JP4312827B2 - ヒトのミューテーター遺伝子hMSH2及び遺伝性非ポリープ性大腸ガン - Google Patents
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Description
本出願は、1993年5月5日に出願されたシリアルナンバー08/056、546の一部継続出願である。
産業上の利用分野
本発明は、個人において大腸ガン及び他のガンの要因となる一つの遺伝子に関する。また、さらに本発明は、患者の治療のための薬剤を特定するのに利用できる、生物化学的な試験法にも関する。
従来の技術
HNPCC(リンチ症)は、ガンの素因となる症候のなかで最も一般的なものの一つであり、西洋会社では200人に1人もの個人が患者となる(Lynch et al.,1993)。患者は結腸、子宮内膜、卵巣及び他の器官に腫瘍を発生するが、これはしばしば50歳前に起こる。この疾病が家系性であることはほぼ一世紀前に分かっていたが(Warthin et al.,1913)、その原因作用における遺伝性の役割を定めることは困難であった(Lynch et al.,1966)。しかし最近、2つの大きな家系の連鎖解析によって、第2染色体上の多形性マーカーとの関係があることが示された(Peltomaki et al.,1993a)。他の家系の研究によって、HNPCC家系の大部分で、腫瘍形成が同じ染色体の2p遺伝子座と連関を持つことが示唆された(Aaltonen et al.,1993)。
HNPCCの臨床的な定義は、早期発症の大腸ガン及び他の特異的なガンが少なくとも2世代に渡って一親等の親戚に発生することである(Lynch et al.,1993)。その素因は、常染色体の優性遺伝である。当初、HNPCCの原因遺伝子はガン抑制遺伝子であると予想されていた。ガンの素因となり、この様な遺伝をするものとして以前に知られていた他の疾病は、抑制遺伝子の突然変異によって起こるからである(Knudson総説,1993)。しかし、HNPCCの患者の腫瘍の解析からは、異なる機構が示唆された。腫瘍発生の過程では、ガン抑制遺伝子をコードする遺伝子座の多くは体細胞から失われる(Stanbridge,1990)。それと対照的に、染色体の2p遺伝子座の対立遺伝子(アリル)はどちらもHNPCC腫瘍中で保持されていることがわかった(Aaltonen et al.,1993)。しかし、この第2染色体の欠失を調べたときに、HNPCC腫瘍では多数のマイクロサテライト配列が体細胞突然変異を受けているのが見られた。
ガン細胞のゲノムに広く見られる細かい変異は最初、不定プライマーPCR法を用いて散発性の大腸の腫瘍の一部に発見された(Peinado et al.,1992)。続いて、これらの変異はゲノムのポリA領域の最高4ベースの欠失を表していることがわかった(Ionov et al.,1993)。他の研究によって、散発性の腫瘍のこれとは別個の同様のサブグループが、様々の単純な反復配列、特に2塩基あるいは3塩基の反復から成るマイクロサテライト配列に挿入変異あるいは欠失変異を持つことが示された(Ionov et al.,1993; Thibodeau et al.,1993; Aaltonen et al.,1993)。興味深いことに、これらの散発性の腫瘍は、HNPCC家系に発生する腫瘍と、いくつかの特徴が共通である。例えば、結腸の右側部に現れる傾向及び細胞がほぼ2倍体である傾向などである。これらのデータ及び他のデータから、HNPCC及び散発性のガンは、マイクロサテライト配列の複製に誤りを起こさせる遺伝性の欠陥と関連を持つことが示唆された(Ionov et al.,1993; Aaltonen et al.,1993)。
この仮定された欠陥を引き起こす機構は、腫瘍細胞のDNAの研究からは解明できなかった。しかしより単純な生物の研究によって、興味深い可能性が提起された(Levinson and Gutman,1987; Strand et al.,1993)。その研究は、DNAミスマッチの修復遺伝子に欠陥を持つバクテリア及び酵母では、2塩基反復配列に不安定性が見られることを示したものである。主にDNA複製あるいはDNA組換えに関与する遺伝子を破壊しても、マイクロサテライト配列の複製の正確さには明らかな影響は見られなかった(Kunkel総説,1993)。これらの重要な研究によって、HNPCC患者の腫瘍のマイクロサテライト配列に変異が生じる原因は、DNAミスマッチの修復に欠陥があることであるということが示唆された(Strand et al.,1993)。
以上から、当該技術分野においては、遺伝性非ポリープ性大腸ガン、及び遺伝性及び散発性腫瘍のどちらにも見られる複製の誤りという表現型の原因である実際の遺伝子及びタンパク質を同定する必要がある。その遺伝子及びタンパク質を同定することで、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの現在よりもより幅広い診断上のスクリーニングが可能となるであろう。また関与する遺伝子及びタンパク質を同定することで、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの薬物治療に利用できる化合物を合理的にスクリーニングすることが可能となり、罹患した個人の遺伝子治療が可能となるであろう。
発明の概要
本発明の目的の一つは、変異を受けた時に遺伝性非ポリープ性大腸ガンの遺伝的な決定因子となるDNA分子を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、遺伝性非ポリープ性大腸ガンを引き起こす特異的な突然変異を持つ複数のDNA分子を提供することである。
さらに、本発明の目的は、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの素因を持つ個人を処置する方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、ガンの素因の決定方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの素因を持つ個人の処置に効果のある薬剤を同定するための、試験化合物のスクリーニングの方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、ヒトのDNAミスマッチ修復に重要なタンパク質を提供することである。
さらに、本発明の目的は、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの有り得る治療法を研究するための、遺伝子組換え動物を提供することである。
本発明の以上及び他の目的は、下に記載するいくつかの態様によって示している。本発明の態様の一つでは、単離され精製された1つのDNA分子を示す。この分子は、配列ID NO:1に示すように、hMSH2の配列を少なくとも約20ヌクレオチド持っている。
本発明のもう一つの態様では、単離され精製された1つのDNA分子を示す。このDNA分子は、腫瘍中に見いだされるhMSH2の1つの対立遺伝子(アリル)の配列を少なくとも約20ヌクレオチド持っており、そして上記のDNA分子は配列IDNO:1に示したhMSH2と比較して変異を持っている。
さらに本発明の一つの態様では、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの素因を持つ個人の1つの処置法を提供する。この方法によって、体細胞変異が阻害される。hMSH2の1つの対立遺伝子(アリル)に変異を持つ個人は遺伝性非ポリープ性大腸ガンに罹患しやすい。この方法の内容は、配列ID NO:1に示すように、hMSH2の配列を少なくとも約20ヌクレオチド持っているDNA分子を、hMSH2の1つの対立遺伝子(アリル)に変異を持つ個人に投与するものであり、そして上記のDNA分子はその個人のhMSH2の1つの対立遺伝子(アリル)の変異を修復するのに充分である。
さらに本発明の一つの態様では、ガンの素因を決定するための方法を提供する。この方法の内容は、ヒトの生体試料を検査してhMSH2遺伝子にhMSH2の発現またはhMSH2タンパク質の機能に影響するような変異が存在するか確かめるものである。このような変異が存在すれば、ガンの素因となり得る。
