CN109971856A - 用于评估人类受检者罹患肺癌的试剂盒或系统及应用 - Google Patents
用于评估人类受检者罹患肺癌的试剂盒或系统及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于评估人类受检者罹患肺癌的试剂盒或系统及应用。试剂盒包括至少三组用于扩增两种或更多种核酸的引物。系统包括：用于进行所述受检者的临床风险评估的系统指令；用于进行所述受检者的遗传风险评估的系统指令，所述遗传风险评估包括，在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种选自已知与肺癌表型相关的单核苷酸多态性的存在；和用于结合所述临床风险评估与所述遗传风险评估以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险的系统指令；所述试剂盒或系统可以与人类受检者临床风险相结合以改善肺癌风险分析。所述试剂盒或系统在应用中可辅助用于确定肺癌筛查方案的决策，从而能尽早提供预防方针。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，具体涉及用于评估人类受检者罹患肺癌的试剂盒或系统及应用。
背景技术
肺癌的发病率和死亡率在全球范围内均居首位，是我国发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。我国每年因癌症死亡的病人中有近四分之一死于肺癌。虽然近年来随着诊疗技术的提高和治疗方法的不断改进，肺癌病人的生存率有所提高，但由于肺癌早期多无特异性症状，大多数患者临床诊断时已经属于中晚期，目前肺癌5年生存期仍只有17.1％。尽管近年来西方国家中肺癌发病率和死亡率有降低的趋势，但中国人群相比其他人群仍然具有较高的肺癌发病率和死亡率。无论是高绝对数或是高死亡率，都使肺癌毫无疑问地成为中国公共卫生的主要问题。
由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查肺癌的方法主要是通过化验血肿瘤指标及CT、PET-CT等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。
大规模人群筛查代价高昂。理想情况下，绝对谁应该接受筛查以及筛查的程序和密度应该基于个体的肺癌风险。然而，于目前没有确切的或有效的方法来确定疾病的个体风险，因此有针对性的筛查仅基于年龄、性别、生活习惯以及家族史的非常泛泛的风险因素。由于大部分进行筛查的个体永远不会患肺癌，而许多未进行筛查的个体且患有肺癌，这使得筛查项目效率低下。
遗传风险评估可以提高筛查项目的效率。然而，肺癌的遗传易感性是复杂的并且涉及多种变体和基因。为了提高筛查效率和降低肺癌死亡率，需要改进的方法来评估人类受试者患肺癌的风险。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了用于评估人类受检者罹患肺癌的试剂盒或系统及其应用。
本发明所采用的技术方案如下：
一种用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的试剂盒，包括至少三组用于扩增三种或更多种核酸的引物，其中所述三种或更多种核酸独立地包括选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、 rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、 rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、 rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、 rs501942、rs2736100、rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
该试剂盒还可包括进行扩增反应所需要的其它试剂，例如缓冲液、核苷酸和/或聚合酶，以及用于从样品中提取核酸的试剂。
一种用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的系统，包括：
用于进行所述受检者的临床风险评估的系统指令；
用于进行所述受检者的遗传风险评估的系统指令，所述遗传风险评估包括，在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种选自已知与肺癌表型相关的单核苷酸多态性的存在；
和用于结合所述临床风险评估与所述遗传风险评估以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险的系统指令；
具体的，该系统是计算机执行的系统。
其中所述单核苷酸多态性选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、 rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、 rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、 rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、 rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
