ES2231872T3 - Endonucleasas de desapareamiento y utilizaciones de estas para la identificacion de mutaciones en cadenas de polinucleotidos diana. - Google Patents
Endonucleasas de desapareamiento y utilizaciones de estas para la identificacion de mutaciones en cadenas de polinucleotidos diana.Info
- Publication number
- ES2231872T3 ES2231872T3 ES97928643T ES97928643T ES2231872T3 ES 2231872 T3 ES2231872 T3 ES 2231872T3 ES 97928643 T ES97928643 T ES 97928643T ES 97928643 T ES97928643 T ES 97928643T ES 2231872 T3 ES2231872 T3 ES 2231872T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- cel
- enzyme
- polynucleotide
- endonuclease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA ENDONUCLEASA AISLADA A PARTIR DE APIO, CEL I, ASI COMO A PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DE LA MISMA EN LA DETECCION DE MUTACIONES EN POLINUCLEOTIDOS DIRECCIONADOS. DICHOS PROCEDIMIENTOS FACILITAN LA LOCALIZACION E IDENTIFICACION DE MUTACIONES, APAREAMIENTOS ERRONEOS Y POLIMORFISMOS. LA CITADA ENZIMA RECONOCE CUALQUIER TIPO DE APAREAMIENTO ERRONEO, INDEPENDIENTEMENTE DEL CONTEXTO DE SECUENCIAS EN EL QUE SE ENCUENTRE, Y LA ENZIMA ES ACTIVA EN RANGOS DE PH QUE VAN DESDE EL ACIDO HASTA EL BASICO.
Description
Endonucleasas de desapareamiento y utilizaciones
de estas para la identificación de mutaciones en cadenas de
polinucleotidos diana.
La presente invención hace referencia a los
materiales y procedimientos para la detección de mutaciones en
ácidos nucleicos diana. Más específicamente, la invención
proporciona nuevas nucleasas específicas de desapareamientos y los
procedimientos de utilización de la enzima que facilitan el rastreo
genético de enfermedades hereditarias y el cáncer. El procedimiento
también es útil para la detección de polimorfismos genéticos.
En la presente solicitud se hace referencia a
diversas publicaciones citadas mediante números entre paréntesis,
con el fin de describir más completamente el estado de la materia a
la que pertenece la invención. Las citas completas para estas
referencias se hallan al final de la especificación. La descripción
de cada una de estas publicaciones se ha incorporado como
referencia en la presente especificación.
La secuencia de nucleótidos dentro de un gen se
puede alterar o "desaparear" mediante mutación de muchas
formas, siendo la más frecuente las sustituciones de pares de
bases, las mutaciones de desplazamiento de la pauta de lectura y las
deleciones e inserciones. Estas mutaciones pueden inducirse por
factores ambientales, como la radiación y los agentes químicos; los
errores también son producidos ocasionalmente por las polimerasas
de DNA durante la replicación. Muchas enfermedades humanas se
producen porque la fidelidad de la replicación del DNA no se
mantiene. La fibrosis quística, la anemia falciforme y algunos
cánceres están causados por cambios en una sola base en el DNA dando
como resultado la síntesis de proteínas anómalas o no
funcionales.
La elevada tasa de crecimiento de las plantas y
la abundancia de intercaladores de DNA en las plantas, sugieren una
tendencia aumentada para las lesiones de desapareamiento y de
desplazamiento de la pauta de lectura. Las plantas y los hongos
poseen abundantes nucleasas específicas de cadena sencilla que
atacan tanto al DNA como al RNA (9-14). Algunas de
éstas, como la Nucleasa \alpha de Ustilago maydis, se
piensa que intervienen en la conversión génica durante la
recombinación del DNA (15,16). De otras nucleasas, la nucleasa S1 de
Aspergillus oryzue (17), y la nucleasa P1 de Penicillium
citrinum (18) y la Nucleasa del frijol de los brotes de
Vigna radiata (19-22) son las mejores
caracterizadas. S1, P1 y la Nucleasa del frijol son proteínas Zn
activas a pH 5,0 aproximadamente, mientras que la Nucleasa \alpha
es activa a pH 8,0. La propiedad de formación de cadenas sencillas
de las lesiones del DNA parece utilizarse por una enzima de las
plantas, la nucleasa SP, para la reparación de productos de adición
voluminosos. La nucleasa SP, purificada de la espinaca es una Dnasa
de cadena sencilla, una Rnasa y además es capaz de producir una
incisión en el DNA en los dímeros TC6-4 y las
lesiones cisplatina, todo ello a pH neutro (23, 24). Todavía no se
sabe con certeza si la SP puede producir incisiones en los
desapareamientos de pares bases del
DNA.
DNA.
En Escherichia coli, las lesiones de
sustituciones de bases y de bucles de DNA no apareados se reparan
gracias a un sistema de reparación de trozos grandes dirigidos por
metilación. Las proteínas en este sistema multienzimático incluyen
MutH, MutL y MutS (1,2). Este sistema es eficiente, pero la lesión y
los bucles de DNA superiores a 4 nucleótidos no se reparan. Las
proteínas MutS y MutL están conservadas desde las bacterias a los
humanos y parecen ser capaces de realizar papeles de reparación
similares en los organismos superiores. Para algunas de las
lesiones que no se reparan correctamente por el sistema MutS/MutL, y
para la conversión génica donde sistemas de reparación de trozos
cortos pueden ser más favorables, se necesita otros sistemas de
reparación de desapareamientos de pares de bases con capacidades
nuevas.
En la actualidad, el procedimiento más directo
para el análisis mutacional es la secuenciación del DNA, sin embargo
también es la labor más intensiva y cara. Generalmente no es
práctico secuenciar todas las regiones potencialmente relevantes de
cada muestra experimental. En lugar de ello, se utiliza
generalmente algún tipo de procedimiento de rastreo para identificar
y seleccionar para su secuenciación únicamente aquellas muestras
que contengan mutaciones. Los polimorfismos de conformación de
cadena sencilla (SSCPs) son un procedimiento de rastreo ampliamente
utilizado que se basa en las diferencias de movilidad entre las
secuencias de cadena sencilla de tipo salvaje y la mutante en
geles de poliacrilamida nativos. Otros procedimientos se basan en
las diferencias de movilidad de los heterodúplexs de tipo
salvaje/mutante (comparado con los homodúplexs) en geles nativos
(análisis de heterodúplexs) o geles desnaturalizantes
(electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante). Mientras que
la preparación de la muestra es relativamente sencilla en estos
ensayos, se requieren unas condiciones muy exactas para la
electroforesis para poder generar diferencias de movilidad a menudo
sutiles que forman la base de la identificación de las muestras que
contienen mutaciones. Otro parámetro crítico es el tamaño de la
región a analizar. En general, los SSCPs se utilizan para rastrear
regiones no superiores a 200-300 pares de bases. La
fiabilidad de los SSCPs para detectar mutaciones de cadena sencilla
es algo incierta pero es probablemente del 70-90%
para secuencias inferiores a los 200 pb. A medida que aumenta el
tamaño de la región, disminuye el rango de la detección, por
ejemplo, en un estudio se describe un 87% de fiabilidad para
secuencias de 183 pb y del 57% para 307 pb (35). La capacidad para
rastrear regiones mayores en una sola etapa aumentaría la utilidad
de cualquier procedimiento de rastreo de mutaciones.
Otro tipo de técnica de rastreo que se utiliza
actualmente se basa en el corte de bases no apareadas en los
heterodúplexs formados entre sondas de tipo salvaje hibridadas con
las secuencias experimentales que contienen las mutaciones
puntuales. Los productos de corte también se analizan mediante
electroforesis en gel, ya que los subfragmentos generados por el
corte de la sonda en un desapareamiento generalmente difieren
considerablemente en tamaño respecto al de tamaño completo, la sonda
no cortada se detecta fácilmente con un sistema de gel estándar. El
corte del desapareamiento se puede generar químicamente (tetróxido
de osmio, hidroxilamina) o con una alternativa enzimática menos
tóxica, utilizando la Rnasa A. El ensayo de corte de la Rnasa A
también se ha utilizado, aunque mucho menos frecuentemente, para
rastrear mutaciones en los mRNAs endógenos para la detección de las
mutaciones en el DNA amplificado por PCR. Utilizando el
procedimiento de rastreo original de la Rnasa se ha publicado una
tasa de detección de mutaciones del 50% (36).
Un procedimiento más novedoso para la detección
de mutaciones en el DNA se basa en la DNA ligasa, que une
covalentemente dos oligonucleótidos adyacentes que se hibridan en
un ácido nucleico complementario. El desapareamiento ha de suceder
en el lugar de la ligación. Al igual que con otros procedimientos
que se basan en los oligonucleótidos, son parámetros esenciales la
concentración de sal y la temperatura de la hibridación. Otro
parámetro es la cantidad de enzima añadida respecto a la
concentración del DNA.
Los procedimientos mencionados anteriormente no
pueden detectar de forma fiable un cambio de base en un ácido
nucleico que esté contaminado con más del 80% con otro ácido
nucleico, bien sean secuencias de tipo salvaje o normales. Los
problemas de contaminación son significativos en la detección del
cáncer, en donde una célula maligna, por ejemplo en circulación,
está presente en cantidades relativamente bajas. Los procedimientos
que se utilizan en la actualidad carecen de la sensibilidad
adecuada para ser aplicados en la práctica con fines clínicos.
Un procedimiento para la detección de mutaciones
génicas con enzimas de reparación de desapareamientos de pares de
bases se ha descrito por Lu-Chang y Hsu. Véase la
patente internacional WO 93/20233. El producto del gen MutY que
reconoce residuos A/G desapareados se utiliza junto con otra enzima
descrita en las referencias como "enzimas de todo tipo" que
pueden producir una mella en cualquier desapareamiento de bases.
Las enzimas no detectan inserciones y deleciones. También, todos
los tipos de enzimas reconocen desapareamientos distintos con
eficiencias distintas y su actividad puede verse afectada
negativamente por secuencias de DNA flanqueantes. Este procedimiento
se basa en consecuencia en un cóctel de enzimas de reparación de
desapareamientos de pares de bases y de DNA glicosilasas para
detectar la diversidad de mutaciones que pueden suceder en una
molécula de DNA dada.
La patente americana US 5.459.039 describe un
procedimiento para la detección de diferencias en la secuencia de
bases entre regiones homólogas de dos moléculas de DNA que
comprenden el contacto de los dúplexs de DNA con una proteína que
reconoce esencialmente cualquier desapareamiento de pares de bases.
La proteína de reconocimiento del desapareamiento es el producto
del gen mutS de E. coli.
En la patente americana 5.571.676 se describe un
procedimiento para la identificación de una o más alteraciones en
una secuencia de DNA determinada. El procedimiento descrito utiliza
un número de proteínas para detectar los desapareamientos y da como
resultado la formación de un heterodúplex con un desapareamiento en
donde dicho desapareamiento puede ser de aproximadamente 5 a 2000
bases de longitud.
En Biochemical properties and hormonal
regulation of barley nuclease, Brown y col., Eur. J. Biochem.
168, 357-364 (1987), se discuten las propiedades
bioquímicas y la regulación hormonal de una nucleasa aislada de la
cebada. Brown y col., describen la nucleasa de cebada como capaz de
hidrolizar RNA> DNA desnaturalizado> DNA nativo e indican que
dicha nucleasa de cebada posee actividad endonucleolítica.
Las características de la nucleasa de cebada se
discuten en Mung Bean Nuclease I. Physical, Chemical and
Catalytic Properties, Kowalski y col., Biochemistry, vol 15, nº
20, 1976:4457-4463 y Mung Bean Nuclease I.
Terminally Directed Hydrolysis of Native DNA, Kroeker y col.,
Biochemistry, vol. 15, nº 20, 1976:4463-4467. Estas
referencias indican que la nucleasa de frijol funciona como una
nucleasa específica de cadena sencilla, pero que se inactiva a un pH
por encima de 6.
En Changes in site specificity of
single-strand -specific endonucleases on supercoiled
PM2 DNA with temperature and ionic environment, Kowalski y col.,
Nucleic Acids Research, vol. 12, nº 18, sep. 1984, se discuten los
cambios en la especificidad de sitio de la nucleasa de frijol como
resultado de efectos del entorno sobre la conformación del DNA
superenrrollado.
Una nucleasa aislada del trigo que cataliza la
hidrólisis del DNA desnaturalizado, el rRNA y el
3'-AMP se describe en Enzymes of Nucleic Acid
Metabolism from Wheat Seedlings. Hanson y Fairley. The Journal of
Biological Chemistry, vol. 244, nº 9,
2240-2249.