さらに本発明の一つの態様では、腫瘍を予防あるいは治療できる治療薬剤を同定するためのスクリーニングの方法を提供する。このスクリーニングの方法の内容は、試験化合物を精製したhMSH2タンパク質あるいは細胞と接触させ、hMSH2タンパク質あるいは細胞のDNAミスマッチ修復能を調べ、上記のhMSH2タンパク質あるいは上記の細胞のDNAミスマッチ修復能を増大させる試験化合物は治療薬剤の可能性がある、というものである。
本発明の一つの態様では、単離し精製したあるタンパク質を提供する。このタンパク質は配列ID NO:2に示す配列を持つ。
さらに本発明の一つの態様では、遺伝子組換え動物を提供する。この遺伝子組換え(非ヒト)動物は、その生殖系列にhMSH2の対立遺伝子(アリル)の1つを持つ。このhMSH2の対立遺伝子(アリル)は、遺伝性非ポリープ性大腸ガンに罹患したヒトあるいはRER+腫瘍に見られるものである。また、突然変異を導入したため、MSH2の野生型対立遺伝子(アリル)を全く持たない動物も提供する。
従って、本発明が当該技術分野に提供するのは、遺伝性非ポリープ性大腸ガンの原因遺伝子の塩基配列及びそれによって腫瘍が発生する機構に関する情報である。これによって当該技術分野では、種々のガンの発生する危険のある個人を同定し、その個人にそのようなガンが実際に発生するのを予防する処置を施すための種々の技術を実施することが可能となるものである。
【図面の簡単な説明】
図1には、ハイブリッド体細胞に保持されているマーカーで、hMSH2遺伝子のマッピングに使用したものをまとめた。
PCRを用いて、各ハイブリッド細胞に表に示したマーカーのそれぞれが存在する(黒塗りの枠)か存在しない(白塗りの枠)かを決定した。各ハイブリッド細胞の研究室での名称及び正式名称(かっこ内)を表に示してある。このハイブリッド細胞のパネルは、領域136から177の外にある、追加の10個の多型性マーカーによっても確かめられた。M:微小核体を通じて第2染色体を転移された細胞由来のハイブリッド細胞;T:t(X;2)転座細胞由来のハイブリッド細胞;X:X線照射した第2染色体供与細胞由来のハイブリッド細胞。MO:マウス-ヒトハイブリッド細胞;HA:ハムスター-ヒトハイブリッド細胞;RA:ラット-ヒトハイブリッド細胞;TEL:テロメア;CEN:セントロメア。
図2に示したのは、染色体バンド2p16内での各DNA配列間の距離及び位置関係を決定するため行ったFISH解析である。パネル2A及び2Bには、123マーカーのFISHによるマッピングを示した。パネル2Aに示したのは、Gバンドの見られる中期の第2染色体である。パネル2Bに示したのは、パネル2Aと同一の染色体を、123マーカーのビオチンラベルしたP1クローンでFISH解析したものである。この結果から、123マーカーの位置は染色体バンド2p16.3であった。パネル2C及び2Dに示したのは二重ハイブリダイゼーションで、染色体の2p16の微小分割(マイクロFISH)プローブと123マーカーの局在が同一であることを表している。パネル2Cに示したのは、DAPI染色した中期の第2染色体である。パネル2Dに示したのは、ビオチンラベルした123マーカーのプローブ(濃く染まった小さい輪に見える)と、スペクトラムオレンジでラベルした2p16マイクロFISHプローブ(薄く染まった大きい輪に見える)とで同時にハイブリダイゼーションを行ったものである。パネル2Eには、CA5、hMSH2及びze3のP1クローンで同時にハイブリダイゼーションした間期の核の代表的な例を示した。この結果は、マーカー間の距離を直接的に測定し、マーカー間の位置及び相対的な距離を決定するのに利用した(Trasket al.,1989の方法)。挿入図:画像処理プログラム、NIH Imageを利用して、距離の測定の便のためgrayの平均値を表面に表示し、相対的な位置情報を図式的に示した。この表面に表示した値は、明確な間期の染色体及びCA-MSH2-ze3という相対的な位置を表している。
図3に示したのは、HNPCC家系の連鎖解析である。
罹患した個人で、マーカー119と136との間で減数分裂組換えの起きたものの全てを含む。黒塗りの枠は、その個人が家系内で疾患を関係のある対立遺伝子(アリル)を持たないことを、あるいは個人が罹患した親から疾患と関係の無い対立遺伝子(アリル)を受け継いだことを示す。白塗りの枠は、個人が疾患と関係のある対立遺伝子(アリル)と同じサイズの対立遺伝子(アリル)を持つことを示す。平行線の枠は、そのマーカーが研究されていなかったことを示す。全ての個人は、55歳より若い時点で大腸ガンあるいは子宮ガンになるか、あるいは子供がそのような疾患にかかったが、通常、疾患の相は決定できなかったため、必ずしもその患者が疾患と関係のある対立遺伝子(アリル)を持つことを表してはいない。
図4に示したのは、hMSH2遺伝子の位置である。
各ハイブリッド体細胞(図4A及び4B)あるいはYACクローン(図4C及び4D)のDNAをEcoRI消化したもの(図4A及び4C)及びPstI消化したもの(図4B及び4D)のサザンブロットについて、cDNAクローンpNP-23からの放射線標識した挿入断片でハイブリダイゼーションを行った。サザンブロット及びハイブリダイゼーションは、記載されたように(Vogelstein et al.,1987)行った。オートラジオグラフを示す。ハイブリッド細胞Z11及びZ12の5.0キロベースのPstI断片は、ハムスターDNAに由来するものである。
図5に示したのは、hMSH2遺伝子のcDNAの塩基配列である。
オープンリーディングフレーム(ORF)は塩基1から始まり、塩基2802で終っている。予想されるアミノ酸配列を示す。2879より下流の配列は決定していない。
図6に、酵母のMSH2遺伝子とヒトのMSH2遺伝子との相同性を示した。
酵母の(y)MSH2遺伝子の予想されるアミノ酸配列(Reenan and Kolodner,1992)とヒトのMSH2遺伝子の予想されるアミノ酸配列とを最も相同性の高い領域で比較した。同種のアミノ酸のブロックは黒塗りにしてある。
図7には、生殖系列及び体細胞系列におけるhMSH2の突然変異を示す。
PCR産物のシークエンス反応のポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。実施例に記載するように、ジェノミックDNAの試料から、hMSH2の保存された領域を含む1.4キロベースのPCR産物が生成した。シークエンス反応ではアンチセンスプライマーを使用した。比較のため、各シークエンス反応からのddA反応物を隣り合ったレーンに流した。C、G、Tについても同様である。各DNA試料は、患者Cx10の腫瘍(レーン1)及び正常な(レーン2)結腸、RER-大腸ガン細胞系列(レーン3)、患者J-42(レーン4)及びJ-143(レーン5)のリンパ球に由来する。図7A:HNPCC患者J-42及びJ-143のリンパ球DNAにおいて、変異(コドン622のC→T)が観察される。図7B:患者Cx10の腫瘍(レーン1)及び正常な結腸粘膜(レーン2)における変異(コドン639のC→T)。図7C:患者Cx10の腫瘍のDNA(レーン1)においてはコドン633のAがTG2塩基に置換されているが、この女性患者Cx10の正常な結腸(レーン2)においては置換されていない。矢印は、パネルA及びBでは塩基の置換を、パネルCではTG2塩基の挿入を示す。
好適な態様についての詳細な記載
1993年5月5日に提出されたシリアルナンバー08/056,546号の内容は、本明細書中に明確に取り入れている。
遺伝性の非ポリープ性大腸癌の原因遺伝子は、細菌のMutSのヒト相同遺伝子であるhMSH2であるということが本発明の発見である。hMSH2のcDNA配列は、SEQ ID NO:1に示す。この遺伝子は、DNA不適合修復酵素をコードする。遺伝子の変異により、細胞は、突然変異を蓄積する。例えば、散発性および遺伝性の非ポリープ性大腸癌において見られる複製を誤る表現型(RER+)は、ミクロサテライトDNAにおける多様性(挿入および欠失)を含む。酵母および細菌において、MutS関連遺伝子の欠陥により他の変異型も生じる。
