicos ou proteínas), ' . amplificação de ácidos nucléicos marcadores, detecção de ácidos nucleicos marcadores amplificados e similares.

Por exemplo, dispositivos automatizados que podem ser 1 incorporados nos sistemas da presente invenção foram ! utilizados para avaliar uma variedade de fenômenos biológicos, incluíndo, por exemplo, níveis de expressão de genes em resposta a estímulos selecionados (Service, 1998a), genotipagem de DNA de alta produtividade (Zhang et al., 1999) e muitos outros. Da mesma forma, sistemas integrados para a realização de experimentos de mistura, | amplificação de DNA, sequenciamento de DNA e similares também estão disponíveis (Service, 1998b). Uma variedade de | componentes de sistemas automáticos estão disponíveis, por | exemplo, de Caliper Technologies (Hopkinton, | Massachusetts), que utilizam vários sistemas Zymate, que normalmente incluem, por exemplo, módulos de manuseio de fluido e robóticos. Da mesma forma, o robô ORCAR*”" comum, que é usado em uma variedade de sistemas laboratoriais, por exemplo, para a manipulação de bandejas de microtitulação, também está disponível comercialmente, por exemplo, junto à Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, Califórnia). Da mesma forma, sistemas microfluídicos comercialmente disponíveis que podem ser usados como componentes do sistema na presente invenção incluem os da Agilent Technologies da Caliper Technologies. Além disso, a literatura de patentes e têcnica inclui numerosos exemplos de sistemas microfluídicos, incluindo aqueles que podem interagir

º diretamente com placas de micropoços para manuseio de o fluidos automatizado.

. Qualquer uma de uma variedade de configurações de . manuseio de líquidos e/ou arranjos pode ser usada nos sistemas da presente invenção. Um formato comum para uso nos sistemas da presente invenção é uma placa de microtitulação, em que o manuseador de líquidos ou arranjo inclui uma bandeja de microtitulação. Tais bandejas são disponíveis comercialmente e podem ser encomendadas em uma variedade de tamanhos de poços e números de poços por bandeja, bem como com qualquer um de uma variedade de superfícies funcionalizadas para a ligação de componentes de ensaio ou matriz. Bandejas comuns incluem a placa de 96 poços onipresente, com placas com 384 e 1536 poços também de uso comum. Amostras podem ser processadas em tais bandejas, com todas as etapas de processamento sendo realizadas nas bandejas. As amostras também podem ser processadas no aparelho microfluídico, ou em combinações de aparelhos de microtitulação e microfluídicos. Além dos arranjos de fase líquida, os componentes | podem ser armazenados ou analisados em arranjos de fase sólida. Estes arranjos fixam materiais em um padrão espacialmente acessível (por exemplo, uma grade de linhas e colunas) em um substrato sólido, como uma membrana (por exemplo, náilon ou nitrocelulose), um polímero ou superfície cerâmica, um vidro ou superfície de sílica modificada, uma superfície de metal, ou coisa parecida. Componentes “podem ser avaliados, por exemplo, por hibridização, por reidratação local (por exemplo, com uma pipeta ou outro elemento de manipulação de fluidos) e

À Ao A ARO Ro A, ME fm a o am 65 1 transferência de fluidos, ou esmagando o arranjo Ou " cortando sítios de interesse no arranjo. . O sistema também pode incluir aparelhos de detecção . que são usados para detectar informações de alelo, usando qualquer uma das abordagens aqui observadas.

Por exemplo, | um detector configurado para detectar produtos de PCR em tempo real (por exemplo, um detector de luz, como um | detector de fluorescência) ou um leitor de arranjo pode ser incorporado no sistema.

Por exemplo, o detector pode ser configurado para detectar uma emissão de luz a partir de uma reação de hibridização ou amplificação compreendendo um alelo de interesse, em que a emissão de luz é um indicativo | da presença ou ausência do alelo.

Opcionalmente, um ligante operável entre o detector e um computador que compreende as instruções do sistema mencionadas acima é fornecido, permitindo uma entrada automática de informações alelo específicas detectadas para o computador, que podem, por exemplo, armazenar as informações do banco de dados e/ou executar as instruções do sistema para comparar as informações específicas do alelo com a tabela de consulta.

Sondas que são usadas para gerar as informações detectadas pelo detector também podem ser incorporadas dentro do sistema, juntamente com qualquer outro hardware ou software para utilizar as sondas para detectar o amplicon.

Estes podem incluir elementos termocicladores (por exemplo, para a realização de amplificação de PCR ou LCR amplificação do alelo a ser detectado pelas sondas), arranjos nos quais as sondas estão dispostas «e/ou hibridizadas, ou similares.

Os elementos de manuseio de fluidos observados acima para o tratamento das amostras

- podem ser usados para mover materiais de amostra (por . exemplo, ácidos nucléicos de molde e/ou proteínas a serem É detectadas) íntrons, sondas, amplicons ou similares em ' . contato entre si. Por exemplo, o sistema pode incluir um conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores configurados para detectar pelo menos um alelo de um ou mais genes ou loci ligados associados a um fenótipo. O módulo detector é configurado para detectar uma ou mais saídas de sinal a partir do conjunto de sondas ou iniciadores marcadores, ou um amplicon produzido a partir do conjunto de sondas ou iniciadores marcadores, identificando deste modo a presença ou ausência do alelo. A amostra a ser analisada é opcionalmente parte do sistema, ou pode ser considerada separada dele. A amostra inclui opcionalmente, por exemplo, DNA genômico, DNA genômico amplificado, cCDNA, CDNA amplificado, RNA, RNA amplificado, proteínas, etc, como observado aqui. Opcionalmente, os componentes do sistema "para interfacear com um usuário são fornecidos. Por exemplo, os sistemas podem incluir uma exibição visível para o usuário para a visualização de uma saída de instruções do sistema implementado por computador, dispositivos de entrada do usuário (por exemplo, teclados ou dispositivos apontadores como o mouse) para a entrada de comandos do usuário e | 25 ativação do sistema, etc. Tipicamente, oO sistema de | interesse inclui um computador, onde as várias instruções | do sistema implementadas por computador são integradas no software de computador, por exemplo, armazenadas em mídia legível por computador. Aplicações de desktop padrão, como software de

