JP2001503276A

JP2001503276A - 乳癌の易罹病性の診断アッセイ

Info

Publication number: JP2001503276A
Application number: JP52188698A
Authority: JP
Inventors: ジュープ，エルダン、アー; タムスン，リンダ、エフ; レスタ，レジーナ; デロルコ，ラバト、ティー
Original assignee: オゥクラホゥマ、メディカル、リサーチ、ファウンデイシャン
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2001-03-13
Also published as: DE69704031T2; CA2269664A1; AU7002398A; WO1998020167A1; US6355427B1; CA2269664C; AU723400B2; ATE199025T1; DE69704031D1; EP0943017A1; EP0943017B1

Abstract

(57)【要約】女性が生涯で乳癌を発症する確率を、プロヒビチン遺伝子の3’ＵＴＲに見られる対立遺伝子の変異に基づいて決定することができるようになった。この確率は、3’ＵＴＲ配列の729位置に依存する、すなわちこの位置にチミン（T）またはシトシン（C）があるか或いはその両方があるかに依存する。729位置の多型性は、男性の遺伝性乳癌の易罹患性を示すものとしても開示される。種々の標準的な技術を用いてこの729位置の配列を決定することができる。好ましくは、この配列はＰＣＲによりこの領域を増幅してＲＦＬＰ分析にかけることにより決定される。

Description

【発明の詳細な説明】乳癌の易罹病性の診断アッセイ発明の技術分野本発明は、プロヒビチン遺伝子の3'非翻訳領域の配列に基づいて乳癌の易罹患性を決定するための診断アッセイに関する。発明の背景乳癌は、北米では女性の癌に関する死亡原因の第二位である。しかし、散発性の乳癌と家族性すなわち遺伝性乳癌とを区別しなければならない。現在、全ての乳癌のうちの約10％が強い家族性のものとして分類されており、これらのうちの多くは、遺伝性乳癌遺伝子ＢＲＣＡ1もしくはＢＲＣＡ2の突然変異により引き起こされるものと思われる。しかし、家族性のものと思われる乳癌のうちの少なくとも３分の１はＢＲＣＡ1もしくはＢＲＣＡ2とは関係がなく、このことは、（１以上の）他の遺伝性乳癌遺伝子の存在を示唆している。近年の研究により、活性なＢＲＣＡ1もしくはp53を含まなくても正常なヒト17番染色体の導入後に乳癌細胞中で癌抑制が観察されたことに基づき、乳癌の発症に重要なさらなる遺伝子が 17番染色体に位置する可能性が示唆された(Theileら、”Suppression of tumori genicity of breast cancercells by transfer of human chromosome 17 does n ot require transferred BRCA1 and p53 genes,”Oncogene 10:439-443(1995)) 。ラットの再生肝細胞に比べて正常に増殖する細胞中に優先的に発現するｍＲＮＡを富化するサブトラクションハイブリダイゼーションを用いて、抗増殖性遺伝子プロヒビチン(antiproliferative gene prohibitin)が発見された(McClungら、“Isolation of a cDNA that hybrid selects antiproliferative mRNA from rat liver,”Biochem Biophys Res Comm 164:1316-1322(1989)；Nuellら、“Pro hibition，an evolutionarily conserved intracellular protein that blocks DNA synthesis in normal fibroblasts and HeLacells,”Mol Cell Biol 11:137 2-1381(1991)を参照のこと)。17番染色体のq21位置にマップするヒトプロヒビチン遺伝子（Whiteら、“Assignment of the human prohibitin gene（PHB）to ch romosome 17 and identification of a DNA polymorphism,”Genomics 11:228-2 30(1991)）は、家族性および散発性の乳癌においてこの領域におけるヘテロ接合性が頻繁に欠損していることに基づき、家族性乳癌および子宮癌の癌抑制遺伝子座の第一候補遺伝子であった(Blackら、“A somatic cell hybrid map of the l ong arm of human chromosome 17,containing the familial breast cancer loc us(BRCA1),”Am J Hum Genet 52:702-710(1993);Nagaiら、“Detailed deletion mapping of chromosome segment 17q12-21 in sporadic breast tumors,”Gene s，Chromosome and Cancer 11:58-62(1994))。さらに、Satoらの“The human pr ohibitin gene located on chromosome 17q21 ismutated insporadic breastcan cer,”Cancer Res 52:1643-1646(1992)は、23の散発性ヒト乳癌の分析において、プロヒビチンエクソン４の高度保存領域における４つの突然変異について報告した。しかし、位置的なクローニングの研究は、17番染色体上の家族性乳癌遺伝子としてプロヒビチンではなくＢＲＣＡ1を同定する結果となった(Mikiら、“A strongc and idate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1,”Sence 266:66-71(1994))。家族性乳癌患者から精製したＤＮＡ由来のプロヒビチン遺伝子の従来研究は、これらの患者のいずれかが、プロヒビチンゲノムＤＮＡのタンパク質コード領域の生殖系列変化を保有したという証拠を提供しなかった。従って、家族性／遺伝性乳癌と、プロヒビチンのタンパク質コード領域における突然変異とは、無関係であると結論付けられていた(Takinoら、Internat'l J Oncol 3:769-772(1993)) 。さらに研究を続けても、家族性／遺伝性乳癌におけるプロヒビチンのタンパク質コード領域における体細胞突然変異を同定しなかった。このことは、該タンパク質コード領域が乳癌では頻繁に突然変異をおこさないことを示す(Satoら、Gen omics 17:762-764(1993))。 Jupeらによる従来研究は、散発性乳癌への易罹病性の増大についての診断検査を開示した。