JP2015204800A - ＭｕｔＳ変異体を用いたＰＣＲ法 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸増幅反応においてＭｕｔＳの添加による増幅阻害をなくし、ＭｕｔＳの非特異的増幅反応の抑制の効果を向上させること。
【解決手段】ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体を添加する核酸増幅法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、核酸増幅における非特異的反応産物の生成を抑制する方法に関する。

ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。

核酸増幅法は現在までに様々な方法が開発されており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。

中でも、ＤＮＡの特異的配列の増幅に用いられるＰＣＲ法は、研究分野から応用分野に至るまで極めて幅広く普及している技術である。現在、ＰＣＲ法は更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ法や、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出するリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。これらの技術も、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。

ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、少なくとも一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを２０〜５０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。

ＰＣＲ法には、一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を増幅することで、目的とする遺伝子配列を増幅できる特徴がある反面、プライマーが目的としない配列にハイブリダイズしてしまった場合（プライマーのミスマッチアニーリング）においても、その配列の増幅が起こり、非特異増幅が生じるという欠点がある。また、ＰＣＲ中にプライマー同士が会合することで、プライマーダイマーが生じ、これが鋳型ＤＮＡとして働いて、非特異増幅産物が生成されるという欠点がある。そのため、ＰＣＲにおける課題は、非特異増幅を抑制し目的産物のみを増幅させることにある。

非特異増幅を低減させる方法として、特許文献１ではＰＣＲに耐熱性のＭｕｔＳ（ＭｕｔＳミスマッチ結合タンパク質（ＭｕｔＳ ＤＮＡ Ｍｉｓｍａｔｃｈ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ））を添加することで非特異増幅を低減させる方法が記載されている。また、非特許文献１ではＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＭｕｔＳを用いて等温増幅中の非特異増幅を低減したことが報告されている。これらの方法ではＭｕｔＳが増幅時に生じるミスマッチ塩基対を認識し、結合することで、ＤＮＡポリメラーゼの作用を阻害することで、非特異的な増幅を防ぐことで、核酸増幅反応における非特異増幅を低減することができるとされている。

しかしながら、ＭｕｔＳを添加した場合、非特異増幅以外の核酸増幅においても阻害が起こることがしばしば観察され、更なる改良が求められていた。

ＷＯ２０１３／１７５８１５

Ｍｉｔａｎｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ２５７−２６２（２００７） Ｍ．Ｈ．Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２２， ７４６−７５６（２００３） Ｇ．Ｏｂｍｏｌｏｖａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４０７，７０３−７１０（２０００） Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ ２４，６４０−６４７（１９９６） Ｍ．Ｓ．Ｊｕｎｏｐ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ７，１−１２（２００１） Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ. Ｂｉｏｌ． ７，９４３−９４５（２０００）

本発明の目的は核酸増幅反応においてＭｕｔＳの添加による増幅阻害を低減し、ＭｕｔＳの非特異的増幅反応の抑制の効果を向上させることである。

本発明者らはＭｕｔＳを添加した核酸増幅反応で起こる阻害が、ＭｕｔＳによるヌクレオシド三リン酸の不活化が原因であることを示唆する結果を見出した。
この問題点を解決する方法を検討した結果、ＡＴＰａｓｅ活性部位を改変したＭｕｔＳ変異体を用いることで、ＭｕｔＳ添加による増幅阻害が低減することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］
ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体を反応液中に含む核酸増幅法。
［２］
前記ＭｕｔＳ変異体が、ＡＴＰａｓｅ活性部位を改変したＭｕｔＳ変異体である、［１］に記載の方法。
［３］
前記ＭｕｔＳ変異体が、ＡＴＰａｓｅ活性部位の極性アミノ酸残基を非極性アミノ酸残基または反対の極性を示すアミノ酸残基に改変したＭｕｔＳ変異体である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記ＭｕｔＳ変異体が、配列番号１に示されるアミノ酸における５９７、６７０、および６７１番目に相当するアミノ酸からなる前記ＡＴＰａｓｅ活性部位に関するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するＭｕｔＳ変異体である、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
Ｋ５９７に相当する改変がＫ５９７Ｍ又はＫ５９７Ａのアミノ酸置換であるＭｕｔＳを用いる、［４］に記載の方法。
［６］
Ｄ６７０に相当する改変がＤ６７０Ａのアミノ酸置換であるＭｕｔＳを用いる、［４］に記載の方法。
［７］
Ｅ６７１に相当する改変がＥ６７１Ａ、Ｅ６７１Ｍ、Ｅ６７１Ｋ又はＥ６７１Ｎのアミノ酸置換であるＭｕｔＳを用いる、［４］に記載の方法。
［８］
［１］から［７］のいずれかに記載の方法に用いるための反応液組成物。
［９］
以下の（ａ）〜（ｅ）を含む、［８］に記載の反応液組成物。
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
（ｄ）２価イオンおよび１価イオンを含むバッファー溶液、および
（ｅ）ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体
［１０］
［８］または［９］のいずれかに記載の反応液組成物を含む試薬またはキット。

