WO2013175815A1 - 核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法 - Google Patents

核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法 Download PDF

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WO2013175815A1
WO2013175815A1 PCT/JP2013/053494 JP2013053494W WO2013175815A1 WO 2013175815 A1 WO2013175815 A1 WO 2013175815A1 JP 2013053494 W JP2013053494 W JP 2013053494W WO 2013175815 A1 WO2013175815 A1 WO 2013175815A1
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nucleic acid
protein
amplification
amplification reaction
seq
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PCT/JP2013/053494
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福井　健二
敦広 島田
成紀 倉光
横山　茂之
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独立行政法人理化学研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification method, a reagent therefor, a method for suppressing errors in a nucleic acid amplification reaction, and a method for determining the presence or absence of a gene mutation.
  • Nonspecific amplification of oligonucleotide and mutation by DNA polymerase are due to primer mishybridization and deoxyribonucleotide misincorporation by DNA polymerase, respectively.
  • Non-specific amplification can be suppressed by adjusting the temperature of the PCR annealing step.
  • an error is likely to occur particularly when a large DNA is used as a template.
  • Polymerase errors can be avoided by using high-fidelity DNA polymerase.
  • replication accuracy and extension efficiency are in a trade-off relationship, many oligonucleotide sequences cannot be efficiently amplified unless a low-fidelity DNA polymerase is used.
  • Non-Patent Document 1 reports that an E. coli DNA mismatch repair system is used to destroy an error-containing sequence in a PCR product.
  • Non-Patent Document 2 describes that an error filtering technique has been established using immobilized Thermus aquaticus-derived MutS (TaqMutS). Although these techniques can improve the selectivity of sequences that do not contain errors from the DNA cluster, they involve relatively complex steps and are not applicable to simple PCR reactions.
  • Patent Document 1 shows that TaqMutS has low mismatch recognition ability, and Alicyclobacillus acidocaldarius-derived MutS having higher mismatch recognition ability is useful.
  • Non-Patent Document 3 describes that TaqMutS was used to suppress nonspecific replication during isothermal amplification. Although this technology has achieved accurate diagnosis of SNPs, it can be applied to nucleic acid amplification reactions including temperature fluctuations or reactions at elevated temperatures such as PCR, or generated by polymerases with this technology. It was unclear whether the mutation could be suppressed.
  • an object of the present invention is a simple error suppression method for nucleic acid amplification reaction, particularly PCR, non-specific amplification by extension from mismatch primer, and amplification from mismatch template in which mutation is introduced by polymerase. It is providing the method of suppressing.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for amplifying a target nucleic acid region wherein a nucleic acid sample, a primer, and a MutS protein are contacted to perform a nucleic acid amplification reaction, and the MutS protein comprises the following (a), ( b) or (c) protein: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an activity of suppressing errors in nucleic acid amplification reaction (c) SEQ ID NO:
  • the above method which is a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with one amino acid sequence and having an activity of suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction.
  • a method for suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction wherein the nucleic acid amplification reaction is performed by contacting a nucleic acid sample, a primer, and a MutS protein, and the MutS protein comprises the following (a), (B) or (c) protein: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an activity of suppressing errors in nucleic acid amplification reaction (c) SEQ ID NO:
  • the above method which is a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with one amino acid sequence and having an activity of suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction.
  • a reagent for nucleic acid amplification which contains a MutS protein
  • the MutS protein is a protein of the following (a), (b) or (c):
  • SEQ ID NO: SEQ ID NO:
  • the reagent which is a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with one amino acid sequence and having an activity of suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction.
  • a method for determining the presence or absence of a mutation at a target site in a target nucleic acid region the step of amplifying the target nucleic acid region by the method according to any one of (1) to (4), and nucleic acid amplification
  • the said method including the process of confirming presence or absence.
  • amplification from a mishybridized primer or an error-containing sequence is suppressed and non-specific amplification and amplification can be performed by simply adding a MutS protein with extremely high thermal stability in a nucleic acid amplification reaction. Mutation of the base sequence can be suppressed.
  • the simple method of the present invention can greatly improve the efficiency and accuracy of nucleic acid amplification techniques, particularly PCR-related techniques.
  • FIGS. 1F and 1G shows a schematic diagram of hybridization of primers and templates used in FIGS. 1F and 1G.
  • the results of amplification of perfect match (left), GT mismatch (center) or unmatched T-containing (right) templates using perfect match primers are shown.
  • the results of plotting the relative amount of fragments amplified from a perfect match (top), GT mismatch (middle) or unmatched T-containing (bottom) template versus TthMutS concentration are shown.
  • the three graphs show the results when using LAaqTaq (left), KOD polymerase (center) or A. aeolicus DnaE (right), respectively.
  • a schematic diagram of the mechanism by which MutS suppresses amplification from mismatched templates is shown.
  • the result of amplifying the 423-bp region of the ttha1806 gene in the T. thermophilus genome in the presence of TthMutS is shown.
  • M represents a 500-bp DNA ladder marker.
  • additional TthMutS solution was replenished.
  • the final concentration of TthMutS is shown at the top of the panel.
  • the result of quantifying the amplification in FIG. 2A is shown. Non-specific amplification and specific amplification are shown in white and black, respectively.
  • the 594-bp region of the tthb071 gene is amplified in the presence of TthMutS and electrophoresed.
  • the result of quantifying the amplification in FIG. 2C is shown.
  • Non-specific amplification and specific amplification are shown in white and black, respectively.
  • the results of amplification and electrophoresis of the 1,278-bp region of the ttha1548 gene in the presence of TthMutS are shown.
  • the result of quantifying amplification in FIG. 2E is shown.
  • Non-specific amplification and specific amplification are shown in white and black, respectively.
  • the results of amplification of ttha1806 (423 bp) in the presence of 200 ⁇ M MnCl 2 in the presence or absence of 0.3 ⁇ M TthMutS, cloning into the pT7Blue vector, and sequence analysis using the T7 promoter are shown.
  • the number of mutations per 423 bp is shown.
  • FIG. 2K shows the result of quantifying amplification in FIG.
  • Non-specific amplification and specific amplification are shown in white and black, respectively.
  • the result of amplifying ttha1806 in the presence of 300 nM TthMutS or AaeMutS and performing electrophoresis is shown.
  • each reaction tube was supplemented with 0 ( ⁇ ) or 300 ⁇ M (+) TthMutS or AaeMutS.
  • FIG. 2M shows the result of quantifying amplification in FIG. Non-specific amplification and specific amplification are shown in white and black, respectively. The result of having conducted the same experiment as FIG.
  • FIG. 3A shows the results of electrophoresis. Lane 1 is a reaction mixture containing no DNA polymerase, Lane 2 is a reaction mixture containing LA Taq hot start vesion, and Lane 3 is a reaction mixture containing LA Taq hot start version digested with EcoRI. Yes, where the EcoRI site is located in the center of the template DNA. FIG. 3B shows the result of stopping PCR at each cycle and analyzing the reaction mixture by PAGE.
  • the amount of amplified fragment was quantified with ImageJ software and plotted against cycle number.
  • KOD polymerase (A) or A. aeolicus DnaE (B) on PCR of 80-bp perfect match template using mismatch primer is shown.
  • the results of electrophoresis using KOD polymerase or A. aeolicus DnaE, and perfect match (left), GT mismatch (center) or unpaired T-containing (right) primers are shown.
  • Figure 5A shows PCR of 80-bp perfect match template using perfect match (left) or unpaired T-containing (right) primers in the presence of A. aeolicus MutL C-terminal domain (MutL CTD). The results of electrophoresis are shown.
  • FIG. 5B shows the result of quantifying the amount of the amplified fragment and plotting it against the A.Aaeolicus MutL CTD concentration. Amplifications from perfect match primer (top) and unpaired T-containing primer (bottom), respectively, are shown. It was shown that the thermostable protein that does not have mismatch recognition ability has no inhibitory effect on mismatch primer-dependent amplification. The results of testing the effects of KOD polymerase and A. aeolicus DnaE on PCR of 80-bp mismatch template using perfect match primers are shown.
  • FIG. 6A shows the results of performing electrophoresis using KOD polymerase and performing electrophoresis.
  • FIG. 6B shows the results of performing electrophoresis using A. aeolicus DnaE and performing electrophoresis. The results are shown using perfect match (left), GT mismatch (center) or unmatched T-containing (right) templates, respectively.
  • Figure 7A shows the results of electrophoresis of 80-bp perfect match (left) or unmatched T-containing (right) template PCR using perfect match primers in the presence of A. aeolicus MutL CTD. Show.
  • FIG. 7B shows the result of quantifying the amount of the amplified fragment and plotting it against the concentration of A. aeolicus MutL CTD.
  • thermostable protein that does not have mismatch recognition ability has no inhibitory effect on mismatch template-dependent amplification.
  • the result of having tested the dependence of the TthMutS effect on the number of mismatches in the 80-bp template is shown.
  • FIG. 8A shows the result of performing electrophoresis using a template having 0, 1, 2 or 3 unpaired T and performing electrophoresis. PCR was performed in the absence or presence of TthMutS using LA Taq hot start version and perfect match primers, respectively.
  • FIG. 8B is a bar graph showing the results of quantifying the amount of amplified fragments. The result of CD measurement of TthMutS is shown.
  • FIG. 9A shows the far ultraviolet CD spectrum of TthMutS.
  • FIG. 9B shows the temperature dependence of the residue molar ellipticity at 222 nm.
  • the heating rate was 1 ° C./min.
  • the effect of CoCl 2 on the error suppression ability of TthMutS is shown.
  • FIG. 10A shows the result of amplifying the 423-bp region of ttha1806.
  • the graph of FIG. 10B shows the quantification results of non-specific amplification and specific amplification in FIG. 10A in white and black, respectively.
  • FIG. 10C shows the result of amplifying the 594-bp region of tthb071.
  • FIG. 10D shows the quantification results of non-specific amplification and specific amplification in FIG. 10C in white and black, respectively.
  • FIG. 10E shows the result of amplifying the 1,278-bp region of ttha1548.
  • the graph of FIG. 10F shows the quantification results of nonspecific amplification and specific amplification in FIG. 10E in white and black, respectively.
  • the result of CD measurement of AaeMutS is shown.
  • FIG. 11A shows the far-infrared CD spectrum of AaeMutS.
  • FIG. 11B shows the temperature dependence of the residue molar ellipticity at 222 nm. The heating rate was 1 ° C./min.
  • FIG. 12A shows the results of electrophoresis of TthMutS mixed with perfect match double-stranded DNA ( ⁇ ), GT mismatch double-stranded DNA ( ⁇ ), and unpaired T-containing double-stranded DNA ( ⁇ ).
  • FIG. 12B shows the result of quantifying the signal shifted from the gel photograph of A (DNA to which TthMutS was bound) and plotting the percentage of the total signal amount against the TthMutS concentration.
  • 12C and 12D show the results of performing the same operation as FIGS. 12A and 12B using AaeMutS.
  • MutS protein coexists in a nucleic acid amplification reaction.
  • the MutS protein (hereinafter sometimes simply referred to as MutS) is also referred to as, for example, a mismatch binding protein or a mismatch recognition protein.
  • MutS is generally a protein that recognizes mismatched base pairs in double-stranded nucleic acids (hereinafter sometimes simply referred to as mismatches) and can bind to mismatched base pairs.
  • mismatch base pair refers to a non-complementary normal base pair such as a combination of adenine and thymine or uracil and a combination of guanine and cytosine. It means a complementary base pair.
  • one strand has a base deleted at a site corresponding to a predetermined base of the other strand, and a base pair is deleted at that portion. Also includes state (also referred to as unpaired base).
  • a double-stranded nucleic acid having a mismatched base pair is referred to as “mismatch double-stranded nucleic acid”, “mismatch substrate” or “mismatch template”.
  • the mismatched double-stranded nucleic acid is, for example, a substantially complementary double-stranded nucleic acid having two or more mismatched base pairs and including a non-complementary region. It means a strand nucleic acid.
  • a perfectly complementary base pair is “perfect match” for a mismatched base pair
  • a perfectly complementary double-stranded nucleic acid is “perfect match double-stranded nucleic acid”, “perfect match substrate” or “perfect match” It is called a “template”.
  • a primer that can hybridize to a template but forms one or more mismatched base pairs is called a “mismatch primer”, and a primer that forms a completely complementary base pair when hybridized to a template. This is referred to as “perfect match primer”.
  • the MutS protein for example, the MutS protein (AaeMutS) derived from Aquifex aeolicus is preferably used.
  • Aquifex aeolicus from which AaeMutS protein is derived is highly thermophilic and its growth temperature is about 90 ° C.
  • AaeMutS protein has high heat resistance and is stable up to a temperature of about 95 ° C.
  • the thermal stability of MutS protein can be analyzed by measuring the temperature at which the three-dimensional structure of the protein is maintained by circular dichroism (CD) spectroscopy.
  • CD circular dichroism
  • the activity measuring method of MutS protein is not restrict
  • a specific example of the AaeMutS protein includes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a protein functionally equivalent to the AaeMutS protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can also be used.
  • a protein functionally equivalent to the AaeMutS protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and Proteins having activity to suppress errors in nucleic acid amplification reactions are included.
  • deletion, addition, insertion or substitution of one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be performed by commonly used techniques such as site-directed mutagenesis (Zoller et al., Nucleic® Acids® Res. 10). 6478-6500, 1982) can be carried out by modifying the base sequence (SEQ ID NO: 2) encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid residue substitution is preferably a conservative substitution.
  • conservative substitutions between amino acid residues include glycine and proline, glycine and alanine or valine, leucine and isoleucine, glutamic acid and glutamine, aspartic acid and asparagine, cysteine and threonine, threonine and serine or alanine, lysine and arginine, etc. Substitutions between these amino acids are known.
  • a protein functionally equivalent to the AaeMutS protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 70% or more, 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a protein having an amino acid sequence having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and having an activity of suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction is also included. Since TthMutS showing only 37.5% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 also suppresses errors in nucleic acid amplification reactions such as PCR, proteins with lower identity can also be used in the present invention.
  • the activity of suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction refers to the activity of suppressing the occurrence of a base (error) different from the template base sequence during the nucleic acid amplification reaction. That is, for example, in a nucleic acid amplification reaction, the activity to suppress amplification (extension) from a mismatch primer relative to amplification (extension) from a perfect match primer and / or the mismatch second from amplification from a perfect match double-stranded nucleic acid. It refers to the activity of suppressing amplification from single-stranded nucleic acids.
  • the activity to suppress errors in nucleic acid amplification reactions also includes mutations generated by polymerases in nucleic acid amplification reactions, that is, the activity to suppress amplification from mismatched double-stranded nucleic acids generated by incorporation of wrong nucleotides by polymerase.
  • the MutS protein used in the present invention has one of the activity of suppressing errors in the nucleic acid amplification reaction, the activity of suppressing amplification from mismatched primers, and the activity of suppressing amplification from mismatched double-stranded nucleic acids. However, it preferably has both activities.
  • the occurrence frequency (mutation rate) of a base (error) different from the base sequence of the template in the nucleic acid amplification reaction due to the coexistence of MutS is, for example, 1/2 or less, preferably 1/3 or less. More preferably, it is reduced to 1/4 or less.
  • the frequency of error occurrence varies with the reaction conditions and can be reduced by optimizing the reaction conditions, but per 1000 bases, for example, less than 20 bases, preferably less than 10 bases, more preferably less than 5 bases, Preferably less than 2 bases, most preferably less than 1 base.