进一步的，该系统还包括：
一组标志物探针或引物，其被设置以在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在；
检测器，其被设置以检测一种或多种来自所述标志物探针或引物组或由所述标志物探针或引物组产生的扩增子的信号输出，从而鉴定至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在或不存在。
进一步的，所述检测器检测一种或多种光发射，其中所述光发射指示所述单核苷酸多态性的存在或不存在。
进一步的，其中所述生物样品包括基因组DNA、扩增的基因组DNA、cDNA、扩增的cDNA、RNA或扩增的RNA。
在以上所述的系统或者试剂盒中：
其中2个连锁不平衡的单核苷酸多态性的D'>0.7。
在没有协变量的对数加性模型下，通过逻辑回归单独地检验所述单核苷酸多态性与肺癌的相关。
对所述单核苷酸多态性结合检测其与肺癌的相关。
其中结合所述临床风险评估与所述遗传风险评估包括将所述风险评估相乘。
用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的试剂盒或系统的用途，包括：
进行所述人类受检者的临床风险评估；
进行所述人类受检者的遗传风险评估，其中所述遗传风险评估包括，在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在；
和结合所述临床风险评估与所述遗传风险评估，以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险；
其中至少三种单核苷酸多态性选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、 rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、 rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、 rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、 rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、 rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
用于确定通过临床风险评估所分类的人类受检罹患胃癌表型的总体风险是否应该重新分类的试剂盒或系统的用途，包括：
结合所述临床风险评估与遗传风险评估，以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险；
其中所述遗传风险评估包括，在来源于所述受检者的生物样品中，检测至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在；
和确定将所述临床风险评估与所述遗传风险评估结合是否引起所述受检者罹患肺癌的总体风险的重新分类；
其中至少三种单核苷酸多态性选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、 rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、 rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、 rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、 rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、 rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
进一步的，在评估所分类的人类受检罹患胃癌表型的总体风险是否应该重新分类中，净重新分类改进(netreclassificationimprovement，NRI)＞0.01。
更进一步的，净重新分类改进(netreclassificationimprovement，NRI) ＞0.05。
更进一步的，净重新分类改进(netreclassificationimprovement，NRI) ＞0.08。
更进一步的，净重新分类改进(netreclassificationimprovement，NRI) 约为0.09。
进一步的，通过临床风险评估所确定的5年风险在1.5％～2％之间。更进一步的，优选该方法的净重新分类改进(NRI)＞0.1；更进一步的，净重新分类改进(NRI)＞0.12；更进一步的，净重新分类改进(NRI)＞0.15。更进一步的，净重新分类改进(netreclassificationimprovement，NRI)为0.195。
在如上所述的两种用途中：
其中进行所述临床风险评估使用选自Gail模型、Claus模型、Claus表格、BOADICEA、Jonker模型、ClausExtendedFormula、Tyrer-Cuzick模型、和 Manchester评分系统的模型。
其中进行所述临床风险评估包括获得以下一种或多种的信息：肺癌的疾病史、年龄、吸烟史、癌症的家族史、呼吸系统疾病史。
