JP4042826B2 - Ｄｎａ変異の検出法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば遺伝子多型を用いるヘテロ接合性の消失（ロス オブ ヘテロツァイゴシティ：ＬＯＨ）の検出を、定量的で簡便かつ高感度に実施し、癌などの疾病の診断に応用することができる検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子操作法の進歩はめざましく、遺伝子を利用した疾病の診断法へも広がりつつある。例えば、機能蛋白（酵素や構造蛋白）の遺伝的な欠損や機能異常が原因とされる遺伝病の診断、癌化に伴う正常細胞から癌細胞への遺伝子変異を検出する癌の診断、感染菌やウイルスなどの遺伝子の検出や同定を利用する感染症の診断、組織の細胞中ｍＲＮＡの検出から遺伝子の転写レベルの定量（蛋白発現レベルの予測）など広範にわたり、一部は、既に臨床に供されているものもある。
【０００３】
癌の遺伝子診断とは、狭義には、癌遺伝子あるいは癌抑制遺伝子の発現や変異などの異常を遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）から特定するものであるが、広義には、ある種の癌に特異的に発現する蛋白を同定したり発現量を検索することも含んでいる。この癌化にかかわる遺伝子として多くの癌遺伝子や癌抑制遺伝子が報告されており、これらの遺伝子に欠失や突然変異などの何らかの変異が認められることも多い。しかし、これらの遺伝子のうち、診断的価値のある遺伝子、即ち、比較的多くの症例で共通の変異が認められている遺伝子の報告は少ないが、このような遺伝子として、癌遺伝子ではｒａｓ遺伝子など、癌抑制遺伝子ではｐ５３遺伝子などが知られている。
【０００４】
ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）は、点突然変異、遺伝子増幅、染色体欠失などの色々な遺伝子変異の分析に利用されてきた。染色体欠失は、悪性新生物の一般的な特徴であり、polymorphic base substitutions、variable number of tandem repeats （ＶＮＴＲ）、マイクロサテライト型多型などの種々の遺伝子多型マーカーを用いることにより、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）として検出される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
マイクロサテライト型多型を指標とするヘテロ接合体の検出には、ＰＣＲが利用され、広く遺伝子の連鎖分析に用いられてきた。しかし、固形癌を対象とする場合、この方法を用いるＬＯＨの検出には、幾つかの問題点があった。(1) 一般に、癌組織中に含まれる癌細胞数は少なく、また、癌細胞によって引き起こされる間質系細胞の増殖や白血球の浸潤によって、欠失の判定が困難になる場合があった。(2) 常に、正常細胞との比較が必要であった。(3) フォルマリン固定パラフィン包埋切片のような保存材料では、ＤＮＡが断片化してＰＣＲが難しく、ＬＯＨの検出は困難であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、末端平滑化したＤＮＡ断片を例えば一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）で分析すると、ＬＯＨが簡便かつ定量的に検出できることを見出し、本発明に至ったものである。即ち本発明は、癌の診断などに有用なＬＯＨの簡便で高感度な検出法を提供するものである。
【０００７】
本発明の第１の要旨は、試料中のＤＮＡ断片を検出する際に、あらかじめ該ＤＮＡ断片の末端平滑化処理を行うことを特徴とするＤＮＡ断片中の変異の検出法である。
【０００８】
本発明の第２の要旨は、試料中のＤＮＡ断片が、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）の産物である第１の要旨のＤＮＡ断片中の変異の検出法である。
【０００９】
本発明の第３の要旨は、変異の検出法が一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）である第１又は２の要旨のＤＮＡ断片中の変異の検出法である。
【００１０】
本発明の第４の要旨は、遺伝子から遺伝子多型の存在する遺伝子領域のＤＮＡを複製し、複製したＤＮＡ断片の３’末端側に平滑化処理を行い、得られたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）で分析することを特徴とするヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を検出する方法である。
【００１１】
本発明の第５の要旨は、ＤＮＡ断片として複製しようとする１遺伝子領域中における遺伝子多型は１箇所の塩基置換による多型である第４の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１２】
本発明の第６の要旨は、遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン１領域における制限酵素ＨａｅIII 感受性の有無である第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１３】
本発明の第７の要旨は、複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’（前向き）と５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１４】
本発明の第８の要旨は、遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のエクソン４領域における制限酵素ＢｓｔＵＩ感受性の有無である第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１５】
