JP5608169B2 - 遺伝子コピー数の変化のパターンに基づいた悪性メラノーマのゲノム分類 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年10月31日に出願された米国特許出願第61/110,308号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれている。
該当なし
該当なし
(a)少なくとも1つのMM細胞を含む、細胞系または腫瘍を含む複数のm個の試料を得るステップ、
(b)ステップ(a)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含むデータセットを取得するステップ、
(c)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータをデータセットから削除すること
を含む、データセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料をデータセットから削除するステップ、
(d)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もるステップ、
(e)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算するステップ、
(2)ステップ(e)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止するステップ、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算するステップ、
(4)ステップ(e)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均するステップ、および
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(e)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってr個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットするステップ
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てるステップ、
(f)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定するステップ、および
(g)場合によって、ステップ(f)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価するステップ
を含む、悪性メラノーマ(MM)ゲノムサブグループのデータベースを得るための方法に関する。
(a)
(i)少なくとも1つのMM腫瘍またはMM細胞系を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、および
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して、約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および、
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(v)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによって、r個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、および
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること
を含む方法によって開発されたデータベースを準備すること、
(b)MM細胞を含有すると疑われる試料を準備すること、
(c)ステップ(ii)からのものと同じ、少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第2のデータセットVsampleを取得すること、および
(d)Vsampleからの試料を、Vsampleを、ステップ(i)−(vii)において決定されたクラスターと比較することによって分類すること
を含む、MM腫瘍またはMM細胞系を分類する方法に関する。
(a)
(i)MM細胞を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて、正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
(5)データセット内の試料を、1引く(ステップ(v)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってr個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが各試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること、および
(viii)ステップ(vi)において選択された各クラスターから少なくとも1つのMM細胞系を選択し、ゲノムサブグループによって定義されたパネルに構築すること
を含む方法で構築された、ゲノムサブグループによって分類されたMM細胞のパネルから、各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞系を選択すること、
(b)各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞を治療介入と接触させること、
(c)各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入の有効性をアッセイすること、
