JP2000511774A - ミスマッチエンドヌクレアーゼおよび標的ポリヌクレオチド鎖中突然変異の同定におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 セロリーから単離されたエンドヌクレアーゼＣＥＬ Ｉならびに標的ポリヌクレオチド中の突然変異の検出における使用方法を開示する。該方法は、突然変異、ミスマッチおよび多型の位置決定および同定を容易とする。該酵素は、ミスマッチが存在する配列に関するかに拘らずいずれのタイプのミスマッチをも認識し、該酵素は酸性ないし塩基性のｐＨ範囲で活性である。

Description

【発明の詳細な説明】 ミスマッチエンドヌクレアーゼおよび標的ポリヌクレオチド鎖中 突然変異の同定におけるその使用 米国特許法第２０２条(ｃ)に従って、米国政府は、国立保健研究所（National Institutes of Health）、国立癌センター（National Cancer Institute）から の基金の一部で行った、ここに記載された発明においてある種の権利を有するこ とをここに承認する。 本出願は、１９９６年６月５日に出願された米国出願第０８/６５８,３２２号 の一部継続出願であり、ここに出典明示してその全開示を本明細書の一部とみな す。発明の分野 本発明は、標的核酸中の突然変異の検出用の物質および方法に関する。さらに 詳細には、本発明は、新規なミスマッチ特異的ヌクレアーゼおよび遺伝性疾患お よび癌の遺伝的スクリーニングを促進する該酵素の使用方法を提供する。また、 当該方法は、遺伝的多型の検出に有用である。発明の背景 本出願では、本発明が属する技術分野の水準をより十分に記述するために、い くつかの刊行物がカッコ内の数字によって引用される。これらの文献の完全な書 誌的事項は、本明細書の終わりに見出される。これらの各刊行物の開示は、ここ に出典明示して、本明細書の一部とみなす。 遺伝子内のヌクレオチド配列は、その最も頻繁なものが、塩基対置換、フレー ムシフト突然変異および欠失または挿入である、いくつかの方法のうちいずれか で突然変異的に改変させ、または「ミスマッチとする」ことができる。これらの 突然変異は、放射線および突然変異原性化学薬品のごとき環境要因によって誘導 でき；複製間にＤＮＡポリメラーゼによって偶然にエラーが起こる。ＤＮＡ複製 の信頼性は維持されないので、多数のヒト疾患状態が発生する。ＤＮＡ中での単 一の塩基変化によって、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血およびある種の癌が生じ る結果、異常型もしくは非機能的蛋白質が合成される。 植物の高成長速度および植物中のＤＮＡインターカレーターの豊富さは、ミス マッチおよびフレームシフト障害の傾向の増大を示唆する。植物および真菌は、 ＤＮＡおよびＲＮＡの両者を攻撃する豊富な一本鎖特異的ヌクレアーゼを有する ことが知られている（９〜１４）。これらのうちいくらかは、Ustilago maydis のヌクレアーゼαのように、ＤＮＡ組換えの間に、遺伝子変換に加坦することが 提案されている（１５、１６）。これらのヌクレアーゼのうち、Aspergil1us or yzue からのＳ１ヌクレアーゼ（１７）、およびPenicillium citrinumからのＰ１ ヌクレアーゼ（１８）、およびVigna radiataの芽からのリョクトウ（緑豆、Mun g Bean）・ヌクレアーゼ（１９〜２２）は、最も特徴付けられている。Ｓ１、P1 およびリョクトウ・ヌクレアーゼは、主にｐＨ５.０付近で活性なＺｎ蛋白質で あり、一方、ヌクレアーゼαはｐＨ８.０で活性である。ＤＮＡ障害の一本鎖性 特性は、バルキーな付加的修復に関して、植物酵素、ＳＰヌクレアーゼによって 使用されているらしい。ホウレン草から精製されたヌクレアーゼＳＰは、一本鎖 ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼであつて、全ての中性ｐＨにてＴＣ_6-4二量体およびシ スプラチン障害においてＤＮＡを切断できる（２３、２４）。ＳＰがミスマッチ においてＤＮＡを切断できるか否かは未だ知られていない。 Escherichia coliでは、塩基置換および不対合ＤＮＡループの障害は、メチル 化指向性ロングパッチ修復システムによって修復される。このマルチ酵素システ ムにおける蛋白質には、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳが含有まれる（１、 ２）。このシステムは有効であるが、Ｃ／Ｃ障害および４ヌクレオチドよりも長 いＤＮＡループは修復されない。ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬ蛋白質は、細菌からヒ トに至るまで保存されており、高等生物で同様の修復役割を遂行できるらしい。 ＭｕｔＳ/ＭｕｔＬシステムによって十分に修復されないいくらかの障害、およ びショートパッチ修復システムがより望ましい遺伝子変換について、新規な能力 を有 する他のミスマッチ修復システムが必要である。 現在、突然変異分析に関する最も直接的な方法は、ＤＮＡ配列決定であるが、 それは最も骨が折れかつ高価でもある。全ての実験試料ごとに潜在的に関係する 領域を配列決定するのは、通常、実用的ではない。それよりも、普通は、いくつ かのタイプの予備的スクリーニング法を用いて、突然変異を含む試料のみを配列 決定するために同定し標的化する。一本鎖立体配座多型(ＳＳＣＰ)は、天然ポリ アクリルアミドゲルでの一本鎖野生型および突然変異体の配列間の移動度の差に 基づく、広範に使用されるスクリーニング法である。他の方法は、天然ゲル（ヘ テロデュプレックス分析）または変性ゲル（変性勾配ゲル電気泳動）での野生型 /突然変異体ヘテロデュプレックス（対照ホモデュプレックスと比較）における 移動度の相違に基づいている。これらのアッセイでは、試料の調製は比較的容易 であるが、突然変異を含む標的を同定するための基礎を形成するしばしは微妙な 移動度の相違を生じさせるには、電気泳動には非常に正確な条件が必要とされる 。もう一つの大変重要なパラメーターは、スクリーニングすべき標的領域のサイ ズである。一般に、ＳＳＣＰを使用して、約２００〜３００塩基より長くない標 的領域をスクリーニングする。単一塩基の突然変異を検出するＳＳＣＰの信頼性 は多少不確実であるが、２００塩基より小さい標的については恐らく７０〜９０ ％の範囲であろう。標的領域のサイズが増加するほど、検出率は下降し、例えば 、長さが１８３塩基対の標的についての８７％から３０７塩基対の標的の５７％ までという一つの研究がある（３５）。単一の工程で、より長い領域をスクリー ニングする能力は、いずれの突然変異スクリーニング法の有用性をも高めるであ ろう。 現在用いられているスクリーニング技術のもう一つのタイプは、点突然変異を 含む実験用標的に対してハイブリダイズする野生型プローブ間で形成されたヘテ ロデュプレックス中の不対合塩基の切断に基づいている。また、ミスマッチにお いてプローブの切断によって生じるサブフラグメントは、全長非切断プローブと サイズが一般的に有意に異なり、しかも標準ゲルシステムで容易に検出されるの で、切断生成物はゲル電気泳動によっても分析される。ミスマッチ切断は、化学 的に（四酸化オスミウム、ヒドロキシルアミン）またはＲＮアーゼＡを用い毒性 の小さい酵素代替物にてのいずれかで遂行されてきた。頻度は大変小さいが、Ｒ ＮアーゼＡ切断アッセイも、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ標的中の突然変異に つき検出するために、内因性ｍＲＮＡ標的中の突然変異をスクリーニングするの に使用されてきた。５０％を超える突然変異検出率が、オリジナルのＲＮアーゼ スクリーニング法について報告されている（３６）。 ＤＮＡ中の突然変異を検出するより新しい方法は、相補的標的核酸にハイブリ ダイズする２つの隣接するオリゴヌクレオチドを共有結合させるＤＮＡリガーゼ に依拠する。ミスマッチは、連結反応の部位で生じなければならない。オリゴヌ クレオチドに依拠する他の方法に関しては、ハイブリダイゼーションでの塩濃度 および温度が非常に重要である。もう一つの考慮すべき事柄は、ＤＮＡ濃度に対 する添加される酵素の量である。 前記した方法は、正常または野生型配列のごとき、８０％を超えるバックグラ ウンド核酸で汚染された核酸中の塩基変化を信頼性をもっては検出できない。汚 染問題は、例えば、循環中で悪性細胞が極少量存在する癌検出において重要であ る。今日用いられている方法は、臨床的状況において実際上適用されるべき十分 な感度に欠ける。 ミスマッチ修復酵素を用いた遺伝子突然変異の検出法は、ＬｕＣｈａｎｇおよ びＨｓｕによって記載されている。ＷＯ９３/２０２３３参照。誤対合Ａ/Ｇ残基 を認識するＭｕｔＹ遺伝子の産物は、全ての塩基対ミスマッチにおいてニックを 入れることができる「全タイプ酵素」として文献中に記載されたもう一つの酵素 と組み合わせて使用されている。当該酵素は、挿入および欠失を検出しない。ま た、全タイプ酵素は、異なるミスマッチを異なる効率にて認識し、その活性は、 フランキングＤＮＡ配列によって悪影響を受け得る。従って、この方法は、所与 のＤＮＡ分子中で生じ得る種々の突然変異を検出するには、ミスマッチ修復酵素 およびＤＮＡグリコシラーゼのカクテルに依存する。 しばしば、臨床的状況において突然変異またはミスマッチの性質は不明である ので、特異的ＤＮＡグリコシラーゼの使用は除外される。従って、フランキング ＤＮＡ配列に関係なく、同等の効率にて全てのミスマッチを認識したり、挿入お よび欠失も検出する能力のある単一酵素のシステムに対する要望が存在する。大 量の試料を必要とせず、毒性化学薬品の使用も必要とせず、骨が折れ高価でもな く、その上、ミスマッチだけでなくＤＮＡの欠失および挿入も検出する能力のあ る、単一の塩基対ミスマッチを検出するのに、敏感で正確なアッセイを有するこ とは有益であろう。 所与のＤＮＡ分子中の突然変異の位置の同定を促進するであろう方法とカップ リングさせたそのようなシステムは、遺伝的スクリーニング応用について明らか に有利であろう。この新規な突然変異検出システムを提供するのが本発明の目的 である。発明の概要 本発明は、標的ポリヌクレオチド鎖中の突然変異またはミスマッチの検出のた めの物質および方法を提供する。標的核酸鎖中の改変された塩基対合のスクリー ニングおよび同定を促進するゲルアッセイシステムと組み合わせて、新規なエン ドヌクレアーゼを用いて、検出が達成される。 本発明の一つの態様により、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の突然変異またはミス マッチの検出に有用な新規な植物由来ヌクレアーゼが提供される。セロリー、例 えば、（Apium graveolens var ．dulce）は、挿入的/欠失的ＤＮＡループ障害お よびミスマッチにつき高度に特異的である豊富な量の本発明のヌクレアーゼを含 有する。