本発明の第９の要旨は、複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧ３’（前向き）と５’ＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１６】
本発明の第１０の要旨は、遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン７領域における制限酵素ＡｐａＩ感受性の有無である第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１７】
本発明の第１１の要旨は、複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣ３’（前向き）と５’ＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００１８】
本発明の第１２の要旨は、ｐ５３癌抑制遺伝子内の複数個の遺伝子多型のそれぞれを、第４又は５の要旨のＬＯＨの検出法で検出し、その結果を組み合わせることによる癌の検査方法である。
【００１９】
本発明の第１３の要旨は、第７，９，１１の要旨のＬＯＨの検出方法により得られる検出結果を２以上組み合わせることによる第１２の要旨の癌の検査方法である。
【００２０】
本発明の第１４の要旨は、２組以上のプライマーを同時に用いる第４又は５の要旨のＬＯＨの検出方法である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本発明における試料中のＤＮＡ断片とは、組織、血液、細胞、体液、精子、感染菌、ウイルスなどから抽出したＤＮＡを制限酵素などで適当なサイズに切断したＤＮＡ断片、または、組織、血液、細胞、体液などから抽出したＤＮＡを鋳型として適当なＤＮＡ領域のみをＰＣＲなどで増幅したＤＮＡ断片を意味する。
【００２２】
本発明の末端平滑化処理とは、２本鎖ＤＮＡ断片の末端１本鎖部分を平滑にすることであり、KlenowフラグメントやＴ4 ＤＮＡポリメラーゼのような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、１本鎖部分を修復する酵素で処理するか、平滑に切断する制限酵素で処理して１本鎖部分を含む末端部を取り除けばよい。３′→５′エクソヌクレアーゼ活性有する耐熱性ポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を施行する等の方法を用いることが可能である。分析しようとする２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖とアンチセンス鎖の長さが異なったり不揃いの場合、熱変成して１本鎖にして分析すると、ＤＮＡ断片に由来するピークは分裂し、多重となる。これに対し、２本鎖ＤＮＡ断片を平滑化して分析すると単一ピークに収束し、遺伝子変異を起こしたＤＮＡ断片との識別が、極めて容易となる。
【００２３】
本発明のＤＮＡ断片中の変異とは、点突然変異あるいは遺伝子多型等の塩基の置換、塩基の欠損や挿入とそれに伴うフレームシフト、数塩基の欠損や挿入、遺伝子全体の脱落などが含まれる。
【００２４】
本発明のＤＮＡ断片中の変異の検出法としては、ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism) 法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧＧＥ (denaturing gradient gel electrophoresis)法、ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimide modification) 法などがあげられる（バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本 雅編，羊土社(1993)）。
【００２５】
本発明における遺伝子とは、被験者の組織、血液、細胞、体液、感染菌、ウイルスなどから抽出したＤＮＡである。特に、癌患者の診断の場合は、癌組織、癌細胞あるいは尿、膵液、十二指腸液等の体液から抽出したゲノムＤＮＡが対象になる。
【００２６】
本発明の遺伝子多型とは、ヒト染色体の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来する。平均して数百塩基に１箇所程度そのような遺伝子多型が存在すると言われており、遺伝子多型を解析することにより、父方由来の染色体（アレル）と母方由来の染色体（アレル）を区別することができる。従って、遺伝子多型を利用し、ヘテロ接合体における一方のアレルの消失（ＬＯＨ）を測定すれば、遺伝子の欠失を検出することができる。しかし、一塩基の置換による遺伝子多型は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも50％であり、１つの遺伝子の欠失を調べるためには、ヘテロ接合体の出現頻度の高い、複数の遺伝子多型を組み合わせるのが望ましい。また、遺伝子多型には民族間差が存在するので、欠失を診断したい遺伝子のなかから、その民族で出現頻度の高い遺伝子多型を選択する必要がある。
【００２７】
本発明の複製すべき遺伝子の領域とは、１つの遺伝子多型を含む範囲であれば特に制限はないが、ＰＣＲで増幅し易くＳＳＣＰに適した長さと範囲を選ぶ必要がある。長さは通常 100〜200bp で、範囲はＰＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計から決めればよい。
【００２８】
ＤＮＡ断片の検出のために、ＤＮＡ断片のラベル化をすることもできる。ＤＮＡ断片のラベル化としては、プライマーとして予めラベル化したプライマーを使用する方法、又は、ＰＣＲを実施する際にラベル化した塩基成分（例えば燐の放射性ラベル）を用いる方法、又は、ＰＣＲを実施した後にラベル化する方法がある。
【００２９】