２つのプロヒビチン対立遺伝子（イントロン２および５に見られる配列の違いに基づいて“非Ｂ”および“Ｂ”で示される）についてヘテロ接合性である個体、または非Ｂ対立遺伝子についてホモ接合性である個体は、散発性癌を発症する危険性が低いことが報告された。癌を発症させる可能性は、Ｂ型対立遺伝子についてホモ接合性である個体、そしてまた、Ｂ型対立遺伝子の少なくとも１つの3’非翻訳領域（“3’ＵＴＲ”）において突然変異を有する個体で、増大する。Ｂ型対立遺伝子についてのホモ接合住および３'ＵＴＲにおける体細胞突然変異を示す乳癌由来細胞系および原発性乳癌についての分析が報告された。ＢＴ-20、ＭＣＦ7およびＳＫ-ＢＲ-3乳癌細胞系の完全長プロヒビチンｃＤＮＡを配列決定し、3’ＵＴＲに制限される突然変異を同定した。完全長プロヒビチン転写体を顕微注入法により導入すると、これら３つの細胞系は、細胞周期の進行中に休止した。また、これらの細胞は全てＢ-対立遺伝子についてホモ接合性であった。野生型プロヒビチン3’ＵＴＲの配列と比較して、ＢＴ-20では２つの点突然変異が同定された(つまり758位置でＧ(グアニン)からＡ(アデニン)へ、および814位置でＴ(チミン)からＣ(シトシン)へ)。また、ＭＣＦ7も２つの点突然変異を有していた(236位置でＧからＡへ、および729位置でＣからＴへ)。ＳＫ -ＢＲ-３は、729位置のＣからＴへの変化を含む26塩基の変化を示した。このように、ＭＣＦ7およびＳＫ-ＢＲ-3ではどちらも729位置がＣからＴに変化した。J upeら“Prohibitin in breastcancer cell lines:Loss of antiproliferative a ctivity is linked to 3'untranslated region mutations,”Cell Growth and D ifferentiation 7:871-878(1996)を参照のこと。今回、従来のプロヒビチン研究の教示に反し、729位置でのＣからＴへのこの変化は、体細胞突然変異の結果ではなく、むしろこの位置での天然の対立遺伝子の変異の結果であることが判明した。すなわちこの変化は、生殖系列多型性（ge rmline polymorphism）である。さらに、この変化は乳癌の易罹患性マーカー(su sceptibility marker)として使用することができる生殖系列多型性である。データは、729-Ｔについてのホモ接合性の頻度が、乳癌患者において罹患していない女性よりも約4〜5倍高いと思われること、乳癌全体の4％がホモ接合性Ｔ／Ｔ(罹患していない女性の1％未満で認められるようである)である女性に発症すること、およびこれらの女性が生涯において乳癌を発症する危険性が約50％であることを示す。従って、ＢＲＣＡ1遺伝子座近くの染色体17q21上に位置するプロヒビチン遺伝子が、乳癌の易罹患性マーカーとして使用することができる3’ＵＴＲ中の生殖系列多型性を示すこと判明した。図面の簡単な説明図１Ａおよび図１Ｂは、顕微解剖した（micro-dissected）患者の腫瘍から得た突然変異プロヒビチン3’ＵＴＲ配列の整列を表す。図は、3’ＵＴＲの3’末端に位置する頻繁に突然変異した140bpにわたるセンスＤＮＡ鎖を示し、ＤＮＡ鎖は図１Ａに示す初めの70塩基と図１Ｂに示す終わりの70塩基からなる。729位置のみが異なる２つの野生型（ＷＴ）対立遺伝子の配列が一番上に示されている。７人の異なる患者（ＴＮ-Ｘ）の乳癌（Ｔ）由来の突然変異配列と、近傍の正常（Ｎ）組織由来の配列を整列させている。これらの近傍の正常配列は、729位置を除き全く同じであった。この位置は、ＣまたはＴ（Ｃ/Ｔ）のいずれかを含んでいた。著しく突然変異した乳癌細胞系SK-BR-3由来の配列が、図の中央に示されている。小文字は野生型配列に対する塩基の変化を示す。さらに挿入も小文字で示し、欠失はダッシュで示している。ＵＴＲ-729の変異塩基は、影付きのボックスで囲み、６塩基AfTIII認識部位はこれより大きなボックスで囲んである。図２は、野生型プロヒビチン3'ＵＴＲの5'-3'センス配列、および遺伝子型決定（genotyping）用のAfTIII制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイに使用し得るプライマー（下線）の位置を示す。このアッセイは、ＰＣＲ増幅に使用される一次プライマーセットＰ１/Ｐ２を用いて２つのステップで行われる。次に、一次ＰＣＲ反応生成物を2.5％アガロースゲルにかけ、852bpバンドを切り出して精製する。プライマーセットＰ3/Ｐ2またはＰ4/Ｐ2のどちらかを用いたＰＣＲのテンプレートとして852bp断片を使用し、サブ断片を生成する。このサブ断片を、マイクロスピンカラム(microspin columns；Pharmacia)で精製し、AfTIIIで消化する。プライマーＰ1、Ｐ３およびＰ４は全てセンスプライマーである。プライマーＰ２は、その配列が5'-ＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＴＴ-3'（配列番号：19）であるアンチセンスプライマーである。図３は、プロヒビチン遺伝子の5'-3'センス配列を示す。この配列は、イントロン６中で始まり、エクソン７のタンパク質コード領域を含み、3'ＵＴＲの最後まで続く。プライマーＰ１’（配列番号:23）（順方向）およびＰ２（配列番号：19 ）（逆方向）を使用して、AfTIIIのRFLP遺伝子聖決定アッセイに使用するためのＰＣＲ断片を合成する。合成した1237bp断片（図３の93位置から1328位置まで）をAfTIIIで消化し、遺伝子型を決定する。記号“^*”は852bp 3Ｕ'ＴＲコード配列の開始を示し（図２）、配列の右側の数字は852bp 3Ｕ'ＴＲコード配列の塩基数を示す。記号“++++++”は、構成的AfTIII部位の位置を示し、記号“^******” は多型部位の位置を示す。該部位がＡＴＧＴＧＴであるとき、AfTIIIによる切断は失われる。ＣからＴへの多型性は、852bp ＵＴＲの729位置（図２）、およびこの配列の1205位置（図３）で起こる。また、この図には、実施例１で記載されるようなサザンブロット実験で使用する442bpプローブを合成するために使用する順方向P3'プライマー（配列番号：25）および逆方向P4'プライマー（配列番号：26）も示されている。図４は、図３で記載したようなＰＣＲアッセイで得られた制限断片長多型分析（RFLP）の診断パターンを示す。図示された遺伝子型は、1-C/C；2-C/T；3-T/T である。観察した断片の大きさを図の左側に示す。671bp断片は、全ての遺伝子型に共通している。また、566bpおよび442bp断片で示されたパターンは、442bp プローブを用いるゲノムサザンブロットでも観察される。発明の詳細な説明対照と乳癌症例の間でのプロヒビチン3'ＵＴＲの(本出願の図２に定義したような)729位置におけるC/C、C/T、およびT/T生殖系列遺伝子型の頻度に基づき、個体が生涯に乳癌を発症する可能性を示す易罹患性を測定する簡単な試験を開発した。