ES2842938T3 - Composiciones y métodos para la modulación del empalme de IKBKAP - Google Patents

Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 10 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 34801 a 34828 de SEQ ID NO:1, en el que el oligonucleótido modificado comprende en al menos un nucleósido modificado, en el que el al menos un nucleósido modificado comprende una unidad estructural de azúcar modificada, y en el que el compuesto es capaz de aumentar la inclusión del exón 20 en un transcrito IKBKAP en una célula.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la modulación del empalme de IKBKAP

Antecedentes

Las moléculas de ARNm eucariotas recién sintetizadas, también conocidas como transcritos primarios o pre-ARNm, elaborados en el núcleo, se procesan antes o durante el transporte al citoplasma para su traducción. El procesamiento de los pre-ARNm incluye la adición de un casquete metilado en 5' y una cola de poli(A) de aproximadamente 200-250 bases en el extremo 3' del transcrito.

Otra etapa en el procesamiento del ARNm es el empalme del pre-ARNm, que se produce en la maduración del 90­ 95 % de los ARNm de mamíferos. Los intrones (o secuencias intermedias) son regiones de un transcrito primario (o el ADN que lo codifica) que no están incluidas en la secuencia codificante del ARNm maduro. Los exones son regiones de un transcrito primario que permanecen en el ARNm maduro cuando llega al citoplasma. Los exones se empalman para formar la secuencia de ARNm madura. Las uniones de empalme también se conocen como sitios de empalme con la unión en el lado 5' del intrón a menudo llamado "sitio de empalme 5'" o "sitio donante de empalme" y la unión en el lado 3' del intrón se llama “sitio de empalme 3'" o "sitio aceptor de empalme". En el empalme, el extremo 3' de un exón corriente arriba se une al extremo 5' del exón aguas abajo. De este modo, el ARN sin empalmar (o pre-ARNm) tiene una unión exón/intrón en el extremo 5' de un intrón y una unión intrón/exón en el extremo 3' de un intrón. Una vez que se elimina el intrón, los exones son contiguos en lo que a veces se denomina unión o límite exón/exón en el ARNm maduro. Los sitios de empalme críptico son aquellos que no se usan en el pre-ARNm de tipo salvaje, pero se pueden usar cuando el sitio de empalme natural está inactivado o debilitado por una mutación, o junto con una mutación que crea un nuevo sitio de empalme en otra parte en el pre-ARNm. El empalme alternativo, definido como el empalme de diferentes combinaciones de exones o segmentos de exones, a menudo da como resultado múltiples transcritos de ARNm maduro expresadas a partir de un solo gen.

Hasta el 50 % de las enfermedades genéticas humanas que resultan de una mutación puntual son causadas por un empalme aberrante. Tales mutaciones puntuales pueden interrumpir un sitio de empalme actual o crear un nuevo sitio de empalme, dando como resultado transcritos de ARNm que comprenden una combinación diferente de exones o con deleciones en exones. Las mutaciones puntuales también pueden resultar en la activación de un (os) sitio (s) de empalme críptico, interrumpir un sitio de ramificación (que funciona durante una etapa intermedia en la catálisis de empalme) o interrumpir elementos cis reguladores (esto es, potenciadores de empalme o silenciadores, que se pueden crear, destruir, reforzado o debilitado por mutación) (Cartegni et al., Nat. Rev. Genet., 2002, 3, 285­ 298; Crawczak et al., Hum. Genet., 1992, 90, 41-54).

Se han usado oligonucleótidos antisentido para apuntar a mutaciones que conducen a empalmes aberrantes en varias enfermedades genéticas con el fin de redirigir el empalme para dar un producto de empalme (Kole, Acta Biochimica Polonica, 1997, 44, 231-238). Tales enfermedades incluyen p-talasemia (Dominski and Kole, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 8673-8677; Sierakowska et al., Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1173-1182; Sierakowska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 12840-44; Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 9591-9596); distrofia de Kobe (Takeshima et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 515-520); Distrofia muscular de Duchenne (Dunckley et al. Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1665-1668; Dunckley et al. Human Mol. Genetics, 1998, 5, 1083-90); osteogénesis imperfecta (Wang and Marini, J. Clin Invest., 1996, 97, 448-454); y fibrosis quística (Friedman et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 36193-36199).

