BR112016028521B1

BR112016028521B1 - Métodos para triagem de um neoplasma colorretal e para análise de metilação de dna, e, composição de oligonucleotídeos

Info

Publication number: BR112016028521B1
Application number: BR112016028521-2A
Authority: BR
Inventors: Suzanne Pedersen; Laurence Lapointe; Rohan Baker; Amber C. Donahue; Yen-lin Peng; Frederic Waldman
Original assignee: Clinical Genomics Pty Ltd; Quest Diagnostics Investments Incorporated
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2023-03-14
Also published as: MX370850B; NZ727493A; US20230212685A1; PH12016502417A1; EP3152333A2; AU2015271697B2; IL280521B; IL280521A; JP2020191876A; CN106574303A; KR102587812B1; EP3152333A4; EP3152333B1; BR112016028521A2; US20170191135A1; WO2015187823A2; JP6722659B2; CA2951141C; IL249365B; JP2017516504A

Abstract

MÉTODOS PARA TRIAGEM DE UM NEOPLASMA COLORRETAL OU PREDISPOSIÇÃO PARA DESENVOLVIMENTO DE UM NEOPLASMA COLORRETAL E PARA ANÁLISE DE METILAÇÃO DE DNA, E, COMPOSIÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS É descrita aqui uma combinação de sequências genômicas cujos padrões de metilação têm utilidade para a detecção e diferenciação melhoradas entre neoplasmas colorretais. São adicionalmente descritos aqui métodos, ácidos nucleicos e kits para detectar ou diferenciar entre neoplasmas colorretais.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório U.S. N° 62/007.687 depositado em 4 de junho de 2014, cujos conteúdos são aqui incorporados em suas totalidades por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O câncer colorretal (CRC, ColoRectal Cancer) é a terceira forma mais comum de câncer e a segunda causa principal de mortes relacionadas com câncer no mundo ocidental. Sua evolução natural (acredita- se que a sequência adenoma-carcinoma ocorre na maioria dos pacientes) e sua acessibilidade pelos métodos não cirúrgicos torna-o adequado para detecção precoce e prevenção.

[003] A detecção precoce melhora enormemente as chances de cura de CRC. A colonoscopia é um teste extremamente específico e sensível, entretanto, é um teste invasivo que exige a preparação do intestino e a cooperação do paciente. Também está associada a um risco menor de complicações sérias, reduzindo seu uso generalizado. Há uma necessidade de detecção não invasiva de alterações pré-malignas e malignas neoplásicas do cólon com sensibilidade alta e especificidade excelente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] É aqui descrito, em algumas modalidades, um método para a triagem de um neoplasma colorretal ou de uma predisposição para desenvolvimento de um neoplasma colorretal em um indivíduo, compreendendo: ensaiar uma amostra biológica do indivíduo pela determinação do estado de metilação do gene Septina 9 e do estado de metilação de um gene marcador adicional dentro da amostra biológica, em que o gene marcador adicional é selecionado do gene dedo de zinco 1 da família Ikaros (IKZF1, Ikaros Family Zinc-Finger 1) e o gene aminotransferase de cadeia ramificada 1 (BCAT1, Branched-Chain AminoTransferase 1), em que a metilação de Septina 9 e do um gene marcador adicional é indicativo de um neoplasma colorretal, ou de uma predisposição para o desenvolvimento de um neoplasma colorretal, no indivíduo. Em algumas modalidades, o ensaio de uma amostra biológica compreende a determinação do estado de metilação do gene Septina 9, do gene IKZF1, e do gene BCAT1. Em algumas modalidades, a determinação do estado de metilação do gene Septina 9 e do estado de metilação de um gene marcador adicional compreende pelo menos um dentre amplificação, método de PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase), amplificação isotérmica, método de NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, amplificação baseada em sequência de ácido nucleico), método de LCR (Ligase Chain Reaction, reação em cadeia da ligase), amplificação específica de metilação, PCR específica de metilação (MSP, Methylation Specific PCR), MSP aninhada, Heavy-Methyl™, sequenciamento de bissulfito, detecção por meio de arranjos de DNA, detecção por microarranjos de oligonucleotídeos, detecção por meio de microarranjos de ilhas CpG (Cytosine-phosphatidyl-Guanine, citosina-fosfatidil-guanina), detecção por meio de enzimas de restrição, o método COBRA (Combined Bissulfite Restriction Analysis, análise de restrição combinada com bissulfito), PCR em tempo real, PCR em tempo real HeavyMethyl™, MSP MethyLight™, MethyLight™ Algo™, o método QM (Quantum-Mechanical), Headloop MethyLight™, HeavyMethyl™ MethyLight™, HeavyMethyl™ Scorpion™, MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão com iniciador sensível à metilação e MS-SNuPE (Methylation-Sensitive Single Nucleotide Primer Extension, Extensão com Iniciador (“primer”) de Nucleotídeo Único Sensível à Metilação). Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou de plasma. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de fezes, lavagem com enema, seção cirúrgica ou biópsia de tecido. Em algumas modalidades, o neoplasma é um câncer. Em algumas modalidades, o neoplasma é um adenoma. Em algumas modalidades, o neoplasma é pré-canceroso. Em algumas modalidades, o dito indivíduo é humano. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende DNA genômico. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende DNA isento de células.