ラベル化処理方法としては、ＳＳＣＰ後に検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検出）などで例えば、ＤＮＡの５’末端側を標識化すればよい。特に好ましくは、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端をあらかじめＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５^TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光ラベル化したものを用いればよい。これをＳＳＣＰ法に応用したのが蛍光ＳＳＣＰ法である。
【００３０】
本発明によれば、ＬＯＨの判定を簡便かつ高感度で行なうことができ、例えば大腸癌、膵癌、膀胱癌などの各種癌等の診断に利用することができる。又、同一遺伝子座位に存在する２個以上の好ましくはお互いに重複しない複数個の遺伝子多型についてそれぞれＬＯＨを検出し、その検出結果を組み合わせることにより、即ち、それら検出結果のいずれかひとつがヘテロ接合でありかつＬＯＨ陽性であれば仮に他がホモ接合であっても「陽性」と判定することにより、遺伝子欠失の判定可能な症例をより増加させることができ、癌等の疾病の診断効率の向上に一層寄与することができる。
【００３１】
【実施例】
実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例のみによって限定されるものではない。
【００３２】
実験例
ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン１における制限酵素ＨａｅIII 遺伝子多型の検出（オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’（前向き）と５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される１２４ｂｐのＤＮＡ断片のＳＳＣＰ）
１．オリゴヌクレオチドプライマーの調製
ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマー、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’（前向き）と、５’末端をＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TM（Ｃｙ５^TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光ラベルした５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’（逆向き）は、Ｏｌｉｇｏ １０００ ＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ^TM（ベックマン社）を用いて合成した。
【００３３】
２．ゲノムＤＮＡの抽出
手術で入手した新鮮な大腸癌および膵癌患者検体から癌組織と正常組織を入手した。また、正常者の組織として末梢血の白血球を用いた。これらの組織からのＤＮＡの抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Moleular Biology， Elsevir Science Publishing 社出版）や菅野ら（Lab. Invest. 68 361 (1993) ）の方法で行った。
【００３４】
３．ＰＣＲ
組織より抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型） 0.5μg 、各オリゴヌクレオチドプライマーを12.5ｐmoleずつ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を10ｎmoleずつ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株））1.25units を、ＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ 1.0 ｍＭ、トリトンＸ−１００ 0.1％を含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 9.0）50μl に加え、その上にミネラルオイル（シグマ社）50μl を重層した。この溶液について、次の条件下でＰＣＲを行った。最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、94℃で１分間、50℃で１分間、72℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７分間の反応を行った。
【００３５】
また、ＤＮＡポリメラーゼの違いによるＰＣＲ産物の３’末端側の状態（ゲノムＤＮＡ非依存性の伸長部分）を比較するため、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株））をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・シータス社）又はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジン社）に変え、同様に反応させた。反応の緩衝液は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・シータス社）についてはＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ 1.5ｍＭ、ゼラチン 0.001％を含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.3）を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジン社）についてはＫＣｌ10ｍＭ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ６ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ ２ｍＭ、トリトンＸ−１００ 0.1％、ヌクレアーゼの混入がないＢＳＡ10μg/mlを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.2）を用いた。