También se han usado compuestos antisentido para alterar la proporción de las formas larga y corta de pre-ARNm de Bcl-x (Patente de los Estados Unidos 6,172,216; Patente de los Estados Unidos 6,214,986; Taylor et al., Nat. Biotechnol. 1999, 17, 1097-1100) o para forzar la omisión de exones específicos que contienen codones de terminación prematura (Wilton et al., Neuromuscul. Disord., 1999, 9, 330-338). La Patente de los Estados Unidos 5,627,274 y el documento WO 94/26887 describen composiciones y métodos para combatir el empalme aberrante en una molécula de pre-ARNm que contiene una mutación usando oligonucleótidos antisentido que no activan la RNasa H.

También se han usado compuestos antisentido dirigidos a elementos inhibidores del empalme en exones o sus intrones flanqueantes para aumentar el uso de tales exones durante el empalme, por ejemplo, en el contexto de atrofia muscular espinal (Cartegni Nat Struct Biol; Imaizumi; Hua PLoS Biol; Singh; otros artículos de Hua et al, etc.). La disautonomía familiar (FD), un trastorno genético raro que se encuentra casi exclusivamente en la población judía asquenazí, es una afección autosómica recesiva causada por una única mutación puntual intrónica en el intrón 20 (IVS20+6T^C) del gen IKBKAP. (Maayan, C., Kaplan, E., Shachar, S., Peleg, O., and Godfrey, S. 1987, "Incidence of familial dysautonomia in Israel 1977-1981," Clin Genet 32:106-108; Slaugenhaupt, S.A., and Gusella, J.F. 2002, "Familial dysautonomia," Curr Opin Genet Dev 12:307-311; Anderson, S.L., Coli, R., Daly, I.W., Kichula, E.A., Rork, M.J., Volpi, S.A., Ekstein, J., and Rubin, B.Y. 2001, "Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene," Am J Hum Genet 68:753-758). La FD, también conocida como síndrome de Riley-Day y neuropatía autónoma sensorial hereditaria tipo III (HSAN-III), se caracteriza por un desarrollo deficiente y una degeneración progresiva de las neuronas sensoriales y autónomas. Los síntomas notables incluyen anhidrosis, disminución del gusto, reflejos tendinosos profundos deprimidos, hipotensión postural, pérdida de la percepción del dolor y la temperatura, alacrima, reflujo gastroesofágico y escoliosis (Axelrod, F.B., and Simson, G.G.V. 2007 "Hereditary sensory and autonomic neuropathies: types II, III, and IV", Orphanet Journal of Rare Diseases 2:). La extensión y la gravedad de los síntomas varían entre los pacientes, pero incluso con un tratamiento avanzado, la enfermedad conduce a una muerte prematura, y solo la mitad de los pacientes sobreviven hasta los 40 años.

La tecnología antisentido es un medio eficaz para modular la expresión de uno o más productos génicos específicos, incluidos productos de empalme alternativos, y es especialmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación. El principio detrás de la tecnología antisentido es que un compuesto antisentido, que se hibrida con un ácido nucleico diana, modula las actividades de expresión génica, tal como la transcripción, el empalme o la traducción, a través de uno de un número de mecanismos antisentido. La especificidad de secuencia de los compuestos antisentido los hace extremadamente atractivos como herramientas para la validación de la diana y la funcionalización de genes, así como también como agentes terapéuticos para modular selectivamente la expresión de genes implicados en enfermedades.