  • the amplification method of the present invention is used as a method for suppressing errors in the nucleic acid amplification reaction. You can also
  • the AaeMutS protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has domain I (residues 1-129 of SEQ ID NO: 1), domain II (residues 147-242 of SEQ ID NO: 1), domain III (245-377 of SEQ ID NO: 1). And 504-530 residues), domain IV (residues 396-503 of SEQ ID NO: 1), domain V (residues 532-746 of SEQ ID NO: 1), domain VI (residues 747-859 of SEQ ID NO: 1) It is thought to include. Domain I is considered to have mismatch base pair recognition function, domains II-IV are considered to have DNA binding function, domain V is considered to have dimer formation and ATP binding function, and domain VI is tetramer It is thought to have a forming domain.
  • domain IV is an essential site for the activity to suppress errors in the nucleic acid amplification reaction
  • a protein that is functionally equivalent to the AaeMutS protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a portion other than domain IV, particularly a portion other than domain I has a mutation.
  • the Aquifex Aaeolicus-derived MutS protein should be prepared based on its amino acid sequence according to a method known to those skilled in the art, for example, a method of chemically polymerizing amino acids one by one to synthesize a polypeptide (peptide synthesis method). You can also. However, since such a method is not suitable for industrial use from the viewpoint of cost, a method of producing by a genetic engineering technique using the AaeMutS gene is preferably used.
  • a recombinant vector containing a gene encoding MutS protein derived from Aquifex aeolicus (AaeMutS gene) is prepared, and a transformant obtained by introducing the vector into an appropriate host cell is cultured in a medium, and the culture A method of collecting from an object is preferably used.
  • the base sequence of the gene encoding the MutS protein derived from Aquifex aeolicus can be obtained from the NCBI database (www.ncbi.nlm.nih.gov), for example. Specifically, a gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 can be mentioned. Genes include nucleic acids, nucleic acids include single-stranded nucleic acids and double-stranded nucleic acids, and nucleic acids include DNA and RNA.
  • the MutS gene according to the present invention includes genes functionally equivalent to the gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, as listed in (a) to (e) below.
  • A a gene that hybridizes with a gene consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having an activity of suppressing an error in a nucleic acid amplification reaction
  • An activity comprising a nucleotide sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and suppressing errors in nucleic acid amplification reactions
  • C a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (d) one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • e A gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence having an identity of 70% or more with the amino
  • the SSC solution (1 ⁇ SSC) consists of 150 mmol / L NaCl and 15 mmol / L sodium citrate.
  • the AaeMutS gene may be extracted from, for example, the Aquifex aeolicus cells as described above, synthesized by a genetic engineering technique, or synthesized by a chemical technique.
  • a recombinant vector can be obtained, for example, by ligating the AaeMutS gene to an appropriate vector.
  • the vector for inserting the AaeMutS gene is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
  • the plasmid DNA include plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, and pUC119; plasmids derived from Bacillus subtilis such as pUB110 and pTP5; and plasmids derived from yeast such as YEp13, YEp24, and YCp50.
  • phage DNA examples include ⁇ phages such as Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, and ⁇ ZAP.
  • animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, insect virus vectors such as baculovirus, and the like can also be used.
  • the method for inserting the AaeMutS gene into the vector is not particularly limited, and conventionally known methods can be employed. Specific examples include, for example, a method in which a purified AaeMutS gene (DNA) is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector DNA, and the two are linked.
  • the AaeMutS gene is preferably incorporated into the vector under conditions such that, for example, the protein encoded by it is expressed.
  • cis elements such as enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selectable markers, ribosome binding sequences ( SD sequences, KOZAK sequences, etc.) can also be linked.
  • selectable markers include a drug resistance gene such as a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
  • the transformant can be obtained, for example, by introducing a recombinant vector into a host.
  • the host is not particularly limited as long as it can express AaeMutS protein by a recombinant vector, and can be selected in consideration of the host-vector system according to the type of the recombinant vector.
  • Specific examples of the host include, for example, Escherichia genus such as Escherichia coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas putida, and bacteria belonging to genus Rhizobium such as Rhizobium meliloti.
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, animal cells such as COS cells and CHO cells, and insect cells such as Sf9 and Sf21 can also be used.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be employed. Specific examples include, for example, a method using calcium ions (Cohen, SN et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114), DEAE dextran method, electroporation method and the like. It is done.
  • AaeMutS protein can be prepared by culturing the transformant. Furthermore, AaeMutS protein may be isolated from the obtained culture. “Culture” includes, for example, a culture supernatant containing cultured transformants, a supernatant of the culture, cultured cells or cultured cells, or a disrupted product of cultured cells or cultured cells.
  • the transformant is cultured according to, for example, a normal method applied to host culture, and the conditions can be determined appropriately according to, for example, the type of host.
  • the AaeMutS protein when the AaeMutS protein is produced in cells or cells, it can be isolated by disrupting the cells or cells after culturing. In addition, when the AaeMutS protein is produced outside the cells or cells, for example, it can be isolated by using the culture solution as it is or by removing the cells or cells from the culture solution by centrifugation or the like. Thereafter, the AaeMutS protein can also be purified from the culture by combining general biochemical methods used for protein isolation and purification alone or in combination as appropriate.
  • the purification method is not particularly limited, and examples thereof include ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the tag sequence when a protein to which a tag sequence is added is expressed for purification, the tag sequence can be removed by protease treatment or the like during or after the purification step.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed using a reaction solution obtained by bringing a nucleic acid sample, a primer, and a MutS protein into contact with each other.
  • the addition amount of MutS in the reaction solution is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the amount of the nucleic acid sample at the start of the reaction and the amounts of various primers.
  • the amount of nucleic acid sample at the start of the reaction per 25 ⁇ L of the reaction solution is, for example, 0.1 to 1000 ng, preferably 0.5 to 500 ng, more preferably 2 to 200 ⁇ ng, and the total amount of all primers is For example, 0.01 to 1000 pmol, preferably 0.05 to 500 pmol, more preferably 0.1 to 100 pmol, and the amount of MutS protein is, for example, 0.01 to 1000 ⁇ g, preferably 0.05 to 500 ⁇ g, More preferably, it is 0.1 to 100 ⁇ g.
  • the MutS protein may be activated by, for example, an activator, for example, in order to further avoid binding to the perfect match double-stranded nucleic acid.
  • the activator is not particularly limited, but for example, ATP, ADP, ATP- ⁇ -S (adenosine 5′-O- (3-thiotriphosphate)), AMP-PNP (adenosine 5 ′-[ ⁇ , ⁇ -Imido] triphosphate) and the like, and other examples include nucleotides capable of binding to MutS.
  • Activation can be performed by, for example, incubating MutS and an activating agent at room temperature for several seconds to several minutes.
  • a nucleic acid amplification reaction may be performed in the presence of a single-strand binding protein (SSB).
  • SSB single-strand binding protein
  • SSB is not particularly limited, and conventionally known proteins can be used.
  • Specific examples of SSB include, for example, single-stranded binding protein derived from E. coli, Drosophila, and Xenopus, gene 32 protein derived from T4 bacteriophage, and other proteins derived from other species. .
  • the type of nucleic acid sample at the start of the reaction is not limited at all, and may be, for example, a nucleic acid derived from a natural product or a non-natural product nucleic acid by synthesis or the like.
  • the nucleic acid sample include polynucleotides such as DNA and RNA.
  • the polynucleotide includes oligonucleotides.
  • the polynucleotide may contain, for example, an unmodified nucleotide, may contain a modified nucleotide, may contain a natural nucleotide, or may contain a non-natural nucleotide.
  • Non-natural nucleotides include, for example, bases other than the bases of natural nucleotides.
  • the bases include xanthosines, diaminopyrimidines, isoG, isoC (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6329-6333). , 1995).
  • the polynucleotide may include artificial synthetic nucleic acids such as LNA, PNA (peptide nucleic acid), morpholino nucleic acid, methyl phosphonate nucleic acid, S-oligonucleic acid, and may be a chimeric molecule thereof.
  • DNA include genomic DNA, cDNA, and synthetic DNA.
  • RNA include total RNA, mRNA, rRNA, siRNA, hnRNA, synthetic RNA, spliced RNA, and unspliced RNA.
  • RNA DNA
  • cDNA DNA
  • the nucleic acid sample at the start of the reaction can be prepared from, for example, a sample derived from a living body such as blood, organ, tissue, or cell, or a sample containing microorganisms such as food, soil, or waste water.
  • the living body include animals including humans and non-humans, plants, and the like.
  • RNA contained in the sample include RNA present in the nucleus and cytoplasm, RNA derived from infected viruses and bacteria, and the like.
  • the recovery of the test nucleic acid from the sample is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted, and the recovered nucleic acid can be purified or fragmented as necessary.
  • the nucleic acid sample may be, for example, a double-stranded nucleic acid or a single-stranded nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid may be any of double-stranded DNA, double-stranded RNA, double-stranded DNA and RNA, and the like.
  • the double-stranded nucleic acid may be used as a template nucleic acid as it is, or for example, a nucleic acid amplified with a vector such as a phage or a plasmid can be used as the template nucleic acid.
  • the amplification reaction may be started as it is, or a step of denaturing the double-stranded nucleic acid into a single-stranded nucleic acid may be included as necessary.
  • the denaturing method is not particularly limited, and examples thereof include a method of changing the temperature of the reaction solution and a method of changing the pH of the reaction solution.
  • the double-stranded nucleic acid is denatured into a single-stranded nucleic acid by raising the temperature to 40 to 120 ° C., preferably about 95 ° C., and then the temperature is lowered to 0 to 65 ° C.
  • the primer it is preferable to anneal the primer to the single-stranded nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid is denatured into a single-stranded nucleic acid, and subsequently the pH of the reaction solution is lowered to about 6 to 9, It is preferable to anneal the primer to the single-stranded nucleic acid.
  • the type of primer to be used is not particularly limited and can be appropriately determined according to, for example, the type of nucleic acid sample, the type of target nucleic acid region, the type of nucleic acid amplification method, and the like.
  • at least one type is preferably a primer that can hybridize to a target nucleic acid region in a nucleic acid sample.
  • a primer for amplifying a target nucleic acid region for example, a primer that hybridizes to the sense strand and a primer that hybridizes to the antisense strand are preferably used as a pair of primer sets.
  • one type of primer set may be used, or two or more types may be used in combination.
  • two or more types of nucleic acid regions may be amplified in the same reaction solution.
  • the primer in the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the nucleic acid sample, the target nucleic acid region, the type of nucleic acid amplification method, and the like.
  • the primer may be, for example, a natural product-derived polynucleotide or a non-natural product polynucleotide by synthesis or the like.
  • the polynucleotide may be any of, for example, deoxyribonucleotides, modified deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified ribonucleotides, polynucleotides containing these derivatives, or chimeric polynucleotides.
  • ribonucleotide derivative examples include ribonucleotides in which the oxygen atom at the ⁇ -position is replaced with a sulfur atom.
  • the primer may include, for example, an artificially synthesized nucleic acid such as LNA, PNA (peptide nucleic acid), morpholino nucleic acid, methyl phosphonate nucleic acid, S-oligonucleic acid, or a chimeric polynucleotide thereof.
  • the polynucleotide includes oligonucleotides.
  • the primer is preferably hybridized (annealed) to a target nucleic acid region (hybrid region) in a nucleic acid sample, for example, under stringent conditions, and more preferably, the target nucleic acid under stringent conditions. It is preferable to hybridize only to the region.
  • Stringent conditions can be determined, for example, depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex between the primer and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, and the like. For example, J. Sambrook, E. F. See Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
  • the primer when a nucleic acid sample and a primer are hybridized under a temperature slightly lower than the melting temperature of the primer, the primer can be specifically hybridized to the target nucleic acid region.
  • a primer can be designed by, for example, commercially available primer construction software such as Primer 3 (manufactured by Whitehead Institute for Biomedical Research).
  • a polymerase can be used for amplification of the target nucleic acid region.
  • the polymerase is not particularly limited, and a conventionally known polymerase can be used.
  • the polymerase may be naturally derived, may be an enzyme obtained by a genetic engineering technique, or may be a mutant with an artificial mutation.
  • Specific examples of the polymerase include a polymerase derived from the genus Aquifex, a polymerase derived from the Thermus genus, a polymerase derived from the genus Bacillus, a polymerase derived from the genus Geobacillus, a polymerase derived from the genus Alicyclobacillus, and a polymerase derived from Escherichia coli.
  • the polymerase derived from the genus Aquifex is preferably, for example, a DNA polymerase derived from Aquifex aeolicus, and specifically, a DNA polymerase III ⁇ subunit derived from Aquifex aeolicus.
  • Examples of the polymerase derived from Thermus genus include DNA polymerase derived from Thermus aquaticus (Taq DNA polymerase), DNA polymerase derived from Thermus thermophilus (Tth DNA polymerase) and the like.
  • Polymerases derived from the genus Alicyclobacillus include those derived from Alicyclobacillus acidocaldarius.
  • polymerase derived from the genus Bacillus examples include, for example, a polymerase derived from the thermophilic Bacillus genus. Specific examples include a DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus (Bst DNA polymerase), a DNA polymerase derived from Bacillus caldotenax (Bca DNA polymerase (registered trademark)). Examples of the DNA polymerase include BcaBEST DNA polymerase and Bca (exo-) DNA polymerase.
  • a polymerase derived from the genus Geobacillus for example, a polymerase derived from Geobacillus caldoxylosilyticus is preferable, and a specific example includes a polymerase derived from Geobacillus caldoxylosilyticus DSM12041.
  • Vent (registered trademark) DNA polymerase for example, Vent (registered trademark) DNA polymerase, Vent (registered trademark) (Exo-) DNA polymerase, DeepVent (registered trademark) DNA polymerase, DeepVent (registered trademark) (Exo-) DNA polymerase, ⁇ 29 phage DNA
  • examples include polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Pfu turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, Thermonator DNA polymerase, DNA polymerase III ⁇ subunit, and the like.
  • the template nucleic acid contains unnatural nucleotides
  • Y188L / E478Q mutant HIV ⁇ ⁇ I reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase, Klenow fragment of DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, HotTub It is preferable to use DNA polymerase or the like (Michael Sismour. 1 et al., Biochemistry, 42, No.28, 8598, 2003, U.S. Pat. No. 6,617,106, Michael J. Lutz et al., Bioorganic & Medical Chemistry letters 8 , 1149-1152, 1998 etc.).
  • a substance that improves the heat resistance of the enzyme such as trehalose may be added to the reaction solution. This makes it possible to more efficiently amplify nucleic acids containing unnatural nucleotides.
  • DNA polymerase derived from Aquifex aaeolicus DNA polymerase III ⁇ subunit derived from Aquifex aaeolicus, KOD DNA polymerase, DNA polymerase derived from Thermus aquaticus, DNA polymerase I derived from Thermus aquaticus are preferably used.
  • a polymerase having strand displacement activity (strand displacement ability) is preferable, and those having normal temperature, intermediate temperature and heat resistance can be suitably used.
  • the polymerase those having substantially no 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity are preferable.
  • examples of such polymerases include Klenow fragment of Escherichia coli derived DNA polymerase I, mutants lacking the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of the aforementioned thermophilic Bacillus genus polymerase, and the like. It is done. Specific examples of the latter include 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity deletion mutants of Bst ⁇ DNA polymerase and Bca ⁇ ⁇ DNA polymerase.
  • the enzyme used for the reaction is not particularly limited as long as it has a cDNA synthesis activity using RNA as a template.
  • Specific examples include avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV RTase), Rous-related virus 2 reverse transcriptase (RAV-2 RTase), Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase (MMLV RTase), and the like.