Ú

NS a | i 67 ] processamento de texto (por exemplo, Microsoft Word" ou "o Corel WordPerfect") e software de banco de dados (por ' exemplo, software de planilhas como o Microsoft Excel" ou . Corel Quattro Pro", ou programas de bancos de dados como o Microsoft Access" ou Sequel", Oracle", Paradox") podem ser adaptados à presente invenção pela alimentação de uma sequência de caracteres que corresponde à um alelo da presente invenção, ou uma associação entre um alelo e um fenótipo.

Por exemplo, os sistemas podem incluir software que tem as informações de cadeia de caracteres apropriadas, | por exemplo, usadas em conjunto com uma interface de usuário (por exemplo, uma GUI em um sistema operacional padrão, como um sistema Windows, Macintosh ou Linux) para | manipular sequências de caracteres.

Programas de alinhamento de sequências especializados como BLAST também podem ser incorporados nos sistemas da invenção para o alinhamento de ácidos nucléicos ou proteínas (ou cadeias de caracteres correspondentes), por exemplo, para identificar e relacionar os alelos múltiplos.

Como se observa, os sistemas podem incluir um computador com um banco de dados apropriado e uma sequência | de alelos ou correlação da invenção.

Software para o | alinhamento de sequências, bem como conjuntos de dados | inseridos no sistema de software que compreende qualquer i uma das sequências da presente invenção pode ser uma | característica da invenção.

O computador pode ser, por ! exemplo, uma máquina de PC (Intel x86 ou DOS" compatível com chip Pentium, OS2" Windows" WINDOWS NT", WINDOWS95", WINDOWS98"", Windows2000, WindowsME, ou LINUX, um MACINTOSH.TM., Power PC, ou uma base UNIX (por exemplo, uma

” estação de trabalho SUN" ou máquina à base de LINUX) ou no outro computador comercialmente comum que é conhecido por uma pessoa versada na técnica. Software para a entrada e . alinhamento ou, de outro modo, manipulação das sequências está disponível, por exemplo, BLASTP e BLASTN, ou pode ser facilmente construído por uma pessoa versada na técnica usando uma linguagen de programação padrão, como ! VisualBasic, Fortran, Basic, Java ou similares.

A invenção fornece métodos para determinar o perfil polimórfico de um indivíduo em uma ou mais dos SNPs da invenção. Os SNPs inclui aqueles apresentados nas Tabelas 1 a5.

O perfil polimórfico constitui as formas polimórficas ocupando os diversos sítios polimórficos em um indivíduo.

Em um genoma diplóide, duas formas polimórficas, iguais ou diferentes entre si, geralmente ocupam cada sítio polimórfico. Assim, o perfil polimórfico em sítios X e Y pode ser representado na forma X (x1, x1) e Y (yl, y2), em que x1, x1 representa duas cópias do alelo x1 ocupando o sitio X e y1, y2 representam alelos heterozigotos ocupando o sítio Y.

O perfil polimórfico de um indivíduo pode ser classificado por comparação com as formas polimórficas associadas à resistência ou suscetibilidade a fenótipos de câncer de mama que ocorrem em cada sítio. A comparação pode ser realizada em, pelo menos, por exemplo, 1, 2, 5, 10, 25, 50 ou todos os sítios polimórficos e, opcionalmente, outros em desequilíbrio de ligação com eles. Os sítios polimórficos podem ser analisados em combinação com outros sítios polimórficos. No entanto, o número total de sítios

. polimórficos analisados é geralmente menor do que 10.000, . 1000, 100, 50 ou 25 e pode ser de cerca de 10 ou menos, de i cerca de 5 ou menos, ou de cerca de 2 ou menos.

. O número de alelos de resistência ou suscetibilidade presentes em um indivíduo em particular pode ser combinado de forma aditiva ou como razão para fornecer uma pontuação global para a propensão genética do indivíduo aos fenótipos de câncer de mama (ver US 60/566.302, US 60/590.534, US 10/956.224 e WO/2005/086770). Os alelos de resistência podem ser, cada um, arbitrariamente classificados como +1 e os alelos de suscetibilidade como -1 (ou vice-versa). Por exemplo, se um indivíduo é tipado em 100 sítios | polimórficos da invenção e é homozigoto para a resistência em todas eles, ele poderia ser atribuído uma pontuação de 100% de propensão genética para a resistência aos fenótipos de câncer de mama ou de 0% de propensão à suscetibilidade aos fenótipos de câncer de mama. O inverso aplica-se se a indivídua for homozigota para todos os alelos suscetíveis. Mais tipicamente, um indivíduo é homozigoto para alelos de resistência em alguns loci, homozigoto para alelos de suscetibilidade em alguns loci, e heterozigotos para alelos de resistência/suscetibilidade em outros loci. Tal propensão genética do indivíduo, para fenótipos de câncer de mama pode ser classificado por atribuição de todos os alelos de resistência a pontuação de +1, e todos os alelos de susceptibilidade a uma pontuação de -1 (ou vice-versa) e a combinação das pontuações. Por exemplo, se um indivíduo tem 102 alelos de resistência e 204 alelos de susceptibilidade, o indivíduo pode ser classificado como tendo uma propensão genética de 33% para a resistência e f

" 67% de propensão genética para a susceptibilidade.

o Alternativamente, alelos de resistência homozigótica podem ser atribuídos com uma pontuação de +1, alelos | . heterozigotos uma pontuação de zero e alelos de suscetibilidade homozigótica com uma pontuação de -1. Os números relativos de alelos de resistência e alelos de suscetibilidade também podem ser expressos como uma porcentagem. Assim, um indivíduo que é homozigoto para alelos de resistência em 30 sítios polimórficos, homozigoto para alelos de susceptibilidade a 60 sítios polimórficos, e heterozigoto nos 63 sítio é atribuída uma propensão genética de 33% para a resistência. Como uma outra alternativa, a homozigosidade para a susceptibilidade pode ser classificada como +2, heterozigosidade, como +1, e homozigosidade para resistência como 0.

