ES2292270B1 - Procedimiento para detectar selectivamente acidos nucleicos con estructuras atipicas convertibles en muescas. - Google Patents
Procedimiento para detectar selectivamente acidos nucleicos con estructuras atipicas convertibles en muescas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para detectar selectivamente ácidos nucleicos con estructuras atípicas convertibles en muescas, basado en marcaje específico, selección e identificación de moléculas que contienen estructuras atípicas. Uso de este procedimiento en selección e identificación de ácidos nucleicos que presentan estructuras atípicas en poblaciones mixtas de ácidos nucleicos con y sin estructuras atípicas. Aplicación de este procedimiento en la detección de mutaciones en poblaciones de individuos y en la detección de variaciones entre diferentes cepas de la misma especie.
Description
Procedimiento para detectar selectivamente
ácidos nucleicos con estructuras atípicas convertibles en
muescas.
La presente invención se encuadra dentro del
campo técnico de la genómica funcional. Y en concreto se refiere a
un procedimiento sensible para la detección de cualquier
estructura atípica de ácidos nucleicos (AN), como mutaciones y
polimorfismos.
Los rápidos avances en biología molecular
acontecidos en los últimos tiempos, como la secuenciación de
nucleótidos de las moléculas de ácidos nucleicos, han permitido
conocer una gran cantidad de genomas desde los organismos más
sencillos hasta organismos más complejos como el hombre,
contribuyendo a entender aspectos tales como la evolución, análisis
genético, identificación, etc.
Las técnicas aplicadas en la identificación, han
tenido un enorme desarrollo en farmacología, medicina forense y
preventiva.
Una de las áreas con mayor crecimiento ha sido
la aplicación de dichas técnicas al diagnóstico de enfermedades, ya
sean por desordenes hereditarios o bien de origen patológico.
La alteración estructural de un gen que causa su
pérdida o bien una alteración en su función, puede implicar desde
una pérdida o cambio de un único nucleótido, hasta la eliminación
de segmentos de Ácido desoxirribonucleico (ADN) de millones de
nucleótidos.
La detección de grandes alteraciones es
fácilmente analizable, mientras que para detectar cambios mínimos
en la estructura genética se han desarrollado distintas
técnicas.
Existen múltiples métodos para la detección de
mutaciones y/o polimorfismos que se encuadran en dos grupos
principales: identificación de mutaciones no conocidas e
identificación de mutaciones conocidas.
Es posible detectar mutaciones conocidas con una
elevada eficiencia, pero aún queda mucho por mejorar en lo que se
refiere al número de individuos o secuencias diana que pueden ser
analizados en un experimento.
Métodos sensibles para detectar mutaciones
conocidas incluyen PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
específico para un determinado alelo como TagMAMA [Glaab W.E.,
Skopek T.R. A novel assay for allelic discrimination that combines
the 5' fluorogenic nuclease polymerase chain reaction (TagMan) and
mismatch amplification mutation assay. Mut. Res.
430:1-12] y la detección de reacciones de
extensión de cebadores dirigido por PNA (Ácido Péptido
Nucleico)y análisis MALDI-TOF [Sun X.,
Hung K., Wu L. Sidransky D., B. Guo. Detection of tumour mutations
in the presence of excess amounts of normal DNA. Nat. Biotech. 2002
Feb; 19:186-189].
Es de vital importancia distinguir los métodos
de análisis de mutaciones conocidas de los métodos de criba para
nuevas mutaciones.
El procedimiento descrito en la presente
invención es altamente sensible, ya que combina la facilidad de
detección de nuevas mutaciones con la elevada sensibilidad de
detección de las mismas, en comparación con los métodos conocidos
hasta el momento.
Actualmente, una de las técnicas de búsqueda de
nuevas mutaciones más utilizada, es la secuenciación directa,
usando didesoxidinucleótido trifosfato como terminador de la
síntesis de ADN.
La secuenciación directa permite identificar
cambios en el AN amplificado con cebadores específicos, pero este
método es relativamente caro, ya que requiere un análisis
independiente por cada individuo y representa limites respecto al
tamaño de la secuencia que se está investigando. Normalmente, un
análisis independiente puede abordar entre 300 y 600 pares de bases
(pb).
No obstante, este método ha resultado ser muy
efectivo en la generación de bancos de datos de polimorfismos
pequeños de secuencias pequeñas (SNPs) en el genoma humano, aunque
este hecho ha supuesto enormes esfuerzos económicos.
Existen otros métodos para realizar la criba de
mutaciones que se basan en la propia estructura secundaria de AN,
en potenciales heterodúplex de AN, en cambios de esta estructura
secundaria de AN, o bien, en cambios en potenciales heterodúplex de
AN en función de determinados parámetros.
Un ejemplo de este tipo de métodos es SSCP
(polimorfismo conformacional de cadena simple), que aprovecha la
variación de movilidad de heterodúplex versus homodúplex en geles
de poliacrilamida con gradiente de temperatura o gradiente
desnaturalizante, o en dHPLC (Cromatografía Líquida de Alta
Resolución) para separar homodúplex y heterodúplex [McCallum et
al, Targeted screening for induced mutations. Nat. Biotech. 2000
Apr; 18(4):455-7] y para identificar
mutaciones.
Otros métodos para la criba de mutaciones han
empleado agentes químicos o enzimas para reconocer y procesar
heterodúplex y así intentar aumentar la capacidad de discriminación
de las variaciones.
El reconocimiento de sitios de desapareamiento
en heterodúplex o de estructuras atípicas en AN y su procesamiento
se ha llevado a cabo de forma habitual por dos métodos:
- a)
- Químicamente, por ejemplo la detección química de mismatch (zonas de mal apareamiento al existir bases del tipo no Watson y Crick) es un ejemplo, el estudio desarrollado por Cotton G.H. et al [Cotton RAG I. et al. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair base-mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. (1988); Proc Natl Acad Sci USA, 85, 4397-4401].
- b)
- Enzimáticamente, por ejemplo en sitios en que el ADN está dañado, [Harrison L. et al. (1999); In vitro repair of synthetic ionizing radiation-induced multiply damaged DNA sites. J Mol Biol, 290, 667-684], y en pares de bases desapareadas [Cell, Oleykowski C. A et al. (1998); Mutation detection using a novel plant endonuclease NAR, 2f, 4597-4602].
El procesamiento de los heterodúplex o de las
estructuras atípicas tiene como resultado el corte en una de las
cadenas de ADN (nick) o en ambas.
El análisis de la presencia de los fragmentos
generados es más fácil que el análisis directo de homo y
heterodúplex, y se puede llevar a cabo por ejemplo mediante
análisis como electroforésis en geles de secuenciación
[Oleykowski CA, Bronson Mullins CR, Godwin AK, Yeung AT. Nucleic
Acids Res. 1998 Oct 15; 26(20):4597-602;
Colbert T, Till BJ, Tompa R, Reynolds S, Steine AN, Yeung AT,
McCallum CM, Comai L, Henikoff S. 2001 Jun; 126
(2):480-4].
El procedimiento que describimos en la presente
invención permite el marcaje y la recuperación específicos de
moléculas que contienen estructuras atípicas, por ejemplo
posiciones de desapareamiento, y permite la detección de éstas
cuando la relación de moléculas con estructuras atípicas y de
moléculas sin estructuras atípicas es sustancialmente menor que en
los métodos descritos anteriormente.
Hasta ahora, la mayoría de los sistemas de criba
de mutaciones están basados en la detección directa de los
productos resultantes del procesamiento de los heterodúplex. Dicho
de otra manera, los fragmentos mutantes se analizan, casi siempre
en presencia de los fragmentos silvestres, en el mismo porcentaje
de representación que en la muestra original.
Existen dos excepciones notables que describen
métodos que combinan cribado de mutaciones con una alta
sensibilidad de detección.
La primera excepción viene desarrollada en el
procedimiento de Makrigiorgos [Makrigiorgos, Gerassimos M.,
Method for identifying mismatch repair glycosylase reactive sites,
compounds and uses thereof, US patent 6,174,680] en la que el
funcionamiento de su método depende de la conversión de estructuras
atípicas de ADN a emplazamientos abásicos, los cuales se pueden
unir covalentemente con una molécula, que permita una purificación
afín. El grado de detección de moléculas mutantes en este caso es
de un 1% [Chakrabarti et al. (2000). Highly selective isolation
of unknown mutations in di verse DNA fragments: toward new
multiplex screening in cancer. Cancer Res.
(60)3732-3737].
La otra excepción es el método basado en
amplificación de fragmentos de ADN generados por procesamiento de
dúplex y ligación de adaptadores de ADN, descrito también por
Makrigiorgos [Makrigiorgos, Gerassimos M., Methods for rapid
screening of polymorphisms, mutations and methylation, US2003022215
y WO02/086169], se ha desarrollado un procedimiento en el que
las moléculas de heterodúplex son amplificadas después de su
reconocimiento y procesamiento.
Para ello, se generan moléculas heterodúplex con
extremos desfosforilados y se realiza un corte en las dos cadenas
de las moléculas heterodúplex en la posición de desapareamiento.
Este corte revela dos nuevos extremos que, en contraste con los
extremos originales, sí están fosforilados.
Por lo tanto, la diferencia del estado de
fosforilación de los extremos se utiliza para ligar de manera
específica un adaptador sintético de ADN a los nuevos extremos. De
este modo, en la siguiente etapa, es posible de detectar la
presencia de ADN mutante en la muestra original.
Este aspecto tiene lugar cuando se usa un
cebador específico, para el adaptador sintético, en combinación con
otro cebador que reconoce el fragmento de ADN en una reacción de
PCR, y se obtiene un producto de PCR.
Este segundo método desarrollado por
Makrigiorgos permite detectar mutaciones que representan una
sensibilidad de hasta 1% del total de una mezcla [Zhang Y., Kaur
M., Price B.D., Tetradis S., Makrigiorgos G.M. An amplification and
ligation based method to scan for unknown mutations in DNA. Hum
Mutat. 2002 Aug; 20(2):139-47].
El hecho de generar estructuras de ácidos
nucleicos ineptos a la actividad de determinadas enzimas ha
figurado anteriormente en otros métodos de detección de
mutantes.
No obstante, las diferentes formas descritas en
otros métodos desarrollados para generar las estructuras ineptas,
son diferentes a la forma de generar este tipo de estructuras que
se muestra en la presente invención y, por tanto, no serian
funcionales en el contexto del procedimiento propuesto en esta
memoria.
Makrigiorgos [Makrigiorgos, Gerrasimos M.,
Methods for rapid screening of polymorphisms, mutations and
methylation, US patent application U.920030022215 y
WO02/086169] describe la ligación de un oligo/adaptador de ADN
con didesoxinucleósidos a los extremos 3', con el fin de protegerlos
del proceso de pirofosforilación por la
ADN-polimerasa en ausencia de dNTPs libres (una
actividad enzimática de la ADN-polimerasa).
Shuber, por otro lado [Shuber, Anthony P.,
Direct sequence identification of mutations by cleavage- and
ligation-associated
mutation-specific sequencing WO96/41002],
menciona la posibilidad de bloquear extremos para impedir la
ligación inespecífica mediante desfosforilación, la posibilidad de
añadir una cola homopolimérica de didesoxinucleótidos, y la
ligación de ADN de doble cadena modificado.
Nick translation es un método clásico que ha
sido utilizado de forma general para marcar el ADN y que fue
desarrollado por Wong. Wong [Wong, Gordon G. Methods and
products for analysing nucleic acids using nick translation, US
Patent application 20020187508] describe que la traducción de
muesca puede ser usada para marcar moléculas de ADN con una
molécula detectable (por incorporación de una entidad fluorescente
o una entidad que puede ser acoplada a una entidad fluorescente,
radiactiva, etc) y describe instrumentos para detectar las
moléculas.