  • AMV RTase avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase
  • RAV-2 RTase Rous-related virus 2 reverse transcriptase
  • MMLV RTase Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase
  • a DNA polymerase having reverse transcription activity can also be used.
  • Specific examples include polymerases derived from Thermus genus such as Tth DNA polymerase, and polymerases derived from thermophilic Bacillus genus.
  • Etc. can also be used.
  • examples of the polymerase derived from the thermophilic Bacillus genus include Bst DNA polymerase, Bca DNA polymerase, BcaBEST DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase and the like.
  • Bca DNA polymerase does not require manganese ions in the reaction, and can synthesize cDNA while suppressing secondary structure formation of template RNA under high temperature conditions.
  • a reverse transcription reaction using total RNA or mRNA as a template and a cDNA obtained by the reverse transcription reaction can be obtained.
  • the DNA polymerase reaction as a template can be performed with one kind of polymerase.
  • the present invention is not limited to this, and for example, various DNA polymerases as described above may be used in combination with the aforementioned reverse transcriptase such as MMLV-RTase.
  • the amount of the enzyme (eg, polymerase) in the reaction solution of the nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 1000 U, preferably 0.05 to 500 U, more preferably 0.1 to 200 U per 25 ⁇ L of the reaction solution. is there.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted.
  • the nucleic acid amplification reaction may be performed, for example, by changing the temperature, or may be performed at a constant temperature.
  • Examples of the former include a polymerase chain reaction (PCR) method (see, for example, Patent Nos. 2502041, 2546576, and 2703194), an RT-PCR method (see, for example, Trends in Biothechnology, Vol.10, pp.146). -153, 1992, etc.).
  • PCR usually includes a denaturation step in which a double-stranded nucleic acid is denatured into a single-stranded nucleic acid, an annealing step in which a primer is hybridized to the single-stranded nucleic acid, and an extension step in which extension from the hybridized primer is performed.
  • the latter is a so-called isothermal amplification method
  • the constant temperature includes, for example, not only maintaining a set temperature accurately but also a condition of a substantially constant temperature.
  • the “substantially constant temperature” includes, for example, the meaning of temperature change that does not impair the functions of various components used in the amplification reaction.
  • an isothermal amplification method for example, refer to Smart Amplification Process method (WO01 / 030993, WO2004 / 040019, WO2005 / 063977, Mitani, Y. et al., Nature Methods, 2007, Vol. 4, No. 3, 257-262 ), SDA (Strand Displacement Amplification) method (see JP 10-313900), improved SDA method, NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) method (see Japanese Patent No. 2650159), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method (See Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63), ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method (see WO00 / 56877) It is done.
  • the Aquifex aeolicus-derived MutS (AaeMutS) of the present invention has a high heat resistance and is stable up to a temperature of about 95 ° C, and therefore includes a reaction at a temperature of 85 ° C or higher, particularly 90 ° C or higher, for example, 95 ° C or higher. It can be used particularly advantageously in nucleic acid amplification reactions. Therefore, the present invention is advantageous because an error in the nucleic acid amplification reaction can be effectively suppressed in the nucleic acid amplification reaction performed by varying the temperature change, particularly PCR. Further, since it is stable and does not deactivate even at high temperatures, there is no need to supplement MutS additionally during the nucleic acid amplification reaction, and the process is simple.
  • PCR involves amplification of a target sequence by changing the reaction temperature, for example, by dissociating double-stranded nucleic acid, annealing the primer to the dissociated single strand, and synthesizing nucleic acid from the primer. Can do.
  • the conditions for the PCR method are not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • primers for example, the type of nucleic acid amplification reaction or the type of target sequence for amplification, and one or more types may be used.
  • One type or two or more types of primer sets to be paired may be used.
  • the concentration of each component in the reaction solution is not particularly limited, but is as described above, for example.
  • the concentration of dNTP in the reaction solution is, for example, 0.01 to 100 mmol / L, preferably 0.1 to 10 mmol / L.
  • the dNTP includes, for example, dATP, dTTP, dGTP, and dCTP, and may further include dUTP instead of or in addition to dTTP.
  • NTP ATP, UTP, GTP, CTP
  • dNTP may be added instead of or in addition to dNTP.
  • the reaction solution may further contain, for example, a buffer solution, a surfactant, a catalyst, DMSO (dimethyl sulfoxide), betaine, DTT (dithiothreitol), a chelating agent such as EDTA, glycerol, and the like.
  • a buffer solution examples include Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, and the like, and the concentration in the reaction solution is, for example, 0.001 to 1000 mmol / L, pH Is, for example, 5-10.
  • the surfactant include a Tween system such as Tween-20 and a Triton system such as Triton X-100.
  • the catalyst examples include potassium salts such as potassium acetate, ammonium salts such as ammonium sulfate, magnesium salts such as magnesium sulfate, and the like.
  • potassium salts such as potassium acetate
  • ammonium salts such as ammonium sulfate
  • magnesium salts such as magnesium sulfate
  • DMSO betaine
  • formamide such as ammonium sulfate
  • glycerol glycerol
  • enzyme stabilizers for stabilizing enzymes
  • glycerol bovine serum albumin
  • saccharide examples include monosaccharides and oligosaccharides. Specifically, trehalose, sorbitol, mannitol and the like can be used.
  • reaction solution may contain, for example, an acidic substance described in WO99 / 54455, a cation complex, or the like.
  • the reaction solution may contain cobalt ions, and the effect of MutS can be improved by replenishing the cobalt ions. Any of these various components may be used, for example, or two or more of them may be used in combination.
  • the present invention also relates to a reagent for nucleic acid amplification.
  • the reagent of the present invention is characterized by containing the MutS protein as described above, and other configurations are not particularly limited.
  • the reagent of the present invention may further contain reagents such as primers, enzymes such as polymerase, dNTPs, buffers, melting temperature adjusting agents, enzyme stabilizers, and the like.
  • the addition ratio of each component in the nucleic acid amplification reagent of the present invention is not particularly limited, but for example, a ratio such that the concentration is as described above when added to the reaction solution of the amplification reaction is preferable.
  • the reagent for nucleic acid amplification of the present invention may be, for example, a kit for nucleic acid amplification. In this case, for example, it is preferable to further include instructions for use.
  • each component may be accommodated in a container, respectively, for example, or may be appropriately combined and stored in each container.
  • the form and material of the container are not particularly limited.
  • the reagent for nucleic acid amplification of the present invention contains a MutS protein and suppresses errors in the nucleic acid amplification reaction. Therefore, it can also be used as a reagent for suppressing errors in the nucleic acid amplification reaction.
  • the present invention also relates to a method for determining the presence or absence of a mutation in a target nucleic acid region.
  • the occurrence of errors is suppressed, that is, the amplification (extension) from the mismatch primer is specifically suppressed relative to the amplification (extension) from the perfect match primer.
  • the amplification (extension) from the mismatch primer is specifically suppressed relative to the amplification (extension) from the perfect match primer.
  • erroneous amplification from mismatched primers can be avoided, so that the presence or absence of mutation depending on the presence or absence of amplification can be determined with excellent reliability.
  • the determination method of the present invention is useful for determining, for example, the susceptibility to various diseases, whether or not the disease is present, and the sensitivity and resistance to a drug for the disease.
  • the normal sequence is a normal sequence and the disease patient sequence is a mutant sequence .
  • the gene of the subject is used as the nucleic acid sample, and it is determined whether the target site is normal type or mutant type.
  • the target site is a normal type
  • the nucleic acid sample has a normal type sequence, and the subject can be determined to be less likely to have a disease or to be a healthy person.
  • the target site is mutated
  • the nucleic acid sample is a mutated sequence, and the subject can be determined to be highly likely to have a disease or to be a disease patient.
  • the target site in the nucleic acid sample may be, for example, 1 base (mononucleotide) or 2 bases (dinucleotide) or more. In the latter case, the target site may be continuous or discontinuous. Among them, it is preferable to apply the determination method of the present invention when the target site for determination is a single base or a mononucleotide. If the primer and the hybrid region in the nucleic acid sample differ by only one base, the other sequences are completely homologous, so even if the nucleic acid sample has a base that is mismatched to the primer, the primer hybridizes to the nucleic acid sample. Easy to soy.
  • the determination method of the present invention is suitable for determination of single nucleotide polymorphism, for example.
  • the mismatch generated when the primer is hybridized to the nucleic acid sample may be, for example, one base, a plurality of consecutive bases, or a plurality of discontinuous bases.
  • the upper limit of the plurality of bases is not particularly limited, but for example, a number that can maintain the double-stranded state of the nucleic acid sample and the primer is preferable.
  • the upper limit is, for example, 5 bases or less, more preferably 3 bases or less, particularly preferably 2 bases or less. is there.
  • the amplification product obtained by the amplification reaction is detected and the presence or absence of amplification is confirmed.
  • the detection of the amplification product may be performed, for example, over time during the reaction or after a certain time has elapsed from the start of the reaction.
  • the former is so-called real-time detection, and may be, for example, continuous detection or intermittent detection. In the latter case, for example, it is preferable to detect the amplification product at the start of the reaction and after a lapse of a certain time, and confirm the presence or absence of amplification from the fluctuation.
  • Examples of the detection method of the amplification product include a method of detecting an amplification product of a specific size by general gel electrophoresis, and can be detected by a fluorescent substance such as ethidium bromide or SYBR (registered trademark) Green. . It is also possible to detect by using a probe labeled with a labeling substance and hybridizing it to an amplification product.
  • An example of the labeling substance is biotin. Biotin can be detected by, for example, binding with fluorescently labeled avidin or avidin to which an enzyme such as peroxidase is bound.
  • a method using immunochromatography for example, a method (immunochromatography method) using a chromatographic medium using a label detectable with the naked eye.
  • a method using immunochromatography method using a chromatographic medium using a label detectable with the naked eye.
  • the target site in the test nucleic acid sample is a wild type or a mutant type. For example, if a primer that is completely complementary to the region containing the target site in the wild-type sequence (perfect match primer) is used as the primer, if amplification is confirmed, the target site is the wild type and mutation Can be determined not to exist. When amplification is not confirmed, it can be determined that the target site is a mutant type and a mutation exists. On the other hand, if a primer that is completely complementary to the region containing the target site in the mutant sequence (perfect match primer) is used as a primer, for example, if amplification is confirmed, the target site is a mutant type. Yes, it can be determined that there is a mutation. Moreover, when amplification is not confirmed, it can be judged that a target site
  • the present invention significantly improves the existing PCR-related technology.
  • the inhibitory effect on the occurrence of errors in nucleic acid amplification reactions can be applied to a wide range of PCR-related technologies including viral and bacterial infections and SNP diagnosis. It is also a significant effect that the rate of mutagenesis by polymerase is reduced to about 1/3 to 1/4.
  • it can be advantageously used in gene cloning using DNA polymerase with low fidelity but high elongation efficiency. That is, in PCR using such a DNA polymerase, the use of MutS is an attractive option for enabling error-free gene construction.
  • Example 1 Protein Overexpression and Purification MutS from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus that can grow at 95 ° C. was prepared.
  • the Aquifex aeolicus MutS gene was amplified by PCR using A. aeolicus VF5 genomic DNA as a template.
  • the forward and reverse primers used for amplification are as follows.
  • E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Madison, WI) was transformed with pET-HisTEV / A. Aeolicus MutS and 1.5 L YT medium (0.8% (w / v) tryptone, 50 ⁇ g / ml ampicillin, The cells were cultured at 37 ° C. in 0.5% (w / v) yeast extract and 0.5% (w / v) NaCl. When the culture concentration reached 4 ⁇ 10 8 cells / ml, isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside was added to 100 ⁇ M. After inducing gene expression, the cells were grown at 37 ° C. for 4 hours and collected by centrifugation.
  • the fraction containing AaeMutS was detected and collected by SDS-PAGE, and ammonium sulfate was added to this fraction to a final concentration of 1M.
  • This solution was applied to a Toyopearl-Phenyl column (TOSOH, Tokyo, Japan) equilibrated with buffer I containing 1M ammonium sulfate sulfate.
  • the column was washed with buffer I (100 ml) containing 1 M ammonium sulfate and the protein was eluted with a 1-0 mm ammonium sulfate gradient with 300 ml of buffer I.
  • the A. aeolicus DnaE gene encoding the DNA polymerase III ⁇ subunit was amplified by PCR using A. aeolicus genomic DNA as a template.
  • the forward and reverse primers used for amplification are as follows.
  • E. coli Rosetta2 (DE3) (Novagen) was transformed with pET-HisTEV / A.
  • Aeolicus DnaE Cells were cultured and collected by the same method as that for overexpression of A. aeolicus MutS. AaeDnaE was purified by the same method as AaeMutS.
  • Example 2 Circular Dichroism (CD) Spectroscopy
  • the thermal stability of AaeMutS or TthMutS obtained in Example 1 was measured by circular dichroism (CD) spectroscopy.
  • CD measurement was performed using a Jasco spectropolarimeter J-720W (Jasco, Tokyo, Japan). All measurements were performed using a 0.1 cm cell. Residual molar ellipticity [ ⁇ ] was defined as 100 ⁇ obs / lc. Here, ⁇ obs represents the observed ellipticity, l represents the optical path length (cm), and c represents the amino acid residue molar concentration of each protein. The measurement was performed in a solution containing 50 mM potassium phosphate (pH 7.0), 20 mM NaCl, and 5 ⁇ M AaeMutS or TthMutS. The CD spectrum was measured at 25 ° C.
  • both TthMutS and AaeMutS showed spectra having negative maxima near 209 and 222 nm, indicating that the normal structure was maintained.
  • the thermal stability of this structure was evaluated by examining the thermal dependence of the value of [ ⁇ ] at 222 nm ([ ⁇ ] 222 ).
  • [ ⁇ ] 222 approached 0 at around 85 ° C.
  • Example 3 PCR using 80-bp DNA template
  • a system for monitoring the amplification efficiency of 80 base pair (bp) DNA was constructed (FIG. 3A). The number of cycles was set to 20. This is the midpoint of the PCR amplification curve ( Figure 3B).
  • the effects of Thermus thermophilus MutS (TthMutS), Aquifex aeolicus MutS (AaeMutS) and Aquifex aeolicus MutL C-terminal domain (AaeMutL CTD) were tested using mismatch-containing primers (FIG. 1A). Thereby, it was tested whether TthMutS, AaeMutS and AaeMutL CTD can suppress non-specific amplification caused by primer mishybridization.
  • Mispairs such as GT pairs and unpaired bases such as single base insertion / deletion loops (Modrich, P. & Lahue, R. Annu Rev Biochem 65, 101-133 (1996); Kunkel, T. A. & Erie, D. A. Annu Rev Biochem 74, 681-7102005 (2005)). Primers containing GT mispair as mispair and unpaired T as unpaired base were used.
  • TthMutS replication-type DNA polymerase families.
  • DNA was synthesized by BEX co (Tokyo, Japan).
  • BEX co Tokyo, Japan
  • the following 80-base single-stranded DNA represented by SEQ ID NO: 7: 5'-GGTAAGCGACATCTCTCTCTCGAGTGATACGTCCTAGCAGAATTCCGCTACATGAAGCTTCTAGAGGTTACTGCAGCCTGAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • the following primers were used as perfect match primers, GT mismatch primers, and unpaired T-containing primers.
  • aeolicus in the presence of various concentrations of TthMutS, AaeMutS or AaeMutL CTD Using DnaE, PCR was performed in 1 ⁇ Takara LA PCR buffer II (Takara) containing 20 nM template DNA, 400 nM primer, 400 m dATP, dTTP, dCTP and dGTP.