[005] É aqui descrito, em algumas modalidades, um método para a análise de metilação de DNA, compreendendo: a) tratar o DNA de uma amostra biológica com um ou mais reagentes capazes de converter bases de citosina não metiladas em sulfonato de uracila ou em outra base tendo um comportamento de ligação diferente da citosina enquanto deixa a citosina metilada não afetada; e b) amplificar o DNA tratado por meio de: i) um iniciador específico para um gene Septina 9; ii) um iniciador específico para um gene IZKF1 ou BCAT1; e c) detectar o DNA amplificado. Em algumas modalidades, o método compreende amplificar o DNA tratado por meio de: i) um iniciador específico para um gene Septina 9; ii) um iniciador específico para um gene IZKF1; e iii) um iniciador específico para um gene BCAT1.

[006] Em algumas modalidades, é aqui descrito um método para análise de metilação de DNA, compreendendo: a) tratar o DNA de uma amostra biológica com um ou mais reagentes capazes de converter bases de citosina não metiladas em sulfonato de uracila; e b) amplificar o DNA tratado por meio de: i) um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; e variantes das mesmas; ii) um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes da mesma, ou um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas; e iii) opcionalmente um oligonucleotídeo selecionado dentre SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:9 e variantes da mesma; e c) detectar o DNA amplificado.

[007] Em algumas modalidades, é aqui descrita uma composição de oligonucleotídeos, que compreende ou consiste essencialmente em: i) um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; e variantes das mesmas; ii) um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em: 1) SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; ou 2) SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas; e iii) opcionalmente um oligonucleotídeo selecionado de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a composição de oligonucleotídeos compreende um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; e um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

[008] A FIG. 1 exemplifica a sensibilidade e a especificidade de marcadores de metilação de Septina 9, IKZF1, e BCAT1, sozinhos ou em combinação. A adição de IKZF1 e BCAT1 ao Septina 9 resultou na captura de 20 casos adicionais (aumento de sensibilidade de 10%).

[009] A FIG. 2 exemplifica a sensibilidade dos marcadores de metilação de Septina 9, IKZF1, e BCAT1, sozinhos ou em combinação, pelo estágio de câncer colorretal. A adição de IKZF1 e BCAT1 ao Septina 9 capturou um adicional de 13 casos de estágio II e 6 casos de estágio III, aprimorando a detecção de cânceres de estágio precoce.

[0010] A FIG. 3 exemplifica a sensibilidade dos marcadores de metilação de Septina 9, IKZF1, e BCAT1, sozinhos ou em combinação, na detecção de câncer colorretal pelo estágio em número absoluto (3A) e por percentagem do total (3B).

[0011] A FIG. 4 exemplifica a sensibilidade e a especificidade de marcadores de metilação de Septina 9, IKZF1, e BCAT1, sozinhos ou em combinação na detecção de câncer colorretal usando >1 poço, > 2 poços, e > 3 poços.

[0012] A FIG. 5 exemplifica as diferenças no desempenho entre vários protocolos na detecção de câncer colorretal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0013] São aqui descritos método, iniciadores, reagentes e kits para a detecção de um neoplasma colorretal.