A pontuação do indivíduo, bem como a natureza do perfil polimórfico, são úteis no prognóstico ou diagnóstico de susceptibilidade de um indivíduo a um fenótipo de câncer de mama. Opcionalmente, um paciente pode ser informado de susceptibilidade a um fenótipo de câncer de mama indicado pelo perfil genético. A presença de uma alta propensão genética para os fenótipos de câncer de mama pode ser tratada como um aviso para iniciar o tratamento profilático ou terapêutico. Por exemplo, indivíduos com elevado risco de desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama podem ser monitorados de forma diferente (por exemplo, mamografia mais frequente) ou podem ser tratados profilaticamente (por | exemplo, com uma ou mais fármacos). A presença de uma alta propensão a um fenótipo de câncer de mama também indica a utilidade de realização de testes secundários, tais como o A 71 ; / . uma biópsia e outros métodos conhecidos na técnica. . O perfil polimórfico é útil, por exemplo, na seleção ' de agentes para afetar o tratamento ou profilaxia de ' . fenótipos de câncer de mama em um determinado indivíduo. Indivíduos com perfis polimórficos semelhantes são susceptíveis de responder a agentes de uma maneira similar. O perfilhamento polimórfico também é útil para a estratificação de indivíduos em ensaios clínicos de agentes sendo testados quanto à capacidade de tratar fenótipos de câncer de mama ou condições relacionadas. Tais ensaios são realizados em populações tratadas ou de controle que têm perfis polimórficos similares ou idênticos (ver a EP |

99.965.095,5), por exemplo, um perfil polimórfico indicando que um indivíduo tem um risco aumentado de desenvolvimento | 15 de um fenótipo de câncer de mama. O uso de populações | geneticamente compatíveis elimina ou reduz a variação no resultado do tratamento devido a fatores genéticos, levando a uma avaliação mais precisa da eficácia de um fármaco potencial. Algoritmos implementados por computador ! algoritmos podem ser usados para identificar subpopulações | mais geneticamente homogêneas em que o tratamento Ou | profilaxia tem um efeito significativo, não obstante que o | tratamento ou profilaxia é ineficaz em populações mais heterogêneas. Em tais métodos, os dados são fornecidos para uma primeira população com um fenótipo de câncer de mama tratado com um agente, e uma segunda população também com o | fenótipo do câncer de mama, porém tratado com um placebo. O | perfil polimórfico de indivíduos nas duas populações é determinado em pelo menos um sítio polimórfico ou dentro de | 30 uma região de 100 Kb ou 50 Kb ou 20 Kb de uma região

. definida pelo SNPs fornecida nas Tabelas 1 a 5. Dados o também são fornecidos para saber se cada paciente nas populações alcança um desfecho desejado de tratamento bem . sucedido ou profilaxia.

Subpopulações de cada uma dentre a primeira e segunda populações são então selecionadas de ; modo que os indivíduos na subpopulações têm maior similaridade de perfis polimórficos uns com os outros do ; que os indivíduos na primeira e segunda populações | originais.

Há muitos critérios pelos quais a similaridade | pode ser avaliada.

Por exemplo, um critério é o de requerer que os indivíduos na subpopulações tenham pelo menos um alelo de suscetibilidade em cada um de pelo menos um dos genes acima.

Outro critério é que os indivíduos na subpopulações tenham pelo menos 75% de suscetibilidade de alelos para cada um dos sítios polimórficos em que o perfil polimórfico é determinado.

Independentemente dos critérios utilizados para avaliar a similaridade, os dados de desfecho das subpopulações são comparados para determinar se o tratamento ou profilaxia alcançou um resultado estatisticamente significativo nas subpopulações.

Como resultado da implementação por computador, bilhões de critérios de similaridade podem ser analisados para identificar uma ou algumas subpopulações apresentando significância estatística.

Perfis polimórficos também são úteis para a exclusão de indivíduos sem predisposição aos fenótipos de câncer de mama a partir de ensaios clínicos.

A inclusão de tais indivíduos no ensaio aumenta o tamanho da população necessária para alcançar um resultado estatisticamente significativo.

Indivíduos sem predisposição aos fenótipos

: de câncer de mama podem ser identificados por determinação * do número de resistências e os alelos de suscetibilidade em Ú um perfil polimórfico como descrito acima. Por exemplo, se . um indivíduo for genotipado em dez sites em dez genes da invenção associados com fenótipos de câncer de mama, vinte alelos são determinados no total. Se mais de 50% e, de preferência, mais de 60% ou 75% destes são genes de resistência, é improvável que o indivíduo desenvolva um fenótipo de câncer de mama e pode ser excluídos do estudo.

Em outras modalidades, a estratificação dos indivíduos em ensaios clínicos pode ser realizada utilizando perfilhamento polimórfico em combinação com outros métodos : de estratificação incluindo, mas sem se limitar, ao histórico familiar, modelos de risco (por “exemplo, Pontuação de Gail, modelo de Claus), fenótipos clínicos ! (por exemplo, lesões atípicas) e biomarcadores candidatos | específicos.