米国における女性の乳癌発症の全確率が12.5％であるとして、Bayes Theo remを、72人の乳癌患者および92人の罹患していない女性について測定した遺伝子型頻度（genotyplc frequencies）に適用した（表１）。これにより得られた、特定の遺伝子型を有する女性が一生のうちに乳癌を発症する確率｛確率＝[(所与の遺伝子型を有する乳癌患者の頻度)×(女性の乳癌を発症する全確率、すなわち0.125)]÷(所与の遺伝子型を有する罹患していない女性の頻度)×100}は、C/C 、10％；C/T、17％；およびT/T、約50％である。この算出されたパーセンテージは、サンプリングした人口の大きさにより異なるであろうが、開示したパーセンテージは危険性についての有効なガイドを提供するものと期待される。ある女性の乳癌を発症する可能性を測定するためには、その女性の生殖系列プロヒビチンの3'ＵＴＲの729位置に関する遺伝子型を測定するだけでよい。つまり、その女性が729位置においてホモ接合性チミン（T/T）であるか、ホモ接合性シトシン（C/C）であるか、あるいはヘテロ接合性（C/T）であるか、である。72 9位置にある個体の遺伝子型を測定するために、標準的な技法を用いて患者サンプルの野生型変種からゲノムＤＮＡを単離することができる。好ましくは、ゲノムＤＮＡは、実施例１に記載されたような血液または頬細胞標本（smear）から単離する。ゲノムＤＮＡを調製したあと、プロヒビチン3'ＵＴＲの塩基729を含む領域を増幅してもよく、あるいはゲノムＤＮＡを直接消化してもよい(実施例１)。ゲノムＤＮＡの調製と同様、これも、種々の一般的な技法により行うことができる。好ましくは、この領域は、実施例１に記載されたように、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）技法により増幅される。好ましくは、ＰＣＲ増輻に続いて、実施例１で記載するような制限断片長多型（“RFLP”）分析を行う。この分析は、3'ＵＴＲ中の729位置のＣがＴに置換されることにより、729位置にかかるその６塩基認識部位で制限エンドヌクレアーゼAfTIIIにより切断される可能性が失われるという事実に基づく。あるいは、ＰＣＲにより増幅した配列の729位置を、例えば、AmpliCycle^TMPCR キット（パーキンエルマー社）またはサザンブロットを用いて直接配列決定するなど、配列の種類を識別するためのあらゆる他の手段により測定することができる。特定の遺伝子型が乳癌を生じる可能性（すなわち確率）は前記のとおりである。729位置でＣ-対立遺伝子についてホモ接合性（C/C）である女性の場合、乳癌を発症する確率は10％であり、ヘテロ接合性（C/T）である女性の場合はこの確率は17％であり、Ｔ-対立遺伝子についてホモ接合性（T/T）である女性が一生涯で乳癌を発症する確率は、約50％である。これらの確率は、表１に示した92人の対照女性および72人の乳癌患者の生殖系列プロヒビチンの遺伝子型に基づいている。 729位置に関する女性の遺伝子型を正確に測定することができれば、種々の有効な目的を果たせる。第一に、そして主に、先に記載したように、これにより、女性が一生のうちに乳癌を発症する確率を測定することができるような手段が提供される。発症の危険性が高いと診断された女性の場合、より頻繁に検査をすることにより発症の危険性が高いという認識を高めることで、癌の早期発見につながり、生き残る可能性が高くなる。これは、乳癌の発症について一般にまだスクリーニングが行われない新生児から40歳までの女性に対して特に有用である。またこのアッセイは、遺伝的カウンセリングにも使用できる。両親がどちらもこのＴ-対立遺伝子についてホモ接合性である場合、T/T遺伝子型を有する子供が生まれる確率は100％である。これに対し、両親がどちらもＣ-対立遺伝子についてホモ接合性である場合、T/T遺伝子型を有する子供が生まれる確率は０％である。片方の親のみがこのＴ対立遺伝子についてホモ接合性である場合、あるいは親の片方または両方が729位置でヘテロ接合性（C/T）である場合、T/T遺伝子型を有する子供が生まれる確率は、これら両極端の間のどこかであり、古典的なメンデルの遺伝学に従って決定することができる。彼らの遺伝子型に基づいて、子供の両親は、その子供の遺伝子型を新生見のときに、または出生前でも、測定することができる。つぎに、この情報を上記のように使用して、早期検出および治療を行うようにするための最適な検査スケジュールを決定することができる。またこのアッセイは、乳癌の予後、罹患していない期間の予想、長期生存、および男女両方のための療法を決定するために、使用することもできる。ＵＴＲ-729でのプロヒビチン多型の測定７名の個人患者に対して徹底的な突然変異分析をまず行った。この中で、分析した腫瘍の全てを、組織病理学により侵入性（invasive）腺管癌として診断した。クロス混入（cross contamination）を避けるために、これらの分析は顕微解剖によりヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片から別々に単離した腫瘍組織および正常な隣接組織について行った。我々が行った乳癌細胞系および他の癌細胞系におけるプロヒビチン3'ＵＴＲの未公表研究は、最後の200塩基がプロヒビチンの抗増殖活性を含み、且つ最も大きく突然変異したことを示した。従って、3'ＵＴＲの最後の140bpのみを検査した。ＰＣＲ増幅生成物をTAクローニングベクターにクローン化し、少なくとも腫瘍からの２つのクローンおよび正常な隣接組織からの２つのクローンを各患者から配列決定した。図１Ａおよび図１Ｂは、これら７つの腫瘍配列[ＴＮ-56(Ｔ)、配列番号：２；ＴＮ-78(Ｔ)、配列番号：４；ＴＮ-50(Ｔ)、配列番号；６；ＴＮ-1(Ｔ)、配列番号；９；ＴＮ-3(Ｔ )、配列番号：11；ＴＮ-31(Ｔ)、配列番号13；およびＴＮ-94(Ｔ)、配列番号：1 5]および正常な隣接組織[ＴＮ-56(Ｎ)、配列番号：３；ＴＮ-78(Ｎ)、配列番号：５；ＴＮ-50(Ｎ)、配列番号：７；ＴＮ-1(Ｎ)、配列番号：10、ＴＮ-3(Ｎ)、配列番号：12；ＴＮ-31(Ｎ)、配列番号：14；およびＴＮ-94(Ｎ)、配列番号：16 ]を、野生型プロヒビチン3'ＵＴＲ(ＷＴ)（配列番号：1）および野生型プロヒビチン3'ＵＴＲの3'末端近傍の140bp領域（配列番号17）中の大きく突然変異した乳癌細胞系SK-BR-3（配列番号：8）配列と比較した、整列を示す。最も頻繁に且つ一様にのみ変化した部位は、全ての腫瘍においてチミン（Ｔ）に変化した729位置のシトシン（Ｃ）であった。また、各患者由来の隣接する正常組織由来の３’ＵＴＲ配列も、図１Ａおよび図１Ｂの腫瘍配列のすぐ下に示されている。この分析は、３’ＵＴＲの729位置でヘテロ接合性を示す以外は、正常組織全てが野生型であることを示した。乳癌に隣接する７つの正常組織検体のうち７個がプロヒビチン３’ＵＴＲの72 9位置でヘテロ接合性（C/T）を示したという知見は予期せぬものであり、この時点以前までは、“Ｃ”のみが正常組織中または正常組織由来の細胞系中のこの位置で見い出されていた。