  • thermal cycler PC707 (ASTEC, Tokyo, Japan), a denaturation process at 80 ° C for 1 minute, an annealing process at 48 ° C for 1 minute, and an extension process at 70 ° C for 2 minutes (gradient is 1 minute), 20 PCR was performed by repeating the cycle. 6 ⁇ l reaction was mixed with 1 ⁇ l sample buffer (50% (v / v) glycerol and 0.05% (w / v) bromophenol blue), 9 in 1 x TBE buffer (89 mM trisborate and 2 mM EDTA). Electrophoresis was performed on a% polyacrylamide gel. The gel was stained with SYBR Gold (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) And the product detected with UV light at 254 nm. The amount of amplified DNA product was measured using ImageJ software.
  • TthMutS affected amplification by LA Taq.
  • LA Taq contains T. aquaticus DNA polymerase I (family A DNA polymerase) (Eom, S. H., Wang, J. & Steitz, T. A. Nature 382, 278-281 (1996)).
  • KOD polymerase family A DNA polymerase
  • FIG. 4A results when KOD polymerase is used are shown in FIG. 1C center panel and FIG. 4A, and the results when Aquifex aeolicus DnaE is used are shown in FIG.
  • TthMutS error suppression by TthMutS is widely applicable to all replicating DNA polymerases.
  • TthMutS appears to bind to the mismatched primer-template complex in the extension process and prevent access to the 3 ′ end of the DNA polymerase primer (FIG. 1D).
  • FIGS. 1F and G Results of testing amplification from mismatch template are shown in FIGS. 1F and G. Mismatches in the template did not affect amplification efficiency in the absence of TthMutS, but mismatch-specific suppression was observed when TthMutS was added (FIGS. 1F and G). The effect of TthMutS was observed in all three replication DNA polymerase family proteins (FIGS. 1G and 6).
  • TthMutS suppressed mismatch template amplification to the same extent regardless of the number of mismatches in the template (Fig. 8). This indicates that a single mismatch is sufficient to produce TthMutS-dependent suppression.
  • Fig. 1H The mechanism shown in Fig. 1H is conceivable as a mechanism by which MutS suppresses amplification from mismatched templates.
  • the mismatch in the template disappears in the denaturation step, but is regenerated in the annealing step and is considered to be recognized by MutS (FIG. 1H).
  • MutS binding to template mismatch is thought to inhibit progression with DNA polymerase strand displacement.
  • the C-terminal domain of A. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ aeolicus-derived heat-resistant protein MutL is stable to temperatures up to 95 ° C, but has no mismatch recognition ability and no mismatch-specific suppression ability (Figs. 5 and 7).
  • Example 4 PCR using genomic DNA template
  • TthMutS and AaeMutS could actually be used for PCR with longer oligonucleotide sequences.
  • Three different sequences (423, 594 and 1,278-bp) were amplified from T. thermophilus genomic DNA using perfect match primers. Subsequently, the PCR product was cloned and sequenced.
  • PCR was performed using LA Taq in the presence of 200 ⁇ M MnCl 2 under conditions where errors were likely to occur.
  • thermophilus HB8 genomic DNA 100 ⁇ M CoCl 2 , 400 nM dATP, dTTP, dCTP and dGTP in the presence of various concentrations of TthMutS or AaeMutS PCR was performed in GC I buffer (Takara). PCR was performed using a temperature control system and thermal cycler PC707 (ASTEC, Tokyo, Japan), repeating a denaturation step at 95 ° C for 1 minute, an annealing step at 58 ° C for 1 minute, and an extension step at 70 ° C for 2 minutes for 30 cycles. .
  • TthMutS When TthMutS was used, an additional TthMutS solution (equal to the protein solution added first) was replenished at the end of the 15th cycle. 10 ⁇ l of the reaction mixture was mixed with 1 ⁇ l of loading buffer (50% (v / v) glycerol, 0.9% (w / v) SDS, and 0.05% (w / v) bromophenol blue), and 1 ⁇ TBE buffer (89 (1.5 mM trisboric acid and 2 mM EDTA) were electrophoresed on a 1.5% agarose gel. The gel was stained with ethidium bromide and the product was detected with UV light at 254 nm. The amount of amplified DNA product was measured using ImageJ software.
  • reaction product was ligated to the pT7Blue vector (Novagen) using TA cloning and sequenced using the BigDye terminator version 3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • TthMutS reduces the polymerase mutation to about 1/3 (FIG. 2G).
  • the mutation rate was reduced to about 1/3 to 1/4 (FIG. 2H).
  • the results of sequence analysis of the PCR product showed that TthMutS had an equivalent effect on all mismatches.
  • AaeMutS suppressed non-specific amplification in both the 80-bp template (FIGS. 2I and J) and the genomic DNA template (FIGS. 2K and L).
  • the specificity factor of 0.4 ⁇ M AaeMutS for the 423-bp sequence was more than 1 ⁇ 10 6 . This is significantly higher than the specificity factor of TthMutS.
  • AaeMutS showed a sufficient inhibitory effect without supplementing additional protein solution during the reaction (FIGS. 2M and N). Sequence analysis of the PCR product also confirmed that AaeMutS reduces the rate of mutagenesis by polymerase to about 1/3 to 1/4 (FIGS. 2O and P).
  • Example 5 Mismatch recognition ability of AaeMutS and TthMutS at room temperature
  • AaeMutS and TthMutS the binding between double-stranded DNA containing a mismatch and AaeMutS and TthMutS was analyzed by gel shift assay. The experiment was performed at room temperature. 0-4 ⁇ M AaeMutS or TthMutS 100 nM perfect match double stranded DNA, GT mismatch double stranded DNA, unpaired T-containing double stranded DNA, 50 mM HEPES (pH 7.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2. Mixed in buffer containing 0.1% (w / v) BSA. For the production of double-stranded DNA of the substrate, the single-stranded DNA summarized in Table 1 below was hybridized.
  • a perfect match double-stranded DNA was prepared by hybridizing perfect match 1 with perfect match 2.
  • GT mismatch double-stranded DNA and unpaired T-containing double-stranded DNA were prepared by hybridizing 1 and 2.
  • the dissociation constants of TthMutS for perfect match, GT mismatch, and unpaired T-containing substrate were about 4.6, 0.78, and 0.050 ⁇ M, respectively (FIGS. 12A and 12B), and it can be said that they showed affinity for the mismatch.
  • the affinity for mismatch was low.
  • AaeMutS has a lower affinity for mismatch than TthMutS (FIGS.
  • the method of the present invention significantly improves the existing PCR-related technology.
  • the inhibitory effect on the occurrence of errors in nucleic acid amplification reactions can be applied to a wide range of PCR-related technologies including viral and bacterial infections and SNP diagnosis. It is also a significant effect that the rate of mutagenesis by polymerase is reduced to about 1/3 to 1/4.
  • it can be advantageously used in gene cloning using DNA polymerase with low fidelity but high elongation efficiency. That is, in PCR using such a DNA polymerase, the use of MutS is an attractive option for enabling error-free gene construction.

Abstract

　核酸増幅反応、特にPCRのための簡便なエラー抑制方法であって、非特異的増幅とポリメラーゼによる変異生成を抑制する方法を提供する。　本発明は、目的の核酸領域を増幅する方法であって、核酸試料と、プライマーと、MutSタンパク質とを接触させて核酸増幅反応を行うことを特徴とする方法に関する。

Description

核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法
　本発明は、核酸増幅方法、そのための試薬、核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法、及び遺伝子変異の有無の判定方法に関する。
　PCRに基づく技術においては、主に2つのタイプのエラーが問題となる。オリゴヌクレオチドの非特異的増幅とDNAポリメラーゼによる変異である。これらのエラーは、それぞれプライマーのミスハイブリダイゼーションと、DNAポリメラーゼによるデオキシリボヌクレオチドのミスインコーポレーションによるものである。非特異的増幅はPCRのアニーリング工程の温度を調節することにより抑制できる。しかし、特に、テンプレートとして巨大なDNAを用いる場合にエラーが起こりやすい。ポリメラーゼによるエラーは、忠実度の高い（high-fidelity）DNAポリメラーゼを用いることにより回避可能である。しかし、複製精度と伸長効率とはトレードオフの関係にあることから、忠実度の低い（low-fidelty）DNAポリメラーゼを用いなければ効率的に増幅できないオリゴヌクレオチド配列も多い。
　これらの2つのタイプのエラーの発生過程では、ミスマッチ塩基対が生じ、それが反応中のある段階において一時的に存在する。したがって、ミスマッチ認識タンパク質、MutSを用いて、反応産物からミスマッチオリゴヌクレオチドを除去することにより、PCRエラーを抑制することが期待されていた。非特許文献１には、PCR産物中のエラー含有配列を破壊するために、大腸菌のDNAミスマッチ修復システムを用いることが報告されている。非特許文献２には、固定化したThermus aquaticus由来MutS（TaqMutS）を用いてエラーフィルタリング技術を確立したことが記載されている。これらの技術により、DNA群からのエラーを含まない配列の選択性を向上させることはできるが、比較的複雑な工程を含み、単純なPCR反応には適用できない。
　特許文献１には、TaqMutSのミスマッチ認識能が低いこと、それよりもミスマッチ認識能が高いAlicyclobacillus acidocaldarius由来MutSが有用であることが示されている。一方、非特許文献３には、TaqMutSを用いて、等温増幅中の非特異的複製を抑制したことが記載されている。この技術によりSNPの正確な診断が達成されているが、この技術をPCRのような温度の変動又は高温での反応を含む核酸増幅反応に適用可能であるか、この技術によりポリメラーゼによって生成される変異を抑制できるかについては不明であった。
WO2010/061922
Smith, J. & Modrich, P. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 4374-4379 (1996) Binkowski, B. F., Richmond, K. E., Kaysen, J., Sussman, M. R. & Belshaw, P. J. Nucleic Acids Res 33, e55 (2005) Mitani, Y. et al. Nat Methods 4, 257-262 (2007)
　本発明者らは、TaqMutSと99%のアミノ酸配列同一性を有し、したがってTaqMutSと同等の性質を有すると考えられるThermus thermophilus由来MutS（TthMutS）の存在下でPCRを実施すると、核酸増幅反応におけるエラーを抑制することはできるが、耐熱性が不十分であるため、PCRサイクルの途中で追加のTthMutSを補充する必要があり、工程が煩雑になる問題があることを見出した。したがって、本発明の目的は、核酸増幅反応、特にPCRのための簡便なエラー抑制方法であって、ミスマッチプライマーからの伸長による非特異的増幅、及びポリメラーゼによって変異が導入されたミスマッチテンプレートからの増幅を抑制する方法を提供することである。
　本発明者らは、高度好熱菌Aquifex aeolicus由来のMutS（AaeMutS）が、常温においてミスマッチ認識能をほとんど有しないにもかかわらず、AaeMutSの存在下でPCRを実施すると、驚くべきことに、核酸増幅反応におけるエラーを効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）目的の核酸領域を増幅する方法であって、核酸試料と、プライマーと、MutSタンパク質とを接触させて核酸増幅反応を行うことを特徴とし、MutSタンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
である、前記方法。
（２）前記核酸増幅反応を、温度を変動させて行う、（１）記載の方法。
（３）前記核酸増幅反応がPCRである、（２）記載の方法。