本発明に従った有用なDNA分子は、特異的にhMSH2配列にハイブリダイゼーションする分子である。典型的に、これらは少なくとも約20塩基の長さで、SEQ ID NO:1に示した核酸配列を持つ。このような分子は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、ダグ配列、などのような、当該技術分野において既知の技術に従って、標識できる。本発明の別の見地に従うと、DNA分子は、HNPCC患者の腫瘍または散発性のRER+腫瘍にみられる突然変異を含む。このような分子は、家族全体にみられる特定の突然変異を突き止めるためのアリル特異的なオリゴヌクレオチドプローブとして使用可能である。
本発明のある見地に従うと、DNAはSEQ ID NO:2に示すようなhMSH2タンパク質のすべてまたは部分をコードすることが望ましい。タンパク質が発現するようにするために、DNA配列は、プロモーター、コザック保存配列、および終止配列のような適切な制御配列に機能できる状態に接続することができる。
変異型hMSH2アリルの遺伝によって癌が進行しやすい患者は、SEQ ID NO:1に示す正常なhMSH2遺伝子配列のすべてまたは部分を含むDNA分子の投与によって治療できる。部分的な遺伝子配列は、変異アリルおよび正常な部分の間の二重組換えにより患者に存在する欠陥を正しく直すために、変異アリルに存在する突然変異に対応する位置を包含する場合に有効である。部分的な遺伝子もまた、機能的なDNA不適合修復酵素を発現するのに十分なタンパク質をコードする場合には、有効に投与できる。このような部分配列は、必ずしも変異アリルに組換えを生じる必要はなく、ゲノムの離れた位置または独立に複製するベクター上で保持されてもよい。ヒトにDNAを投与する方法は、当該技術分野において公知であり、どれでも都合に応じて使用できる。この目的にかなう様々なベクターも知られている。ベクターは必要でない技術もある。このような技術は、当業者によく知られている。
本発明の一部として、抗腫瘍治療の組合せを使用することも意図される。このような治療法の組合せは、散発性またはHNPCCに関連したRER+腫瘍を持つ患者に有効である。治療法は、患者が耐性になる可能性がある標準的な抗腫瘍治療と、上述したようなhMSH2遺伝子を組み合わせる。RER+細胞に存在する欠陥、即ちhMSH2変異の治療によって、腫瘍が耐性の変異を増大させる可能性が非常に減少する。耐性になることを遅らせるまたは妨げることによって、癌患者の生命は、長くなるであろう。さらに、このように耐性を妨げることは、治療薬による腫瘍の破壊が非常に効果的になる。hMSH2遺伝子治療と組合せのできる抗腫瘍治療の例は、ホルモン、放射線、細胞毒素薬、細胞毒素、および抗体である。
hMSH2遺伝子が正常または変異型であるかについて決定するために、体試料を試験することが可能である。変異は、SEQ ID NO:1に示した配列から逸脱し、病気に関連し、それによってhMSH2タンパク質の機能または発現が変化する。このような変異は、保存されていないアミノ酸置換、欠失、早期の終結およびフレームシフトを含む。表I参照。試験用の適切な身体試料は、生検組織、血液、出生前または胚の組織などから得たDNA、RNA、またはタンパク質を含む。
HNPCCおよび散発性のRER+腫瘍を引き起こす欠損の原因は、DNA不適合修復酵素にあるという情報が提供されれば、欠損を治療できるかについて決定するために試験化合物および組成物について測定できる。このような治療用化合物は、タンパク質を正常に活性のある形態に保持するために誤ったhMSH2変異タンパク質に結合できる。または、このような治療用化合物は、不適合修復の別の経路の発現を刺激できる。このような治療用化合物の探索は、試験化合物を正常または腫瘍中に見いだされたhMSH2変異を持つ細胞に接触することによって遂行される。試験化合物と接触した細胞の能力は、接触していない同様の細胞についての不適合修復酵素の能力と比較する。このような活性は、当該技術分野において既知の方法にしたがって試験できる。例えば、レビンソンおよびグットマン、1987、およびストランドら.,1993参照。細胞内のミクロサテライトDNAにおける変化を観察することは、不適合修復酵素活性を測定する1つの方法である。他の研究では、in vitroで核抽出物におけるDNA不適合修復について測定する。ホルメス、1990;トーマス、1991;およびファング、1993参照。
hMSH2タンパク質のcDNA配列およびアミノ酸が提供されれば、当該技術分野において通常の技術を有する者は、容易にhMSH2タンパク質を生産し、他のヒトタンパク質から単離し精製できる。例えば、このタンパク質を細菌、酵母、または他の通常の細胞系で生産するために、組換え細胞または生物を使用できる。単離し精製したタンパク質は、例えばin vitroのDNA不適合修復活性測定において新しい治療薬の探索に使用できる。タンパク質はまた、hMSH2に対する抗体を作製するために使用できる。治療のためのタンパク質投与もまた、意図される。
トランスジェニック動物もまた、本発明によって意図される。これらの動物は、HNPCCまたは散発性の腫瘍に関与するhMSH2アリルを、生殖系列中に挿入されて有する。このような動物は、腫瘍の発達を妨げたり遅らせる薬剤および他の治療薬を試験するためのモデルシステムを提供する。また、自身のMSH2遺伝子に1つまたはそれ以上の突然変異を含む遺伝的に操作した動物も意図される。突然変異は、HNPCC患者または他のヒトRER+腫瘍においてみられるhMSH2アリルに見いだされる突然変異に相当するように作製する。元来のMSH2アリルを両方不活性化してヒトの野生型または変異型hMSH2アリルを含む動物が、特に望ましい。
実施例
実施例1
体細胞ハイブリッド
ヒト−ハムスター、ヒト−マウス、およびヒト−ラットハイブリッド細胞系列を、HNPCCマッピングを容易にするために作製した。ミクロ細胞仲介染色体転移または第二染色体の供与体をX線照射することによる標準的な細胞融合によって、第二染色体のみを含むハイブリッドを得た。さらに、ヒト繊維芽細胞由来の(X;2)(q28;p21)転移を含む2つのハイブリッドを使用した。先の研究において、HNPCC座位は、マーカー123を囲みおよびマーカー119および136の内側の25cMの領域にマップされている(ペルトマキら.,1993a)。38個のハイブリッドを、これら3個の2p染色体マーカーでスクリーニングした。8個のハイブリッドが、染色体2pの適切な座位をマッピングするのに有用であることが判明した。例えば、ハイブリッドL1およびL2は、マーカー123を含む遠い方の半分の領域を含み、一方ハイブリッドy3はマーカー123よりいくらか近い領域を含む(図1)。
方法
ミクロ細胞仲介第二染色体ハイブリッドを作製する方法は、先に記載されている(チェンら.,1992;スプールら.,1993)。ヒト第二染色体を含むX線照射した供与細胞をCHO細胞に融合して作製したハイブリッドもある(チェンら.,1994)。マウスハイブリッドは、HPRT欠損L細胞(A9)をt(X;2)(q28;p21)転移を含むヒト繊維芽細胞腫(GM7503)と融合させ、およびHATを含む培地で選択することによって作製した。
実施例2
多型性マーカー