[0014] Para facilitar um entendimento da presente descrição, numerosos termos são definidos abaixo.

[0015] Como aqui usado, salvo indicação em contrário, quando faz-se referência a um valor numérico, o termo “cerca de” significa mais ou menos 10% do valor enumerado.

[0016] Os termos “amplificação” ou “amplificar” como aqui usados incluem métodos para copiar um ácido nucleico alvo, aumentando, deste modo, o número de cópias de uma sequência de ácido nucleico selecionada. A amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser DNA ou RNA. As sequências amplificadas nesta maneira formam um “produto de amplificação”, também conhecido como “amplicon”. Embora métodos exemplificadores descritos doravante refiram-se à amplificação usando reação em cadeia da polimerase (PCR), numerosos outros métodos conhecidos na técnica para a amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, métodos isotérmicos, método do círculo rolante, etc.). O técnico versado entenderá que estes outros métodos podem ser usados quer no lugar de, quer juntos com, os métodos de PCR. Vide, por exemplo, Saiki, “Amplification of Genomic DNA” em PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp. 13-20; Wharam et al., Nucleic Acids Res., 29(11):E54- E54, 2001; Hafner et al., Biotechniques, 30(4):852-56, 858, 860, 2001; Zhong et al., Biotechniques, 30(4):852-6, 858, 860, 2001.

[0017] Como aqui usado, o termo “oligonucleotídeo” ou “polinucleotídeo” refere-se a um polímero curto composto de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, ou qualquer combinação dos mesmos. Os oligonucleotídeos são, de modo geral, entre cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, ou 30 e cerca de 150 nucleotídeos (nt) em comprimento, mais preferencialmente entre de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, ou 30 e cerca de 70 nt.

[0018] Como aqui usado, um “iniciador” é um oligonucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeos alvo e resulta na adição de nucleotídeos na extremidade 3’ do iniciador na presença de uma DNA- ou RNA-polimerase. O nucleotídeo 3’ do iniciador deve, de modo geral, ser idêntico à sequência alvo em uma posição de nucleotídeo correspondente para extensão e/ou amplificação ideais. O termo “iniciador” inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizadas incluindo iniciadores de ácido peptídeo-nucleico, iniciadores de ácido nucleico travado (LNA, Locked Nucleic Acid), iniciadores modificados com fosforotioato, iniciadores marcados, e semelhantes. Como aqui usado, um “iniciador direto” é um iniciador que é complementar à fita antissenso de DNA. Um “iniciador reverso” é complementar à fita senso de DNA.

[0019] Um oligonucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que é específico para um ácido nucleico alvo “hibridizará” com o ácido nucleico alvo sob condições adequadas. Como aqui usado, “hibridização” ou “hibridizar” refere-se ao processo pelo qual uma fita única de oligonucleotídeo anela-se com uma fita complementar mediante o pareamento de bases sob condições de hibridização. É uma interação específica, isto é, não aleatória, entre dois polinucleotídeos complementares. A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre os ácidos nucleicos) são influenciados por fatores como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, a estringência das condições envolvidas, e a Tm do híbrido formado.

[0020] Como aqui usado, um oligonucleotídeo é “específico” para um ácido nucleico se ele for capaz de hibridizar com o alvo de interesse e de não substancialmente hibridizar com os ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis altos de identidade de sequência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de computador disponível para comercialização com uma configuração padrão que utiliza algoritmos bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST).

[0021] Como aqui usado, uma “variante” de um oligonucleotídeo (como uma sonda ou um iniciador de oligonucleotídeo) tem um comprimento semelhante ao de um oligonucleotídeo específico (na faixa de 5 nucleotídeos) e hibridiza com substancialmente a mesma região que o oligonucleotídeo específico. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo variante hibridiza sob condições estringentes com o oligonucleotídeo específico. As condições de hibridização estringentes de modo geral incluem uma temperatura de recozimento relativamente alta (por exemplo cerca de 60°C a 63°C), que favorecerá a ligação do oligonucleotídeo variante ao seu alvo, e resultará na dissociação do oligonucleotídeo variante de qualquer sequência não alvo à qual ele tem estado brevemente ligado.