本発明によって、反応液の調製時および核酸増幅反応中に起こっているヌクレオシド三リン酸の不活化を防ぐことで、ＭｕｔＳによる増幅阻害を回避できる。さらに、ＭｕｔＳの非特異増幅低減効果を示す濃度範囲を拡張することができる。したがって、ＭｕｔＳを添加した試薬の調製を行いやすくすることができる。

Ｔｔｈ ＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を評価した図である。 Ｔｔｈ ＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価の妥当性を確認した図である。 Ｔｔｈ ＭｕｔＳ変異体のヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を評価した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一態様は、ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体を反応液中に含む核酸増幅法である。

本発明の核酸増幅法に用いる増幅系はＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＴＲＣ、ＮＡＳＢＡなどが挙げられるが特に限定されない。以下、ＰＣＲ法を例にとり本願発明を説明するが、その他の増幅系への適用を排除するものではない。

［１］定義・評価法など
本発明の核酸増幅法に用いるＭｕｔＳとはＤＮＡミスマッチ結合タンパク質であり、ミスマッチ塩基対を認識して結合するタンパク質である。

本発明においてミスマッチ塩基対とは、ワトソン−クリック型塩基対以外はすべてミスマッチを意味する。

本発明におけるヌクレオシド三リン酸とは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）などから選ばれる１または２種以上の混合物であるが、これに限定されない。

本発明におけるＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性はＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび評価対象のＭｕｔＳ（１．８μＭ）を含むＰＣＲ反応液を用意し、このＰＣＲ反応液に対してすぐに熱サイクルを行うサンプル（Ａ）と、この前記反応液を２５℃で１時間放置してから熱サイクルを行うサンプル（Ｂ）との増幅量を比較することで確認することができる。サンプル（Ｂ）において増幅が確認できない場合、もしくはサンプル（Ａ）と比較して増幅量が減少している場合、ＭｕｔＳがヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を有しているものとし、また、サンプル（Ａ）とサンプル（Ｂ）とで同等の増幅量が確認できる場合、ＭｕｔＳはヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を有していないものとする。

＜ＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価方法＞
本発明における「ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性」の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４、酵素液（ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−）を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２および３）、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌを含む溶液を作製し、この溶液に、さらにＭｕｔＳ（１．８μＭ）を含む反応液と、ＭｕｔＳを含まない反応液とを用意する。前記反応液ですぐにＰＣＲを行うサンプルと、室温で１時間静置してからＰＣＲを行うサンプルを調製する。ＰＣＲは、９４℃、１分の前反応の後、９４℃、２０秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて行う。反応終了後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１２０００キットに供し増幅産物を確認する。ＭｕｔＳ濃度が１．８μＭの場合において、すぐに熱サイクルを行ったサンプルと１時間放置してから熱サイクルを行ったサンプルとの増幅量を比較することでＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を評価できる。
なお、本評価方法において、「ＭｕｔＳを含まない反応液」は、１時間放置することが増幅量に与える影響を排除するためのコントロールとして用いる。

［２］核酸増幅法
本発明の核酸増幅法を実施するための反応液組成物の構成は、ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体を反応液中に含むほかは、特に限定されない。例えばＰＣＲ反応液であれば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有させればよい。