Perfis polimórficos também podem ser usados após oO completamento de um ensaio clínico para elucidar diferenças na resposta à um dado tratamento. Por exemplo, o conjunto de polimorfismos pode ser usado para estratificar oOs | | pacientes inscritos nos subtipos ou classes de doença. Também é possível usar os polimorfismos para identificar subgrupos de pacientes com perfis polimórficos semelhantes que têm resposta incomum (alta ou baixa) ao tratamento ou | que não respondem como um todo (não respondedores). Desta forma, informações sobre os fatores genéticos subjacentes que influenciam a resposta ao tratamento podem ser usados em muitos aspectos do desenvolvimento do tratamento (estes variam desde a identificação de novos alvos, através do

. design de novos testes para rotulagem de produtos e . alvejamento do paciente), Além disso, os polimorfismos podem ser usados para identificar os fatores genéticos ' . envolvidos na resposta adversa ao tratamento (efeitos adversos). Por exemplo, pacientes que apresentam resposta adversa podem ter mais perfis polimórficos semelhantes do que seria esperado pelo acaso. Isto permite a identificação precoce e a exclusão de tais indivíduos do tratamento. Isso também fornece informações que podem ser usadas para entender as causas biológicas de eventos adversos e para modificar o tratamento para evitar tais resultados.

Perfis polimórficos também podem ser usados para outros fins, incluindo o teste de paternidade e análise forense, conforme descrito por US 6.525.185. Na análise forense, o perfil polimórfico de uma amostra na cena de um crime é comparado com o de um suspeito. Um emparelhamento entre os dois é evidência de que o suspeito, de fato, | cometeu o crime, enquanto que a falta de um emparelhamento exclui o suspeito. Os presentes sítios polimórficos podem ser usados em tais métodos, assim como outros sítios polimórficos no genoma humano.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Avaliação de um painel SNP para a Avaliação de Risco de Câncer de Mama em um Estudo controlado por caso aninhado da Women's Health Initiative Fundamentação A medida em que a variação genética associada ao câncer de mama (BCa) recém descoberto pode ajudar na avaliação de risco de BCa não é clara. O efeito da adição de informações de risco de um painel de 7 SNPs associados

E ísFisaasaas“aasss"imsiui”Ú Mimos um A Av A ASS SSÓ6S e OÓáíuíÉOCM MMS OC 75 . ao BCa na estratificação do risco oferecido pelo modelo de o Gail foi avaliado.

Métodos é 1664 mulheres que desenvolveram BCa após a randomização no Ensaio Clínico WHI e 1636 controles isentos de BCa emparelhado foram examinados.

Controles foram pareados com base na idade de referência, a etnia auto relatada, participação no estudo clínico, anos desde a randomização e status de histerectomia.

Sete SNPs da literatura publicada atendendo aos critérios rigorosos para | a significância ampla do genoma e replicação foram escolhidos para serem genotipados (Painel de 7-SNP). Para modelar o risco de SNP pelos 7 SNPs do painel selecionado, estimativas do tamanho do efeito anteriormente reportado | 15 foram usadas junto com um modelo multiplicativo para oO risco relativo.

Para produzir um risco clínico/genético combinado, estimativas do risco absoluto do modelo de Gail foram multiplicadas por riscos relativos de SNP combinados para produzir um risco clínico/genético combinado.

O desempenho da classificação foi avaliado através de tabelas de reclassificação para quantificar OO índice de reclassificação líquido (NRI), e as curvas características de operação do receptor (ROC). Resultados

Associações de SNP individuais com BCa para as mulheres brancas foram em geral consistentes com relatos anteriores.

Estimativas do risco absoluto de 5 anos de Gail e do risco relativo de 7-SNP foram ambas associadas com a incidência de BCa quando testado por regressão logística; houve uma correlação estatisticamente significativa (P =

SE MAPA Ati O SS ECC RR RR SR RR SS aaa RAR RR BM NE TTLSÂ SSSSs2SS 76 . 0,01), porém muito fraca (r = 0,044), entre o risco de Gail . e o Risco SNP. Neste grupo, um aumento de duas vezes no risco de Gail ] . produz um aumento menor do que duas vezes na incidência de câncer, sugerindo que o risco de Gail não é tão bem calibrado neste conjunto de dados, o que é consistente com um relatório anterior (Chiebowski et al., 2007). O prognosticador combinado foi mais fortemente associado do que o risco de Gail ou os componentes SNP sozinhos. Na análise da curva ROC, a combinação do risco de Gail e SNP tinha uma área sob a curva (AUC) de 0,594 (95% de Cl: | 0,576-0,612) em comparação com 0,556 (95% de Cl: 0,537- 0,575) para o risco de Gail sozinho. A diferença na AUC foi estatisticamente significativa (95% de Cl: 0,025 a 0,050, P | 15 empírico < 0,001). Na análise da tabela de reclassificação, limiares de risco de 5 anos que são potencialmente clinicamente significativos no contexto de tomada de | decisão sobre a prevenção primária foram escolhidos: < 1,5% | (abaixo do risco médio), de 1,5 a 2% (risco moderado) e > 2% (risco elevado). A reclassificação em mulheres brancas foi avaliada para o SNP x classificação de Gail versus o risco de Gail sozinho. O NRI neste contexto foi de 0,09 (Z = 4,5, P = 0,033) com melhora da classificação de 6,4% dos casos e 2,6% dos controles.

Mulheres com biópsias de mama anteriores parecem ser um subgrupo com particular benefício da reclassificação usando a pontuação de SNP X Gail combinada.