优选的，所述临床风险评估使用Gail模型获得。
一种具有评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险功能的遗传芯片，其特征在于，包括至少三种核酸，其中核酸独立地包括选自rs4886591、rs71658797、 rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、 rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、 rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、 rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、 rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775、或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
进一步的，所述芯片包括代表各SNP的各个已知等位基因的核酸。
在本发明的技术方案中，试剂盒、系统及其用途中的至少一些特征可以结合一起使用。例如，用于检测调节剂(modulators)的系统可以用来实践调节剂检测的用途。用于鉴定肺癌表型易感性与多态性之间的关联的系统可以用于实践本文中的用途。试剂盒可以用来实践本文中的用途。因此，系统、试剂盒及其用途的所述特征可以应用到本文中不同的系统、试剂盒及其用途。
贯穿本说明书，词语“包括”、或其变体例如“包含”或“含有”将被理解为意指包含所述元件、整体(integer)或步骤，或一组元件、整体或步骤，但不排除任何其它元件、整体或步骤，或一组元件、整体或步骤。
以下通过下列非限制性的实施例并参考附图对本发明进行描述。
本发明所采用的技术效果如下：
1、通过本发明公开的试剂盒、系统及其用途，可以评估人类受检者发生肺癌的总体风险，并且如果该受检者被评估为具有发生肺癌的风险，则可对他们及时进行肺癌常规筛查。合适的肺癌筛查方法的例子包括但不限于，胸片和低剂量CT。
2、通过本发明公开的试剂盒、系统及其用途，可以评估人类受检者发生肺癌的总体风险，如果受检者被评估为具有发生肺癌的风险，则可以及时对他们进行预防措施或进行抗癌治疗。
3、通过本发明公开的试剂盒、系统及其用途，可以将一组人类受检者分层(stratify)以进行候选治疗的临床试验，包括使用本发明所公开的技术来评估受检者发生肺癌的个人总体风险，和使用评估结果来选择更可能对治疗反应的受检者。
4、通过本发明所公开的技术可知，将单核苷酸多态性与临床风险评估相结合提供超过单独使用临床风险评估的优势。所述试剂盒或系统可以与人类受检者临床风险相结合以改善肺癌风险分析。所述试剂盒或系统在应用中可辅助用于确定肺癌筛查方案的决策，从而能尽早提供预防方针。
附图说明
图1为10-SNP、34-SNP以及与Gail组合的风险评分的接受者操作特性曲线(receiver operating characteristic curve)。
图2为按年龄分类、癌症家族史(一级亲属)和风险等位基因数量的肺癌风险。风险等位基因数量最高和最低五分位数到75岁的累积风险。
图3为按年龄分类、癌症家族史(一级亲属)和风险等位基因数量的肺癌风险。风险等位基因数量最高和最低十分位数到75岁的累积风险。
图4为按年龄分类、癌症家族史(一级亲属)和风险等位基因数量的肺癌风险。风险等位基因数量最高和最低五分位数的5年风险。
图5为按年龄分类、癌症家族史(一级亲属)和风险等位基因数量的肺癌风险。风险等位基因数量最高和最低十分位数的5年风险。
具体实施方式
下面结合附图，说明本实施例的具体实施方式。
一般技术和定义。
除非另外具体定义，用于本文中的所有技术和科学术语都将被认为具有与本领域(例如，在细胞培养、肺癌分析、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学领域)普通技术人员通常理解的意义相同的意义。
应该理解本发明并不限于特定的实施方式，当然其可以改变。也应该理解本文中使用的术语仅出于描述特定的实施方式的目的，而不是意在限制。
本文中使用的“肺癌”是指在个体中表现出发生肺癌倾向的表型。表现出肺癌倾向的表型可以，例如，在一组给定的环境条件下(饮食、身体活动方式、地理位置等)，在具有该表型的个体中比在相关一般群体的成员中表现出更高的癌症将会形成的可能性。
本文中使用的“生物样品”是指任何来自于或者可从人类患者得到的样品，例如，来自患者的体液(血液、唾液、尿液等)、活检、组织、和/或废物。因此，组织活检、粪便、痰(sputum)、唾液、血液、淋巴、泪液、汗液、尿液、阴道分泌物等可以容易地对其筛查SNP，基本上含有合适核酸的任何有兴趣组织也能被筛查。这些样品通常在知情同意之后通过标准医学实验室方法取自于患者。这些样品可以是以直接取自于患者的形式，或者可以至少部分被处理(纯化)以除去至少一些非核酸的材料。
“多态性”是可变的基因座；即，在一个群体内，在多态性处的核苷酸序列具有多于一种的形式或等位基因。多态性的一个例子是“单核苷酸多态性”，其是基因组中单个核苷酸位置处的多态性(特定位置处的核苷酸在个体或群体之间可变)。