El método desarrollado por Wong no es aplicable
al procedimiento aquí descrito, porque las reacciones enzimáticas
usadas funcionan sólo porque se procede a una detección directa del
producto marcado y no a su selección. En la descripción de la
patente desarrollada por Wong, éste menciona de manera explícita
que la ADN-polimerasa no reacciona a los extremos
de ADN lineal.
Esta mención no corresponde con las
observaciones descritas en la presente invención y que son
cruciales para la elección de la enzima adecuada para el
procedimiento descrito en esta memoria.
La aparente contradicción probablemente viene
dado por el hecho que una incorporación de una molécula detectable
a los extremos de ADN en el protocolo de Wong sólo causa un pequeño
ruido de fondo, ya que la incorporación a los extremos es muy
minoritaria en comparación con la incorporación desde la muesca por
traducción de muesca.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento sensible para la detección de
cualquier estructura atípica de AN que pueda ser convertida en un
corte o muesca (nick) de cadena simple.
Éstas estructuras atípicas que pueden ser
convertidas en muescas de AN son heterodúplex de AN y daños de
cualquier origen provocados en el AN.
El procedimiento desarrollado en la presente
invención, ofrece una aproximación mejorada para la detección de
estructuras atípicas de AN, incluyendo heterodúplex.
La novedad del presente procedimiento se
fundamenta en la inclusión de pasos intermedios de protección de
sitios activos no deseados en el ADN mediante incorporación de
componentes que convierten estos sitios activos en sitios no
reactivas en las reacciones posteriores, aumentando de este modo su
especificidad.
El procedimiento aquí desarrollado, mejora los
métodos citados en diferentes aspectos, incluyendo un limite de
detección menor del 1%,y la posibilidad de detectar todas
estructuras atípicas que se pueden convertir en un nick o muesca y,
que serán expuestas en detalle en la presente memoria, en el
procedimiento general de detección de polimorfismos de ADN.
La presente invención meJora,procedimiento
originalmente descrito por Yeung [Nucleic acid molecule encoding
a mismatch endonuclease and methods of use thereof, US Patent
US6391557 and Mismatch endonuclease and its use in identifying
mutations in targeted polynucleotide strands, US Patent
5869245], que contiene, de forma general, las siguientes
etapas:
- a)
- Preparación de una población molde: ADN lineal se genera mediante PCR, se desnaturaliza y se deja para que vuelva a formar dúplex y heterodúplex.
- b)
- Reconocimiento y modificación de moléculas en forma heterodúplex mediante, por ejemplo, una endonucleasa de desapareamiento o un método químico.
- c)
- Marcaje del ADN modificado en el paso anterior
- d)
- Selección de los fragmentos marcados e identificación de dichos fragmentos, típicamente por amplificación por PCR.
Las etapas anteriormente citadas son conocidas y
forman parte de la estrategia de varios métodos de detección de
mutaciones incluyendo SSCP (Polimorfismo de la Conformación de un
ADN de Cadena Sencilla) [M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K,
Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel
electrophoresis as single-strand conformation
polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Apr;
86(8):2766-70] como la aproximación de
detección de mutantes en Tilling [McCallum CM, Comai L, Greene
EA, Henikoff S. Targeted screening for induced mutations. Nat
Biotechnol. 2000 Apr; 18(4):455-7, Henikoff
S, Comai L. Single-nucleotide mutations for plant
functional genomics. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 2003
Jun; 54:375-401] y otros muchos métodos de
detección de mutaciones en AN.
La ventaja sustancial de nuestro procedimiento
se muestra en la etapa b) ya que en nuestro caso, previamente a la
etapa de marcaje, se realiza un enmascaramiento o protección
selectiva de sitios de daño de ADN y extremos de ADN, mediante
incorporación de grupos protectores, para que no sean centros
reactivos en la reacción de marcaje, y de este modo, se smarquen
selectivamente aquellos sitios que han sido resaltados por
reconocimiento y modificación de una estructura atípica de ADN.
No obstante, en el procedimiento aquí presentado
como en casi todos los métodos anteriormente citados, se procede
después a un análisis directo del producto obtenido mediante
electroforésis en geles o capilares de secuenciación, o dHPLC
(Cromatografía líquida de alta presión desnaturalizante).
Dentro de las deficiencias encontradas en el
estado del arte, figuran la falta de especificidad de la mayoría de
las enzimas cuando se usan en condiciones estándar y el daño
inesperado presente en las moléculas por PCR o generado durante su
procesamiento.
Consecuentemente, la altura inventiva y
originalidad del procedimiento aquí presentado se basa tanto en la
secuencia de manipulaciones descritas en el proceso, como en la
búsqueda y establecimiento de las condiciones precisas y no obvias
que permiten su funcionamiento.
En la presente invención, se han identificado
determinados aspectos que mejoran de forma sustancial el
funcionamiento del ensayo básico expuesto en los cuatro puntos
generales mencionados anteriormente y que impiden obtener un
procedimiento funcional viable y rentable a gran escala.
Por lo tanto, a partir de múltiples
investigaciones se ha llegado a la conclusión de que:
- a)
- Cualquier población de moléculas ADN, incluyendo fragmentos de ADN obtenidos por amplificación de ADN, contiene moléculas dañadas, y por tanto, es necesario enmascarar este daño a nivel molecular mediante la incorporación de nucleótidos u otros compuestos que impiden el marcaje del ADN a este nivel, en pasos posteriores.
- b)
- Todos los fragmentos lineales tienen extremos reactivos y, es necesario enmascararlos mediante la incorporación en el AN de nucleótidos u otros compuestos que impiden el marcaje del ADN en estos extremos, en pasos posteriores.
- c)
- Los ensayos de procesamiento de desapareamientos, usando endonucleasas especificas de sitios de desapareamiento, han tenido que ser optimizados para causar la ruptura de una única cadena (nicking) en lugar de un corte de las dos cadenas del ADN.
- d)
- Se conoce que la ADN-polimerasa I de E. coli tiene actividad exonucleasa de ADN del 3' a 5' y no solo del 5' a 3'. No obstante, se considera de forma general, que los extremos romos de ADN son ineptos para la reacción exonucleasa del 3' a 5'.
- e)
- A diferencia de esta afirmación, hemos podido comprobar que ADN-polimerasa I de E. coli sí es capaz de incorporar nucleótidos a los extremos romos de moléculas de ADN. Esto significa que el uso de ADN-polimerasa I de E. coli puede marcar cualquier ADN desde los extremos, y no solo moléculas con muescas generadas de manera específica en posiciones con estructuras atípicas como son los desapareamientos. La enzima Taq ADN-polimerasa tiene actividad 3' terminal desoxinucleotidil aparte de actividad 5' a 3' ADN exonucleasa y actividad 5' a 3' ADN-polimerasa. Por esta razón, es necesario enmascarar los extremos de ADN mediante la incorporación de componentes que impiden el marcaje del ADN en los pasos posteriores.
- f)
- Se ha observado que el uso de la enzima Taq ADN-polimerasa a 72ºC, temperatura óptima para esta enzima, compromete la eficacia del bloqueo de los extremos de ADN por razones que desconocemos pero que pueden implicar la desnaturalización parcial o daño al ADN a esta temperatura.
- Por esta razón, ha sido necesario buscar un intervalo de temperatura en el que se obtiene máxima especificidad y rendimiento del marcaje. El intervalo al que la enzima Taq ADN-polimerasa muestra mayor rendimiento es entre 37 y 60ºC.
- g)
- El proceso que se usa para generar muescas en el ADN, por ejemplo usando una endonucleasa de desapareamiento, puede resultar parcialmente inespecifico, y por tanto, generar puntos de partida para marcaje no selectivo, si el ADN no ha sido previamente protegido contra actividades inespecificas de generación de muescas por parte de las enzimas. Por ejemplo, hemos observado que la enzima Cel I (SURVEYOR^{TM}) tiene actividad exonucleasa 3'-5' y que convierte extremos de ADN en sustratos para marcaje en los pasos posteriores del procedimiento.
- h)
- Se ha observado que cualquier manipulación de ADN durante el proceso de detección de mutaciones, especialmente por sometimiento de la muestra a vórtice o precipitaciones de ADN, puede causar daño a las moléculas. El daño molecular puede ser el punto de partida para el marcaje en pasos posteriores, y este hecho tiene que evitarse, no sólo durante el proceso de preparación del molde, sino en todos los pasos anteriores al marcaje.
- i)
- El proceso de selección se lleva a cabo en un tubo y conlleva un riesgo de contaminación, que necesita ser monitorizado con un control interno no mutado, ya que cualquier fragmento de ADN sin mutaciones se puede identificar por PCR y distinguir de los otros fragmentos que se están cribando por la presencia de mutaciones.
Teniendo en cuenta todas las especificaciones
arriba mencionadas, el esquema del procedimiento, aplicado a la
detección de mutaciones, queda de la siguiente manera:
- a)
- Preparación de la población molde.
- b)
- Generación de ADN lineal, por ejemplo mediante PCR usando una polimerasa de alta fidelidad como Pfu ADN-polimerasa (Pfu-polimerasa)
- c)
- Desnaturalización el ADN para que le permita formar ADN dúplex y heterodúplex.
- d)
- Bloqueo de los extremos de ADN y del daño en las moléculas de ADN usando ddGTP en una reacción de "nick translation" con Taq ADN-polimerasa. En este paso, tanto el tiempo como la temperatura de incubación son cruciales. El tiempo de incubación es entre 30 minutos y 18 horas y la temperatura entre 37 y 60ºC.
- e)
- Reconocimiento y procesamiento de estructuras atípicas, en condiciones favorables, como intervalos cortos de incubación entre 2 y 7 minutos y bajas concentraciones de enzima, como una dilución 1/10 (es decir, utilizando únicamente una cantidad del 10% de enzima), para la creación de muescas en el ADN en la posición de la estructura atípica.
Teniendo en cuenta, el esquema de procedimiento
mencionado en la presente memoria, es necesario establecer una
serie de especificaciones concluyentes que muestran las diferencias
significativas entre la presente invención y otras patentes que se
encuentran en el estado del arte.
En la etapa d), referente al bloqueo de los
extremos de ADN y del daño en las moléculas de ADN usando ddGTP en
una reacción de "nick translation" con Taq
ADN-polimerasa, hay que especificar determinados
aspectos, que siguen a continuación.
Los métodos que se han descrito anteriormente en
el estado del arte para bloquear estructuras de ADN contra
actividades enzimáticas, no son aplicables al procedimiento
descrito en la presente invención.
Por ejemplo, Makrigiorgos [Makrigiorgos,
Gerrasimos M., Methods for rapid screening of polymorphisms,
mutations and methylation, US patent application US20030022215 y
WO02/086169] utiliza la ligación de un fragmento de ADN
sintético que lleva una molécula que bloquea la acción de enzimas
usadas posteriormente.
No obstante, en el procedimiento descrito por
Makrigiorgos, el uso de ADN ligasa es incompatible con el
procedimiento descrito en la presente invención.
Por otro lado, en la presente invención para que
el procedimiento sea viable, no sólo es necesario el hecho de que
se bloqueen los extremos de ADN, sino que también se requiere que
exista un bloqueo de daño de ADN.