より正確にHNPCC座位をマップするために、さらなる多型性マーカーを3つの方法で得た。第一に、123マーカーを取り囲む85kbを含むゲノムクローンを、染色体バンド2p16.3に位置するように蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)に使用した(図2A,B)。それから2p16バンド領域をミクロディセクション法で切り出し、このバンド内の配列をポリメラーゼ鎖反応を使用して増幅し、およびプラスミドベクターにサブクローニングした(実験の手法参照)。切り出しの正確さは、切り出した物とマーカー123を含むゲノムクローンに同時にハイブリダイゼーションすることによる二色のFISHを使用して確認した(図2C,D)。サブクローンは、(CA)15プローブに対するハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、ハイブリダイゼーションしたクローンを同定し塩基配列を決定した。それからこれらの配列をゲノムDNAをPCR解析するためのオリゴヌクレオチドプライマーを決定するために使用した。19個の(CA)n繰り返しマーカーをこのようにして同定した。19個のうち、4個は高度に多型性を示し、図1に示した体細胞ハイブリッドパネルによって測定したところ、マーカー119および136の間の領域にマップされた。第二に、ヒトゲノムDNAからポリ(CA)プローブを使用してランダムにクローニングしたさらに8個の(CA)nマーカーは、CEPH家系におけるリンケージ解析によってマーカー119および136の間に位置することがわかった。これらのうち5個は特に有用であり、以下の研究に使用した。最後に、さらに1個のマーカーを、マーカー123を含むゲノムP1クローンのサブクローンを(CA)15プローブでスクリーニングすることによって同定した。これらの解析を通じて、13個の新しい多型性マーカーをマーカー119および136の間の25cMの間隔内に同定し、平均のマーカー間の距離は〜2cMであった(表II)。これらのマーカーは、体細胞ハイブリッドの解析並びにCEPHおよびHNPCC家系におけるリンケージによって互いにマップされた。これら2つのマップ技術は、統一的且つ相補的な情報を提供した。例えば、CA16およびCA18の相対的な位置はリンケージ解析では区別できなかったが体細胞ハイブリッドL1,L2,およびY3にて決定できた。逆に、ze3およびyh5マーカーの相対的な位置は体細胞ハイブリッドマッピングでは決定できなかったが、リンケージ解析によって明らかになった。
方法
すべてのマーカーは、ヒトゲノムライブラリーから放射性標識した(CA)nプローブによるスクリーニングによって得た(ウエーバーおよびメイ、1989)。”T”マーカー(表1参照)は、ワイゼンバッハら.,1992に記載されたように、全ヒトゲノムDNAから作製したライブラリーより得た。”M”マーカーは、以下に記載するように、ミクロディセクション法で切り出した染色体2p16より得たライブラリーから作製した。CA2マーカーは、Sau3で完全消化しおよびラムダYESのXhoI部位にクローニングしたP1クローン210から作製したライブラリーから得た(エリッジら.,1991)。これらのライブラリーから得たクローンの塩基配列を決定し、CA繰り返しを取り囲むプライマーを選択した。強く増幅し高度にヘテロ接合性を生じるプライマーのみHNPCC家系の詳細な解析に使用した。この研究に使用したすべてのマーカーは、CEPH家系におけるリンケージ解析および図1に示した体細胞ハイブリッドパネルでの評価によって、染色体2pに由来することが示された。プライマー配列および各々のマーカーに関する具体的な詳細は、ゲノムデータベースに登録した。CEPHファミリー1331、1332、1347、1362、1413、1416、884、および102におけるマーカー座位のマップを得るためのリンケージ解析を(ワイセンバッハら.,1992)、LINKAGEプログラムパッケージのCLINKプログラムを使用して(ラスロップら.,1984)、性差に関するオプションは使用せず、11ポイントの計算により行った。データから支持される座位の最適な順番の確率を、座位の対を逆位させつつ評価した。
実施例3
ゲノムクローン
表1に示した多型性マーカーの多くを、2p16配列を含むゲノムクローンを得るために使用した。ゲノムクローンは、これらの多型性マーカー、染色体2p16の切り出しに由来する10個のさらに配列を付加した部位(STS)、またはYACジャンクションにてヒトP1およびYACライブラリーをPCRスクリーニングすることによって得た。300から1800kbを含む35個のYACクローンに加えて、85−95kbを各々含む23個のP1クローンを得た。YACクローンは場合によって、リンケージおよび体細胞ハイブリッドマップを確認した。例えば、マーカーze3およびyh5はYACの4F4および1E1に見られ、一方、CA16およびCA18は共にYACの8E5に見られ、これらが近接しているという証拠を提供した。ゲノムクローンの最も多い領域は(28個のYACおよび17個のP1クローン)、マーカーyb9およびyh5の間にあり(表1)、この領域がこれらの研究を通してHNPCC遺伝子を含む可能性が高いことがわかった。yh5およびyh9間の領域は、〜9Mb(1cMあたり1Mbと仮定する)含むと予想される。YACクローンの大きさに基ずき、キメラ性を考慮して、我々はyh5およびyb9間の配列の70%以上を含むと見積った。
方法
表1に記載したマーカーを、PCRによってYACまたはP1ライブラリーをスクリーニングするのに使用した。CEPH AライブラリーはResearch Genetics Inc.より入手したもので、21,000個のYACクローンを含み、スクリーニングが容易で正のクローンが明白に同定できる形に配置されている。マーカーを含む10個のYACクローンの大きさは、ベックマンのGenLineII装置を使用してトラバース方向に変化させるパスフィールドゲル電気泳動によって決定し、平均0.7Mb(幅0.2−1.8Mb)であることがわかった。ある場合には、逆方向のPCRをYACジャンクションを決定するのに使用し(ジョスリンら.,1991)、および得られた配列はYACまたはP1ライブラリーにて”染色体ウオーキング”に使用した。ジャンクションはまた、YACクローンの端が染色体2p16に位置する(それ故おそらくキメラでない)がどうかを試験するためのプライマーの設計にも使用した。このようにして試験した4個のYACクローンのうち3個は、体細胞ハイブリッドパネルによる解析によって決定したところ、第二染色体の期待された領域内に両端があった。ヒトゲノムP1ライブラリーもまた、PCRによってスクリーニングした(Genome Systems Inc.)。hMSH2遺伝子を含むP1クローンM1015およびM1016を、エキソンのシーケンス用プライマーおよびSequiThermTMポリメラーゼ(Epicentre Techonogies)を使用してイントロン−エキソンの境を決定するために使用した。
実施例4
HNPCCファミリーの解析
次に、表1に記載したマーカーを、染色体2pとの関連づけがされている6つの大きなHNPCC家系(ペルトマキら.,1993a)を解析するために使用した。大腸癌または子宮内膜癌にかかっている56人を含む、213人について調べた。4つの家系は、アメリカ合衆国からで、1つはニューファンドランド、1つはニュージーランドであった。調査する患者の数を増加させるため、我々は患者の正常器官のホルマリンで固定しパラフィンでほう埋した断片を得て、これからDNAを精製した(ゴエルツら.,1985a)。13個の各々のマーカーのうち単一のアリルが、6つの家族の各々において病気と共に分離することが判明した(即ち、アリルは患者の50%以上にて見られた)。3つ以上の家系の患者の間で共有するマーカーのアリルはなかった。
14人の患者は、予想された一連のアリルを含み、それ故マーカー119および136間の組換えが起こっていた。これらの患者のうち11人は、単純な1回の組換えが起きたようであった。これらのうちで最も有用な情報は、J家系の患者148および家系621の患者44であった(図3)。患者521−44は、CA5から遠位のマーカーにて病気に関連したアリル持つが、より近接した座位で多くの組換えが起きているために、CA5マーカーがHNPCC座位に近接した位置にあった。患者J−148は、yh5に近接した全てのマーカーにて病気に関連したアリル持つが、yh5および119で組換えが起きているために、yh5の離れた位置にあった。同じ遺伝子がJおよび621家系の両方に含まれると仮定すれば、HNPCC遺伝子はマーカーCA5およびyh5間に存在することが予期され、その領域はおよそ2cMにわたる(表1)。
3人の患者のDNAは(C−202,4−156,4−92)、この領域内で2回組換えが起こったようであった。おそらく一世代に付き1回組換えが起こったものと思われ、これはC−202において両親のDNAを解析することによって示された;他の患者では、両親のDNAは入手できなかった。3人の患者はすべて、CA5およびze3に病気に関連したアリルを持つが、より近接した位置および離れた位置にはない(図3)。一回の組換えを持つ両親のデータと併せて、二回の組換え結果から、HNPCC遺伝子がCA5およびze3の間に位置し、その距離は2cM以下であることが示唆された。