A menudo, en el diagnóstico clínico, la
naturaleza de la mutación o del desapareamiento de pares de bases es
desconocida por lo que se descarta la utilización de DNA
glicosilasas específicas. En consecuencia, es necesario utilizar un
sistema enzimático que sea capaz de reconocer todos los
desapareamientos con igual eficiencia y también de detectar las
deleciones e inserciones, independientemente de las secuencias de
DNA flanqueantes. Sería beneficioso disponer de un ensayo sensible
y preciso para detectar desapareamientos de un solo par de bases que
no requiera una gran cantidad de muestra, que no requiera la
utilización de agentes químicos tóxicos, que tampoco requiera un
trabajo excesivo ni muy caro y que sea capaz de detectar no sólo
desapareamientos de pares de bases, sino también deleciones e
inserciones del DNA.
Un tal sistema, acoplado con un procedimiento que
facilitara la identificación de la localización de la mutación en
una molécula de DNA dada, sería claramente ventajosa para
aplicaciones de rastreo genético. Es el objetivo de la presente
invención el proporcionar este nuevo sistema de detección de
mutaciones.
La presente invención proporciona materiales y
procedimientos para la detección de mutaciones o desapareamientos en
una cadena polinucleotídica determinada. La detección se lleva a
cabo utilizando endonucleasas junto con un sistema de ensayo en gel
que facilita el rastreo y la identificación del apareamiento de
bases alterado en las cadenas de los ácidos nucleicos
determinados.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona una nucleasa de plantas nueva que es útil
para la detección de mutaciones o desapareamientos en un
determinado DNA o RNA. La nucleasa proporcionada es una enzima
endonucleasa de desapareamiento para determinar la presencia de una
mutación en una secuencia dada de un polinucleótido de cadena
sencilla de mamífero respecto a una secuencia no mutada en un
polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido que incluye la
mencionada secuencia que se quiere analizar, y en donde dicha
enzima se aísla a partir de una planta y es eficaz para:
a) detectar todos los desapareamientos entre los
polinucleótidos hibridados, en donde la mencionada detección tiene
lugar en un intervalo de pH de 5-9 y la mencionada
enzima tiene actividad en dicho intervalo de pH;
b) reconocer los bucles polinucleotídicos y las
inserciones en los mencionados polinucleótidos hibridados;
c) catalizar la formación de una mella de cadena
sencilla en el sitio del DNA que contiene un desapareamiento;
d) reconocer una mutación en una secuencia
polinucleotídica determinada sin los efectos negativos causados por
las secuencias flanqueantes de DNA; y
e) reconocer las diferencias en las cadenas
polinucleotídicas entre aproximadamente 100 pb y 3 Kb de longitud.
El apio, por ejemplo, (Apium graveolens, var. ducle)
contiene cantidades abundantes de la nucleasa de la invención que
es altamente específica para lesiones de bucles de DNA por
inserción/deleción. Esta enzima, denominada aquí como CEL I, produce
una incisión en el enlace fosfodiéster en el extremo 3' del
nucleótido desapareado. La CEL I ha sido purificada unas 10.000
veces, por lo que es esencialmente homogénea.
En una realización preferida de la invención, se
proporciona un procedimiento para determinar una mutación en una
secuencia diana de un polinucleótido de cadena sencilla de
mamífero, respecto a una secuencia no mutada de un polinucleótido
que se hibrida con el polinucleótido, incluyendo la secuencia diana.
Las secuencias se amplifican mediante la reacción de la polimerasa
en cadena (PCR), se marcan con un marcador detectable, se hibridan
a otro, se exponen a la CEL I de la presente invención y se
analizan en geles para determinar la presencia de la mutación. El
procedimiento proporciona una mejora ya que comprende la
utilización de una enzima endonucleasa de desapareamientos de
origen vegetal, en donde dicha enzima tiene la capacidad de:
a) detectar todos los desapareamientos entre los
polinucleótidos hibridados, en donde la mencionada detección tiene
lugar en un intervalo de pH de 5-9 y la mencionada
enzima tiene actividad en dicho intervalo de pH;
b) catalizar la formación de una mella de cadena
sencilla en una secuencia diana que contenga un
desapareamiento;
c) reconocer una mutación en una secuencia
polinucleotídica determinada sin los efectos negativos causados por
las secuencias flanqueantes de DNA; y
d) reconocer las diferencias en las cadenas
polinucleotídicas entre aproximadamente 100 pb y 3 Kb de
longitud.
La endonucleasa de origen vegetal de la invención
tiene una combinación única de propiedades. Éstas incluyen la
capacidad para detectar todos los desapareamientos posibles entre
las secuencias hibridadas formadas en la realización del
procedimiento de la invención; reconocer los bucles
polinucleotídicos y las inserciones entre las secuencias hibridadas;
detectar los polimorfismos entre dichas cadenas hibridadas;
reconocer las diferencias de secuencia en las cadenas
polinucleotídicas entre aproximadamente 100 bp y 3 Kb de longitud y
reconocer dichas mutaciones en una secuencia polinucleotídica diana
sin los efectos negativos de las secuencias flanqueantes de DNA.
La endonucleasa de origen vegetal, CEL I, de la
invención no es exclusiva del apio. Se han descrito actividades
enzimáticas funcionalmente similares en catorce especies de plantas
distintas. En consecuencia, la enzima está probablemente conservada
en el reino vegetal y puede purificarse a partir de otras plantas
distintas al apio. El procedimiento para purificar esta actividad
endonucleasa de una planta distinta al apio es bien conocido por los
expertos en la materia y se contempla dentro del ámbito de la
presente invención. Dichas enzimas se han purificado a homogeneidad
a partir de especies vegetales como, por ejemplo, Arabidopsis
thaliana de acuerdo con la presente invención. Esta nueva
enzima, denominada ARA I, presenta actividades enzimáticas similares
a la CEL I y por ello puede utilizarse ventajosamente en ensayos de
rastreo de mutaciones genéticas de la invención.
La mencionada endonucleasa derivada de las
plantas puede no limitarse al reino vegetal, sino que podría
hallarse en otras formas de vida. Dichas enzimas pueden presentar
funciones similares a la de CEL I del apio o bien adaptarse a otras
etapas especiales del metabolismo del DNA. Dichas enzimas o los
genes que las codifican pueden utilizarse o modificarse para
producir actividades enzimáticas que puedan funcionar de forma
idéntica o parecida a la de CEL I.
En otra realización de la invención, el
procedimiento descrito anteriormente se utiliza junto con la adición
de la DNA ligasa, la DNA polimerasa o una combinación de lo mismo,
con lo que se reduce el corte de DNA inespecífico.
En otra realización más de la presente invención,
el análisis simultáneo de muestras múltiples se realiza utilizando
la enzima descrita anteriormente y el procedimiento de la invención
mediante una técnica referida aquí como análisis multiplex.
Con el fin de presentar más claramente los
parámetros de la presente invención, se proporcionan las siguientes
definiciones:
El término "endonucleasa" hace referencia a
una enzima que puede cortar internamente el DNA.
El término "ácido nucleico aislado" hace
referencia a una molécula de DNA o RNA que se separa de las
secuencias normalmente contiguas (en las direcciones 5' y 3') en el
genoma normal del organismo en el cual se origina.
El término "desapareamiento de pares de
bases" indica una combinación de pares de bases que generalmente
se forma sin estar de acuerdo con las reglas de apareamiento de
bases de Watson y Crick. Por ejemplo, cuando se trata de las bases
que se hallan comúnmente en el DNA, adenina, guanina, citosina y
timidina, los desapareamientos de pares de bases son aquellas
combinaciones distintas a los pares de bases A-T y
G-C que normalmente se hallan en el DNA. Tal como se
describió aquí, un desapareamiento indicado, por ejemplo como C/C
significa que un residuo citosina se halla enfrente de otro residuo
citosina, y no de la propia pareja que sería la guanina.
El término "inserción o deleción de DNA"
hace referencia a la presencia o ausencia de bases
"desapareadas" entre dos cadenas de DNA, de modo que la
complementariedad no se mantiene a lo largo de la región de bases
delecionadas.
El término "complementariedad" hace
referencia a dos cadenas de DNA que presentan características de
apareamiento de pares de bases normales. Sin embargo, el DNA
complementario puede contener uno o más desapareamientos.
El término "hibridación" hace referencia al
enlace de hidrógeno que tiene lugar entre las dos cadenas de DNA
complementarias.
El término "secuencias de DNA flanqueantes"
hace referencia a las secuencias de ácido nucleico contiguas que se
hallan en 5' y 3' del sitio de corte de la endonucleasa.
El término "análisis multiplex" hace
referencia al ensayo simultáneo de muestras de DNA agrupadas de
acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.
El término "esencialmente puro" hace
referencia a la preparación que contiene al menos un
50-60% en peso del material de interés. Más
preferentemente, la preparación comprende al menos el 75% en peso,
y más preferentemente el 90-95% en peso del
material de interés. La pureza se cuantifica mediante procedimientos
adecuados para el material a purificar, que en el caso de proteínas
incluye procedimientos de cromatografía, la electroforesis en gel
de agarosa o poliacrilamida, el análisis por HPLC y similares.
C>T indica que la sustitución de un residuo de
citosina por uno de timina produce un desapareamiento. La
sustitución inadecuada de una base por otra produce un
desapareamiento o un polimorfismo que puede indicarse de dicha
manera.
La
N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina
(TAMRA) es un colorante fluorescente utilizado para marcar
estándares de peso molecular de DNA que a su vez se utiliza como un
estándar interno para el DNA analizado por secuenciación
automatizada de DNA.
Los cebadores se pueden marcar fluorescentemente
con 6-carboxifluoresceína (6-FAM).
Alternativamente, los cebadores se pueden marcar con
4,7,2',7'-tetracloro-6-carboxifluoresceína
(TET). Otros procedimientos alternativos de marcaje de DNA se
conocen en la materia y se abarcan en el ámbito de la presente
invención.
La CEL I se ha purificado a homogeneidad, por
ello, la secuenciación del extremo amino-terminal se
prevé que proporcione las sondas correspondientes
oligonucleotídicas específicas para facilitar el clonaje de la
enzima del apio. Después del clonaje y la secuenciación del gen,
ésta se puede expresar en cualquiera de los sistemas de DNA
recombinante. Este procedimiento es bien conocido por los expertos
en la materia y se abarca en el ámbito de la presente
invención.
La Figura 1 muestra los resultados de análisis
del gel de poliacrilamida y sodio dodecil sulfato (SDS) de la
enzima purificada CEL I. Las posiciones de los marcadores de peso
molecular se muestran en el lateral. La T indica la parte superior
del gel.
La Figura 2 muestra algunos sustratos de DNA
heterodúplex utilizados en la realización de los análisis de ácidos
nucleicos de acuerdo con la presente invención. La Figura 2A
muestra un 64-mer que puede marcarse terminalmente
bien en el 5'-P o el 3'-OH. Las
posiciones nucleotídicas utilizadas como referencia en este
análisis se indican independientemente del número de inserciones de
nucleótidos en X en la cadena superior. Las secuencias insertadas y
los números del sustrato se indican en la tabla. La Figura 2B
muestra los sustratos de pares de bases desapareadas utilizadas en
este análisis, con las diversas identidades de los nucleótidos Y y
Z tal como se indica en la tabla que acompaña para producir
diversos sustratos desapareados.
La Figura 3 es un autorradiograma que demuestra
el efecto de la temperatura sobre las incisiones efectuadas por CEL
I en sustratos distintos.
La Figura 4 es un autorradiograma que muestra las
preferencias de incisión relativas de CEL I en los bucles de DNA de
un nucleótido.
La Figura 4 muestra que además de X=G, X=C
también permite conformaciones alternativas de apareamiento bases.
La Figura 4B demuestra que la cadena inferior del sustrato es
competente para la incisión por CEL I al igual que en el
desapareamiento C/C, #10, carril 16.
La Figura 5 es un autorradiograma de los geles de
poliacrilamida al 15% que muestran la estimulación inducida por la
DNA polimerasa AmpliTaq en la incisión de CEL I purificada en los
desapareamientos del DNA de un nucleótido extrahelicoidal sencillo.
F indica el sustrato de tamaño completo, de 64 nucleótidos de
largo, marcado en el extremo 5' terminal (*) de la cadena superior.
En los paneles 5A, 5B y 5C, los sustratos se trataron con diversas
cantidades de CEL I en presencia o ausencia de la DNA
polimerasa.
La Figura 6 es un autorradiograma que muestra el
pH óptimo de la incisión de CEL I en el residuo G extrahelicoidal
en presencia o ausencia de la DNA polimerasa AmpliTaq. El panel
superior muestra la actividad de CEL I en ausencia de la DNA
polimerasa AmpliTaq. El panel inferior muestra la actividad de CEL I
en presencia de la polimerasa.
La Figura 7 es un autorradiograma que muestra el
reconocimiento de los desapareamientos por sustitución de bases por
la CEL I purificada en presencia de la DNA polimerasa AmpliTaq.
(I) Indica el sitio de incisión primario en el enlace fosfodiéster
3' de un nucleótido desapareado. El panel 7A muestra el corte del
sustrato en presencia de CEL I y de la DNA polimerasa. En el panel
7B, se omitió CEL I.
La Figura 8 es una autorradiograma que muestra la
capacidad de CEL I para reconocer mutaciones en muestras de DNA
agrupadas en presencia de un exceso de DNA de tipo salvaje. Los
carriles 3, 5, 6, 10, 11, 12 y 13 contienen muestras individuales
que presentan heterodúplexs de tipo salvaje. Los carriles 4 y 6
contienen una deleción AG. Los carriles 8 y 9 contienen un sustrato
con un bucle de 11 pares de bases. Las muestras descritas
anteriormente se agruparon y trataron con CEL I. Los resultados de
este análisis multiplex se muestran en el carril 14.
La Figura 9 es un autorradiograma que muestra
además la capacidad de CEL I para reconocer las mutaciones en
presencia de un exceso de DNA de tipo salvaje. Los productos de PCR
marcados (amplificados a partir del exón 2 del gen BRCA1), 1, 2, 3,
4, 10 o 30 formando heterodúplexs, se expusieron a CEL I en un solo
tubo de reacción y los productos se migraron en un gel de
poliacrilamida al 6%. Los carriles 1 y 2 eran controles negativos
que migran en ausencia de CEL I. Los carriles 3 a 11 contienen una
muestra con la deleción AG en presencia de cantidades crecientes de
heterodúplexs no mutados de tipo salvaje.
La Figura 10 muestra un diagrama representativo
esquemático del gen BRCA1 y las regiones de unión
exón-intrón de los exones del gen.
La Figura 11 es un histograma de una muestra
representando la localización de una deleción de 5 pares de bases
en el exón 11D de BRCA1 seguido de la amplificación por PCR y de un
tratamiento con CEL I. Un pico indica un fragmento de DNA de un
tamaño específico generado por corte por CEL I en el sitio de un
desapareamiento. El panel A muestra el resultado obtenido con un
cebador marcado con 6-FAM hibridado al nucleótido
3177 de BRCA1. El panel B muestra los resultados obtenidos con un
cebador marcado con TET e hibridado 73 bases en el intrón que se
halla entre el exón 11 y el 12. El panel C representa el estándar
de tamaño interno del carril TAMRA. Remarcar que la posición de la
mutación se puede confirmar en ambas cadenas del DNA.
La Figura 12 es un histograma de una muestra
representando la localización de una mutación de codón de parada,
A>T, en la posición 2154 y un polimorfismo C>T en el
nucleótido 2201 en el exón 11C de BRCA1 después de la amplificación
por PCR y el tratamiento con CEL I. El panel A muestra un pico en
la base #700 y el panel B muestra un pico en #305 correspondiente
con el sitio de la mutación de codón de parada. El panel C es el
estándar interno del carril TAMRA.
La Figura 13 muestra los resultados obtenidos de
las cuatro muestras distintas analizadas por la presencia de
mutaciones en el exón 11A utilizando los procedimientos de la
presente invención. Se muestran los resultados de las muestras de
6-FAM. El panel A muestra un polimorfismo T>C en
el nucleótido 2430 y un segundo pico en la posición #483
correspondiente con el sitio de otro polimorfismo C>T en el
nucleótido 2731. El panel B muestra sólo el segundo polimorfismo
descrito en el panel A. El panel C no muestra ni polimorfismos ni
mutaciones. El panel D muestra los dos polimorfismos del panel
A.
La Figura 14 muestra un gel representando el
esquema de la purificación para la endonucleasa de desapareamientos
ARA I de Aradobidopsis thaliana. Carril 1: extracto crudo de
células rotas por prensa francesa; carril 2: fraccionamiento con
sulfato amónico saturado al 25%-85%; carril 3: columna de afinidad
de Con Sepharose-A carril, ARA I se eluyó con
\alpha-metil manósido; carril 4: pico de ARA I de
la columna de fosfocelulosa P-11; carril 5: pico de
ARA I de la columna de intercambio aniónico de DEAE Sephacel. Los
estándares de peso molecular se muestran en los carriles indicados
por una "S".
La Figura 15 muestra un autorradiograma de un
análisis de gel desnaturalizante de secuenciación de DNA que
demuestra que ARA I corta sustratos desapareados según el esquema
de purificación. Los números de los carriles corresponden con las
etapas de purificación de la Figura 14. Los paneles A, B, C muestran
el corte de ARA I en el sustrato #2, sustrato #4 y sustrato #18
(sustrato control sin desapareamiento), respectivamente. F =
longitud completa, I = corte de ARA I.
La Figura 16 es un diagrama esquemático de ARA I
basado en el ensayo de detección de desapareamientos.
La Figura 17 es una ilustración de los resultados
obtenidos del análisis obtenido del GeneScan de la actividad
endonucleolítica de ARA I en un heterodúplex que contiene un
desapareamiento.
La Figura 18 muestra una comparación de la
detección de mutaciones con el GeneScan entre ARA I y CEL I,
incluyendo una serie de reacciones control con el alelo de tipo
salvaje del exón 19 del gen BRCA1. Este fragmento de DNA no
contiene ninguna mutación y según ello no se observó ninguna mella
de desapareamiento. Los paneles A y B muestran dos cadenas tratadas
con 7 ng de CEL I y estimulación para el corte de desapareamiento
con la DNA polimerasa AmpliTaq. B= (6-FAM); G=
(TET). Los paneles C y D son dos cadenas tratadas con 20 ng de ARA
I purificada sin estimulación por la DNA polimerasa AmpliTaq. Los
paneles E y F muestran las dos cadenas tratadas con 20 ng de ARA I
y estimulación para el corte de desapareamientos por la DNA
polimerasa AmpliTaq.
La Figura 19 muestra un análisis simultáneo con
el GeneScan de la actividad de detección de desapareamientos de CEL
I y ARA I en el exón 19 del gen BRCA1. Los paneles A y B
muestran el corte del desapareamiento utilizando 7 ng de CEL I en
presencia de 0,5 unidades de DNA polimerasa AmpliTaq. Los paneles C
y D muestran el corte de un desapareamiento de la deleción de un
nucleótido A por 20 ng de ARA I sin la DNA polimerasa AmpliTaq. Los
paneles E y F muestran el corte del mismo sustrato por 2 ng de ARA
I estimulado con 0,5 ng de DNA polimerasa AmpliTaq. Los paneles E y
F muestran el corte del mismo sustrato por 2 ng de ARA I con
estimulación del corte de desapareamiento en presencia de 0,5 ng de
DNA polimerasa AmpliTaq. Todas las mutaciones y los polimorfismos
detectados se confirmaron por secuenciación automatizada. Estos
resultados sugieren que el procedimiento de detección de mutaciones
por ARA I, al igual que el de CEL I, puede identificar mutaciones
difícilmente detectables por SSCPs o secuenciación de DNA.
La Figura 20 muestra una comparación de la
detección de mutaciones por GeneScan entre ARA I y CEL I,
incluyendo una serie de reacciones control utilizando el alelo de
tipo salvaje del exón 2 del gen BRCA1. Al igual que en la
Figura 18, este segmento del gen no contiene mutaciones, por lo que
no se observó ninguna mella de despareamiento. El panel A y B
muestra las dos cadenas tratadas con 7 ng de CEL I con estimulación
del corte de desapareamiento con 0,5 unidades de DNA polimerasa
AmpliTaq. Los paneles C y D muestran las dos cadenas tratadas con 20
ng de ARA I purificada sin estimulación por la DNA polimerasa
AmpliTaq. Los paneles E y F muestran las dos cadenas tratadas con
20 ng de ARA I con estimulación de corte de desapareamiento por la
presencia de la DNA polimerasa AmpliTaq. Los paneles G y H muestran
el corte del mismo sustrato por 2 ng de ARA I estimulado por la
presencia de 0,5 unidades de DNA polimerasa AmpliTaq.
La Figura 22 es un autorradiograma que muestra la
actividad endonucleasa de desapareamientos similar a ARA I y CEL I
está presente en los extractos de 11 plantas distintas.
La base enzimática para el mantenimiento de las
secuencias de bases correctas durante la replicación del DNA se ha
estudiado extensamente en E. coli. Este organismo ha
evolucionado una vía de reparación de desapareamientos que corrige
diversos desapareamientos de pares de bases de DNA en el DNA
hemimetilado, así como inserciones/deleciones hasta cuatro
nucleótidos de largo. Las células deficientes en esta vía mutan más
frecuentemente, ya que poseen genes denominados MutS,
MutL y MutH, etc. La proteína MutS se une al
desapareamiento y MutH es la endonucleasa que produce una mella en
el DNA en el sitio GATC en la cadena donde el residuo A no está
metilado. MutL forma un complejo con MutH y MutS durante la
reparación. En muchos sistemas, existen proteínas homólogas de MutS
y MutL, pero no MutH. En las levaduras, MSH2 (homóloga de MutS)
puede unirse a un desapareamiento por ella misma, aunque se ha
observado un complejo de dos homólogas de MutL (MLH y PMS1) más una
MSH2. El homólogo humano hMSH2 ha evolucionado para unirse a
inserciones mayores de DNA de hasta 14 nucleótidos de longitud, que
se producen frecuentemente por mecanismos como el desapareamiento
en repeticiones de microsatélites en el hombre. El papel de hMLH1 en
la reparación del bucle todavía no queda claro. Las mutaciones en
cualquier de estos homólogos humanos se mostró eran responsables
para la forma hereditaria del cáncer de colon
no-polipósico (27, 28).
El apio contiene aproximadamente 40 \mug de
psoraleno, un intercalador fotoreactivable, por gramo de tejido
(3). Como una necesidad, el apio posee una elevada capacidad para
la reparación de lesiones por inserción, deleción, y otros
fotoaductos de psoraleno. La presencia de cadena sencilla en el
sitio de la lesión es común a la sustitución de bases y las
lesiones formadoras de bucles de DNA. Los resultados en los
siguientes ejemplos muestran que el apio, Arabidopsis
thaliana y otras especies de plantas poseen muchas
endonucleasas específicas de desapareamiento para tratar con estos
sucesos potencialmente mutagénicos.
Se ha hallado que la incisión en un sitio de
desaparareamiento por CEL I es altamente estimulada por la presencia
de una polimerasa de DNA. Para un bucle de DNA que contiene una
inserción de un solo nucleótido, el sustrato preferente de CEL I es
A \geq G> T> C. Para desapareamientos de pares de bases por
sustitución, el sustrato preferente de CEL I es C/C \geq C/A
\simC/T \geq G/G > A/C \sim A/A -T/C > T/G - G/T- G/A-
A/G> T/T. CEL I muestra un pH óptimo amplio desde pH 6 a pH 9.
Con menor importancia comparada con las incisiones de bucles, CEL I
es también una DNasa de cadena sencilla y una exonucleasa débil.
CEL I posee actividades bioquímicas nuevas cuando se compara con
otras endonucleasas. La nucleasa del frijol es una nucleasa de 39 Kd
que es una Dnasa de cadena sencilla y RNasa y tiene la capacidad de
mellar el DNA en regiones desestabilizadas y bucles de DNA
(19-22). Sin embargo, tiene un pH óptimo de 5,0. No
se sabe si la actividad de la nucleasa de frijol puede ser
estimulada por una DNA polimerasa como en el caso de la CEL I. Por
ello, las nucleasas de CEL I y de frijol parecen ser enzimas
distintas, aunque todavía no se ha llegado a ninguna conclusión al
respecto.
El mecanismo responsable para la estimulación por
la DNA polimerasa AmpliTaq de la actividad de CELI es actualmente
desconocido. Una posibilidad es que la DNA polimerasa tiene una
afinidad elevada para el grupo 3'-OH producido por
la incisión de CEL I en el desapareamiento de pares de bases y
desplaza la CEL I simplemente por competición. CEL I puede tener
afinidades distintas por el extremo 3'-OH generado
por incisiones en desapareamientos distintos, con lo que se atenúa
la magnitud de la actividad de la DNA polimerasa AmpliTaq para
estimular su actividad. La utilización de una DNA polimerasa para
desplazar una endonucleasa de reparación en la reparación del DNA
también se observó para el mecanismo de endonucleasas UvrABC (25).
Se demostró que la endonucleasa UvrABC no se renueva salvo que se
halle en presencia de la DNA polimerasa I. Los factores proteicos
in vivo que pueden estimular la actividad de CEL I pueden no
limitarse a las DNA polimerasas. Es posible que las DNA helicasas,
las DNA ligasas, las
3'-5'-exonucleasas o las proteínas
que se unen a los extremos del DNA realicen dicha función.
Es importante remarcar que un sustrato marcado en
5' puede utilizarse para mostrar una banda de incisión de CEL I en
un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Recientemente, se ha
demostrado una actividad putativa de incisión de todo tipo de
desapareamiento en el hombre (24) relacionada con la topoisomerasa
I. Esta enzima es incapaz de liberarse de un sustrato marcado en 5'
después de producir una mella en el desapareamiento debido a la
formación de un intermediario covalente enzima-DNA
con el extremo 3' de la mella de DNA (26). Este complejo covalente
enzima-DNA no puede migrar en el gel
desnaturalizante de poliacrilamida para formar una banda. Se ha
demostrado la producción de mellas en el desapareamiento por CEL I
con sustratos marcados en 5'. En consecuencia, la actividad CEL I
no es un equivalente vegetal de la actividad de reparación de
desapareamientos de todo tipo de la topoisomerasa I humana.
La CEL I parece ser una glicoproteína
manopiranosil según su fuerte unión con la resina de Concavanalin
A-Sepharose y mediante tinción de CEL I con la
tinción de glicoproteínas de base de Schiff-ácido periódico. En la
medida que se conoce, no se ha puesto en evidencia ninguna enzima
de reparación que sea una glicoproteína. Las glicoproteínas son a
menudo excretadas de las células, en las membranas celulares o
secretadas en los orgánulos. Sin embargo, también se ha demostrado
que las glicoproteínas existen en el núcleo para funciones
importantes. El nivel de una glicoproteína de estrés de 100 KDa se
halló que se incrementaba en el núcleo cuando se sometieron células
de fibroma Gerbil a un tratamiento de choque térmico (27). Se sabe
que los factores de transcripción para la RNA polimerasa II en las
células humanas se modifican por sus residuos
N-acetilglucosamina (28, 29). Recientemente, se
halló que la lactoferrina, una glicoproteína de unión al hierro, se
unía al DNA en el núcleo de las células humanas y activaba la
transcripción de forma secuencia-específica (30).
El núcleo de las células infectadas con ciertos virus contiene
glicoproteínas virales (31-33). Estos ejemplos de
glicoproteínas que residen dentro del núcleo, no meramente en la
membrana nuclear o en los poros de la membrana, tienden a mostrar
que las proteínas glicosiladas pueden ser importantes en el núcleo.
La CEL I parece ser un ejemplo de una glicoproteína que puede
participar en la reparación del DNA.
Las propiedades de la endonucleasa de
desapareamientos del apio, CEL I, se asemejan a las nucleasas de
cadena sencilla. Los mejores sustratos para CEL I son los bucles de
DNA y los desapareamientos de los bucles de DNA y las sustituciones
de bases como el desapareamiento C/C. En cambio, los bucles mayores
de 4 nucleótidos y el desapareamiento C/C son los sustratos menos
idóneos para el sistema de reparación de desapareamientos mutHLS de
E. coli (1,2). En consecuencia, CEL I es una enzima que
posee una nueva actividad endonucleasa de desapareamientos.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
describir la invención con mayordetalle. Estos ejemplos, que
ajustan el mejor modo actual para llevar a cabo la presente
invención, intentan ilustrar y no limitar la invención.
Las dos preparaciones de CEL I distintas se
generaron tal como se describió anteriormente. Sus propiedades son
similares excepto que la preparación menos pura (fracción Mono Q)
puede contener factores proteicos que pueden estimular la actividad
CEL I.
Se homogeneizaron 100 g de tallo de apio en una
licuadora Waring con 100 ml de un tampón de Tris-HCl
0,1 M pH 7,0 con fenilmetanosulfonil fluoruro 10 \muM (PMSF)
(Tampón A) a 4ºC durante 2 minutos. La mezcla se aclaró mediante
centrifugación y el sobrenadante se guardó a -70ºC. El extracto se
fraccionó mediante una cromatografía de intercambio aniónico en una
columna FPLC Mono Q HR5/10. La actividad nucleasa de CEL I unida se
eluyó con un gradiente lineal de sal a aproximadamente 0,15 M de
KCl.
Se extrajeron 7 kg de apio a 4ºC con una
licuadora y se ajustaron con Tampón A 10X para dar una concentración
final de Tampón A 1X. El extracto se concentró con una etapa de
precipitación saturada con sulfato amónico al
25-85%. El sedimento final se disolvió en 250 ml de
Tampón A contra KCl 0,5 M en Tampón A. La solución se incubó con 10
ml de resina de Concanavalin A-Sepharose (Sigma)
durante toda la noche a 4ºC. La pasta en suspensión se empaquetó en
una columna de 2,5 cm de diámetro y se lavó con KCl 0,5 M en Tampón
A. La enzima CEL I unida se eluyó con 60 ml de
\alpha-D-manosa 0,3 M, KCl 0,5 M
en tampón A a 65ºC. La CEL I se dializó contra una solución de KPO4
25 mM, PMSF 10 \muM, pH 7,4 (Tampón B) y se aplicó a una columna
de fosfocelulosa que había sido equilibrada en el tampón B. La
enzima unida se eluyó con un gradiente lineal de KCL en Tampón B.
El pico de actividad de CEL I de esta columna fue fraccionado
posteriormente por tamaño en una columna de FPLC Superose 12 en KCl
0,2 M, ZnCl2 1 mM, PMSF 10 \muM, Tris-HCl 50 mM
pH 7,8. El centro del pico de CEL I de esta etapa de filtración en
gel se utilizó como la CEL I purificada en este estudio. Una banda
de proteína de aproximadamente 34.000 daltons es visible cuando 5
microgramos de CEL I de la fracción de Superose se visualiza con
tinción de azul de Coomassie o tinción de carbohidratos (equipo de
tinción de base de Schiff-ácido periódico de Sigma Chemicals (5))
en un gel de poliacrilamida al 15% y SDS, tal como se muestra en la
Figura 1. Una segunda banda de aproximadamente 36.000 daltons
también fue visible en el gel. Ambas bandas se tiñeron con la
tinción específica de glicoproteínas. Las diferencias de movilidad
sutiles observadas en las dos bandas pueden ser debidas a una
glicosilación diferencial. Alternativamente, pueden deberse a un
contaminante en la preparación que se copurifique con CEL I.
Las concentraciones de las muestras se
determinaron mediante el ensayo deproteínas con ácido
bicinchonínico (4, Pierce).
La purificación siguiente a la enzima CEL I, los
análisis mutacionales con los sustratos de DNA clínicos y
experimentales se realizaron en un sistema de gel adecuado. La CEL
I reconoció y cortó el DNA con diversos desapareamientos,
deleciones e inserciones. Los siguientes ejemplos describen en mayor
detalle la forma en que el análisis mutacional se practica de
acuerdo con la presente invención.
Los sustratos de heterodúplexs de DNA de 64 pares
de bases de longitud se construyeron conteniendo desapareamientos de
pares de bases o bucles de DNA que se prepararon utilizando los
procedimientos publicados por Jones y Yeung (34). Los bucles de DNA
están compuestos de nucleótidos distintos y bucles de tamaños
diversos tal como se ilustra en la Fig. 2. Los dúplexs de DNA se
marcaron en uno de los cuatro extremos para que pudieran
identificarse las incisiones de la endonucleasa de DNA en los
nucleótidos desapareados como una banda truncada de DNA en un gel
desnaturalizante de secuenciación de DNA. Los oligonucleótidos de
DNA se sintetizaron en un sintetizador de DNA de Applied Biosystems
y se purificaron utilizando un gel PAGE desnaturalizante en
presencia de urea 7M a 50ºC. Los oligonucleótidos de cadena
sencilla purificados se hibridaron con las cadenas opuestas
adecuadas. El dúplex de DNA, conteniendo o no los desapareamientos,
se purificó utilizando un gel PAGE no desnaturalizante. El DNA se
eluyó a partir del silica-gel mediante electro
elución en una unidad Centricon de un electroeluidor AMICON modelo
57005. El reservorio superior de esta unidad se ha rediseñado para
incluir particiones estancas al agua que previenen la contaminación
cruzada.
De 50 a 100 fmol de sustrato marcado en 5' con
[P32] descritos en el Ejemplo II se incubaron con la preparación
Mono Q de CEL I en Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 25
mM, MgCl2 10 mM durante 30 minutos a temperatura de 0ºC a 80ºC. Se
añadieron de 0,5 a 2,5 unidades de DNA polimerasa AmpliTaq a la
reacción de la nucleasa. Se incluyeron dNTP 10 \muM en la mezcla
de reacción de acuerdo con las indicaciones (Figuras 2 & 5). La
reacción de 20 \mul se finalizó añadiendo 10 \mul de SDS al
1,5%, EDTA 47 mM y formamida al 75% más colorantes de trazado y se
analizó en un gel PAGE al 15% desnaturalizante con urea 7M a 50ºC.
Se utilizó un autorradiograma para visualizar las bandas
radioactivas. Se incluyeron marcadores escalonados de peso molecular
de secuenciación química de DNA. Los sitios de incisión se
determinaron de forma adecuada mediante
co-electroforesis de la banda de incisión y el
marcador escalonado de secuenciación de DNA en el mismo carril.
La fracción de CEL I eluída de la cromatografía
Mono Q del extracto de apio se halló que mellaba de forma específica
los heterodúplexs de DNA que contenían bucles de DNA con un solo
residuo extrahelicoidal guanina (sustrato #2) o un residuo timina
(#3), pero no el dúplex de DNA perfectamente apareado (#1), tal
como se muestra en la Figura 3. En estos experimentos 50 fmol de
heterodúplexs #2 (carriles 3-9), #3 (carriles
10-16), dúplex perfectamente apareado #1 (carriles
17-23) y sustrato de DNA de cadena sencilla
(carriles 24-30), cada uno marcado en el extremo 5'
con ATP-[P32]-\gamma y la T4 polinucleótido
quinasa a aproximadamente 6000 Ci/mmol, se incubaron con 0,5 \mul
(10 \mug) de fracción Mono Q de la preparación de CEL I en
Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 25 mM, MgCl2 10 mM
durante 30 minutos a diversas temperaturas. Cada reacción de 20
\mul se terminó añadiendo 10 \mul de SDS al 1,5%, EDTA 47 mM y
formamida al 75% conteniendo xilén cianol y azul de bromofenol. Diez
microlitros de la muestra se cargaron en un gel de secuenciación de
DNA desnaturalizante compuesto de poliacrilamida al 15% y urea 7 M
a aproximadamente 50ºC y se sometieron a una separación
electroforética y una autorradiografía como se describió
anteriormente (7). Las reacciones de secuenciación química G+A y T
se realizaron tal como se describió (7) y se utilizaron como
marcadores de tamaño. La incisión de CEL I produjo bandas de
aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. Se han dibujado líneas
desde las posiciones de las bandas de incisión a los enlaces
fosfodiéster (I y II) mellados por la endonucleasa en referencia al
marcador escalonado de secuenciación. Para un sustrato marcado 5',
cuando una nucleasa mella en 5' de un nucleótido y produce un
extremo 3'OH, la banda truncada migra un espacio correspondiente a
medio nucleótido más despacio que la banda para el nucleótido en el
carril del producto de reacción de secuenciación química del DNA
(34).
El sustrato #2 puede aparear sus bases en dos
conformaciones porque la G insertada se halla dentro de la
secuencia CGCG. En consecuencia tanto el residuo G en la segunda o
tercera posición del nucleótido puede desaparearse, posiblemente en
la conformación extrahelicoidal, cuando se hibrida este dúplex:
5'-CGGCG-3'
\hskip0.2cmó
\hskip0.2cm5'-CGGCG-3'
3'G-CGC-5'
\hskip1cm5'-GC-GC-5'
Según ello, se observaron dos bandas de incisión,
correlacionándose cada una con el enlace fosfodiéster inmediato 3'
del nucleótido desapareado. Véase la Fig. 3, carriles
3-9. Este desplazamiento puede tener lugar en la
secuencia diana únicamente cuando G o C están en la cadena superior
desapareada. En consecuencia, el residuo T no apareado en el
sustrato #3 produjo una banda de incisión en la misma posición
relativa que la banda superior derivada del sustrato #2. Véase la
Fig. 3, carriles 10-16. Estas movilidades en gel son
consistentes con la producción de un grupo 3'-OH
sobre la porción desoxirribosa (6). CEL I aumenta su actividad con
el aumento de temperatura de hasta 45ºC, tal como se ilustra por el
aumento en la intensidad de la banda, véase la Fig. 3. Sin embargo,
de 65ºC a 80ºC, la especificidad disminuyó debido a la
desnaturalización del dúplex de DNA.
Para confirmar que existe una única incisión de
la endonucleasa en cada dúplex de DNA, se repitió el experimento
descrito en la Fig. 3 con el DNA marcado en el extremo 3' de la
cadena superior. Si sólo hubo un sitio de incisión, las posiciones
de incisión iniciales demostraron por los sustratos marcados en sus
extremos 5' o 3' que debería ser el mismo enlace fosfodiéster. En
estos experimentos, los sustratos se marcaron en el extremo 3' con
[P32] \alpha-dCTP, dGTP frío y el fragmento
Klenow de la DNA polimerasa I a aproximadamente 6000 Ci/mmol. La
preparación de la muestra, la resolución del gel desnaturalizante y
el análisis de autorradiograma son los mismos que se describen en
la Fig. 3, excepto que la incubación de 50 fmol de sustrato con 10
\mug de la fracción Mono Q de CEL I fue de 30 minutos a una sola
temperatura, 37ºC. Los marcadores escalonados de secuenciación del
DNA para los sustratos #4 y #5 que se muestran en los carriles
1-4 ilustran las secuencias de DNA utilizadas. En
los carriles 5-8 no hubo enzimas durante la
incubación. Los carriles 9-12 son incisiones de la
endonucleasa de desapareamiento de los sustratos #2, #4, #5, #3,
respectivamente. Se ha dibujado una línea desde la posición de la
banda de incisión al enlace fosfodiéster (I) mellado por la
endonucleasa en el marcador escalonado de secuenciación de
referencia. Los carriles 13 y 14 demuestran la coelectroforesis de
la banda de incisión de CEL I con un marcador escalonado de
secuenciación química de DNA para determinar de forma exacta la
posición de incisión. Las preferencias de incisión relativas para
los sustratos 32, #3, #4 y #5 se muestran en la Fig. 4 para los
sustratos marcados en 3'. Las movilidades de las bandas de incisión
en los carriles 9-12 de la Fig. 4 indican que las
reacciones de incisión tuvieron lugar en el enlace fosfodiéster
inmediato 3' del nucleótido no apareado. En consecuencia, el sitio
de incisión es el mismo para los sustratos marcados bien en el
extremo 5' o en el 3'. El hecho de que la incisión del DNA tuviera
lugar en la posición del mismo enlace, independientemente de que el
sustrato estuviera marcado en su extremo 3' o 5', muestra que CEL I
no es una DNA glicosilasa. Un mecanismo de la DNA glicosilasa
hubiera causado que la posición de la incisión del DNA en los dos
sustratos de DNA fuera una base más allá porque una base se excisa
por la DNA glicosilasa.
La determinación precisa de la incisión se
realizó al igual que en el ejemplo del carril 14 en donde la
reacción de secuenciación química del residuo T de la cadena
superior marcada del sustrato #2 (carril 13) se mezcló con el
producto de incisión de CEL I del carril 9 y se analizó en el mismo
carril. Para un sustrato marcado en 3', cuando una nucleasa mella
en 3' de un nucleótido y produce un extremo 5' PO4, la banda
truncada migra con la banda para dichos nucleótido en el carril del
producto de reacción de secuenciación química del DNA (7). Además,
la movilidad del gel, relativa a los estándares de tamaño de la
secuenciación química del DNA, mostró que la mella de DNA produjo
un extremo 5'-fosforilado (6). Para un bucle de DNA
con una inserción de un solo nucleótido, la especificidad de la
nucleasa es A \geq G>T>C. Se puede observar en la Fig. 4A
que una pequeña cantidad de actividad 3' o 5' exonucleasa se halla
en esta preparación de CEL I.
Se analizó si CEL I puede cortar en la cadena
inferior de un bucle de DNA originado por un nucleótido de la
cadena superior, o si la mella de la cadena que contiene el bucle
puede conducir a una incisión secundaria de CEL I a partir de la
mella. Para ello, la cadena inferior que contiene nucleótidos no
apareados en el sustrato #2 se marcó en su extremo 3' y se incubó
en presencia de CEL I. El nucleótido extrahelicoidal en la cadena
superior, o la mella de DNA realizada por CEL I en la cadena
superior del sustrato #2, mostrado en el carril 9 de la Fig. 4, no
condujeron a una mella significativa de la cadena inferior (carril
18). Como un control contra la posibilidad de que la secuencia de
DNA favorezca la incisión de CEL I en la cadena superior y no en la
cadena inferior, se analizó la capacidad de CEL I de producir una
incisión en la cadena inferior del sustrato con desapareamiento C/C
en los carriles 15 y 16. La incisión de desapareamiento se realizó
cuando CEL I estaba presente en el carril 16.
En la caracterización del sitio de incisión de
una endonucleasa de reparación, es importante determinar si se han
realizado una o dos incisiones por cada lesión. Ello se logra
generalmente utilizando sustratos marcados que contienen una
lesión, a su vez, en los cuatro extremos de un dúplex de DNA. Esta
prueba fue satisfactoria en el análisis del sustrato #2 utilizando
tres sustratos marcados debido a la ausencia de incisión en la
cadena superior. En la Fig. 3, carril 4-7 y la Fig.
4, carril 9, respectivamente, se ha comparado la incisión de este
sustrato en los sustratos marcados en 5' y 3'. En ambos casos, el
sitio de incisión se halló en el lado 3' del nucleótido
desapareado. La ausencia de incisión en la cadena inferior para el
sustrato #2 se demostró en el carril 18 de la Fig. 4. En este caso,
únicamente se necesitó el sustrato marcado 5' ya que no se produjo
ninguna incisión en la cadena inferior.
La actividad de CEL I se estimuló en presencia de
una DNA polimerasa. En la Fig. 5, las incisiones de CEL I en el
sustrato del bucle de un solo nucleótido se estimularon con DNA
polimerasa AmpliTaq con cantidades distintas dependiendo de los
nucleótidos presentes en el bucle. Fue necesario utilizar cantidades
distintas de CEL I para ilustrar la estimulación de la DNA
polimerasa. La estimulación de la escisión en los sustratos C y T
extrahelicoidales se muestran mejor en las Figs. 5A & B
(comparar los carriles 4 con los carriles 9 y los 5 con los 10, en
los respectivos paneles) donde se necesitaron niveles mayores de
CEL I para mostrar una buena incisión en estos desapareamientos.
Para los sustratos G y A extrahelicoidales que se hallan entre los
sustratos mejores para CEL I, la estimulación de la DNA polimerasa
AmpliTaq puede representarse mejor utilizando un nivel menor de CEL
I como en la Fig. 5. Las cantidades de estimulación por AmpliTaq de
CEL I en la Fig. 5 se cuantificaron y se muestran en la Tabla
I.
El pH óptimo de CEL I para el sustrato
extrahelicoidal G se investigó en ausencia o presencia de la DNA
polimerasa AmpliTaq. La CEL I (9,5 ng) se incubó con 100 fmol del
sustrato en una reacción de 20 \mul en tampones de pH
5-6,5 (imidazol) y pH 7-9,5
(Tris-HCl) durante 30 minutos a 37ºC. Cuando se
utilizó, media unidad de AmpliTaq DNA polimerasa en la incubación
en los paneles superiores (-polimerasa) o inferiores (+
polimerasa), respectivamente. Tal como se muestra en la Fig. 6, la
CEL I fue activa a pH de 5,0 a 9,5, mostrando un amplio intervalo
de pH óptimos centrado en aproximadamente pH 7,5 (panel superior).
Cuando en la reacción se hallaba la AmpliTaq DNA polimerasa, la
incisión se estimuló en todo el intervalo de pH (panel inferior).
El procedimiento de ensayo no untiliza las cinéticas iniciales y por
ello se descartan conclusiones cuantitativas sobre este perfil de
pH de CEL I. Sin embargo, es evidente que la enzima trabaja muy
bien en intervalos de pH neutros.
Otras combinaciones de sustratos desapareados
también son reconocidos por CEL I y se produce una incisión en uno
de las cadenas de cada dúplex de DNA. En algunos de estos sustratos
la incisión es menos eficiente comparada con los que contienen
bucles de DNA; en consecuencia se utilizaron 45ºC para la incubación
en lugar de 37ºC. En este estudio, se utilizaron sustratos con el
extremo 5' de las cadenas superiores marcado. El autorradiograma de
la Fig. 7 muestra que los desapareamientos que contienen un residuo
C son los sustratos de desapareamiento preferidos, siendo a menudo
mejor C/C que C/A y C/T. Las incisiones en estos desapareamientos
tienden a producir dos posiciones de incisión alternas, una en el
enlace 3' fosfodiéster del residuo C desapareado y la otra en el
enlace fosfodiéster de un nucleótido más allá eliminado en la
dirección 3'. Aunque no se ha investigado si estarían presentes en
estos desapareamientos sitios de incisión alternos en otro contexto
de secuencia de DNA. Una explicación posible para este fenómeno
puede ser que la desestabilización de pares de bases sea mayor
junto a un desapareamiento que contenga un residuo C que para otras
sustituciones de bases. Alternativamente, el nucleótido desapareado
específico puede desplazarse una posición por el sitio 3' porque el
nucleótido próximo es también un residuo C y los dos residuos
pueden intercambiar sus papeles en el apareamiento con el residuo G
en la cadena de DNA opuesta. Para los pares de bases desapareados
por sustitución de bases, la especificidad de CEL I en presencia de
AmpliTaq DNA polimerasa, respecto a la cadena superior, es
C/C>C/A \sim C/T > G/G > A/C \sim A/A \sim T/C >
T/G \sim G/T \sim G/A \sim A/G > T/T (Fig.7A). Se sabe que
las DNA polimerasas de las eubacterias producen una incisión en
estructuras inusuales del DNA (8), se realizó un test para
determinar si la AmpliTaq DNA polimerasa por ella misma produciría
una incisión en los 13 sustratos utilizados en la Fig. 7. En una
exposición prolongada del autorradiograma, no se observó ninguna
incisión de desapareamiento por la AmpliTaq DNA polimerasa (Fig.
7B).
La sensibilidad de CEL I para la detección de
desapareamientos se demuestra por su capacidad para detectar
mutaciones en muestras de DNA agrupadas. El DNA se obtuvo de
linfocitos de sangre periférica de individuos con los que se realizó
un rastreo genético en el Fox Chase Cancer Center. Las muestras se
obtuvieron de familias con únicamente cáncer de mama, únicamente
cáncer de ovario, familias con el síndrome de cáncer de
ovario/cáncer de mama o de muestras control sin cáncer de mama ni
de ovario. Se utilizaron los cebadores no marcados específicos del
exón 2 de BRCA1 para amplificar por PCR esta región del gen. Los
productos de PCR de tipo salvaje del exón 2 se marcaron con
ATP-P^{32}-gamma. En resumen, se
purificaron 10 picomoles del producto de PCR mediante el
procedimiento del equipo Wizard (Promega). A continuación, los
productos de tipo salvaje del exón 2 se fosforilaron con la T4
kinasa y 15 picomoles de ATP-P^{32} gamma a 6.000
Ci/mmol en 30 \mul de tampón kinasa 1X (Tris-HCl
70 mm (pH 7,6), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 5 mM) a 37ºC durante 1
hora. Las reacciones se pararon con 1 \mul de EDTA 0,5 M. El
volumen de reacción se llevó a 50 \mul con tampón 1XSTE (NaCl 100
mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM) y se
pasaron por una columna Pharmacia Probe Quant. El DNA marcado (1
pmol/\mul en 100 \mul) se utilizó a continuación para la
hibridación con las muestras experimentales amplificadas por PCR y
no marcadas. Para cada muestra individual, se incubaron 100 fmol
del producto de PCR con 200 fmol del producto de PCR de tipo salvaje
marcado con P32 en el tampón de reacción de CEL I (KCl 25 mM, MgCl2
10 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5). Después de la
desnaturalización y la renaturalización, los productos de PCR
marcados isotópicamente y formando heterodúplexs se expusieron a
CEL I durante 30 minutos a 37ºC en tampón de reacción 1X y la
reacción se paró mediante adición de 10 \mul de mezcla de parada
(formamida al 75%, EDTA 47 mM, SDS al 1,5%, xilen cianol y
bromofenol azul). Los heterodúplexs se trataron con la enzima
individualmente (carriles 4-13) o se agruparon en un
mismo tubo de muestras (carril 14) y se trataron. Los productos de
la reacción se cargaron en un gel de poliacrilamida al 15% que
contenía urea 7 M y los resultados se mostraron en la Fig. 8. De
las 10 muestras analizadas, 2 contenían una deleción AG (carriles 4
y 7), 2 contenían un bucle de 11 pares de bases (carriles 8 y 9) y
las otras 6 eran de tipo salvaje (carriles 5, 6, 10, 11, 12 y 13).
El corte por CEL I en la deleción AG dio como resultado la
formación de dos bandas, una de aproximadamente 151 nucleótidos de
la cadena superior, la otra de 112 nucleótidos de la cadena inferior
(carriles 4 y 7). El corte de CEEL I en los bucles de 11 pare de
bases dio como resultado la formación de una banda de 147
nucleótidos de la cadena superior y un grupo de bandas de 109
nucleótidos en la cadena inferior (carriles 8 y 9). Los carriles 1,
2 y 3 contienen DNA que no se expuso a CEL I como un control
negativo y carril 15 contiene los marcadores de 64 y 34 pb. Como
puede observarse en el carril 14 del gel, cuando se agrupan las
muestras y se exponen simultáneamente a CEL I, la enzima corta en
todas las mutaciones enunciadas anteriormente sin pérdida de
especificidad. Además, los productos de PCR de las muestras de tipo
salvaje no mostraron ninguna mella específica de DNA.
Para ilustrar mejor la capacidad de CEL I para
detectar mutaciones en muestras de DNA agrupadas, 1, 2, 3, 5, 10 o
30 productos de PCR marcados radioactivamente y formando
heterodúplexs (de nuevo amplificados a partir del exón 2 del gen
BRCA1) se expusieron a CEL-I en un solo tubo de
reacción y los productos se migraron en un gel de poliacrilamida al
6% que contenía urea 7M. Las muestras se amplificaron y marcaron
radioactivamente tal como se describió anteriormente. Cada
agrupación de muestras contenía sólo una muestra con una mutación
(deleción AG). Las otras muestras en cada uno de los agrupamientos
eran de tipo salvaje, Los carriles 1 y 2 contienen muestras control
que no se expusieron a CEL I. En las muestras agrupadas si había
una mutación, la CEL I cortó de manera consistente los productos de
PCR, demostrándose la sensibilidad de la enzima en presencia de un
exceso de DNA no mutado, de tipo salvaje (carriles 4, 5, 6, 7, 8, 9
y 11). Como un control, se analizaron los productos de PCR con
heterodúplexs que no contenían mutaciones y no se observó ninguna
banda de corte correspondiente con la mutación aparecida (Fig. 9,
carriles 3 y 10).
Los grupos de cebadores de PCR específicos para
los exones del gen BRCA1 se han sintetizado por Fox Chase Cancer
Center. La secuencia del gen de BRCA1 es conocida. Las secuencias
de unión exón-intrón y los números de bases
correspondientes se muestran en la tabla II. Los cebadores para
amplificar las secuencias deseadas pueden diseñarse por los
expertos en la materia siguiendo la metodología descrita en
Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds,
John Wisely and Sons, Inc. (1995). Estos cebadores se diseñaron para
que en cada reacción de PCR, un cebador se marcara en su extremo 5'
con un marcaje fluorescente, 6-FAM, mientras que el
otro cebador se marca de modo similar con un marcaje de otro color,
TET. Por lo tanto, el producto de PCR está marcado con dos colores
y por ello pueden observarse los sucesos de mellado del DNA en cada
cadena de forma independiente y corroborarse sus cuantificaciones.
Un resumen de los resultados se muestra en la Tabla III.
La Fig. 10 muestra un esquema de los exones
presente en el gen BRCA1. Se obtuvieron muestras de sangre
periférica de individuos de familias con riesgo elevado y se aisló
el DNA. Los productos de PCR se amplificaron utilizando Elongase
(BRL) y se purificaron utilizando Wizard PCR Preps (Promega). El DNA
se calentó a 94ºC y se enfrió lentamente en tampón de CEL I 1X
(Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 25 mM, MgCl2 10 mM)
para formar heterodúplexs. Los heterodúplexs se incubaron en 20
\mul de tampón de CEL I 1X con 0,2 \mul de CEL I y 0,5 unidades
de AmpliTaq a 45ºc durante 30 minutos. Las reacciones se pararon con
fenantrolina 1 mM y se incubaron durante 10 minutos adicionales a
45ºC. La muestra se pasó por una columna Centricep (Princeton
Separations) y se secó. A continuación, se añadieron 1 \mul de
tampón de carga ABI (EDTA 25 mM, pH 8,0, dextrán azul a 50 mg/ml),
4 \mul de formamida desionizada y 0,5 \mul de estándar interno
de carril TAMRA al sedimento de DNA seco. La muestra se calentó a
90ºC durante 2 minutos y se enfrió rápidamente en hielo antes de
cargarla en el gel. La muestra se cargó a continuación en un gel de
acrilamida al 4,25% desnaturalizante de 34 pocillos de lectura y se
analizó en un secuenciador ABI 373 utilizando el programa GENESCAN
672. El cebador marcado con 6-FAM en esta muestra
experimental se hallaba en el nucleótido 3177 del cDNA de BRCA1
(región 11D), el cebador marcado con TET se hallaba 73 nucleótidos
dentro del intrón entre el exón 11 y el 12. Cada pico representa la
presencia de una banda de DNA producida por el corte del
heterodúplex por CEL I si hubiera una mutación o un polimorfismo.
Un pico representa el tamaño del fragmento producido por CEL I
desde el lado 3' del sitio de desapareamiento al 5' del marcaje
6-FAM de la cadena superior. El otro pico
representa el fragmento correspondiente en la cadena inferior del
lado 3' del desapareamiento al 5' del marcaje TET. La suma de los
dos fragmentos equivale a una longitud de una base más del producto
de PCR. El panel 6-FAM muestra un pico en la base
#645 del marcaje 6-FAM y el panel TET muestra un
pico en la base #483 del marcaje TET, correspondiendo ambos con el
sitio de deleción de 5 bases en el nucleótido 3819 del cDNA de
BRCA1
(Fig. 11).
(Fig. 11).
Se realizó el análisis del exón 11 en otro
individuo utilizando un cebador marcado con 6-FAM
en el nucleótido 1454 del cDNA de BRCA1 (Fig. 12). El otro cebador
estaba marcado con TET en el nucleótido 2459 (región 11C). Los
productos amplificados por PCR se amplificaron y prepararon tal
como se describió anteriormente. En este individuo, el panel
6-FAM muestra un pico en la base #700 y el panel
TET muestra un pico en #305, cada pico corresponde con el sitio de
incisión de CEL I en la cadena de DNA correspondiente en una
mutación de un codón de parada de A>T en el nucleótido 2154 del
cDNA de BRCA1. El panel 6-FAM también muestra un
pico en la base #747 y el panel TET muestra un pico en #258
correspondiente con el sitio de un polimorfismo C>T en el
nucleótido 2201 del cDNA de BRCA1. La mutación de un codón de
parada y el polimorfismo se confirmaron por secuenciación de esta
muestra (KO-11) utilizando el secuenciador ABI 377.
Los picos que están marcados con un asterisco también están
presentes en el carril del control sin enzima y representan el ruido
de fondo del producto de
PCR.
PCR.
Algunos individuos tienen mutaciones en otras
regiones del exón 11, la región 11A, en el esquema de la Fig. 10.
Un cebador marcado con 6-FAM en el nucleótido 2248
del cDNA de BRCA1 y un cebador marcado con TET en el nucleótido 3290
se utilizaron para amplificar esta región del exón 11. Después de
la amplificación, las muestras se procesaron tal como se describió
anteriormente. Los 4 paneles 6- FAM representan reacciones CEL I con
4 muestras de individuos distintos. El primer panel en la Fig. 13A,
la muestra #KO-2, muestra un pico en #182
correspondiendo con el sitio de un polimorfismo T>C en el
nucleótido 2430 y un segundo pico en el nucleótido #483
correspondiendo con el sitio de otro polimorfismo C>T en el
nucleótido 2731. El segundo panel, Fig. 13B, muestra
#KO-3, muestra únicamente el segundo polimorfismo.
El tercer panel, Fig. 13C, muestra #KO-7, no
muestra ningún polimorfismo. El cuarto panel, Fig. 13D, muestra
#KO-11, muestra dos picos correspondientes con los
dos polimorfismos. Es interesante remarcar que esta muestra,
KO-11, es positiva para una mutación de codón de
parada y para un polimorfismo en la región del exón 11C,
correspondiente con los nucleótidos 1454-2459, tal
como se describió
anteriormente.
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla IV muestra las secuencias flanqueantes
5' y 3' que rodean las mutaciones detectadas por CEL I en la
presente invención. Aunque no es exhaustiva, puede observarse a
partir de la variabilidad de las secuencias flanqueantes de estas
mutaciones y polimorfismos que las sensibilidad y el reconocimiento
de desapareamientos de heterodúplexs de DNA por CEL I no se ve
afectado negativamente por dichas secuencias flanqueantes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede observar a partir de los anteriores
ejemplos descritos, la utilización de CEL I presenta diversas
ventajas sobre los procedimientos que utilizan otros sistemas de
reparación de desapareamientos durante el análisis de mutaciones en
el diagnóstico clínico. Estas ventajas se resumen en la Tabla V.
\newpage
Tal como se citó anteriormente, muchas especies
de plantas sintetizan enzimas endonucleasas eficientes. De acuerdo
con la presente invención, se ha aislado una endonucleasa nueva,
ARA I, de Arabidospsis thaliana. Esta endonucleasa es
bastante similar a CEL I en muchos aspectos. Arabidopsis
thaliana proporciona un sistema modelo para los estudios de
biología molecular y bioquímica. Las ventajas del sistema de
Arabidopsis incluyen un ciclo de vida corta de aproximadamente 26
días, el tamaño pequeño de la planta, su genoma diploide y
especialmente el tamaño pequeño del genoma comparado con la mayoría
de plantas superiores. El genoma de Arabidopsis, de 7 x 10^{7}
pb, es sólo 10 veces mayor que el de E. coli (4 x 10^{6}
pb), lo que facilita que el clonaje de la endonucleasa de
desapareamiento y su manipulación genética sean más fáciles que en
las plantas superiores y en el hombre, ya que ambos contienen
aproximadamente 2 x 10^{9} pb. Por ello, el descubrimiento de la
endonucleasa de desapareamiento ARA I en Arabidopsis y la capacidad
para utilizar ARA I para la detección de mutaciones, son etapas
importantes que conducen a la aplicación de esta endonucleasa de
desapareamiento en la detección de mutaciones.
El procedimiento de purificación de ARA I es muy
similar al descrito para CEL I. Ello no sorprendente ya que los
resultados indican que las dos enzimas son similares.
Se crecieron 250 g de callos de Arabidopsis
thaliana ecotipo Columbia en agar mínimo salino y se guardaron
congelados. Los callos se resuspendieron en una licuadora Waring
con Tampón A (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 con
fenilmetanosulfonil fluoruro 10 \muM (PMSF)). Las células
resuspendidas se rompieron con dos pases por una prensa francesa a
20.000 PSIG para producir el lisado crudo. El lisado crudo se
aclaró mediante centrifugación y el sobrenadante se ajustó a 25% de
saturación con sulfato amónico sólido a 4ºC. Al cabo de 2 horas, la
solución se centrifugó y el sobrenadante se ajustó al 85% de
saturación con sulfato amónico. La solución se centrifugó de nuevo
y el sedimento se disolvió en 160 ml de Tampón A que contenía NaCl
0,5 M. Cinco ml de resina Con A se añadieron a esta solución y la
mezcla se dejó toda la noche dando vueltas a 4ºC durante 3 horas. La
pasta en suspensión se empaquetó en una columna de 2,5 cm de
diámetro y se lavó con KCl 0,5 M en tampón A. La ARA I unida se
eluyó con aproximadamente 60 ml de M
alfa-metilmanósido 0,5 M, NaCl 0,5 M en Tampón A a
4ºC. La ARA I eluída se dializó contra una solución de Tampón B
(KPO4 25 mM, PMSF 10 mM, pH 7,4) y se aplicó a una columna de
fosfocelulosa equilibrada en Tampón B. La enzima unida se eluyó con
un gradiente de KCL en Tampón B. El pico eluído de la
P-11 se dializó contra el Tampón A y se concentró
pasándola a través de una columna de intercambio aniónico Mono Q.
La ARA I eluída de la etapa Mono Q se purificó varios centenares de
veces, aunque, sin embargo, la preparación no fue del todo
homogénea.
La composición de la proteína de diversas etapas
de purificación se analizó por una electroforesis en gel de
gradiente de poliacrilamida del 4-20%. En el gel,
que se muestra en la Figura 14, los carriles son los siguientes: 1,
preparación del extacto; 2, precipitación con sulfato amónico; 3,
cromatografía en columna de afinidad de Con-A
Sepharose; 4, cromatografía P-11 de fosfocelulosa; y
5, purificación final en una columna de intercambio aniónico DEAE
Sephacel rindieron una purificación de aproximadamente 10.000 veces
de ARA I. La proteína en el gel se visualizó mediante azul de
Coomassie R-250.
Los productos de PCR se amplificaron utilizando
AmpliTaq (Perkin-Elmer) y se purificaron utilizando
Wizard PCR Preps (Promega). El DNA se calentó a 94ºC y se enfrió
lentamente en tampón 1X ARA I (Tris-HCl 20 mM, pH
7,4, KCL 25 mM, MgCl2 10 mM) para formar heterodúplexs. Los
heterodúplexs se incubaron en 20 \mul de tampón ARA I 1X con 0,2
\mul de ARA I (0,01 \mug) 0,5 unidades de AmpliTaq (Perkin
Elmer) a 45ºC durante 30 min. Las reacciones se pararon con 1 ml de
fenantrolina y se incubaron durante 10 minutos adicionales a 45ºC.
Las muestras se pasaron por una columna Centricep (Princeton
Separations) y se secaron. Al sedimento de DNA seco se añadió 1
\mul de tampón de carga ABI (EDTA 25 mM, pH 8,0, dextran Azul a
50 mg/ml), 4 \mul de formamida desionizada y 0,5 \mul de
marcador interno de carril TAMRA. La muestra se calentó a 90ºC
durante 2 minutos y luego se enfrió rápidamente en hielo antes de
cargar. La muestra se cargó en un gel de acrilamida
desnaturalizante al 4,25% de 34 pocillos para su lectura en un
secuenciador ABI utilizando el programa GENESCAN 672. El eje
vertical del electroferograma corresponde a las unidades
fluorescentes relativas. El eje horizontal del electroferograma es
la longitud del DNA en nucleótidos.
Después de la purificación, la presencia de la
actividad endonucleasa de desapareamientos de ARA I fue fácilmente
observable. La Figura 15 muestra un autorradiograma del análisis de
un gel de secuenciación desnaturalizante del DNA de sustratos con
desapareamientos cortados por ARA I. Los carriles en el gel
corresponden con los carriles que contienen etapas diversas de ARA I
purificada mostradas en la Figura 14. En la Figura 15, los paneles
A, B, C ilustran el corte de ARA I sobre el sustrato #2 con el
nucleótido G extrahelicoidal, el sustrato #4 con el nucleótido A
extrahelicoidal y el sustrato #18, un control sin desapareamiento,
respectivamente. F hace referencia a los sustratos de longitud
completa, mientras que I hace referencia a los sustratos cortados
por ARA I que producen un fragmento de 35 nucleótidos de
longitud.
Las dianas para el GeneScan se prepararon tal
como se describió para los estudios de CEL I.
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de
individuos con riesgo elevado de cáncer de ovario/mama y se aisló el
DNA que se utilizó como un molde para las PCRs. Los cebadores de la
PCR específicos para los exones del gen BRCA1 se sintetizaron con
un colorante 6-FAM en el extremo 5' del cebador de
sentido de transcripción 5' y con un colorante TET en el extremo 5'
del cebador de sentido de transcripción 3'. Los productos de PCR
para un exon se hibridaron para formar heterodúplexs y reaccionaron
con ARA I. Los productos se resolvieron en un secuenciador de DNA
automatizado a ABI 373 con el programa GeneScan 672.
Un diagrama esquemático del ensayo detección de
desapareamientos de ARA I se muestra en la Figura 16. Se mezclaron
los productos de PCR de un alelo de BRCA1 de tipo salvaje (con una
deleción AG en este ejemplo). Después de la desnaturalización por
calor y la rehibridación, se formaron los heterodúplexs de modo que
en algunos de ellos, las bases AG extras formaron un bucle en la
cadena superior. En otros, las bases CT extras formaron un bucle en
la cadena inferior. Las cadenas con bucles se marcaron con un
marcador de color en el extremo 5' de cada uno de los cebadores
utilizados para crear el fragmento de DNA. ARA I corta los bucles
en lado 3' del desapareamiento, al igual que el corte con CEL I.
Como resultado, se produjeron una banda azul truncada
(6-FAM) y una verde truncada (TET). Las longitudes
de estas dos bandas señalan de forma independiente la localización
de la mutación en el
fragmento.
fragmento.
Una ilustración de los resultados obtenidos a
partir del análisis del GeneScan basado en el corte de ARA I de un
heterodúplex que contiene un desapareamiento se muestra en la
Figura 17. La resolución de ARA I tratada con los fragmentos de DNA
se produce en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en un
secuenciador de DNA automatizado Modelo 373 de Perkin Elmer. En el
gel de poliacrilamida desnaturalizante, las señales fluorescentes
que migraron más rápido son los cebadores de PCR residuales. Los
dos fragmentos de ARA I, uno azul (6-FAM) y uno
verde (TET) continuaron estando en sus posiciones respectivas. La
banda de migración más lenta es el producto de PCR de tamaño
completo no cortado. Estas bandas son representadas por el programa
GeneScan como picos en el fluorograma en la parte inferior de la
Figura 17. El programa GeneScan, utilizando estándares de peso
molecular de color rojo (TAMRA) que migran en el mismo carril,
identifica los tamaños de la banda azul y de la banda verde. La
longitud de los fragmentos generados por ARA I de los dos extremos
coloreados del producto de PCR señala de forma independiente la
localización de la mutación.
Las Figuras 18-21 proporcionan
una comparación simultánea de la detección de la mutación por
GeneScan de ARA I respecto a CEL I, utilizando el mismo producto de
PCR del gen BRCA1 descrito en los ejemplos anteriores. Como se puede
observar a partir de los resultados, CEL I y ARA I parecen tener
una actividad enzimática idéntica en los sustratos analizados. Por
ello, ARA I al igual que CEL I es una endonucleasa nueva importante
que puede utilizarse para facilitar la identificación de mutaciones
en el DNA. Por ello, la enzima proporciona un valor adicional al
conjunto de reactivos utilizados en los ensayos de rastreo
genético.
Como apoyo de la reivindicación de que las
endonucleasas de desapareamiento de Arabidopsis, e incluso de muchas
otras plantas, son similares a la reivindicada CEL I del apio, se
presentan los resultados para la detección del desapareamiento por
los extractos de 10 plantas, además de Arabidopsis. Los extractos
vegetales indicados, a saber, la alfalfa, el frijol, el repollo, la
coliflor, la Chá há, la lechuga, el repollo chino, el tomate y el
brócoli se obtuvieron mediante homogenización de una parte de
planta con una parte de tampón A en una licuadora Waring. Tal como
se muestra en la Figura 22, un microlitro del homogenado crudo se
ensayó con el sustrato #4 marcado en 5' con P32 en la cadena
superior (sustrato A extrahelicoidal). Los carriles G+A y T son
marcadores escalonados de secuenciación de DNA de Maxam y Gilbert
utilizados para determinar el sitio de corte exacto en la cadena
superior. El corte de la endonucleasa de desapareamiento produjo un
fragmento de 35 nucleótidos de longitud visible en los carriles 1 a
11. Se observó actividad en las raíces, el tallo, las hojas, las
flores y los frutos de estas plantas, ilustrando su naturaleza
ubicua. Los carriles 12-22, que corresponden a los
carriles 1-11, sirven como controles negativos
utilizando un sustrato #1 de desapareamiento. Chá há es un vegetal
vietnamita que se parece al tallo del apio y es rico en
nucleasas.
nucleasas.
Para mejor ilustrar la naturaleza ubicua de la
actividad endonucleasa de desapareamiento similar a ARA I y CEL I,
se analizó lla actividad enzimática de lo extractos de un grupo de
11 plantas (incluyendo todas las plantas de la Figura 22, más el
espárrago). Véase Figura 23. Los extractos de plantas identificados
en la Figura 22 se utilizaron para cortar un sustrato #2, (sustrato
G extrahelicoidal). Se analizó 1 \mul del homogenado crudo con el
sustrato #2 marcado en 5'con P32 en la cadena superior. Los carriles
G, G+A, C y T son marcadores escalonados de secuenciación de DNA de
Maxam y Gilbert utilizados para determinar el sitio exacto de corte
en la cadena superior. El corte de la endonucleasa de
desapareamiento produjo fragmentos de 34 y 35 nucleótidos de
longitud visibles en los carriles 1 a 17. Se observaron dos bandas
para el corte de desapareamiento debido al desplazamiento del
desapareamiento en los dos residuos G consecutivos en el sustrato
desapareado. Se observó actividad en las raíces, brotes, tallos,
hojas, flores y frutos de estas plantas. Los carriles
12-22 corresponden con los carriles
2-11, pero con el sustrato #1 sin desapareamiento.
Los carriles 14-17 muestran que las actividades
endonucleasas de desapareamiento de 4 de las plantas eran proteínas
manosil similares a CEL I y ARA I. Estas actividades se unieron con
una resina ConA-Sepharose y a continuación se
eluyeron con tampón de manosa. Los carriles 18-21
son controles de los carriles 14-17 excepto que se
utilizó el sustrato #1, sin desapareamiento. Es evidente, a partir
de las Figuras 22 y 23, de que las endonucleasas de desapareamiento
CEL I y ARA I son similares y están conservadas en las plantas
tanto en términos de capacidad de corte de desapareamientos,
abundancia de actividad como de la naturaleza manosil de las
glicoproteínas.
glicoproteínas.
La descripción y los ejemplos descritos
anteriormente hacen referencia a las realizaciones preferidas de la
invención. Otras realizaciones pueden ser evidentes a los expertos
en la materia.
1. Modrich, P. (1994)
Science 266, 1959-1960.
2. Su, S.S., Lahue, R.S.,
Au, K.G., y Moldrich, P. (1988) J. Biol.
Chem. 263, 5057-5061.
3. Finkelstein, E., Afek U.,
Gross, E., Aharoni, N., rosenberg, L., y
Halevy, S. 81994) International Journal of Dermatology
33, 116-118.
4. Smith, P.K., Krohn, R.I.,
hermanson, G.T., mallia, A.K., Gartner, F.H.,
Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M.,
Olson, B.J., y Klenk, D.C. (1985) Analytical
Chemistry 150, 76-85.
5. Gregory D.J., Culp, D.J., y
Jahnke, M.R. (1990) Analytical Biochem. 185,
324-330.
6. Yeung, A.T., Mattes, W.B., Oh,
E.Y., y Grossman, L. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 80, 6157-6161.
7. Yeung, A.T., Dinehart, W.J. y
Jones, B.K. 81988) Nucleic Acids Res, 16,
4539-4554.
8. Lyamichev, V., Brow, M.A.D., y
Dahlberg, J.E. (1993) Science 260,
778-783.
9. Ramotar, D., Auchihcloss, A. H.,
y Fraser, M. J. (1987) J.Biol. Chem. 262,
425-31.
10. Chow, T.Y.-K y Resnick, m.A.
(1987) J. Biol. Chem. 262,
1759-17667.
11. Wyen, N.V., Erdei, S.., y
Farkas, G.L. (1971) Biochem Biphys. Acta 232,
472-83.
12. Brown, P.H., y Ho, D.T.
(1987) Eur. J. Biochem. 168,
357-364.
13. Hanson, D.M. y Farley, J.L.
(1969) J. Biol. Chem. 244,
2440-2449.
14. Nucleases, eds. Linn, S.M.,
Lloyd, R.S., y Roberts, R.J. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1993.
15. Holloman, W.K., Rowe, T.C. y
Rusche, J.R. (1981) J. Biol. Chem. 256,
5087-5094.
16. Badman, R. (1972) Genetic
Res., Camb. 20, 213-229.
17. Shank T.E., Rhodes, c.
Rigby, P.W.J., y Berg, P. (1975) Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 72, 989-993.
18. Maekawa, K., Tsunasawa, S.,
Dibo, g., y Saklyama, F. (1991) Eur. J.
Biochem. 200, 651-661.
19. Kowalski, D., Kroeker, W.D., y
Laskowski, M. Sr. (1976) Biochemistry 15,
4457-4462.
20. Kroeker, W.D., Kowalski, D., y
Laskowski, M. Sr. (1976) Biochemistry 15,
4463-4467.
21. Ardelt, W., y Laskowski, M.,
Sr. (1971) Biochem. Biophys. Res. Commun. 44,
1205-1211.
22. Kowalski, D. (1984) Nucleic
Acids Res. 12, 7071-7086.
23. Strickland, J.A., Marzilli
L.G., Puckett, Jr., J.M., y Doetsch, P.W.
(1991) Biochemistry 30, 9749-9756.
24. Doetsch, P.W., McCray, W.H.,
Lee, K., Bettler, D.R., y Valenzuela, M.R.L.
(1988) Nucleic Acids Res. 16,
6935-6952.
25. Caren, P.R., Kushner, S.R., y
Grossman, L., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82, 4925-4929.
26. Yeh, Y-C., Liu,
H.-F, Ellis, C.A., y Lu, A.-L. (1994) J.
Biol. Chem. 269, 15498-15504.
27. Welch, W.J., Gerrels, J.I.,
thomas, G. P., Lin, J.J.-L., y Feramisco, J.R.
(1983) J. Biol. Chem. 258,
7102-7111.
28. Jackson, S.P., y Tijan, R
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
1781-1785.