Otro ejemplo, es el procedimiento descrito por
Shuber [Shuber, Anthony P., Direct sequence identification of
mutations by cleavage- and ligation-associated
mutation-specific sequencing WO96/4100] que
primero genera heterodúplex mediante hibridación en una muestra
problema y en una muestra control fijada sobre un soporte sólido y,
después corta los heterodúplex, liga un adaptador a los fragmentos
generados y finalmente secuencia los fragmentos desde un oligo
basado en la secuencia del adaptador.
El protocolo de Shuber es similar en algunos
aspectos al protocolo desarrollado por Makrigiorgos en lineas
anteriores. Ambos coinciden en el hecho que se liga un adaptador al
ADN cortado a la altura o muy cerca de la posición de
desapareamiento del heterodúplex.
La diferencia entre los dos estriba en que en el
protocolo de Shuber se incorpora un paso adicional de bloqueo para
evitar que el adaptador sea ligado a los extremos originales del
heterodúplex, presentes antes de que se produzca el corte. Shuber
también contempla un paso de desfosforilación, es decir, la
posibilidad de añadir una cola homopolimérica de
didesoxinucleótidos, y la ligación posterior de ADN de doble cadena
modificado.
Makrigiorgos, por el contrario, utiliza
heterodúplex que no tienen grupos 5' fosfato, y que, por tanto, no
son reactivos en la reacción de ligación.
En el procedimiento descrito por Shuber, después
de la ligación, desnaturaliza el ADN y elimina las moléculas que no
están unidas al soporte sólido, y a continuación procede con la
secuenciación directa de los fragmentos utilizando un cebador
complementario al adaptador ligado al heterodúplex cortado.
Finalmente Shuber realiza la secuenciación
mediante el método estándar "Dideoxynucleotide Sequencing
Method" (Método de secuenciación de Didesoxinucleótidos). Sin
embargo, utilizando este método, cuando ambas hebras del ADN de
referencia se unen de forma no selectiva al soporte sólido porque
el ADN de referencia ha sido amplificado por ejemplo con oligos
biotinilados como describe Shuber en [WO96/4100], la
secuenciación directa no es posible porque se produce una mezcla de
la lectura de las dos cadenas al mismo tiempo.
Otro ejemplo más, es el descrito por Luchniak
et al. [Biotech Histochem. 2002 Jan;
77(1):15-9] describen el uso de
didesoxinucleótidos trifosfatos y Taq ADN-polimerasa
para bloquear la traducción in situ no deseada de muescas de
ADN en cromosomas enteros de plantas (tanto en células fijadas o en
cromosomas extendidos).
Luchniak prefiere Taq
ADN-polimerasa de E. Coli, es decir, E. Coli
ADN-polimerasa I para llevar a cabo el proceso
porque la actividad nucleasa 3' a 5' de E. coli.
ADN-polimerasa I podría eliminar el ddGTP
incorporado en el paso de bloqueo.
En el trabajo desarrollado por Luchniak, los
extremos de ADN no son importantes, la idea es de bloquear las
muescas generadas en el ADN por contaminaciones de enzimas de
degradación de ADN en los tratamientos enzimáticos aplicados para
permeabilizar la pared celular.
Por el contrario, los extremos de ADN son de
extrema importancia para la presente invención. El uso de la Taq
ADN-polimerasa tiene, por tanto, un fundamento
diferente que el descrito por Luchniak et al.
En la presente invención, la enzima Taq
ADN-polimerasa tiene, en adición a su actividad
exonucleasa del 5' a 3' y de su actividad polimerasa, una actividad
terminal transferasa.
Por lo tanto, en la invención descrita en la
presente memoria, los didesoxinucleótidos trifosfatos son
utilizados para enmascarar y proteger tanto sitios de daño interno
como extremos de ADN contra todas las actividades catalíticas de la
Taq ADN-polimerasa, durante el marcaje con
moléculas seleccionables. Es decir, en la presente invención,
mediante la adicción de didesoxinucleótidos trifosfatos se bloquean
y enmascaran los sitios activos que no interesa que sean reactivos
para reacciones posteriores.
En el método descrito por Luchiak et al.,
la reacción de protección y de la traducción de la muesca se lleva
a cabo a 62ºC.
En los ejemplos incluidos en nuestra
descripción, se demuestra que las condiciones de reacción descritas
por Luchniak et al. no son funcionales en el contexto del
procedimiento descrito en la presente memoria.
En la etapa e), referente al reconocimiento y
procesamiento de estructuras atípicas, en condiciones favorables
anteriormente descritas, hay que especificar determinados aspectos,
que siguen a continuación.
Por ejemplo, para el reconocimiento de sitios de
desapareamiento de ADN en heterodúplex se realiza mediante una
endonucleasa mismatch que puede ser Cel I o enzimas de la misma
familia, comercialmente disponible como SURVEYOR^{TM} nucleasa
que, en condiciones favorables a la formación de muescas en el ADN,
como intervalos cortos de incubación entre 2 y 7 minutos y bajas
concentraciones de enzima a una dilución 1/10.
La solicitud de patente de Yeung [Nucleic
acid molecule encoding a mismatch endonuclease and methods of use
thereof, United States Patent US6391557 and Mismatch endonuclease
and its use in identifying mutations in targeted polynvcleotide
strands, United States Patent 5869245], describe un método para
la detección de mutaciones basada en el uso de la enzima Cel I
(SURVEYOR^{TM}).
La enzima Cel I (SURVEYOR^{TM}) se puede
utilizar en el procedimiento descrito en la presente memoria, pero
hay que destacar que el uso de esta enzima es de forma general para
generar muescas en la doble cadena de ADN en lugares donde existen
desapareamientos.
Para que funcionen endonucleasas de sitios de
desapareamiento en el contexto de nuestra aplicación es necesario
que se genere una molécula de ADN con una muesca y que el ADN con
un grupo 3' hidroxilo (3'-OH) libre en la posición
de la muesca es perfectamente complementario al ADN en la otra
cadena en la posición 3'.
En caso contrario, es decir, que se produzca un
solo desapareamiento en la posición 3', la Taq
ADN-polimerasa exhibe una actividad de polimerasa
que es de 100 a 1.000.000 veces menor que la normal para incorporar
un dNTP en esta posición [Huang MM et al., Extension of base
mispairs by Tag DNA polymerase: implications for single nucleotide
discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11;
20(17):4567-73.]
Cuando se aplica el procedimiento descrito en la
presente memoria utilizando Cel 1/SURVEYOR^{TM} para generar
muescas de ADN, se usa por tanto una actividad de estas enzimas que
no esta descrita previamente para las mismas [Oleykowski CA,
Bronson Mullins CR, Godwin AK, Yeung AT. Nucleic Acids Res. 1998
Oct 15; 26(20):4597-602], por ejemplo, la
generación por parte de la enzima de una incisión 5' en el sitio de
desapareamiento o por el contrario, una incisión 3' seguida por
una actividad nucleasa que elimina el sitio de desapareamiento.
Si, como se ha descrito, solo existe una
actividad de corte en la posición 3', en el sitio desapareado, la
estructura generada no serviría como un cebador para la reacción de
marcaje con la Taq ADN-polimerasa.
Los agentes usados para generar muescas en el
ADN no son de por si el objeto de la presente invención, aunque si
forman parte del procedimiento.
En el procedimiento desarrollado por Yeung
[Mismatch endonuclease and its use in identifying mutations in
targeted polynucleotide strands, WO 97/46701, US Patent
5869245] también se reivindica que, la especificidad del proceso
de reconocimiento de sitios de desapareamiento puede verse
aumentado por la actividad de la enzima Cel I en combinación con
otras enzimas como ADN ligasa, ADN-polimerasa, ADN
helicasa, 3'-5' Exonucleasa o proteínas que se unen
extremos de ADN, o una combinación de dichas enzimas.
A este efecto, queremos destacar las diferencias
del proceso que describe Yeung y el proceso de protección de ADN
que reivindicamos en la presente invención, previo al
procesamiento de las moléculas de ADN para generar moléculas con
doble cadena con muescas, incluido en la presente invención.
Yeung presenta como ejemplo en su solicitud de
patente que añadiendo Taq ADN-polimerasa a la
reacción de incubación con la enzima Cel I, la especificidad de Cel
I aumenta cuando se usa Cel I en combinación con Taq
ADN-polimerasa. La reivindicación expresa
claramente que el fin de la adición de enzimas adicionales es de
reducir la inespecificidad o la autoalimentación o "turn over"
de la reacción de corte llevado a cabo por parte de Cel I.
Las diferencias ventajosas del procedimiento de
enmascaramiento descrito en la presente invención son varias, que
se han reflejado de forma genérica sobre moléculas de ADN, hecho
que no debe limitar la aplicación de la presente invención sobre
moléculas de cualquier molécula de AN:
- a)
- El fin del paso de protección no es afectar a la especificidad de la reacción de corte, ni aumentar la renovación de la disponibilidad ("turn over") de Cel I, comercialmente conocida como SURVEYOR^{TM}, en la reacción de corte. La razón que ha hecho necesario la incorporación del paso de protección se fundamenta en la necesidad de proteger sitios de daño de ADN y extremos de ADN para que no sean centros reactivos en la reacción de marcaje.
- b)
- La enzima usada en la reacción de protección no puede ser una ligasa, helicasa, 3'-5' exonucleasa, o proteínas que se unen a extremos de ADN. La enzima usada necesita ser una ADN-polimerasa sin actividad 3'-5' exonucleasa, o una combinación de enzimas que puedan llevar a cabo esta reacción.
- Lo más importante de la presente invención es que el proceso de protección no se lleva a cabo meramente incubando un molde de ADN con varias enzimas.
- La parte crucial de este paso es que la enzima incorpore un componente, por ejemplo un análogo de nucleótido, en el ADN previamente a la etapa de procesamiento que llevará a la formación de ADN de doble cadena con muesca y, que este componente incorporado bloquee de forma efectiva la integración de nucleótidos o componentes marcados durante el paso de marcaje.
- No obstante, no podemos excluir que, utilizando Cel I (SURVEYOR^{TM}) para generar muescas en heterodúplex de ADN, existe la posibilidad de que en el proceso de protección llevado a cabo en la presente invención, con el fin de evitar marcaje de sitios no deseados, también se puedan proteger parte de los sitios de cortes inespecificos en el tratamiento de con Cel I (SURVEYOR^{TM}).
- c)
- La purificación del ADN modificado, necesario en el proceso de cambio de las condiciones de tampón para las siguientes reacciones, se tiene que llevar a cabo en condiciones que no afectan a la integridad del ADN (por ejemplo, realizar filtrado en vez de precipitación con Etanol).
- d)
- Marcaje del ADN modificado, por ejemplo mediante la incorporación de nucleótidos biotinilados usando una reacción de nick translation (traducción de muesca) con Taq ADN-polimerasa, bajo condiciones precisas de tiempo y de temperatura, descritas anteriormente.
\newpage
- e)
- Selección e identificación de ADN marcado. El ADN marcado con biotina se selecciona, por ejemplo, mediante partículas o bolas magnéticas cubiertas con estreptavidina y posteriormente es identificado mediante PCR.
- f)
- En todo el proceso desde paso a) a g), se incorpora un control interno sin mutaciones que monitoriza la selectividad del proceso.
El procedimiento aquí descrito, como se ha
mencionado anteriormente, puede ser aplicado a moléculas de ácido
ribonucléico (ARN), moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN),
estructuras moleculares distintas de cualquier AN natural,
diseñadas para interaccionar con estructuras de AN de una manera
similar a la que se da naturalmente, como por ejemplo Ácido
péptidonucléico (PNA), cualquier combinación de los AN mencionados
anteriormente.