本文中使用的术语“SNP”或“单核苷酸多态性”是指个体之间的遗传变异；例如，生物体DNA中可变的单一含氮碱基位置。本文中使用的“SNP”是复数的SNP。当然，当提及本文的DNA时，该提及可包括DNA的衍生物，例如其扩增子、RNA转录物等。
术语“等位基因”是指在一个特定基因座处出现或在此处编码的两种或更多种不同核苷酸序列中的一种，或由这样的基因座所编码的两种或更多种不同多肽序列中的一种。例如，第一种等位基因可以出现在一条染色体上，而第二种等位基因出现在第二条同源染色体上，例如，正如对于杂合个体的不同染色体、或群体中的不同纯合或杂合个体之间的不同染色体所出现的。当等位基因与性状相关联(linked)并且当等位基因的存在是该性状或性状形式将在含有该等位基因的个体中出现的指示物时，该等位基因与该性状“正”相关。当等位基因与性状相关联并且当该等位基因的存在是该性状或性状形式将不会在含有该等位基因的个体中出现的指示物时，该等位基因和性状“负”相关。
当标志物多态性或等位基因可以在统计上与表型关联(正相关或负相关) 时，其与特定表型(肺癌易感性等)“相关”或“关联”。用于确定多态性或等位基因是否在统计上关联的方法为本领域技术人员公知。也就是说，特定的多态性在病例群体(例如，肺癌患者)中要比在对照群体(例如，不具有肺癌的个体)中更常出现。该关联通常被推断为在本质上是原因性的，但其不必是——表型下的性状与基因座的简单遗传相关(与之关联)足以让相关/关联产生。
“连锁不平衡”(LD)用来描述两个邻近的多态性基因型之间的统计相关性。通常来说，LD是指，假设配子之间哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)(统计独立)时两个基因座处的随机配子的等位基因之间的相关性。LD通过Lewontin的相关参数(D’)或通过Pearson相关系数(r)量化 (Devlin和Risch，1995)。D’为1的两个基因座被认为是处于完全的LD。在另一个极端，D’为0的两个基因座被称为处于连锁平衡。连锁不平衡是根据用于单倍型频率估计的期望最大化算法(EM)的应用来计算的(Slatkin和 Excoffier，1996)。邻近基因型/基因座的根据本发明的D’选为0.7以上，优选0.8以上，更优选0.9以上，理想的为约1.0。
“等位基因频率”是指等位基因在个体内、品系内、或品系群体内的一个基因座出现的频率(比例或百分比)。例如，对于等位基因“A”，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体具有分别为1.0、0.5、或0.0的等位基因频率。可以通过将来自品系或群体的个体样品的等位基因频率平均来估计该品系或群体(例如，病例或对照)内的等位基因频率。相似地，可以通过将组成群体的品系的等位基因频率平均来计算品系群体内的等位基因频率。
如果个体在一个给定基因座处仅有一种类型的等位基因(例如，二倍体个体在两条同源染色体各自的一个基因座处具有一个拷贝的相同等位基因)，则该个体为“纯合的”。如果在一个给定基因座处存在多于一个的等位基因型(例如，具有两种不同等位基因各自的一种拷贝的二倍体个体)，则该个体为“杂合的”。术语“同质性”表示群体的成员在一个或多个特定基因座处具有相同的基因型。相反，术语“异质性”用来表示群体内的个体在一个或多个特定基因座处的基因型不同。
“基因座/座位”(locus)是染色体位置或区域。例如，多态性基因座是多态性核酸、性状决定子、基因或标志物所在的位置或区域。在一个另一个实施例中，“基因的基因座”是能够找到特定基因的物种基因组中的特定染色体部位(区域)。
“标志物”、“分子标志物”或“标志物核酸”是指在鉴定基因座或连锁基因座时用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如，蛋白质)。标志物可从基因组核苷酸序列、或从表达的核苷酸序列(例如，从RNA、nRNA、mRNA、cDNA等)、或从编码的多肽获得。该术语也指与标志物序列互补或在其侧翼的核酸序列，例如，用作能够扩增标志物序列的探针或引物对的核酸。“标志物探针”是可用于鉴定标志物基因座的存在的核酸序列或分子，例如，与标志物基因座序列互补的核酸探针。当核酸，例如根据Watson-Crick碱基配对原则在溶液中特异性地杂交时，其为“互补的”。“标志物基因座”是能够用来追踪第二连锁基因座的存在的基因座，例如，编码或对表型性状的群体变异有作用的连锁或相关的基因座。例如，标志物基因座可以用来监测等位基因在一个基因座例如QTL的分离，该等位基因在遗传上或物理上与标志物基因座连锁。因此，“标志物等位基因”、或者“标志物基因座的等位基因”是在群体的标志物基因座处发现的多个多态性核苷酸序列中的一个，该群体对于该标志物基因座为多态性的。一方面，本发明提供与目标表型(例如肺癌易感性/抗性)相关的标志物基因座。预计各个被鉴定的标志物与对相关表型起作用的遗传元件 (例如QTL)具有紧密的物理和遗传邻近性(产生物理和/或遗传连锁)。对应于群体成员之间遗传多态性的标志物可以用本领域已确立的方法进行检测。这些方法包括，例如，基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性 (RFLP)的检测、同工酶标志物的检测、等位基因特异性杂交(ASH)的检测、单核苷酸延伸的检测、基因组的扩增可变序列的检测、自主(self-sustained) 序列复制的检测、简单序列重复(SSR)的检测、单核苷酸多态性(SNP)的检测、或扩增的片段长度多态性(AFLP)的检测。