Nótese que: el documento WO2008051604 describe métodos para determinar si un sujeto porta una mutación genética asociada a una enfermedad común en poblaciones judías; el documento EP1225232 describe un método para detectar la presencia en un sujeto de un polimorfismo ligado a un gen asociado con disautonomía familiar; El documento US2006069045 describe métodos de modulación del empalme de ARNm en una célula o individuo normal o enfermo; el documento US2011201679 describe métodos para elevar la expresión del gen IKBKAP y el nivel de proteína IKAP funcional en células; Keren et al (2010) describen que la fosfatidilserina aumenta los niveles de IKBkAp en las células de disautonomía familiar (PLoS o Ne 5 (12): e15884); y Dong et al (2002) describen la detección de las mutaciones y frecuencias de IKBKAP IVS20+6T^C y R696P entre judíos Ashkenazi (American J. Medical Genetics, vol. 110, no. 3, páginas 253 - 257).

Sumario

La invención reivindicada proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 10 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 34801 a 34828 de SEQ ID NO:1, en el que el oligonucleótido modificado comprende al menos un nucleósido modificado y en el que al menos un nucleósido modificado comprende una unidad estructural de azúcar modificada, en el que el compuesto es capaz de aumentar la inclusión del exón 20 en un transcrito IKBKAP en una célula. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto reivindicado y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, un método in vitro de modulación del empalme en una transcrito de IKBKAP en una célula que comprende poner en contacto la célula con un compuesto reivindicado o una composición reivindicada, un compuesto o composición reivindicados para su uso en un método para aumentar la inclusión del exón 20 en un transcrito IKBKAP, y un compuesto o composición reivindicados para su uso en el tratamiento de la disautonomía familiar.

Las realizaciones preferidas de la invención reivindicada se establecen en las reivindicaciones dependientes adjuntas. Otras realizaciones preferidas incluyen aquellas en las que la secuencia de nucleobase comprende al menos 11 (tales como al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18) de dichas nucleobases contiguas, y/o en el que el oligonucleótido modificado comprende al menos dos nucleósidos modificados que comprenden unidades estructurales de azúcar modificadas (que son iguales entre sí o diferentes entre sí) o en el que cada nucleósido del oligonucleótido modificado es un nucleósido modificado y cada nucleósido modificado comprende la misma modificación (preferiblemente en el que los nucleósidos modificados comprenden cada uno la misma unidad estructural de azúcar sustituida por 2', preferiblemente seleccionado entre 2'-F, 2'-OMe y (preferiblemente) 2'-MOE), y/o en el que las nucleobases contiguas son complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 34801 a 34826 o 34802 a 34821 de SEQ ID NO:1.

Además, se describe la siguiente tecnología, en la que el término "realización" no debe interpretarse como tal como una realización de la invención reivindicada (que se establece en las reivindicaciones adjuntas).

Se describen oligonucleótidos que son complementarios a un transcrito IKBKAP. Opcionalmente, el oligonucleótido es complementario de una región diana del transcrito IKBKAP que comprende el exón 20, el intrón 19 y el intrón 20. Opcionalmente, el transcrito IKBKAP comprende una mutación que da como resultado un sitio de empalme aberrante. Opcionalmente, el transcrito de IKBKAP comprende una mutación que da como resultado la exclusión del exón 20 del ARNm de IKBKAP maduro. Opcionalmente, los oligonucleótidos inhiben el empalme aberrante de un transcrito de IKBKAP mutante. Opcionalmente, se incrementa el empalme normal del transcrito de IKBKAP. Opcionalmente, se incrementa la proteína IKAP funcional que tiene el exón 20. Opcionalmente, se incrementa la proteína IKAP funcional que tiene los exones 20-37.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-D. Estas cifras ilustran los niveles de inclusión del exón 20.

Figuras 2A-F. Las figuras 2A, 2B, 2D y 2F ilustran los porcentajes de inclusión del exón 20 de IKBKAP en respuesta a diferentes dosis de compuestos oligonucleotídicos antisentido. Las figuras 2C y 2F ilustran los porcentajes de inclusión del exón 20 de IKBKAP en diferentes tejidos de ICV o inyecciones subcutáneas.

Figuras 3A-B. Estas figuras ilustran construcciones de minigen.

Figuras 4A-D. Estas figuras ilustran microwalks de compuestos oligonucleotídicos antisentido en diferentes regiones de un gen IKBKAP.