(d)治療介入を、各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入の決定された有効性によって分類し、1つのサブグループからの少なくとも1つのMM細胞系を抑えるまたは死滅させるが、別のサブグループからのMM細胞系を抑えない、または死滅させないことにより、このサブグループのMM細胞系を抑えるまたは死滅させるための治療介入の特異性が示されること、
を含む、悪性メラノーマ(MM)細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入を分類する方法に関する。治療介入は、化学療法、生体応答修飾物質、ワクチン免疫療法または生化学療法であり得る。治療介入が生体応答修飾物質である場合、それはインターフェロン、インターロイキン−2、モノクローナル抗体および腫瘍壊死因子アルファ、またはそれらの組合せなどの活性薬剤を含む医薬組成物であり得る。
(a)
(i)少なくとも1つのMM細胞を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、および
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(v)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによって、r個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること、および
(viii)ステップ(vi)において選択された各クラスターから少なくとも1つの試料を選択し、ゲノムサブグループによって定義されたパネルに構築すること
を含む、データベースを構築すること、
(b)ステップ(a)のデータベースを分析して各サブグループに対して特徴的なコピー数の異常を決定すること、および
(c)各サブグループについての決定された特徴的なコピー数の異常に基づいて、複数のプローブを設計し、各プローブをゲノムサブグループに割り当てること
を含む、試料からのMM細胞を分類するためのプローブパネルを構築する方法に関する。
(a)データベースを構築するための説明書であって、
(i)少なくとも1つのMM細胞を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、および
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(v)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによって、r個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、および
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること
についての説明を含む、前記データベースを構築するための説明書、ならびに
(b)場合によって、第1、第2、第3、第4、第5、第6の細胞系またはこれらの単離ゲノムDNAであって、
ここで、
第1の細胞系は、SKMEL119、HS944、WM1366およびWM88からなる群から選択され、
第2の細胞系は、WM3248であり、
第3の細胞系は、1205LUであり、
第4の細胞系は、451LU、SKMEL19、SKMEL28、SKMEL30、SKMEL63、WM35、WM983およびWM983Cからなる群から選択され、
第5の細胞系は、WM3211、M14、MEWO、SKMEL2、SKMEL5、UACC257、UACC62、WM122、WM13662、WM239A、WM32112、WM32482、WM793Bおよび501MELからなる群から選択され、および
第6の細胞系は、MALME3MまたはWM882である前記細胞系
を含む、MM腫瘍試料を分類するためのキット。
ここで、
第1の細胞系は、SKMEL119、HS944、WM1366およびWM88からなる群から選択され、
第2の細胞系は、WM3248であり、
第3の細胞系は、1205LUであり、
第4の細胞系は、451LU、SKMEL19、SKMEL28、SKMEL30、SKMEL63、WM35、WM983およびWM983Cからなる群から選択され、
第5の細胞系は、WM3211、M14、MEWO、SKMEL2、SKMEL5、UACC257、UACC62、WM122、WM13662、WM239A、WM32112、WM32482、WM793Bおよび501MELからなる群から選択され、および
第6の細胞系は、MALME3MまたはWM882である。
1.機械学習アルゴリズム(ランダムフォレストなど)を適用して、正常細胞が著しく混入した試料を同定し、削除するステップ、
2.教師なしクラスタリング(階層クラスタリングなど)を使用して、データをゲノム非負値行列因子分解(gNMF)モデルに適合させる前に、予想されるクラスター数を見積もるステップ、
3.gNMFの多数のランダムスタートを使用し、続いてgNMFから得られたH行列の相関を距離行列として適用して試料を分類するステップ、
4.腫瘍および癌細胞系を、gNMFアルゴリズムを使用していくつかの予想されるクラスター数に分類し、続いてコーフェン相関係数およびベイズ情報量規準(BIC)を使用して最良モデルを選択し、最終的なクラスターの数を決定するステップ、および
5.場合によって、10倍安定性検定を適用してクラスターの安定性を評価するステップ
を含む。
ゲノム全般にわたるコピー数のプロファイル、または「コピー数」は、2つ以上の遺伝子座のDNAコピー数の測定値である。コピー数のプロファイルは、細胞が本質的に野生型であり、各遺伝子座が2つのコピーで存在している(二倍体のため、性染色体を除く)場合、または野生型の異常体、すなわち、遺伝子座の増幅および欠失を含有する場合に評価することができる。増幅および欠失は、エレメントの一部およびエレメントの全体、または多くのエレメントに同時に影響を与え得る。コピー数のプロファイルにより、増幅または欠失の正確な数は必ずしも決定されないが、遺伝学的異常性を含有する領域および異常性が欠失であるか増幅であるかは同定される。
BIC=−2*lnL+kln(n) (1)