核酸増幅法としてＰＣＲを行う場合、反応液組成物として、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む構成が例示できるが、これに限定されない。
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
（ｄ）２価イオンおよび１価イオンを含むバッファー溶液、および
（ｅ）ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体
前記反応液組成物には、必要に応じて、さらに、その他の試薬類、たとえばＰＣＲ増強因子、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを含んでもよい。

上記の構成を有する反応液は、試薬やキットの形態にすることができる。本発明の核酸増幅法を実行するための試薬、キットは、ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体を含むことを特徴とし、その他の構成は特に制限されない。たとえば、すべての反応液組成物を１液にまとめた形態でも良いし、２液以上に分割した形態でも良い。

本発明の方法に使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体的には、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼのシリーズ（ＨＳ、ＧＸＬ、Ｍａｘ）などが挙げられる。これらのうち２以上を組み合わせて用いても良い。

本発明の方法において、鋳型となる核酸は特に限定されない。合成ＤＮＡ、生体試料等から精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写反応により得たｃＤＮＡなどが挙げられる。また、精製されている必要性はなく、鋳型となる核酸を含む生体試料の粗精製サンプルや、生体試料そのものを使用することもできる。

本発明において使用する１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとは、増幅されるべき核酸の各核酸鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであり、２種またはそれ以上のプライマーを使用することが好ましい。該プライマーは、２本鎖核酸の配列の異なる各鎖と実質的に相補的であって、一方のプライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、その伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として機能することができるように選択される。

１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体は、ＰＣＲ反応において基質として使用される。この基質として、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。

前記のＰＣＲ反応液にはさらに緩衝剤を含むことが好ましい。前記緩衝剤として、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。
また、前記緩衝液中には、１〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ^２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。

さらに、前記ＰＣＲ反応液中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。

［３］ＭｕｔＳ変異体
本発明に用いるＭｕｔＳ変異体の変異前のＭｕｔＳの由来は特に限定されない。
前記ＭｕｔＳの由来としては、ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ ２〜６（配列番号４〜８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（配列番号９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（配列番号１０）、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのｈｅｘＡ（配列番号１１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）（配列番号１２）、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ（配列番号１３）およびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）（配列番号１）などが挙げられるが、これに限定されない。また、このほかに、超好熱菌であるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１４）とＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号１５）などが挙げられるが、他のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓを用いることができる。好ましくはＴａｑ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓおよびＴｔｈである。

本発明に用いるＭｕｔＳ変異体は、ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減するよう改変されたものであれば、特に限定されない。

このような特性の変化が得られる変異箇所としては特に限定されないが、ＡＴＰａｓｅ活性部位が変異したものが好ましい。例えば、非特許文献５に記載のＴａｑ ＭｕｔＳにおいては、配列番号１２のアミノ酸配列においてアミノ酸５４３〜７３１に該当する。
Ｔａｑ由来のＭｕｔＳ以外についてはＡＴＰａｓｅ活性部位は特定されていないが、ＡＴＰａｓｅ活性部位に関するアミノ酸は、由来の異なるＭｕｔＳにおいて高度に保存されており（非特許文献２〜４）、アミノ酸配列の一次構造を比較（アラインメント）することにより、その位置を高い蓋然性で予測し確認することができる。

本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。
本明細書では、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。

本発明者らは、前記方法により、Ｔｔｈ由来のＭｕｔＳのＡＴＰａｓｅ活性部位は配列番号１に記載のアミノ酸配列においてアミノ酸５５１〜７３９に相当する部分を意味することを確認した。本明細書で具体的に配列を提示したＭｕｔＳ以外のＭｕｔＳであっても、同様の確認が可能である。

本発明の核酸増幅法において、ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体は、ＡＴＰａｓｅ活性部位の極性アミノ酸残基を非極性アミノ酸残基または反対の極性を示すアミノ酸残基に改変したＭｕｔＳ変異体であることが好ましい。
本発明における極性アミノ酸とは、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システイン、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トレオニン、およびセリンであり、非極性アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンである。