[0022] O termo “região de interesse” refere-se a uma região de um ácido nucleico a ser sequenciada.

[0023] O termo “amostra biológica” como aqui usado refere-se a uma amostra contendo ácidos nucleicos de interesse. Uma amostra biológica pode compreender amostras clínicas (isto é, obtidas diretamente de um paciente) ou ácidos nucleicos isolados e pode ser fluidos celulares ou acelulares e/ou amostras de tecido (por exemplo, biópsia). Em algumas modalidades, uma amostra é obtida de um tecido ou fluido corporal coletado de um indivíduo. As fontes de amostra incluem, mas não se limitam a, esputo (processado ou não processado), lavagem alveolar bronquial (BAL, Bronchial Alveolar Lavage), lavagem bronquial (BW, Bronchial Wash), sangue inteiro ou células sanguíneas isoladas de qualquer tipo (por exemplo, linfócitos), fluidos corporais, fluido cerebrospinal (CSF, CerebroSpinal Fluid), urina, plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia). Os métodos de obter as amostras de teste e as amostras de referência são bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica e incluem, mas não se limitam a, aspirações, seções de tecido, extração de sangue ou de outros fluidos, biópsias cirúrgica ou por agulha, coleta de tecido fixado em parafina, coleta de fluidos corporais, coleta de fezes, e semelhantes. No presente contexto a amostra biológica é preferencialmente sangue, soro ou plasma.

[0024] Como aqui usado, o termo “indivíduo” refere-se a um mamífero, como um humano, mas pode também ser outro animal como um animal doméstico (por exemplo, um cão, um gato, ou semelhante), um animal de fazenda (por exemplo, uma vaca, uma ovelha, um porco, um cavalo, ou semelhante) ou um animal de laboratório (por exemplo, um macaco, um rato, um camundongo, um coelho, um porquinho-da-índia, ou semelhante). O termo “paciente” refere-se a um “indivíduo” que possui, ou é suspeito de possuir, um polimorfismo genético de interesse.

[0025] Como aqui usados, os termos “câncer de estágio I”, “câncer de estágio II”, “câncer de estágio III” e “câncer de estágio IV” referem-se à classificação de estadiamento TNM para câncer. O câncer de estágio I tipicamente identifica que o tumor primário está limitado ao órgão de origem. O estágio II significa que o tumor tem se espalhado através da parede muscular do cólon. O estágio III significa que o tumor tem se espalhado para os linfonodos. O estágio IV significa que o tumor primário tem se espalhado para os outros órgãos.

[0026] Como aqui usado, “estado de metilação” refere-se ao nível de metilação de resíduos de cisteína (encontrados em pares CpG) no gene de interesse. Quando usado em referência a um sítio CpG, o estado de metilação pode estar metilado ou não metilado. Os níveis de metilação de um gene de interesse são determinados por qualquer meio adequado.

ANÁLISE DE METILAÇÃO

[0027] É aqui descrito, em algumas modalidades, um método para a triagem de um neoplasma colorretal ou de uma predisposição para o desenvolvimento de um neoplasma colorretal em um indivíduo, compreendendo: ensaiar uma amostra biológica do indivíduo pela determinação do estado de metilação do gene Septina 9 e do estado de metilação de um gene marcador adicional dentro da amostra biológica, em que o um gene marcador adicional é selecionado do gene dedo de zinco 1 da família Ikaros (IKZF1) e o gene aminotransferase de cadeia ramificada 1 (BCAT1), em que a metilação de Septina 9 e do um gene marcador adicional é indicativo de um neoplasma colorretal, ou de predisposição para o desenvolvimento de um neoplasma colorretal, no indivíduo. Em algumas modalidades, ensaiar a amostra biológica compreende determinar o estado de metilação do gene Septina 9, do gene IKZF1, e do gene BCAT1.

[0028] É aqui descrito, em algumas modalidades, um método para a análise de metilação de DNA, compreendendo: a) tratar o DNA de uma amostra biológica com um ou mais reagentes capazes de converter bases de citosina não metiladas em sulfonato de uracila ou em outra base tendo um comportamento de ligação diferente do da citosina enquanto que deixa a citosina metilada não afetada; e b) amplificar o DNA tratado por meio de: i) um iniciador específico para um gene Septina 9; ii) um iniciador específico para um gene IZKF1 ou um gene BCAT1; e c) detectar o DNA amplificado. Em algumas modalidades, o método compreende analisar o DNA tratado por meio de: i) um iniciador específico para um gene Septina 9; ii) um iniciador específico para um gene IZKF1; e iii) um iniciador específico para um gene BCAT1.

Septina 9

[0029] O gene Septina 9 humano (também conhecido como proteína de fusão semelhante à MLL-septina (MLL, Myeloid/Lymphoid Leukemia ou Mixed-Lineage Leukemia, leucemia mieloide-linfoide ou leucemia de linhagem mista), proteína de fusão MSF-A semelhante à MLL-septina, Sipa, Eseptina, Msf, proteína semelhante à septina como septina de Ovário/de Mama (septina Ov/Br) e Septina D1) é um membro da família dos genes Septina. Tem sido considerado que os membros da família dos genes Septina estão associados a múltiplas funções celulares variando desde tráfego de vesículas até citocinese. É sabido que o gene Septina 9 compreende quatro variantes transcritos, as variantes Septina 9 e as variantes Q9HC74 (que são versões truncadas dos transcritos de Septina 9). Os transcritos de Septina 9 e de Q9HC74 compreendem, cada um, uma região de promotor rica em CpG, respectivamente. A disrupção da ação de Septina 9 resulta em divisão celular incompleta, e tem sido mostrado que Septina 9 é parceiro de fusão do protooncogene MLL sugerindo uma função em tumorigênese.

IZKF1

[0030] O gene proteína dedo de zinco 1 da família Ikaros de humano (IZKF1), é também conhecido como o gene que codifica a proteína Ikaros ligadora de DNA. Tem sido descoberto que a proteína IZKF1 é o principal supressor de tumor e a perda de sua função tem estado ligada à leucemia linfoide. É sabido que IKZF1 é suprarregulada em granulócitos, células-B, células-T e células matadoras naturais, e é infrarregulada em eritroblastos, megacariócitos e monócitos.

BCAT1

[0031] O gene aminotransferase de cadeia ramificada humana 1 (BCAT1) codifica a enzima responsável pela catálise da primeira etapa no metabolismo de aminoácidos ramificados como leucina, isoleucina e valina. BCAT1 tem expressão limitada e acredita-se que é encontrado apenas em determinados tecidos, como tecidos embrionários, em cérebro de adultos, em ovário e em placenta. A expressão do gene BCAT1 tem estado associada à proliferação em levedura e potencial metastásico aumentado em cânceres humanos.

[0032] Em algumas modalidades, genes adicionais são analisados para o estado de metilação. Em algumas modalidades, um gene adicional selecionado dentre IRF4, GRASP, CAHM, VIM1, TMEFF2, SOX21, SLC5A15, NPY. ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2, e SDC2 é analisado para o estado de metilação.

[0033] Em algumas modalidades, é aqui descrito um método para a análise de metilação de DNA, compreendendo: a) tratar o DNA de uma amostra biológica com um ou mais reagentes capazes de converter bases de citosina não metiladas em sulfonato de uracila; e b) amplificar o DNA tratado por meio de: i) um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; e variantes das mesmas; ii) um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; ou um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas; e iii) opcionalmente um oligonucleotídeo selecionado dentre SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, e SEQ ID NO:9 e variantes das mesmas; e c) detectar o DNA amplificado.

[0034] Em algumas modalidades, é aqui descrita uma composição de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo essencialmente em: i) um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; e variantes das mesmas; ii) um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em: 1) SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; ou 2) SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas; e iii) opcionalmente um oligonucleotídeo selecionado dentre SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a composição de oligonucleotídeos compreende um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; e um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas.

[0035] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos são úteis na detecção de um neoplasma colorretal. Em algumas modalidades, o neoplasma colorretal é pré-maligno. Em algumas modalidades, o neoplasma colorretal é maligno. Em algumas modalidades, o neoplasma colorretal é câncer colorretal sem considerar o estágio do câncer (por exemplo, estágio I, II, III, ou IV). Em algumas modalidades, o câncer colorretal é um câncer de estágio I. Em algumas modalidades, o câncer colorretal é um câncer de estágio II. Em algumas modalidades, o câncer colorretal é um câncer de estágio III. Em algumas modalidades, o câncer colorretal é um câncer de estágio IV. Em algumas modalidades, o neoplasma colorretal é adenoma, sem considerar o tamanho do adenoma (por exemplo, maior que 3 cm; menor que ou igual a 3 cm; maior que 1 cm; menor que ou igual a 1 cm). Em algumas modalidades, o adenoma é considerado como um adenoma avançado.

[0036] Em algumas modalidades nas quais um neoplasma colorretal é detectada, técnicas adicionais são realizadas para caracterizar o neoplasma colorretal (por exemplo, para caracterizar o neoplasma colorretal como maligno ou pré-maligno) (por exemplo, para caracterizar a neoplasma colorretal dentro de um estágio específico de câncer colorretal).

[0037] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para monitorar o estado de metilação no decorrer do tempo. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados mensalmente, a cada seis meses, anualmente, a cada 2 anos, a cada 3 anos, a cada 4 anos, a cada 5 anos, ou em intervalo de tempo mais longo.

[0038] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para monitorar o tratamento de um neoplasma colorretal. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados imediatamente antes do, durante o e/ou depois do tratamento para monitorar o sucesso do tratamento. Em algumas modalidades, os métodos são realizados em intervalos em pacientes isentos de doenças para garantir ou monitorar o sucesso do tratamento.

[0039] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para obter um perfil de risco do indivíduo para desenvolver um neoplasma colorretal.

[0040] Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou de plasma. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amostra de fezes, uma lavagem com enema, uma seção cirúrgica ou uma biópsia de tecido. Em algumas modalidades, o neoplasma é um câncer. Em algumas modalidades, o neoplasma é um adenoma. Em algumas modalidades, o neoplasma é pré-canceroso. Em algumas modalidades, o dito indivíduo é humano. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende DNA genômico. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende DNA isento de células.

Métodos para a detecção de metilação

[0041] Em algumas modalidades, a determinação do estado de metilação do gene Septina 9 e do estado de metilação de um gene marcador adicional é realizada por qualquer método adequado. Estão disponíveis numerosos métodos para a detecção de DNA diferentemente metilado em lócus específicos tanto em amostras de tecido primário quanto em amostras de paciente como sangue, urina, fezes ou saliva (analisado em Kristensen e Hansen, Clin. Chem. 55: 1471 -83, 2009; Ammerpohl et al., Biochim Biophys Acta. 1790:847-62, 2009; Shames et al., Cancer Lett. 251: 187-98, 2007; Clark et al., Nat. Protoc. 1:2353-64, 2006). Em algumas modalidades, a análise do estado de metilação é realizada por pelo menos um dentre amplificação, método de PCR , amplificação isotérmica, método de NASBA, método de LCR, amplificação específica de metilação, PCR específica de metilação , MSP aninhada, Heavy-Methyl™, sequenciamento de bissulfito, detecção por meio de arranjos de DNA, detecção por microarranjos de oligonucleotídeos, detecção por meio de microarranjos de ilhas CpG, detecção por meio de enzimas de restrição, o método COBRA Bissulfi, PCR em tempo real, PCR em tempo real HeavyMethyl™, MSP MethyLight™, MethyLight™ Algo™, o método QM, Headloop MethyLight™, HeavyMethyl™ MethyLight™, HeavyMethyl™ Scorpion™, MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão com iniciador sensível à metilação e MS-SNuPE . Técnicas adicionais usadas para avaliar os níveis de metilação de DNA incluem, Restriction Landmark Genomic Scanning for Methylation (RLGS-M), análise Comprehensive High-Throughput Relative Methylation (CHARM), imunoprecipitação de DNA metilado, análise com enzima de restrição específica de metilação, e pirossequenciamento quantitativo de bissulfito. (Vide, por exemplo, a Publicação PCT N° WO2012/034170, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência).