Neste subgrupo, o modelo de Gail tinha uma AUC de 0,514 (IC 95%: 0,471-0,561), indistinguível do acaso. Comparado com o grupo completo, a diferença de AUC para o

Bbç aaa" an un nn nn a 4 """Ai e SAeS SMS $ÂAÂ ÊO OM) 77 . modelo de Gail foi no limite de significância (IC 95%: - i é 0,002 a 0,081, P empírico = 0,06). O modelo combinado teve ' uma AUC de 0,571 (IC 95%: 0,526 a 0,614). A estimativa : . bootstrap da diferença em AUC para o modelo combinado versus Gail sozinho também foi significativa (IC 95%: 0,029 a 0,085, P < 0,001).

Métricas de reclassificação no subgrupo de biópsia indicaram que o NRI é 0,18, que também é muito significativo, apesar do menor número de eventos (Z = 3,9, P = 4,9 x 10-5). Aqui, a classificação melhorou em 14,8% dos controles (P = 1.5 x 05/10), mas apenas 2,8% dos casos (P = 0,16; Tabelas 7 e 8), A reamostragem bootstrap indicou que a diferença em NRI entre o grupo total e o subgrupo da biópsia foi estatisticamente significativa. Com base em 1000 replicatas bootstrap, um intervalo de confiança de 95% para a melhoria em NRI no subconjunto de biópsia se estendeu de 0,02 até 0,16, com P empírico = 0,03.

Tabela 7. Testes de regressão logística da associação com os subtipos de receptor de câncer de mama. | rores sa-positivos rumores mR-negativos | men TATO 95%) 95%) log (Gail 5 - 0,55 1,1 x 107º |-0,03 (-| 0,89 risco anual) (0,37 a 0,37 a 0,72) 0,32) log (risco | 1,20 1,7 x 10 |0,56 SNP) (0,92 aj” (0,03 a 1,47) 1,09) x Gail) (0,57 aj”? 0,14 a o a ú - Tabela 8. Razão de probabilidades combinadas para o : painel 67-SNP indicando o valor preditivo melhorado para o . câncer de mama ER+ ao contrário do câncer de mama ER-. rsID de Alelo Câncer de Mama ae Risco frogos = leo = fem => 82 62 2

EEEF F 042 m) 615 m) — EFE FE RF 84 98 H19 Combinadas Discussão Uma estratégia combinando ambos fatores de risco clínico (risco de Gail) e fatores de risco genético comum bem validado (quadro 7-SNP) resulta em melhoria na classificação de riscos BCa em mulheres caucasianas pós- menopausa. Isto pode ter implicações significativas para

. informar a prevenção primária e/ou estratégias de triagem. * Exemplo 2 - Uso de SNPs para Avaliação do Risco de Câncer de Mama: Modelo 10-SNP - Genotipagem SNP Dez (10) SNPs que foram relatados como estando | associados com câncer de mama com alta significância estatística em vários grandes conjuntos de múltiplas | amostras foram identificados e são apresentados na Tabela Ss. A genotipagem de 7 dos 10 SNPs é descrita no Exemplo

1. Os 3 SNPs restantes (rs4973768, rs6504950, rsl1249433) foram genotipados na plataforma Sequenom MassaArray. Dois ensaios foram projetados em orientações opostas para cada | um dos SNPs. Dois desses SNPs (rs6504950 e rsl1249433) | 15 foran previamente genotipados nas mesmas amostras em | arranjos de oligonucleotídeo. Amostras que apresentaram um desempenho fraco na genotipagem Sequenom anterior também tiveram um mau desempenho neste conjunto de dados, com a concordância de menos de 90% nesses dois SNPs, em comparação com 99,9% para as outras amostras. Como resultado, os dados para esse mesmo conjunto de amostras problemáticas foi excluído. A tabela 10 resume os resultados de genotipagem para os 10 SNPs associados com o câncer de mama. Tabela 9. Loci replicados associados com câncer de mama invasivo. 95%)? (1,23 - | al., 2007 bi 80 | “o Lo = | | ha | TJ é Rs3803662 | TNRC9 16q 0,25 1,20 Easton et (1,16- al., 2007 o 1,24) Rs889312 MAP3K1 0,28 1,13 Easton Et (1,10 - | al., 2007 1,16) Rs13387042 | (nenhum) | 2935 0,50 1,20 Stacey et (1,14 - | al., 2007 1,26) Rs13281615 | (nenhum) | 8qg24 1,08 Stacev et (1,05 -| | al., 2008 1,11) Rs53817198 |LSPl 1l1p 0,30 1,07 Easton et (1,04 -jal., 2007 1,11) Rs4973768 SLC4A7 3p24 0,46 1,11 Ahmed et | (1,08 -j|al., 2009 1,13) | Rs6504950 COX11 17023.2 0,73 1,05 Ahmed et (1,03 -j al., 2009 1,09) Rs11249433 | FOGRIB 1p11.2 0,39 1,14 Thomas et (1,10- al., 2009 1,19) "Frequência do alelo de risco elevado. *Taxa de probabilidade (e intervalo de confiança) por cópia do alelo de risco elevado.

Tabela 10. Desempenho da genotipagem dos loci de câncer de mama |

; » — lrese0n6s2 — jarrango — >> Jo269 foas | : | | Ireaa1508a — arranjo — josst = => joao [o,os |

PESTE PPP CANA "Frequência do alelo de risco elevado previamente reportada em mulheres caucasianas.

?Vvalor de P para o equilíbrio Hardy-Weinberg, de um teste de razão de probabilidade, em mulheres caucasianas.

Foram excluídas 264 amostras de análises que tinham mais de 2 genótipos faltando dos 10 SNPs; para as amostras restantes incluídas na análise, 96% tinham dados completos para os 10 SNPs.

Cada SNP foi testado individualmente para a associação com câncer de mama invasivo por meio de regressão logística sob um modelo log aditivo sem covariáveis. Os resultados para as mulheres caucasianas foram em geral consistentes com relatórios anteriores, conforme demonstrado na Tabela

11.