Figura 5. Esta figura ilustra la estabilidad de los ARNm omitidos con o sin el codón de terminación prematura usando RT-PCR.

Descripción detallada - de la invención reivindicada o de otra manera

En este documento, "realización" se puede referir a una realización de la invención reivindicada (según las reivindicaciones adjuntas) o a una realización que no forma parte de la invención reivindicada pero que puede representar antecedentes útiles para comprender la invención reivindicada.

A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en este documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis química y análisis químico. Determinadas técnicas y procedimientos de este tipo se pueden encontrar, por ejemplo, en "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21st edition, 2005; "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

Como se usa en este documento, "transcrito de IKBKAP" significa una transcrito transcrita de un gen IKBKAP.

Como se usa en este documento, "gen IKBKAP' significa el número de acceso GENBANK NT_008470.16 truncado de los nucleótidos 13290828 a 13358424, denominado en este documento como SEQ ID NO:1.

Como se usa en este documento, "sitio de empalme aberrante" significa un sitio de empalme que resulta de una mutación en el ADN y ARNm nativo. En determinadas realizaciones, los sitios de empalme aberrantes dan como resultado transcritos de ARNm que comprenden una combinación diferente de exones. En determinadas realizaciones, los sitios de empalme aberrantes dan como resultado transcritos de ARNm con deleciones de exones. En determinadas realizaciones, los sitios de empalme aberrantes dan como resultado transcritos de ARNm con deleciones de porciones de exones, o con extensiones de exones, o con nuevos exones. En determinadas realizaciones, los sitios de empalme aberrantes dan como resultado transcritos de ARNm que comprenden codones de parada prematuros.

Como se usa en este documento, "nucleósido" significa un compuesto que comprende una unidad estructural de nucleobase y una unidad estructural de azúcar. Los nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos de origen natural (como se encuentran en el ADN y ARN) y nucleósidos modificados. Los nucleósidos pueden estar enlazados a una unidad estructural fosfato.

Como se usa en este documento, "modificación química" significa una diferencia química en un compuesto cuando se compara con una contraparte de origen natural. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobase. Las modificaciones químicas de oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluidas modificaciones de unidades estructurales de azúcar y modificaciones de bases de nucleósidos) y modificaciones de enlaces internucleosídicos.

Como se usa en este documento, "furanosilo" significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.

Como se usa en este documento, "unidad estructural de azúcar de origen natural" significa un ribofuranosilo que se encuentra en el ARN de origen natural o un desoxirribofuranosilo que se encuentra en el ADN de origen natural. Como se usa en este documento, "unidad estructural de azúcar" significa una unidad estructural de azúcar de origen natural o una unidad estructural de azúcar modificada de un nucleósido.

Como se usa en este documento, "unidad estructural de azúcar modificada" significa una unidad estructural de azúcar sustituida, una unidad estructural de azúcar bicíclica o tricíclica o un sustituto de azúcar.

Como se usa en este documento, "unidad estructural de azúcar sustituido" significa un furanosilo que comprende al menos un grupo sustituyente que difiere del de una unidad estructural de azúcar de origen natural. Las unidades estructurales de azúcar sustituidas incluyen, pero no se limitan a, furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'.

Como se usa en este documento, "unidad estructural de azúcar sustituida en 2'" significa un furanosilo que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, una unidad estructural de azúcar sustituida en 2' no es una unidad estructural de azúcar bicíclico (esto es, el sustituyente 2' de una unidad estructural de azúcar sustituida en 2' no forma un puente con otro átomo del anillo de furanosilo.

Como se usa en este documento, "MOE" significa -OCH²CH²OCH³.

Como se usa en este documento, "unidad estructural de azúcar bicíclico" significa una unidad estructural de azúcar modificada que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (que incluye, pero no se limita a, un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, resultando en una estructura bicíclica. En determinadas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En determinadas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En determinadas de tales realizaciones, el puente conecta el carbono 2' y el carbono 4' del furanosilo.