在核酸扩增的上下文中的术语“扩增”，是为产生额外拷贝的选定核酸(或其转录形式)的任何过程。典型的扩增方法包括多种基于聚合酶的复制方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶介导的方法例如连接酶链式反应(LCR) 和基于RNA聚合酶的扩增(例如，通过转录)方法。
“扩增子”是扩增出的核酸，例如，通过任何可用的扩增方法(例如，PCR、 LCR、转录等)通过扩增模板核酸而生成的核酸。
当使用给定核酸的序列构建出特定核酸、或当使用给定的核酸构建出特定核酸时，该特定核酸“得自”该给定核酸。
“基因”是基因组中的一个或多个核苷酸序列，其共同编码一个或多个被表达的例如RNA或多肽的分子。该基因可以包括编码序列，该序列转录为RNA， RNA之后可被翻译为多肽序列，并可以包括帮助基因复制或表达的相关结构序列或调节序列。
“基因型”是一个个体(或一组个体)在一个或多个遗传基因座的基因组成。基因型由个体的一个或多个已知基因座的等位基因确定，一般由从其亲代遗传的等位基因的编译(compilation)所确定。
“单倍型”是个体在单条DNA链上多个遗传基因座处的基因型。通常来说，通过单倍型描述的遗传基因座是在物理上和遗传上连锁的，即，在同一条染色体链上。
标志物、探针、或引物“组”是指标志物探针、引物的集合或小组、或由其得到的数据，其用于共同目的，例如，鉴定具有特定基因型(例如，发生肺癌的风险)的个体。对应于标志物、探针或引物、或衍生自其使用的数据常常被储存在电子介质中。尽管一组中的成员各自具有在特定目的方面的应用，但是选自该组和亚组(其包括某些，但并非所有的标志物)的单独标志物也有效地实现特定目的。
上述的多态性和基因、和相应的标志物探针、扩增子或引物可以以物质核酸的形式，或以包含核酸序列信息的系统指令的形式包括在本文的任何系统中。例如，该系统可以包括对应于本文所述的基因或多态性(或扩增其一部分)的引物或扩增子。在上述的方法中，该标志物探针或引物组任选地检测多个所述基因或遗传基因座中的多个多态性。因此，例如，该标志物探针或引物组检测这些多态性或基因或者任何其它本文定义的多态性、基因或基因座的各种中的至少一种多态性。任何这样的探针或引物可以包括任何这样的多态性或基因、或其互补核酸、或其转录产物(例如，通过例如转录或剪接从基因组序列产生的nRNA或mRNA形式)的核苷酸序列。
在本文中使用的“逻辑回归”(logistic regression)是指通过将数据拟合至逻辑曲线来预测事件发生的可能性的方法。本领域的技术人员将会理解怎样在本发明的背景中使用该方法。
本文中使用的“Hosmer-Lemeshow检验”是指用于测量拟合度缺乏的统计方法。使用该检验的方法在领域内公知(Hosmer DW，LemeshowS.Applied LogisticRegression.NewYork：Wiley；1989：Section5.2.2)。
本文中用到的“接受者操作特征曲线”是指二元分类系统的敏感度相对于 (1-特异性)在其鉴别阈值变化时的图表。ROC也可以通过将真阳性部分(TPR ＝真阳性率)相对于假阳性部分(FPR＝假阳性率)作图来对等地表示。也已知为相关操作特征曲线，因为其是两个操作特征(TPR和FPR)随着标准变化的比较。ROC分析对独立地从成本环境或类别分布(并在将其具体化之前)选择可能最佳的模型以及去除非最佳模型提供了工具。ROC分析以直接和自然的方式与作出诊断决策的成本/利益分析相关。ROC曲线首先是由电子工程师和雷达工程师在二战中开发的，用来检测战场中的敌人目标，因此也已知为信号检测理论，之后很快就被引入到心理学中以解释信号的感知性检测。自那之后， ROC分析已经被用于医学、放射学、和其它领域数十年，并且不久以前已经被引入像机器学习和数据挖掘等其它领域。本领域的技术人员将清楚在本发明背景中的使用方法。
本文中使用的术语“将临床风险评估与遗传风险评估结合来获得总体风险”是指依赖于两种评估结果的任何合适的数理分析。例如，临床风险评估和遗传风险评估的结果可以相加，更优选相乘。
临床风险评估。
任何合适的临床风险评估程序可以用于本发明中。优选地，临床风险评估不包括对在一个或多个基因座处进行基因分型。在一个实施方式中，临床风险评估流程包括从获得关于以下一种或多种的信息：肺癌的疾病史、年龄、吸烟史、癌症的家族史、呼吸系统疾病史、用药史、体重指数、酒精消耗史、运动史、饮食习惯和职业。临床风险评估程序的例子包括，但不限于，Gail模型(Gail 等人，1989，1999和2007；Costantino等人，1999；Rockhill等人，2001)、 Claus模型(Claus等人，1994和1998)、Claus表格、BOADICEA(Antoniou 等人，2002和2004)、Jonker模型(Jonker等人，2003)、Claus Extended Formula (vanAsperen等人，2004)、Tyrer-Cuzick模型(Tyrer等人，2004)、Manchester 评分系统(Evans等人，2004)等。在一个优选实施方式中，临床风险评估程序是Gail模型。
任何合适的临床风险评估程序均可用于本发明。优选地，临床风险评估不涉及在一个或多个座位上对受试者进行基因分型。尽管如此，临床风险评估程序可包括获得关于TP53和EGFR基因中突变的信息。