Tabela 11. Testes de SNP individuais de associação com câncer de mama invasivo em mulheres caucasianas. [rep assme = = for esse fp |

: o : : Taxa de probabilidade (e intervalo de confiança) por ; cópia do alelo de risco elevado anteriormente relatado.

Nenhun dos novos SNPs foram significativamente associados com câncer de mama, mas todos os testes tenderam na direção esperada e os intervalos de confiança abrangem as razões de probabilidade anteriormente relatadas.

Nenhuma interação significativa de pares entre os 10 SNPs foi detectada (45 testes distintos renderam 2 testes com P < 0,05, e nenhum com P < 0,01). A classificação de risco SNP do Composto Pra modelar o risco SNP utilizando os 10 SNPs associados ao câncer de mama selecionado, as estimativas de tamanhos de efeito relatadas anteriormente foram utilizadas.

Um modelo multiplicativo para o risco relativo pelos SNPs foi usado, onde os valores de risco para cada SNP foram escalonados para ter uma média da população de 1 com base nas frequências esperadas de três genótipos diploides possíveis.

Os genótipos em falta também foram atribuídos com um risco relativo de 1. O risco absoluto de 5 anos de Gail e o risco relativo de 10-SNP para a associação com a incidência de câncer de mama por meio de regressão logística com estimativas de o ME NR | 83 | | . risco log transformado foram testados separadamente.

Ambos | x foram fortemente associados, como mostrado na Tabela 12, ' Tabela 12. Testes de regressão logística da associação Í . com o câncer de mama invasivo em mulheres caucasianas. de risco risco? Log (risco de|/0,51 (0,34 a/l1,42 (1,26 a/l3,8x 10º anos de | 0,68) 1,60 Gail) SNP) 1,30) 12,46) Log (SNPx | 0,68 (0,54 a|l1,61 (1,46 a/3,6 x 10* risco de | 0,82) 1,77) Gail) 5 * Coeficiente de regressão logística para a pontuação de risco ? Razão de probabilidade ajustada que corresponde a um aumento de 2 vezes na pontuação de risco.

O risco de Gail e o risco SNP foram fracamente, porém significativamente correlacionados (r = 0,043, P = 0,010). O prognosticador combinado formado pela multiplicação do risco Gail absoluto pelo risco relativo SNP foi mais fortemente associado do que qualquer componente isoladamente.

A inclusão do risco de Gail e do risco SNP como termos separados melhora ainda mais o ajuste (P = 1,8 x 10º). Um termo de interação não melhora a previsão do status do câncer de mama (P = 0,50). A pontuação de Gail x 10 SNP combinado parecia ser um pouco mais informativa do que a pontuação de Gail x 7 SNP: em um modelo com ambas pontuações, a pontuação de Gail x 10 SNP melhorou o ajuste

. em relação à pontuação de 7 SNP sozinha (teste de proporção . de probabilidade: P = 0,060), mas não vice-versa (P = 0,47). Ú - O teste de Hosmer-lemeshow foi usado para avaliar a calibração das pontuações de risco de 10 SNP.

Como com as pontuações de 7-SNP, a pontuação de 10 SNP parece ser bem calibrada (P = 0,98, Figura 1). Desempenho de Classificação O desempenho da classificação foi avaliado usando as curvas características operacionais (ROC). AUC para as pontuações de Gail x 7SNP e Gail x 10SNP é essencialmente inalterada (0,599 e 0,600, respectivamente), e a diferença não é significativa (Figura 2). | Também foi avaliada a precisão da classificação usando tabelas de reclassificação (Cook et al., 2006), e as diferenças quantificadas na classificação por “melhoria de reclassificação líquida” ou NRI (Pencina et al., 2008). Os limiares de risco de cinco anos de 1,5% (para o risco abaixo da média) e 2% (para o risco elevado) e a reclassificação avaliada para o risco combinado de SNP x Gail combinado versus Gail sozinho, em mulheres caucasianas (Tabela 13). Tabela 13. Tabela de reclassificação para o risco de Gail x SNP versus o risco de Gail em mulheres caucasianas. | risco sto x Risco de cair ae sanos — => Õ&> Risco de |< 1,5% 1,5% aj > 2,0% Total Gail de 5 2,0% anos [as [múaneres [942 = = Jaas == =| === as =

MM 85 o [eventos [oo asa ds se == | eventos :

ENO 2,0% eventos |Proporção Joao — loass = losoa — [ossos =|

FEET RR RO RO RO Dmaneres ao =úúÚlass | jon | eventos | Proporção |oaso —josoo — Joser lose =| [retas | | eventos O NRI para esta tabela é 0,095 (Z = 4,4, P = 6,1 x 10º 6). A classificação melhorou para 7,7% dos casos (P = 4,2 x 107), e 1,8% dos controles (P = 0,11). Estes resultados foram ligeiramente melhores do, mas não significativamente diferentes do que os resultados do modelo 7-SNP. A reclassificação sob os modelos 10-SNP versus 7-SNP também foi avaliada diretamente. NRI para o modelo de 10 à SNP foi de 0,011, que não foi significativo (Z = 0,72, P = . 0,23). A reclassificação líquida dos casos melhorou em 2,6% (P = 0,007), mas piorou para 1,6% dos controles (P = 0,94). ' - Se NRI é avaliado com um grande número de valores-limite, então as estatísticas melhoram porque às mulheres têm ' alterações nas pontuações que são grandes o suficiente para movê-las para uma nova categoria.