つぎに、Ｔが腫瘍発生の原因の少なくとも一部となるが同時にまたクローンまたはフィールド影響を示す従来の正常な隣接組織においても見られる“イニシエーター”突然変異であるか、あるいは、Ｔが正常集団に存在する生殖系列対立遺伝子変異体（多型）を表すか、を測定するために、さらに研究を行なった。これら２つの可能性を見分けるために、乳癌患者および対照個体の腫瘍から取り出した生殖系列組織において729位置にチミンがあるかを測定する検査を行った。つまり、３’ＵＴＲの729位置（ＵＴＲ-729）におけるＴ対Ｃの頻度を、これらの２つのグループに由来する生殖系列遺伝子型（血液サンプルおよび/または頬から掻き出した細胞(buccal cell scrapes)）を表す組織において測定した。シトシン（Ｃ）が野生型配列で存在する場合、ＵＴＲ-729を含む領域が制限酵素AfTIIIにより切断される。この切断部位は、チミン（Ｔ）が存在すると失われる。患者サンプルから配列決定を行うと、AfTIII認識部位（図１Ａおよび図１Ｂ）内でこの単一変化のみを同定した。AfTIII RFLP分析において、92人の健康な女性ボランティアのうち70％がホモ接合性C/C、29％がヘテロ接合性C/Tおよび1. 1％がホモ接合性T/Tであった(表１)。表１．対照および乳癌患者における３’ＵＴＲ変異体の遺伝子型および対立遺伝子の頻度これは、４％がT/T、39％がC/Tおよび57％がC/Cであった72人の乳癌患者の場合と対称的である(Ｘ²=3.672およびｐ＜0.159)。表１のデータが一般人口の患者および対照の遺伝子型頻度を正確に反映し、生涯における乳癌発症の危険率が12.5 ％であるものと仮定すると、Baye's Theorem(Fleiss，J.,StatisticalMethods f or Rates and Proportions，2nd ed.，John Wiley & Sons，New York,1981，pp ．1-17)を使用して、特定の遺伝子型を有する女性がその生涯の間に乳癌を発症する確率を計算することができる。これらの確率は、C/Cでは10％、C/Tでは17％、およびT/Tでは約50％である。さらに、全ての乳癌患者のうち４％がT/Tであれば、将来的に乳癌になるであろう女性の４％は、この単純検査により同定することができる。対照および患者の平均年齢±標準偏差は、それぞれ40±12.9歳および55±11.5 歳であった。患者および対照の大多数（95％）は、オクラホマ州在住の白人女性である。また、潜在的な乳癌の相対危険度についても、確率（odds ratio;ＯＲ）で調べた。C/Tを有する被験者およびT/Tを有する被験者（すなわちＴ保持者）を組み合わせた確率を、ＯＲ_T=[(C/Tを有する乳癌患者の人数+T/Tを有する乳癌患者の人数）÷（C/Cを有する乳癌患者の人数）]÷[（C/Tを有する罹患していない被験者の人数+Ｔ/Ｔを有する罹患していない被験者の入数）÷（C/Cを有する罹患していない被験者の人数）]として計算した。T/Tを有する被験者すなわちホモ接合性Ｔの確率を、ＯＲ_T/T=[（T/Tを有する乳癌患者の人数）÷（C/Cを有する乳癌患者の人数+C/Tを有する乳癌患者の人数）]÷[（T/Tを有する罹患していない被験者の人数）÷（C/Cを有する罹患していない被験者の人数+C/Tを有する罹患していない被験者の人数）]として計算した。C/TまたはT/Tを有する被験者を組み合わせた後に計算したこの確率は、約1.7である。C/TとC/Cを組み合わせてT/Tを分けて考えた場合、この確率は約4.0である。ここでも、計算した確率はサンプルした人口のサイズによって異なり得るが、ここに開示した確率が危険率についての有用なガイドを提供するものと期待される。ＵＴＲ-729における多型と癌との関連性アメリカ合衆国では、女性がその生涯の間に乳癌を発症する危険性は８分の１（12.5％）であり、乳癌により死亡する危険性は28分の1(3.6％)である(Boring ら、“Cancer statistics,”CA Cancer J Clin 44:7-26(1994))。乳癌全体の約1 0％は、現在のところ家族性として分類されており、その大部分は、染色体17q21 上のＢＲＣＡ1遺伝子(Hallら、“Linkage of early onset familial breast can cer to chromosome 17q21,”Science 250:1684-1689(1990))、または染色体13q1 2-13上のＢＲＣＡ2遺伝子(Woosterら、“Localization of a breast cancer sus ceptibility gene，ＢＲＣＡ2,to chromosome 13q12-13,”Science 265:2088-20 90(1994))における生殖系列の突然変異により引き起こされると考えられる。しかし、乳癌の大半は、散発性であると考えられる。もともと、これらの散発性癌の多くもまた家族性乳癌遺伝子における体細胞突然変異によって引き起こされるものとして考えられていた。これは、真実ではないことが判明した。散発性乳癌では、あるとしてもＢＲＣＡ1の僅かな体細胞突然変異しか発見されなかった(Merajverら、“So matic mutations in the BRCA1 gene in sporadic ovarian tumours,”Nat Gene t 9:439-443(1995);Hoskingら、“A somatic BRCA1 mutation in anovarian tum our,”Nat Genet 9:343-344(1995)；およびFutrealら、“BRCA1mutations in pr imary breast and ovarian carcinomas,”Science 266:120-122(1994))。他の研究でば、70人中１人のみ(Lancasterら、“BRCA2 mutationsin primary breast a nd ovarian cancers,”Nat Genet 13:238-240(1996))、および乳癌患者100人中１人のみが、ＢＲＣＡ２において体細胞の突然変異を有していた(Mikiら、“Mut ation analysis in the BRCA2 gene in primary breast cancers,”Nat Genet 1 3:245-247(1996));Tengら、“Low incidence of BRCA2 mutations in breast ca rcinoma and other cancers,”Nat Genet 13:241-244(1996))。従って、これらの遺伝子座における突然変異は、散発性乳癌の大多数において重要ではないと思われる。表１は、729-T多型を有する生殖系列プロヒビチン対立遺伝子を１つでも有する女性が、729-Cについてホモ接合性である女性に比べて乳癌の危険性が約2.0倍高いことを示す(17％対10％)。さらに、Bayes'Theoremは、729-Tでホモ接合性である女性がその生涯の中で乳癌を発症する危険性は50％であると予言している。