（４）MutSタンパク質が、85℃以上で核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有する、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法であって、核酸試料と、プライマーと、MutSタンパク質とを接触させて核酸増幅反応を行うことを特徴とし、MutSタンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
である、前記方法。
（６）前記核酸増幅反応を、温度を変動させて行う、（５）記載の方法。
（７）前記核酸増幅反応がPCRである、（６）記載の方法。
（８）MutSタンパク質が、85℃以上で核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有する、（５）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）核酸増幅のための試薬であって、MutSタンパク質を含み、MutSタンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
である、前記試薬。
（１０）PCRのための試薬である、（９）記載の試薬。
（１１）MutSタンパク質が、85℃以上で核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有する、（９）又は（１０）記載の試薬。
（１２）目的の核酸領域の標的部位における変異の有無を判定する方法であって、（１）～（４）のいずれかに記載の方法により目的の核酸領域を増幅する工程、及び核酸増幅の有無を確認する工程を含む、前記方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-116926号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の方法により、核酸増幅反応において、極めて熱安定性の高いMutSタンパク質を単に添加するだけで、ミスハイブリダイズしたプライマー又はエラー含有配列からの増幅を抑制し、非特異的増幅及び増幅される塩基配列の変異を抑制できる。本発明の簡便な方法により、核酸増幅技術、特にPCR関連技術の効率及び正確性を大きく向上させることができる。
パーフェクトマッチプライマー、GTミスマッチプライマー、又は不対合T含有プライマーを用いた場合のハイブリダイゼーションの模式図を示す。 パーフェクトマッチ（左）、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（右)プライマーを使用して、パーフェクトマッチテンプレートを増幅した結果を示す。 パーフェクトマッチ（上)、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（下)プライマーからの産生物の相対量をTthMutS濃度に対してプロットした結果を示す。３つのグラフは、それぞれ、LA Taq（左)、KODポリメラーゼ（中央)又はA. aeolicus DnaE（右)を使用した場合の結果を示す。 MutSがミスマッチプライマー依存的増幅を抑制するメカニズムの模式図を示す。 図1F及び図1Gで使用したプライマー及びテンプレートのハイブリダイゼーションの模式図を示す。 パーフェクトマッチプライマーを使用して、パーフェクトマッチ（左)、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（右)テンプレートを増幅した結果を示す。 パーフェクトマッチ（上)、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（下)テンプレートから増幅された断片の相対量を、TthMutS濃度に対してプロットした結果を示す。３つのグラフは、それぞれ、LA Taq（左)、KODポリメラーゼ（中央)又はA. aeolicus DnaE（右)を使用した場合の結果を示す。 MutSが、ミスマッチテンプレートからの増幅を抑制するメカニズムの模式図を示す。 T. thermophilusゲノム中のttha1806遺伝子の423-bp領域を、TthMutS存在下で増幅し、電気泳動した結果を示す。Mは、500-bp DNAラダーマーカーを示す。15サイクル目の終わりに、追加のTthMutS溶液を補充した。TthMutSの終濃度を、パネルの最上部に示す。 図2Aにおける増幅を定量した結果を示す。非特異的増幅及び特異的増幅を、それぞれ白及び黒で示す。 tthb071遺伝子の594-bp領域をTthMutSの存在下で増幅し、電気泳動した結果を示す。 図2Cにおける増幅を定量した結果を示す。非特異的増幅及び特異的増幅を、それぞれ白及び黒で示す。 ttha1548遺伝子の1,278-bp領域をTthMutSの存在下で増幅し、電気泳動した結果を示す。 図2Eにおける増幅を定量した結果を示す。非特異的増幅及び特異的増幅を、それぞれ白及び黒で示す。 ttha1806（423 bp)を200μM MnCl2の存在下、0.3μM TthMutSの存在下又は非存在下で増幅し、pT7Blueベクターにクローニングし、T7プロモーターを用いて配列解析した結果を示す。423 bpあたりの変異数を示す。独立して実施した5回の実験の、平均 ± 標準偏差を表す。 ttha1548をMnCl2の非存在下で増幅し、pT7Blueベクターにクローニングし、T7プロモーター及びU-19-merプライマーを用いて配列解析した結果を示す。ttha1548の5’-及び3’-末端500 bp領域で検出された変異をカウントした。 80-bp DNAのPCRを200 nM AaeMutSの存在下で実施し、電気泳動した結果を示す。PM、GT及びΔTは、それぞれ、パーフェクトマッチ、GTミスマッチ及び不対合T含有プライマー又はテンプレートを表す。 図2Iにおける増幅を定量した結果を示す。 AaeMutSを用いて、図2Aと同じ実験を実施した結果を示す。 図2Kにおける増幅を定量した結果を示す。非特異的増幅及び特異的増幅を、それぞれ白及び黒で示す。 300 nM TthMutS又はAaeMutSの存在下でttha1806を増幅し、電気泳動した結果を示す。15サイクル目の終わりに、各反応チューブに、0（-）又は300 nM（+）のTthMutS又はAaeMutSを補充した。 図2Mにおける増幅を定量した結果を示す。非特異的増幅及び特異的増幅を、それぞれ白及び黒で示す。 AaeMutSを用いて、図2Gと同じ実験を実施した結果を示す。 AaeMutSを用いて、図2Hと同じ実験を実施した結果を示す。 80-bpパーフェクトマッチテンプレートDNAのPCRを、パーフェクトマッチプライマーを用いて実施した結果を示す。図3Aは、電気泳動の結果を示す。レーン1は、DNAポリメラーゼを含まない反応混合物であり、レーン2は、LA Taq hot start vesionを含む反応混合物であり、レーン3は、LA Taq hot start versionを含む反応混合物をEcoRIで消化したものであり、ここで、EcoRI部位は、テンプレートDNAの中心に位置する。図3Bは、各サイクルでPCRを停止し、反応混合物をPAGEで分析した結果を示す。増幅断片の量をImageJソフトウェアで定量し、サイクル数に対してプロットした。 ミスマッチプライマーを用いた80-bpパーフェクトマッチテンプレートのPCRに対するKODポリメラーゼ（A）又はA. aeolicus DnaE（B）の効果を示す。KODポリメラーゼ又はA. aeolicus DnaE、及びパーフェクトマッチ（左)、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（右)プライマーを用いてPCRを実施し、電気泳動した結果を示す。 図5Aは80-bpパーフェクトマッチテンプレートのPCRを、パーフェクトマッチ（左)又は不対合T含有（右)プライマーを用いて、A. aeolicus MutL C-末端ドメイン（MutL CTD)の存在下で実施し、電気泳動した結果を示す。図5Bは、増幅断片の量を定量し、A. aeolicus MutL CTD濃度に対してプロットした結果を示す。それぞれ、パーフェクトマッチプライマー（上）及び不対合T含有プライマー（下）からの増幅を示す。ミスマッチ認識能を有しない耐熱性タンパクは、ミスマッチプライマー依存的増幅に対して抑制効果を有しないことが示された。 パーフェクトマッチプライマーを用いた80-bpミスマッチテンプレートのPCRに対するKODポリメラーゼ及びA. aeolicus DnaEの効果を試験した結果を示す。図6Aは、KODポリメラーゼ用いてPCRを実施し、電気泳動した結果を示す。それぞれ、パーフェクトマッチ（左)、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（右)テンプレートを用いた結果を示す。図6Bは、A. aeolicus DnaE用いてPCRを実施し、電気泳動した結果を示す。それぞれ、パーフェクトマッチ（左)、GTミスマッチ（中央)又は不対合T含有（右)テンプレートを用いた結果を示す。 図7Aは、80-bpパーフェクトマッチ（左)又は不対合T含有（右)テンプレートのPCRを、パーフェクトマッチプライマーを用いて、A. aeolicus MutL CTDの存在下で実施し、電気泳動した結果を示す。図7Bは、増幅断片の量を定量し、A. aeolicus MutL CTD濃度に対してプロットした結果を示す。ミスマッチ認識能を有しない耐熱性タンパク質は、ミスマッチテンプレート依存的増幅に対して抑制効果を有しないことが示された。 TthMutS効果の、80-bpテンプレート中のミスマッチ数への依存性を試験した結果を示す。図8Aは、0、1、2又は3個の不対合Tを有するテンプレートを用いてPCRを実施し、電気泳動した結果を示す。それぞれ、LA Taq hot start versionとパーフェクトマッチプライマーを用いて、TthMutSの非存在下又は存在下でPCRを実施した。図8Bは、増幅断片の量を定量した結果を示す棒グラフである。 TthMutSのCD測定の結果を示す。図9Aは、TthMutSの遠紫外線CDスペクトルを示す。図9Bは、222 nmにおける残基モル楕円率の温度依存性を示す。加熱速度は1℃/分とした。 TthMutSのエラー抑制能に対するのCoCl2の効果を示す。PCRを実施して、T. thermophilus HB8ゲノムDNAから、パーフェクトマッチプライマーを用いて遺伝子を増幅し、電気泳動した結果を示す。図10Aは、ttha1806の423-bp領域を増幅した結果を示す。図10Bのグラフは、図10Aにおける非特異的増幅及び特異的増幅の定量結果を、それぞれ白及び黒で示す。図10Cは、tthb071の594-bp領域を増幅した結果を示す。図10Dのグラフは、図10Cにおける非特異的増幅及び特異的増幅の定量結果を、それぞれ白及び黒で示す。図10Eは、ttha1548の1,278-bp領域を増幅した結果を示す。図10Fのグラフは、図10Eにおける非特異的増幅及び特異的増幅の定量結果を、それぞれ白及び黒で示す。 AaeMutSのCD測定の結果を示す。図11Aは、AaeMutSの遠赤外線CDスペクトルを示す。図11Bは、222 nmにおける残基モル楕円率の温度依存性を示す。加熱速度は1℃/分とした。 TthMutS と AaeMutS の室温におけるミスマッチ認識能を比較した結果を示す。図12Aは、TthMutS をパーフェクトマッチ二本鎖DNA（■）、GTミスマッチ二本鎖DNA（●）、不対合T含有二本鎖DNA（▲）と混合し、電気泳動した結果を示す。図12Bは、Aのゲル写真からシフトしたシグナル（TthMutS が結合したDNA）を定量し、全体のシグナル量に占める%を、TthMutS 濃度に対してプロットした結果を示す。 図12C及び12Dは、図12A及び12Bと同じ操作を AaeMutS を用いて行った結果を示す。
　本発明は、核酸増幅反応において、MutS タンパク質を共存させることを特徴とする。MutSタンパク質（以下、単にMutSと称する場合もある）とは、例えば、ミスマッチ結合タンパク質又はミスマッチ認識タンパク質ともいう。MutSは、一般に、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対（以下、単にミスマッチと称する場合もある）を認識し、ミスマッチ塩基対に結合可能なタンパク質である。
　本発明において「ミスマッチ塩基対」とは、例えば、アデニンとチミン又はウラシルとの組合せ及びグアニンとシトシンとの組合せのような、相補的な正常塩基対ではなく、例えば、グアニンとチミンのような非相補的な塩基対を意味し、さらに、二本鎖核酸において、一方の鎖が、他方の鎖の所定塩基に対応する部位において塩基を欠失し、その部分で塩基対が欠失している状態（不対合塩基とも称する）も含む。以下、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を「ミスマッチ二本鎖核酸」、「ミスマッチ基質」又は「ミスマッチテンプレート」という。
　本発明において、ミスマッチ二本鎖核酸は、例えば、実質的には相補的な二本鎖核酸であって、１又は２以上のミスマッチ塩基対を有することにより、非相補的な領域を含む二本鎖核酸を意味する。他方、ミスマッチ塩基対に対して、完全に相補的な塩基対を「パーフェクトマッチ」、完全に相補的な二本鎖核酸を「パーフェクトマッチ二本鎖核酸」、「パーフェクトマッチ基質」又は「パーフェクトマッチテンプレート」という。さらに、テンプレートにハイブリダイズ可能であるが、１又は２以上のミスマッチ塩基対を形成するプライマーを「ミスマッチプライマー」といい、テンプレートにハイブリダイズしたときに完全に相補的な塩基対を形成するプライマーを「パーフェクトマッチプライマー」と称する。
　本発明において、MutSタンパク質としては、例えばAquifex aeolicus由来のMutS タンパク質（AaeMutS）が好適に使用される。以下、本発明をAaeMutSに言及して説明するが、本発明において使用されるMutSはこれに限定されるわけではない。AaeMutSタンパク質が由来するAquifex aeolicusは高度好熱であり、その生育温度は約90℃である。AaeMutSタンパク質は、耐熱性が高く、約95℃の温度まで安定である。MutSタンパク質の熱安定性は、円偏光二色性（CD）分光分析により、タンパク質の立体構造が維持される温度を測定することにより解析できる。また、MutSタンパク質の活性測定方法は、制限されず、当業者に周知の種々の方法により測定することができる。具体例としては、The Journal of Biological Chemistry 276, 34339-34347, 2001等の文献に記載されている方法が使用できる。したがって、AaeMutSタンパク質は、85℃以上、特に90℃以上、例えば95℃以上の温度での反応を含む核酸増幅反応において、特に有利に使用できる。
　AaeMutSタンパク質の具体例として、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列からなるAaeMutSタンパク質と機能的に同等のタンパク質も使用できる。配列番号１のアミノ酸配列からなるAaeMutSタンパク質と機能的に同等のタンパク質には、配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質が包含される。ここで数個とは、２～５個、好ましくは２～３個を意味する。配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１又は数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入又は置換は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Zollerら、Nucleic Acids Res.10 6478-6500,1982）により、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列（配列番号２）を改変することにより実施することができる。
　アミノ酸残基の置換は保存的置換であることが好ましい。アミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシンとプロリン、グリシンとアラニン又はバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン等のアミノ酸の間での置換が知られている。
　また、配列番号１のアミノ酸配列からなるAaeMutSタンパク質と機能的に同等のタンパク質には、配列番号１のアミノ酸配列と70%以上、75%以上、好ましくは80%以上、85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質も包含される。なお、配列番号１のアミノ酸配列と37.5%のみの同一性を示すTthMutSもPCRなどの核酸増幅反応においてエラーを抑制することから、より低い同一性を有するタンパク質も本発明において使用され得る。
　本発明において、核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性とは、核酸増幅反応の際にテンプレートの塩基配列とは異なる塩基（エラー）が発生することを抑制する活性をさす。すなわち、例えば核酸増幅反応において、パーフェクトマッチプライマーからの増幅（伸長）に対してミスマッチプライマーからの増幅（伸長）を抑制する活性、及び/又はパーフェクトマッチ二本鎖核酸からの増幅に対してミスマッチ二本鎖核酸からの増幅を抑制する活性をさす。核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性は、核酸増幅反応において、ポリメラーゼにより生成される変異、すなわちポリメラーゼによって誤ったヌクレオチドが取り込まれて生成されるミスマッチ二本鎖核酸からの増幅を抑制する活性も包含する。本発明において使用するMutSタンパク質としては、上記核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性のうち、ミスマッチプライマーからの増幅を抑制する活性及びミスマッチ二本鎖核酸からの増幅を抑制する活性のいずれかを有していればよいが、好ましくは両方の活性を有する。
　本発明によれば、MutSの共存により核酸増幅反応の際のテンプレートの塩基配列とは異なる塩基（エラー）の発生の頻度（変異生成率）は、例えば1/2以下、好ましくは1/3以下、より好ましくは1/4以下に低減される。エラーの発生の頻度は、反応条件により変動し、反応条件を至適化することによって低減され得るが、1000塩基当たり、例えば20塩基未満、好ましくは10塩基未満、より好ましくは5塩基未満、さらに好ましくは2塩基未満、最も好ましくは1塩基未満である。
　本発明の、目的の核酸領域を増幅する方法において使用するMutSタンパク質は核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するので、本発明の増幅方法を、核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法として使用することもできる。
　配列番号１のアミノ酸配列からなるAaeMutSタンパク質は、ドメインI（配列番号１の1-129残基）、ドメインII（配列番号１の147-242残基）、ドメインIII（配列番号１の245-377及び504-530残基)、ドメインIV（配列番号１の396-503残基)、ドメインV（配列番号１の532-746 残基)、ドメインVI（配列番号１の747-859残基)を含むと考えられる。ドメインIは、ミスマッチ塩基対認識機能を有すると考えられ、ドメインII～IVはDNA結合機能を有すると考えられ、ドメインVは、ダイマー形成及びATP結合機能を有すると考えられ、ドメインVIは、テトラマー形成ドメインを有すると考えられる。
　ドメインI-Vは、核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性に必須の部位であることから、上記の配列番号１のアミノ酸配列からなるAaeMutSタンパク質と機能的に同等のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、ドメインI-V以外の部分、特にドメインI以外の部分に変異を有するものであることが好ましい。
　Aquifex aeolicus由来のMutSタンパク質は、そのアミノ酸配列を元に当業者に公知の手法、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成する方法（ペプチド合成法）に従って調製することもできる。しかし、このような方法はコストの観点から工業的な利用には好適でないため、AaeMutS遺伝子を用いた遺伝子工学的手法により製造する方法が好ましく用いられる。すなわち、Aquifex aeolicus由来のMutSタンパク質をコードする遺伝子（AaeMutS遺伝子）を含む組換えベクターを作製し、該ベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取する方法が好ましく用いられる。