離れているCA5、ze3、およびyh5の物理的距離を決定するために、中期および間期のFISH解析を行なった。これらのマーカーを含むP1クローンによる二色FISHを、ビオチンで標識したP1クローン820および838(各々CA5およびyh5マーカーを含む)について行い、蛍光標識したアビジンで検出し、およびクローン836(マーカーze3を含む)をスペクトラム−オレンジで標識した(メルザーら.,1992)。これらのマーカーのハイブリダイゼーションシグナルは、中期染色体において一致しているようにみえ、これらは1.0Mb以内の間隔に存在することが確定した。FISHを間期の核について行なって、3個のマーカーの相対的な位置を決定し、これらの間の距離を決定した(ツラスクら.,1989)。結果は、マーカーの方向性は、テロメア−yh5−ze3−CA5−セントロメアであることがわかった(データは示さない)。yh5およびze3間の距離を直接測定したところ、0.3Mb以下であり、これらのマーカーがどちらもYACクローン4E4および1E1上に存在することと一致した。48個の間期の染色体を測定し、ze3およびCA5間の距離は0.8Mb以下であることがわかり、各々独立してリンケージデータと一致した。
方法
中期の染色体のGバンドをガラスミクロニードルで切り出して上記に記載したようにPCRによって増幅した(グエンら.,1993、カオおよびユー.,1991)。二色FISHを行なうために、PCR産物を二回目のPCR反応にて蛍光標識(スペクトラム−オレンジ、Imagenetics、ナペルバイル、イリノイ州)またはビオチン化した。P1クローンは、ニックトランスレーションまたは縮退オリゴヌクレオチドプライマーによって標識した(グエンら.,1993)。FISHを上記に記載したように行い(グエンら.,1993)および二色バンドパスフィルターを備えたZeiss Axiophotで可視化した。間期のFISHパターンを解析するために、ハイブリダイゼーションシグナル間の距離を最小24核測定した(ツラスクら.,1989)。
実施例 5
候補となる遺伝子
先に記載したマッピングの結果に基づき、我々は所定の遺伝子がHNPCCの候補となるかどうかを、そのCA5-ze3ドメインに対する位置を決定することによって決めることができた。考慮した最初の遺伝子は、DrosophilaのSOS遺伝子(EganおよびWeinberg、1993、によって概説されている)のヒトホモログであった。この遺伝子は種々の真核生物においてシグナルを膜結合受容体からras経路に伝達する。この遺伝子は、rasと相互作用する別の遺伝子であるNF1が癌素因症候群(Viskochilら、1990; Wallaceら、1990)を引き起こし、SOSはin situハイブリダイゼーションによれば染色体2p16-21に位置する(Webbら、1993)ことから、候補になると考えられた。しかしながら、ハイブリッド・パネルからSOS配列を増幅するためにPCRを用いたところ、SOSはCA5-yh5ドメインから遠位にあることが分かった(ハイブリッドZ19には存在するがZ29には存在しない)。
我々は次にインターフェロンで誘導されるRNAで活性化されるプロテイン・キナーゼ遺伝子PKRについて検討した。この遺伝子は腫瘍抑制活性を持ち(Lengyel、1993、によって概説されている)、2p16の近傍に位置づけられる(Hanashら、1993)ことが示されている。当初我々はPKRをHNPCCの範囲から除外することができず、そのためHNPCCの家系C由来の二人の個体におけるPKRのコード領域の配列を決定した。これら二人の個体のリンパ芽球由来のRNAからcDNAをつくるために、逆転写酵素を用い、PKRに特異的なプライマーを用いてPCRを行った。PKR産物の配列を決定したところ、コード領域内に公表されている配列(Meursら、1990)との食い違いはなかった。それに続いた研究によってPKR遺伝子はyh5マーカーから遠位にあることが示され、従ってHNPCCの基準から除外することができた。
我々は次に、バクテリアおよび酵母において破壊するとミクロサテライトの不安定性を生じることが以前に示されている(LevinsonおよびGutman、1987; Strandら、1993)、MutLおよびMutSミスマッチ修復酵素のヒトホモログについて考慮した。酵母のMutL関連遺伝子PMS1(Kramerら、1989)のヒトホモログは、染色体2pには存在しないように思える(M. Liskay、私信)。MutSのホモログを同定するために、我々は結腸癌細胞株からcDNAをPCRで増幅するための縮重したオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた。同一のプライマーが、以前に酵母のMSH2遺伝子をそのMutSとの類似性をもとにして同定するのに用いられている(ReenanおよびKolodner、1992)。非ストリンジェント条件のPCRでは、予想されるサイズの断片が得られ、これらの断片はプラスミドベクターにクローン化した。クローンの大部分はリボソームRNA遺伝子を含んでおり、これは縮重プライマーに弱い相同性のある豊富な転写産物の存在を示している。しかしながら、そのクローンの中の一部分は酵母のMSH2遺伝子の配列に類似した配列を含んでおり、そうしたクローンの一つ、pNP-32についてさらに評価を行った。このクローンをもたらしたヒトの遺伝子を以降hMSH2と呼ぶ。
クローンpNP-23由来の挿入断片は、体細胞ハイブリッドDNAのサザンブロットにおけるプローブとして使用した。この挿入断片は、Pst1またはEcoRIで消化したヒトのゲノムDNAにおいてそれぞれ一つまたは二つの断片にハイブリダイズし、これらの断片はヒトの染色体2pの大部分を含むハイブリッドZ30に存在していた。他のハイブリッドの解析によって、その断片はハイブリッドZ11、Z29、L1およびL2には存在するが、Z12、Y3またはZ19には存在しないことが示され、それによってヒトのMSH2(hMSH2)遺伝子はマーカーCA18および119に隣接する領域に位置づけられた(例えば図4)。続いて表1に列挙されているYACクローンについて分析し、YAC 5A11で同定された予想されるサイズのEcoRIおよびPst1断片が、CA5マーカーを用いたYACライブラリーの検索によって得られた(図4)。
サザンブロットしたものを確認するために、我々はpNP-23の配列に基づいて非縮重プライマーをデザインした。ゲノムDNAがPCRの鋳型として使用できるように、数組のプライマーを検証した;介在するイントロンのため最初のプライマーはcDNA以外の鋳型については効果的に使用できなかった。これらのプライマーを用いたPCRは、サザンブロットの結果と完全に一致した。予想された101bpの断片は、ハイブリッドZ4、Z11、Z29、L1およびL2、およびYAC 5A11には存在していたが、他のハイブリッドまたはYACクローンには存在していなかった(示していない)。
hMSH2配列のYAC 5A11への位置づけによって、これらの配列がマーカーCA5に近接していることが示された。hMSH2のCA5に対する距離および相対的な方向を決定するために、我々は間期のFISH解析を行った。CA5、ze3およびhMSH2配列を含むP1クローン(それぞれ、クローン820、836およびM1015)をフルオレセインおよびSpectrum Orangeによる標識(Melterら、1992)に続いて、同時に間期の核にハイブリダイズさせた。その結果、MSH2は連鎖解析によってCA5とze3の間で、マーカーCA5から0.3Mb以内に限定されるHNPCC座位の中に存在することが示された(図2E)。