式中、Lは、モデルがデータにどれくらい正確に近似しているかを測定する尤度であり、kはモデルにおいて使用されるパラメータの数であり、nは試料の数である。二次の項、k*ln(n)は、過剰適合を回避するためにモデルにおいて使用されるパラメータの数のペナルティとして機能する。
x(i,j)=|Xi−Xj| (2)
i番目の試料とj番目の試料の間の距離、およびt(i,j)=モデルポイント、TiとTjの間のデンドログラムの距離であり、この距離はこれらの2つのポイントが最初に一緒に連結される結節の高さである。
V=W*H+e (4)
(式中、Wは各サブグループに対する標準モデルとみなすことができ、Hは各サブグループに属する各試料の相対的な重量とみなすことができ、eはモデル適合の剰余を表し、rはクラスタリングされるサブグループの数である(通常mよりもずっと小さい))。入力としてrおよびVを与えると、gNMFアルゴリズムはまずWおよびHの初期値をランダムに設定し、次いで、式(5)および(6)に従った乗法更新ルールを用いてWおよびHを繰り返し更新する:
1.訓練セット内の事象の数がnである場合、n個の事象をランダムにサンプリングするが、元のデータからの置き換えがある。この試料は、木を成長させるための訓練セットになる。
2.m個の入力変数がある場合、数m<<Mは、各結節において、m個の変数がMからランダムに選択され、結節を分割するためにこれらのm個の変数に対する最良の分割が使用されるように特定される。mの値はフォレストが成長する間、一定に保たれる。
3.各木は可能な限りの最大規模まで成長させる。剪定はしない。
1.フォレスト内の任意の2つの木間の相関。相関が大きくなるとフォレストのエラー発生率が増加する。
2.フォレスト内の個々の木それぞれの強度。エラー発生率が低い木は強力な分類器である。個々の木の強度が増加すると、フォレストのエラー発生率が減少する。
本発明の方法において、コピー数のプロファイルの参照データベースが作成され、そこでMM細胞を含む複数(m個)の試料におけるゲノムのコピー数が決定される(mは1から5,000,000までの整数である。例えば、複数の試料は、2個、5個、10個、15個、20個、25個、50個、100個、200個、500個、1,000個、10,000個、50,000個、100,000個の試料、250,000個の試料、500,000個、1,000,000個の試料などであり得る)。次に、MM細胞はコピー数のパターン、コピー数のプロファイルに従ってゲノムサブグループに分類される。これらのサブグループのそれぞれは、遺伝子型に基づいた分類を表すだけではなく、種々の治療介入に対する特徴的な応答性も示すことが予想される。例えば、サブグループの1つが放射線に対して感受性である一方、別のサブグループは化学療法などの薬学的介入に対して感受性である可能性がある。
(i)コピー数領域は少なくとも100個のプローブを含有しなければならない;
(ii)コピー数領域の平均コピー数と隣接するコピー数領域を比較したp値は0.00001未満でなければならない;
(iii)トランジションのシグナル/ノイズ比は0.1超でなければならない。
コピー数の変化領域は、これらの領域における平均コピー数が実質的に1.65未満である(欠失)または2.65超である(増加)場合に、0.01を下回るp値を伴って検出され得る。
診断パネルを構築すると、MMの診断に対する感受性が増加する。これから対象はMMについて診断されるだけでなく、対象は、分類パネルにおける対象のMM遺伝子型の分類に基づいてMMの「ゲノム型」についても診断され得る。このように、治療の成功を高め、対象の生活の質を改善する標的治療介入が施され得る。
一次病巣の顕微鏡的に判定された病期(microstage)に釣り合ったマージンを伴う外科的切除である;厚さが2mm以下である病巣のほとんどに対して、放射状再切除マージンは1cmになる。
以下の実施例は例示する目的のみのものであり、特許請求された発明を限定するものと解釈されるべきではない。所期の発明を同様に首尾よく実行することができる種々の代替の技法および手順が、当業者にとって利用可能である。
本発明者らは、30のメラノーマ細胞系および109のメラノーマの短期培養物についてのCGHデータを、種々の発表された供給源(Greshockら、2007年;Linら、2008年)から集め、メラノーマの分類モデルを確立した。この研究において使用された細胞系の供給源は表1に列挙されている。これらのデータは、AffymetrixのGENECHIP(登録商標)Mapping 250K STY SNPアレイを使用して、製造者の指示に従って取得された。
Genomic Suiteソフトウェア(バージョン6.08.0103)(Partek; St.Louis、MO)が、各遺伝子座のコピー数を決定し、コピー数の変化領域を定義するためのデータを低レベル処理するために使用された。すべてのSNPプローブに対するシグナルを含有するCELファイルが、ソフトウェアにローディングされ、コピー数が、腫瘍または細胞系の試料に対するシグナル強度を、基線2に対して補正された、正常な雌性組織試料90個の参照セットに対するシグナル強度と比較することによって計算された。参照セットは、同じマイクロアレイプラットフォームによって測定された、他の正常試料のセットまたは腫瘍試料と同じ患者からの対合正常組織からなってもよい。
(i)領域は少なくとも100個のプローブを含有しなければならない;
(ii)領域の平均コピー数と隣接するコピー数領域を比較したp値は0.00001未満でなければならない;
(iii)トランジションのシグナル/ノイズ比は0.1超でなければならない。
コピー数の変化領域は、これらの領域の平均コピー数が1.65未満である(欠失)または2.65超である(増加)場合に、0.01を下回るp値を伴って検出された。