　なお、本発明において、例えば、分子生物学、微生物学及び組換え技術等の一般的方法は、当該技術分野の標準的な参考書籍を参照して実施できる[Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第3版(Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)；Current Protocols in Molecular biology(Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1987)；Methods in Enzymology (Academic Press);PCR Protocols: Methods in Molecular Biology(Bartlett & Stirling, Humana Press, 2003)；Antibodies:A Laboratory Manual(Harlow & Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987)]。
　Aquifex aeolicus由来のMutSタンパク質をコードする遺伝子（AaeMutS遺伝子）の塩基配列は、例えば、NCBIのデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）より入手できる。具体的には、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。遺伝子には、核酸が包含され、核酸には一本鎖核酸及び二本鎖核酸が包含され、核酸にはDNA及びRNAが包含される。本発明によるMutS遺伝子には、以下の(a)～(e)に挙げるような、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包含される。
（a）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（b）配列番号２の塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（c）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（d）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（e）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
　ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、0.7～1 mol/LのNaCl存在下、60～68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1～2倍濃度のSSC溶液を用い、65～68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、SSC溶液（1×SSC）とは、150 mmol/LのNaCl、15mmol/Lクエン酸ナトリウムからなる。
　AaeMutS遺伝子は、例えば、前述のようなAquifex aeolicus菌体から抽出してもよいし、遺伝子工学的手法により合成してもよいし、化学的手法により合成してもよい。
　組換えベクターは、例えば、適当なベクターにAaeMutS遺伝子を連結することにより得られる。AaeMutS遺伝子を挿入するためのベクターは、例えば、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等の大腸菌由来プラスミド；pUB110、pTP5等の枯草菌由来プラスミド；YEp13、YEp24、YCp50等の酵母由来プラスミド等が挙げられる。ファージDNAとしては、例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等のλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等を用いることもできる。
　ベクターにAaeMutS遺伝子を挿入する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、精製したAaeMutS遺伝子（DNA）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して、両者を連結する方法等が挙げられる。AaeMutS遺伝子は、例えば、それがコードするタンパク質を発現するような条件でベクターに組み込まれることが好ましい。このため、ベクターは、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、tacプロモーター等のプロモーターの他に、所望により、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列、KOZAK配列等）等を連結することもできる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
　形質転換体は、例えば、組換えベクターを宿主に導入することにより得られる。宿主としては、組換えベクターによりAaeMutSタンパク質を発現できるものであれば、特に制限されず、例えば、組換えベクターの種類に応じて、宿主－ベクター系を考慮して選択できる。宿主の具体例としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のEscherichia属、Bacillus subtilis等のBacillus属、Pseudomonas putida等のPseudomonas属、Rhizobium meliloti等のRhizobium属に属する細菌等が挙げられる。この他に、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、Sf9、Sf21等の昆虫細胞を用いることもできる。形質転換の方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
　形質転換体を培養することによってAaeMutSタンパク質を調製できる。さらに、得られた培養物からAaeMutSタンパク質を単離してもよい。「培養物」は、例えば、培養した形質転換体を含む培養液の他に、培養液の上清、培養細胞若しくは培養菌体、又は、培養細胞若しくは培養菌体の破砕物等を包含する。形質転換体を培養は、例えば、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われ、その条件等は、例えば、宿主の種類等に応じて適宜決定できる。
　AaeMutSタンパク質が、例えば、菌体内又は細胞内に生産される場合、培養後、菌体又は細胞を破砕することにより単離できる。また、AaeMutSタンパク質が、例えば、菌体外又は細胞外に生産される場合、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により培養液から菌体又は細胞を除去することで単離できる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、又は、適宜組み合わせることによって、培養物からAaeMutSタンパク質を精製することもできる。精製方法としては、特に制限されず、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、例えば、精製のために、タグ配列を付加したタンパク質を発現させる場合には、精製工程の間又は後に、プロテアーゼ処理等により、タグ配列を除去することもできる。
　本発明において、核酸増幅反応は、核酸試料と、プライマーと、MutSタンパク質を接触させて得られる反応液を用いて実施する。反応液におけるMutSの添加量は、特に制限されず、例えば、反応開始時の核酸試料の量及び各種プライマーの量等に応じて適宜決定できる。具体例として、反応液25μLあたり、反応開始時の核酸試料量は、例えば、0.1～1000ngであり、好ましくは0.5～500ngであり、より好ましくは2～200 ngであり、全プライマーのトータル量は、例えば、0.01～1000 pmolであり、好ましくは0.05～500 pmolであり、より好ましくは0.1～100 pmolであり、MutSタンパク質量は、例えば、0.01～1000μgであり、好ましくは0.05～500μgであり、より好ましくは0.1～100μgである。
　MutSタンパク質は、例えば、パーフェクトマッチ二本鎖核酸への結合をさらに回避するため、例えば、活性化剤により活性化されていてもよい。活性化剤は、特に限定されないが、例えば、ATP、ADP、ATP-γ-S(アデノシン5’-O-(3-チオ三リン酸))、AMP-PNP(アデノシン5’-[β,γ-イミド]三リン酸)等が挙げられ、この他に、MutSに結合できるヌクレオチドが挙げられる。活性化は、例えば、MutSと活性化剤とを、室温で、数秒間から数分間インキュベートすることで行える。
　さらに、一本鎖結合タンパク質（Single-Strand Binding protein:SSB）の共存下、核酸増幅反応を行ってもよい。SSBを併用することで、例えば、MutSタンパク質が一本鎖核酸に結合することを、より一層回避できる。SSBとしては、特に制限されず、従来公知のタンパク質が使用できる。SSBの具体例としては、例えば、大腸菌、ショウジョウバエ、及びアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、T4バクテリオファージ由来の遺伝子32タンパク質、この他に、他の種に由来するこれらのタンパク質が挙げられる。
　本発明において、反応開始時における核酸試料の種類は、何ら制限されず、例えば、天然物由来の核酸でもよいし、合成等による非天然物の核酸であってもよい。核酸試料としては、例えば、DNAやRNA等のポリヌクレオチドが挙げられる。なお、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドを含んでもよいし、修飾ヌクレオチドを含んでもよく、天然ヌクレオチドを含んでもよいし、非天然ヌクレオチドを含んでもよい。非天然ヌクレオチドとは、例えば、天然ヌクレオチドの塩基以外の塩基を含み、前記塩基としては、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、isoG、isoC(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6329-6333, 1995）等が挙げられる。また、ポリヌクレオチドは、例えば、LNA、PNA（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、S-オリゴ核酸等の人工合成核酸を含んでもよく、これらのキメラ分子であってもよい。DNAとしては、例えば、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA等が挙げられ、RNAは、例えば、全RNA、mRNA、rRNA、siRNA、hnRNA、合成RNA、スプライスドRNA、アンスプライスドRNA等が挙げられる。核酸試料がRNAの場合、例えば、逆転写反応によりRNAからDNA（cDNA）を生成し、得られたDNAをテンプレートとして、さらに増幅反応を行ってもよい。反応開始時の核酸試料は、例えば、血液、臓器、組織、細胞等の生体由来試料や、食品、土壌、排水等の微生物含有試料等から調製できる。前記生体としては、例えば、ヒト及び非ヒトを含む動物、ならびに植物等が挙げられる。試料に含まれるRNAとしては、例えば、核及び細胞質等に存在するRNA、感染したウイルス及び細菌由来のRNA等が挙げられる。なお、試料からの被検核酸の回収は、特に制限されず、従来公知の方法が採用でき、また、必要に応じて回収した核酸の精製や断片化を行うことができる。
　核酸試料は、例えば、二本鎖核酸でも一本鎖核酸でもよい。二本鎖核酸としては、例えば、二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNAとRNAとの二本鎖等のいずれであってもよい。二本鎖核酸は、そのままテンプレート核酸として使用してもよいし、例えば、ファージやプラスミド等のベクターで増幅されたものを、テンプレート核酸として使用することもできる。核酸試料が二本鎖核酸の場合、そのまま増幅反応を開始してもよいし、必要に応じて、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する工程を含んでもよい。変性方法は、特に制限されないが、例えば、反応液の温度を変化させる方法、及び、反応液のpHを変動させる方法がある。前者の場合、例えば、温度を40～120℃、好ましくは約95℃に上昇させることで、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性し、続いて、温度を0～65℃に降下させることで、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリングを行うことが好ましい。後者の場合、例えば、反応液のpHを約7～14に上げることで、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性し、続いて、反応液のpHを約6～9に下げることで、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリングを行うことが好ましい。
　使用するプライマーの種類は、特に制限されず、例えば、核酸試料の種類、目的の核酸領域の種類、核酸増幅法の種類等に応じて適宜決定できる。例えば、2種類以上のプライマーを使用する場合には、例えば、少なくとも1種類が、核酸試料における目的の核酸領域にハイブリダイズ可能なプライマーであることが好ましい。目的の核酸領域を増幅するためのプライマーとしては、例えば、センス鎖にハイブリダイズするプライマーとアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマーとを、一対のプライマーセットとして使用することが好ましい。プライマーセットは、例えば、1種類でもよいし、2種類以上を併用してもよい。また、対となるプライマーセットと、その他のプライマーとを組み合わせて使用してもよい。例えば、同一の反応液において、2種類以上の核酸領域を増幅してもよい。この場合、目的の核酸領域を増幅するためのプライマーとして、少なくとも1種類ずつ、目的の核酸領域にハイブリダイズ可能なプライマーを使用することが好ましい。
　本発明におけるプライマーは、特に制限されず、例えば、核酸試料、目的の核酸領域、核酸増幅法の種類等に応じて、適宜決定できる。プライマーは、例えば、天然物由来のポリヌクレオチドでもよいし、合成等による非天然物のポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドとしては、例えば、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、これらの誘導体を含むポリヌクレオチド又はキメラポリヌクレオチド等のいずれであってもよい。リボヌクレオチド誘導体としては、例えば、α位の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド等が挙げられる。プライマーは、例えば、LNA、PNA（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、S-オリゴ核酸等の人工合成核酸を含んでもよく、これらのキメラポリヌクレオチドであってもよい。なお、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを包含する。
　本発明において、プライマーは、例えば、ストリンジェントな条件下、核酸試料における目的の核酸領域（ハイブリッド領域）にハイブリダイズ（アニーリング）することが好ましく、より好ましくは、ストリンジェントな条件下、目的の核酸領域のみにハイブリダイズすることが好ましい。ストリンジェントな条件は、例えば、プライマーとその相補鎖との二本鎖の融解温度Tm（℃）及びハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定でき、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照できる。具体例として、プライマーの融解温度よりわずかに低い温度条件下、核酸試料とプライマーとのハイブリダイゼーションを行うと、プライマーを目的の核酸領域に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、例えば、Primer3（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）等の市販のプライマー構築ソフト等により設計できる。
　目的の核酸領域の増幅には、一般にポリメラーゼが使用できる。ポリメラーゼとしては、特に制限されず、従来公知のポリメラーゼが使用できる。ポリメラーゼは、例えば、天然由来でもよいし、遺伝子工学的手法により得られた酵素でもよいし、また、人工的に変異を加えた変異体であってもよい。ポリメラーゼの具体例としては、Aquifex属由来のポリメラーゼ、Thermus属由来のポリメラーゼ、Bacillus属由来のポリメラーゼ、Geobacillus属由来のポリメラーゼ、Alicyclobacillus属由来のポリメラーゼ、大腸菌（Escherichia coli）由来のポリメラーゼ等が挙げられる。Aquifex属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Aquifex aeolicus由来のDNAポリメラーゼが好ましく、具体的には、Aquifex aeolicus由来のDNAポリメラーゼIIIαサブユニットが挙げられる。Thermus属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Thermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）、Thermus thermophilus由来のDNAポリメラーゼ（Tth DNAポリメラーゼ）等が挙げられ、Alicyclobacillus属由来のポリメラーゼとしては、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のポリメラーゼが挙げられ、Bacillus属由来のポリメラーゼとしては、例えば、好熱性Bacillus属由来のポリメラーゼが好ましく、具体例としては、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ（Bst DNAポリメラーゼ）、Bacillus caldotenax由来のDNAポリメラーゼ（Bca DNAポリメラーゼ（登録商標））が挙げられる。また、DNAポリメラーゼとしては、例えば、BcaBEST DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ等も挙げられる。Geobacillus属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Geobacillus caldoxylosilyticus由来のポリメラーゼが好ましく、具体例として、Geobacillus caldoxylosilyticus DSM12041由来のポリメラーゼが挙げられる。この他にも、例えば、Vent（登録商標）DNAポリメラーゼ、Vent(登録商標)(Exo-)DNAポリメラーゼ、DeepVent（登録商標）DNAポリメラーゼ、DeepVent(登録商標)(Exo-)DNAポリメラーゼ、Ф29ファージDNAポリメラーゼ、MS-2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9゜Nm DNAポリメラーゼ、Therminator DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIIIαサブユニット等が挙げられる。また、テンプレート核酸が非天然ヌクレオチドを含む場合、例えば、取り込み効率の観点から、Y188L/E478Q変異型HIV I逆転写酵素、AMV逆転写酵素、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメント、9゜Nm DNAポリメラーゼ、HotTub DNAポリメラーゼ等を使用することが好ましい（Michael Sismour. 1 et al., Biochemistry, 42, No.28, 8598, 2003、米国特許第6617106号、Michael J. Lutz et al., Bioorganic & Medical Chemistry letters 8, 1149-1152, 1998等）。この場合、反応液に、さらに、トレハロース等の酵素の耐熱性を向上させる物質を添加してもよい。これによって、さらに効率的に非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅を行うことができる。
　これらのDNAポリメラーゼの中でも、Aquifex aeolicus由来のDNAポリメラーゼ、Aquifex aeolicus由来のDNAポリメラーゼIIIαサブユニット、KOD DNAポリメラーゼ、及びThermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus由来のDNAポリメラーゼIが好ましく用いられる。