【００３６】
ＰＣＲ産物の収率は、８％アクリルアミドゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して求めた。
【００３７】
４．ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化
0.5 units の Klenow fragment（宝酒造（株））を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）又はパーキンエルマー・シータス社）で調製したＰＣＲ反応液５μl に添加し、37℃で30分間反応した。
【００３８】
５．蛍光ＳＳＣＰ分析
分析は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TMＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア社）を用い、トリス・グリシン緩衝液（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭ）を含む15％アクリルアミド（ビスアクリルアミド／アクリルアミド＝１／30）ゲル（高さ 200mm×幅 345mm×厚さ 0.5mm）を用いた。ＰＣＲ反応液、もしくは、３’平滑化処理したＰＣＲ反応液の１μl を、ＳＳＣＰ用のローディング液10μl に加えて80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μl をゲルにチャージし泳動した。
ローディング液の組成は、ＥＤＴＡ20ｍＭ、ブロムフェノールブルー0.05％を含む脱イオン処理した90％ホルムアミド溶液である。電気泳動の緩衝液は、トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭを含む溶液である。電気泳動は、24℃で20Ｗ×10時間行った。測定データの解析は、解析用のソフトＦｒａｇｍｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア社）を用いた。
【００３９】
下記の比較例は、実験例の各操作に従って行った。
【００４０】
比較例１
大腸癌患者検体と正常者白血球から抽出したゲノムＤＮＡを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・シータス社）を用いてＰＣＲで増幅後、蛍光ＳＳＣＰ分析を行った結果を図１Ａに示した。図中のラインは、それぞれ、１：ＨａｅIII 感受性ホモ接合体の健常者、２：ＨａｅIII 耐性ホモ接合体の健常者、３：ヘテロ接合体の大腸癌患者の正常組織部、４：同一大腸癌患者の癌組織部（ＬＯＨ＋）を示した。
【００４１】
比較例２
ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株））を用い、比較例１と同様にして行った。結果を図１Ｂに示した。
【００４２】
比較例３
ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジン社）を用い、比較例１と同様にして行った。結果を図１Ｄに示した。
【００４３】
図１Ａ，Ｂ，Ｄのいずれにおいても、ピークが２つに分裂したり、多数のピークが出現し、遺伝子欠損の判定が煩雑であった。
【００４４】
実施例１（ＰＣＲ産物の３’末端平滑化の効果）
実験例の操作法に従い、比較例２のＰＣＲ反応物に Klenow fragment（宝酒造（株））を加えて３’末端を平滑化後、蛍光ＳＳＣＰ分析を行った。その結果を図１Ｃに示した。ＰＣＲ産物の３’末端を平滑化処理することにより、図１Ａ，Ｂの様なピークの分裂が収束しＬＯＨの判定が、極めて容易になった。概念図で示すと図１５の様になる。即ち、末端平滑化処理により、ピークの分裂が収束する。また、ＤＮＡポリメラーゼを変えた比較例１のＰＣＲ反応物についても Klenow fragment（宝酒造（株））を加えて３’末端を平滑化後、蛍光ＳＳＣＰ分析を行い、図１Ｃと同様な結果を得た。
【００４５】
実施例２（ＬＯＨの検出感度）
ＬＯＨ＋の癌細胞の検出感度を調べるため、ヘテロ接合体の健常者の白血球ゲノムＤＮＡ（ＬＯＨ−の正常細胞に相当）に、ＬＯＨ＋のＤＮＡモデルとして、ＨａｅIII 感受性ホモ接合体の健常者の白血球ゲノムＤＮＡ（モデルとしてホモ接合体のＬＯＨ−細胞を用いているので、片方のアレルが欠損した癌細胞としては１／２量のＤＮＡでよい）を20：０（癌細胞の含量は０％に相当）、18：１（10％）、16：２（20％）、14：３（30％）、12：４（40％）、10：５（50％）、８：６（60％）、６：７（70％）、４：８（80％）、２：９（90％）、０：10（100 ％）の比率で混合し、実験例に従ってＰＣＲ反応、ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化、蛍光ＳＳＣＰ分析を行った。測定データは、解析用のソフトＦｒａｇｍｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア社）を用いて解析し、その結果を図２に示した。図２では、ＨａｅIII 耐性アレル（Ａ１）とＨａｅIII 感受性アレル（Ａ２）をそれぞれ 100bpと 200bpに設定し、Ａ２の高さを合わせて重ね書きした。また、癌細胞の割合とＡ１／Ａ２の比をプロットしたところプロットは、良好な直線に乗った（図３）。このことから、ＰＣＲ産物の３’末端側を平滑化処理してＡ１／Ａ２比を求めることにより、アレル欠損の量、即ち、正常細胞の中に含まれる癌細胞数を正確に測定できることが分かる。
【００４６】
実施例３（膵癌組織におけるｐ５３遺伝子のＬＯＨ検出例）