表１のデータが乳癌全体を代表するものであれば、全人口の１％未満を示すとしても、乳癌患者の約４％がT/T女性において発症するであろう。したがって、この多型性について一般人口で女性をスクリーニングすることにより、将来的に乳癌になる危険性が平均よりはるかに高い全女性のうち最大１％までを同定することが可能であろう。同様に、ホモ接合性C/Cの女性（全人口の70％）に、彼女達の生涯における乳癌発症の確率は約10％である或いは平均危険率より僅かに低いだけであると告げることができる。さらに、729-T多型は遺伝し、このことは、以前散発性であると考えられていた乳癌の実質的なサブセット（すなわちC/TおよびT/T女性つまり全体の43％において発症する乳癌）が、遺伝的な要素を有することを示す。一般人口のC/C、C/TおよびT/T個体の相対比率（表１）から、多くのホモ接合性T/T女性は、ヘテロ接合性C/Tの両親を有することが推測される。この場合、乳癌のT/T女性にT/Tを有する親族がいる確率は、４分の１である。これは、乳癌に罹患した一親等の親族がいる女性の正確な乳癌発症危険率である(Boringら、CA Cancer J Clin 44:7-26(1994))。実施例１：診断アッセイ法プロヒビチン遺伝子の3’ＵＴＲの配列に基づいた乳癌の易罹患性を測定するための診断アッセイについて、以下に記載する。サンプルの採集抗凝血物質を含む試験管の中に日常的静脈注射により血液サンプル（約10ml）を採集した。無菌細胞学ブラシ(H-Histobrush,174-600型;Spectrum Laboratories，テキサス州ダラス)を用いて頬細胞標本を採集した。研究参加者には、内頬の各側で30 秒間ブラシをくるくる回すように指示した。次にブラシを無菌採集試験管に挿入し、キャップをきつく閉めて、ＤＮＡテンプレートを調製する前に4℃で保存した。ＤＮＡ調製血液サンプル由来ＤＮＡを、PureGeneキット（Gentra、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて調製した。頬細胞標本由来ＤＮＡを、Horriganらにより“Polymerase chain reaction-ba sed diagnosis of Del(5g)in acute myeloid leukemia and myelody splastic s yndrome identifies a minimal deletion interval,”Blood 88:2665-2670(1996 )（もともとRichardsらにより公表された方法“Multiplex PCR amplification f rom the CFTR gene using DNA prepared from buccal brushed/swabs,”Hum Mol Genet 2:159-160(1993)の改変である）に記載された方法を用いて単離した。50 mM無菌NaOH（0.6ml）を含む1.5ml試験管に細胞学ブラシを移した。ブラシのとってをクリップし、ふたを閉めた。30秒間激しく撹拌した（vortexing）あと、５分間で95℃までサンプルを加熱した。再び試験管を激しく攪拌し、ブラシの水気をきり、試験管から除去する前に残留液を回収した。1mM Tris，pH＝8.0（0.06m l）を加えて溶液を中和した。完全に混合したあと、サンプルを-20℃で保存した。また、皮膚、毛嚢および実質的に他のあらゆる組織源から、および線維芽細胞やリンパ芽球細胞系から精製した高分子量ＤＮＡについても、この分析を行うことができる。この場合、PureGeneキット（Gentra、モンタナ州ミネアポリス）または他の類似の方法を用いて、その製造会社の指示に従って、ＤＮＡを調製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応 Taq Goldポリメラーゼ（パーキンエルマー社、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、血液から生成したゲノムＤＮＡ（0.1μｇ）または頬標本抽出物（0.010ml）について、ＰＣＲ反応を行った。使用した反応条件は、以下の通リである：10mM Tris-HCl,pH=8.0,50mM KCl,1.5mM MgCl,100-200μＭ、各dA TP、dGTP、dTTPおよびdCTP、0.1％Triton X-100,0.5-1.0 units Taq Goldポリメラーゼ、および各プライマー（100ng）からなる反応混合物（50-μl）。アッセイの１つの形態において、図２および配列番号17に示されるように、プライマー5'-ＣＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧ-3'(プライマーP1，センス)（配列番号：20）およびプライマーP2（配列番号：19）を用いて合成された852bp 3' ＵＴＲをゲル精製し、プライマー5'-ＴＧＡＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣ-3'(プライマーP3、センス)（配列番号：18）および5'-ＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＴＴ-3'(プライマーP2、アンチセンス)（配列番号：19）を用いて二次ＰＣＲ産物を合成した。制限断片長多型分析緩衝液およびその製造会社（New England Biolabs、マサチューセッツ州ケンブリッジ）により推奨される条件を用いて制限酵素AfTIIIでＰＣＲ産物を消化した。希釈マスターミックスを用いて、個々のサンプルからなる１つのグループ全てに対して消化を行った。確認した配列を有する対照を、各消化シリーズに含めた。消化産物を電気泳動法により20％アクリルアミドゲルで分離し、臭化エチジウムで染色して紫外線で可視化した。このほかに、PureGeneキットを用いて精製した高分子量ＤＮＡを、サザンブロットにより制限断片長多型性について分析した。一般に、ＤＮＡ10〜15μｇを、 37℃で16時間、制限酵素AfTIII（New England Biolabs）で消化した(この製造会社の供給する緩衝液を使用)。1/10容の3M酢酸ナトリウムおよび２容の無水エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させることにより、消化を終了させた。水中に再懸濁し、ローディング染料（Promega 6X）を加えたあと、サンプルを1％アガロースゲルにロードし、ブロモフェノールブルーローディング染料がゲルの底に達するまで、電気泳動を行った。次に、ゲルを、0.5M NaOH/1.5M NaCl中で3 0分変性させたあと、0.5M Tris/1.5M NaCl(pH=7.0)中で中和させた。つぎに、キャピラリーによりHybond膜に移してサザンブロットを行った（Amersham、イリノイ州アーリントンヘイツ)。80℃で焼成するかまたは紫外線で架橋して、この膜にＤＮＡを固定させた。プロヒビチン3'ＵＴＲを含む核酸断片を用いてプローブすることにより、ＲＦＬＰを検出した。