続いてpNP-23の挿入断片を用いてこの遺伝子由来の付加的な配列を得るために、ヒトの結腸癌細胞からまたはヒトの胎児の脳組織から合成されたcDNAライブラリーを検索した。最初に75のcDNAクローンを同定し、部分的に配列を決定した。cDNA配列コンティグの末端を示すPCR産物は、次にcDNAライブラリーを再検索するためのプローブとして使用した。このcDNA”ウォーク”を新たなコンティグの末端について再び繰り返した。総計で147のcDNAクローンを同定した。これらのクローンに由来した混成の配列を図5に示した。オープン・リーディング・フレーム(ORF)はcDNAコンティグの5’末端の69nt下流から始まり、2802bpまで続いている。このORFを開始するメチオニンは配列関係から効率の良い翻訳と矛盾せず(Kozak、1986)、読み枠と一致した終止コドンが先に存在する。hMSH2転写産物の5’末端の位置を独立に決定するために、PCRを基礎とした手順(RACE、Frohmanら、1988)において胎盤および脳由来のRNAを用いた。この解析によって、すべての検出可能な転写産物の5’末端は図5に示されている配列の上流100bp以内であり、nt-69より上流は不均一であることが示された。酵母のMSH2遺伝子に最も高い相同性を示す領域が図6に示されている。この領域は、おそらくMutSがDNAに結合する能力を与えるヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメインを含んでいる(ReenanおよびKolodner、1992)。酵母およびヒトのMSH2タンパク質は、コドン615と788の間で77%同一であった。これら二つのタンパク質の全長(酵母およびヒトでそれぞれ966および934アミノ酸)の中には、類似したアミノ酸のブロックが他にも数個分布していた。
方法
結腸直腸癌細胞のRNAから逆転写酵素で合成したcDNAをPCRの鋳型として、縮重したプライマー5’-CTG GAT CCA C(G/A/T/C)G G(G/A/T/C)C C(G/A/T/C)A A(T/C)A A(T/C)A TG-3’および5’-CTG GAT CC(G/A) TA(G/A) TG(G/A/T/C) GT(G/A/T/C) (G/A)C(G/A) AA-3’と共に使用した。これら二つのプライマーは、以前に酵母のMSH2遺伝子を同定するために用いられており、哺乳動物およびバクテリアの関連遺伝子の間で保存されている配列に基づいている(ReenanおよびKolodner、1992)。ヒトのMSH2遺伝子を検出するための最適なPCR条件は、以前に記載されている緩衝液(Sidranskyら、1991)で95℃で30秒、41℃で90秒、70℃で90秒の35サイクルからなる。PCR産物は記載されているように(HoltonおよびGraham、1991)T末端ベクターにクローン化し、改良T7ポリメラーゼ(USB)で配列を決定した。続いて、SW480結腸癌細胞(Clontech)または胎児の脳(Stratagene)のRNAから合成したcDNAライブラリーを検索するために、酵母のMSH2遺伝子に相同性のあるヒトの配列を含む一つのクローン(pNP-23)由来の挿入断片を使用した。さらに二回スクリーニングした後、陽性のクローンをプラスミドに変換し、改良T7ポリメラーゼ(Kinzlerら、1991)を用いて配列を決定した。いくつかの場合においては、hMSH2特異的プライマー一つおよびベクター特異的プライマー一つを用いて挿入断片を増幅し、続いてSequiThermポリメラーゼ(Epicentre Technologies)で配列を決定した。MSH2転写産物の5’末端を決定するために、脳および胎盤のcDNA(Clontech)を用いてRACEを行った(Frohmanら、1989)。
実施例6
hMSH2の変異
hMSH2のHNPCC座位への物理的位置づけは興味深いことであったが、それがこの遺伝子が病気の原因となっていることの証明にはならなかった。より確固とした証拠を得るために、我々はhMSH2の生殖系列の変異が、以前に第2染色体との関連が確立された(Peltomakiら、1993a)二つのHNPCCの家系に存在するかどうかを決定した。隣接したエクソンを含むゲノムのPCR断片の配列を決定することによって、hMSH2の最も良く保存された領域(図6)内にあるイントロン-エクソンの境界を決定した。続いて、これら二つの家系の発病したメンバーのリンパ球由来のゲノムDNA試料を、このドメインの配列を決定するためのPCRの鋳型として用いた。42および44才の時にそれぞれ結腸、および子宮内膜の癌にかかった個体J-42由来のDNAには、コドン622でプロリンからロイシンへの置換を生じるCからTへの変換(CCAからCTA)を持つアリルを一つ含むことが分かった(図7、上段)。さらに無関係な固体由来のDNA試料20個についてはこの位置はすべてプロリンをコードしていた。続いて、Jの家系のメンバー21人をPCR産物を直接配列決定することによって解析した。11人の発病した固体はすべてコドン622にCからTへに変換を持つ一つのアリルを含んでいたが、一方10人の発病していないメンバーは二つの正常なアリルを含んでおり、これによって病気と共に完全に分離することが証明された。重要なことだが、このプロリンは高度に保存された位置にあり、同一の残基は原核生物および真核生物由来のすべての既知のMutS関連遺伝子に見いだされる(図6、およびReenanおよびKolodner、1992)。
家系CではMSH2の保存領域に変異が同定されず、このため我々は次にhMSH2転写産物の他の部分を検討することにした。結腸癌にかかった27才の男性である、患者C-202のリンパ芽球細胞からRNAを精製した。このRNA由来のコドン89から934を含む4つのhMSH2特異的産物を合成するために、逆転写酵素とPCRの組み合わせ(RT-PCR)を用いた(実験手順を参照のこと)。一組のプライマーを用いた時に異常な短いRT-PCR産物が認められた。様々なMSH2プライマーを用いたマッピングおよび配列決定によって、異常な産物はMSH2転写産物のコドン265から314を除去したと推定されるスプライシング欠損の結果生じるものであることが示された。家系Cでは異常な転写産物は病気と一緒に分離することが分かり、この産物は20人の無関係な個体では見られなかった。
我々は次にhMSH2がより最近病気と関連づけられたファミリー(R. P. およびM. N-L、未発表データ)の一つの中で変化しているかどうかを決定したいと考え、詳細な解析のために家系8を選択した。結腸癌にかかった42才の男性である、8-143のリンパ芽球細胞からDNAおよびRNAを回収した。PCRを用いてゲノムDNAからhMSH2の保存された領域を増幅し、直接配列を決定した。コドン669に始まるエクソンの上流(イントロンの位置-6)のポリピリミジン領域中でのTからCへの置換が見つかった。しかしながら、この置換は20人の無関係な正常の個体のうちの2人でも見られ、そのために0.05アリル頻度で生じる、病気には無関係な多型であることが分かった。続いてhMSH2のコード領域を先に記載したようにRT-PCRで増幅したところ、異常な転写産物は検出されなかった。しかしながら、PCR産物の配列決定によって、コドン406の位置にアルギニン残基の終止コドンへの置換を引き起こすCからTへの変換(CGAからTGA)があることが明らかとなった。RNAは家系8の第2の発病したメンバーのリンパ球からも入手でき、同一の終止コドンが同定された。この変化は他の20人の無関係な個体には見いだされなかった。
最後に、我々はこの遺伝子の変異が、明らかな癌遺伝家系歴のない患者由来のRER+の腫瘍で起こるかどうかを決定しようと考えた。そのような患者由来の4つの結腸直腸腫瘍細胞株において、ゲノムDNAをPCRの鋳型として用いて、MSH2の保存された領域を研究した。一つの腫瘍(患者Cx10由来)は二つのhMSH2の変化を含むことが判明した。最初のものはコドン639にヒスチジンからチロシンへの置換を生じるCからTへの変換(CATからTAT)であった。この変化は無関係の個体由来の20の試料には見いだされなかったが、この患者の正常な結腸由来のDNAには存在し、そのために生殖系列の変化を示していると見込まれた(図7、中段)。家系Jのミスセンス変異のように、Cx10の変化はすべてのMutSのホモログで完全に保存されている位置にあった(図6、およびReenanおよびKolodner、1992)。Cx10由来の腫瘍における第2の変化は、コドン663におけるAのGTジヌクレオチドへの変換(ATGからTGTG)であった。その結果生じた1bpの挿入は、36nt下流に終止コドンを生じるフレームシフトを引き起こすことが予想された。この変異はCx10の腫瘍から精製したRNAおよびDNAの両方について示されたが、患者の正常な結腸には存在せず、そのため体細胞の変異であることが示された(図7、下段)。Cx10由来のPCR産物をクローン化して配列を決定したところ、コドン663の挿入変異およびコドン639の変換は違うアリルに存在することが示された。