１４名の癌患者正常組織のｐ５３遺伝子ＨａｅIII 耐性アレル（Ａ１）とＨａｅIII 感受性アレル（Ａ２）を分析したところ、７名（50％）がヘテロ接合体で、ＬＯＨを測定する対象として適していた。そこで、これら７名の癌患者の正常組織と癌組織のゲノムＤＮＡを、実施例１の蛍光ＳＳＣＰ法で分析した（表１）。対象者７名の正常組織のＡ１／Ａ２比は、0.96±0.01（平均±ＳＤ）であった。平均±２ＳＤの範囲0.94〜0.98を正常値（ＬＯＨ−）とすれば、それを越える５／７（71.4％）が陽性（ＬＯＨ＋）であった。また、ＬＯＨ＋とＫ-ras遺伝子の突然変異との一致は、５／６（83.3％）であった。ＬＯＨ＋症例のＡ１／Ａ２比の範囲は0.52〜1.48で、｛A1/A2(正常組織) −A1/A2(癌組織) ｝／｛A1／A2（正常組織）｝の計算式から推定した癌組織中に含まれる癌細胞の割合は19〜37％であった。このように、本発明の方法を用いるＬＯＨの検出法は、癌の診断に有用であることが分かる。ここで、Ａ１は欠失する方のアレルを示し、Ａ２は保存される方のアレルを示す。
【００４７】
【表１】

【００４８】
実施例４（膀胱癌患者のｐ５３遺伝子のＬＯＨの検出例）
１．ゲノムＤＮＡの抽出
膀胱癌患者尿２８例及び健常者尿１２例を入手した。
【００４９】
５０ｍＬ用量のディスポの遠心管に集めた尿サンプルを、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てて尿沈渣を集めた。この沈渣を４０ｍＬの生理食塩水に再分散し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して洗浄した。ＤＮＡを抽出するまでは、この沈渣の状態で、−８０℃に凍結して保存した。実験例と同様に、洗浄沈渣をプロテナーゼＫで酵素消化後、フェノール・クロロフォルム法でＤＮＡを抽出した。
【００５０】
膀胱癌患者１９名の正常及び癌組織のＤＮＡは、外科手術時に得られた対応組織のフォルマリン固定パラフィン包埋サンプルから、Ｌｅviらの方法（Cancer Res.,68，361(1993))に従って抽出した。
【００５１】
２．プライマーの合成
オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｏｌｉｇｏ １０００ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ^TM（ベックマン社）を用いて合成した。ｐ５３遺伝子のイントロン１、エクソン４、イントロン７部位の遺伝子多型を解析するためにデザインしたそれぞれのプライマーの組み合わせを、表２に示した。
【００５２】
【表２】

【００５３】
前向き、または、後ろ向きプライマーのいずれか一方の５’末端は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５^TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、ヨウ化ジカルボシアニンで蛍光ラベル化した。
【００５４】
３．ＰＣＲ
ｐ５３遺伝子のイントロン１とエクソン４部位のＰＣＲの条件は、次の通りであった。抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型）を 0.1〜0.5 μg 、各オリゴヌクレオチドプライマーを12.5ｐmoleずつ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を10ｎmoleずつ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株））1.25units を、ＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ 1.0ｍＭ、トライトンＸ−１００ 0.1％を含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 9.0）50μl に加え、その上にミネラルオイル（シグマ社）50μl を重層した。一方、イントロン７部位については、抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型）を 0.1〜0.5 μg 、各オリゴヌクレオチドプライマーを12.5ｐmoleずつ、ｄＮＴＰを10ｎmoleずつ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・シータス社）1.25units を、ＫＣｌ50ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ 1.5ｍＭ、ゼラチン 0.001％(W/V) を含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.3）50μl に加え、その上にミネラルオイル50μl を重層した。これらの溶液について、次の条件下でＰＣＲを行った。イントロン１については、最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、変成条件94℃で１分間、アニーリング50℃で１分間、伸長反応72℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７分間の伸長反応を行った。イントロン７については、最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、94℃で１分間、60℃で30秒間、72℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７分間反応を行った。エクソン４については、最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７分間反応を行った。
【００５５】
ＰＣＲ産物の収率は、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して求めた。
【００５６】
４．ＰＣＲ産物の３’末端の平滑化