Por exemplo, com 25 limiares em quantis de 4% de risco, o NRI para os modelos | 10-SNP versus 7-SNP é 0,056 (Z = 1,8, P = 0,04), e com 100 limiares, NRI melhora para 0,069 (Z = 2,0, P = 0,02). Conclusões ! Neste conjunto de dados, é demonstrado que O | classificador 10-SNP é essencialmente tão preditivo e bem calibrado como demonstrado para o classificador 7-SNP.

O conjunto de dados WHI não parece ser grande o suficiente para demonstrar efetivamente que oO classificador 10 SNP é | melhor do que o classificador 7-SNP.

No entanto, a pequena melhora esperada da adição de SNPs ao modelo será provavelmente clinicamente significativa em alguns contextos.

Será percebido pelas pessoas versadas na técnica que inúmeras variações e/ou modificações podem ser feitas com a invenção, como mostrado nas modalidades específicas, sem se afastar do espírito ou do escopo da invenção como amplamente descrita.

As presentes modalidades, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos como sendo ilustrativas e não restritivas.

Todas as publicações discutidas e/ou aqui referenciadas são aqui incorporadas nas suas totalidades.

O presente pedido reivindica a prioridade de US

" 61/182.809, depositado no dia 1º de junho de 2009, e US . 61/258.420, depositado no dia 5 de novembro de 2009, todo o conteúdo dos quais sendo incorporado neste documento por ' - referência. Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descritivo é exclusivamente com a finalidade de fornecer um contexto para a presente invenção. Não é para ser tomada como uma admissão de que qualquer uma ou todas estas questões fazem parte da base da técnica anterior ou eram de conhecimento geral no domínio relevante para a presente invenção, tal como existia antes da data de prioridade de cada reivindicação deste pedido. | REFERÊNCIAS Ahmed et al. (2009) Nature Genetics 41: 585-590. Antoniou et al. (2009) Hum Mol Genet 18:4442-4456. Barringer et al. (1990) Gene 89: 117-122. Beaucage e Caruthers (1981) Tetrahedron Letts. 22:1859-1862. Blok e Kramer (1997) Mol Cell Probes 11; 187-194. Bonnet et al. (1999) PNAS 96: 6171-6176. Chee et al. (1996) Science 274: 610-614. Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685. Chiebowski et al. (2007) J Natl Cancer Inst 99: 1695- 1705, Cook et al. (2006) Ann Intern Med 145: 21-29. Costantino et al. (1999) J Natl Cancer Inst 91: 1541-

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Chem. 71: 1138-1145 |

Claims (38)

See 2/8 REIVINDICAÇÕES

1. Método para avaliar o risco total de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama CARACTERIZADO pelo fato de compreender: Ss realizar uma avaliação de risco clínico da indivídua; realizar uma avaliação de risco genético da indivídua, em que a avaliação de risco genético envolve a detecção, em uma amostra biológica derivada da indivídua, da presença de pelo menos dois polimorfismos de mnucleotídeo únicos conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer de mama; e combinar a avaliação de risco clínico com a avaliação de risco genético para obter o risco total de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama.

2. Método de determinação se o risco total de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama analisado por avaliação de risco clínico deve ser reclassificado, CARACTERIZADO por compreender: combinar à avaliação de risco elíinico com uma avaliação de risco genético para obter o risco total de uma mulher para desenvolver um fenótipo de câncer de mama, em que a avaliação do risco genético envolve a detecção, em uma amostra biológica derivada da indivídua, da presença de pelo menos dois polimorfismos de nucleptideo Unico conhecidos por estarem associados a um fenótipo de câncer de mama, e determinar se a combinação da avaliação de risco clínico com a avaliação de risco genético resulta em uma reclassificação do risco total do indivíduo para O desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama.

. : 2/8

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a melhoria de reclassificação líquida (NRI) do método é maior do que 0,01.

Ss 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a melhoria de reclassificação líquida (NRI) do método é maior do que 0,05.

Ss. Método, de acordo com a ztseivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que O risco de 5 anos determinado pela avaliação de risco clínico está entre cerca de 1,5% a cerca de 2%.

6. Método, de acordo com à reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a melhoria de reclassificação líquida (NRI) do método é maior do que 0,1.

7. Método, de acordo com auarquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a realização da avaliação de risco clínico usa um modelo selecionado de um grupo consistindo do Modelo de Gail, Modelo de Claus, Tabelas de Claus, BOADICEA, Modelo de Jonker, Fórmula Estendida de Claus, Modelo de Tyrer-Cuzick e o Sistema de Pontuação de Manchester.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que realizar a avaliação de risco clínico inclui a obtenção de informações da mulher de um ou mais dos seguintes: histórico médico de câncer de mama, carcinoma de ducto ou carcinoma lobular, idade, idade do primeiro período menstrual, idade em que ela deu à luz à primeira vez, histórico familiar de câncer de mama, resultados das eo 3/8 biópsias de mama anteriores e raça/etnia.

9. Método, de acordo Com à reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a avaliação de risco clinico é obtida utilizando o Modelo de Gail.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de compreender detectar a presença de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez polimorfismos de nucleotídeo únicos conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer de mama.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de compreender detectar a presença de sete, oito, nove ou dez polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer de mama.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que os polimorfismos de nucleotídeo único são selecionados de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rs889312, relashiOd4o, reliscalãas, reddicoBAa, resbli7i9d ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que os polimorfismos de nucleotídeo únicos são selecionados de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rs889312, rs13387042, rs13281615, res4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950 e rsl1249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

o a/8

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 Ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de compreender detectar a presença de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez dos polimorfismos de nucleotídeo único.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12 Ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de compreender detectar a presença de sete, oito, nove ou dez dos polimorfismos de nucleotídeo único.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que os polimorfismos de nmueleotideo único são testados individualmente quanto à associação com câncer de mama por regressão logística no modelo aditivo log sem covariáveis.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que os polimorfismos de nucleotídeo único são testados em combinação quanto à associação com câncer de mama.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a combinação da avaliação de risco clínico com a avaliação de risco genético compreende multiplicar as avaliações de Tisco.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a mulher é caucasiana.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a mulher teve uma biópsia da mama.