方法
変異を検出するために、PCR産物をcDNAおよびヒトゲノムDNAの鋳型から合成し、続いてSequiThermTMを用いて直接配列を決定した。いくつかの場合においては、直接の配列決定データを確認するために、PCR産物を配列決定のためのT末端ベクターにクローン化した。ゲノムDNAからのMSH2の保存された領域を増幅するために用いたプライマーは、hMSH2のコドン614から705を含む1.4kbの断片を生じる5’-CCA CAA TGG ACA CTT CTG C-3’および5’-CAC CTG TTC CAT ATG TAC G-3’、およびMSH2 cDNAのコドン683から783を含む2.0kbの断片を生じるプライマー5’-AAA ATG GGT TGC AAA CAT GC-3’および5’-GTG ATA GTA CTC ATG GCC C-3’である。RT-PCRのためのプライマーは、コドン89から433には5’-AGA TCT TCT TCT GGT TCG TC-3’および5’-GCC AAC AAT AAT TTC TGG TG-3’、コドン350から705には5’-TGG ATA AGA ACA GAA TAG AGG-3’および5’-CCA CAA TGG ACA CTT CTG C-3’、コドン614から783には5’-CAC CTG TTC CAT ATG TAC G-3’および5’-AAA ATG GGT TGC AAA CAT GC-3’、およびコドン683から949には5’-GTG ATA GTA CTC ATG GCC C-3’および5’-GAC AAT AGC TTA TCA ATA TTA CC-3’であった。
考察
本明細書に記載されている実施例から三つの主要な結論が導き出せる。最初に、物理的位置づけおよび連鎖解析によって、HNPCC座位は第2染色体のマーカーCA5およびze3に近接する0.8Mbの区分に位置づけられた。第二に、酵母のMSH2遺伝子の新規のヒトホモログが同定され、この遺伝子は同じ0.8Mbの距離にあることが示された。第三に、hMSH2遺伝子の変化は、典型的なHPNCCを持つか、または持たないRER+の腫瘍にかかった患者の生殖系列に起こっており、腫瘍ではこの遺伝子の付加的な体細胞の変化が起こっていた(表1に要約されている)。変化は高度に保存された領域にあるか、または予想される遺伝子産物を大きく変化させており、このように重要な機能的影響を持つ変異を示している。これらの結果は、hMSH2の変異がHNPCCおよび腫瘍に見られるRER+陽性の表現型の原因となっていることを示している。
これらのデータは、HNPCCに見られる腫瘍を理解するための実質的な示唆を含んでいる。特に、それらはこれらの患者由来の腫瘍で以前に観察されたミクロサテライトの変化が付帯徴候ではなく、本質的に病原性に関連していることを示唆している。さらに、MutS関連遺伝子に欠陥を有する酵母およびバクテリアで観察された変異は、これらの配列は解析のための簡単な道具を提供するけれども、単一に繰り返した配列における挿入および欠失には限定されない(Modrich、1991)。同様に、ミクロサテライトの挿入または欠失に加えて、多くの変異がHNPCCの腫瘍で見つかると予想されるかも知れない。これは結腸直腸の腫瘍形成を促進することが示されている癌遺伝子および癌抑制遺伝子(FeasonおよびVogelstein、1990)における多数の続発する変異を誘導し得る。このように、HNPCCの腫瘍の分子的病因はミスマッチ修復の欠損に関連した変異の割合の増加によって促進されるけれども、非HNPCCの場合に起こる腫瘍と類似のものとなるようである。従って、HNPCC患者由来の結腸癌では、散発性の結腸直腸癌に見られるのと同程度の頻度でAPC、p53、RASの変異を含むことが分かっている(Aaltonenら,1993)。
HNPCC患者由来の結腸直腸癌は、それらの比較的正常な細胞発生の様相によって区別され(Kouriら、1990)、散発性のRER+の腫瘍は、RER-の場合に起こるものよりも実質的に少ない染色体の欠失しか起こらないことが示されている(Thibodeauら、1993; Aaltonenら、1993)。これらのデータは、遺伝子の不均一性が結腸直腸癌の進行には重要であるが、二通りの異なる様式で発生することを示唆している(Thibodeauら、1993)。最も一般的には、結腸直腸癌は80年近く前に示唆されたように、異数性を生じる大きな変化を通じて進行する(Boveri、1914)。HNPCC由来の腫瘍およびRER+の散発性腫瘍においては、その変化は染色体全体に分布する多数の小さな配列の変化から成るような、おそらくより微妙なものであろう。変化を生み出す後者のメカニズムは、RER+の散発性の腫瘍にかかった患者と同様に、HNPCC患者のような宿主にとってより危険が少なく、それらの腫瘍の組織病理学的解析から予想されるよりも良好な予測が得られるように思える(Ionovら; 1993; Thibodeauら、1993; Lotheら、1993; Lynchら、1993)。
参考文献
配列表
(2)配列情報 SEQ ID NO:1:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 2947 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 二本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: ヒト
(xi)配列: SEQ ID NO:1:
(2)配列情報 SEQ ID NO:2:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 934 アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: タンパク質
(iii)ハイポセティカル: YES
(iv)アンチセンス: NO
(vi)起源:
(A)生物名: ヒト
(xi)配列: SEQ ID NO:2:
(2)配列情報 SEQ ID NO:3:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 23 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:3:
(2)配列情報 SEQ ID NO:4:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 23 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:4:
(2)配列情報 SEQ ID NO:5:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 19 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:5:
(2)配列情報 SEQ ID NO:6:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 19 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:6:
(2)配列情報 SEQ ID NO:7:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 20 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:7:
(2)配列情報 SEQ ID NO:8:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 19 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:8:
(2)配列情報 SEQ ID NO:9:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 20 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:9:
(2)配列情報 SEQ ID NO:10:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 20 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:10:
(2)配列情報 SEQ ID NO:11:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 21 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:11:
(2)配列情報 SEQ ID NO:12:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 19 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:12:
(2)配列情報 SEQ ID NO:13:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 19 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:13:
(2)配列情報 SEQ ID NO:14:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 20 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:14:
(2)配列情報 SEQ ID NO:15:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 19 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:15:
(2)配列情報 SEQ ID NO:16:
(i)配列の特性
(A)配列の長さ: 23 塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直線状
(ii)配列の種類: cDNA
(iii)ハイポセティカル: NO
(iv)アンチセンス: NO
(xi)配列: SEQ ID NO:16:
Claims (13)
- SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号69〜2873に示したhMSH2の全長配列を含むDNA分子。
- cDNAである、請求項1に記載のDNA分子。
- 標識された、請求項1に記載のDNA分子。
- プロモーター配列に機能できる状態につながれた、請求項1に記載のDNA分子。
- 転写の際に、天然のhMSH2 mRNA配列のRNA分子を産生する、請求項4に記載のDNA分子。
- SEQ ID NO:1に示したhMSH2に対して変異を含むDNA分子であって、腫瘍にみられるhMSH2アリル(対立遺伝子)の少なくとも20塩基の配列を含むDNA分子であって、前記変異が、以下のもの:
(i)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1934(図5Bにおいて示されるコドン622)におけるCからTへの変化であってコードされるアミノ酸をプロリンからロイシンに変化させるもの;
(ii)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド793〜942の欠失;
(iii)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1285(図5Aにおいて示されるコドン406)におけるCからTへの変化であってアルギニンを終止コドンへ変化させるもの;
(iv)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1984(図5Bにおいて示されるコドン639)におけるCからTへの変化であってヒスチジンをチロシンへ変化させるもの;そして
(v)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド2056(図5Bにおいて示されるコドン663)でのフレームシフトであってATGコドンをTGTGへ変化させるもの;
からなる群から選択される、前記DNA分子。 - 腫瘍が、RER+腫瘍である、請求項6に記載のDNA分子。
- hMSH2発現またはhMSH2タンパク質機能に影響を与えるhMSH2における変異であって、以下のもの:
(i)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1934(図5Bにおいて示されるコドン622)におけるCからTへの変化であってコードされるアミノ酸をプロリンからロイシンに変化させるもの;
(ii)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド793〜942の欠失;
(iii)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1285(図5Aにおいて示されるコドン406)におけるCからTへの変化であってアルギニンを終止コドンへ変化させるもの;
(iv)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1984(図5Bにおいて示されるコドン639)におけるCからTへの変化であってヒスチジンをチロシンへ変化させるもの;そして
(v)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド2056(図5Bにおいて示されるコドン663)でのフレームシフトであってATGコドンをTGTGへ変化させるもの;
からなる群から選択される変異;
の存在を調べるためヒトの体試料を試験し、このような変異の存在を癌になる素因の指標とすること;
を含む、癌の素因の決定方法。 - 試料がDNAである、請求項8に記載の方法。
- 試料がRNAである、請求項8に記載の方法。
- 試料がタンパク質である、請求項8に記載の方法。
- 試験化合物を、腫瘍においてみられるhMSH2変異であって、以下のもの:
(i)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1934(図5Bにおいて示されるコドン622)におけるCからTへの変化であってコードされるアミノ酸をプロリンからロイシンに変化させるもの;
(ii)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド793〜942の欠失;
(iii)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1285(図5Aにおいて示されるコドン406)におけるCからTへの変化であってアルギニンを終止コドンへ変化させるもの;
(iv)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド1984(図5Bにおいて示されるコドン639)におけるCからTへの変化であってヒスチジンをチロシンへ変化させるもの;そして
(v)SEQ ID NO: 1において示されるヌクレオチド2056(図5Bにおいて示されるコドン663)でのフレームシフトであってATGコドンをTGTGへ変化させるもの;
からなる群から選択される変異;
を含有する細胞と接触させ;
細胞がDNAミスマッチの修復を行う能力を調べて、細胞がDNAミスマッチの修復を起こす能力を増加させる試験化合物を治療薬の候補とする;
ことよりなる、腫瘍を予防または治療することができる治療薬を探索するためのスクリーニング方法。 - SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列を含むタンパク質。
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