一貫して使用したプローブは、多型AfTIII切断部位のすぐ5' 側にある442bp核酸断片であった。これは、テンプレートとして全長3'ＵＴＲクローン、ならびにプライマーP3'およびP4'を用いたＰＣＲにより合成した(図３) 。ランダムプライマー標識キット（ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いてプローブを標識した。65℃で少なくとも12時間、膜をハイブリダイズし、これと同じ温度で高いストリンジェンシー下で洗浄した。次にフィルターをＸ線フィルムまたはホスホイメージャー（phosphoimager）スクリーンに露出し、解釈のためにＲＦＬＰを表示した。或いは、多型AfTIII部位の3'端側にある124bp断片、ならびにP3'およびP2プライマーを用いて合成した566bp断片（図３）をプローブとして用いても良い。これらのプローブのいずれも、異なる遺伝子型を識別するＲＦＬＰを表示する。442bpプローブを用いてプローブしたサザンブロットは、566bpおよび442bpの染色体バンドパターン（図４に図示）を表した。３’ＵＴＲの729位置におけるＣからＴへの置換（図２）により、その６塩基認識配列におけるAfTIIIによる切断性が失われる。突然変異した乳癌(7)、乳癌細胞系(3)、およびホモ接合性Ｔ乳癌患者から得た頬細胞掻き取り標本（7）を分析すると、729位置におけるＣからＴへの置換は認識部位における唯一の変化であることを示し、これまでのところ、AfTIII断の喪失の原因であると検出された。ホモ接合性Ｃ個体は、多型部位において対立遺伝子両方の切断を有するが、ホモ接合性Ｔ個体の対立遺伝子は切断しない。ホモ接合性個体は、それぞれＣおよびＴからなる１つの対立遺伝子を有する。実施例２：代替診断アッセイ方法二次ＰＣＲ産物がセンスプライマーP4、5'-ＧＧＡＴＧＧＡＣＴＴＧＴＡＴＡＧ-3'（配列番号：21）およびアンチセンスプライマー５'-ＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＴＴ-3'(プライマーP2、アンチセンス)（配列番号：19）を用いて合成されたことを除き、実施例１に記載したように代替アッセイを行った。実施例３：代替診断アッセイ方法図３および配列番号：22に挙げた1237bpゲノム配列に示されるように、使用したプライマーが5'-ＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧ-3'(プライマーP1'、センス)（配列番号：23）および5'-ＧＧＡＡＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＴＴ-3'(プライマーP2、アンチセンス)（配列番号：19）であったことを除き、実施例１に記載したように代替アッセイを行った。配列番号：22を用いたこのアッセイでは、1205位置の塩基は配列番号：17の729位置に対応する。図４は、各遺伝子型についてのこのアッセイで生じたバンドパターンを示す。センスプライマー配列番号：23およびアンチセンスプライマー配列番号：19を用いて、ホモ接合性Ｃ個体（C/C）のＲＦＬＰパターンは、両ＤＮＡ鎖について、構成的AfTIII部位から3'ＵＴＲの終わりまで測定された566bpが、729/1205位置で切断されて２つの別々のバンド442bpおよび124bpに分かれたことを示す。ホモ接合性Ｔ個体（T/T）は、構成的AfTIII部位から3’ＵＴＲの終わりまで測定された566bpからなる１つのバンド（これば両ＤＮＡ鎖上の729/1205位置で切断されていない）を生成した。ヘテロ接合性個体（C/T）は３つの異なるバンドを生成し、このことは、一方のＤＮＡ鎖で、構成的AfTIII部位から3’ＵＴＲの終わりまで測定された566bpが729/1205位置で切断されて442bpおよび124bpからなる２つの異なるバンドに分かれ、他方のＤＮＡ鎖では、構成的AfTIII部位から3’ＵＴＲの終わりまで測定された566bpからなる１つのバンドが729/1205位置で切断されなかったことを示す。このアッセイでは、全ての遺伝子型に共通するバンドは、ＰＣＲ生成物の5'端側から構成的切断部位まで測定された671bp 断片である。この方法は、サザンブロットの結果に100％相関することを示す単一ステッププロセスである。実施例４−代替アプローチこのアッセイの予測値は、プロヒビチン3'ＵＴＲ中の729位置にある個体の生殖系列遺伝子型を決定することを含む。この測定を達成するために使用することができる可能性がある幾つもの具体的な方法がある。我々は、実施例１に記載したＲＦＬＰおよびＤＮＡ配列決定を主に使用して、データを収集した。しかし、単一塩基オリゴヌクレオチドのミスマッチのスクリーニングに基づく他の方法 (Jupe，E.R．およびZimmer，E.A.の“Assaying differential ribosomal ＲＮＡ gene expression with allele-specific oligonucleotide probes,”In Method s in Enzymology-Molecular Evolution:Producing the Biochemical Data,Acade mic Press，pp．541-552，1993)、対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅(AllenらのBitTe chniques 19:454(1995)、Ault，G.のJ Virological Nethods 946:145-156(1994) 、Tada,M.のCancer Research 53:2472-2474(1993)、HuangのNucleic Acids Rese arch 20:4567-4573(1992)、SommerのBio Techniques 12:82-87(1992)、およびKw okのNucleic Acids Research 18:999-1005(1990))、または、高特異性熱安定性リガーゼを用いた方法(Ampligase，Epicenter Technologies)を、多型性検出に適用することができる。さらに、現在使用されているあらゆる方法(例えば一本鎖コンホメーション多型性または変性勾配ゲル電気泳動法など)、あるいは単一塩基の変化を検出するために将来開発されるようなあらゆる方法も、これらの遺伝子型の検出に適用することができる。また、このテストはＲＮＡで開始して行うこともできる。この場合、ＲＮＡは、配列決定または逆転写酵素(Castlesら、 BioTechniques 21:425-428(1996))を用いたｃＤＮＡへの変換を行ったあと、ＰＣＲおよび単一塩基変化の検出が可能なあらゆる方法を行うことにより直接分析することができる。実施例５：男性の遺伝性乳癌の診断アッセイプロヒビチン3’ＵＴＲにおける729位置でのC/T多型性は、男性の乳癌の易罹患性を診断するのにも有用である。乳癌と診断された男性患者から単離したゲノムＤＮＡの一部を実施例３に記載したアッセイに従って調べた。この患者の遺伝子型はT/Tと同定された。これは、乳癌の危険性が高いことに相当する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レスタ，レジーナアメリカ合衆国ニューヨーク州12159、リンガスランズ、ミドルセックス・ドライヴ 45番 (72)発明者デロルコ，ラバト、ティーアメリカ合衆国メリランド州20855、ダーウッド、ニードウッド・ロウド 8030番アパートマント101