29. Jackson, S.P., y Tijan,
(1989) Cell 55, 125-133.
30. He, J., y Furmanski, P. 81995)
Nature 373, 721-724.
31. Peeples, M.E. 81988) Virology
162, 255-259.
32. Buckley, A., y Gould, E.A.
(1988) J. Gen. Virology 69,
1913-1920.
33. Gauffre, A., Viron, A.,
Barel, M., Hermann, J., Puvion, E., y
Frade, R. (1992) Molecular Immunology 29,
113-1120.
34. Jones, B.K. y Yeung, A.T.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
8410-8414.
35. Sarker, y col., (1992)
Nucleic Acids Research 20:871-878.
36. Meyers, R.M. y col., (1986)
CSHSQB 52:275.
Claims (16)
1. Procedimiento para la determinación de una
mutación en una secuencia diana de un polinucleótido de cadena
sencilla en comparación con la hibridación de una secuencia no
mutada con el polinucleótido que incluye dicha secuencia diana, en
donde los mencionados polinucleótidos se amplifican, se marcan con
un marcador detectable, se hibridan uno con otro, se someten a la
actividad de la endonucleasa y se analiza la presencia de dicha
mutación; comprendiendo la mejora la utilización de una enzima
endonucleasa de desapareamiento de origen vegetal, en donde dicha
enzima tiene la capacidad de:
a) detectar todos los desapareamientos entre
dichos polinucleótidos hibridados, en donde la mencionada detección
tiene lugar en un intervalo de pH de 5-9 teniendo
actividad mencionada enzima en dicho intervalo de pH;
b) catalizar la formación de una mella de cadena
sencilla en una secuencia diana que contiene un desapareamiento;
c) reconocer una mutación en una secuencia
polinucleotídica determinada sin los efectos negativos causados por
las secuencias de polinucleótidos flanqueantes de DNA; y
d) reconocer las diferencias de secuencia en las
cadenas polinucleotídicas entre aproximadamente 100 pb y 3 Kb de
longitud.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la mencionada endonucleasa se deriva del apio.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicho polinucleótido es DNA.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde las secuencias sometidas a dicha actividad endonucleasa
se someten además a la actividad de una proteína, seleccionándose
dicha proteína de un grupo consistente en una DNA ligasa, DNA
polimerasa, DNA helicasa, 3'-5'DNA exonucleasa,
proteínas de unión a DNA que se unen a los extremos del DNA o a una
combinación de dichas proteínas, con lo que se reduce el corte de
DNA inespecífico.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde el DNA diana se analiza en presencia de múltiples
muestras agrupadas.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde el mencionado polinucleótido es un cDNA.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dichos polinucleótidos se analizan en un gel de
secuenciación de DNA, con lo que se identifica la localización de la
mutación en una cadena de DNA diana respecto a los marcadores de
peso molecular de secuenciación de DNA.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicha determinación se utiliza como un ensayo de
detección del cáncer.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicha determinación se utiliza como un ensayo de
detección de las alteraciones genéticas que conducen a defectos del
nacimiento.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicha enzima también reconoce los bucles
polinucleotídicos y las inserciones entre los mencionados
polinucleótidos hibridados.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en donde las secuencias sometidas a la mencionada
actividad endonucleasa se someten posteriormente a la actividad de
una proteína, seleccionándose dicha proteína de un grupo consistente
en una DNA ligasa, DNA polimerasa, DNA helicasa,
3'-5'DNA exonucleasa, proteínas de unión a DNA que
se unen a los extremos del DNA o a una combinación de las
mencionadas proteínas, con lo que se estimula la tasa de renovación
de dicha endonucleasa.
12. Enzima endonucleasa de desapareamiento para
la determinación de una mutación en una secuencia diana de un
polinucleótido de mamífero de cadena sencilla en comparación con una
secuencia no mutada en un polinucleótido que se hibrida con el
polinucleótido que incluye dicha secuencia diana, y en donde dicha
enzima se ha aislado de una fuente vegetal y es eficaz para:
a) detectar todos los desapareamientos entre
dichos polinucleótidos hibridados, en donde la mencionada detección
tiene lugar en un intervalo de pH de 5-9, teniendo
actividad dicha enzima en dicho intervalo de pH;
b) reconocer los bucles polinucleotídicos y las
inserciones en los mencionados polinucleótidos hibridados;
c) catalizar la formación de una mella de cadena
sencilla en el sitio del DNA que contiene un desapareamiento;
d) reconocer una mutación en una secuencia
polinucleotídica determinada sin los efectos negativos causados por
las secuencias flanqueantes de DNA; y
e) reconocer las diferencias en la secuencia en
las cadenas polinucleotídicas entre aproximadamente 100 pb y 3 Kb de
longitud.
13. Enzima de acuerdo con la reivindicación 12,
en donde dicha enzima es CEL-1.
14. Enzima de acuerdo con la reivindicación 11,
en donde dicha enzima se halla esencialmente en la forma pura.
15. Enzima de acuerdo con la reivindicación 13,
en donde dicha enzima se halla esencialmente en la forma pura.
16. Enzima de acuerdo con la reivindicación 12,
en donde la fuente vegetal es Arabidopsis thaliana.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/658,322 US5869245A (en) | 1996-06-05 | 1996-06-05 | Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands |
| US658322 | 1996-06-05 | ||
| US80362197A | 1997-02-21 | 1997-02-21 | |
| US803621 | 2010-06-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2231872T3 true ES2231872T3 (es) | 2005-05-16 |
Family
ID=27097607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97928643T Expired - Lifetime ES2231872T3 (es) | 1996-06-05 | 1997-05-20 | Endonucleasas de desapareamiento y utilizaciones de estas para la identificacion de mutaciones en cadenas de polinucleotidos diana. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0964929B1 (es) |
| JP (1) | JP4213214B2 (es) |
| AT (1) | ATE280245T1 (es) |
| AU (1) | AU721493B2 (es) |
| CA (1) | CA2256526C (es) |
| DE (1) | DE69731315T2 (es) |
| ES (1) | ES2231872T3 (es) |
| WO (1) | WO1997046701A1 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2400441C (en) * | 2000-02-22 | 2013-08-27 | Fox Chase Cancer Center | Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof |
| JP4310599B2 (ja) * | 2000-07-05 | 2009-08-12 | 東洋紡績株式会社 | 塩基多型を検出する方法 |
| AU2002314712C1 (en) | 2001-02-02 | 2008-10-02 | Novici Biotech Llc | A method of increasing complementarity in a heteroduplex polynucleotide |
| US7838219B2 (en) | 2001-02-02 | 2010-11-23 | Novici Biotech Llc | Method of increasing complementarity in a heteroduplex |
| US7582423B2 (en) | 2001-02-02 | 2009-09-01 | Novici Biotech Llc | Population of polynucleotide sequence variants |
| US7078211B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-07-18 | Large Scale Biology Corporation | Nucleic acid molecules encoding endonucleases and methods of use thereof |
| DE10248258A1 (de) * | 2002-10-16 | 2004-05-06 | Biopsytec Analytik Gmbh | Mutierte Nukleinsäure einer Cel I-Endonuklease und Verfahren zur Herstellung des rekombinanten vollständigen Cel I-Proteins |
| EP1613776A1 (en) * | 2003-04-02 | 2006-01-11 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Error reduction in automated gene synthesis |
| ES2292270B1 (es) * | 2004-04-14 | 2009-02-16 | Oryzon Genomics, S.A. | Procedimiento para detectar selectivamente acidos nucleicos con estructuras atipicas convertibles en muescas. |
| JP2006271311A (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Hitachi Ltd | 核酸分析方法 |
| JPWO2010008071A1 (ja) * | 2008-07-18 | 2012-01-05 | 国立大学法人富山大学 | 定量法を利用した遺伝子変異スクリーニング法 |
| FR2950630B1 (fr) | 2009-09-30 | 2014-08-22 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Methode de detection de microorganismes |
| WO2011067373A1 (fr) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Assistance Publique - Hopitaux De Paris | Methode de detection d'une polyglobulie chez un chien |
| WO2013116771A1 (en) | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Synthetic Genomics, Inc. | Materials and methods for the synthesis of error-minimized nucleic acid molecules |
| KR102126744B1 (ko) | 2013-03-14 | 2020-06-26 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 내열성 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법 |
| KR20170053636A (ko) | 2014-09-11 | 2017-05-16 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 내열성의 미스매치 엔도뉴클레아제의 이용방법 |
| CN106191228B (zh) * | 2015-05-06 | 2019-10-11 | 中国科学院植物研究所 | Dtt在提高celi家族酶活性中的应用 |
| CN105420361B (zh) * | 2015-12-14 | 2018-08-14 | 福建医科大学 | 基于酶切灵敏检测人类egfr基因突变的方法及试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5459039A (en) * | 1989-05-12 | 1995-10-17 | Duke University | Methods for mapping genetic mutations |
| AU3919293A (en) * | 1992-03-27 | 1993-11-08 | University Of Maryland At Baltimore | Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes |
| AU693198B2 (en) * | 1994-04-25 | 1998-06-25 | Avitech Diagnostics, Inc. | Detection of mutation by resolvase cleavage |
| US5571676A (en) * | 1995-06-07 | 1996-11-05 | Ig Laboratories, Inc. | Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing |
-
1997
- 1997-05-20 ES ES97928643T patent/ES2231872T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-20 EP EP97928643A patent/EP0964929B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-20 AT AT97928643T patent/ATE280245T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-05-20 JP JP50061798A patent/JP4213214B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-20 DE DE69731315T patent/DE69731315T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-20 WO PCT/US1997/008705 patent/WO1997046701A1/en active IP Right Grant
- 1997-05-20 CA CA002256526A patent/CA2256526C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-20 AU AU32845/97A patent/AU721493B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0964929B1 (en) | 2004-10-20 |
| EP0964929A4 (en) | 2003-03-05 |
| DE69731315D1 (de) | 2004-11-25 |
| CA2256526A1 (en) | 1997-12-11 |
| DE69731315T2 (de) | 2006-03-09 |
| JP4213214B2 (ja) | 2009-01-21 |
| EP0964929A1 (en) | 1999-12-22 |
| WO1997046701A1 (en) | 1997-12-11 |
| ATE280245T1 (de) | 2004-11-15 |
| CA2256526C (en) | 2007-04-24 |
| AU3284597A (en) | 1998-01-05 |
| AU721493B2 (en) | 2000-07-06 |
| JP2000511774A (ja) | 2000-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2231872T3 (es) | Endonucleasas de desapareamiento y utilizaciones de estas para la identificacion de mutaciones en cadenas de polinucleotidos diana. | |
| US5869245A (en) | Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands | |
| US5420032A (en) | Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence | |
| McGoldrick et al. | Characterization of a mammalian homolog of the Escherichia coli MutY mismatch repair protein | |
| JP4836952B2 (ja) | 高感受性エンドヌクレアーゼを生産する方法、新規なエンドヌクレアーゼ調製物、及びそれらの使用 | |
| EP1340812A2 (en) | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (Foki) restriction endonuclease | |
| Lee et al. | Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro | |
| US20080113354A1 (en) | Methods and Compositions for High Sensitivity Fluorescent Mutation Detection with Mismatch Cutting Dna Endonucleases | |
| AU2001247212B2 (en) | Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof | |
| ES2362100T3 (es) | Método para producir endonucleasas altamente sensibles, nuevas preparaciones de endonucleasas y usos de las mismas. | |
| AU2001247212A1 (en) | Nucleic acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use thereof | |
| Parani et al. | Identification of Sesamum alatum x Sesamum indicum hybrid using protein, isozyme and RAPD markers | |
| JP2002517214A5 (es) | ||
| Laue et al. | A complex family of class-II restriction endonucleases, DsaI–VI, in Dactylococcopsis salina | |
| US5824530A (en) | Overexpression of recombinant bacteriophage T4 endonuclease VII and uses thereof | |
| Kutueva et al. | The methylation pattern of a cytosine DNA‐methyltransferase gene in Arabidopsis thaliana plants | |
| February | Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in targeted polynucleotide strands | |
| Perrino et al. | Sequence variants in the 3′→ 5′ deoxyribonuclease TREX2: identification in a genetic screen and effects on catalysis by the recombinant proteins | |
| Haukanes et al. | Mechanism of incision by an apurinic≤ apyrimidinjc endonuclease present in human placenta | |
| Frank-Kamenetskii et al. | PNA Directed Genome Rare Cutting: New Developments | |
| Yeung et al. | Detection of Mutations Using a Novel Endonuclease | |
| INäKBCIED | Detection of Mutations Using a Novel Endonuclease | |
| Frank-Kamenetskii et al. | PNA Directed Genome Rare | |
| Rangarajan | Purification and characteristics of extracellular nuclease from rhizopus stononifer | |
| Kita | STUDIES ON NEW RESTRICTION ENZYMES AND |