El origen de los ácidos nucleicos (AN) de la
población de moléculas molde empleada en este procedimiento, puede
ser viral, procariota, eucariota, o plasmidico, o la combinación
de cualquiera de ellos, y dicha población de moléculas molde de AN
puede generarse por extracción directa o cualquier método de
amplificación in vitro de ADN desde una fuente apropiada, o
sintéticamente.
Las estructuras atípicas de AN pueden ser
producto de la generación de heterodúplex partiendo de diferentes
muestras que varían entre ellos, dicha variación puede ser natural,
o causada por tratamientos físicos, químicos o biológicos.
Las estructuras atípicas también pueden ser
resultado de daños causados físicamente, químicamente o
biológicamente en el AN, o por la actividad de enzimas dentro de
las células, siempre y cuando estas estructuras atípicas puedan ser
convertidas en muescas de una única cadena en el ADN.
Para un experto en la materia, cualquier
polimerasa de alta fidelidad puede reemplazar la Pfu
ADN-polimerasa, en el proceso de generación del ADN
lineal por PCR, ya que el uso de esta enzima no es especifico de la
presente invención.
Del mismo modo, es evidente que cualquier agente
que reconoce y modifica sitios de desapareamiento en moléculas
heterodúplex generando una muesca (nick) [Mung bean nuclease,
Kowalski D. et al. (1976) Biochemistry 15:
4457-4463, venom phosphodiesterase Pritchard AE et
al. J. Biol. Chem. 1977; 252:
8652-8659], sin afectar a ADN correctamente
bloqueado que no tiene estructuras atípicas, puede reemplazar la
enzima endonucleasa de desapareamiento Cel I (SURVEYOR^{TM}) en
la generación de moléculas para posterior marcaje. Un ejemplo de
esta afirmación es la combinación de la glicosilasa de sitios de
desapareamientos MutY [Au KG et al. Escherichia coli mutY gene
product is required for specific
A-G- - - -C.G mismatch correction
Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;
85(23):9163-6]. y endonucleasa AP humana
[Shaper NL, Grossman L, Purification and properties of the human
placental apurinic/apyrimidinic endonuclease Methods Enzymol. 1980;
65(1):216-24.] o cualquier otra
combinación de una glicosilasa con una endonucleasa AP.
En el procedimiento descrito en la presente
memoria, el proceso de protección de ADN previo al marcaje,
selección y detección puede ser aplicado a cualquier producto de
doble cadena que contenga posiciones atípicas al que se le puede
aplicar un tratamiento que genera una ruptura de ADN en una de las
dos hebras. Por ejemplo, AlkA 3 metiladenina ADN glicosilasa [P.
Karran, T. Hjelmgren and T. Lindahl. Induction of a DNA glycosylase
for N-methylated purines is part of the adaptive
response to alkylating agents 1982 Nature
296:770-773], con AP endonucleasa humana
[Shaper NL, Grossman L, Purification and properties of the human
placental apurinic/apyrimidinic endonuclease Methods Enzymol.
1980; 65(1):216-24.] o cualquier otra
glicosilasa específica para daño de ADN usada en combinación con
una endonucleasa AP.
Una vez establecido que es crucial eliminar el
daño de ADN preexistente y proteger los extremos incorporando
componentes análogos de nucleótidos, como ddGTP (didesoxiguanosina
trifosfato), frente a la actividad de marcaje posterior con
biotina, cabe la posibilidad de intentar evaluar el potencial de
otros nucleótidos modificados o otros componentes para bloquear la
reacción de marcaje en sitios no deseados.
En esta memoria se pretende incidir en que la
utilización de componentes equivalentes siempre tiene que ser
evaluado en el conjunto total de reacciones en las que se quieren
utilizar. Es decir, si se incorpora un componente equivalente del
que no se conocen sus propiedades por completo, se pueden ver
afectados los pasos posteriores, aunque el componente añadido
reemplace perfectamente la función del componente original.
Por lo tanto, no basta con comprobar que un
componente es equivalente y que puede reemplazar a otro en un
determinado paso, sino que también hay que verificar que no afecte
a pasos posteriores porque es posible que el componente que se
incorpora lo haga correctamente durante el paso de protección, pero
puede ser eliminado en el paso de la modificación previo al
marcaje. O, por el contrario, que sea un potente y resistente
bloqueador, y que tenga una eficiencia baja de incorporación en los
sitios a proteger.
Potenciales componentes alternativos para el uso
de ddGTP en el procedimiento incluyen, a AZT (Azidotimidina)
[Copeland WC et al. Human DNA polymerases alpha and beta are
able to incorporate anti-HIV deoxynucleotides into
DNA, J Biol Chem. 1992 Oct 25;
267(30):21459-64] o cualquier otro
análogo de nucleótido con capacidad de terminar la síntesis de ADN
cuando es incorporado en el ADN [Lim SE, Copeland WC,
Differential incorporation and removal of antiviral
deoxynucleotides by human DNA polymerase gamma. J Biol Chem. 2001
Jun 29; 276(26):23616-23].
En la presente invención está incorporado un
paso en el que se marcan moléculas con un corte en una sola hebra,
de ADN con biotina, aprovechando las actividades 5' a 3'
AFN-polimerasa y 5' a 3' exonucleasa de la Taq
ADN-polimerasa.
Para un experto en la materia, resulta evidente
la posibilidad de utilizar cualquier enzima o grupo de enzimas que
combine dichas actividades, sin incorporar otras que interfieran
con el proceso integral, podría remplazar la Taq
ADN-polimerasa en este proceso, si bien, el
potencial de éstas enzimas alternativas y las condiciones de
reacción a utilizar necesitan ser evaluadas en conjunto.
Existen potenciales enzimas o combinaciones de
éstas fue pueden utilizarse en este pasó, incluyendo proteínas
mutadas derivadas de I deficientes en su normal capacidad de editar
(proofreading exonucleasa), o el fragmento Klenow de
ADN-polimerasa deficiente en actividad exonucleasa
en combinación con una 5'-3' exonucleasa (por
ejemplo, exonucleasa I de ADN). Del mismo modo, la biotina puede ser
reemplazada por otras moléculas que permiten, de manera directa o
indirecta, la separación de fragmentos que la hayan incorporado de
las otras que no lo han hecho.
Los métodos de separación pueden estar basados
en separación magnética usando bolas acopladas a un ligando para la
molécula incorporada, cromatografía de afinidad con un ligando para
la molécula incorporada, citometría de flujo o otros métodos
aplicados a la separación no destructiva de moléculas.
Para un experto en la materia, la opción de
hacer una amplificación después de la selección especifica de los
fragmentos marcados viene derivada de la necesidad de visualizar
los fragmentos seleccionados en un gel de agarosa.
Por otro lado, la presencia de este fragmento
podría ser detectada mediante cualquier método directo
suficientemente sensible desarrollado para detectar fragmentos de
ADN, incluyendo espectrometría de masas, cromatografía, análisis
mediante hibridación sobre cualquier tipo de soporte (filtro, chips
de ADN, fibra óptica, bolas) y microscopia de fuerza atómica.
Teniendo en cuenta el fundamento de la presente
invención, enfocado al paso intermedio de protección o
enmascaramiento por adicción de componentes análogos a las
moléculas de AN, que evitan específicamente el marcaje de sitios
protegidos en las moléculas de AN, se ha desarrollado una
aplicación que deriva del fundamento de detección selectiva de
ácidos nucleicos con estructuras atípicas convertibles en muescas
de AN.
Esta nueva aplicación del presente
procedimiento, es la identificación de variaciones entre diferentes
cepas de una misma especie, por ejemplo, diferentes cepas de la
misma especie de levaduras, por ejemplo, de Saccharomyces
cerevisae.
Según el procedimiento al que se refiere la
presente invención, éste puede ser utilizado para identificar:
- a)
- variaciones o diferencias en secuencias de AN en diferentes individuos de una misma especie,
- b)
- variaciones o diferencias en secuencias de AN en células de un mismo individuo, por ejemplo, para identificar de forma selectiva en un mismo individuo células cancerosas de células no cancerosas.
- c)
- mutaciones en genes de interés en diferentes individuos de una misma especie,
- d)
- mutaciones en genes de interés en células de un mismo individuo, por ejemplo para identificar células cancerosas que tienen mutado algún gen.
- e)
- daño de AN en secuencias de interés, por ejemplo para detectar de forma selectiva daño de ADN en secuencias de interés.
- f)
- Daño de ADN a nivel de todo el genoma.
Los experimentos que a continuación se
presentan, se describen como soporte de aspectos particulares de la
presente invención y en ningún caso para limitar el alcance de la
misma.
Seguidamente se ilustran los experimentos
individuales que muestran cómo se lleva a cabo el procedimiento
desarrollado en la presente invención, es decir, SAMPAD (SAMPAD:
Detección y amplificación selectiva de mutaciones, polimorfismos y
ADN dañado).
Primero ilustramos diferentes formas de hacer
componentes individuales de SAMPAD (ensayos 1 a 8).
\newpage
Después se muestran múltiples métodos que pueden
ser utilizados para marcar el ADN, como se observa en los ensayos
del 9 al 11.
También se han desarrollado eficientemente
varias formas para reducir el ruido de fondo en el marcaje (ensayos
12 a 17), para la optimización y la combinación de pasos
individuales (ensayos 18 a 21) y SAMPAD funcional en el ensayo 22 y
una realización completa en el ensayo 23.
Finalmente se describe una realización completa
que conlleva una aplicación industrial de este procedimiento en la
identificación de variaciones entre diferentes cepas de una misma
especie, tal y como se muestra en el ensayo 24.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
1
El molde utilizado está basado en un plásmido
pUC18, digerido en un único sitio NotI, durante 1 hora a 37ºC en
presencia de 50 mM Tris HCl, alcanzando un pH 7.5 junto con 10 mM
MgCl_{2}, 100 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 10U NotI en un volumen total
de 20 \mul y ligado con el siguiente fragmento:
| 5' c atg tcg cgc gcg cga tat atg ggg ggt a 3' | (SEQ 1) | |
| 3' agc gcg cgc gct ata tac ccc cca tgt ac 5' | (SEQ 2) |
Las moléculas de ADN se ligaron durante 3 horas
a 37ºC, con 1U T4 ADN ligasa, 40 mM Tris HCl, 100 mM MgCl_{2}, 10
mM DTT y 0.5 mM ATP.
Con los productos de ligación se transformaron
células de E. Coli DH5\alpha químicamente competentes,
mediante un cambio térmico brusco aplicando frío o shock frío (30
minutos en hielo a 0ºC) seguido de un cultivo de las células sin
selección (90 minutos en caldo LB a 37ºC). Los transformantes se
seleccionaron mediante resistencia a antibiótico y el molde para
SAMPAD se generó por amplificación con Pfu
ADN-polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
2
El molde utilizado está basado en un plásmido
pUC18, digerido en el único sitio NotI, durante 1 hora a 37ºC con
50 mM Tris HCl a pH 7.5, 10 mM MgCl_{2}, 100 mM NaCl, 0.1 mg/ml
BSA y 10U NotI en un volumen total de 20 \mul y, ligado con el
siguiente fragmento:
| 5' c atg tcg cgc gcg cga tat att agg ggg gta 3' | (SEQ 3) | |
| 3' agc gcg cgc gct ata taa tcc ccc cat gta c 5' | (SEQ 4) |
Las moléculas de ADN se ligaron durante 3 horas
a 37ºC con 1U T4 ADN ligasa, 40 mM Tris HCl, 100 mM MgCl_{2}, 10
mM DTT y 0.5 mM ATP.