ここにＣＥＬ Ｉと命名される本酵素は、ミスマッチヌクレオチドの３' 側のホスホジエステル結合で切断する。ＣＥＬ Ｉは、実質上均質となるように 、約１０，０００倍精製された。 本発明の好ましい具体例において、標的配列を含めたポリヌクレオチドとハイ ブリダイズできるポリヌクレオチドの非変異配列を参照として、一本鎖哺乳類ポ リヌクレオチドの標的配列中の突然変異を検出する方法が提供される。該配列は 、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、検出マーカーで標識され、 相互にハイブリダイズさせ、本発明のＣＥＬ Ｉに曝露させ、突然変異の存在に つき ゲル上で分析される。 本発明の植物由来エンドヌクレアーゼは、特性の独特の組合せを有する。これ らは、本発明の方法を実施するにおいて形成されるハイブリダイズした配列間の 全ての可能なミスマッチを検出し；かくハイブリダイズした配列間のポリヌクレ オチドループおよび挿入を認識し；当該ハイブリダイズした鎖間の多型を検出し ；長さが約１００ｂｐおよび３ｋｂ間のポリヌクレオチド鎖中の配列相違を認識 し、フランキングＤＮＡ配列の実質的な有害作用なくして標的ポリヌクレオチド 配列中のかかる突然変異を認識する能力を含む。 植物ベースのエンドヌクレアーゼである本発明のＣＥＬ Ｉは、セロリーに対 して特有というのではない。機能的に類似する酵素活性が１４の異なる植物種に おいて示されている。従って、本酵素は植物界で保存されているようで、セロリ ー以外の植物から精製することもできる。セロリー以外の植物からの本エンドヌ クレアーゼ活性を精製する手順は当業者によく知られており、本発明の範囲内に あるものと考えられる。かかる酵素は、例えば、本発明に従って、植物種Arabid opsis thaliana から実質的に均質になるまで精製された。ＡＲＡ Ｉと命名され るこの新規酵素は、その酵素活性が、ＣＥＬ Ｉと同様であり、従って、本発明 の遺伝的突然変異スクリーニングアッセイに役立てるために用いることもできる 。 植物ベースのエンドヌクレアーゼは、植物界に限定されるものではなく、他の 生物形態中にも同様に見出すこともできる。かかる酵素は、セロリー中のＣＥＬ Ｉの機能と同様の機能を発揮し、またはＤＮＡ代謝の他の特別な段階に適合さ せることもできる。かかる酵素またはそれらをコードする遺伝子は、ＣＥＬ Ｉ と同一または類似に機能できるように酵素活性を生じさせるように使用または修 飾することもできる。また、かかる遺伝子の単離およびその修飾も本発明の範囲 内のものである。 本発明のもう一つの具体例において、前記方法は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポ リメラーゼまたはその組合せと併用し、それにより、非特異的ＤＮＡ切断が減少 する。 本発明のさらにもう一つの具体例において、多重分析として本明細書で引用さ れる技術によって、本発明の前記の酵素および方法を用いて多数の試料の同時分 析が実施される。 本発明のパラメーターをより明確に記述するために、以下の定義を供する： 「エンドヌクレアーゼ」なる用語は、ＤＮＡを内部で切断できる酵素をいう。 「単離された核酸」なる用語は、それが由来する生物の天然に生じるゲノム中 の通常直ぐ隣接する（５'および３'方向）配列から分離されたＤＮＡまたはＲＮ Ａ分子をいう。 「塩基対ミスマッチ」なる用語は、ワトソンおよびクリック塩基対合規則に従っ て核酸中で通常は形成されない塩基対の組合せを示す。例えば、ＤＮＡ中に一般 的に見出される塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンおよびチミジンを 扱う場合、塩基対ミスマッチは、通常ＤＮＡ中に見出されるＡ−ＴおよびＧ−Ｃ 対以外の塩基組合せである。本明細書に記載されたごとく、例えば、シトシン残 基が、本来の対合パートナーであるグアニンに対抗して、もう一つのシトシンに 対して見出されることを意味するＣ/Ｃのごときミスマッチが示され得る。 「ＤＮＡ挿入または欠失」なる熟語は、挿入および欠失した塩基の領域にわた り相補性が維持されないような、ＤＮＡの２つの鎖間における「マッチした」塩 基の存在または不存在をいう。 「相補的」なる用語は、実質的に正常な対合特性を呈する２つのＤＮＡ鎖をい う。しかしながら、相補的ＤＮＡは１以上のミスマッチを含み得る。 「ハイブリダイゼーション」なる用語は、２つの相補的ＤＮＡ鎖間で起こる水 素結合をいう。 「フランキング核酸配列」なる熟語は、エンドヌクレアーゼ切断部位に対して ５'側および３'側にある隣接する核酸配列をいう。 「多重分析」なる用語は、前記の方法によるプールされたＤＮＡ試料の同時ア ッセイをいう。 「実質的に純粋な」なる用語は、注目する物質の少なくとも５０〜６０重量％ を含む調製物をいう。より好ましくは、調製物が注目する物質の少なくとも７５ 重量％、最も好ましくは、９０〜９９重量％を含む。純度は、蛋白質の場合はク ロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰ ＬＣ分析などを含めた、精製すべき物質に適切な方法によって測定される。 Ｃ＞Ｔは、ミスマッチを生起するチミジン残基に代えてのシトシン残基の置換 を示す。ミスマッチまたは多型を生起するもう一つに代えてのいずれかの塩基の 不適当な置換もこのように示すこともできる。 N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシルローダミン(ＴＡＭＲＡ)は、ＤＮＡ 分子量標準を標識するのに用いる蛍光染料であり、該標準は自動ＤＮＡ配列決定 によって分析されるＤＮＡについての内部標準として利用される。 プライマーは、6-カルボキシフルオレセイン(6−ＦＡＭ)で蛍光標識すること ができる。別法として、プライマーは、4,7,2',7'-テトラクロロ-6-カルボキシ フルオレセイン(ＴＥＴ)で標識することもできる。他の代替ＤＮＡ標識法は、当 該技術分野で知られており、本発明の範囲内にあると考えられる。 ＣＥＬ Ｉは、実質的に均質となるように精製され、かくして、アミノ末端ペ プチドの配列決定は、対応する特異的オリゴヌクレオチドプローブを供してセロ リーからの酵素のクローニングを促進すると考えられる。遺伝子のクローニング および配列決定に続き、いずれかの数の組換えＤＮＡシステムにおいて該遺伝子 を発現させることができる。この手順は当業者によく知られており、本発明の範 囲内にあると考えられる。図面の簡単な記載 図１は、精製酵素ＣＥＬ Ｉのドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリル アミドゲル分析の結果を示す。分子量マーカーの位置を片側に示す。Ｔは、分解 ゲルの先端を示す。 図２は、本発明に従って核酸分析を行うのに用いたある種のヘテロデュプレッ クスＤＮＡ基質を示す。図２Ａは、5'-Ｐまたは3'-ＯＨのいずれかの末端にて標 識できる２体を示す。本分析で参照として用いられたヌクレオチド位置を、 ヌクレオチド挿入数とは無関係に頂部鎖中のＸにおいて示す。挿入された配列お よび基質の番号は表中に示す。図２Ｂは、本分析で用いられたミスマッチ塩基対 基質を示し、種々の誤対合基質を生じるように付表中におけるごとく変化させた ヌクレオチドＹおよびＺが何であるかも共に示す。 図３は、異なる基質中のＣＥＬ Ｉ切断に対する温度の影響を示すオートラジ オグラムである。 図４は、一ヌクレオチドのＤＮＡループにおけるＣＥＬ Ｉの相対的切断優先 性を示すオートラジオグラムである。図４Ａは、Ｘ＝Ｇに加えて、Ｘ＝Ｃもまた 、２つの代替塩基対合立体配座を可能とすることを示す。図４Ｂは、基質の底部 鎖が１６レーン中の＃１０のＣ/Ｃミスマッチにおけるごとく、ＣＥＬ Ｉ切断に 対して受容能があることを示す。 図５は、単一らせん外ヌクレオチドのＤＮＡミスマッチにおける精製ＣＥＬ Ｉ切断のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ媒介刺激を示す、変性１５％ポ リアクリルアミドゲルのオートラジオグラムである。Ｆは、頂部鎖の５'末端(^*) で標識された６４ヌクレオチド長の全長基質を示す。パネル５Ａ、５Ｂおよび５ Ｃでは、ＤＮＡポリメラーゼの存在または不存在下で、ＣＥＬ Ｉの量を変えて 基質を処理した。 図６は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在または不存在下でのら せん外Ｇ残基におけるＣＥＬ Ｉ切断の至適ｐＨを示すオートラジオグラムであ る。頂部パネルは、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの不存在下でのＣＥ Ｌ Ｉ活性を示す。底部のパネルは、ポリメラーゼの存在下でのＣＥＬ Ｉ活性を 示す。 図７は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在下での精製ＣＥＬ Ｉに よる塩基置換ミスマッチの認識を示すオートラジオグラムである。（Ｉ）は、ミ スマッチヌクレオチドの３'側のホスホジエステル結合における一次切断部位を 示す。パネル７Ａは、ＣＥＬ ＩおよびＤＮＡポリメラーゼ双方の存在下での基 質の切断を示す。パネル７Ｂでは、ＣＥＬ Ｉは省略した。 図８は、過剰な野生型ＤＮＡの存在下、プールされたＤＮＡ試料中の突然変異 を認識するＣＥＬ Ｉの能力を示すオートラジオグラムである。レーン３、５、 ６、１０、１１，１２および１３は、野生型ヘテロデュプレックスを含有する単 一試料を含む。レーン４および６は、ＡＧ欠失を含む。レーン８および９は、１ １塩基対ループを有する基質を含む。前記の試料をプールし、ＣＥＬ Ｉで処理 した。この「多重分析」の結果をレーン１４に示す。 図９は、過剰な野生型ＤＮＡの存在下で突然変異を認識するＣＥＬ Ｉの能力 を示すオートラジオグラムである。１、２、３、４、１０または３０のヘテロデ ュプレックス化放射性同位体標識ＰＣＲ産物（ＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン２か ら増幅された）を単一反応管中でＣＥＬ Ｉに曝露し、生成物を６％ポリアクリ ルアミドゲルで泳動させた。レーン１および２は、ＣＥＬ Ｉの不存在下での陰 性対照の泳動である。レーン３ないし１１は、野生型非変異ヘロデュプレックス の量を増やしつつ存在させたときに、ＡＧ欠失を有する１つの試料を含む。 図１０は、ＢＲＣＡ１遺伝子およびその遺伝子中のエクソン境界の模式的代表 的なダイアグラムを示す。 図１１は、ＰＣＲ増幅およびＣＥＬ Ｉでの処理に続いての、ＢＲＣＡ１の１ １Ｄエクソン中の５塩基欠失の位置決定を示す、試料のヒストグラムである。ス パイクは、ミスマッチ部位でのＣＥＬ Ｉによる切断によって生じた特異的サイ ズのＤＮＡフラグメントを示す。パネルＡは、ＢＲＣＡ１のヌクレオチド３１７ ７でアニールされた6-ＦＡＭ標識化プライマーで得られた結果を示す。パネルＢ は、エクソン１１およびエクソン１２間のイントロン内に７3塩基アニールされ たＴ ＥＴ標識プライマーで得られた結果を示す。パネルＣは、ＴＡＭＲＡ内部レーン サイズ標準を表す。突然変異の位置は、ＤＮＡの両鎖上で評価できることに注意 されたし。 図１２は、ＰＣＲ増幅およびＣＥＬ Ｉでの処理に続いての、ＢＲＣＡ１の１ １Ｃエクソン中の２１５４位でのナンセンス突然変異、Ａ＞Ｔおよびヌクレオチ ド２２０１での多型Ｃ＞Ｔの位置決定を示す試料のヒストグラムである。ナンセ ンス突然変異の部位に対応して、パネルＡは、塩基＃７００でスパイクを示し、 パネルＢは、＃３０５でスパイクを示す。パネルＣは、ＴＡＭＲＡ内部レーン標 準である。 図１３は、本発明の方法を用いてエクソン１１Ａ中の突然変異の存在について 分析した４つの異なる試料から得られた結果を示す。6-ＦＡＭ試料からの結果を 示す。パネルＡは、ヌクレオチド２４３０での多型Ｔ＞Ｃおよびヌクレオチド２ ７３１でのもう一つの多型Ｃ＞Ｔの部位に対応する＃４８３位での第２のスパイ クを示す。パネルＢは、パネルＡ中に記載された第２の多型のみを示す。パネル Ｃは、多型または突然変異を示さない。パネルＤは、パネルＡで見られる２つの 多型を示す。 図１４は、Arabidopsis thalianaのＡＲＡ Ｉミスマッチエンドヌクレアーゼ についての精製スキームを示すゲルを示す。レーン１：フレンチ・プレス（Fren ch Press）によって破壊された細胞の粗抽出物；レーン２：２５％〜８５％飽和 硫酸アンモニウム分別；レーン３：Ｃｏｎ Ａ−セファロースアフィニティーカ ラム、ＡＲＡＩは、α−メチルマンノシドにより溶出させた；レーン４：ホスホ セルロースＰ−１１カラムのＡＲＡ Ｉピーク；レーン５：ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈ ａｃｅｌアニオン交換カラムのＡＲＡ Ｉピーク。分子量標準は、レーン中にて 「Ｓ」で示す。 図１５は、ＡＲＡ Ｉが精製スキームを通じてミスマッチ基質を切断すること を示す変性ＤＮＡ配列決定ゲル分析のオートラジオグラムを示す。レーン番号は 、図１４中の精製工程のそれらに対応する。パネルＡ、Ｂ、Ｃは、各々、基質＃ ２、基質＃４および基質＃１８（非ミスマッチ対照基質）のＡＲＡ Ｉ切断を示 す。Ｆ＝全長、Ｉ＝ＡＲＡ Ｉ切断。 図１６は、ＡＲＡ Ｉベースのミスマッチ検出アッセイの模式的ダイアグラム である。 図１７は、ミスマッチを含むヘテロデュプレックスに対するＡＲＡ Ｉのヌク レオチド内分解活性のジーンスキャン分析から得られたデータの図解である。 図１８は、ＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン１９の野生型対立遺伝子を用いる一連 の対照反応が関与する、ＡＲＡ Ｉ対ＣＥＬ Ｉのジーンスキャン突然変異検出の 比較を示す。ＤＮＡの本フラグメントはいずれの突然変異も含まず、従って、ミ スマッチニッキングは観察されなかった。パネルＡおよびＢは、７ｎｇのＣＥＬ Ｉで処理され、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってミスマッチ切断 において刺激された２つの鎖を示す。Ｂ＝（6−ＦＡＭ）；Ｇ＝（ＴＥＴ）。パ ネルＣおよびＤは、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼよる刺激なくして、 ２０ｎｇの精製ＡＲＡ Ｉで処理された２つの鎖である。パネルＥおよびＦは、 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在によってミスマッチ切断の間に刺 激された２０ｎｇのＡＲＡ Ｉで処理された２つの鎖を示す。 図１９は、ＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン１９中のＣＥＬ ＩおよびＡＲＡ Ｉミ スマッチ検出活性の並べたジーンスキャン分析を示す。パネルＡおよびＢは、０ .５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在下における、７ｎｇ のＣＥＬ Ｉを用いるミスマッチ切断を示す。パネルＣおよびＤは、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなくしての、２０ｎgのＡＲＡ ＩによるＡヌクレオ チド 欠失ミスマッチの切断を示す。パネルＥおよびＦは、０.５ユニットのＡｍｐｌ ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在下によってミスマッチ切断中に刺激された ２ｎｇのＡＲＡ Ｉによる同一基質の切断を示す。検出された全ての突然変異お よび多型は、自動化配列決定により確認された。これらの結果は、ＣＥＬ Ｉ突 然変異検出法と同様にＡＲＡ ＩがＳＳＣＰまたはＤＮＡ配列決定で検出するの が困難である突然変異を同定できることを示唆する。 図２０は、ＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン２の野生型対立遺伝子を使用する一連 の対照反応のシリーズを含む、ＡＲＡ Ｉ対ＣＥＬ Ｉのジーンスキャン突然変異 検出の比較を示す。図１８におけるごとく、本遺伝子セグメントは、いずれの突 然変異も含まず、かくして、ミスマッチニッキングは観察されない。パネルＡお よびＢは、０.５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってミス マッチ切断中で刺激された７ｎｇのＣＥＬ Ｉで処理された２つの鎖を示す。パ ネルＣおよびＤは、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる刺激なくして 、２０ｎｇの精製ＡＲＡ Ｉで処理された２つの鎖を示す。パネルＥおよびＦは 、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＮＡポリメラーゼの存在によるミスマッチ切断のために刺 激された２０ｎｇのＡＲＡＩで処理された２つの鎖を示す。パネルＧおよびＨは 、０.５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在によってミスマ ッチ切断のために刺激された２ｎｇのＡＲＡ Ｉで処理された２つの鎖を示す。 図２１は、ＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン２中のＣＥＬ ＩおよびＡＲＡ Ｉミス マッチ検出のジーンスキャン分析を示す。パネルＡおよびＢは、０.５ユニット のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在における７ｎｇのＣＥＬ Ｉによ るＡＧ−欠失ミスマッチ切断を示す。パネルＣおよびＤは、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼなくしての、２０ｎｇのＡＲＡ ＩによるＡＧヌクレオチド 欠失ミスマッチの切断を示す。パネルＥおよびＦは、０.５ユニットのＡｍｐｌ ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在によつてミスマッチ切断において刺激され た２０ｎｇのＡＲＡ Ｉによる同一基質の切断を示す。パネルＧおよびＨは、０. ５ユニット のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在によるミスマッチ切断において 刺激された２ｎｇのＡＲＡ Ｉによる同一基質の切断を示す。 図２２は、ＡＲＡ ＩおよびＣＥＬ Ｉのそれと同様のミスマッチエンドヌクレ アーゼ活性が、１０種の他の植物の抽出物に存在することを示すオートラジオグ ラムである。 図２３は、ＡＲＡ ＩおよびＣＥＬ Ｉと同様のミスマッチエンドヌクレアーゼ 活性が、１１種の他の植物の抽出物に存在することを示すオートラジオグラムで ある。発明の詳細な記載 ＤＮＡ複製の間の正しい塩基配列の維持についての酵素的基礎は、E.coli.で 広範に研究されてきた。本生物は、４ヌクレオチド長までの挿入/欠失と同様に ヘミメチル化ＤＮＡ中の種々のＤＮＡ塩基対ミスマッチを訂正するミスマッチ修 復経路を進化させてきた。この経路を欠く細胞はより頻繁に突然変異し、それゆ えに、当該遺伝子は、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨ等と呼ばれる。Ｍｕｔ Ｓ蛋白質は、ミスマッチに結合し、ＭｕｔＨは、Ａ残基がメチル化されていない 鎖上のＧＡＴＣ部位でＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。ＭｕｔＬは 、修復の間にＭｕｔＨおよびＭｕｔＳとで複合体を形成する。ＭｕｔＳおよびＭ ｕｔＬの相同物は多くの系で存在するが、ＭｕｔＨは存在しない。酵母において 、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ相同物）は、それ自体ミスマッチに結合できるが、２つの ＭｕｔＬ相同物（ＭＬＨおよびＰＭＳＩ）プラスＭＳＨ２の複合体が観察されて いる。ヒト相同物ｈＭＳＨ２は、ヒトのマイクロサテライト繰返しでの誤整列の ごときメカニズムによりしばしば生起する１４ヌクレオチド長までより大きなＤ ＮＡ挿入に結合するように進化してきた。ループ修復におけるｈＭＬＨ１の役割 は不明である。これらのヒト相同物のいずれか１つにおける突然変異は非ポリー プ性結腸癌の遺伝的形式の原因であることが示された（２７、２８）。 セロリーは、光感作性インターカレーターであるソラレンを組織グラム当たり ４０μｇを超えて含有する（３）。必然的に、セロリーは挿入、欠失および他の ソラレン・フォトアダクツ（photoadduct）の障害の修復について高い能力を有 するであろう。障害部位における一本鎖性は、塩基置換およびＤＮＡループ障害 に共通する。以下の例におけるデータは、セロリー、Arabidopsis thalianaおよ び他の植物種が、これらの潜在的な突然変異誘発性の事象に対処するために豊富 なミスマッチ−特異的エンドヌクレアーゼを有することを示す。 ＣＥＬ Ｉによるミスマッチ部位での切断は、ＤＮＡポリメラーゼの存在によ って顕著に刺激されることが判明した。単一ヌクレオチド挿入を含むＤＮＡルー プでは、ＣＥＬ Ｉ基質優先性は、Ａ≧Ｇ＞Ｔ＞Ｃである。塩基置換ミスマッチ 塩基対については、ＣＥＬ Ｉ基質優先性は、Ｃ/Ｃ≧Ｃ/Ａ〜Ｃ/Ｔ≧Ｇ/Ｇ＞Ａ/ Ｃ〜Ａ/Ａ〜Ｔ/Ｃ＞Ｔ/Ｇ〜Ｇ/Ｔ〜Ｇ/Ａ〜Ａ/Ｇ＞Ｔ/Ｔである。ＣＥＬ Ｉは、 ｐＨ６ないしｐＨ９の広範囲のｐＨ至適を示す。ループ切断と比較して程度は低 いが、ＣＥＬ Ｉは一本鎖ＤＮアーゼでもあり、弱いエキソヌクレアーゼである 。ＣＥＬ Ｉは、他のヌクレアーゼと比較して、新規な生化学的活性を有する。 リョトウ・ヌクレアーゼは一本鎖ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼである３９ｋｄの ヌクレアーゼであり、脱安定化領域およびＤＮＡループでＤＮＡをニックする能 力を有する（１９〜２２）。しかしながら、それは５.０においてｐＨ至適を有 する。リョクトウ・ヌクレアーゼ活性が、ＣＥＬ Ｉの場合におけるＤＮＡポリ メラーゼによって刺激され得るか否かは知られていない。従って、ＣＥＬ Ｉお よびリョクトウ・ヌクレアーゼは相違する酵素であるらしい；しかしながら、こ のことはまだ最終的に確認されていない。 ＣＥＬ Ｉ活性のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ刺激の原因となるメカ ニズムは、現在不明である。一つの可能性は、ＤＮＡポリメラーゼが、ミスマッ チでのＣＥＬ Ｉ切断によって生成する３'-ＯＨ基に高い親和性を有し、単にそ の部位での競合によつてＣＥＬ Ｉを置換するということである。ＣＥＬ Ｉは、 異なるミスマッチでの切断により生成される３'-ＯＨ末端に異なる親和性を有し 、それにより、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼがその活性を刺激できる 程度を 低下させるかも知れない。ＤＮＡ修復において修復エンドヌクレアーゼを置換す るためのＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＵｖｒＡＢＣエンドヌクレアーゼメカニ ズムについても観察された（２５）。ＵｖｒＡＢＣエンドヌクレアーゼは、ＤＮ ＡポリメラーゼＩが存在しないと代謝回転しないことが示されている。ＣＥＬ Ｉ活性を刺激できるｉｎ ｖｉｖｏでの蛋白質因子は、ＤＮＡポリメラーゼに限 られないかもしれない。ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、３'-５'エキソヌ クレアーゼまたはＤＮＡ末端に結合する蛋白質はその機能を遂行する可能性があ る。 ５'-標識基質は、変性ポリアクリルアミドゲルにてＣＥＬ Ｉ切断バンドを示 すのに使用できることに注意することが重要である。最近、推定ヒト全型ミスマ ッチ切断活性（２４）がヒト・トポイソメラーゼＩに関連することが示された。 ３'末端にＤＮＡニックがある共有結合酵素-ＤＮＡ中間体の形成によるミスマッ チニッキングの後、この酵素は５'-標識基質からそれ自体を放出することができ ない（２６）。本共有結合蛋白質-ＤＮＡ複合体は、変性ポリアクリルアミドゲ ルに移動してバンドを形成することができない。ＣＥＬ Ｉミスマッチニッキン グは５'-標識基質に関して示されてきた。従って、ＣＥＬ Ｉは、トポイソメラ ーゼＩ様ヒト全型ミスマッチ修復活性の植物同等体ではない。 ＣＥＬ Ｉは、コンカナバリンＡ−セファロース樹脂へのその強い結合および 過ヨウ素酸シッフ糖蛋白質染料でのＣＥＬ Ｉの染色によって判断して、マンノ ピラノシル糖蛋白質であるらしい。知られている限り、修復酵素は、糖蛋白質で あるとは示されていない。糖蛋白質は、細胞から細胞膜上に分泌されるかあるい は細胞小器官内へ分泌されることがしばしば見出されている。しかしながら、糖 蛋白質は重要な機能のために核に存在することも示されている。アレチネズミ繊 維腫細胞が熱ショック処理に付されると、１００ｋＤａのストレス糖蛋白質のレ ベルが核中で増加することが知られている（２７）。ヒト細胞中のＲＮＡポリメ ラーゼ１１についての転写因子は、N-アセチルグルコサミン残基で修飾されるこ とが見出されている（２８、２９）。最近、鉄-結合性糖蛋白質のラクトフェリ ンが、ヒト細胞の核中のＤＮＡと結合し、配列特異的に転写を活性化することが 見出された（３０）。いくらかのウィルスで感染した細胞の核は、ウイルス糖蛋 白質を 含有することが知られている（３１〜３３）。糖蛋白質が核膜上または核膜孔の みならず核の内側で存在することが知られているこれらの例は、グリコシル化蛋 白質が核中で重要であるかも知れないことを示す傾向にある。ＣＥＬ Ｉは、Ｄ ＮＡ修復に関係できる糖蛋白質の例であるらしい。 セロリー・ミスマッチエンドヌクレアーゼＣＥＬ Ｉの性質は、一本鎖ヌクレ アーゼのそれと類似している。ＣＥＬ Ｉに最も適合する基質は、ＤＮＡループ およびＣ/Ｃミスマッチのごとき塩基置換ミスマッチである。対照的に、４ヌク レオチドを超えるループおよびＣ/Ｃミスマッチは、E.coli ｍｕｔＨＬＳミスマ ッチ修復システムにおける最悪適合の基質である（１、２）。従って、ＣＥＬ Ｉは新規なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素である。 より詳細に本発明を記述するために以下の実施例を提供する。本発明を実施す るのに現在考えられる最良の態様を記載するこれらの実施例は例示的なものであ ることを意図し、本発明を限定するものではない。 実施例 Ｉ ＣＥＬ Ｉの精製 ２つの異なるＣＥＬ Ｉ調製物を下記のごとく作成した。それらの特性は、純 度が低い調製物（Ｍｏｎｏ Ｑ画分）がＣＥＬ Ｉ活性を刺激できる蛋白質因子を 含有できることを除いて同様である。（ｉ）ＣＥＬ Ｉ Ｍｏｎｏ Ｑ画分の調製 ワーリングブレンダー中で、１０μＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭ ＳＦ）を含む０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７.０の緩衝液（緩衝液Ａ）１０ ０ｍｌでセロリー茎１００グラムを４℃にて２分間ホモジナイズした。混合物を 遠心によって清澄化し、上清を−７０℃で貯蔵した。ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ Ｈ Ｒ５/１０カラムでのアニオン交換クロマトグラフィーによって抽出物を分画し た。結合したＣＥＬ Ｉヌクレアーゼ活性を約０.１５Ｍ ＫＣｌにて塩の直線勾 配で溶出させた。（ii）高度に精製されたＣＥＬ Ｉの調製 ４℃のセロリー７ｋｇをジューサーで抽出し、10×緩衝液Ａで調整して、１× 緩衝液Ａの最終濃度とした。抽出物を２５％ないし８５％飽和硫酸アンモニウム 沈殿工程で濃縮した。最終ペレットを２５０ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、緩衝液Ａ 中の０.５Ｍ ＫＣｌに対して透析した。１０ｍｌのコンカナバリンＡ−セファロ ース樹脂（Ｓｉｇｍａ）で４℃にて溶液を一晩インキュベートした。スラリーを 直径２.５ｃｍのカラムに詰め、緩衝液Ａ中の０.５Ｍ ＫＣｌで洗浄した。結合 したＣＥＬ Ｉを６５℃にて緩衝液Ａ中の０.３Ｍα-Ｄマンノース、０.５Ｍ Ｋ Ｃｌの６０ｍｌで溶出させた。ＣＥＬ Ｉは、２５ｍＭ ＫＰＯ₄、１０μＭ ＰＭ ＳＦ、ｐＨ７.４の溶液（緩衝液Ｂ）に対して透析し、緩衝液Ｂ中で平衡化した ホスホセルロースカラムに適用した。結合した酵素を緩衝液Ｂ中のＫＣｌの直線 勾配で溶出させた。このカラムからのＣＥＬ Ｉ活性のピークを、さらに、０.２ Ｍ ＫＣｌ，１ｍＭ ＺｎＣｌ₂，１０μＭ ＰＭＳＦ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ ｐＨ７.８中Superose １２ FPLCカラムにてサイズ分画した。このゲル濾過か らのＣＥＬ Ｉピークの中央を、本研究で精製ＣＥＬ Ｉとして使用した。約３４ ０００ダルトンの蛋白質バンドは、図１に示すごとく、１５％ポリアクリルアミ ドゲルＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で、Superose １２画分の５ｍｇのＣＥＬ Ｉをク ーマシーブルー染色または炭水化物染色（過ヨウ素酸シッフ塩基染色キット、Ｓ ＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（５））で視覚化すると目で視えた。おおよそ３ ６０００ダルトンの第２のバンドもゲル中で見えた。両バンドを糖蛋白質特異的 染料で染色した。２つのバンドで観察された微妙な移動度の相違は、異なるグリ コシル化のためかも知れない。あるいは、それらは、ＣＥＬ Ｉで共精製する調 製物中では汚染物質であるのかも知れない。蛋白質測定 試料の蛋白質濃度は、ビシンコニン酸蛋白質アッセイによって測定した（４、 ｐｉｅｒｃｅ）。 ＣＥＬ Ｉ酵素の精製に続き、実験用および臨床用ＤＮＡ基質の突然変異分析 を適当なゲルシステムで行った。ＣＥＬ Ｉは、種々のミスマッチ、欠失および 挿入においてＤＮＡを認識し、それを切断した。以下の実施例は、より詳細に、 本発明に従い突然変異分析を行った方法を記載する。 実施例 II 種々のミスマッチを含むヘテロデュプレックスの調製 ６４塩基対長のＤＮＡヘテロデュプレックス基質は、ＪｏｎｅｓおよびＹｅｕ ｎｇ（３４）に報告された同様の方法を用いて調製されたミスマッチ塩基対また はＤＮＡループを含むように構築した。ＤＮＡループは、図２に示したごとく異 なるヌクレオチドおよび種々のループサイズで構成される。ＤＮＡデュプレック スは、４つの末端のうち一つで標識し、そのため誤対合ヌクレオチドでのＤＮＡ エンドヌクレアーゼ切断は、変性ＤＮＡ配列決定ゲル上で切形ＤＮＡバンドとし て同定できた。オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡシンセサイザーで合成し、５０℃にて７Ｍ尿素の存在下、変性ＰＡＧＥゲ ルを用いて精製した。精製一本鎖オリゴヌクレオチドは、適当な相手方鎖とハイ ブリダイズさせた。ミスマッチを含むか含まないＤＮＡデュプレックスは、非変 性ＰＡＧＥゲルを用いて精製した。ＤＮＡは、ＡＭＩＣＯＮモデル５７００５電 気溶出機のＣｅｎｔｒｉｃｏｎユニット中、電気溶出法を用いることによってゲ ルスライスから溶出させた。このユニットの上方貯蔵器は改造して、クロス‐汚 染を予防するため防水隔壁を含ませた。 実施例 III ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイ 実施例IIに記載した５０ないし１００ｆｍｏｌの５'[³²Ｐ]‐標識基質を２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中の Ｍｏｎｏ Ｑ ＣＥＬ Ｉ調製物と共に０℃ないし８０℃の温度で３０分間インキ ュべートした。０.５ないし２.５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラ ーゼを ヌクレアーゼアッセイ反応液に加えた。示す場合、１０μＭ ｄＮＴＰを（図２ および5)反応混合液に含ませた。２０μｌの反応は、１.５％ＳＤＳ、４７ｍＭ ＥＤＴＡおよび７５％ホルムアミド＋トラッキング染料の１０μｌを添加して停 止させ、７Ｍ尿素中、５０℃にて変性１５％ＰＡＧＥゲルで分析した。オートラ ジオグラムを用いて放射性バンドを可視化した。化学的ＤＮＡ配列決定ラダーを サイズマーカーとして含ませた。同一レーンでの切断バンドおよびＤＮＡ配列決 定ラダーの共‐電気泳動によって、切断部位を正確に決定した。 実施例 ＩＶ 単一ヌクレオチドＤＮＡループおよびヌクレオチド置換での ＣＥＬ Ｉ切断活性に対する温度の影響 セロリー抽出物のＭｏｎｏ Ｑクロマトグラフィーから溶出したＣＥＬ Ｉ画 分は、単一らせん外グアニン(基質＃２)またはチミジン残基（＃３）を持つＤＮ Ａループを含むＤＮＡヘテロデュプレックスを特異的にニックすることが見出さ れたが、図３に示されたごとき完全に塩基対合したＤＮＡデュプレックス＃１で はそうではなかった。これらの実験において、約６０００Ｃｉ/ミリモルのγ−[³² Ｐ]ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで各々を標識したヘテロデュ プレックス＃２レーン３〜９）、＃３(レーン１０〜１６）、完全に塩基対合し たデュプレックス＃１(レーン１７〜２３）および一本鎖ＤＮＡ基質（レーン２ ４〜３０）の５０ｆｍｏｌを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４，２５ｍ Ｍ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂中のＣＥＬ Ｉ調製物のＭｏｎｏ Ｑ画分０.５μ ｌ(１０μｇ)と共に種々の温度にて３０分間インキュベートした。各２０μｌの 反応物をキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルーを含有する１.５％ ＳＤＳ、４７ｍＭ ＥＤＴＡおよび７５％ホルムアミドの１０μｌの添加によっ て終了させた。試料１０μｌを、約５０℃にて１５％ポリアクリルアミドゲル、 ７Ｍ尿素変性ＤＮＡ配列決定ゲルに負荷し、従前に報告されている（７）ごとく 電気泳動分離およびオートラジオグラフィーに付した。Ｇ＋ＡおよびＴの化学的 配列決定反応を記載された（７）ごとくに行い、サイズマーカーとして使用した 。ＣＥＬ Ｉ切断は、約35ヌクレオチド長のバンドを生じた。線は、切断バンドの位置から 参照配列決定ラダー中のエンドヌクレアーゼによってニックされたホスホジエス テラーゼ結合(ＩおよびII)まで引いた。５'−標識基質については、ヌクレアー ゼがヌクレオチドの５'側をニックし、３'-ＯＨ末端を生成する場合、切形バン ドは、化学的ＤＮＡ配列決定反応生成物レーン中のそのヌクレオチドのバンドよ り半ヌクレオチドの間隔だけゆっくりと泳動する（３４）。 基質＃２は、挿入されたＧがＣＧＣＧ配列内にあるので、２つの立体配座にて 塩基対合できる。従って、このデュプレックスが： 5'-ＣＧＧＣＧ-3’または 5'-ＣＧＧＣＧ-3’ 3'-Ｇ−ＣＧＣ-5’ 5'-ＧＣ−ＧＣ-5’ とハイブリダイズする場合、第２または第３のヌクレオチド位置いずれかにおけ るＧ残基は不対合となり得、おそらく立体配座はらせん外となる。 従って、２つのミスマッチ切断バンドが観察され、各々は不対ヌクレオチドの 直ぐ３'側のホスホジエステル結合に関連付けられる。図３、レーン３〜９参照 。このズレは、ＧまたはＣがミスマッチ頂部鎖にある場合にのみ標的配列中に生 じ得る。従って、基質＃３中の非対Ｔ残基は、基質＃２から誘導された上方バン ドと同一の相対的位置で１つの切断バンドを与えた。図３、レーン１０〜１６参 照。これらのゲル移動度は、デオキシリボース部位上の３'-ＯＨ基の生成と一致 する（６）。ＣＥＬ Ｉは、バンド強度の増大によって示されるごとく温度が４ ５℃に至るまで活性が増加する。図３参照。しかしながら、６５℃ないし８０℃ では、ＤＮＡデュプレックスの変性のために特異性が減少する。 実施例 Ｖ ＣＥＬ Ｉの相対的切断優先性 各ＤＮＡデュプレックスでの単一エンドヌクレアーゼ切断があるか否かを確認 するために、図３に記載された実験を、頂部鎖の３'末端で標識されたＤＮＡに て繰り返した。もし、ただ一つの切断部位があったなら、５'または３'末端で標 識された基質によって明らかにされた最初の切断位置は同一のホスホジエステル 結合 であるはずである。これらの実験では、基質を、約６０００Ｃｉ/ミリモルまで 、[³²Ｐ]α-ｄＣＴＰ、冷ｄＧＰＴおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラ グメントで３'末端にて標識した。試料調製、変性ゲル分解およびオートラジオ グラム分析は，単一温度の３７℃にて３０分間、１０μｇのＣＥＬ Ｉ Ｍｏｎｏ Ｑ画分で５０ｆｍｏｌｅの基質をインキュベートした以外は、図３に記載した のと同一である。基質＃４および＃５についてのＤＮＡ配列決定ラダーをレーン １〜４に示し、使用したＤＮＡ配列を図示した。レーン５〜８は、インキュベー ションの間酵素はなかった。レーン９〜１２は、各々、基質＃２、＃４、＃５、 ＃３のミスマッチエンドヌクレアーゼ切断である。線は、切断バンドの位置から 参照配列決定ラダー中のエンドヌクレアーゼによってニックされたホスホジエス テル結合（Ｉ）に至るまで描いた。レーン１３および１４は、正確に切断位置を 決定するための化学的ＤＮＡ配列決定ラダーと共にＣＥＬ Ｉ切断バンドの共電 気泳動を示す。基質＃２、＃３、＃４および＃５についての相対的切断優先性は 、３'標識基質につき図４に示す。図４のレーン９〜１２における切断バンドの 移動度は、切断反応が不対合ヌクレオチドの直ぐ３'側のホスホジエステル結合 で生じたことを示す。従って、切断部位は、５'または３'末端いずれかにて標識 した基質と同一である。ＤＮＡ切断が同一の結合位置で生じることが見出される という事実は、基質ＤＮＡが５'末端または３'末端で標識されたかどうかに拘ら ず、ＣＥＬ ＩがＤＮＡグリコシラーゼでないことを示す。ＤＮＡグリコシラー ゼメカニズムは、２つのＤＮＡ基質中のＤＮＡ切断位置を１塩基離れさせるであ ろう。というのは、塩基はＤＮＡグリコシラーゼによって切除されるためである 。 切断部位の正確な決定は、基質＃２の標識頂部鎖のＴ残基の化学的配列決定反 応物(レーン１３)とレーン９のＣＥＬ Ｉ切断生成物とを混合し、同一レーンで 分析されたレーン１４における例のごとくに行った。３'-標識基質については、 ヌクレアーゼがヌクレオチドの３'側をニックし、５'ＰＯ₄末端を生成する場合 、切形バンドは、化学的ＤＮＡ配列決定反応生成物レーンにおけるそのヌクレオ チドのバンドと共に泳動する（７）。さらに、化学的ＤＮＡ配列決定のサイズ標 準に対するゲル移動度は、ＤＮＡニックが５’-リン酸化末端を生じたことを示 す （６）。単一ヌクレオチド挿入を持つＤＮＡループについて、ヌクレアーゼ特異 性は、Ａ≧Ｇ＞Ｔ＞Ｃである。図４Ａにおいて、５'ないし３'エキソヌクレアー ゼ活性の少量がこのＣＥＬ Ｉ調製物中に存在することが分かる。 ＣＥＬ Ｉが頂部鎖中の一つのヌクレオチドのＤＮＡループから横切って底部 の鎖中で切断できるか否か、またはループを含む鎖のニッキングがニックから横 切る第２のＣＥＬ Ｉ切断に導くこともできるか否かを試験するために、基質＃ ２中の不対合ヌクレオチドを含まない底部鎖を３'末端にて標識し、ＣＥＬ Ｉの 存在下でインキュベートした。図４のレーン９に見られる、頂部鎖におけるらせ ん外ヌクレオチド、または基質＃２の頂部鎖中にＣＥＬ Ｉによって作られたＤ ＮＡニックは、底部鎖の有意なニッキングに至らなかった(レーン１８)。ＤＮＡ 配列効果が、底部鎖ではなく上部鎖におけるＣＥＬ Ｉ切断に有利であるかも知 れない可能性に対する対照として、ＣＥＬ Ｉをレーン１５および１６のＣ/Ｃミ スマッチ基質中の底部鎖の切断について試験した。ＣＥＬ Ｉがレーン１６中に 存在した場合、ミスマッチ切断がなされた。 修復エンドヌクレアーゼの切断部位の特徴付けにおいては、１つまたは２つの 切断が各障害のためになされたか否かを判断することは重要である。これは、Ｄ ＮＡデュプレックスの４つの末端で、標識されている障害含有基質を用いること によって通常は達成される。この試験は、底部鎖では切断がほとんど不在のため ３つの標識基質を用いることによって基質＃２の分析中で満足される。図３、レ ーン４〜７および図４、レーン９の各々において、５'標識および３'標識基質の 両者の本基質の切断を比較した。切断部位は、両ケースにおいて誤対合ヌクレオ チドの３'側であることが見出された。基質＃２について底部鎖上の切断の欠如 は、図４のレーン１８で示された。有意な底部鎖切断が生じなかったので、この 場合、５'標識基質のみ必要であった。 実施例 ＶＩ ＤＮＡループ誤対合における切断に対する ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの効果 ＣＥＬ Ｉ活性はＤＮＡポリメラーゼの存在によって刺激される。図５では、 単一ヌクレオチドループ基質におけるＣＥＬ Ｉ切断は、いずれのヌクレオチド がループ中に存在するかに依存してＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによ って種々の程度刺激された。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ刺激を説明 するためには、ＣＥＬ Ｉの異なる量を用いることが必要であった。らせん外Ｃ およびらせん外Ｔ基質での切断の刺激は、図５ＡおよびＢに最良に示され（それ ぞれのパネルにおいて、レーン９とレーン４とを、レーン１０とレーン５とを比 較せよ）、そこでは、より高いＣＥＬ Ｉレベルがそれらの誤対合での良好な切 断を示すために必要である。ＣＥＬ Ｉについて最も良好な基質に属するらせん 外Ｇおよびらせん外Ａ基質については、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 刺激は、図５のごとくＣＥＬ Ｉの大変低いレベルを用いて、最良に示すことが できる。図５中のＣＥＬ ＩのＡｍｐｌｉＴａｑ刺激の量を定量し、表Ｉに示し た。 オートラジオグラムは、ＡＭＢＩＳデンシトメーターで２次元的に定量し、各バ ンドにおけるシグナルの量はカウントとして与えた。 実施例 ＶＩＩ ＣＥＬ Ｉ活性の至適ｐＨ らせん外Ｇ基質についてのＣＥＬ ＩのｐＨ至適は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼの不存在または存在下で調べた。ＣＥＬ Ｉ（９.５ｎｇ）を、ｐＨ ５〜６.５（イミダゾール）およびｐＨ７〜９.５（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）の緩衝液 の２０μｌ反応液中の基質１００ｆｍｏｌと共に３７℃で３０分間インキュベー トした。使用する場合、０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラー ゼを、各々、頂部（−ポリメラーゼ）または底部パネル（＋ポリメラーゼ）に存 在させた。図６に示すごとく、ＣＥＬ ＩはｐＨ５.０ないし９.５で活性である ことが判明し、約ｐＨ７.５を中心として広域ｐＨ至適を示した（頂部パネル） 。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが存在する場合、切断は、全ｐＨ範囲 にわたって刺激された(底部パネル)。該アッセイ法は、初期の反応速度を用いず 、従って、ＣＥＬ ＩのこのｐＨプロフィールの定量的結論を除外した。しかし ながら、酵素が中性ｐＨ範囲で大変良く働くことは明らかである。 実施例 VIII 塩基対置換におけるＣＥＬ Ｉによる切断 また、ミスマッチ基質の他の組合せは、ＣＥＬ Ｉにより認識され、各ＤＮＡ デュプレックスの２つのＤＮＡ鎖の一つ上で切断される。これらの基質のいくら かは、ＤＮＡループを含むものと比較して、ほとんど有効に切断されない；従っ て、３７℃の代わりに４５℃をインキュベーションで用いた。頂部鎖の５'末端 が標識された基質を本研究で用いた。図７のオートラジオグラムは、Ｃ残基を含 むミスマッチが、Ｃ/ＡおよびＣ/Ｔよりもしばしば良好なＣ/Ｃにてのミスマッ チ基質で あることを示す。これらのミスマッチにおける切断は、２つの代替切断位置を生 じる傾向にあり、一つはミスマッチＣ残基の３'側のホスホジエステル結合にお けるものであり、一つは３'方向にさらに１ヌクレオチド取り除かれたホスホジ エステル結合におけるものである。代替切断部位が、もう一つのＤＮＡ配列内と いう関係においてこれらのミスマッチにつき観察されるであろうか否かは、調べ られていない。この現象の一つの可能な説明は、他の塩基−置換についてよりも Ｃ残基を含むミスマッチの隣のより大きな塩基対の脱安定化であろう。あるいは 、特異的ミスマッチヌクレオチドは、３'側へ１位置だけシフトするのかも知れ ない。というのは、次のヌクレオチドもまた、Ｃ残基であって、２つの残基は、 反対のＤＮＡ鎖中のＧ残基との対合においてそれらの役割を交換できるからであ る。塩基置換ミスマッチ塩基対については、頂部鎖に関してＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＣＥＬ Ｉ特異性は、Ｃ／Ｃ≧Ｃ／Ａ〜Ｃ／Ｔ ≧Ｇ／Ｇ＞Ａ／Ｃ〜Ａ／Ａ〜Ｔ／Ｃ＞Ｔ／Ｇ／〜Ｇ／Ｔ〜Ｇ／Ａ〜Ａ／Ｇ＞Ｔ／ Ｔである(図７Ａ)。真正細菌ＤＮＡポリメラーゼは、通常でないＤＮＡ構造にて 切断することが知られている（８）ので、試験は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポ リメラーゼそれ自体が図７で用いられた１３基質にて切断するかどうかを決定す るために行った。オートラジオグラムの延長された曝露下で、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによるミスマッチ切断は観察されなかった(図７Ｂ)。 実施例 ＩＸ ＣＥＬ Ｉを用いたＤＮＡ突然変異の検出および多重分析 ミスマッチ検出のためのＣＥＬ Ｉの感度を、プールされたＤＮＡ試料の突然 変異を検出するその能力によって示す。ＤＮＡは、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎ ｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒで遺伝子スクリーニングを受けた個人の末梢血リンパ球か ら得た。試料は、肺癌のみ、卵巣癌のみ、肺/卵巣癌症候群の家系から、または 非肺/卵巣癌対照試料から得た。ＢＲＣＡ１のエクソン２につき特異的な非標識 プライマーを用いて、当該遺伝子のこの領域をＰＣＲした。エクソン２の野生型 ＰＣＲ産物を、ガンマ³²Ｐ−ＡＴＰで標識した。略言すると、１０ピコモルのＰ ＣＲ産物を、 Ｗｉｚａｒｄ手順によって精製した（Ｐｒｏｍｅｇａ）。次いでエクソン２の野 生型ＰＣＲ産物を、３０μｌ １×キナーゼ緩衝液（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ7.6)，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５ｍＭジチオトレイトール)中のＴ４キナーゼ および６０００Ｃｉ/ミリモルの１５ピコモルのガンマ³²Ｐ−ＡＴＰを用い、３ ７℃で１時間リン酸化した。反応は、１μｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡで停止させた。 反応容量は、１×ＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ，ｐＨ７.５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で５０μｌとし、Pharmacia Probe Quan tカラムを通して処理した。次いで、標識化ＤＮＡ(100μｌ中１ｐｍｏｌ/μｌ) を、個々の非標識ＰＣＲ増幅実験試料とのハイブリダイゼーションで使用した。 各個人の試料について、１００ｆｍｏｌの非標識ＰＣＲ増幅産物を、ＣＥＬ Ｉ 反応緩衝液(２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ，ｐＨ７．５)中の２００ｆｍｏｌの³²Ｐ−標識野生型ＰＣＲ産物と共にイン キュベートした。変性および再生に続き、ヘテロデュプレックス放射性同位体標 識ＰＣＲ産物を、１×ＣＥＬ反応緩衝液中でＣＥＬ Ｉに３７℃にて３０分間曝 露し、１０μｌ停止混合液(７５％ホルムアミド、４７ｍＭ ＥＤＴＡ、１.５％ ＳＤＳ，キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー)の添加により停止 させた。ヘテロデュプレックスは、個々に酵素で処理するか(レーン４〜１３)、 あるいは１つの試験管にプールし(レーン１４)、処理した。反応生成物を、７Ｍ 尿素を含有する１５％アクリルアミドゲルに負荷し、結果を図８に示す。分析し た１０試料のうち、２つはＡＧ欠失を含み(レーン４および７)、２つは１１塩基 対ループを含み(レーン８および９)、他の６つは野生型であった（レーン５，６ ，１０，１１，１２および１３）。ＡＧ欠失におけるＣＥＬ Ｉによる切断の結 果、２つのバンドが形成され、一方は頂部鎖からおおよそ１５１ヌクレオチドで あり、他方は底部鎖から１１２ヌクレオチドにおけるものであった(レーン４お よび７)。１１塩基対ループにおけるＣＥＬ Ｉによる切断の結果、頂部鎖から１ ４７ヌクレオチドにおける１つのバンド、および底部鎖中の１０９ヌクレオチド における一群のバンドが形成された(レーン８および９)。レーン１、２および３ は、陰性対照としてＣＥＬ Ｉに曝露されなったＤＮＡを含有し、レーン１５は 、６４および３４塩基対のヌ クレオチドマーカーを含有する。当該ゲルのレーン１４に見られるごとく、試料 をプールし、同時にＣＥＬ Ｉに曝露した場合、酵素は、特異性を喪失すること なく全ての前記リストの突然変異において切断した。また、野生型試料のＰＣＲ 産物は、非特異的ＤＮＡニッキングを示さなかった。 プールされたＤＮＡ試料において突然変異を検出するＣＥＬ Ｉの能力をさら に説明するために、１、２、３、５、１０または２０のヘテロデュプレックスの 標識ＰＣＲ産物（ＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン２から再度増幅したもの）を単一 の反応管中にてＣＥＬ Ｉに曝露し、生成物を７Ｍ尿素を含有する６％ポリアク リルアミドゲルで泳動させた。試料を増幅し、前記のごとく放射性同位体標識し た。各プールは、突然変異（ＡＧ欠失）を有する１つの試料のみを含有するもの であった。各プールの他の試料は野生型であった。レーン１および２は、ＣＥＬ Ｉに曝露されていない対照試料を含有するものであった。突然変異が存在した プール試料において、ＣＥＬ Ｉは、過剰の野生型、非突然変異のＤＮＡの存在 下で、酵素の感度を示すＰＣＲ産物を矛盾なく切断した（レーン４、５、６、７ 、８、９および１１）。対照として、突然変異を含まないヘテロデュプレックス 化ＰＣＲ産物を分析し、出現した突然変異に対応するバンドを切断するものはな かった（図９、レーン３および１０）。 実施例 Ｘ ハイリスク家系から得られた試料における ＣＥＬ Ｉによる突然変異および多型の検出 ＢＲＣＡ１遺伝子におけるエクソンにつき特異的なＰＣＲプライマーセットは 、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒで合成された。ＢＲＣＡ１ の遺伝子配列は知られている。エクソンの境界および対応する塩基番号を表IIに 示す。所望の配列を増幅するためのプライマーは、Current Protocols in Molec ular Bioloqv ，Ausubelら編，John WileyおよびSons，Inc．(1995)に記載されて いる方法に従い当業者によって容易に設計され得る。これらのプライマーは、各 ＰＣＲ反応において、一方のプライマーは、蛍光標識である6-ＦＡＭで ５'末端にて標識されるが、他方のプライマーは、もう一つの色標識であるＴＥ Ｔで同様に標識されるように計画した。従って、ＰＣＲ産物は、いずれの鎖にお けるＤＮＡニッキング事象も独立して観察でき、測定物を確証されるように２つ の色で標識した。結果の概要を表IIIに示す。 図１０は、ＢＲＣＡ１遺伝子に存在するエクソンの模式図を示す。ハイリスク 家系の個人からの末梢血試料を集め、ＤＮＡを単離した。ＰＣＲ産物をElongase (BRL)を用いて増幅し、Wizard PCR Preps(Promega)を用いて精製した。ＤＮＡを ９４℃に加熱し、１×ＣＥＬ Ｉ緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４ ，２５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂)中でゆっくり冷却して、ヘテロデュプ レックスを形成させた。該ヘテロデュプレックスを０．２μｌのＣＥＬ Ｉおよ び０.５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑと共に、２０μｌ １×ＣＥＬ Ｉ緩衝液中 で４５℃にて３０分間インキュベートした。反応を１ｍＭフェナンスロリンで停 止させ、４５℃にてさらに１０分間インキュベートした。試料をCentricepカラ ム(Princeton Separations)を通して処理し、乾燥した。１μｌのＡＢＩ負荷緩 衝液(２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０，５０mg/mlブルーデキストラン)、４μｌ の脱イオン化ホルムアミドおよび０.５μｌのＴＡＭＲＡ内部レーン標準を乾燥 したＤＮＡペレットに添加した。試料を９０℃にて２分間加熱し、次いで負荷に 先立って氷で急冷した。次いで、試料を３４ｃｍの読み取り易い４.２５％変性 アクリルアミドゲルに負荷し、GENESCAN 672ソフトウェアを用いてＡＢＩ ３７ ３シーケンサーで分析した。