Como se usa en este documento, el término "sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de reemplazar la unidad estructural de azúcar de origen natural de un nucleósido, de modo que el nucleósido resultante es capaz de (1) incorporarse en un oligonucleótido y (2) hibridación con un nucleósido complementario. Tales estructuras incluyen anillos que comprenden un número diferente de átomos que el furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo que no es oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Tales estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para unidades estructurales de azúcar sustituida (por ejemplo, sustitutos de azúcar carbocíclicos bicíclicos de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales). Los sustitutos de azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (por ejemplo, los sistemas sin anillo de ácido nucleico peptídico). Los sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolino, morfolinos modificados, ciclohexenilos y ciclohexitoles.

Como se usa en este documento, "nucleótido" significa un nucleósido que comprende además un grupo de enlace fosfato. Como se usa en este documento, "nucleósidos enlazados" pueden estar enlazados o no por enlaces fosfato y, de este modo, incluye, pero no se limita a, "nucleótidos enlazados". Como se usa en este documento, los "nucleósidos enlazados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (esto es, no hay nucleósidos adicionales presentes entre los que están enlazados).

Como se usa en este documento, "nucleobase" significa un grupo de átomos que se puede unir a una unidad estructural de azúcar para crear un nucleósido que es capaz de incorporarse en un oligonucleótido, y

en el que el grupo de átomos es capaz de unirse con una nucleobase complementaria de origen de otro oligonucleótido o ácido nucleico. Las nucleobases pueden ser de origen natural o pueden estar modificadas.

Como se usa en este documento, "base heterocíclica" o "nucleobase heterocíclica" significa una nucleobase que comprende una estructura heterocíclica.

Como se usa en este documento, los términos "nucleobase no modificada" o "nucleobase de origen natural" significan las nucleobases heterocíclicas de ARN o ADN de origen natural: las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) (incluido el 5-metil C) y uracilo (U).

Como se usa en este documento, "nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase que no es una nucleobase de origen natural.

Como se usa en este documento, "nucleósido modificado" significa un nucleósido que comprende al menos una modificación química en comparación con los nucleósidos de ARN o ADN de origen natural. Los nucleósidos modificados comprenden una unidad estructural de azúcar modificada y/o una nucleobase modificada.

Como se usa en este documento, "nucleósido bicíclico" o "BNA" significa un nucleósido que comprende una unidad estructural de azúcar bicíclico.

Como se usa en este documento, "nucleósido de etilo restringido" o "cEt" significa un nucleósido que comprende una unidad estructural de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH³)-O-2'.

Como se usa en este documento, "nucleósido de ácido nucleico bloqueado" o "LNA" significa un nucleósido que comprende una unidad estructural de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH²-O-2'.

Como se usa en este documento, "nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un nucleósido sustituido en 2' no es un nucleósido bicíclico.

Como se usa en este documento, "2'-desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende una unidad estructural de azúcar 2'-H furanosil, como se encuentra en los desoxirribonucleósidos (ADN) de origen natural. En determinadas realizaciones, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).

Como se usa en este documento, "oligonucleótido" significa un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) no modificados y/o desoxirribonucleósidos (ADN) no modificados y/o uno o más nucleósidos modificados. Como se usa en este documento, "oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que ninguno de los enlaces internucleosídicos contiene un átomo de fósforo. Como se usa en este documento, los oligonucleótidos incluyen oligonucleósidos.

Como se usa en este documento, "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleósido modificado y/o al menos un enlace internucleosídico modificado.

Como se usa en este documento, "enlace internucleosídico" significa un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido.

Como se usa en este documento, "enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.

Como se usa en este documento, "enlace internucleosídico modificado" significa cualquier enlace internucleosídico distinto de un enlace internucleosídico de origen natural.

Como se usa en este documento, "compuesto oligomérico" significa una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico consiste en un oligonucleótido.

Como se usa en este documento, "grupo terminal" significa uno o más átomos enlazados a uno o ambos, el extremo 3' o el extremo 5' de un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un grupo terminal es un grupo conjugado. En determinadas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos del grupo terminal.