Con los productos de ligación se transformaron
células de E. Coli DH5\alpha químicamente competentes,
mediante cambio térmico brusco aplicando frío o shock frío (30
minutos en hielo a 0ºC) seguido de un cultivo de las células sin
selección (90 minutos en caldo LB a 37ºC).
Los transformantes se seleccionaron mediante
resistencia a antibiótico y el substrato para SAMPAD se generó por
amplificación con Pfu ADN-polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
3
Se han amplificado los moldes construidos como
modelo usando las condiciones estándar para la amplificación con
Pfu-polimerasa.
Estas condiciones estándar a las que se hace
alusión en este ensayo son las siguientes:
- a)
- Volumen total de reacción de 20 \mul,
- b)
- 200 pg de substrato modelo de ADN,
- c)
- 2 \mul 10 X tampón de reacción Pfu-polimerasa formado por: 200 mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25ºC); 100 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}; 100 mM NaCl; 1% Triton X 100 1 mg/ml albúmina sérica bovina y 20 mM MgSO_{4},
- d)
- 5.12 \mul dNTPs (12.5 \muM de cada dNTP) y
- e)
- 0.5 \mul de cada cebador (M13 cebadores de secuenciación 5'gtaaaacgacggccagt 3' (SEQ 5) y 5' caggaaacagctatgac 3' (SEQ 6), concentración 10 \muM) y,
- f)
- 0.5 U Pfu ADN-polimerasa.
El molde se cuantificó con una electroforésis en
gel, se diluyó de forma requerida con H_{2}O destilada y se
mezcló en las proporciones deseadas (1:0 (=matched) hasta
1:256).
Las mezclas obtenidas se desnaturalizaron
incubando en un baño a 95ºC y seguidamente se dejaron enfriar
gradualmente hasta temperatura ambiente, es decir, entre 18 y 25ºC
durante un intervalo de entre 9 y 12 horas.
Las moléculas heterodúplex resultantes son
fragmentos de ADN lineal (de 1900 pb) con dos bases desapareadas en
la posición 944.
Las moléculas dúplex son idénticas pero sin
nucleótidos desapareados.
Ensayo
4
Las reacciones de enmascaramiento se llevaron a
cabo entre 30 minutos y 18 horas, preferentemente un intervalo
entre 60 y 120 minutos, a una temperatura entre 37 y 60ºC,
preferentemente en un intervalo entre 45 y 55ºC en un volumen de
entre 10 \mul y 20 \mul.
Esta reacción contiene lo siguiente:
- a)
- 2 \mul ADN (8,5 ng/\mul),
- b)
- 2 \mul tampón 10X de Taq polimerasa (formado por: 160 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}; 670 mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25ºC) y 0.1% Tween 20),
- c)
- 0,75 \mul 25 mM MgCl_{2},
- d)
- 5 \mul ddGTP mix, formado por: ddGTP mix: 2 pl 10 mM dATP; 2 \mul 10 mM dCTP; 2 \mul 10 mM dTTP; 2 \mul 10 mM ddGTP y 72 \mul H_{2}O destilada,
- e)
- 10U Taq polimerasa, y
- f)
- 10 \mul H_{2}O destilada hasta un volumen total de 20 \mul.
Ensayo
5
SURVEYOR^{TM} es la acepción de una enzima de
la familia de las Cel I nucleasas, que proviene del apio (Apium
graveolens). Las nucleasas de la familia Cel I reconocen ADN
heterodúplex y lo cortan o hacen una muesca en el mismo.
La reacción de SURVEYOR^{TM} se lleva a cabo
en un volumen de 20 \mul. Se incubaron 8.5 ng de ADN con 0.1
\mul de SURVEYOR^{TM} y 2 \mul de tampón de reacción de
SURVEYOR^{TM} 10X, entre 2 y 7 minutos en un intervalo de
temperatura entre 37ºC y 45ºC, preferentemente durante 5 minutos a
42ºC.
Ensayo
6
El ADN (8.5 ng) se marcó mediante la
incorporación de biotina 11 dCTP. La reacción se lleva a cabo en un
volumen entre 10 y 100 \mul (preferentemente 30 \mul con 3
\mul de tampón de reacción de Taq 10X formado por: 160 mM
(NH_{4})_{2}
SO_{4} con 670 mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25ºC) y con 0.1% Tween 20; 0.75 \mul 25 mM MgCl_{2}; 5 \mul mix de dNTP marcado con biotina (compuesto por: 2 \mul 10 mM dATP, 2 \mul 10 mM dGTP, 2 \mul 10 mM dTTP, 1.92 \mul 10 mM dCTP y 0.8 \mul biotina 11 dCTP).
SO_{4} con 670 mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25ºC) y con 0.1% Tween 20; 0.75 \mul 25 mM MgCl_{2}; 5 \mul mix de dNTP marcado con biotina (compuesto por: 2 \mul 10 mM dATP, 2 \mul 10 mM dGTP, 2 \mul 10 mM dTTP, 1.92 \mul 10 mM dCTP y 0.8 \mul biotina 11 dCTP).
A continuación se seleccionaron los fragmentos
marcados con biotina mediante partículas o bolas magnéticas
cubiertas con estreptavidina, la cual es capaz de unirse con gran
afinidad a la biotina, pudiendo ser usada para la purificación de
moléculas marcadas con biotina.
Ensayo
7
En primer lugar hay que lavar las partículas
magnéticas con el doble de su volumen de una solución de TEN 100
formada por: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA y 100 mM NaCl a pH 7.5,
aplicando el imán y eliminando el sobrenadante cada vez que se
aplica este imán.
A continuación hay que resuspender las
partículas en un volumen igual al inicial de una solución TEN 200
(formada por: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA y 200 mM NaCl a pH
7.5).
Después se añade el control interno: 7,5 ng más
30 \mul del tratamiento de generación de muesca de traducción y
20 \mul de partículas lavadas.
El cuarto paso es incubar durante 30 minutos en
agitación constante a temperatura ambiente (18 a 25ºC).
A partir de este punto, hay que realizar
lavados, pero antes hay que tomar muestras para PCR.
Hay que lavar tres veces las partículas con 400
\mul de una solución TEN 1000 (formado por: 10 mM Tris HCl, 1 mM
EDTA y 1 M NaCl a pH 7.5) aplicando el imán y eliminando el
sobrenadante cada vez que se aplica.
El último paso es la resuspensión en 40 \mul
de H_{2}O y la toma de muestras para PCR.
Ensayo
8
Amplificación con PCR de producto seleccionado
usando oligos específicos:
| 5'gtaaaggagaagaacttt 3' | (SEQ 7) | |
| 5' ttatttgtatagttcatcca 3' | (SEQ 8) |
Los productos resultantes fueron analizados por
electroforésis en gel de agarosa al 1% en tampón TAE.
Ensayo
9
Los plásmidos se aislaron mediante métodos
estándar de minipreparación de plásmidos (se recogieron 2 ml de
cultivo crecido durante un intervalo entre 12 y 15 horas) en medio
selectivo, se centrifugaron y se resuspendieron en 100 \mul de
solución tamponadora (formada por: 50 mM glucosa, 25 mM Tris HCl
(pH=8) y 10 mM EDTA a pH=8), después se suplementaron con una
segunda solución tamponadora (compuesta por: 0.2 N NaOH y 1% SDS),
se mezclaron las soluciones y se suplementaron con una solución
tamponadora final (formada por: 3 M CH_{3}COOK y 11.5% ácido
acético).
Finalmente el ADN se extrajo mediante extracción
directa en medio fenol:cloroformo y se recuperó precipitando con
etanol).
Como resultado, aproximadamente 200 ng de ADN
plasmidico se marcaron, como en el ensayo 6, con Taq
ADN-polimerasa y tampón de Taq
ADN-polimerasa sustituidos por
ADN-polimerasa I de E. coli y tampón de
reacción de ADN-polimerasa I de E. coli
respectivamente y las condiciones de incubación modificadas a 30
minutos y 37ºC.
En la Figura 1 se muestra un ADN plasmídico
purificado que es un buen substrato para el marcaje por ADN "nick
translation".
En la mencionada figura 1 se aprecia, de
izquierda a derecha los carriles, que muestran lo siguiente:
- a)
- M: marcador \lambdaPst
- b)
- 1: PCR de una mezcla de los plásmidos A y B sin marcaje con biotina e identificación después de tres rondas de selección.
- c)
- 2: PCR de una mezcla de los plásmidos A y B sin marcaje con biotina e identificación después de seis rondas de selección.
- d)
- 3: PCR de una mezcla de los plásmidos A y B, donde A está marcado con biotina y B no está marcado, después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: PCR de una mezcla de los plásmidos A y B, donde A está marcado con biotina y B no está marcado, después de seis rondas de selección.
- f)
- 5: Control positivo de la PCR del plásmido A.
- g)
- 6: Control positivo de la PCR del plásmido B.
Ensayo
10
En la figura 2, se observa el marcaje del ADN
con Taq ADN-polimerasa que, aunque funciona a 37ºC,
es más eficiente a 50ºC.
El ADN sustrato se construyó como en el ensayo 1
y el molde se preparó como en el ensayo 3.
El ADN se marcó como en el ensayo 6, se
seleccionó como en el ensayo 7 y fue identificado como en el ensayo
8.
El resultado de este marcaje se muestra en la
Figura 2 en la que, de izquierda a derecha, se observa:
- a)
- M: marcador \lambdaPst
- b)
- 1: ADN marcado con biotina 11 dCTP usando Taq ADN-polimerasa a 37ºC durante 30 minutos. Control realizado antes de la selección.
- c)
- 2: ADN marcado con biotina 11 dCTP usando Taq ADN-polimerasa a 37ºC durante 30 minutos. Control realizado después de tres rondas de selección.
- d)
- 3: ADN marcado con biotina 11 dCTP usando Taq ADN-polimerasa a 50ºC durante 30 minutos. Control realizado antes de la selección.
- e)
- 4: ADN marcado con biotina 11 dCTP usando Taq ADN-polimerasa a 50ºC durante 30 minutos. Control realizado después de tres rondas de selección.
- f)
- 5: Control negativo de la PCR sin ADN.
Ensayo
11
El ADN sustrato se construyó como en el ensayo 1
y el molde se preparó como en el ensayo 3.
A continuación, el ADN se marcó con terminal
desoxinucleotidil transferasa formado por:
- a)
- 17 ng de ADN modelo,
- b)
- 1.5 \mul 1 mM Biotina 11 dCTP,
- c)
- 10 \mul 5X tampón de reacción de terminal transferasa (formado por: 1 M cacodilato potásico, 125 mM Tris, 0.05% Triton X 100 y 5 mM CoCl_{2} a pH 7.2 y a una temperatura de 25ºC),
- d)
- 40 U terminal desoxinucleotidil transferasa y,
- e)
- H_{2}O destilada hasta 50 \mul. durante 15 minutos a 37ºC.
El ADN obtenido se seleccionó como en el ensayo
7 y fue identificado como en el ensayo 8.
En la Figura 3 se muestra la eficiencia de la
desoxinucleotidil transferasa terminal que marca el ADN.
Este aspecto proporciona una alternativa para el
marcaje sin "nick translation".
En la figura 3 se observa de izquierda a derecha
lo siguiente:
- a)
- 1: Identificación del ADN antes de la selección.
- b)
- 2: Identificación del ADN modificado después de tres rondas de selección.
- c)
- 3: Control negativo de la PCR sin ADN.
- d)
- M: marcador \lambdaPst.
Ensayo
12
En la figura 4 se muestra la reparación con
ADN-ligasa que interfiere erróneamente con ADN
"nick translation".