Claims

【特許請求の範囲】 1. 遺伝性乳癌の危険性を測定するための方法であって、 a．患者の細胞サンプルから得たゲノムＤＮＡの一部分の塩基の同一性を決定するステップであって、ここで前記ゲノムＤＮＡが3'非翻訳領域を含むプロヒビチン遺伝子を含み、前記部分は前記3'非翻訳領域中の前記プロヒビチン遺伝子の配列番号：17に定義されるような729位置に対応する、前記ステップ、および b．遺伝性乳癌の危険性と前記塩基同一性とを相関させるステップ、を含む方法。 2. 729位置の塩基同一性が、前記729位置を含む前記プロヒビチン遺伝子の3'非翻訳領域の前記部分の一部を配列決定することにより決定される、請求項1 に記載の方法。 3. 前記729位置の塩基同一性が、3'非翻訳領域の前記部分とＣ-対立遺伝子プロヒビチンとの間の単一塩基のマッチまたはミスマッチを検出することによリ決定される、請求項１に記載の方法。 4. 729位置の塩基同一性を、前記729位置の塩基同一性を決定するのに適した制限エンドヌクレアーゼで前記プロヒビチン遺伝子の3'非翻訳領域の前記部分を消化することにより決定する、請求項１に記載の方法。 5. 前記制限エンドヌクレアーゼがAfTIIIであり、これによって、729位置がシトシンであるときAfTIIIにより影響を受ける切断部位が存在すると決定される、請求項４に記載の方法。 6. a．3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖の前記消化部分を分離するステップ、 b．前記消化し分離した3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖を膜に固定するステップ、 c．前記消化し分離した3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖を少なくとも１つの標識核酸プローブとハイブリダイズするステップであって、ここで前記標識核酸プローブは、前記消化分離し固定した3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖に相補的に結合することができ、且つ前記729位置で切断が起こったかどうかを確定することができる、前記ステップ、および d．前記標識核酸プローブが前記消化分離し固定した3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖に結合したかを検出するステップであって、ここで前記消化分離し固定した 3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖に結合した前記標識核酸プローブが前記729位置での切断が生じなかったことを示す場合、前記患者が遺伝性乳癌の危険性がある、前記ステップ、をさらに含む、請求項５に記載の方法。 7. 前記患者の細胞サンプルから得たＲＮＡ画分を検査することにより前記塩基同一性を決定し、これにより前記729位置の前記ゲノムＤＮＡの同一性を決定することができる、請求項１に記載の方法。 8. 前記729位置の塩基同一性がチミンについてホモ接合性であるときに、生涯で乳癌を発症する危険性が罹患していない関連人口の危険性よりも高いと評価する、請求項１に記載の方法。 9. 前記729位置の塩基同一性がヘテロ接合性シトシン/チミンであるときに、生涯で乳癌を発症する危険性が罹患していない関連人口の危険性よりも高いがチミンについてホモ接合性である個体の危険性よりは低いと評価する、請求項１に記載の方法。 10．前記729位置の塩基同一性がホモ接合性シトシンであるときに、生涯で乳癌を発症する危険性が罹患していない関連人口の危険性より低いかまたはそれと同等であると評価する、請求項１に記載の方法。 11．ヒト患者の遺伝性乳癌の危険性を決定するための方法であって、 a．患者の細胞サンプルから得た二本鎖ゲノムＤＮＡの一部分を単離するステップであって、ここで前記ゲノムＤＮＡが3'非翻訳領域を含むプロヒビチン遺伝子を含む、前記ステップ、 b．第一反応区域において前記二本鎖ゲノムＤＮＡを第１本鎖ゲノムＤＮＡおよび第２一本鎖ゲノムＤＮＡに分離するステップ、 c．前記反応区域にセンスプライマーを提供するステップであって、ここで前記反応区域が前記第１一本鎖ゲノムＤＮＡと前記センスプライマーとの間のハイブリダイゼーションに好ましい条件を有する、前記ステップ、 d．同時に前記反応区域にアンチセンスプライマーを提供するステップであって、ここで前記反応区域が前記第２一本鎖ゲノムＤＮＡと前記アンチセンスプライマーとの間のハイブリダイゼーションに好ましい条件を有する、前記ステップ、 e．ポリメラーゼ連鎖反応法により二本鎖ゲノムＤＮＡの前記部分の複数コピーを作製して合成二本鎖ＤＮＡを形成するステップ、 f．前記3'非翻訳領域ＤＮＡ鎖について配列番号：17により定義される729位置の塩基同一性を決定するステップ、および g．前記塩基同一性を遺伝性乳癌の危険性と相関させるステップであって、ここで前記729位置がホモ接合性Ｃ/Ｃである前記患者が最も低い危険性、ヘテロ接合性Ｃ/Ｔである患者が中程度の危険性、およびホモ接合性Ｔ/Ｔである患者が最も高い危険性を有する、前記ステップ、を含む方法。 12．前記センスプライマーが配列番号：18を含む、請求項11に記載の方法。 13．前記センスプライマーが配列番号：20を含む、請求項11に記載の方法。 14．前記センスプライマーが配列番号：21を含む、請求項11に記載の方法。 15．前記センスプライマーが配列番号：23を含む、請求項11に記載の方法。 16．前記アンチセンスプライマーが配列番号：19を含む、請求項11に記載の方法。 17．前記アンチセンスプライマーが配列番号：19を含む、請求項12に記載の方法。 18．前記アンチセンスプライマーが配列番号：19を含む、請求項13に記載の方法。 19．前記アンチセンスプライマーが配列番号：19を含む、請求項14に記載の方法。 20．前記アンチセンスプライマーが配列番号：19を含む、請求項15に記載の方法。 21．ステップｆの前に、852bp断片を形成するために精製し、および配列番号： 18を含むセンスプライマーと配列番号：19を含むアンチセンスプライマーを用いた第２ポリメラーゼ連鎖反応を行って合成二本鎖ＤＮＡを形成するステップをさらに含む、請求項18に記載の方法。 22．前記729位置の塩基同一性が配列決定により決定される、請求項11に記載の方法。 23．前記729位置の塩基同一性が、前記合成された二本鎖ＤＮＡとＣ-対立遺伝子プロヒビチンとの間の単一塩基のマッチまたはミスマッチの検出により決定される、請求項11に記載の方法。 