遗传风险评估。
通过检测分析三个或更多个已知与肺癌相关的单核苷酸多态性分析受检者的基因型来进行遗传风险评估，以计算风险分数。本领域的技术人员将会理解，每一个SNP具有大于1.0的与肺癌相关的优势比(odds ratio，OR)，更优选大于1.05。这样的SNP的例子包括，但不限于，指定为rs4886591、 rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、 rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、 rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、 rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、 rs116480994、rs13201681和rs67340775的那些(参见表1)，或与其中一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
表1.肺癌相关SNP
技术人员可以容易地鉴定与本文中具体提到的那些处于连锁不平衡的SNP。利用1000人基因组数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/； http://www.internationalgenome.org/data)可以方便分析与每个肺癌相关SNP存在连锁不平衡的SNP。
标志物扩增策略。
用于扩增标志物(例如，标志物基因座)的扩增引物和用于检测这类标志物或将样品对于多种标志物等位基因进行基因分型的合适探针可用于本发明中。例如，对于PCR的引物选择在美国10/042,406和美国10/236,480中描述；对于短程PCR(short-rangePCR)，美国10/341,832提供针对引物设计的指导。而且，还有用于引物设计的公众免费设计软件，如“Primer3” (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。通过这样的引物设计原则和设计软件、公共数据库中人类基因组序列和多态性位置及序列，技术人员可以设计合成引物来扩增SNP以实践本发明。此外，应该理解，用来检测包含SNP的核酸(例如，包含SNP的扩增子)的精确探针可以不同，例如，能鉴定待检测的标志物扩增子区域的任何探针可以与本发明结合使用。此外，检测探针的构造当然可以不同。因此，本发明并不限于本文记述的序列。
实际上，可以理解扩增并不是标志物检测所必须的，例如可以只通过对基因组DNA的样品进行Southern印迹来直接检测未扩增的基因组DNA。进行 Southern印迹、标准扩增(PCR、LCR等)和许多其它核酸检测方法的规程已经充分确立，并在例如Sambrook等人(上文)中教导。
在扩增/检测方法中，例如，还可以通过进行检测产物形成的实时扩增反应来省略单独的检测探针，其中在掺入产物时修饰相关的扩增引物，将标记的核苷酸掺入扩增子，或通过监测与未扩增的前体相比扩增子的分子旋转特性的改变(例如，通过荧光偏振)。通常，分子标志物通过本领域中可得到的任何确立的方法来检测，包括，但不限于，等位基因特异性杂交(ASH)、单核苷酸延伸的检测、芯片杂交(任选地包括ASH)、扩增片段长度多态性(AFLP) 检测、扩增可变序列检测、随机扩增的多态性DNA(RAPD)检测、限制性片段长度多态性(RFLP)检测、自主序列复制检测、简单序列重复(SSR)检测、单链构象多态性(SSCP)检测、同功酶标志物检测、sanger测序检测、新一代测序检测、分子信标检测、TaqMan检测、northern分析(其中，将表达水平用作标志物)、mRNA或cDNA的定量扩增等等。
技术人员将会理解，用于扩增包含已知与肺癌相关的SNP的核酸的寡核苷酸所杂交的基因组区域的序列可以用来设计在5’和/或3’端较长的引物、在 5’和/或3’端可能较短的引物(只要该截短形式仍然可以用于扩增)、具有一个或一些核苷酸差异的引物(但是仍然可以用于扩增)、或者与提供的那些不具有序列相似性但却是根据与具体提供的寡核苷酸所杂交的位置相近的基因组序列设计的并且仍然可用于扩增的引物。
基于芯片的标志物检测。
基于芯片的检测可利用市场上可买到的芯片进行，例如从Affymetrix(SantaClara，Calif.)或其它的制造商购买。关于核酸芯片操作的综述包括Sapolsky等人(1999)；Lockhart(1998)；Fodor(1997a)；Fodor(1997b) 和Chee等人(1996)。由于基于芯片的检测固有的高通量性质，基于芯片的检测为用于鉴定样品中本发明标志物的一种优选方法。
多种探针芯片已在文献中描述，并且可用于本发明背景中用于检测与本文指出的表型相关的标志物。DNA探针芯片通常包含玻璃芯片，其上置有高密度的DNA探针(短的DNA片段)芯片。使用DNA探针芯片来获得等位基因信息通常包括下列一般步骤：设计和制备DNA探针芯片、制备样品、样品DNA 与芯片杂交、信号检测和数据分析。