El ADN sustrato se construyó como en el ensayo 1
y el molde se preparó como en el ensayo 3.
La reparación mediante T4 ADN ligasa se llevó a
cabo en un total de 340 ng de ADN modelo en una reacción con un
volumen de 20 \mul (2 \mul 10X tampón de reacción T4
ADN-ligasa (formado por: 400 mM
Tris-HCl, 100 mM MgCl_{2}, 100 mM DTT, 5 mM ATP a
pH 7.8 y a 25ºC), 5 U T4 ADN ligasa y H_{2}O destilada hasta un
volumen total de 20 \mul) durante 30 minutos a 37ºC.
El ADN se marcó como en el ensayo 6, se
seleccionó como en el ensayo 7 y fue identificado como en el ensayo
8.
Los nicks o muescas producidos en el ADN se
reparan con T4-ADN-ligasa. Aunque
la T4 ADN ligasa interfiere con el ADN nick translation. También se
vio que el nick translation substractivo (es decir un nick
translation inicial en el ADN, marcaje y eliminación de las
moléculas de ADN marcadas antes del reconocimiento de los
heterodúplex para quitar moléculas en las que se haya producido
anteriormente una muesca) y la reparación anterior al nick
translation no eran prácticos.
En la figura 4, se muestra de izquierda a
derecha:
- a)
- M: marcador \lambdaPst.
- b)
- 1: plásmido después de la reparación del nick e identificación antes de la selección.
- c)
- 2: plásmido sin reparar e identificación antes de la selección.
- d)
- 3: plásmido después de la reparación del nick e identificación después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: plásmido sin reparar e identificación después de tres rondas de selección.
- f)
- 5: plásmido después de la reparación del nick e identificación después de seis rondas de selección.
- g)
- 6: plásmido sin reparar e identificación después de seis rondas de selección.
- h)
- 7: plásmido después de la reparación del nick e identificación después de nueve rondas de selección.
- i)
- 8: plásmido sin reparar e identificación después de nueve rondas de selección.
- j)
- 9: plásmido después de la reparación del nick e identificación después de doce rondas de selección.
- k)
- 10: plásmido sin reparar e identificación después de doce rondas de selección.
Ensayo
13
En la figura 5 se observa cómo las actividades
exonucleasa y polimerasa pueden llevar al marcaje de los extremos
de ADN (es una figura que ilustra un modelo teórico).
La línea en negrita muestra el resultado de la
actividad ADN-polimerasa, es decir, indica el
marcaje por actividad ADN-polimerasa:
Ensayo
14
En la Figura 6 aparece el enmascaramiento del
daño en el ADN por nick translation con
ADN-polimerasa I de E. coli usando ddGTP que
minimiza el ruido de fondo en el ADN nick translation en ADN
plasmidico.
El ADN plasmidico se preparó como en el ensayo
9, se enmascaró como en el ensayo 4 con la excepción de que la Taq
ADN-polimerasa y el tampón de reacción de Taq
ADN-polimerasa fueron reemplazados por
ADN-polimerasa I de E. coli y el tampón de
reacción de ADN-polimerasa I de E. coli,
respectivamente, y la reacción fue llevada a cabo a 37ºC.
A continuación, se marcó como en el ensayo 9, se
seleccionó como en el ensayo 7 y fue identificado como en el ensayo
8.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Si se comparan dos condiciones experimentales;
por una parte se enmascara el ADN con ddGTP y se marca con biotina
11 dCTP, se selecciona e identifica y, por otra parte, es procesado
sin enmascaramiento.
Tal y como se muestra en la figura 6, claramente
el enmascaramiento reduce de forma drástica la cantidad del
marcaje llevada a cabo.
En la citada figura 6 se aprecia lo
siguiente:
- a)
- M: marcador \lambdaPst.
- b)
- 1: enmascaramiento con ddGTP e identificado antes de la selección.
- c)
- 2: sin enmascaramiento con ddGTP e identificado antes de la selección.
- d)
- 3: enmascaramiento con ddGTP e identificado después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: sin enmascaramiento con ddGTP e identificado después de tres rondas de selección.
- f)
- 5: control negativo de la identificación.
- g)
- 6: control positivo de la identificación.
- h)
- M: marcador \lambdaPst.
Ensayo
15
En la figura 7, se muestra como la
ADN-polimerasa I de E. coli marca
indiscriminadamente extremos romos en ADN lineal,
independientemente del pretratamiento con ddGTPs.
Los moldes de ADN se prepararon como en el
ensayo 1, el modelo se amplificó como en el ensayo 3, se enmascaró
como en el ensayo 4, se marcó como en el ensayo 9 (con la misma
cantidad de ADN que en el ensayo 6), se seleccionó como en el
ensayo 7, y fue identificado como en el ensayo 8.
Aquí se demuestra que la enzima
ADN-polimerasa I de E. coli lleva a cabo el
marcaje de moléculas de ADN sin importar que estas hayan sido o no
pretratadas con ddGTP.
En esta memoria se ha probado previamente cómo
el uso ADN-polimerasa I con ddGTPs en ADN circular
de plásmido (figura 6) provoca un enmascaramiento del daño en el
ADN.
El molde para la síntesis de ADN se produce por
la actividad exonucleasa 3' a 5' (ver figura 5 que refleja
consideraciones teóricas).
Por tanto, se necesita una
ADN-polimerasa sin actividad exonucleasa 3' a
5'.
En la siguiente figura 7, se observa lo
siguiente:
- a)
- M: marcador \lambdaPst.
- b)
- 1: ADN tratado con ddGTP, marcado con biotina e identificado antes de la selección.
- c)
- 2: ADN tratado con ddGTP, marcado con biotina e identificado antes de la selección.
- d)
- 3: ADN tratado con ddGTP, marcado con biotina e identificado antes de la selección.
- e)
- 4: ADN marcado con biotina e identificado antes de la selección.
- f)
- 5: ADN tratado con ddGTP, marcado con biotina e identificado después de tres rondas de selección.
- g)
- 6: ADN tratado con ddGTP, marcado con biotina e identificado después de tres rondas de selección.
- h)
- 7: ADN tratado con ddGTP, marcado con biotina e identificado después de tres rondas de selección.
- i)
- 8: ADN marcado con biotina e identificado después de tres rondas de selección.
- j)
- 9: control negativo de la identificación.
- k)
- 10: control positivo de la identificación.
- l)
- M: marcador \lambdaPst.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ensayo
16
En la figura 8 se muestra como el
enmascaramiento del daño en el ADN con ddGTP usando Taq
ADN-polimerasa minimiza el ruido de fondo en el ADN
"nick translation" en ADN lineal.
Los moldes de ADN se prepararon como en el
ensayo 1, el modelo se amplificó como en el ensayo 3, se enmascaró
el daño como en el ensayo 4, se marcó con biotina como en el ensayo
6, se seleccionó como en el ensayo 7, y fue identificado como en el
ensayo 8.
En este ensayo, se comparan dos condiciones
experimentales: por una parte se enmascara el ADN con ddGTP y se
marca con biotin 11 dCTP, se selecciona e identifica y, por otra
parte, el ADN es procesado sin enmascaramiento.
Claramente, el enmascaramiento reduce de forma
drástica la cantidad de modificación llevada a cabo.
Este aspecto se muestra en la figura 8, donde se
aprecia:
- a)
- M: marcador \lambdaPst.
- b)
- 1: ADN enmascarado con ddGTP e identificado antes de la selección.
- c)
- 2: ADN no enmascarado con ddGTP e identificado antes de la selección.
- d)
- 3: ADN enmascarado con ddGTP e identificado después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: ADN no enmascarado con ddGTP e identificado después de tres rondas de selección.
Ensayo
17
En la Figura 9 se muestra como el
enmascaramiento con ddGTP mediante Taq
ADN-polimerasa funciona óptimamente a 50ºC.
Los moldes de ADN se prepararon como en el
ensayo 1, el modelo se amplificó como en el ensayo 3, se enmascaró
como en el ensayo 4 (pero en un intervalo comprendido entre 50ºC y
60ºC, para probar la temperatura óptima de enmascaramiento), se
marcó como en el ensayo 6, se seleccionó como en el ensayo 7, y fue
identificado como en el ensayo 8.
En este ensayo se muestra como el
enmascaramiento con ddGTP llevado a cabo a 60ºC es menos eficiente
que a 50ºC. Teniendo en cuenta esta figura, juntamente con los
datos presentados en la figura 2, donde el ADN nick translation con
Taq ADN-polimerasa demostró ser inaceptablemente
lento a 37ºC, se toma 50ºC como la temperatura óptima a la cual
llevar a cabo el ADN nick translation mediado por Taq
ADN-polimerasa.
Teniendo en cuenta todo lo expuesto en este
ensayo, en la figura 9, se aprecia lo siguiente:
- a)
- M: marcador \lambdaPst.
- b)
- 1: ADN enmascarado con ddGTP reacción a 50ºC e identificación antes de la selección.
- c)
- 2: ADN enmascarado con ddGTP reacción a 60ºC e identificación antes de la selección.
- d)
- 3: ADN enmascarado con ddGTP reacción a 50ºC e identificación después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: ADN enmascarado con ddGTP reacción a 60ºC e identificación después de tres rondas de selección.
- f)
- 5: control negativo de PCR sin ADN.
- g)
- 6: control positivo de PCR.
- h)
- M: marcador \lambdaPst.
Ensayo
18
En la Figura 10 se muestran como los mismatch
(desapareamientos) en el ADN procesados por la nucleasa Mung bean
pueden ser detectados con SAMPAD.
Los moldes de ADN se prepararon como en el
ensayo 1 y 2, el modelo se amplificó como en el ensayo 3, se
enmascaró como en el ensayo 4, los heterodúplex de ADN fueron
reconocidos y modificados por la nucleasa Mung bean (compuesta por:
8.5 ng de ADN enmascarado en una reacción de 20 \mul de volumen
con 2 \mul tampón de reacción 10 X de nucleasa Mung bean (con 300
mM de acetato de sodio (a pH 4.6), 500 mM cloruro de sodio, 10 mM
acetato de zinc y 0.1% Triton X 100) 50U de nucleasa Mung bean, 15
minutos a 37ºC), se marcó como en el ensayo 6, se seleccionó como
en el ensayo 7, y fue identificado como en el ensayo 8.
El ADN tratado con nucleasa se marcó con biotina
sin purificación.
En la Figura 10, se muestra de izquierda a
derecha:
- a)
- 1: ADN normal o apareado (match) tratado con nucleasa Mung bean e identificación antes de la selección.
- b)
- 2: ADN desapareado (mismatch) tratado con nucleasa Mung bean e identificación antes de la selección.
- c)
- 3: control de la eficiencia de ADN "nick translation" e identificación antes de la selección.
- d)
- 4: ADN normal o apareado (match) tratado con nucleasa Mung bean e identificación después de tres rondas de selección.
- e)
- 5: ADN desapareado (mismatch) tratado con nucleasa Mung bean e identificación después de tres rondas de selección.
- f)
- 6: control de la eficiencia de ADN nick translation e identificación después de tres rondas de selección.
- g)
- 7: control negativo de PCR sin ADN.
- h)
- 8: control positivo de PCR.
- i)
- M: M: marcador \lambdaPst.
Ensayo
19
En la Figura 11 se muestran bajos niveles de
nucleasa SURVEYOR^{TM} para el reconocimiento de
desapareamientos, modificación y tiempos cortos de incubación (un
intervalo entre 2 y 7 minutos) que permiten atrapar eficientemente
moléculas de ADN con nicks (muescas).