Como se usa en este documento, "conjugado" significa un átomo o grupo de átomos enlazados a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están enlazados, incluyendo, pero sin limitarse a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o aclaramiento.

Como se usa en este documento, "grupo de enlace conjugado" significa cualquier átomo o grupo de átomos usado para unir un conjugado a un oligonucleótido o compuesto oligomérico.

Como se usa en este documento, "compuesto antisentido" significa un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido al menos una porción del cual es complementario a un ácido nucleico diana con el que es capaz de hibridar, dando como resultado al menos una actividad antisentido.

Como se usa en este documento, "actividad antisentido" significa cualquier cambio detectable y/o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana.

Como se usa en este documento, "detectar" o "medir" significa que se realiza una prueba o ensayo para detectar o medir. Tal detección y/o medición puede resultar en un valor de cero. De este modo, si una prueba de detección o medición da como resultado un hallazgo de ausencia de actividad (actividad de cero), no obstante, se ha realizado la etapa de detección o medición de la actividad.

Como se usa en este documento, "actividad detectable y/o medible" significa una actividad estadísticamente significativa que no es cero.

Como se usa en este documento, "esencialmente sin cambios" significa poco o ningún cambio en un parámetro particular, particularmente en relación con otro parámetro que cambia mucho más. En determinadas realizaciones, un parámetro no cambia esencialmente cuando cambia menos del 5 %. En determinadas realizaciones, un parámetro no cambia esencialmente si cambia menos de dos veces mientras que otro parámetro cambia al menos diez veces. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una actividad antisentido es un cambio en la cantidad de un ácido nucleico diana. En determinadas de tales realizaciones, la cantidad de un ácido nucleico no diana esencialmente no cambia si cambia mucho menos que lo hace el ácido nucleico diana, pero el cambio no necesita ser cero.

Como se usa en este documento, "expresión" significa el procedimiento mediante el cual un gen da como resultado finalmente una proteína. La expresión incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional (por ejemplo, empalme, poliadenilación, adición de casquete 5', renovación de ARNm) y traducción y modificación postraduccional.

Como se usa en este documento, "ácido nucleico diana" significa una molécula de ácido nucleico con la que se hibrida un compuesto antisentido.

Como se usa en este documento, "ARNm" significa una molécula de ARN que codifica una proteína.

Como se usa en este documento, "pre-ARNm" significa un transcrito de ARN que no se ha procesado completamente en ARNm. El pre-ARN incluye uno o más intrones.

Como se usa en este documento, "transcrito" significa una molécula de ARN transcrita a partir de ADN. Los transcritos incluyen, pero no se limitan a ARNm, pre-ARNm y ARN parcialmente procesado.

Como se usa en este documento, "dirigirse a" o "dirigido a" significa la asociación de un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico diana particular o una región particular de una molécula de ácido nucleico diana. Un compuesto antisentido se dirige a un ácido nucleico diana si es lo suficientemente complementario al ácido nucleico diana para permitir la hibridación en condiciones fisiológicas.

Como se usa en este documento, "complementariedad de nucleobase" o "complementariedad" cuando se hace referencia a nucleobases significa una nucleobase que es capaz de emparejar bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En determinadas realizaciones, nucleobase complementaria significa una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejar bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que es complementario en ese par de nucleobase. Las nucleobases que comprenden determinadas modificaciones pueden mantener la capacidad de emparejarse con una nucleobase homóloga y, de este modo, todavía son capaces de tener complementariedad de nucleobase.

Como se usa en este documento, "no complementario" en referencia a nucleobases significa un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí.

Como se usa en este documento, "complementario" en referencia a compuestos oligoméricos (por ejemplo, nucleósidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos enlazados) significa la capacidad de tales compuestos oligoméricos o regiones de los mismos para hibridar con otro compuesto oligomérico o región del mismo a través de complementariedad de nucleobase bajo condiciones rigurosas. Los compuestos oligoméricos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobase en cada nucleósido. Por el contrario, se toleran algunos desajustes. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios son complementarios al 70 % de las nucleobases (complementarios al 70 %). En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios son 80 % complementarios. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios son 90 % complementarios. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios son 95 % complementarios. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos complementarios o las regiones son 100 % complementarios.