离待分析的核酸样品，扩增，并且通常用生物素和/或荧光报告基团标记。然后使用流控站和杂交炉将标记的核酸样品与阵列一起孵育。可以对阵列进行洗涤和/或染色或复染(适应检测方法)。在杂交、洗涤和染色后，将阵列插入扫描仪中，在扫描仪中检测杂交模式。在荧光报告基团发出的光已经掺入标记的核酸中时收集杂交数据，所述标记的核酸现在与探针阵列结合。与标记的核酸最明确匹配的探针比具有错配的核酸产生更强的信号。由于阵列上每个探针的序列和位置是已知的，因此通过互补性，可以确定应用于探针阵列的核酸样品的特征。
实施例。
图1为10-SNP、34-SNP以及与Gail组合的风险评分的接受者操作特性曲线(receiver operating characteristiccurve)。图2～图5显示了不同条件下的肺癌风险。结合图1～图5来对比实施例1和实施例2的数据。
实施例1。
将10个肺癌相关SNP的风险信息对于由Gail模型提供的风险分层的作用进行评估。2727名肺癌患者和2549名相匹配的非肿瘤患者的对照进行检验分析。对照组在基线年龄和性别的基础上匹配。选择来自发表文献且满足基因组水平显著性和复制的严格标准的10个SNP以对其基因分型(10-SNP组)。为了在10个所选的小组SNP之间对SNP风险进行建模，将之前报道的有效大小估计(effect size estimate)与倍增模型(multiplicativemodel)一起用于相对风险。为产生结合的临床/遗传风险，将Gail模型绝对风险评估与结合的SNP 相对风险相乘，来产生合并的临床/遗传风险。使用重新分类表来评估分类特性，以量化净重新分类指数(NRI)和接受者操作特性(ROC)曲线。
结果：
个体SNP与肺癌的关联大体与之前的报道一致。利用逻辑回归检验时， Gail 5年绝对风险和10-SNP相对风险评估均和肺癌发病率相关；Gail风险和 SNP风险之间存在统计上显著(P＝0.005)的相关。SNP逻辑回归检验结果见表2。
表2.10-SNP结果
相结合的预测结果比单独的Gail风险或SNP部分更强地相关联，结果见表3。在ROC曲线分析中，单独的Gail和SNP风险的曲线下面积(AUC)分别为0.561(95％CI：0.527～0.593)和0.642(95％CI：0.605～0.679)，而 Gail和SNP风险的组合的AUC为0.678(95％CI：0.644～0.713)，见图2。 AUC的差异具有显著统计学意义(95％CI：0.025～0.050，经验P＜0.001)。在重新分类表分析中，在对于一级预防的决定作出的背景下具有潜在临床意义的5年风险阈值被选为：＜2.5％(在平均风险以下)、2.5-5.0％(中等风险) 和＞5.0％(增加的风险)。对于结合的SNP×Gail评分相对于单独的Gail风险，在此背景下的NRI是0.11(Z＝4.2，P＝0.013)，其中对于6.4％的病例和2.6％的对照有分类改进。
表3.与肺癌吸烟相关性的逻辑回归检验
具有吸烟人群似乎是从使用结合的SNP×Gail评分的重新分类中特别获益的亚群体。在该部分中，Gail模型AUC为0.631(95％CI：0.542～0.697)，区别于随机。与全部人群相比，Gail模型的AUC差异是显著的(经验P＝0.03)。结合模型具有0.734的AUC(95％CI：0.639～0.797)。对于结合模型相对于仅Gail的AUC差异的自举(bootstrap)估计也是显著的(P＜0.001)。
在吸烟人群的重新分类度量表明，NRI是0.24，这也是非常显著的尽管事件数量较少(Z＝3.1，P＝2.5×10-6)。此处，对于对照的14.8％分类改进(P ＝1.5×10-5)但仅对于2.8％的病例分类改进(P＝0.16)。自举重新采样表明，全部人群和吸烟人群的NRI差异是统计显著的。基于1000个自举重复物 (replicates)，在吸烟人群中NRI改进的95％置信区间从0.02扩展到0.16，经验P＝0.03。
结论：
将临床风险因素(Gail风险)和充分验证的一般遗传风险因素(10-SNP 组)相结合的策略引起在肺癌风险的分类改善。这可能对于告知一级预防和/ 或筛查策略具有重要意义。
实施例2。
使用模拟来量化一组34个风险相关性SNP的效用，以根据受检者的肺癌风险对其进行分类。单独SNP风险的AUC为0.751(95％CI：0.719～0.783)，而Gail和SNP风险的组合的AUC为0.803(95％CI：0.776～0.930)，见图1。
风险等位基因风险两端的人更容易患肺癌(高端)或不太可能患肺癌(低端)。因为与整个群体中的这些SNP相关的风险的总变化可以解释总相对风险的约四分之一，所以如果还考虑肺癌的家族史，则SNP谱的预测强度增加。考虑到对于群体的最低20％(SNP风险分数)而言，与肺癌相关的强度大致与剩余相对风险相关的风险增加相反，具有肺癌家族史，但处于这些SNP风险分数的群体的最低五分位数的人员具有群体风险。
因此，对于评估肺癌的风险而言，这些SNP的检测是一种有用的方法，并且可以用于确定应该推荐谁进行肺癌筛查、以及以何种强度进行的工具。例如，在风险等位基因的前20％群体(至少24个等位基因)中的人比普通人提早9 年达到平均群体5年风险。因此，如果普通人在50岁时满足进行低剂量CT 筛查的风险阈值，则具有至少24个风险等位基因的人在41岁时就达到了相同的风险阈值。对于风险等位基因的最高五分位数和最高十分位数而言，具有患肺癌的一级亲属的人开始低剂量CT筛查的年龄分别为49岁和47岁。
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的基本结构的情况下，本发明可以作任何形式的修改。
Claims (9)