　等温増幅法により核酸増幅を行う場合、ポリメラーゼとしては、例えば、鎖置換活性（鎖置換能）を有するものが好ましく、常温性、中温性及び耐熱性のものが好適に使用できる。ポリメラーゼとしては、実質的に、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが好ましい。このようなポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）由来DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、前述した好熱性Bacillus属由来のポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体等が挙げられる。後者の具体例としては、Bst DNAポリメラーゼ及びBca DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性欠失変異体等が挙げられる。
　逆転写反応を行う場合、前記反応に使用する酵素としては、例えば、RNAをテンプレートとするcDNA合成活性を有するものであれば、特に限定されない。具体例としては、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（AMV RTase）、ラウス関連ウイルス2逆転写酵素（RAV-2 RTase）、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（MMLV RTase）等が挙げられる。逆転写反応においては、この他に、例えば、逆転写活性を併せ持つDNAポリメラーゼを使用することもでき、具体例としては、Tth DNAポリメラーゼ等のThermus属由来のポリメラーゼや、好熱性Bacillus属由来のポリメラーゼ等も使用できる。好熱性Bacillus属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ、BcaBEST DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ等も挙げられる。Bca DNAポリメラーゼは、例えば、反応にマンガンイオンが不要であり、高温条件下、テンプレートRNAの二次構造形成を抑制しながらcDNAを合成できる。
　また、逆転写活性を併せ持つポリメラーゼとして、例えば、BcaBEST DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ等を使うことにより、全RNA若しくはmRNAをテンプレートとする逆転写反応と、逆転写反応により得られるcDNAをテンプレートとするDNAポリメラーゼ反応とを、1種類のポリメラーゼで行うことができる。なお、これには制限されず、例えば、前述のような各種DNAポリメラーゼと、MMLV RTase等の前述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
　核酸増幅反応の反応液における酵素（例えば、ポリメラーゼ）の量は、特に制限されないが、反応液25μLあたり、例えば、0.01～1000Uであり、好ましくは0.05～500Uであり、より好ましくは0.1～200Uである。
　核酸増幅法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。核酸の増幅反応は、例えば、温度を変動させて行ってもよいし、一定温度で行ってもよい。前者としては、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）法（例えば、特許第2502041号、第2546576号及び第2703194号等参照）、RT-PCR法（例えば、Trends in Biothechnology, Vol.10, pp.146-153, 1992等参照）等が挙げられる。PCRは、通常、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する変性工程、一本鎖核酸にプライマーをハイブリダイズさせるアニーリング工程、ハイブリダイズしたプライマーからの伸長を行う伸長工程を含む。後者は、いわゆる等温増幅法であり、一定温度とは、例えば、設定した温度を正確に維持するだけでなく、ほぼ一定温度の条件も含む。「ほぼ一定温度」とは、例えば、増幅反応に使用される各種成分の機能を損なわない程度の温度変化の意味を含む。等温増幅法としては、例えば、Smart Amplification Process法(WO01/030993、WO2004/040019、WO2005/063977、Mitani, Y. et al., Nature Methods, 2007, Vol. 4, No. 3, 257-262参照）、SDA法（Strand Displacement Amplification）法（特開平10-313900号参照）、改良SDA法、NASBA（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法（特許第2650159号参照）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63参照）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（WO00/56877参照）等が挙げられる。
　本発明のAquifex aeolicus由来のMutS（AaeMutS）は、耐熱性が高く、約95℃の温度まで安定であることから、85℃以上、特に90℃以上、例えば95℃以上の温度での反応を含む核酸増幅反応において、特に有利に使用できる。したがって、本発明は、温度変化を変動させて行う核酸増幅反応、特にPCRにおいて、核酸増幅反応におけるエラーを効果的に抑制できるため、有利である。また、高温でも安定で失活しないため、核酸増幅反応の途中で、追加でMutSを補充する必要がなく、工程が簡便である。
　PCRは、前述のように、反応温度を変化させることにより、例えば、二本鎖核酸の解離、解離した一本鎖へのプライマーのアニーリング、プライマーからの核酸合成により、標的配列の増幅を行うことができる。PCR法の条件は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できる。
　以下、二本鎖DNAを核酸試料（テンプレート）とする例をあげて説明する。核酸試料である二本鎖DNA、プライマー、MutS、DNAポリメラーゼ及びdNTPを含む反応液を準備する。なお、使用するプライマーの種類は、特に制限されず、例えば、核酸増幅反応の種類や、増幅目的の標的配列の種類に応じて設定でき、1種類又は2種類以上を使用してもよく、また、対となるプライマーセットを、1種類又は2種類以上を使用してもよい。
　反応液における各成分の濃度は、特に制限されないが、例えば、前述の通りである。また、反応液におけるdNTPの濃度は、例えば、0.01～100 mmol/Lであり、好ましくは0.1～10 mmol/Lである。dNTPは、例えば、dATP、dTTP、dGTP及びdCTPを含み、さらに、dTTPに代えて、又は加えてdUTPを含んでもよい。dNTPに代えて、又は加えてNTP（ATP、UTP、GTP、CTP）を加えてもよい。
　反応液は、さらに、例えば、緩衝液、界面活性剤、触媒、DMSO（ジメチルスルホキシド）、ベタイン、DTT（ジチオスレイトール）、EDTA等のキレート剤、グリセロール等を含んでもよい。緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液、トライシン緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられ、反応液における濃度は、例えば、0.001～1000 mmol/Lであり、pHは、例えば、5～10である。界面活性剤としては、例えば、Tween-20等のTween系、Triton X-100等のTriton系等が挙げられる。触媒としては、例えば、酢酸カリウム等のカリウム塩、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩等が挙げられる。また、例えば、核酸増幅の効率を向上するための融解温度調整剤として、DMSO、ベタイン、ホルムアミド、グリセロール等、酵素の安定化を図るための酵素安定化剤として、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類等を含んでもよい。糖類としては、例えば、単糖、オリゴ糖が挙げられ、具体的には、トレハロース、ソルビトール、マンニトール等が使用できる。また、反応液は、例えば、WO99/54455に記載されている酸性物質や、陽イオン錯体等を含んでもよい。また、反応液は、コバルトイオンを含んでいてもよく、コバルトイオンを補充することにより、MutSの効果を改善することができる。これらの各種成分は、例えば、いずれか1種類でもよいし、2種類以上を併用してもよい。
　本発明はまた、核酸増幅のための試薬に関する。本発明の試薬は、上記のようなMutSタンパク質を含むことを特徴とし、その他の構成は、特に制限されない。
　本発明の試薬は、さらに、プライマー、ポリメラーゼ等の酵素、dNTP、緩衝液、融解温度調整剤、酵素安定剤等の試薬類を含んでもよい。本発明の核酸増幅用試薬における各成分の添加割合は、特に制限されないが、例えば、増幅反応の反応液に添加した際、前述のような濃度となるような割合が好ましい。また、本発明の核酸増幅用試薬は、例えば、核酸増幅のためのキットであってもよい。この場合、例えば、さらに使用説明書を含むことが好ましい。また、本発明の試薬及びキットにおいて、各成分は、例えば、それぞれ単独で容器に収容されてもよいし、適宜組み合わせて、各容器に収容されてもよい。容器の形態や材質等も、特に制限されない。
　本発明の核酸増幅のための試薬は、MutSタンパク質を含み、核酸増幅反応におけるエラーを抑制することから、核酸増幅反応におけるエラーを抑制するための試薬として用いることもできる。
　本発明はまた、目的の核酸領域における変異の有無を判定する方法に関する。MutSを用いる核酸増幅反応においては、エラーの発生が抑制される、すなわち、パーフェクトマッチプライマーからの増幅（伸長）に対してミスマッチプライマーからの増幅（伸長）が特異的に抑制される。この結果、ミスマッチプライマーからの誤った増幅を回避できるため、増幅の有無による変異の有無の判断を、優れた信頼性で行うことができる。
　本発明の判定方法は、例えば、各種疾患のかかり易さ、疾患か否か、疾患用の医薬への感受性及び耐性を判断する際に有用である。例えば、疾患のかかり易さを、目的の遺伝子(目的の核酸領域)の標的部位における変異の有無によって判定する場合、健常者の配列が正常型配列となり、疾患患者の配列が変異型配列となる。そして、核酸試料として被検者の遺伝子を使用し、その標的部位が正常型か変異型かを判定する。その結果、標的部位が正常型であれば、核酸試料は正常型配列であり、被検者は、疾患にかかる可能性が低い、又は、健常者と判断できる。一方、標的部位が変異型であれば、核酸試料は変異型配列であり、被検者は、疾患にかかる可能性が高い、又は、疾患患者と判断できる。
　核酸試料における標的部位は、例えば、1塩基（モノヌクレオチド）でもよいし、2塩基（ジヌクレオチド）以上でもよく、後者の場合、連続してもよいし、非連続であってもよい。中でも、判定目的の標的部位が、1塩基又はモノヌクレオチドである場合に、本発明の判定方法を適用することが好ましい。プライマーと核酸試料におけるハイブリッド領域とが一塩基のみ異なる場合、他の配列は完全に相同であるため、核酸試料がプライマーに対してミスマッチとなる塩基を有していても、プライマーは核酸試料にハイブリダイズし易い。しかしながら、MutSを用いることにより、例えば、両者が一塩基のみ異なり、プライマーが被検核酸にハイブリダイズする場合でも、MutSが特異的に結合して、誤った伸長反応を抑制できる。このため、本発明の判定方法は、例えば、一塩基多型の判定に適している。
　核酸試料にプライマーがハイブリダイズした際に生じるミスマッチは、例えば、１塩基でもよいし、連続した複数塩基でもよいし、非連続の複数塩基であってもよい。複数塩基の上限は、特に制限されないが、例えば、核酸試料とプライマーとの二本鎖の状態を維持し得る数が好ましい。具体例としては、例えば、ハイブリダイズする両者の長さ（塩基数）に依存するが、上限は、例えば、5塩基以下であり、より好ましくは3塩基以下であり、特に好ましくは2塩基以下である。
　続いて、増幅反応により得られる増幅産物を検出し、増幅の有無を確認する。増幅産物の検出は、例えば、反応中において経時的に行ってもよいし、反応開始から一定時間経過後に行ってもよい。前者は、いわゆるリアルタイムでの検出であり、例えば、連続的な検出であってもよいし、断続的な検出であってもよい。後者の場合、例えば、反応開始時と一定時間経過時に増幅産物の検出を行い、その変動から増幅の有無を確認することが好ましい。
　増幅産物の検出方法としては、例えば、一般的なゲル電気泳動により、特定のサイズの増幅産物を検出する方法が挙げられ、例えば、エチジウムブロマイドやSYBR（登録商標）Green等の蛍光物質により検出できる。また、標識化物質で標識化されたプローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせて、検出することもできる。標識物質としては、例えば、ビオチンが挙げられる。ビオチンは、例えば、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼ等の酵素が結合されたアビジン等との結合によって検出可能である。さらに、免疫クロマトグラフを用いる方法があり、例えば、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を使用する方法（イムノクロマトグラフィー法）が挙げられる。また、増幅の副産物であるピロリン酸を検出することで、間接的に増幅産物を検出することも可能である。
　そして、増幅の有無から、被検核酸試料における標的部位が野生型であるか変異型であるかを判断する。プライマーとして、例えば、野生型配列における標的部位を含む領域に対して完全に相補的なプライマー（パーフェクトマッチプライマー）を使用すれば、増幅が確認された場合は、標的部位は野生型であり、変異は存在しないと判断できる。また、増幅が確認されなかった場合は、標的部位は変異型であり、変異が存在すると判断できる。他方、プライマーとして、例えば、変異型配列における標的部位を含む領域に対して完全に相補的なプライマー（パーフェクトマッチプライマー）を使用すれば、増幅が確認された場合には、標的部位は変異型であり、変異が存在すると判断できる。また、増幅が確認されなかった場合は、標的部位は野生型であり、変異は存在しないと判断できる。
　本発明は、既存のPCR関連技術を有意に改善するものである。核酸増幅反応におけるエラーの発生に対する抑制効果は、ウイルスや細菌感染ならびにSNP診断を含む広範なPCR関連技術に適用できる。ポリメラーゼによる変異生成率を約1/3～1/4に低減したことも有意な効果であり、例えば、忠実度は低いが伸長効率が高いDNAポリメラーゼを用いた遺伝子クローニングにおいて有利に使用できる。すなわち、そのようなDNAポリメラーゼを用いるPCRにおいて、MutSの使用は、エラーを含まない遺伝子構築を可能にするための魅力的な選択肢となる。
　以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１　タンパク質の過剰発現及び精製
　95℃においても成長可能な高度好熱菌Aquifex aeolicus由来のMutSを調製した。
　Aquifex aeolicus MutS遺伝子を、A. aeolicus VF5ゲノムDNAをテンプレートとして用いて、PCRにより増幅した。増幅に用いたフォワード及びリバースプライマーは、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　下線部は、それぞれNcoI及びBglII部位を示す。増幅断片をpET-HisTEV（Kanaujia, S. P. et al. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 63, 103-105 (2007)）のNcoI及びBamHI部位に連結し、pET-HisTEV/A. aeolicus MutSプラスミドを構築した。配列解析により、構築物がエラーを含まないことを確認した。
　E. coli BL21(DE3)（Novagen、Madison、WI)を、pET-HisTEV/A. aeolicus MutSで形質転換し、50μg/ml アンピシリンを含む1.5 LのYT培地（0.8%（w/v)トリプトン、0.5%（w/v)酵母抽出物、及び0.5%（w/v) NaCl）中で37℃で培養した。培養物の濃度が4 × 108 cells/mlに達したら、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを100μMまで添加した。遺伝子発現を誘導後、細胞を37℃で4時間増殖させ、遠心分離により集菌した。細胞を、バッファーI（20 mM Tris-HCl及び50 mM NaCl、pH 7.5)中での超音波処理により破砕し、70℃で10分間加熱した。48,000 gで20分間、遠心処理した。上清を、バッファーIで平衡化したTalonレジンカラム（40 ml、Clontech、Palo Alto、CA)に流した。カラムを300 mlのバッファーIで洗浄し、150 mMイミダゾールを含むバッファーIでタンパク質を溶出した。
　AaeMutSを含む画分をSDS-PAGEで検出して回収し、この画分に硫酸アンモニウムを終濃度が1Mになるように加えた。この溶液を、1M 硫酸アンモニウムを含むバッファーIで平衡化したToyopearl-Phenylカラム（TOSOH、Tokyo、Japan）に流した。カラムを、1M 硫酸アンモニウムを含むバッファーI（100 ml）で洗浄し、300 mlのバッファーIによる1-0 M 硫酸アンモニウム勾配でタンパク質を溶出した。AaeMutSを含む画分をSDS-PAGEで検出し、Vivaspin（登録商標）コンセントレーター（Vivascience、Gottingen、Germany）で濃縮した。AaeMutSタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に、AaeMutS遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
　DNAポリメラーゼIIIαサブユニットをコードするA. aeolicus DnaE遺伝子を、A. aeolicusゲノムDNAをテンプレートとして用いたPCRにより増幅した。増幅に用いたフォワード及びリバースプライマーは、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　下線部は、それぞれNdeI及びBamHI部位を示す。増幅断片を、pET-HisTEVのNdeI及びBamHI部位に連結し、pET-HisTEV/A. aeolicus DnaEプラスミドを構築した。配列解析により、構築物がエラーを含まないことを確認した。
　E. coli Rosetta2(DE3)（Novagen)をpET-HisTEV/A. aeolicus DnaEで形質転換した。A. aeolicus MutSの過剰発現と同様の方法により、細胞を培養し、集菌した。AaeDnaEはAaeMutSと同様の方法により精製した。
　Thermus thermophilus由来のMutS（TthMutS）及びA. aeolicus MutLのC末端ドメインは、文献に記載の方法により過剰発現及び精製を行った（Takamatsu, S., Kato, R. & Kuramitsu, S. Nucleic Acids Res 24, 640-647 (1996)；Iino, H. et al. Biosci Rep 31, 309-322 (2011)）。
実施例２　円偏光二色性（CD）分光分析
　実施例１で得られたAaeMutS又はTthMutSの熱安定性を、円偏光二色性（CD）分光分析により測定した。
　CD測定は、Jasco分光偏光計J-720W（Jasco、Tokyo、Japan）を用いて実施した。すべての測定は、0.1 cmセルを用いて行った。残基モル楕円率[θ]は、100θobs/lcと定義した。ここで、θobsは観察された楕円率を表し、lは光路長（cm）を表し、cは各タンパク質のアミノ酸残基モル濃度を表す。測定は、50 mM リン酸カリウム（pH 7.0)、20 mM NaCl及び5μM AaeMutS又はTthMutSを含む溶液中で実施した。CDスペクトルの測定は、25℃で実施した。