21. Método, de acordo com qualduer uma das reivindicações de 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que os

. : : 5/8 resultados da avaliação de risco clínico indicam que a mulher deve ser submetida a triagens mais frequentes e/ou terapia anticâncer de mama profilática.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que se é determinado que O indivíduo tem um risco de desenvolver câncer de mama, oO indivíduo é mais propenso de ser responsivo à inibição de estrogênio do que não responsivo.

23. Sistema para avaliar o risco total de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama CARACTERIZADO por compreender: instruções do sistema para a realização de uma avaliação de risco clínico da mulher; instruções do sistema para realizar uma avaliação de risco genético da mulher; e instruções de sistema para combinar a avaliação de risco clínico com a avaliação de risco genético para obter o risco total de uma mulher desenvolver um fenótipo de câncer de mama.

24. Sistema, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de ser um sistema implementado por computador.

25. Sistema, de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda: um conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores configurados para detectar, em uma amostra biológica derivada da indivídua, a presença de pelo menos dois polimorfismos de nucleotídeo único conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer de mama;

e . ; 6/8 um detector que é configurado para detectar uma ou mais saídas de sinal a partir do conjunto de sondas marcadoras ou iniciadores, ou uM amplicon produzido a partir do grupo de sondas marcadoras ou iniciadores, deste modo identificando a presença ou ausência de pelo menos dois polimorfismos de nucleotídeo únicos conhecidos por estarem associados com um fenótipo de câncer de mama.

26. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que os polimorfismos de nucleotídeo único são selecionados de WA Grupo consistindo de rs7981582, restosces, ressss1o, rs13387042, rela2el1615, rs4415084, rs3817198 ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

27. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que O grupo de sondas marcadoras ou iniciadores detecta um ou mais dos polimorfismos de nucleotídeo único designados rs2981582, x+53803662, rs889312, xs13387042, xsl3281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, rs6504950 e rsl11249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

28. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que O detector detecta uma ou mais emissões de luz, em que a emissão de luz é um indicativo da presença ou ausência do polimorfismo de nucleotídeo único.

29. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o sistema compreende uma amostra biológica derivada da o. 7/8 indivídua.

so. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra compreende DNA genômico, DNA genômico amplificado, DNAc, DNAC amplificado, RNA ou RNA amplificado.

31. Kit compreendendo pelo menos dois conjuntos de iniciadores para amplificar dois ou mais ácidos nucléicos, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois ou mais ácidos nucléicos compreendem um polimorfismo de nucleotídeo único selecionado de um grupo composto de rs2981582, rs3803662, rs889312, nrsl13387042, rsl3281615, rs4415084, rs3817198, rs4973768, re6504950 e rsl1249433, ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

32. Matriz genética CARACTERIZADA por compreender pelo menos dois ácidos nucleicos que compreendem de forma independente um polimorfismo de nucleotídeo único selecionado de um grupo consistindo de rs2981582, rs3803662, rss89312, rS13387042, rsl3281615, rs4415084, vrasal7100, ress7açeão, resso495O & relizábaas, Ou um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um ou mais dos mesmos.

33. Método para determinar a necessidade de testes de diagnóstico de rotina de uma mulher para câncer de mama CARACTERIZADO por compreender a avaliação do risco geral do indivíduo desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

34. Método de triagem para o câncer de mama em uma mulher CARACTERIZADO por compreender a avaliação do risco

Ú 8/8 geral do individuo desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, e a testagem rotineira para O câncer de mama no indivíduo, se eles forem avaliados como tendo um risco de desenvolver câncer de mama.

35. Método para determinar a necessidade de uma mulher para terapia anticâncer de mama profilática CARACTERIZADO por compreender a avaliação do risco geral do indivíduo de desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

36. Método para a prevenção de câncer de mama em uma mulher CARACTERIZADO por compreender avaliar o risco geral do indivíduo para desenvolver um fenótipo de câncer de mama utilizando o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 21 a 22, e administrar uma terapia anticâncer de mama ao indivíduo se eles forem avaliados como tendo risco de desenvolver câncer de mama.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia inibe o estrogênio.

38. Método para estratificar um grupo de mulheres para um teste clínico de uma terapia candidata, CARACTERIZADO pelo fato de compreender avaliar o risco geral individual dos indivíduos para o desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama utilizando o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, e usar os resultados da avaliação para selecionar indivíduos mais propensos a serem responsivos à terapia.

o o £ os o Z 9 o 2 O o o =2os o o > o o Es & O o Êo o 04 os os Taxa de evento esperada Fig. 1 ao y w

7 7 z rá /z os Pá zé Dá í o 1 Tv é É os Pé 2 É on 7 Ss É o a ” | É | z ze z 7 o2 / ” Gail+10SNP.

O fo Gailt7SNP. o z oo oo o2 os os os 10 1 - Especificidade Fig. 2 b RESUMO

MÉTODOS PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE CÂNCER DE MAMA A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para avaliar o risco global de um sujeito humano do sexo feminino para o desenvolvimento de um fenótipo de câncer de mama. Em particular, a presente invenção refere-se à combinação de avaliação de risco clínico e avaliação de risco genético para melhorar a análise de risco.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1

MOO Campo 2 ONDA nao Outras Informações: - Nome do Arquivo: 201101405 - list de seq.txt - Data de Geração do Código: 30-01-2012 - Hora de Geração do Código: 15:51:43 - Código de Controle: - Campo 1: SDES9DAB6CO6F953 - Campo 2: OBESS4AD5878ED7B Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList)