KR20170052532A

KR20170052532A - 결장직장암에 대한 메틸화된 마커

Info

Publication number: KR20170052532A
Application number: KR1020167036727A
Authority: KR
Inventors: 수잔 페더슨; 로렌스 라포인테; 로한 베이커; 앰버 씨. 도나휴; 옌-린 펭; 프레데릭 월드만
Original assignee: 퀘스트 다이어그노스틱스 인베스트먼츠 인코포레이티드; 클리니칼 게노믹스 피티와이. 엘티디.
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2017-05-12
Also published as: MX370850B; NZ727493A; US20230212685A1; PH12016502417A1; EP3152333A2; AU2015271697B2; IL280521B; IL280521A; JP2020191876A; CN106574303A; KR102587812B1; EP3152333A4; EP3152333B1; BR112016028521A2; US20170191135A1; WO2015187823A2; JP6722659B2; CA2951141C; IL249365B; JP2017516504A

Abstract

본원에서는 그의 메틸화 패턴이 결장직장 신생물 사이의 개선된 검출 및 식별에 유용성을 가지는 것인 게놈 서열의 조합을 개시한다. 본원에서는 결장직장 신생물 사이의 검출 또는 식별을 위한 방법, 핵산 및 키트를 추가로 개시한다.

Description

결장직장암에 대한 메틸화된 마커 {METHYLATED MARKERS FOR COLORECTAL CANCER}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2014년 6월 4일 출원된 미국 가출원 번호 62/007,687의 이점을 주장하고, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

결장직장암 (CRC)은 서방세계에서 세 번째로 흔한 암 형태이며, 암 관련 사망의 두번째로 주된 원인이다. 결장직장암은 그의 자연적 진화 (대부분의 환자에서 선암종으로의 이행이 발생하는 것으로 간주된다) 및 비-수술적 방법에 의한 접근가능성으로 인해 조기 검출 및 예방에 적합하다.

조기 검출은 CRC의 치유 기회를 크게 개선시킨다. 결장경 검사는 극도로 특이적이고 감수성인 검사이지만, 장 준비와 환자의 협조가 요구되는 침습적인 검사이다. 또한, 심각한 합병증의 부차적 위험성과도 연관이 있으며, 이로써 그의 일반적인 사용은 감소된다. 고감수성으로 및 탁월한 특이성으로 결장의 전암성 및 악성 종양성 신생물성 변경을 검출할 수 있는 비-침습적 검출이 요구되고 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서는 대상체로부터의 생물학적 샘플 내의 셉틴(Septin) 9 유전자의 메틸화 상태 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화 상태를 측정함으로써 상기 생물학적 샘플을 검정하는 단계로서, 여기서 하나의 추가적 마커 유전자는 이카로스(Ikaros) 패밀리 아연-핑거 1 (IKZF1) 유전자 및 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 1 (BCAT1) 유전자로부터 선택되고, 여기서 셉틴 9 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화가 대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 나타내는 것인, 대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 스크리닝하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플을 검정하는 단계는 셉틴 9 유전자, IKZF1 유전자, 및 BCAT1 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 셉틴 9 유전자의 메틸화 상태 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것은 증폭, PCR 방법, 등온 증폭, NASBA 방법, LCR 방법, 메틸화 특이 증폭, 메틸화 특이 PCR (MSP), 네스티드 MSP, 헤비-메틸™(Heavy-Methyl™), 비술파이트 서열분석, DNA 어레이에 의한 검출, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 의한 검출, CpG-아일랜드-마이크로어레이에 의한 검출, 제한 효소에 의한 검출, COBRA 방법, 실시간 PCR, 헤비메틸™ 실시간 PCR, MSP 메틸라이트™(MethyLight™), 메틸라이트™ 알고™(MethyLight™ Algo™), QM 방법, 헤드루프 메틸라이트™(Headloop MethyLight™), 헤비메틸™ 메틸라이트™, 헤비메틸™ 스코피온™(HeavyMethyl™ Scorpion™), MSP 스코피온™, 헤드루프 스코피온™ 방법, 메틸화 감수성 프라이머 연장, 및 MS-SNuPE (메틸화-감수성 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대변 샘플, 관장 세척액, 수술 절편 또는 조직 생검이다. 일부 실시양태에서, 신생물은 암이다. 일부 실시양태에서, 신생물은 선종이다. 일부 실시양태에서, 신생물은 전암성이다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 게놈 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 무세포 DNA를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에서는 a) 생물학적 샘플로부터의 DNA를, 메틸화된 시토신에는 영향을 주지 않고 그대로 두면서, 비메틸화된 시토신 염기를 우라실 술포네이트로, 또는 시토신과는 다른 결합 거동을 가지는 또 다른 염기로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계; 및 b) 처리된 DNA를 i) 셉틴 9 유전자에 특이적인 프라이머; ii) IZKF1 또는 BCAT1 유전자에 특이적인 프라이머에 의해 증폭시키는 단계; 및 c) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, DNA의 메틸화 분석 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 처리된 것을 i) 셉틴 9 유전자에 특이적인 프라이머; ii) IZKF1 유전자에 특이적인 프라이머; 및 iii) BCAT1 유전자에 특이적인 프라이머에 의해 증폭시키는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에서는 a) 생물학적 샘플로부터의 DNA를, 비메틸화된 시토신 염기를 우라실 술포네이트로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계; 및 b) 처리된 DNA를 i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 및 2; 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; ii) 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 또는 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 iii) 임의로, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 및 서열식별번호: 9 및 그의 변이체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드에 의해 증폭시키는 단계; 및 c) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, DNA의 메틸화 분석 방법을 개시한다.

일부 실시양태에서, 본원에서는 i) 서열식별번호: 1 및 2; 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; ii) 1) 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체; 또는 2) 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 iii) 임의로, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 9 및 그의 조합으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 뉴클레오티드 쌍을 포함한다.

도 1은 셉틴 9, IKZF1, 및 BCAT1 메틸화 마커 단독 및 조합의 감수성 및 특이성을 예시한 것이다. IKZF1 및 BCAT1을 셉틴 9에 첨가하였을 때, 20건의 추가 사례가 포착되었다 (감수성 10% 증가).
도 2는 결장직장암 병기에 의한 셉틴 9, IKZF1, 및 BCAT1 메틸화 마커 단독 또는 조합의 감수성을 예시한 것이다. IKZF1 및 BCAT1을 셉틴 9에 첨가하였을 때, 추가로 13건의 II기 사례 및 6건의 III기 사례가 포착되었으며, 이는 좀 더 빠른 병기의 암 검출을 개선시킨다.
도 3은 결장직장암 병기에 의해 결장직장암을 검출할 때 (절대 개수 (3a) 및 전체 중의 퍼센트 (3b)) 셉틴 9, IKZF1, 및 BCAT1 메틸화 마커 단독 또는 조합의 감수성을 예시한 것이다.
도 4는 ≥1개의 웰, ≥ 2개의 웰, 및 ≥ 3개의 웰을 사용하여 결장직장암을 검출할 때 셉틴 9, IKZF1, 및 BCAT1 메틸화 마커 단독 및 조합의 감수성 및 특이성을 예시한 것이다.
도 5는 결장직장암을 검출할 때 다양한 프로토콜 사이의 성능 차이를 예시한 것이다.

본원에서는 결장직장 신생물의 검출을 위한 방법, 프라이머, 시약 및 키트를 기술한다.

본 개시내용의 이해를 돕기 위해, 다수의 용어 및 어구를 하기에서 정의한다.

본원에서 사용되는 바, 달리 명시되지 않는 한, 수치 값을 언급할 때, "약"이라는 용어는 열거된 값의 ±10%를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "증폭" 또는 "증폭시키다"라는 용어는 표적 핵산을 카피하여 선택된 핵산 서열의 카피 개수를 증가시키는 방법을 포함한다. 증폭은 기하급수적 또는 선형 증폭일 수 있다. 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 방식으로 증폭된 서열은 "앰플리콘"으로도 공지된, "증폭 생성물"을 형성한다. 본원 이하에서 기술되는 예시적인 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하는 증폭에 관한 것이지만, 핵산을 증폭시키는 다수의 다른 방법 (예컨대, 등온 방법, 롤링 서클 등)도 공지되어 있다. 이들 다른 방법이 PCR 방법을 대신하여, 또는 그와 함께 사용될 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 예컨대, 문헌 [Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp. 13-20]; [Wharamet al., Nucleic Acids Res., 29(11):E54-E54, 2001]; [Hafneret al., Biotechniques, 30(4):852-56, 858, 860, 2001]; [Zhonget al., Biotechniques, 30(4):852-6, 858, 860, 2001]을 참조할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의 조합으로 이루어진 짧은 중합체를 의미한다. 올리고뉴클레오티드 길이는 일반적으로 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 또는 30개 뉴클레오티드 (nt) 내지 약 150 nt 길이, 더욱 바람직하게, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 또는 30 nt 내지 약 70 nt 길이이다.

본원에서 사용되는 바, "프라이머"는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고, DNA 또는 RNA 폴리머라제의 존재하에서 프라이머의 3' 단부에의 뉴클레오티드의 부가를 유도하는 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머의 3' 단부는 일반적으로 최적의 연장 및/또는 증폭을 위해 상응하는 뉴클레오티드 위치에서 표적 서열과 동일하여야 한다. "프라이머"라는 용어는 펩티드 핵산 프라이머, 잠금 핵산 (LNA) 프라이머, 포스포로티오에이트 변형된 프라이머, 표지된 프라이머 등을 비롯한, 합성될 수 있는 모든 형태의 프라이머를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "정방향 프라이머"는 DNA의 안티센스 가닥에 상보적인 프라이머이다. "역방향 프라이머"는 DNA의 센스 가닥에 상보적이다.

표적 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 프로브 또는 프라이머)는 적합한 조건하에서 표적 핵산에 "하이브리드화"할 것이다. 본원에서 사용되는 바, "하이브리드화" 또는 "하이브리드화하는"이란, 정의된 하이브리드화 조건하에서 올리고뉴클레오티드 단일 가닥이 염기쌍 형성을 통해 상보적인 가닥과 어닐링하는 프로세스를 의미한다. 이는 상보적인 두 폴리뉴클레오티드 사이의 특이적인, 즉, 비-무작위적인 상호작용이다. 하이브리드화, 및 하이브리드화 강도 (즉, 핵산 사이의 회합 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도, 관여하는 조건의 엄격도, 및 형성된 하이브리드의 T_m과 같은 인자에 의해 영향을 받는다.

본원에서 사용되는 바, 올리고뉴클레오티드가 관심 표적에는 하이브리드화할 수 있지만, 실질적으로 관심 대상이 아닌 핵산에는 하이브리드화하지 않는다면, 이는 핵산에 "특이적인" 것이다. 고수준의 서열 동일성이 바람직하며, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 및 더욱 바람직하게는, 98% 이상의 서열 동일성을 포함한다. 서열 동일성은 관련 기술분야에 널리 공지된 알고리즘 (예컨대, BLAST)을 이용하는 디폴트 설정 환경과 함께 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머)의 "변이체"는 특정 올리고뉴클레오티드와 길이가 유사하고 (5개 이내의 뉴클레오티드 길이), 특정 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 영역에 하이브리드화한다. 한 실시양태에서, 변이체 올리고뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 특정 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화한다. 엄격한 하이브리드화 조건은 일반적으로 비교적 높은 어닐링 온도 (예컨대, ~60-63℃)를 포함하는데, 이는 변이체 올리고뉴클레오티드의 그의 표적에의 결합을 선호할 것이며, 변이체 올리고뉴클레오티드가 잠시 결합해 있을 수 있는 임의의 오프-타겟 서열로부터 변이체 올리고뉴클레오티드를 해리시킬 것이다.

"관심 영역"이라는 용어는 서열분석하고자 하는 핵산 영역을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "생물학적 샘플"이라는 용어는 관심 핵산을 함유하는 샘플을 의미한다. 생물학적 샘플은 임상적 샘플 (즉, 환자로부터 직접 수득된 것) 또는 단리된 핵산을 포함할 수 있고, 세포성 또는 무세포성 유체 및/또는 조직 (예컨대, 생검) 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터 수집된 조직 또는 체액으로부터 수득된다. 샘플 공급원으로는 (프로세싱된 또는 프로세싱되지 않은) 가래, 기관지 폐포 세척액 (BAL), 기관지 세척액 (BW), 전혈 또는 임의 유형의 단리된 혈액 세포 (예컨대, 림프구), 체액, 뇌척수액 (CSF), 소변, 혈장, 혈청, 또는 조직 (예컨대, 생검 물질)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 시험 샘플 및 참조 샘플을 수득하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 흡인물, 조직 절편, 혈액 또는 다른 유체 채취, 수술적 또는 바늘 생검, 파라핀 포매된 조직 수집, 체액 수집, 대변 수집 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 관련하여, 생물학적 샘플은 바람직하게 혈액, 혈청 또는 혈장이다.

본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 포유동물, 예컨대, 인간이지만, 이는 또한 예컨대, 가축 (예컨대, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예컨대, 소, 양, 돼지, 말 등), 또는 실험용 동물 (예컨대, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등)과 같은 또 다른 동물일 수 있다. "환자"라는 용어는 관심 유전적 다형태를 가지거나, 가지는 것으로 의심되는 "대상체"를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "I기 암," "II기 암," "III기 암," 및 "IV기"라는 용어는 암에 대한 TNM 병기 분류를 의미한다. I기 암은 전형적으로 원발성 종양이 기점이 되는 기관으로 한정되어 있는 것으로 확인되는 것이다. II기는 종양이 결장의 근육 벽을 통해 확산된 것을 의미하는 것이다. III기는 종양이 림프절로 확산된 것을 의미하는 것이다. IV기는 원발성 종양이 다른 기관으로 확산된 것을 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "메틸화 상태"는 관심 유전자 중 (CpG 쌍에서 발견되는) 시토신 잔기의 메틸화 수준을 의미한다. CpG 부위를 참조하여 사용될 때, 메틸화 상태는 메틸화된 상태 또는 비메틸화된 상태일 수 있다. 관심 유전자의 메틸화 수준은 임의의 적합한 수단에 의해 측정된다.

메틸화 분석

일부 실시양태에서, 본원에서는 대상체로부터의 생물학적 샘플 내의 셉틴 9 유전자의 메틸화 상태 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화 상태를 측정함으로써 상기 생물학적 샘플을 검정하는 단계로서, 여기서 하나의 추가적 마커 유전자는 이카로스 패밀리 아연-핑거 1 (IKZF1) 유전자 및 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 1 (BCAT1) 유전자로부터 선택되고, 여기서 셉틴 9 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화가 대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 나타내는 것인, 대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 스크리닝하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플을 검정하는 단계는 셉틴 9 유전자, IKZF1 유전자, 및 BCAT1 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것을 포함한다.

셉틴 9

(MLL 셉틴-유사 융합 단백질, MLL 셉틴-유사 융합 단백질 MSF-A, 시파(Sipa), 이셉틴(Eseptin), Msf, 셉틴-유사 단백질 난소/유방 셉틴 (Ov/Br 셉틴) 및 셉틴 D1로도 또한 공지되어 있는) 인간 셉틴 9 유전자는 셉틴 유전자 패밀리의 구성원이다. 셉틴 유전자 패밀리의 구성원은 소포 수송에서부터 세포질분열에 이르는 다중의 세포 기능과 연관이 있는 것으로 여겨져 왔다. 셉틴 9 유전자는 4개의 전사체 변이체인, 셉틴 9 변이체 및 Q9HC74 변이체 (이는 셉틴 9 전사체의 말단절단된 버전이다)를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 셉틴 9 및 Q9HC74 전사체는 각각 CpG 풍부한 프로모터 영역을 포함한다. 셉틴 9의 작용을 파괴하면, 세포 분열은 완결되지 못하게 되고, 셉틴 9는 프로토온코진 MLL의 융합 파트너인 것으로 밝혀졌으며, 이는 종양 발생에서 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.

IZKF1

인간 이카로스 패밀리 아연 핑거 단백질 1 (IZKF1) 유전자는 또한 DNA 결합 단백질 이카로스를 코딩하는 유전자로도 알려져 있다. IZKF1 단백질은 주된 종양 억제인자인 것으로 밝혀져 있으며, 그의 기능 상실이 림프성 백혈병과 연관되어져 왔다. IKZF1은 과립구, B 세포, T 세포 및 자연살 세포에서 상향조절되고, 적혈구모세포, 거핵구 및 단핵구에서 하향조절되는 것으로 알려져 있다.

BCAT1

인간 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 1 (BCAT1) 유전자는 분지쇄 아미노산, 예컨대, 류신, 이소류신, 및 발린의 대사에서 제1 단계의 촉매화를 담당하는 효소를 코딩한다. BCAT1의 발현은 제한되어 있으며, 이는 오직 특정 조직, 예컨대, 배아 조직에서, 성인 뇌, 난소, 및 태반에서만 발견이 되는 것으로 사료된다. BCAT1 유전자의 발현은 효모에서는 증식과, 및 인간 암에서는 전이성 잠재능 증가와 연관되어져 왔다.

일부 실시양태에서, 추가 유전자가 메틸화 상태에 대하여 분석된다. 일부 실시양태에서, IRF4, GRASP, CAHM , VIM1, TMEFF2, SOX21, SLC5A15, NPY. ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2, 및 SDC2로부터 선택되는 추가 유전자가 메틸화 상태에 대하여 분석된다.

일부 실시양태에서, 본원에서는 a) 생물학적 샘플로부터의 DNA를, 비메틸화된 시토신 염기를 우라실 술포네이트로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계; 및 b) 처리된 DNA를 i) 서열식별번호: 1 및 2; 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; ii) 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 또는 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 iii) 임의로, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 및 서열식별번호: 9 및 그의 변이체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드에 의해 증폭시키는 단계; 및 c) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, DNA의 메틸화 분석 방법을 개시한다.

일부 실시양태에서, 본원에서는 본질적으로 i) 서열식별번호: 1 및 2; 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; ii) 1) 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체; 또는 2) 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 iii) 임의로, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 9 및 그의 조합으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 뉴클레오티드 쌍을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 결장직장 신생물을 검출하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 결장직장 신생물은 전암성이다. 일부 실시양태에서, 결장직장 신생물은 악성 종양성이다. 일부 실시양태에서, 결장직장 신생물은 암의 병기 (예컨대, I기, II기, III기, 또는 IV기)와 상관없이 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 I기 암이다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 II기 암이다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 III기 암이다. 일부 실시양태에서, 결장직장암은 IV기 암이다. 일부 실시양태에서, 결장직장 신생물은 선종의 크기와 상관없이 선종이다 (예컨대, 3 cm 초과; 3 cm 이하; 1 cm 초과; 1 cm 이하). 일부 실시양태에서, 선종은 진행성 선종인 것으로 간주된다.

결장직장 신생물을 검출하는 일부 실시양태에서, 결장직장 신생물을 특징화하는 데 (예컨대, 결장직장 신생물을 악성 종양성인 것으로 또는 전암성인 것으로 특징화하는 데) (예컨대, 결장직장 신생물을 결장직장암의 특정 병기 내에서 특징화하는 데) 추가 기법이 수행된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 시간 경과에 따라 메틸화 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 방법은 매월, 매 6개월마다, 매년, 매 2년마다, 매 3년마다, 매 4년마다, 매 5년마다, 또는 그보다 긴 간격을 두고 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 결장직장 신생물의 치료를 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 방법은 치료 성공을 모니터링하기 위해 치료 직전, 그 동안 및/또는 그 이후에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 치료 성공을 확실하게 하기 위해 또는 그를 모니터링하기 위해 무질환 환자에서 일정한 간격을 두고 수행된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 결장직장 신생물의 발생에 대한 대상체의 위험 프로파일을 수득하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대변 샘플, 관장 세척액, 수술 절편 또는 조직 생검이다. 일부 실시양태에서, 신생물은 암이다. 일부 실시양태에서, 신생물은 선종이다. 일부 실시양태에서, 신생물은 전암성이다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 게놈 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 무세포 DNA를 포함한다.

메틸화 검출 방법

일부 실시양태에서, 셉틴 9 유전자의 메틸화 상태 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것은 임의의 적합한 방법에 의해 수행된다. 1차 조직 샘플 중 또는 환자 샘플, 예컨대, 혈액, 소변, 대변, 또는 타액 중 특정 유전자좌에서 차별적으로 메틸화된 DNA를 검출하는 데 다수의 방법이 이용가능하다 (문헌 [Kristensen and Hansen Clin Chem . 55: 1471-83, 2009]; [Ammerpohl et al. Biochim Biophys Acta . 1790:847-62, 2009]; [Shames et al. Cancer Lett. 251: 187-98, 2007]; [Clark et al. Nat Protoc. 1 :2353-64, 2006] 리뷰). 일부 실시양태에서, 메틸화 상태 분석은 증폭, PCR 방법, 등온 증폭, NASBA 방법, LCR 방법, 메틸화 특이 증폭, 메틸화 특이 PCR (MSP), 네스티드 MSP, 헤비-메틸™, 비술파이트 서열분석, DNA 어레이에 의한 검출, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 의한 검출, CpG-아일랜드-마이크로어레이에 의한 검출, 제한 효소에 의한 검출, COBRA 방법, 실시간 PCR, 헤비메틸™ 실시간 PCR, MSP 메틸라이트™, 메틸라이트™ 알고™, QM 방법, 헤드루프 메틸라이트™, 헤비메틸™ 메틸라이트™, 헤비메틸™ 스코피온™, MSP 스코피온™, 헤드루프 스코피온™ 방법, 메틸화 감수성 프라이머 연장, 및 MS-SNuPE (메틸화-감수성 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장) 중 적어도 하나에 의해 달성된다. DNA 메틸화 수준을 평가하는 데 사용되는 추가 기술로는 메틸화에 대한 제한 랜드마크 게놈 스캐닝(Restriction Landmark Genomic Scanning for Methylation: RLGS-M), 종합 고처리량 상대 메틸화(comprehensive high-throughput relative methylation: CHARM) 분석, 메틸화된 DNA 면역침강, 메틸화 특이 제한 효소 분석, 및 정량적 비술파이트 피로시퀀싱를 포함한다 (예컨대, PCT 공개 번호 WO2012/034170 참조 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).

특정 실시양태에서, 본 발명은 결장직장 신생물의 존재 검출용 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같이, 결장직장 신생물에 특이적인 하나 이상의 메틸화된 마커 유전자를 검출 및/또는 특징화하는 데 유용하거나, 충분하거나, 또는 필요한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 바와 같이, 메틸화된 마커 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 데 필요한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 수득 및 보관하는 데 필요한 성분 및 시약을 포함한다.

실시예

실시간 PCR에 의한 메틸화된 마커 검출

환자로부터 수득된 전혈로부터 혈장을 분리하고, 냉동시켰다. 자기 비드 기술을 사용하여 혈장으로부터 전체 핵산을 추출하고, QIA심포니(QIAsymphony) 플랫폼을 사용하여 정제하였다.

핵산의 비술파이트 전환을 위해 지모 리서치 EZ-96 DNA 메틸화-디렉트(Zymo Research EZ-96 DNA methylation-Direct) 키트를 사용하였다. 상기 키트는 또한 전환 이후의 핵산의 세정 및 농축에도 사용된다.

존재할 경우, 메틸화된 셉틴 9, IKZF1, 및 BCAT1 DNA를 증폭시키고, 비이아 7(Viia 7) 장치 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))를 이용하여 하기 제시되는 바와 같은 메틸화 및 비술파이트 전환 특이 프라이머 및 택맨(TaqMan) 프로브를 이용하여 검출하였다. 증폭가능한 DNA의 존재에 대한 내부 대조군으로서 벡타-액틴 (ACTB)의 증폭 및 검출을 사용하였고; ACTB 프라이머 및 프로브는 비술파이트 전환된 베타-액틴 서열에 특이적이다.

서열식별번호: 1 [셉틴 9 정방향 프라이머] TGT TTT TCG CGC GAT TC

서열식별번호: 2 [셉틴 9 역방향 프라이머] CAC CCA CCT TCG AAA TCC G

서열식별번호: 3 [셉틴 9 프로브] FAM-CGG TTA ACG CGT AGT TGG ATG GGA TTA BHQ1

서열식별번호: 4 [IKZF1 정방향 프라이머] GAC GAC GTA TTT TTT TCG TGT TTC G

서열식별번호: 5 [IKZF1 역방향 프라이머] GCG CAC CTC TCG ACC G

서열식별번호: 6* [IKZF1 프로브] CY5-TTT GTA TCG GAG TAG CGA TTC G-BHQ2

서열식별번호: 7 [BCAT1 정방향 프라이머] GTT TTT TTG TTG ATG TAA TTC GTT AGG TC

서열식별번호: 8 [BCAT1 역방향 프라이머] CAA TAC CCG AAA CGA CGA CG

서열식별번호: 9 [BCAT1 프로브] HEX-CGT CGC GAG AGG GTC GGT T-BHQ2

서열식별번호: 10 [ACTB 정방향 프라이머] GTG ATG GAG GAG GTT TAG TAA GTT

서열식별번호: 11 [ACTB 역방향 프라이머] AAT TAC AAA AAC CACA AC CTA ATA AA

서열식별번호: 12 [ACTB 프로브] FAM-ACC ACC ACC CAA CAC ACA ATA ACA AA CACA BHQ1

* 밑줄 표시된 염기는 LNA 염기이다.

품질 관리 목적으로, 4개의 상이한 대조군을 사용하였다. 양성 대조군의 경우, "고 양성" 또는 "2 ng/mL," 및 "저 양성" 또는 "0.2 ng/ml"인 대조군 샘플을 생성하였다. 양성 대조군 각각에 대해 효소적으로 메틸화된 인간 게놈 DNA를 풀링된 정상적인 인간 혈장에 스파이킹하여 명시된 바와 같은 최종 농도 (2 ng/mL 또는 0.2 ng/mL)를 가지도록 만들었다. 10 ng/ml 농도로 풀링된 정상적인 혈장에 스파이킹된 비메틸화된 대조군 게놈 DNA로부터 "마커-음성" 대조군을 생성하였다. 마지막으로, 1X PBS의 추출 블랭크 대조군을 사용하였다.

SEQUENCE LISTING <110> QUEST DIAGNOSTICS INVESTMENTS INCORPORATED CLINICAL GENOMICS PTY LTD <120> METHYLATED MARKERS FOR COLORECTAL CANCER <130> 034827-0804 <140> PCT/US2015/033968 <141> 2015-06-03 <150> 62/007,687 <151> 2014-06-04 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 tgtttttcgc gcgattc 17 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 cacccacctt cgaaatccg 19 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 3 cggttaacgc gtagttggat gggatta 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gacgacgtat ttttttcgtg tttcg 25 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 gcgcacctct cgaccg 16 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 6 tttgtatcgg agtagcgatt cg 22 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 gtttttttgt tgatgtaatt cgttaggtc 29 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 caatacccga aacgacgacg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 9 cgtcgcgaga gggtcggtt 19 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 gtgatggagg aggtttagta agtt 24 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 aattacaaaa accacaacct aataaa 26 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 12 accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 스크리닝하는 방법이며,
대상체로부터의 생물학적 샘플 내의 셉틴(Septin) 9 유전자의 메틸화 상태 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화 상태를 검출함으로써 상기 생물학적 샘플을 검정하는 단계를 포함하고, 여기서 하나의 추가적 마커 유전자는 이카로스(Ikaros) 패밀리 아연-핑거 1 (IKZF1) 유전자 및 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 1 (BCAT1) 유전자로부터 선택되고, 여기서 셉틴 9 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화가 대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 나타내는 것인, 대상체에서 결장직장 신생물, 또는 결장직장 신생물이 발생할 수 있는 소인을 스크리닝하는 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플을 검정하는 단계가 셉틴 9 유전자, IKZF1 유전자, 및 BCAT1 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 셉틴 9 유전자의 메틸화 상태 및 하나의 추가적 마커 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것이 증폭, PCR 방법, 등온 증폭, NASBA 방법, LCR 방법, 메틸화 특이 증폭, 메틸화 특이 PCR (MSP), 네스티드 MSP, 헤비-메틸™(Heavy-Methyl™), 비술파이트 서열분석, DNA 어레이에 의한 검출, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 의한 검출, CpG-아일랜드-마이크로어레이에 의한 검출, 제한 효소에 의한 검출, COBRA 방법, 실시간 PCR, 헤비메틸™ 실시간 PCR, MSP 메틸라이트™(MethyLight™), 메틸라이트™ 알고™(MethyLight™ Algo™), QM 방법, 헤드루프 메틸라이트™(Headloop MethyLight™), 헤비메틸™ 메틸라이트™, 헤비메틸™ 스코피온™(HeavyMethyl™ Scorpion™), MSP 스코피온™, 헤드루프 스코피온™ 방법, 메틸화 감수성 프라이머 연장, 및 MS-SNuPE (메틸화-감수성 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장) 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 또는 혈장 샘플인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 대변 샘플, 관장 세척액, 수술 절편 또는 조직 생검인 방법.
제1항에 있어서, 신생물이 암인 방법.
제1항에 있어서, 신생물이 선종인 방법.
제1항에 있어서, 신생물이 전암성인 방법.
제1항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 게놈 DNA를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 무세포 DNA를 포함하는 것인 방법.
a) 생물학적 샘플로부터의 DNA를, 메틸화된 시토신에는 영향을 주지 않고 그대로 두면서, 비메틸화된 시토신 염기를 우라실 술포네이트로, 또는 시토신과는 다른 결합 거동을 가지는 또 다른 염기로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계; 및
b) 처리된 DNA를
i) 셉틴 9 유전자에 특이적인 프라이머;
ii) IZKF1 또는 BCAT1 유전자에 특이적인 프라이머에 의해 증폭시키는 단계; 및
c) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, DNA의 메틸화 분석 방법.
제12항에 있어서, 처리된 것을 i) 셉틴 9 유전자에 특이적인 프라이머; ii) IZKF1 유전자에 특이적인 프라이머; 및 iii) BCAT1 유전자에 특이적인 프라이머에 의해 증폭시키는 것을 포함하는 방법.
a) 생물학적 샘플로부터의 DNA를, 비메틸화된 시토신 염기를 우라실 술포네이트로 전환시킬 수 있는 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계; 및
b) 처리된 DNA를
i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 및 2; 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍;
ii) 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 또는 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및
iii) 임의로, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 및 서열식별번호: 9 및 그의 변이체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드에 의해 증폭시키는 단계; 및
c) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, DNA의 메틸화 분석 방법.
제14항에 있어서, 처리된 DNA를 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 및 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드에 의해 증폭시키는 것인 방법.
본질적으로
i) 서열식별번호: 1 및 2; 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍;
ii) 1) 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체; 또는 2) 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및
iii) 임의로, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 9 및 그의 조합으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드
를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 조성물.
제16항에 있어서, 서열식별번호: 4 및 5, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 올리고뉴클레오티드 쌍; 및 서열식별번호: 7 및 8, 및 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 올리고뉴클레오티드 조성물.