Los moldes de ADN se prepararon como en los
ensayos 1 y 2, el modelo se preparó como en el ensayo 3, se
enmascaró como en el ensayo 4, las estructuras heterodúplex de ADN
fueron identificadas como en el ensayo 5 (con la excepción de la
variación en la concentración utilizada de nucleasa SURVEYOR^{TM},
es decir 0.1 \mul de nucleasa por reacción, 5 minutos de
incubación a 42ºC) se purificó como se mostrará en el ensayo 20, se
marcó como en el ensayo 6, se seleccionó como en el ensayo 7, y fue
identificado como en el ensayo 8.
El reconocimiento con SURVEYOR^{TM} nucleasa
(un miembro de la familia de mismatch endonucleasas Cel I,
SURVEYOR^{TM} es el nombre comercial usado por la empresa
TRANSGENOMIC) y la modificación como se utiliza rutinariamente en
aplicaciones de biología molecular (1 \mul SURVEYOR^{TM}
nucleasa por reacción, incubación de 20 minutos a 42ºC) esta
diseñado para maximizar la eficiencia del corte total en las dos
cadenas de ADN.
De este modo se demuestra que con un tiempo de
incubación más corto y una concentración menor de
SURVEYOR^{TM} nucleasa (0.1 \mul de nucleasa por reacción, 5 minutos de incubación a 42ºC) se pueden atrapar moléculas con un nick en una de las dos cadenas de ADN (que pueden ser procesadas por ADN nick translation).
SURVEYOR^{TM} nucleasa (0.1 \mul de nucleasa por reacción, 5 minutos de incubación a 42ºC) se pueden atrapar moléculas con un nick en una de las dos cadenas de ADN (que pueden ser procesadas por ADN nick translation).
También queda demostrado que el uso de la mitad
de la concentración normal de SURVEYOR^{TM} nucleasa para
detección de mutaciones con electrofóresis estándar (0.5 unidades
de SURVEYOR^{TM} nucleasa por reacción y 5 minutos de incubación
a 42ºC) no permite la acción de atrapar moléculas con un nick en
una de las dos cadenas de ADN.
La purificación del ADN después del tratamiento
con SURVEYOR^{TM} nucleasa se llevó a cabo usando columnas de
centrifugación.
Teniendo en cuenta lo expuesto en este ensayo
19, en la figura 11 se aprecia lo siguiente:
- a)
- M: marcador, \lambdaPst
- b)
- 1: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch), 0.5 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado antes de la selección.
- c)
- 2: 50% ADN normal o normal o apareado (match), 50% ADN desapareado (mismatch), 0.5 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado antes de la selección.
- d)
- 3: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch), 0.5 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: 50% ADN normal o apareado (match), 50% ADN desapareado (mismatch), 0.5 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado después de tres rondas de selección.
- f)
- 5: control negativo de PCR sin ADN
- g)
- 6: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch), 0.1 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado antes de la selección.
- h)
- 7: 50% ADN normal o apareado (match), 50% ADN desapareado (mismatch), 0.1 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado antes de la selección.
- i)
- 8: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch), 0.1 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado después de tres rondas de selección.
- j)
- 9: 50% ADN normal o apareado (match), 50% ADN desapareado (mismatch), 0.1 \mul SURVEYOR^{TM} e identificado después de tres rondas de selección.
Ensayo
20
Los moldes de ADN se prepararon como en el
ensayo 1, el modelo se preparó como en el ensayo 3, se enmascaró
como en el ensayo 4, el ADN se procesó precipitación convencional
con etanol, se marcó como en el ensayo 6, se seleccionó como en el
ensayo 7, y fue identificado como en el ensayo 8.
Las condiciones de reacción de SURVEYOR^{TM}
inhiben completamente la actividad de la Taq
ADN-polimerasa.
Las condiciones de reacción de Nucleasa Mung
bean inhiben severamente la actividad de la Taq
ADN-polimerasa. Por ello, se han buscado métodos
adecuados para cambiar las condiciones de reacción, y obtener un
ensayo funcional.
En este ensayo se comprueba el efecto que tiene
la precipitación estándar con etanol en los niveles de
modificación del ruido de fondo del nick translation en ADN después
del enmascaramiento con ddGTP.
La precipitación con etanol causa un daño tal en
el ADN que los beneficios del enmascaramiento con ddGTP
desaparecen.
En la figura 1 figura se muestra:
- a)
- M: marcador \lambdaPst
- b)
- 1,2: ADN enmascarado con ddGTP y precipitado con etanol antes de la modificación e identificado antes de la selección.
- c)
- 3,4: ADN precipitado con etanol antes de la modificación e identificado antes de la selección.
- d)
- 5,6: ADN enmascarado con ddGTP y precipitado con etanol antes de la modificación e identificación después de tres rondas de selección
- e)
- 7,8: ADN precipitado con etanol antes de la modificación e identificación después de tres rondas de selección.
Ensayo
21
Para conseguir un proceso de purificación de ADN
menos dañino, los moldes de ADN se prepararon como en el ensayo 1,
el modelo se preparó como en el ensayo 3, se enmascaró como en el
ensayo 4, el ADN se purificó mediante columnas estándar de
purificación por centrifugación de Millipore Montage, se marcó como
en el ensayo 6, se seleccionó como en el ensayo 7, y fue
identificado como en el ensayo 8.
En la Figura 13 se observa la purificación por
columna de centrifugación después del enmascaramiento con ddGTP que
hace que haya una baja modificación del ruido de fondo.
Aquí se demuestra que la purificación de ADN por
columna de centrifugación es un método poco agresivo que no causa
daño en el ADN y por consiguiente, es el método utilizado en
SAMPAD.
En la figura 13 se aprecia, de izquierda a
derecha, lo siguiente:
- a)
- M: marcador, \lambdaPst
- b)
- 1: ADN enmascarado con ddGTP, purificado por columna de centrifugación e identificación antes de la selección.
- c)
- 2: ADN purificado por columna de centrifugación e identificación antes de la selección.
- d)
- 3: ADN enmascarado con ddGTP, purificado por columna de centrifugación e identificación después de tres rondas de selección.
- e)
- 4: ADN purificado por columna de centrifugación e identificación después de tres rondas de selección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
22
En la Figura 14 se aprecia, teniendo en cuenta
todos los parámetros expuestos en las figuras anteriores, cómo se
pueden detectar eficientemente mutaciones con SAMPAD.
Los moldes de ADN se prepararon como en los
ensayos 1 y 2, el modelo se preparó como en el ensayo 3, se
enmascaró como en el ensayo 4, las estructuras heterodúplex se
identificaron como en el ensayo 5, se purificaron como en el ensayo
20, se marcaron como en el ensayo 6, se seleccionaron como en el
ensayo 7, y fueron identificadas como en el ensayo 8.
De este modo, se demuestra gracias al presente
ensayo, que es posible eliminar eficientemente el ruido de fondo no
deseado y detectar al menos una molécula mutante por 255 normales
aplicando SAMPAD en las condiciones apuntadas anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- Teniendo en cuenta todo lo expuesto en el presente ensayo, en la figura 14 se aprecia, de izquierda a derecha, lo siguiente:
- b)
- M: marcador \lambdaPst.
- c)
- 1: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch) e identificado antes de la selección.
- d)
- 2: 99.2% ADN normal o apareado (match), 0.8% ADN desapareado (mismatch) e identificado antes de la selección.
- e)
- 3: 99.6% ADN normal o apareado (match), 0.4% ADN desapareado (mismatch) e identificado antes de la selección.
- f)
- 4: Control positivo del ADN nick translation con biotina sin tratamiento físico e identificado antes de la selección.
- g)
- 5: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch) e identificado después de tres rondas de selección.
- h)
- 6: 99.2% ADN normal o apareado (match), 0.8% ADN desapareado (mismatch) e identificado después de tres rondas de selección.
- i)
- 7: 99.6% ADN normal o apareado (match), 0.4% ADN desapareado (mismatch) e identificado después de tres rondas de selección.
- j)
- 8: Control positivo del ADN nick translation con biotina sin tratamiento físico e identificado después de tres rondas de selección.
- k)
- 9: control interno de numero 1.
- l)
- 10: control interno de numero 2.
- m)
- 11: control interno de numero 3.
- n)
- 12: control interno de numero 4.
- o)
- 13: control interno de numero 5.
- p)
- 14: control interno de numero 6.
- q)
- 15: control interno de numero 7.
- r)
- 16: control interno de numero 8.
\newpage
Ensayo
23
El producto de SAMPAD ha sido purificado y
secuenciado directamente (sin clonación previa del producto de
PCR). Los substratos de ADN se prepararon como en el ensayo 1 y 2,
el molde se preparó como en el ensayo 3, se enmascaró como en el
ensayo 4, las estructuras heterodúplex se identificaron como en el
ensayo 5, se purificaron como en el ensayo 20, se marcaron como en
el ensayo 6, se seleccionaron como en el ensayo 7, y fueron
identificadas como en el ensayo 8 con la excepción de que se usaron
los cebadores específicos del ensayo 1.
Los productos de identificación fueron
secuenciados directamente con uno de los dos cebadores de
amplificación usando el Kit "BigDYE" desarrollado por Applied
Biosystems. Las secuencias fueron determinadas con una maquina de
secuenciación automática.
Esta posibilidad representa un claro beneficio
sobre la metodología representada por Makrigiorgos
[Makrigiorgos, Gerrasimos M., Methods for rapid screening of
polymorphisms, mutations and methylation, Solicitud de patente en
Estados Unidos US20030022215], que permitía la amplificación
del fragmento directamente flanqueando a la mutación, pero que
pierde la información sobre la identidad de la mutación mismo, ya
que ésta no está presente en el producto de amplificación. También
se mejora el potencial del método presentado por Yeung, que permite
determinar la posición de la mutación (ver reivindicación 7 o 8 de
la solicitud PCT/US97/08705), pero no la identidad de la
mutación.
Ensayo
24
El procedimiento desarrollado en la presente
invención tiene una segunda aplicación industrial.
Este procedimiento también se utiliza para
identificar variaciones entre diferentes cepas de levaduras de la
misma especie.
Se ha preparado ADN genómico de la cepa de
levadura 1 y la cepa de levadura 2, ambos pertenecientes a la misma
especie: Saccharomyces cerevisae.
El ADN ha sido previamente digerido usando las
enzimas de restricción SacI (de Fermentas) y MseI (de New England
Biolabs).
Se ha partido de 1 \mug de ADN y se ha
digerido con 1.5 \mul de SacI(10 u/\mul) añadiendo 4
\mul de tampón SacI+ (de Fermentas) en un volumen final de 40
\mul.
A continuación se ha digerido con 1.5 \mul
MseI, con 4 \mul de tampón NEB2 y 0.5 \mul de tampón BSA (los
dos de New England Biolabs).
Una vez digeridos los fragmentos, se ligan con
0.5 \mul de T4 ligasa (de Fermentas) con 5 \mul de x10 T4
tampón ligasa con adaptadores de ADN sintético compatibles con los
sitios de restricción de MseI o SacI en un volumen final de 50
\mul.
El adaptador compatible con SacI es:
| 5' ctcgtagactgcgtacaagctc 3' | (SEQ 9) | |
| 3' catctgacgcatgt 5' | (SEQ 10) |
\vskip1.000000\baselineskip
El adaptador compatible con MseI es:
| 5' gacgatgagtcctgagtaa 3' | (SEQ 11) | |
| 3' tactcaggactcat 5' | (SEQ 12) |
El adaptador especifico para el sitio de
restricción SacI estaba biotinilado.