24．前記729位置の塩基同一性が、制限断片長多型性により決定される、請求項 11に記載の方法。 25．前記塩基がシトシンであるとき、前記塩基729において前記非翻訳領域を切断する制限エンドヌクレアーゼAfTIIIで前記合成二本鎖ＤＮＡを消化することをさらに含む、請求項11に記載の方法。 26．前記塩基がシトシンであるとき、前記塩基729において前記非翻訳領域を切断する制限エンドヌクレアーゼAfTIIIで前記合成二本鎖ＤＮＡを消化することをさらに含む、請求項21に記載の方法。 27．h．前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を分離するステップと、 i．前記消化し分離した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を膜に固定するステップと、 j．少なくとも１つの標識核酸プローブと前記消化し分離した合成二本鎖ＤＮＡ鎖とをハイブリダイズするステップであって、ここで前記標識核酸プローブが、前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に相補的に結合することができ且つ前記729位置で切断が起こったかどうかを確定することができる、前記ステップと、および k．前記標識核酸プローブが前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に結合したかどうかを検出するステップであって、ここで前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に結合した前記標識核酸プローブが前記729位置において切断が起こらなかったことを示す場合には、前記患者は遺伝性乳癌の危険性がある、前記ステップ、をさらに含む、請求項25に記載の方法。 28．h．前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を分離するステップと、 i．臭化エチジウム染色および紫外線写真撮影により前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ断片のパターンを可視化するステップ、をさらに含む、請求項25に記載の方法。 29．h．前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を分離するステップと、 i．前記消化し分離した合成二本鎖DNA鎖を膜に固定するステップと、 j．少なくとも１つの標識核酸プローブと前記消化し分離した合成二本鎖ＤＮＡ鎖とをハイブリダイズするステップであって、ここで前記標識核酸プローブが、前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に相補的に結合することができ且つ前記729位置で切断が起こったかどうかを確定することができる、前記ステップと、 k．前記標識核酸プローブが前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に結合したかどうかを検出するステップであって、ここで前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に結合した前記標識核酸プローブが前記729位置において切断が起こらなかったことを示す場合には、前記患者は遺伝性乳癌の危険性がある、前記ステップ、をさらに含む、請求項26に記載の方法。 30．h．前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を分離するステップと、 i．臭化エチジウム染色および紫外線写真撮影により前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ断片のパターンを可視化するステップ、をさらに含む、請求項26に記載の方法。 31．ゲノムＤＮＡの前記部分が配列番号：22である、請求項11に記載の方法。 32．配列番号：22を増幅するために前記センスプライマー配列番号：23を使用する、請求項31に記載の方法。 33．配列番号：22を増幅するために前記アンチセンスプライマー配列番号19を使用する、請求項31に記載の方法。 34．配列番号：22を増幅するために前記アンチセンスプライマー配列番号19を使用する、請求項32に記載の方法。 35．前記729位置の塩基同一性を配列決定により決定する、請求項34に記載の方法。 36．前記合成二本鎖ＤＮＡとＣ対立遺伝子プロヒビチンとの間の単一塩基のミスマッチを検出することにより前記729位置の塩基同一性を決定する、請求項 34に記載の方法。 37．前記729位置の塩基同一性が制限断片長多型性により決定される、請求項34 に記載の方法。 38．前記塩基がシトシンであるとき、前記塩基729において前記非翻訳領域を切断する制限エンドヌクレアーゼAfTIIIを用いて前記合成二本鎖ＤＮＡを消化するステップをさらに含む、請求項34に記載の方法。 39．h．前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を分離するステップと、 i．前記消化し分離した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を膜に固定するステップと、 j．少なくとも１つの標識核酸プローブと前記消化し分離した合成二本鎖ＤＮＡ鎖とをハイブリダイズするステップであって、ここで前記標識核酸プローブが、前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に相補的に結合することができ且つ前記729位置で切断が起こったかどうかを確定することができる、前記ステップと、 k．前記標識核酸プローブが前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に結合したかどうかを検出するステップであって、ここで前記消化分離し固定した合成二本鎖ＤＮＡ鎖に結合した前記標識核酸プローブが前記729位置における切断が生じなかったことを示す場合には、前記患者は遺伝性乳癌の危険性がある、前記ステップ、をさらに含む、請求項38に記載の方法。 40．h．前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ鎖を分離するステップと、 i．臭化エチジウム染色および紫外線写真撮影により前記消化した合成二本鎖ＤＮＡ断片のパターンを可視化するステップ、をさらに含む、請求項38に記載の方法。 41．ヒト患者の遺伝性乳癌の危険性を決定するための方法であって、 a．前記患者から単離された、ゲノムＤＮＡの一部分の転写領域中のＲＮＡ配列を決定するステップであって、ここで前記ゲノムＤＮＡが非翻訳領域を含むプロヒビチン遺伝子を含み、前記部分が前記非翻訳領域における前記プロヒビチン遺伝子の配列番号：17に定義される729位置に対応する、前記ステップ、および b．前記塩基同一性と遺伝性乳癌の危険性とを相関させるステップ、を含む方法。