[0042] Em determinadas modalidades, a presente invenção fornece kits para detectar a presença de um neoplasma colorretal. Em algumas modalidades, tais kit incluem reagentes úteis, suficientes, ou necessários para detectar e/ou caracterizar um ou mais genes marcadores metilados específicos para um neoplasma colorretal, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, os kits contêm os reagentes necessários para detectar o estado de metilação dos genes marcadores metilados, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, os kits contêm os ingredientes e reagentes necessários para obter e armazenar uma amostra biológica de um indivíduo.

EXEMPLOS Detecção de marcador metilado por PCR em tempo real

[0043] O plasma foi separado de todo o sangue obtido de um paciente e congelado. O ácido nucleico total foi extraído do plasma usando uma tecnologia de glóbulos magnéticos e purificado com a utilização da plataforma QIAsymphony.

[0044] O kit Zymo Research EZ-96 DNA Methylation-Direct™ foi usado para a conversão do ácido nucleico em bissulfito. Este kit é também usado para limpeza e concentração do ácido nucleico após a conversão.

[0045] Quando presentes, DNAs Septina 9, IKZF1, e BCAT1 metilados foram amplificados e detectados com sondas TaqMan e iniciadores específicos para metilação e conversão em bissulfito, usando o instrumento Viia 7 (Life Technologies). A amplificação e a detecção de beta-actina (ACTB) foram usadas como um controle interno para a presença de DNA amplificável; a sonda e os iniciadores ACTB são específicos para a sequência de beta-actina convertida por bissulfito. SEQ ID NO: 1 [iniciador direto de Septina 9] TGT TTT TCG CGC GAT TC SEQ ID NO: 2 [iniciador reverso de Septina 9] CAC CCA CCT TCG AAA TCC G SEQ ID NO: 3 [sonda de Septina 9] FAM-CGG TTA ACG CGT AGT TGG ATG GGA TTA BHQ1 SEQ ID NO: 4 [iniciador direto de IKZF1] GAC GAC GTA TTT TTT TCG TGT TTC G SEQ ID NO: 5 [iniciador reverso de IKZF1] GCG CAC CTC TCG ACC G SEQ ID NO: 6* [sonda de IKZF1] CY5-TTT GTA TCG GAG TAG CGA TTC G-BHQ2 SEQ ID NO:7 [iniciador direto de BCAT1] GTT TTT TTG TTG ATG TAA TTC GTT AGG TC SEQ ID NO:8 [iniciador reverso de BCAT1] CAA TAC CCG AAA CGA CGA CG SEQ ID NO: 9 [sonda de BCAT1] HEX-CGT CGC GAG AGG GTC GGT T-BHQ2 SEQ ID NO:10 [iniciador direto de ACTB] GTG ATG GAG GAG GTT TAG TAA GTT SEQ ID NO:11 [iniciador reverso de ACTB] AAT TAC AAA AAC CACA AC CTA ATA AA SEQ ID NO: 12 [sonda de ACTB] FAM-ACC ACC ACC CAA CAC ACA ATA ACA AA CACA BHQ1 *As bases sublinhadas são bases de LNA.

[0046] Para propósitos de controle de qualidade, quatro protocolos diferentes foram usados. Para controles positivos, foram geradas uma amostra de controle “positiva alta” ou “2 ng/mL” e uma amostra de controle “positiva baixa” ou “0,2 ng/mL”. Para cada um dos controles positivos, o DNA genômico humano enzimaticamente metilado foi adicionado a um plasma humano normal combinado para uma concentração final conforme indicada (tanto 2 ng/mL quanto 0,2 ng/mL). Um controle “negativo para marcador” foi gerado a partir da adição de DNA genômico de controle não metilado ao plasma normal combinado para uma concentração de 10 ng/mL. Finalmente, o controle em branco de extração de PBS 1X foi utilizado.