　図9及び11に示すようにTthMutS、AaeMutSともに209及び222nm付近に負の極大を持つスペクトルを示し、正常な構造を保持していることが分かった。次にこの構造の熱安定性を、222 nmにおける[θ]の値([θ]222)の熱依存性を調べることで評価した。5μM TthMutS又はAaeMutSについて、25℃から95℃まで1分間に1℃ずつ温度を変化させながら、楕円率の変化を観察した。その結果、TthMutSについては85℃付近で[θ]222が0に近づき(図9B)、この付近の温度で立体構造が壊れていることが示された。一方、AaeMutSについては95℃付近でも[θ]222は負の吸収を保っており(図11B)、立体構造が保持されていることが分かった。以上の結果より、TthMutSに比べてAaeMutSは熱に対してより安定で、95℃のような高温での反応ステップを含むPCR 反応にも応用できる可能性が示された。
実施例３　80-bp DNAテンプレートを用いたPCR
　MutSの効果を正確に解析するために、80塩基対(bp)のDNAの増幅効率をモニターするシステムを構築した（図3A）。サイクル数は20にセットした。これはPCR増幅カーブの中間点である（図3B）。ミスマッチ含有プライマー（図1A）を用いて、Thermus thermophilus MutS（TthMutS)、Aquifex aeolicus MutS（AaeMutS）及びAquifex aeolicus MutL C末端ドメイン（AaeMutL CTD）の効果を試験した。これにより、TthMutS、AaeMutS及びAaeMutL CTDが、プライマーのミスハイブリダイゼーションによって生じる非特異的増幅を抑制できるかどうかを試験した。
　2つのタイプのミスマッチを観察した。GTペアのようなミスペアと、1塩基挿入/欠失ループなどの不対塩基である（Modrich, P. & Lahue, R. Annu Rev Biochem 65, 101-133 (1996)；Kunkel, T. A. & Erie, D. A. Annu Rev Biochem 74, 681-710 (2005)）。ミスペアとしてGTミスペアを含み、不対塩基として不対合Tを含むプライマーを用いた。
　また、TthMutSの効果を、別の2種の複製型DNAポリメラーゼファミリーについて観察した。KODポリメラーゼ(ファミリーB)とAquifex aeolicus DnaE（Bruck, I. et al. J Biol Chem 277, 17334-17348 (2002)）(DNAポリメラーゼIIIαサブユニット)（ファミリーC)である。
　ミスマッチテンプレートからの増幅も試験した（図1E）。すなわち、変異配列が次のサイクルでテンプレートとなるのを、TthMutS、AaeMutS及びAaeMutL CTDが抑制できるかどうかを試験した。
＜方法＞
　DNAは、BEX co（Tokyo、Japan）で合成した。パーフェクトマッチテンプレート、GTミスマッチテンプレート、及び不対合T含有テンプレートを得るために、配列番号７で表される以下の80塩基の一本鎖DNA：
5’-GGTAAGCGACATCTCTCTCGAGTGATACGTCCTAGCAGAATTCCGCTACATGAAGCTTCTAGAGGTTACTGCAGCCTGAC-3’（配列番号７）
を、配列番号８～１０で表される以下のDNA：
5’-GTCAGGCTGCAGTAACCTCTAGAAGCTTCATGTAGCGGAATTCTGCTAGGACGTATCACTCGAGAGAGATGTCGCTTACC-3’（配列番号８）
5’-GTCAGGCTGCAGTAACCTCTAGAAGCTTCATGTAGCGGTATTCTGCTAGGACGTATCACTCGAGAGAGATGTCGCTTACC-3’（配列番号９）
5’-GGTAAGCGACATCTCTCTCGAGTGATACGTCCTAGCAGATTCCGCTACATGAAGCTTCTAGAGGTTACTGCAGCCTGAC-3’（配列番号１０）
に、それぞれアニーリングさせた。
　パーフェクトマッチプライマー、GTミスマッチプライマー、及び不対合T含有プライマーとして、以下のプライマーを用いた。
パーフェクトマッチプライマー：
5’-GTCAGGCTGCAGTAAC-3’（配列番号１１）
5’-CGTAAGCGACATCTC-3’（配列番号１２）
GTミスマッチプライマー：
5’-GTCAGGTTGCAGTAAC-3’（配列番号１３）
5’-GGTAAGTGACATCTC-3’（配列番号１４）
不対合T含有プライマー：
5’-GTCAGGCTTGCAGTAAC-3’（配列番号１５）
5’-GGTAAGCTGACATCTC-3’（配列番号１６）
　テンプレート内のミスマッチ数に対するMutS効果の依存性を解析するため、2個又は3個の不対合Tを含む80-bp DNAを調製した。すなわち、配列番号１７で表される以下のDNA：
5’-GTCAGGCTGCAGTAACCTCTAGAAGCTTCATGTAGCGGAATTCTGCTAGGACGTATCACTCGAGAGAGATGTCGCTTACC-3’（配列番号１７）
を、配列番号１８又は１９で表される以下のDNA:
5’-GGTAAGCGACATCTCTCTCGAGTGTATACGTCCTAGCAGATTCCGCTACATGAAGCTTCTAGAGGTTACTGCAGCCTGAC-3’（配列番号１８）
5’-GGTAAGCGACATCTCTCTCGAGTGTATACGTCCTAGCAGATTCCGCTACATGAAGCTTCTGAGGTTACTGCAGCCTGAC-3’（配列番号１９）
に、それぞれハイブリダイズさせた。
　種々の濃度のTthMutS、AaeMutS又はAaeMutL CTDの存在下、0.06 units/μl LA Taq hot start version（Takara、Shiga、Japan)、0.03 units/μl KODポリメラーゼ（Toyobo、Tokyo、Japan)又は40 nM A. aeolicus DnaEを用い、20 nM テンプレートDNA、400 nM プライマー、400 mM dATP、dTTP、dCTP及びdGTPを含む1 × Takara LA PCRバッファーII（Takara)中でPCRを行った。温度調整システム、サーマルサイクラーPC707（ASTEC、Tokyo、Japan）を用い、80℃ 1分の変性工程、48℃ 1分のアニーリング工程、及び70℃ 2分の伸長工程（勾配は1分)を、20サイクル繰り返してPCRを実施した。6μl反応液を1μlのサンプルバッファー（50%（v/v) グリセロール及び0.05%（w/v) ブロモフェノールブルー)と混合し、1 × TBEバッファー（89 mM トリスホウ酸及び2 mM EDTA）中、9% ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した。ゲルをSYBR Gold（Invitrogen、Carlsbad、CA)で染色し、生成物を254 nmの紫外線で検出した。増幅されたDNA産物の量は、ImageJソフトウェアを用いて測定した。
＜結果＞
　プライマーにおけるミスマッチは、TthMutSの非存在下では、増幅効率に影響を及ぼさなかった。これに対し、TthMutSの存在下で、ミスマッチプライマー依存的増幅が抑制された（図1B及びC）。図1Cに示されるように、TthMutSはLA Taqによる増幅に影響を及ぼした。LA Taqは、T. aquaticus DNAポリメラーゼI（ファミリーAのDNAポリメラーゼ）（Eom, S. H., Wang, J. & Steitz, T. A. Nature 382, 278-281 (1996)）を含む。KODポリメラーゼを用いた場合の結果を、図1C中央パネル及び図4Aに、Aquifex aeolicus DnaEを用いた場合の結果を、図1C右パネル及び図4Bに示す。これらの結果から、TthMutSによるエラー抑制が、すべての複製型DNAポリメラーゼに広く適用可能であることが示された。TthMutSは、伸長工程においてミスマッチプライマー－テンプレート複合体に結合し、DNAポリメラーゼのプライマーの3’末端への接近を妨害すると考えられる（図1D）。
　ミスマッチテンプレートからの増幅を試験した結果を図1F及びGに示す。テンプレートにおけるミスマッチは、TthMutSの非存在下では増幅効率に影響を及ぼさなかったが、TthMutSを添加すると、ミスマッチ特異的抑制が観察された（図1F及びG）。TthMutSの影響は、3種の複製型DNAポリメラーゼファミリータンパク質すべてにおいて観察された（図1G及び図6）。
　TthMutSは、テンプレートにおけるミスマッチ数にかかわらず、ミスマッチテンプレートの増幅を同程度に抑制した（図8)。これは、単一のミスマッチが、TthMutS依存的抑制を生じるのに十分であることを示している。
　MutSがミスマッチテンプレートからの増幅を抑制するメカニズムとして図1Hに示すメカニズムが考えられる。テンプレートにおけるミスマッチは変性工程において消失するが、アニーリング工程において再生され、MutSに認識されると考えられる（図1H）。テンプレートのミスマッチに対するMutSの結合が、DNAポリメラーゼの鎖置換を伴う進行を阻害すると考えられる。
　A. aeolicus由来耐熱性タンパク質MutLのC-末端ドメインは、95℃までの温度に対し安定であるが、ミスマッチ認識能はなく、ミスマッチ特異的抑制能も示さなかった（図5及び図7）。
実施例４　ゲノムDNAテンプレートを用いたPCR
　より長いオリゴヌクレオチド配列のPCRに対して、TthMutS及びAaeMutSを実際に使用可能かどうか試験した。３つの異なる配列（423、594及び1,278-bp)を、T. thermophilusゲノムDNAから、パーフェクトマッチプライマーを用いて増幅した。続いてPCR産物をクローニングし、配列解析した。TthMutS及びAaeMutSの効果を簡単に検出するために、200μM MnCl2の存在下、エラーが生じやすい条件で、LA Taqを用いてPCRを実施した。
＜方法＞
　ttha1806の423-bp領域、tthb071の594-bp領域、及びttha1548の1,278-bp領域を増幅するため、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。
ttha1806の423-bp領域増幅用：
フォワードプライマー：5’-GAGACCACCCGTAGGCGGCT-3’（配列番号２０）
リバースプライマー：5’-CTTAAGGGGCCTCGCGCTCT-3’（配列番号２１）
tthb071の594-bp領域増幅用：
フォワードプライマー：5’-CGTCAGGCTGGCCTTCCCCCTTTCC-3’（配列番号２２）
リバースプライマー：5’-TTCCAGTGGCGGTCGTAGACCCCGTC-3’（配列番号２３）
ttha1548の1,278-bp領域増幅用；
フォワードプライマー：5’-GAGGAGGTGCTCTACGTGGGCAAGGCC-3’（配列番号２４）
リバースプライマー：5’-GGGAAGGTCCTTGAGGCTTCCCGTGTAGC-3’（配列番号２５）
　種々の濃度のTthMutS又はAaeMutSの存在下、0.06 units/μl LA Taq（Takara)、5 ng/μl T. thermophilus HB8ゲノムDNA、100μM CoCl2、400 nM dATP、dTTP、dCTP及びdGTPを含む1 × Takara GC Iバッファー（Takara)中でPCRを行った。温度調整システム、サーマルサイクラーPC707（ASTEC、Tokyo、Japan）を用い、95℃ 1分の変性工程、58℃ 1分のアニーリング工程、及び70℃ 2分の伸長工程を30サイクル繰り返してPCRを実施した。TthMutSを使用する場合は、15サイクル目の終わりに追加のTthMutS溶液（最初に添加したタンパク質溶液と同量）を補充した。10μlの反応液を1μlのローディングバッファー（50%（v/v) グリセロール、0.9%（w/v) SDS、及び0.05%（w/v) ブロモフェノールブルー)と混合し、1 × TBEバッファー（89 mM トリスホウ酸及び2 mM EDTA）中、1.5% アガロースゲルに電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、生成物を254 nmの紫外線で検出した。増幅されたDNA産物の量は、ImageJソフトウェアを用いて測定した。
　特異性因子は、非特異的増幅に対する抑制率と特異的増幅に対する抑制率の比として定義され、以下の式から得られる：
　　　　nμM MutSにおける特異性因子＝ AN0ASn/ANnAS0
　式中、AN0、ASn,、ANn、及びAS0は、それぞれ、0μM MutSにおける非特異的増幅の量、nμM MutSにおける特異的増幅の量、nμM MutSにおける非特異的増幅の量、及び0μM MutSにおける特異的増幅の量を表す。
　増幅されたttha1806及びttha1548のクローニング及び配列解析のために、0又は200μM MnCl2の存在下で同一の反応を実施した。反応産物をTAクローニングを用いてpT7Blueベクター（Novagen)に連結し、BigDye terminator version 3.1 cycle sequencing kit（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いて配列解析した。
＜結果＞
　TthMutSを用いたPCRの結果を図2A～Fに示す。比較的低い温度でアニーリング工程を実施したところ、非特異的増幅が検出された。これは、ミスハイブリダイズしたプライマーから増幅されたものと考えられる。同じ条件で、TthMutSを添加すると、増幅特異性が大幅に改善された。TthMutSは82℃以上の温度で不安定であるため（図9)、全30サイクルのうち、15サイクル目の終わりに追加のTthMutSを補充した。1.1μM TthMutSの423、594及び1,278-bpの配列に対する特異性因子は、それぞれ、8.78、18.0及び23.6であった。この結果は、TthMutSが増幅特異性を約10～20倍増大させることを示している。
　TthMutSの添加により、ポリメラーゼによる変異が約1/3に低減することが示された（図2G）。MnCl2の非存在下で実験を行った場合も同様に、変異率が約1/3～1/4に低減した（図2H）。また、PCR産物の配列解析の結果から、TthMutSがあらゆるミスマッチに対し同等の効果を有することが示された。
　興味深いことに、コバルトイオンを補充することにより、TthMutSの効果が改善された。ただし、コバルトイオンはこの効果のために必ず必要なわけではなかった（図10）。
　AaeMutSは、80-bpテンプレート（図2I及びJ)とゲノムDNAテンプレート（図2K及びL)の両方において、非特異的増幅を抑制した。423-bpの配列に対する0.4μM AaeMutSの特異性因子は1 × 106以上であった。これはTthMutSの特異性因子よりも有意に高いものである。重要なことは、AaeMutSが、反応の途中で追加のタンパク質溶液を補充しなくても、十分な抑制効果を示したことである（図2M及びN）。PCR産物の配列解析により、AaeMutSが、ポリメラーゼによる変異生成率を約1/3～1/4まで低減させることも確認された（図2O及びP）。さらに、広範なミスマッチに対するAaeMutSの効果において、明らかな偏りは見られなかった。これらの結果から、AaeMutSの添加は非特異的増幅及びポリメラーゼ生成エラーの両方を抑制する簡便かつ有用な方法であることが実証された。
実施例５　AaeMutS及びTthMutSの室温におけるミスマッチ認識能
　AaeMutS及びTthMutSのミスマッチ認識能を確認するために、ミスマッチを含む二本鎖DNAとAaeMutS及びTthMutSの結合をゲルシフトアッセイにより解析した。実験は常温で行った。0～4μMのAaeMutS又はTthMutSを100 nMパーフェクトマッチ二本鎖DNA、GTミスマッチ二本鎖DNA、不対合T含有二本鎖DNAと、50 mM HEPES (pH 7.5)、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.1% (w/v) BSAを含むバッファー中で混合した。基質の二本鎖DNA作製のために、以下の表1にまとめた一本鎖DNAをハイブリダイズさせた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　パーファクトマッチ1をパーファクトマッチ2とハイブリダイズさせることでパーファクトマッチ二本鎖DNAを作製した。GTミスマッチ二本鎖DNA及び不対合T含有二本鎖DNAに関しても同様に、1と2をハイブリダイズさせて作製した。
　室温で30分間静置した後、9%のネイティブポリアクリルアミドゲルに流し、1 x TBE バッファー(89 mM トリスホウ酸、2 mM EDTA)中で電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをSYBR Goldで染色し、256 nmの紫外線によりDNAを可視化した。コントロール(MutSの濃度0のレーン)と比較して少しでも電気泳動度が変化している（シフトした）シグナルについては、MutSが結合した分子と判断した。
　その結果、TthMutSの、パーフェクトマッチ、GTミスマッチ、不対合T含有基質に対する解離定数はそれぞれ約4.6、0.78、0.050μMであり(図12A及び12B)、ミスマッチに対して親和性を示したと言えるが、大腸菌MutSの解離定数（Schofield et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 45505-45508）に比べると数十倍、ミスマッチに対する親和性は低かった。一方、AaeMutSはTthMutSに比べてさらにミスマッチに対する親和性が低く(図12C及び12D)、2種類の基質に対する結合はパーフェクトマッチ基質に対する結合と大差なく、解離定数はどの場合も3μM以上であった。これらの結果から、常温におけるAaeMutSのミスマッチ認識能はほとんど無いと言える。
　本発明の方法は、既存のPCR関連技術を有意に改善するものである。核酸増幅反応におけるエラーの発生に対する抑制効果は、ウイルスや細菌感染ならびにSNP診断を含む広範なPCR関連技術に適用できる。ポリメラーゼによる変異生成率を約1/3～1/4に低減したことも有意な効果であり、例えば、忠実度は低いが伸長効率が高いDNAポリメラーゼを用いた遺伝子クローニングにおいて有利に使用できる。すなわち、そのようなDNAポリメラーゼを用いるPCRにおいて、MutSの使用は、エラーを含まない遺伝子構築を可能にするための魅力的な選択肢となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参照により本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

  1. 　目的の核酸領域を増幅する方法であって、核酸試料と、プライマーと、MutSタンパク質とを接触させて核酸増幅反応を行うことを特徴とし、MutSタンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
    である、前記方法。
  2. 　前記核酸増幅反応を、温度を変動させて行う、請求項１記載の方法。
  3. 　前記核酸増幅反応がPCRである、請求項２記載の方法。
  4. 　MutSタンパク質が、85℃以上で核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有する、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　核酸増幅反応におけるエラーを抑制する方法であって、核酸試料と、プライマーと、MutSタンパク質とを接触させて核酸増幅反応を行うことを特徴とし、MutSタンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
    である、前記方法。
  6. 　前記核酸増幅反応を、温度を変動させて行う、請求項５記載の方法。
  7. 　前記核酸増幅反応がPCRである、請求項６記載の方法。
  8. 　MutSタンパク質が、85℃以上で核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有する、請求項５～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　核酸増幅のための試薬であって、MutSタンパク質を含み、MutSタンパク質が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質：
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有するタンパク質
    である、前記試薬。
  10. 　PCRのための試薬である、請求項９記載の試薬。
  11. 　MutSタンパク質が、85℃以上で核酸増幅反応におけるエラーを抑制する活性を有する、請求項９又は１０記載の試薬。
  12. 　目的の核酸領域の標的部位における変異の有無を判定する方法であって、請求項１～４のいずれか１項記載の方法により目的の核酸領域を増幅する工程、及び核酸増幅の有無を確認する工程を含む、前記方法。
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