Como se usa en este documento, "hibridación" significa el emparejamiento de compuestos oligoméricos complementarios (por ejemplo, un compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Aunque no se limita a un mecanismo particular, el mecanismo más común de emparejamiento implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos, entre nucleobases complementarias. Como se usa en este documento, "hibrida específicamente" significa la capacidad de un compuesto oligomérico de hibridar con un sitio de ácido nucleico con mayor afinidad que la que hibrida con otro sitio de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido se hibrida específicamente con más de un sitio diana.

Como se usa en este documento, "porcentaje de complementariedad" significa el porcentaje de nucleobases de un compuesto oligomérico que son complementarias a una porción de igual longitud de un ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad se calcula dividiendo el número de nucleobases del compuesto oligomérico que son complementarias a las nucleobases en las posiciones correspondientes en el ácido nucleico diana por la longitud total del compuesto oligomérico.

Como se usa en este documento, "porcentaje de identidad" significa el número de nucleobases en un primer ácido nucleico que son del mismo tipo (independientemente de la modificación química) que las nucleobases en las posiciones correspondientes en un segundo ácido nucleico, dividido por el número total de nucleobases. en el primer ácido nucleico.

Como se usa en este documento, "modulación" significa un cambio de cantidad o calidad de una molécula, función o actividad cuando se compara con la cantidad o calidad de una molécula, función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, la modulación incluye el cambio, ya sea un aumento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) en la expresión génica. Como ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir un cambio en la selección del sitio de empalme del procesamiento de pre-ARNm, dando como resultado un cambio en la cantidad absoluta o relativa de una variante de empalme particular en comparación con la cantidad en ausencia de modulación.

Como se usa en este documento, "motivo" significa un patrón de modificaciones químicas en un compuesto oligomérico o una región del mismo. Los motivos se pueden definir mediante modificaciones en determinados nucleósidos y/o en determinados grupos de enlace de un compuesto oligomérico.

Como se usa en este documento, "motivo de nucleósido" significa un patrón de modificaciones de nucleósido en un compuesto oligomérico o una región del mismo. Los enlaces de dicho compuesto oligomérico pueden estar modificados o sin modificar. A menos que se indique lo contrario, los motivos en este documento que describen solo nucleósidos están destinados a ser motivos de nucleósidos. De este modo, en tales casos, los enlaces no están limitados.

Como se usa en este documento, "motivo de azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcar en un compuesto oligomérico o una región del mismo.

Como se usa en este documento, "motivo de enlace” significa un patrón de modificaciones de enlace en un compuesto oligomérico o región del mismo. Los nucleósidos de dicho compuesto oligomérico pueden estar modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, los motivos en este documento que describen solo enlaces están destinados a ser motivos de enlace De este modo, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.

Como se usa en este documento, "motivo de modificación de nucleobase" significa un patrón de modificaciones de nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobase es independiente de la secuencia de nucleobase.

Como se usa en este documento, "motivo de secuencia" significa un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o porción del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de modificaciones químicas y, de este modo, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo sin modificaciones químicas.

Como se usa en este documento, "tipo de modificación" en referencia a un nucleósido o un nucleósido de un "tipo" significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. De acuerdo con lo anterior, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo" puede ser un nucleósido no modificado.

Como se usa en este documento, "modificado de manera diferente" significa modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluida la ausencia de modificaciones. De este modo, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado se "modifican de manera diferente", aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Asimismo, el ADN y el ARN están "modificados de manera diferente", aunque ambos son nucleósidos no modificados de origen natural. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden diferentes nucleobases no se modifican de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado con 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado con 2'-OMe y una nucleobase de timina no modificada no se modifican de manera diferente.

Como se usa en este documento, "el mismo tipo de modificaciones" se refiere a modificaciones que son iguales entre sí, incluida la ausencia de modificaciones. De este modo, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen "el mismo tipo de modificación", aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Tales nucleósidos que tienen el mismo tipo de modificación pueden comprender diferentes nucleobases.