1.一种用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的试剂盒，其特征在于包括至少三组用于扩增三种或更多种核酸的引物，其中所述三种或更多种核酸独立地包括选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
2.一种用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的系统，其特征在于包括：
用于进行所述受检者的临床风险评估的系统指令；
用于进行所述受检者的遗传风险评估的系统指令，所述遗传风险评估包括，在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种选自已知与肺癌表型相关的单核苷酸多态性的存在；
和用于结合所述临床风险评估与所述遗传风险评估以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险的系统指令；
其中所述单核苷酸多态性选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
3.根据如权利要求2所述的用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的系统，其特征在于还包括：
一组标志物探针或引物，其被设置以在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在；
检测器，其被设置以检测一种或多种来自所述标志物探针或引物组或由所述标志物探针或引物组产生的扩增子的信号输出，从而鉴定至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在或不存在。
4.根据权利要求3所述的用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的系统，其特征在于：所述检测器检测一种或多种光发射，其中所述光发射指示所述单核苷酸多态性的存在或不存在。
5.根据权利要求3或者4用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的系统，其特征在于：其中所述生物样品包括基因组DNA、扩增的基因组DNA、cDNA、扩增的cDNA、RNA或扩增的RNA。
6.用于评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险的试剂盒或系统的用途，其特征在于包括：
进行所述受检者的临床风险评估；
进行所述受检者的遗传风险评估，其中所述遗传风险评估包括，在来源于所述人类受检者的生物样品中，检测至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在；
和结合所述临床风险评估与所述遗传风险评估，以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险；
其中至少三种单核苷酸多态性选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
7.用于确定通过临床风险评估所分类的人类受检罹患胃癌表型的总体风险是否应该重新分类的试剂盒或系统的用途，包括：
结合所述临床风险评估与遗传风险评估，以获得人类受检者罹患肺癌的总体风险；
其中所述遗传风险评估包括，在来源于所述受检者的生物样品中，检测至少三种已知与肺癌相关的单核苷酸多态性的存在；
确定将所述临床风险评估与所述遗传风险评估结合是否引起所述受检者罹患肺癌的总体风险的重新分类；
其中至少三种单核苷酸多态性选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775，或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
8.一种具有评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险功能的遗传芯片，其特征在于，包括至少三种核酸，其中核酸独立地包括选自rs4886591、rs71658797、rs11571833、rs17879961、rs1051730、rs55781567、rs380286、rs56113850、rs116551911、rs2285947、rs34517439、rs7741164、rs7383287、rs8034191、rs753955、rs149866169、rs2596500、rs2494938、rs28408315、rs36600、rs115666025、rs185038874、rs116295105、rs501942、rs2736100、rs144433536、rs13314271、rs4488809、rs116418332、rs7086803、rs7953330、rs116480994、rs13201681和rs67340775、或与其一种或多种处于连锁不平衡的单核苷酸多态性。
9.如权利要求8所述具有评估人类受检者罹患肺癌表型的总体风险功能的遗传芯片，其特征在于，所述芯片包括代表各SNP的各个已知等位基因的核酸。
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