0.5units／μl のKlenow fragment （宝酒造（株））を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）又はパーキンエルマー・シータス社）で調製したＰＣＲ反応液５μl に添加し、37℃で30分間反応した。
【００５７】
５．蛍光ＳＳＣＰ分析
分析は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TMＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア社）に、トリス・グリシン緩衝液（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭ）を含む15％ポリアクリルアミド（ビスアクリルアミド／アクリルアミド＝１／30）ゲル（高さ 200mm×幅 345mm×厚さ 0.5mm）をセットして行った。３’末端平滑化処理したＰＣＲ反応液の１μl を、ＳＳＣＰ用のローディング液10μl に加えて80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μl をゲルにチャージし泳動した。ローディング液の組成は、ＥＤＴＡ20ｍＭ、ブロムフェノールブルー0.05％を含む脱イオン化した90％ホルムアミド溶液である。電気泳動の緩衝液は、トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭを含む溶液である。電気泳動は、イントロン１とイントロン７については24℃、エクソン４では20℃のそれぞれの温度で、20Ｗ×10時間行った。測定データの解析は、解析用のソフトＦｒａｇｍｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア社）を用いた。
【００５８】
ヘテロ接合体である患者の正常組織及び癌組織のアレルのシグナル比から、癌組織中に含まれる癌細胞の割合を推定する計算は、実施例３と同様にして行った。また、癌細胞の割合が１０％を越えた場合、ＬＯＨ＋とした。
【００５９】
６．分析例
ｐ５３遺伝子のイントロン１、エクソン４、イントロン７の３つともヘテロ接合体であった典型的な尿サンプルでの分析例を、図４〜７に示した。図４，５，６はそれぞれＬＯＨ＋患者Ａ２５，Ａ６，Ａ１の例、図７は健常者Ｂ１の例である。矢印は、欠失の有るアレルのシグナルを示す。
【００６０】
また、同一患者Ａ６の尿と組織を分析し、その結果を比較した例を、図８〜１０に示した。図８は尿、図９は癌組織、図１０は対応組織の正常部位の分析結果を、それぞれ示している。図８のかっこ内は、アレルのシグナルの高さから計算した癌組織中に含まれている癌細胞の予想割合を示している。図８〜９のように、癌患者の尿の分析パターンと癌組織のパターンは、良く一致していた。
【００６１】
７．分析結果のまとめ
４０尿検体を分析して、ｐ５３遺伝子のイントロン１、エクソン４、イントロン７に存在する３つの遺伝子多型のうち、１つ以上がヘテロ接合体であった２３尿検体（５８％）が分析対象として有効であった。このうち、膀胱癌患者は１６検体、健常者は７検体であった。健常者７検体の各遺伝子多型内のアレルのシグナルの比バラツキは、±２ＳＤで５％未満と、極めて安定していた。癌患者１６検体の測定結果を表３にまとめた。いずれかの遺伝子多型のＬＯＨが陽性であるものは８検体（５０％）であった。ｐ５３遺伝子の３ヶ所の遺伝子多型の中から選んだ、単一の遺伝子多型だけで判断した場合、ＬＯＨ＋は６〜７検体と、いずれの場合も、３つの組み合わせより劣っていた。従って、できるだけ重複の少ない遺伝子多型を選択し、それらを組み合わせることにより、ＬＯＨの検出効率を、さらに向上できることが示された。
【００６２】
一方、癌組織レベルでは、測定できた９検体のうち、８検体（８９％）がＬＯＨ＋であった。また、尿検体とＬＯＨの一致率は、６検体／８検体（７５％）と高率であった。このことから、膀胱癌においては、尿検体を用いても、十分にＬＯＨの検出が可能であることが分かった。
【００６３】
【表３】

【００６４】
表３の結果を、さらに、ステージ、グレード別に分類し、表４にまとめた。Ｔis、Ｔa の初期ステージにおいては、ＬＯＨの陽性例はなく、ステージの進行とともに陽性化していくことが分かる。ｐ５３以外の遺伝子マーカーや細胞診の結果と組み合わせることにより、より詳細な癌の把握が可能になる。
【００６５】
【表４】

【００６６】
実施例５（複数個のＰＣＲ反応を同時に行って複数個の遺伝子多型を同時に分析する方法）
大腸癌患者の検体を用い、実施例４のゲノムＤＮＡの抽出とＰＣＲを次のように変更してｐ５３遺伝子のＬＯＨを検出した。
【００６７】
１．ゲノムＤＮＡの抽出
大腸癌患者検体から癌組織と正常組織を入手し、実験例と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６８】
２．ＰＣＲ
抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型）を 0.1〜0.5 μg ／ 2.5μｌ、表２のイントロン１の各オリゴヌクレオチドプライマー 5ｐmoleずつを含む溶液1.25μｌ、表２のエクソン４の各オリゴヌクレオチドプライマー 5ｐmoleずつを含む溶液1.25μｌ、表２のイントロン７の各オリゴヌクレオチドプライマー1.25ｐmoleずつを含む溶液0.3125μｌ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ） 5ｎmoleずつを含む溶液４μｌ、ＫＣｌ 500ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ 10ｍＭ、トライトンＸ−１００ 1％を含む 100ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ 9.0） 2.5μl 、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）） O.625units ／0.125 μｌ、蒸留水 13.0625μｌを混合した。