腫瘍試料は、腫瘍細胞に存在するコピー数の変化のシグナルを弱める、相当な割合の正常細胞を含有する可能性がある。腫瘍試料と正常試料のコピー数のパターン間の差異を捕捉するための機械学習アルゴリズムが展開され、次いでさらなる分析から、正常物が混入した試料を同定し、排除するために使用された。最初に、コピー数の変化領域の数が最も多い試料のサブセットおよび正常試料のセットが選択された。これら2つの試料群は、パラメータを、腫瘍と正常試料との間の差異を最もよく表すように合わせることによって正常試料と腫瘍試料を分類するために、機械学習アルゴリズム(ランダムフォレスト:RF(Breiman、2001))を訓練するために使用された。次に、訓練された分類アルゴリズムは、残りの試料に適用され;分類子は、正常細胞が混入している試料の確率を表すスコアを各試料に割り当てた。正常細胞混入の確率スコアが50%を超える試料は、クラスタリング解析から除外された。
SNPマイクロアレイによって得られたコピー数のデータ密度は高く、相当量のノイズがあった。したがって、コピー数のデータは、ノイズ、次元およびクラスタリング解析の複雑さを縮小するために平滑化された。各試料における有意に増加または欠失した領域の検出後、隣接する領域は、それらの領域が同様のコピー数変化を有し、それらの領域の距離が500kb未満の場合、合併された。DNAセグメントが、データセット内のすべての試料からの区切り点の連結を使用することによって形成された。各セグメント内のプローブの平均コピー数が、さらなる分析に使用された。このステップにより、ハイスループット分析におけるDNAの増加および欠失の明確な解像が可能になった。
各データセットについて、本発明者らは、ピアソンの非類似性((1−r)/2で定義され、rはピアソン相関である)を用いて腫瘍および細胞系のCGHデータを階層クラスタリングした。階層クラスタリングパターンは、データセット内の予想されるサブグループの数の範囲を導くために、プロットされ、視覚的に検査された。次いで、これらの数は、ゲノム非負値行列因子分解を用いたクラスタリング解析において入力として使用された。
gNMFアルゴリズムが、ステップ5において決定された範囲のクラスター数を使用して腫瘍および細胞系のCGHデータを分類するために使用された。各クラスター数について、gNMFアルゴリズムが、我々が開発した停止基準を用いて200回実行された。次いで、分類モデルが、1引く(Hの相関行列の平均)に対する階層クラスタリングによって導かれた。
上記のgNMF手順は、最初の階層クラスタリング解析において選出された、いくつかの予想されるr値(サブグループの数)を用いて実行され、サブグループの数が異なるいくつかのモデルが構成された。次いで、ベイズ情報量規準(BIC)が、腫瘍および細胞系の試料の遺伝子パターンの分布を最もよく反映した最良モデルを選択するために使用された(サブグループの数および各試料のサブグループの1つへの割り当て)。
10倍安定性検定の手順が、分類結果の安定性を評価するために展開された。データセットに対してgNMFを実行し、腫瘍および細胞系の試料をサブグループに割り当てた後、10%の試料がランダムに除外され、同じ手順が残りの90%の試料に対して適用された。この並べ替えによって異なるサブグループに割り当てられた試料の数が計算された。この除外検定は、試料の並べ替えに関してクラスタリングの結果の安定性を表すエラー発生率を導くために、200回繰り返された。同じデータセットに対して同じ手順を用いた階層クラスタリングの安定性も評価され、常にgNMFクラスタリングよりもはるかに高いことが見出された。
ステップ1−2。139のMMの腫瘍および細胞系の試料のCGHデータが、実施例1および2に記載の通り処理された。全部で5616のコピー数が有意に変化したセグメントが検出された。
Claims (20)
- 悪性メラノーマゲノムサブグループのデータベースを得るための方法であって、
(a)少なくとも1つのMM細胞を含む、複数のm個の試料を得るステップ、
(b)ステップ(a)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含むデータセットを取得するステップ、
(c)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータをデータセットから削除すること、
を含む、データセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料をデータセットから削除するステップ、
(d)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もるステップ、
(e)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算するステップ、
(式中、Vijは行列Vのi行j列目であり、(WH)ijは行列(W*H)のi行j列目であり、iは1からnまでにわたり、nはデータセット内のセグメントの数であり、jは1からmまでにわたり、mはデータセット内の試料の数である。)
(2)ステップ(e)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止するステップ、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算するステップ、
(4)ステップ(e)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均するステップ、および
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(e)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってr個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットするステップ
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てるステップ、
(f)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定するステップ、および
(g)場合によって、ステップ(f)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価するステップ