Seguidamente se seleccionaron fragmentos del
genoma biotinilados como en el ensayo 7.
Llegado este punto se amplifica el ADN
seleccionado como en el ensayo 8, pero usando los cebadores (5'
ctcgta
gactgcgtacaaqctc 3' (SEQ 13)) y (5' gacgatgagtcctgagtaa 3' (SEQ 14)) y Pfu-polimerasa (de Fermentas).
gactgcgtacaaqctc 3' (SEQ 13)) y (5' gacgatgagtcctgagtaa 3' (SEQ 14)) y Pfu-polimerasa (de Fermentas).
A los productos de la amplificación de la cepa 1
y a una mezcla de los productos de amplificación de las cepas 1 y 2
se les añade el molde amplificado como en el ensayo 3, a partir
del substrato de los ensayos 1 y 2, generando molde 1 (apareado) y
molde 2 (desapareado), respectivamente.
Este es el material de partida para la detección
de diferencias entre las dos cepas.
Por tanto, el molde 1 sirve para determinar si
una mezcla compleja de ADN eleva el ruido de fondo de forma
inaceptable y, el molde 2 sirve para determinar si SAMPAD funciona
en una mezcla compleja de ADN.
SAMPAD es llevado a cabo con estas muestras de
ADN como en el ensayo 20. Y tal y como se ilustra en la figura 16,
se demuestra que el ADN complejo no interfiere con SAMPAD.
Para determinar si las moléculas heterodúplex
pueden ser identificadas dentro de una mezcla compleja de ADN se
procede a resuspender las partículas magnéticas en 10 \mul de
H_{2}O destilada, y se utiliza 1 \mul de la en una reacción de
35 ciclos de PCR, como en ensayo 3, pero con los cebadores
biotinilados (5' ctcgtagactgcgtacaagctc 3' (SEQ 13)) y (5'
gacgatgagtcctgagtaa 3' (SEQ 14)), generando de esta forma productos
de PCR 1 (derivado de cepa 1) y producto de PCR 2 (derivado de la
mezcla de las dos cepas).
Los productos PCR 1 y PCR 2 se precipitaron como
en ensayo 20 y se resuspendieron tampón de hibridación de ADN
(formado por: 1x MES, 200 \mul/ml de ADN de esperma de arenque y
1 mg/ml de albúmina sérica bovina) y se incubaron durante 10
minutos a 95ºC.
Las dos mezclas de hibridación a su vez se
hibridaron durante un intervalo de 12 a 16 horas con un chip de
oligos de ADN, que contenía oligos de ADN capaces de reconocer los
diferentes fragmentos de digestión con sitio de restricción SacI,
presentes en el genoma de la levadura.
La comparación de fragmentos presentes en la
muestra hibridada derivada de la cepa 1 versus la muestra derivada
de la mezcla de las dos cepas, por tanto revela fragmentos
presentes sólo en la muestra 2 que son ilustraciones de secuencias
diferenciales entre las dos cepas.
En la Figura 14, se aprecia lo explicado en el
ensayo 24, de tal forma que ilustra lo siguiente observado de
izquierda a derecha:
- a)
- M: marcador \lambdaPst
- b)
- 1: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch) con ADN genómico apareado de levadura e identificado antes de la selección.
- c)
- 2: 50% ADN normal o apareado (match), 50% ADN desapareado (mismatch) con ADN genómico desapareado (mismatched) de levadura e identificado antes de la selección.
- d)
- 3: Control positivo del ADN nick translation con biotina e identificado antes de la selección.
- e)
- 4: 100% ADN normal o apareado (match), 0% ADN desapareado (mismatch) con ADN genómico apareado de levadura e identificado después de tres rondas de selección.
- f)
- 5: 50% ADN normal o apareado (match), 50% ADN desapareado (mismatch) con ADN genómico desapareado de levadura e identificado después de tres rondas de selección.
- g)
- 6: Control positivo del ADN nick translation con biotina e identificado después de tres rondas de selección.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> ORYZON GENOMICS, S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR
SELECTIVAMENTE ÁCIDOS NUCLEICOS CON ESTRUCTURAS ATÍPICAS
CONVERTIBLES EN MUESCAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P00000757/2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
- - - - - - - - - - - -
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-04-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia positiva superior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgtcgcgc gcgcgatata tggggggta
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia positiva inferior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgcgcgcg ctatataccc cccatgtac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia negativa superior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgtcgcgc gcgcgatata ttaggggggt a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia negativa inferior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgcgcgcg ctatataatc cccccatgta c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia M13 forward
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia M13 reverse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de identificación
forward
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaggaga agaacttt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de identificación
reverse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatttgtat agttcatcca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia SaCI adaptador
superior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtacaagc tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia SaCI adaptador
inferior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatctgacgc atgt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia MseI adaptador
superior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgatgagt cctgagtaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia MseI adaptador
inferior
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactcaggac tcat
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia
ADAPT-SaCI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtacaagc tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia
ADAPT-MseI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgatgagt cctgagtaa
\hfill19
Claims (47)
1. Procedimiento para detectar selectivamente
ácidos nucleicos (AN) con estructuras atípicas convertibles en
muescas de AN, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- preparación de una población molde de AN con estructuras atípicas;
- b)
- protección de sitios reactivos en el AN no deseados, mediante la incorporación de grupos protectores compatibles con el AN.
- c)
- reconocimiento y modificación de moléculas de AN con estructuras atípicas;
- d)
- marcaje del AN modificado;
- e)
- selección de fragmentos de AN marcados;
- f)
- identificación de fragmentos de AN seleccionados.
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque las estructuras atípicas convertibles
en muescas de AN son heterodúplex de AN.
3. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque las estructuras atípicas convertibles
en muescas de AN son daños en las moléculas de AN.
4. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque la mencionada etapa b) consiste en el
bloqueo y enmascaramiento de los extremos de AN y del daño en las
moléculas de AN mediante la incorporación de grupos protectores
análogos de nucleótidos en una reacción enzimática.
5. Procedimiento según la reivindicación 4
caracterizado porque la mencionada etapa b) consiste en la
incorporación de didesoxinucleótidos en una reacción
enzimática.
6. Procedimiento según la reivindicación 5
caracterizado porque los didesoxinucleótidos incorporados
son preferentemente ddGTP (didesoxiguanosina trifosfato).
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque en la
incorporación de grupos protectores análogos de nucleótidos se
utiliza una enzima ADN terminal transferasa.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque en la
incorporación de grupos protectores análogos de nucleótidos se
utiliza una enzima ADN-polimerasa sin actividad
3'-5'exonucleasa.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque en la
incorporación de grupos protectores análogos de nucleótidos se
utiliza una combinación de enzimas con actividad
ADN-polimerasa sin actividad
3'-5'exonucleasa.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque en la
incorporación de grupos protectores análogos de nucleótidos se
utiliza Taq ADN-polimerasa.
11. Procedimiento según reivindicación 4
caracterizado porque el bloqueo y enmascaramiento de los
extremos de AN y del daño en las moléculas de AN se realiza en un
intervalo de temperatura entre 37 y 60ºC.
12. Procedimiento según reivindicación 11
caracterizado porque el bloqueo y enmascaramiento de los
extremos de AN y del daño en las moléculas de AN se realiza en un
intervalo preferente de temperatura entre 45 y 55ºC.
13. Procedimiento según reivindicación 4
caracterizado porque el bloqueo y enmascaramiento de los
extremos de AN y del daño en las moléculas de AN se realiza en un
intervalo de tiempo entre 30 minutos y 18 horas.
14. Procedimiento según reivindicación 13
caracterizado porque bloqueo y enmascaramiento de los
extremos de AN y del daño en las moléculas de AN se realiza en un
intervalo preferente de tiempo entre 60 y 120 minutos.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 y 4 a 14 caracterizado porque el
reconocimiento y modificación de moléculas de AN en forma de
heterodúplex se realiza mediante una reacción enzimática.
16. Procedimiento según reivindicación 15
caracterizado porque el reconocimiento y modificación de
moléculas de AN en forma de heterodúplex se realiza mediante enzimas
endonuleasas de desapareamiento.
\newpage
17. Procedimiento según reivindicación 15
caracterizado porque el reconocimiento y modificación de
moléculas de AN en forma de heterodúplex con endonucleasas de
desapareamiento se realiza en un intervalo de tiempo de incubación
del enzima entre 2 y 7 minutos.
18. Procedimiento según reivindicación 15
caracterizado porque el reconocimiento y modificación de
moléculas de AN en forma de heterodúplex con endonucleasas de
desapareamiento se realiza en un intervalo de temperatura de
incubación del enzima entre 37ºC y 45ºC.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 y 4 a 14 caracterizado porque el
reconocimiento y modificación de moléculas de AN en forma de
heterodúplex se realiza mediante una reacción química.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 caracterizado el reconocimiento y
modificación de moléculas de AN con AN dañado se realiza mediante
una reacción enzimática.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3 caracterizado porque el
reconocimiento y modificación de moléculas de AN con AN dañado se
realiza mediante una reacción química.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21 caracterizado porque el marcaje se
lleva a cabo con una ADN-polimerasa.
23. Procedimiento según reivindicación 22
caracterizado porque el marcaje se lleva a cabo con Taq
ADN-polimerasa.
24. Procedimiento según reivindicación 1 a 21
caracterizado porque el marcaje se lleva a cabo con una
enzima ADN terminal transferasa.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24 caracterizado porque el marcaje de
los componentes incorporados se realiza preferentemente con
biotina.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25 caracterizado porque la selección de
fragmentos de AN marcados se realiza mediante partículas magnéticas
cubiertas de estreptavidina.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26 caracterizado porque la
identificación de fragmentos de AN marcado y seleccionado se
realiza mediante PCR.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos es ARN.
29. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos es ADN.
30. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos es una estructura diferente de
AN naturales diseñada para interaccionar con estructuras AN
naturales.
31. Procedimiento según reivindicación 30
caracterizado porque la población molde utilizada diferente
de AN naturales diseñada para interaccionar con estructuras AN
naturales es preferentemente APN (Ácido peptidonucléico).
32. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos es cualquier combinación de
ADN, ARN y cualquier estructura diferente de AN naturales diseñada
para interaccionar con estructuras de AN naturales.
33. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque el origen de la
población molde utilizada de ácidos nucleicos es eucariota.
34. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque el origen de la
población molde utilizada de ácidos nucleicos es procariota.
35. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque el origen de la
población molde utilizada de ácidos nucleicos es viral.
36. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque el origen de la
población molde utilizada de ácidos nucleicos es plasmídico.
37. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 caracterizado porque el origen de la
población molde utilizada de ácidos nucleicos es cualquier
combinación de eucariota, procariota, viral y plasmídico.
38. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos se obtiene por extracción
directa.
39. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos se obtiene por amplificación
in vitro.
40. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37 caracterizado porque la población
molde utilizada de ácidos nucleicos se genera sintéticamente.
41. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de detección selectiva de
ácidos nucleicos con estructuras atípicas convertibles en muescas
de AN.
42. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de identificación de
variaciones o diferencias en secuencias de AN entre diferentes
variantes de una misma especie.
43. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de identificación de
variaciones o diferencias en secuencias de AN entre células de un
mismo individuo.
44. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de identificación de
mutaciones de en genes de interés en individuos de una misma
población de AN.
45. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de identificación de
mutaciones en genes de interés en células de un mismo
individuo.
46. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de detección de daño de
ADN en secuencias genéticas de interés.
47. Uso del procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 40 en procesos de detección de daño de
ADN a nivel genómico.
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