この反応液25μｌ上にミネラルオイル（シグマ社）50μl を重層し、ＰＣＲ反応を行った。最初の変成条件のみは94℃で５分間、その後の反応は、変成条件94℃で１分間、アニーリング55℃で１分間、伸長反応72℃で１分間のサイクルを40回繰り返し、最後は72℃で７分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ産物の収率は、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して求めた。
【００６９】
図１１に分析結果を示した。図から明らかなように、一回のＰＣＲだけで、大腸癌患者のエクソン４、イントロン７、イントロン１の各部位における３つの遺伝子多型が同時に分析でき（図１１Ａ）、大腸癌患者癌組織のＬＯＨ（図１１Ｂ）が検出できることが分かる。
【００７０】
図１２から１４は、図１１のエクソン４、イントロン７、イントロン１部位の遺伝子多型をそれぞれ拡大したものである。それぞれの部位におけるアレルのピーク高さから計算した癌組織中に含まれる癌細胞の推定割合は、それぞれエクソン４が６１．２％、イントロン７が５２．３％、イントロン１が５８．４％と、ほぼ同様の結果が得られた。このことから、ＰＣＲの条件を工夫することにより、複数個のＰＣＲ反応を同時に行って複数個の遺伝子多型を同時に分析できることが分かる。
【００７１】
【発明の効果】
本発明により、ＬＯＨの判定が簡便かつ高感度（高い検出率）に行えるようになり、癌の診断に有用であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光ＳＳＣＰ分析法におけるＰＣＲ産物の３’末端平滑化の効果を示す。
【図２】本発明によるＬＯＨの検出感度を示す。
【図３】癌細胞含量の検量線を示す。
【図４】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ２５の尿サンプルの分析結果を示す。
【図５】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の尿サンプルの分析結果を示す。
【図６】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ１の尿サンプルの分析結果を示す。
【図７】末端平滑化ＳＳＣＰ法による健常者Ｂ１の尿サンプルの分析結果を示す。
【図８】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の尿サンプルの分析結果を示す。
【図９】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の癌組織（Ｔｕｍｏｒ）サンプルの分析結果を示す。
【図１０】末端平滑化ＳＳＣＰ法による癌患者Ａ６の対応正常部位組織（Ｎｏｒｍａｌ）サンプルの分析結果を示す。
【図１１】大腸癌患者組織から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、複数個のＰＣＲ反応を同時に行って複数個の遺伝子多型を同時に分析し、ＬＯＨを解析した結果を示す。
【図１２】図１１のエクソン４部位の遺伝子多型の拡大図である。
【図１３】図１１のレントロン７部位の遺伝子多型の拡大図である。
【図１４】図１１のイントロン１部位の遺伝子多型の拡大図である。
【図１５】末端平滑化ＳＳＣＰ法による遺伝子欠失の高感度検出の概念図である。

Claims (28)

1. 試料中のＤＮＡ断片を検出する際に、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法により該ＤＮＡ断片を増幅した後に、標識された前記ＤＮＡ断片に対して、平滑末端処理することを特徴とする一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）法を用いたＤＮＡ断片中の変異の検出法。
2. 遺伝子から遺伝子多型の存在する遺伝子領域のＤＮＡを複製し、複製したＤＮＡ断片の３’末端側に平滑化処理を行い、得られたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ法）で分析することを特徴とするヘテロ接合性の消失（ロス オブ ヘテロツァイゴシティ：ＬＯＨ）を検出する方法。
3. ＤＮＡ断片として複製しようとする１遺伝子領域中における遺伝子多型は１箇所の塩基置換による多型である請求項２記載のＬＯＨの検出方法。
4. 遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン１領域における制限酵素ＨａｅＩＩＩ 感受性の有無である請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
5. 複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’（前向き）と５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
6. 遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のエクソン４領域における制限酵素ＢｓｔＵＩ感受性の有無である請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
7. 複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧ３’（前向き）と５’ＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
8. 遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン７領域における制限酵素ＡｐａＩ感受性の有無である請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