本発明の核酸増幅法において、ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体は、より好ましくは配列番号１におけるアミノ酸Ｋ５９７、Ｄ６７０、Ｅ６７１に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。
好ましい例において、Ｋ５９７アミノ酸はリシン（Ｋ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＫ５９７ＭまたはＫ５９７Ａのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｄ６７０アミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＤ６７０Ａのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｅ６７１アミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）が反対の極性を示すアミノ酸または非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＥ６７１Ｋ、Ｅ６７１Ａ、Ｅ６７１Ｍ、またはＥ６７１Ｎのアミノ酸置換である。

ここで、例えばＫ５９７とは、５９７番目のアミノ酸であるリシン（Ｋ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。なお、本明細書において、例えばＫ５９７Ｍとは、５９７番目のアミノ酸のリシン（Ｋ）がメチオニン（Ｍ）に置換されていることを意味しており、以下同様である。

［４］ＭｕｔＳ変異体の作製方法
本発明の核酸増幅法に用いるＭｕｔＳを改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。

アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。

上記改変ＭｕｔＳ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を７０℃、３０分間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパクを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパクの発現を確認することができる。

上記方法により選抜された菌株から精製ＭｕｔＳを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば７０℃、３０分間処理し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥヘルスケア製）を用いた金属アフィニティーの方法により精製を行うことができる。この操作の後、ＭｕｔＳはフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーに供することで、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１：Ｔｔｈ ＭｕｔＳの作製
サーマス・サーモフィルス由来のＭｕｔＳ（Ｔｔｈ ＭｕｔＳ）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
Ｔｈｅｒｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子発現プラスミドは文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより提供された（非特許文献６）。これを利用して、ＴｔｈＭｕｔＳの配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、１５ｍｌの破砕緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に置換し、Ｔｔｈ ＭｕｔＳを得た。

実施例２：Ｔｔｈ ＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価
Ｔｔｈ ＭｕｔＳのヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価方法として、ＭｕｔＳを含む反応液を調製した後、室温で一時間放置し、ＰＣＲでの増幅量の違いを、Ｈｕｍａｎ β−グロビンの３．６ｋｂを増幅することで比較した。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４、酵素液（ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−）を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２および３）、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌを含む溶液を作製し、この溶液に、さらにＭｕｔＳ（０．５、０．８、１．０、１．３、１．５および１．８μＭ）を含む反応液と、ＭｕｔＳを含まない反応液とを用意した。前記反応液ですぐにＰＣＲを行うサンプルと、室温で１時間静置してからＰＣＲを行うサンプルを調製した。反応は９４℃、１分の前反応の後、９４℃、２０秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。反応終了後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１２０００キットに供し増幅産物を確認した。

結果を図１に示す。Ｔｔｈ ＭｕｔＳ濃度１．８μＭにおいて、直後のサンプルでは増幅が確認できるが、室温で一時間放置したサンプルでは増幅が確認できなかった。このことから、Ｔｔｈ ＭｕｔＳがヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を有していることが確認できた。

実施例３：ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価方法の確認
増幅阻害の原因がヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性によるものかどうかの確認を行った。評価方法として、ｄＮＴＰｓを除いた反応液を調製し、室温で１時間放置した後、ＰＣＲ直前にｄＮＴＰｓを添加してＰＣＲを行った。直後と１時間後のＰＣＲでの増幅量の違いを、Ｈｕｍａｎ β−グロビンの３．６ｋｂを増幅することで比較した。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ_４、酵素液（ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−）を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２および３）、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−を含む、ｄＮＴＰｓを除いた２０μｌを含む溶液を作製し、この溶液に、さらにＭｕｔＳ（０．５、０．８、１．０、１．３、１．５および１．８μＭ）を含む反応液と、ＭｕｔＳを含まない反応液とを用意した。前記反応液で０．２ｍＭｄＮＴＰを添加してすぐにＰＣＲを行うサンプルと、室温で１時間放置してからＰＣＲを行う直前に０．２ｍＭｄＮＴＰｓを添加するサンプルを調製した。反応は９４℃、１分の前反応の後、９４℃、２０秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。反応終了後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１２０００キットに供し増幅産物を確認した。

結果を図２に示す。Ｔｔｈ ＭｕｔＳ濃度１．８μＭにおいて、直後のサンプルと、室温で一時間放置したサンプルの両方で増幅が確認でき、増幅阻害は確認されなかった。このことから、Ｔｔｈ ＭｕｔＳの増幅阻害の原因がヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性であることが確認でき、評価方法の妥当性が示された。