Claims

1. Método para triagem de um neoplasma colorretal em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: ensaiar uma amostra biológica do indivíduo através da detecção do estado de metilação do: (a) gene Septina 9; e (b) pelo menos um gene marcador adicional dentro da amostra biológica selecionado a partir do gene dedo de zinco da família Ikaros 1 (IKZF1) e o gene aminotransferase de cadeia ramificada 1 (BCAT1), em que a metilação de Septina 9 e o um gene marcador adicional é indicativo de um neoplasma colorrectal no indivíduo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ensaiar uma amostra biológica compreende determinar o estado de metilação do gene Septina 9, do gene IKZF1 e do gene BCAT1.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que determinar o estado de metilação do gene Septina 9 e o estado de metilação de um gene marcador adicional compreende pelo menos um de amplificação, método de PCR, amplificação isotérmica, método NASBA, método de LCR, amplificação específica de metilação, PCR específica de metilação (MSP), MSP aninhado, Heavy-Methyl™, sequenciamento de bissulfito, detecção por meio de matrizes de DNA, detecção por meio de micromatrizes de oligonucleotídeos, detecção por meio de micromatrizes de ilha de CpG, detecção por meio de enzimas de restrição, o método COBRA, PCR em tempo real, PCR em tempo real HeavyMethyl™, MSP MethyLight™, MethyLight™ Algo™, o método QM, Headloop MethyLight™, HeavyMethyl™ MethyLight™, HeavyMethyl™ Scorpion™, MSP Scorpion™, método Headloop Scorpion™, extensão de iniciador sensível à metilação e MS-SNuPE (Extensão de Iniciador de Nucleotideo Único Sensível à Metilação).

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue ou plasma, uma amostra de fezes, lavagem de enema, seção cirúrgica ou biópsia de tecido.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que neoplasma é um câncer ou um adenoma.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o neoplasma é pré-canceroso.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é humano.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende DNA genômico.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende DNA livre de célula.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) tratar DNA de uma amostra biológica com um ou mais reagentes capazes de converter bases de citosina não metiladas em uracilo sulfonato ou em outra base tendo um comportamento de ligação diferente da citosina enquanto deixa a citosina metilada não afectada; e b) amplificar o DNA tratado por meio de: i) um iniciador específico para um gene Septina 9, e ii) um iniciador específico para um gene IZKF1 ou BCAT1; e c) detectar o DNA amplificado.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende amplificar o DNA tratado por meio de: i) um iniciador específico para um gene Septina 9; ii) um iniciador específico para um gene IZKF1; e iii) um iniciador específico para um gene BCAT1.

12. Método para análise de metilação de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: a) tratar DNA de uma amostra biológica com um ou mais reagentes capazes de converter bases de citosina não metiladas em uracilo sulfonato; e b) amplificar o DNA tratado por meios consistindo de i) um par de oligonucleotídeos específicos para um gene Septina 9 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; e variantes das mesmas; ii) um par de oligonucleotídeos selecionados a partir de um par de oligonucleotídeos específicos para um gene IKZF1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas, ou um par de oligonucleotídeos específicos para o gene BCAT1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas; e iii) opcionalmente um oligonucleotídeo selecionado dentre SEQ ID NO:3 específica para um gene Septina 9, SEQ ID NO:6 específica para um gene IKZF1, e SEQ ID NO: 9 específica para um gene BCAT1 e variantes de cada uma das mesmas; e c) detectar o DNA amplificado; e em que uma variante é um oligonucleotídeo que hibridiza para substancialmente a mesma região dos genes da Septina 9, IKZF1, ou BCAT1 sob condições de hibridização estringentes.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o DNA tratado é amplificado por meios de: um par de oligonucleotídeos específicos para um gene Septina 9 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; um par de oligonucleotídeos específicos para um gene IKZF1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; e um par de oligonucleotídeos específicos para um gene BCAT1 compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 7 e 8, e variantes das mesmas.

14. Composição de oligonucleotídeos para uso no método como definido na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende: i) um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 2; e variantes das mesmas; ii) um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em: 1) SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; ou 2) SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas; e iii) opcionalmente um oligonucleotídeo selecionado de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 e combinações das mesmas; em que uma variante é um oligonucleotídeo que hibridiza para substancialmente a mesma região do gene Septina 9, IKZF1, ou BCAT1 sob condições de hibridização estringentes.

15. Composição de oligonucleotídeos de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um par de oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 4 e 5, e variantes das mesmas; e um par de nucleotídeos compreendendo ou consistindo em SEQ ID NOs: 7 e 8, e variantes das mesmas.