本実験試料における6-ＦＡＭ標識プライマーは、Ｂ ＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド３１７７（１１Ｄ領域）におけるものであり、 ＴＥＴ標識プライマーは、エクソン１１およびエクソン１２間のイントロン中の ７３ヌク レオチドであった。各スパイクは、突然変異または多型が存在するＣＥＬ Ｉに よるヘテロデュプレックスの切断によって生じるＤＮＡバンドの存在を示す。一 方のスパイクは、ミスマッチ部位の３'側から頂部鎖の５'側の６−ＦＡＭ標識へ 至るＣＥＬ Ｉで生じたフラグメントのサイズを示す。他方のスパイクは、ミス マッチの３'側から５'側のＴＥＴ標識に至る底部鎖中の対応するフラグメントを 示す。２つのフラグメントの総和は、ＰＣＲ産物の長さよりも一塩基長いものに 等しい。6-ＦＡＭパネルは、6-ＦＡＭ標識からの塩基＃６４５におけるスパイク を示し、ＴＥＴパネルは、ＴＥＴ標識からの塩基＃４８３におけるスパイクを示 し、両者は、ＢＲＣＡ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド３８１９における５塩基欠失 の部位に対応する（図１１）。 もう一つの個人におけるエクソン１１の分析は、ＢＲＣＡ１ ｃＤＮＡのヌク レオチド１４５４における6-ＦＡＭ標識プライマーを用いて行った（図１２）。 ＴＥＴ標識プライマーは、ヌクレオチド２４５９（いいＣ領域）におけるもので あった。ＰＣＲ増幅産物を前記のごとく増幅し、調製した。この個体では、6-Ｆ ＡＭパネルは、塩基＃７００におけるスパイクを示し、ＴＥＴパネルは、＃３０ ５でのスパイクを示し、各スパイクは、ＢＲＣＡ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド２ １５４でのＡ＞Ｔのナンセンス突然変異における各ＤＮＡ鎖中のＣＥＬ Ｉ切断 部位に対応する。また、ＢＲＣＡ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド２２０１での多型 Ｃ＞Ｔの部位に対応して、6-ＦＡＭパネルは、塩基＃７４７におけるスパイクを 示し、ＴＥＴパネルは、＃２５８でのスパイクを示す。ナンセンス突然変異およ び多型は、ＡＢＩ ３７７シーケンサーを用いてこの特別の試料（ＫＯ−１１） の配列決定によって確認された。また、星印を付したスパイクは、酵素のない対 照レーン中に存在し、ＰＣＲ産物のバックグラウンドを表す。 ある個人は、図１０の模式図中のエクソン１１、領域１１Ａのもう一つの領域 に突然変異を有する。ＢＲＣＡ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド２２４８における6 ＦＡＭ標識プライマーおよびヌクレオチド３２９０におけるＴＥＴ標識プライマ ーを用いてエクソン１１の本領域を増幅した。増幅に続き、試料を前記のごとく 処理した。４つの6-ＦＡＭパネルは、４つの異なる個人の試料でのＣＥＬ Ｉ反 応を示す。図１３Ａ中の第１のパネル、試料＃ＫＯ−２は、ヌクレオチド２４３ ０における多型Ｔ＞Ｃの部位に対応する＃１８２における１つのスパイクを示し 、第２のスパィクは、ヌクレオチド２７３１におけるもう一つの多型Ｃ＞Ｔの部 位に対応するヌクレオチド＃４８３における１つのスパイクを示す。第２のパネ ル、図１３Ｂの試料＃ＫＯ−３は、第２の多型のみを示す。第３のパネル、図１ ３Ｃの試料ＫＯ−７は、多型を示さない。第４のパネル、図１３Ｄの試料＃ＫＯ −１１は、２つの多型に対応する２つのスパイクを示す。本試料、ＫＯ−１１が 前記のごとくヌクレオチド１４５４〜２４５９に対応するエクソン１１Ｃの領域 においてナンセンス突然変異および多型につき陽性を示すことに注目することは 興味深い。 表ＩＶは、本発明のＣＥＬ Ｉによって検出された突然変異を囲む５'および３ 'フランキング配列を記載する。網羅的ではないが、これらの突然変異および多 型を囲む種々のフランキング配列から、ミスマッチＤＮＡヘテロデュプレックス のＣＥＬ Ｉ感受性および認識がフランキング配列によって悪影響を受けないで あろうことが分かる。 上記の例から分かるように、ＣＥＬ Ｉの利用は、臨床的状況における突然変 異の分析の間に他のミスマッチ修復システムを使用する方法よりも明確な利点を 有する。これらの利点を表Ｖにまとめる。 実施例 ＸＩ 上記のごとく、多くの植物種は、有効なエンドヌクレアーゼ酵素を合成する。 本発明に従って、新規なエンドヌクレアーゼ、ＡＲＡ ＩをArabidopsis thalian a から単離した。このエンドヌクレアーゼは、多くの点でＣＥＬ Ｉとかなり類似 する。Arabidopsis thalianaは、植物分子生物学および生化学での研究について モデル系を提供すると考えられる。Arabidopsis系の利点は、約２６日間の短期 のライフサイクル、植物の小さなサイズ、ゲノムの二倍体性質、およびとりわけ 、最も高等な植物および動物と比較して小さいサイズのゲノムを含む。７×１０⁷ 塩基対におけるArabidopsisゲノムは、E.coli（４×１０⁶塩基対）のそれより 約１０倍だけ大きいに過ぎず、ミスマッチエンドヌクレアーゼの遺伝子クローニ ングおよび遺伝子操作を、共に約２×１０⁹塩基対を含む高等植物およびヒトに おけるよりも実質的に容易にする。従って、Arabidopsisにおけるミスマッチエ ンドヌクレアーゼＡＲＡ Ｉの発見および突然変異検出を行うためにＡＲＡ Ｉを 使用する能力は、突然変異検出においてこれらのミスマッチエンドヌクレアーゼ の適用に導く重要なステップである。 高度に精製されたＡＲＡ Ｉの調製 ＡＲＡ Ｉの精製手順は、ＣＥＬ Ｉについて開示したものと非常に類似する。 これは、２つの酵素が実質的に同様であることをデータが示すので予期されない というのではない。 Arabidopsis thalianaの生態型Columbiaのカルス２５０ｇを最小塩寒天上で増 殖させ、凍結保存した。該カルスを、ワーリングブレンダー中、緩衝液Ａ(１０ μＭフッ化フェニルメタンスルホニル(ＰＭＳＦ)を有する０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ，ｐＨ８.０)に再懸濁した。懸濁細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌを２回通して粉砕して、粗溶解物を得た。粗溶解物を遠心により清澄 化し、上清を、４℃にて、固体硫酸アンモニウムで硫酸アンモニウム中２５％飽 和に調整した。２時間後、溶液を遠心し、上清を硫酸アンモニウム中８５％飽和 に調整した。溶液を再度遠心し、ペレットを０.５Ｍ ＮａＣｌを含有する１６ ０ｍ ｌの緩衝液Ａに溶解した。５ｍｌのＣｏｎＡ樹脂をこの溶液に添加し、混合物を ４°にて３時間一晩揺動させた。スラリーを直径２.５ｃｍのカラムに充填し、 緩衝液Ａ中の０.５Ｍ ＫＣｌで洗浄した。結合したＡＲＡ Ｉを、４℃にて、緩 衝液Ａ中の０.５Ｍ α−メチルマンノシド、０.５Ｍ ＮａＣｌの約６０ｍｌで溶 出させた。溶出したＡＲＡ Ｉを緩衝液Ｂ(２５ｍＭ ＫＰＯ₄，１０ｍＭ ＰＭＳ Ｆ，ｐＨ７.４)の溶液に対して透析し、緩衝液Ｂで平衡化したホスホセルロース カラムに適用した。結合した酵素を、緩衝液Ｂ中のＫＣｌ勾配で溶出させた。Ｐ −１１からの溶出ピークを、緩衝液Ａに対して透析し、Ｍｏｎｏ Ｑアニオン交 換体のカラムを通過させて濃縮した。Ｍｏｎｏ Ｑ段階から溶出したＡＲＡ Ｉ は数千倍精製されたが、調製物はまだ均一ではなかった。 種々の精製工程の蛋白質組成物を、４％ないし２０％ポリアクリルアミド勾配 ＳＤＳゲル電気泳動によって分析した。図１４に示されるゲルにおいて、レーン は、以下の通りである。１．抽出調製、２．硫酸アンモニウム沈殿、３．Ｃｏｎ −Ａセファロースアフィニティーカラムクロマトグラフィー、４．ホスホセルロ ースＰ−１１クロマトグラフィー；および５．ＤＥＡＥセファセルアニオン交換 カラムでの最終精製はＡＲＡ Ｉの１０,０００倍を超える精製を生じる。ゲル中 の蛋白質は、クーマシーブルーＲ−２５０で染色して視覚化した。 ＰＣＲ産物を、ＡｍｐｌｉＴａｑ(Perkin-Elmer)を用いて増幅し、Wizard PCR Preps(Promega)を用いて精製した。該ＤＮＡを、９４℃に加熱し、１×ＡＲＡ Ｉ緩衝液(20ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ7.4，25ｍＭ ＫＣｌ，10ｍＭ ＭｇＣ ｌ₂)中でゆっくり冷却して、ヘテロデュプレックスを形成させた。ヘテロデュプ レックスは、０.２μｌＡＲＡ Ｉ（０.０１μｇ）および０.５ユニットのＡｍｐ ｌｉｔａｑ(Perkin-Elmer)を含有する２０μｌの１×ＡＲＡ Ｉ緩衝液中、４５ ℃にて３０分間インキュベートした。反応を１ｍＭフェナンスロリンで停止させ 、４５℃にてさらに１０分間インキュベートした。試料を、Centricepカラム(Pr inceton Separations)を通して処理し、乾燥した。１μlのＡＢＩ負荷緩衝液(２ ５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０，５０mg/mlブルーデキストラン)、４μｌの脱イオ ン化ホルムアミドおよび０.５μｌのＴＡＭＲＡ内部レーン標準を乾燥したＤ ＮＡペレットに添加した。試料を９０℃で２分間加熱し、次いで、負荷に先立っ て氷で急冷した。次いで、試料を３４ｃｍの読み取り易い４．２５％変性アクリ ルアミドゲルに負荷し、GENESCAN 672ソフトウェアを用いてＡＢＩ ３７３シー ケンサーで分析した。電気泳動物の縦軸は相対的蛍光単位である。電気泳動図の 横軸はヌクレオチド単位でのＤＮＡ長である。 精製を通じて、ＡＲＡ Ｉによって触媒されたミスマッチエンドヌクレアーゼ 活性の存在は容易に観察できた。図１５は、ＡＲＡＩ −切断ミスマッチ基質の 変性ＤＮＡ配列決定ゲル分析のオートラジオグラムを示す。ゲル中のレーンは、 図１４に示した精製ＡＲＡ Ｉの種々の段階を含むレーンに対応する。図１５に おいて、パネルＡ、Ｂ、Ｃは、各々、らせん外Ｇヌクレオチドを有する基質＃２ 、らせん外Ａヌクレオチドを有する基質＃４、ミスマッチのない対照基質の基質 ＃１８のＡＲＡ Ｉ切断を示す。Ｆは、全長基質をいい、一方、Ｉは、３５ヌク レオチド長フラグメントを生成したＡＲＡ Ｉ切断基質をいう。 ジーンスキャン（GeneScan）標的の調製 ジーンスキャン標的は、ＣＥＬ Ｉ研究において記載したごとくに調製した。 肺/卵巣癌の危険性が高い個人からの末梢血を集め、単離したＤＮＡは、ＰＣ Ｒ鋳型として用いた。ＢＲＣＡ１遺伝子中のエクソンにつき特異的なＰＣＲプラ イマーを、順方向プライマーの５'末端に6-ＦＡＭ染料を、および逆方向プライ マーの５'末端にＴＥＴ染料を持たせて合成した。エクソンについてのＰＣＲ産 物をハイブリダイズさせてヘテロデュプレックスを形成させ、ＡＲＡ Ｉと反応 させた。ＡＢＩ ３７３自動ＤＮＡシーケンサーによって産物を分解し、GENESC AN 672ソフトウェアで解析した。 