実施例４：ＴｔｈＭｕｔＳ変異体の作製
サーマス・サーモフィルス由来の改変型ＭｕｔＳ（Ｔｔｈ ＭｕｔＳ）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーマス・サーモフィルス由来のＭｕｔＳ（Ｔｔｈ ＭｕｔＳ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取り扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例４で作製したプラスミドを表１に示す。

実施例４で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、１５ｍｌの破砕緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に置換し、ＭｕｔＳ変異体を得た。

実施例５：Ｔｔｈ ＭｕｔＳ変異体のヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価
Ｔｔｈ ＭｕｔＳ変異体（Ｋ５９７Ｍ、Ｋ６９７Ａ、Ｄ６７０Ａ、Ｅ６７１Ａ、Ｅ６７１Ｍ、Ｅ６７１Ｋ、Ｅ６７１Ｎ）のヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性の評価方法として、反応液を調製した後、室温で一時間放置し、ＰＣＲでの増幅量の違いを、Ｈｕｍａｎ β−グロビンの３．６ｋｂを増幅することで比較した。

ＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ_４、酵素液（ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−）を用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２および３）、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、および１ＵのＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌを含む溶液を作製し、この溶液に、さらにＭｕｔＳ（１．０および１．８μＭ）を含む反応液と、ＭｕｔＳを含まない反応液とを用意した。前記反応液ですぐにＰＣＲを行うサンプルと、室温で１時間静置してからＰＣＲを行うサンプルを調製した。反応は９４℃、１分の前反応の後、９４℃、２０秒→６０℃、３０秒→６８℃、４分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。反応終了後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１２０００キットを用いて増幅産物を確認した。

結果を図３に示す。ＴｔｈＭｕｔＳ濃度１．８μＭにおいて、直後のサンプルと、室温で一時間放置したサンプルの両方で増幅が確認でき、増幅阻害は確認されなかった。これより、反応液が室温で安定であるため、調製が容易になった。

本発明は核酸増幅反応においてＭｕｔＳの添加による増幅阻害をなくし、ＭｕｔＳの非特異的増幅反応の抑制の効果を向上させることである。これにより、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査、診断用途等において、目的産物のみの増幅を容易に確認できるようになる。

Claims (10)

1. ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体を反応液中に含む核酸増幅法。
2. 前記ＭｕｔＳ変異体が、ＡＴＰａｓｅ活性部位を改変したＭｕｔＳ変異体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＭｕｔＳ変異体が、ＡＴＰａｓｅ活性部位の極性アミノ酸残基を非極性アミノ酸残基または反対の極性を示すアミノ酸残基に改変したＭｕｔＳ変異体である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＭｕｔＳ変異体が、配列番号１に示されるアミノ酸における５９７、６７０、および６７１番目に相当するアミノ酸からなる前記ＡＴＰａｓｅ活性部位に関するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するＭｕｔＳ変異体である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. Ｋ５９７に相当する改変がＫ５９７Ｍ又はＫ５９７Ａのアミノ酸置換であるＭｕｔＳを用いる、請求項４に記載の方法。
6. Ｄ６７０に相当する改変がＤ６７０Ａのアミノ酸置換であるＭｕｔＳを用いる、請求項４に記載の方法。
7. Ｅ６７１に相当する改変がＥ６７１Ａ、Ｅ６７１Ｍ、Ｅ６７１Ｋ又はＥ６７１Ｎのアミノ酸置換であるＭｕｔＳを用いる、請求項４に記載の方法。
8. 請求項１から７のいずれかに記載の方法に用いるための反応液組成物。
9. 以下の（ａ）〜（ｅ）を含む、請求項８に記載の反応液組成物。
   （ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
   （ｃ）デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
   （ｄ）２価イオンおよび１価イオンを含むバッファー溶液、および
   （ｅ）ヌクレオシド三リン酸に対する不活化活性を低減させたＭｕｔＳ変異体
10. 請求項８または９のいずれかに記載の反応液組成物を含む試薬またはキット。