を含む、前記悪性メラノーマゲノムサブグループのデータベースを得るための方法。 - MM腫瘍またはMM細胞系を分類する方法であって、
(a)
(i)少なくとも1つのMM腫瘍またはMM細胞系を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(v)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってr個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、および
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること
を含む方法によって開発されたデータベースを準備すること、
(b)MM細胞を含有すると疑われる試料を準備すること、
(c)ステップ(ii)からのものと同じ、少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第2のデータセットVsampleを取得すること、
(d)Vsampleからの試料を、Vsampleをステップ(i)−(vii)において決定されたクラスターと比較することによって分類すること
を含む、前記MM腫瘍またはMM細胞系を分類する方法。 - 教師なしクラスタリングアルゴリズムが階層クラスタリングである、請求項1または2に記載の方法。
- データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにコーフェン相関が使用される、請求項1または2に記載の方法。
- データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにベイズ情報量規準が使用される、請求項1または2に記載の方法。
- データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにコーフェン相関およびベイズ情報量規準が使用される、請求項1または2に記載の方法。
- 複数の試料(m個)が、第1、第2、第3、第4、第5、第6の細胞系であって、
ここで、
第1の細胞系は、SKMEL119、HS944、WM1366およびWM88からなる群から選択され、
第2の細胞系は、WM3248であり、
第3の細胞系は、1205LUであり、
第4の細胞系は、451LU、SKMEL19、SKMEL28、SKMEL30、SKMEL63、WM35、WM983およびWM983Cからなる群から選択され、
第5の細胞系は、WM3211、M14、MEWO、SKMEL2、SKMEL5、UACC257、UACC62、WM122、WM13662、WM239A、WM32112、WM32482、WM793Bおよび501MELからなる群から選択され、および
第6の細胞系は、MALME3MまたはWM882である前記細胞系
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 複数の試料(m個)が、SKMEL119、HS944、WM1366、WM88;WM3248;1205LU;451LU、SKMEL19、SKMEL28、SKMEL30、SKMEL63;WM35、WM983、WM983C、WM3211、M14、MEWO、SKMEL2、SKMEL5、UACC257、UACC62、WM122、WM13662、WM239A、WM32112、WM32482、WM793B、501MEL、MALME3MおよびWM882からなる、請求項1または2に記載の方法。
- (a)
(i)MM細胞を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて、正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)の(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
(5)データセット内の試料を、1引く(ステップ(v)の(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってr個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが各試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること、および
(viii)ステップ(vi)において選択された各クラスターから少なくとも1つのMM細胞を選択し、ゲノムサブグループによって定義されたパネルに構築すること
を含む方法で構築された、ゲノムサブグループによって分類されたMM細胞のパネルから、各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞系を選択すること、
(b)各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞を治療介入と接触させること、
(c)各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入の有効性をアッセイすること、
(d)治療介入を、各サブグループからの少なくとも1つのMM細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入の決定された有効性によって分類し、1つのサブグループからの少なくとも1つのMM細胞を抑えるまたは死滅させるが、別のサブグループからのMM細胞を抑えない、または死滅させないことにより、このサブグループのMM細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入の特異性が示されること、
を含む、悪性メラノーマ(MM)細胞を抑えるまたは死滅させるための治療介入を分類する方法。 - 教師なしクラスタリングアルゴリズムが階層クラスタリングである、請求項9に記載の方法。
- データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにコーフェン相関が使用される、請求項9に記載の方法。
- データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにベイズ情報量規準が使用される、請求項9に記載の方法。
- データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにコーフェン相関およびベイズ情報量規準が使用される、請求項9に記載の方法。
- MM細胞が細胞系からのものである、請求項9に記載の方法。
- 複数の試料(m個)が、第1、第2、第3、第4、第5、第6の細胞系であって、
ここで、
第1の細胞系は、SKMEL119、HS944、WM1366およびWM88からなる群から選択され、
第2の細胞系は、WM3248であり、
第3の細胞系は、1205LUであり、
第4の細胞系は、451LU、SKMEL19、SKMEL28、SKMEL30、SKMEL63、WM35、WM983およびWM983Cからなる群から選択され、
第5の細胞系は、WM3211、M14、MEWO、SKMEL2、SKMEL5、UACC257、UACC62、WM122、WM13662、WM239A、WM32112、WM32482、WM793Bおよび501MELからなる群から選択され、および
第6の細胞系は、MALME3MまたはWM882である前記細胞系
を含む、請求項9に記載の方法。 - 複数の試料(m個)が、SKMEL119、HS944、WM1366、WM88;WM3248;1205LU;451LU、SKMEL19、SKMEL28、SKMEL30、SKMEL63;WM35、WM983、WM983C、WM3211、M14、MEWO、SKMEL2、SKMEL5、UACC257、UACC62、WM122、WM13662、WM239A、WM32112、WM32482、WM793Bおよび501MEL、MALME3MおよびWM882からなる、請求項9に記載の方法。
- 治療介入が、化学療法、生体応答修飾物質、ワクチン免疫療法または生化学療法を含む、請求項9に記載の方法。
- 治療介入が生体応答修飾物質によるものであり、生体応答修飾物質が、インターフェロン、インターロイキン−2、モノクローナル抗体および腫瘍壊死因子アルファからなる群から選択される活性薬剤を含む少なくとも1つの医薬組成物を投与することを含む、請求項17に記載の方法。
- 生体応答修飾物質が2種以上の活性薬剤を投与することを含む、請求項18に記載の方法。
- (a)
(i)少なくとも1つのMM細胞を含む複数のm個の試料を得ること、
(ii)ステップ(i)において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも1つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含む第1のデータセットを取得すること、
(iii)
(1)腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
(2)機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、および
(3)正常細胞を含有する確率が50%以上であるとスコア化する各試料についてのデータを第1のデータセットから削除すること
を含む、第1のデータセットにおいて正常細胞が混入した試料を同定し、混入試料を第1のデータセットから削除すること、
(iv)データセット内のサブグループの数rを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
(v)データセット内の各試料を、
(1)乗法的更新を100ステップ行うごとに、次式を用いてアルゴリズムの発散を計算するステップ、
(2)ステップ(v)(1)において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の100ステップに対して計算された発散と比較して約0.001%超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
(3)アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、次式を用いてアルゴリズムの各実行に対してHのピアソン相関係数行列を計算すること、
(4)ステップ(v)(3)から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
(5)データセット内の腫瘍および細胞系を、1引く(ステップ(v)(4)において決定された平均相関行列)を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによって、r個のサブグループに割り当て、デンドログラムをr個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解(gNMF)アルゴリズムを用いて少なくとも1つのクラスターに割り当てること、
(vi)コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定すること、
(vii)場合によって、ステップ(vi)において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、10倍の安定性検定を用いて評価すること、および
(viii)ステップ(vi)において選択された各クラスターから少なくとも1つの試料を選択し、ゲノムサブグループによって定義されたパネルに構築すること
を含む、データベースを構築すること、
(b)ステップ(a)のデータベースを分析して各サブグループに対して特徴的なコピー数の異常を決定すること、および
(c)各サブグループについての決定された特徴的なコピー数の異常に基づいて、複数のプローブを設計し、各プローブをゲノムサブグループに割り当てること
を含む、試料からのMM細胞を分類するためのプローブパネルを構築する方法。
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