ＡＲＡ Ｉミスマッチ検出の模式的ダイアグラムを図１６に示す。野生型ＢＲ ＣＡ１対立遺伝子および突然変異体ＢＲＣＡ１対立遺伝子（本例中ではＡＧ欠失 を有する）のＰＣＲ産物を混合した。加熱による変性、再アニーリングの後、ヘ テロデュプレックスが形成され、そのうちいくつかでは、過剰のＡＧ塩基が頂部 鎖中でループを形成した。他のものにおいては、過剰のＣＴ塩基が底部鎖中にル ー プを形成した。ループ鎖は、ＤＮＡフラグメントを生成させるのに用いる各プラ イマーの５'末端に色素マーカーを持たせることによって色標識した。ＡＲＡ Ｉ は、ＣＥＬ Ｉによるミスマッチ切断と同様に、ミスマッチの３'側でループを切 断する。その結果、切形青色（6-ＦＡＭ）バンドおよび切形緑色（ＴＥＴ）バン ドが生じる。これらの２つのバンドの長さは、独立してフラグメント中の突然変 異の位置を正確に指摘する。 ミスマッチを含むヘテロデュプレックスのＡＲＡ Ｉ切断に基づくジーンスキ ャン分析から得られたデータの実例を図１７に示す。ＡＲＡ Ｉ処理したＤＮＡ フラグメントの分解は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒの自動ＤＮＡシーケンサー モデル３７３にて変性ポリアクリルアミドゲル中で行う。変性ポリアクリルアミ ドゲルにおいて、最速の泳動蛍光シグナルは、残存するＰＣＲプライマーである 。２つのＡＲＡ Ｉフラグメント、一つは青色（6-ＦＡＭ）および一つは緑色（ ＴＥＴ）、がそれらの各サイズ位置にて続く。最もゆっくりと移動するバンドは 、非切断全長ＰＣＲ産物である。これらのバンドを、ジーンスキャンソフトウェ アによって、図１７の底部のフルオログラム中のピークとして表す。同一レーン 内の赤色の分子量標準（ＴＡＭＲＡ）泳動を用いて、ジーンスキャンソフトウェ アは青色バンドおよび緑色バンドのサイズを同定する。ＰＣＲ産物の２つの着色 端部からのＡＲＡ Ｉで生じたフラグメントの長さは、突然変異の位置を独立し て正確に指摘する。 図１８〜２１は、これまでの実施例に記載した同−ＢＲＣＡ１遺伝子ＰＣＲ産 物を用い、ＡＲＡ Ｉ対ＣＥＬ Ｉのジーンスキャン突然変異検出の同時比較を供 する。データから分かるように、ＣＥＬ ＩおよびＡＲＡ Ｉは、試験した基質に 対して同一の酵素活性を有するらしい。従って、ＣＥＬ ＩのようにＡＲＡ Ｉは 、ＤＮＡにおける突然変異の同定を促進するのに使用できる重要な新しいエンド ヌクレアーゼである。それ自体、当該酵素は、遺伝的スクリーニングアッセイに おいて利用される試薬の蓄積に貴重な付加を提供する。 実施例 ＸＩＩArabidopsis中のミスマッチエンドヌクレアーゼは、事実ほとんどの植物にお いて、セロリーのＣＥＬ Ｉにつき主張したのと実質的に同様であるという主張 の支持において、Arabidopsis以外に１０種の植物の抽出物によるミスマッチ検 出についてのデータを示す。示された植物抽出物は、すなわち、アルファルファ 、リョクトウ、キャベツ、カリフラワー、チャハ(chi−hi)、レタス、パヤリ、 白菜、トマトおよびブロッコリーの抽出物は、ワーリングブレンダーにて１部の 植物を１部の緩衝液Ａと共にホモジナイズすることによって作成した。図２２に 示すごとく、粗ホモジネートの１μｌを頂部鎖５’³²Ｐ標識基質＃４（らせん外 Ａ基質）でアッせイした。レーンＧ＋ＡおよびＴは、頂部鎖中の正確な切断部位 を決定するのに用いたマキサムギルバート（MaxamGilbert）ＤＮＡ配列決定ラダ ーである。ミスマッチエンドヌクレアーゼ切断は、レーン１ないし１１で見える ３５ヌクレオチド長のフラグメントを生成した。活性は、これらの植物の根、苗 条、茎、葉、花、および果実に見られ、これは遍在する性質を示す。レーン１〜 １１に対応するレーン１２〜２２は、ミスマッチでない基質＃１を用いて陰性対 照を示す。チャハ(chi−hi)は、セロリーの茎に似たベトナムの植物であり、ヌ クレアーゼが豊富である。 ＡＲＡ ＩおよびＣＥＬ Ｉと同様のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性の遍在 する性質をさらに示すために、一群の１１植物の抽出物（図２２からの全ての植 物＋アスパラガスを含む）を酵素活性につき分析した。図２３を参照。図２２で 同定された植物抽出物を用いてミスマッチ基質＃２（らせん外Ｇ基質）を切断し た。１μｌの粗ホモジネートを、頂部鎖５’³²Ｐ標識基質＃２でアッセイした。 レーンＧ、Ｇ＋Ａ、Ｃ、およびＴは、頂部鎖中の正確な切断部位を決定するのに 用いるＭａｘａｍＧｉｌｂｅｒｔＤＮＡ配列決定ラダーである。ミスマッチエン ドヌクレアーゼ切断は、レーン１ないし１７で見える３４および３５ヌクレオチ ド長のフラグメントを生成した。ミスマッチ基質中の２つの連続したＧ残基にお けるミスマッチのズレのために、２つのバンドが、ミスマッチ切断につき見られ た。活性は、これらの植物の根、苗条、茎、葉、花、および果実に見られた。レ ーン１２−２２は、ミスマッチのない基質＃１以外はレーン２〜１１に対応する 。 レーン１４〜１７は、４つの植物からのミスマッチエンドヌクレアーゼ活性は、 ＣＥＬ ＩおよびＡＲＡ Ｉと同様にマンノシル蛋白質であることが示されること を説明する。これらの活性を、ＣｏｎＡ−セファロース樹脂に結合させ、次いで 、マンノース緩衝液で溶出させた。レーン１８〜２１は、ミスマッチを有しない 基質＃１を用いた以外はレーン１４〜１７の対照である。糖蛋白質のミスマッチ 切断能力、活性の豊富およびマンノシル性質の点から、ＣＥＬ ＩおよびＡＲＡ Ｉミスマッチエンドヌクレアーゼは、実質的に同様であることが図２２および２ ３から明らかである。 上記の記載例および実施例は、本発明の好ましい具体例に関する。他の具体例 は、当業者に明白であるかもしれない。従って、本発明は、記載および例示され た詳細な具体例に限定されるものではなく、本発明の精神を逸脱することなく修 飾または変形することができ、その全範囲は添付の請求の範囲によって明らかに される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列を含めたポリヌクレオチドとハイブリダ イズできるポリヌクレオチドの突然変異していない配列を参照として、一本鎖ポ リヌクレオチドの標的配列における突然変異を測定する方法であって、ここに、 それらの配列を増幅し、検出マーカーで標識し、相互にハイブリダイズさせ、エ ンドヌクレアーゼに曝露し、該突然変異の存在につき分析すること該方法におい て、ミスマッチエンドヌクレアーゼを用いることを特徴とする改良であって、 該エンドヌクレアーゼの活性が、 ａ）該ハイブリダイズした配列間の全ミスマッチを検出すること； ｂ）長さが約１００ｂｐおよび約３ｋｂ間のポリヌクレオチド鎖における配列 相違を認識すること；および ｃ）フランキングポリヌクレオチド配列によって引き起こされる実質的悪影響 なしに、標的ポリヌクレオチド配列中の該突然変異を認識することよりなる該改 良。 ２．該エンドヌクレアーゼがセロリーに由来する請求項１記載の方法。 ３．該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載の方法。 ４．該エンドヌクレアーゼに曝露された配列を、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメ ラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、３'−５'ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡ末端に 結合するＤＮＡ結合蛋白質およびこれらの蛋白質の組合せよりなる群が選択され る蛋白質にも曝露し、それにより非特異的ＤＮＡ切断を減少させる請求項２記載 の方法。 ５．該エンドヌクレアーゼに曝露された配列を、ＤＮＡポリメラーゼにも曝露す る請求項１記載の方法。 ６．標的ＤＮＡが多重グリッド上で分析される請求項２記載の方法。 ７．該ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである請求項２記載の方法。 ８．該配列がＤＮＡ配列決定ゲル上で分析され、それにより、ＤＮＡ配列決定分 子量マーカーに対する、標的ＤＮＡ鎖中の突然変異の位置を同定する請求項１記 載の方法。 ９．該突然変異が癌について遺伝子的スクリーニングの手段として測定される請 求項１記載の方法。 １０．該突然変異が出産欠陥をもたらす遺伝的変化の検出手段として測定される 請求項１記載の方法。 １１．一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列を含めたポリヌクレオチドとハイブリ ダイズできるポリヌクレオチドの突然変異していない配列を参照として、一本鎖 ポリヌクレオチドの標的配列における突然変異を測定する方法であって、ここに 、それらの配列を増幅し、検出マーカーで標識し、相互にハイブリダイズさせ、 エンドヌクレアーゼに曝露し、該突然変異の存在につき分析する該方法において 、セロリーに由来するミスマッチエンドヌクレアーゼを用いることを特徴とする 改良であって、該エンドヌクレアーゼの活性が、 ａ）該ハイブリダイスした配列間の全ミスマッチを検出すること； ｂ）長さが約１００ｂｐおよび約３ｋｂ間のポリヌクレオチド鎖において配列 相違を認識すること； ｃ）フランキングポリヌクレオチド配列によって引き起こされる実質的悪影響 なしに、標的ポリヌクレオチド配列中の該突然変異を認識すること； ｄ）該ハイブリダイズした配列間のポリヌクレオチドループおよび挿入を認識 すること；および ｅ）ＤＮＡ多型または他の突然変異も存在する標的ポリヌクレオチド配列中の 該突然変異を認識することよりなる該改良。 １２．一本鎖ポリヌクレオチドの標的配列を含めたポリヌクレオチドとハイブリ ダイズできるポリヌクレオチドにおける突然変異していない配列を参照して、一 本鎖哺乳類ポリヌクレオチドの標的配列中の突然変異を測定するためのミスマッ チエンドヌクレアーゼであって、 実質的に純粋な形であり、かつ ａ）該ハイブリダイスした配列間の全ミスマッチを検出し； ｂ）長さが約１００ｂｐおよび約３ｋｂ間のポリヌクレオチド鎖における配列 相違を認識し； ｃ）フランキングポリヌクレオチド配列によって引き起こされる実質的悪影響 なしに、標的ポリヌクレオチド配列中の該突然変異を認識するのに有効的である 該エンドヌクレアーゼ。 １３．該エンドヌクレアーゼが該ハイブリダイズした配列間のポリヌクレオチド ループおよび挿入を認識する請求項１２記載のエンドヌクレアーゼ。 １４．ＤＮＡ多型またはもう一つの突然変異も存在する標的ポリヌクレオチド配 列中の該突然変異を認識する請求項１２記載のエンドヌクレアーゼ。 １５．植物源に由来する請求項１２記載のエンドヌクレアーゼ。 １６．該植物源がセロリーである請求項１５記載のエンドヌクレアーゼ。 １７．該植物源がArabidopsis thabianaである請求項１５記載のエンドヌクレア ーゼ。