9. 複製するＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプライマー、５’ＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣ３’（前向き）と５’ＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’（逆向き）を用いるＰＣＲで増幅される領域である請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
10. ｐ５３癌抑制遺伝子内の複数個の遺伝子多型のそれぞれを、請求項２又は３記載のＬＯＨの検出法で検出し、その結果を組み合わせることによる癌の検査方法。
11. 請求項５，７，９記載のＬＯＨの検出方法により得られる検出結果を２以上組み合わせることによる請求項１０記載の癌の検査方法。
12. ２組以上のプライマーを同時に用いる請求項２又は３記載のＬＯＨの検出方法。
13. 一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法を用いた遺伝子分析方法であって、遺伝子多型の存在する遺伝子領域を複製した標識ＤＮＡ断片を末端平滑処理し、ＤＮＡ断片中の変異を検出し、遺伝子の欠失を調べる方法。
14. 請求項１３記載の遺伝子分析方法であって、ＤＮＡ断片が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて複製されている方法。
15. 請求項１３記載の遺伝子分析方法であって、１本鎖部分を修復する酵素、又は１本鎖部分を平滑に切断する制限酵素を用い、ＤＮＡ断片を末端平滑処理する方法。
16. 請求項１３記載の遺伝子分析方法であって、ＤＮＡ断片中の変異からヘテロ接合体における一方のアレルの消失を測定し、遺伝子の欠失を調べる方法。
17. 一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法を用いるＤＮＡ断片分析方法であって、複製後に末端平滑処理されたＤＮＡ断片を電気泳動分析し、ＤＮＡ断片に由来するピークを表示する方法。
18. 請求項１７記載のＤＮＡ断片分析方法であって、ＤＮＡ断片が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて複製されている方法。
19. 請求項１７記載のＤＮＡ断片分析方法であって、１本鎖部分を修復する酵素、又は１本鎖部分を平滑に切断する制限酵素を用い、ＤＮＡ断片を末端平滑処理する方法。
20. 請求項１７記載のＤＮＡ断片分析方法であって、ＤＮＡ断片に由来するピークを表示する単一ピークを表示する方法。
21. 以下の試薬を含む、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法を用いた遺伝子欠失判定用試薬セット：
    遺伝子多型の存在する遺伝子領域を増幅できるオリゴヌクレオチドプライマーを含む核酸増幅用試薬；
    ２本鎖ＤＮＡ断片の末端一本鎖部分を平滑にする酵素を含む末端平滑化処理用試薬。
22. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端一本鎖部分を平滑にする酵素が、１本鎖部分を修復する酵素、又は／及び１本鎖部分を平滑に切断する制限酵素である試薬セット。
23. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン１領域における制限酵素ＨａｅＩＩＩ感受性の有無である試薬セット。
24. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記核酸増幅用試薬が、５’ＴＣＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＴＴＣ３’の塩基配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、５’ＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＴＧ３’の塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む試薬セット。
25. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のエクソン４領域における制限酵素ＢｓｔＵＩ感受性の有無である試薬セット。
26. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記核酸増幅用試薬が、５’ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧ３’の塩基配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、５’ＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧ３’の塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む試薬セット。
27. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記遺伝子多型が、ｐ５３癌抑制遺伝子のイントロン７領域における制限酵素ＡｐａＩ感受性の有無である試薬セット。
28. 請求項２１記載の遺伝子欠失判定用試薬セットであって、前記核酸増幅用試薬が、５’ＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣ３’の塩基配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、５’ＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＴ３’の塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む試薬セット。

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