Como se usa en este documento, "portador o diluyente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia apropiada para su uso en la administración a un animal. En determinadas realizaciones, un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina estéril. En determinadas realizaciones, tal solución salina estéril es una solución salina de calidad farmacéutica.

Como se usa en este documento, "sustituyente" y "grupo sustituyente" significa un átomo o grupo que reemplaza al átomo o grupo de un compuesto original mencionado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiera del átomo o grupo que se encuentra en un nucleósido de origen natural (por ejemplo, un sustituyente modificado en 2' es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido distinto de H u OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o desprotegidos. En determinadas realizaciones, los compuestos descritos tienen sustituyentes en una o más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con grupos sustituyentes adicionales y pueden unirse directamente o mediante un grupo de enlace, tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo, a un compuesto original.

Asimismo, como se usa en este documento, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico significa que un átomo o grupo de átomos difiere del átomo o grupo de átomos normalmente presente en el grupo funcional mencionado. En determinadas realizaciones, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en determinadas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto de hidrógeno que reemplaza a uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles de usarse como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)R^aa), carboxilo (-C(O)O-R^aa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi(-O-R^aa) sustituido, arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino(-N(R^bb) - (R^cc)), imino(=NR^bb), amido (-C(O)N(R^bb)(R^cc) o -N(R^bb)C(O)R^aa), azido (-N³), nitro (-NO²), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(R^bb)(R^cc) o -N (R^bb)C(O)OR^aa), ureido (-N (R^bb) C(O)N(R^bb)(R^cc)), tioureido (-N(R^bb)C(S)N(R^bb)(R^cc)), guanidinilo (-N(R^bb)C(=NR^bb)N(R^bb)(R^cc)), amidinilo (-C(=NR^bb)N(R^bb)(R^cc) o -N(R^bb)C(=NR^bb)(R^aa)), tiol(-SR^bb), sulfinil (-S(O)R^bb), sulfonil (-S(O)²R^bb) y sulfonamidil (-S(O)²N(R^bb)(R^cc) o -N(R^bb)S(O)²R^bb). En el que cada R^aa, R^bb y R^cc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida que incluye, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en este documento están presentes en un grado recurrente.

Como se usa en este documento, "alquilo", como se usa en este documento, significa un radical hidrocarburo saturado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen por lo general desde 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más por lo general desde 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C¹-C¹²) siendo más preferido desde 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.

Como se usa en este documento, "alquenilo" significa un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, dienos tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen por lo general de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más por lo general desde 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido desde 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo como se usan en este documento pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "alquinilo" significa un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen por lo general desde 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más por lo general desde 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido desde 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo como se usan en este documento pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "acilo" significa un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X donde X es por lo general alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo, como se usa en este documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "alicíclico" significa un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos en los que al menos un anillo es alifático. Los alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen desde aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, como se usa en este documento, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "alifático" significa un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en el que la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un enlace sencillo, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente desde 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más por lo general desde 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferido desde 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede estar interrumpida con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Tales grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos, como se usan en este documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en el que el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula original. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, tert-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi, como se usan en este documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "aminoalquilo" significa un radical alquilo C¹-C¹² sustituido con amino. La porción alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino puede estar ubicado en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede estar sustituido con un grupo sustituyente adicional en las porciones alquilo y/o amino.

Como se usa en este documento, "aralquilo" y "arilalquilo" significan un grupo aromático que está unido covalentemente a un radical alquilo C¹-C¹². La porción del radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula original. Los ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo como se usan en este documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales enlazados al alquilo, el arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.

Como se usa en este documento, "arilo" y "aromático" significan radicales del sistema de anillo carbocíclico mono o policíclico que tienen uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillos de arilo preferidos tienen desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo, como se usan en este documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Como se usa en este documento, "halo" y "halógeno" significan un átomo seleccionado entre flúor, cloro, bromo y yodo.

Como se usa en este documento, "heteroarilo" y "heteroaromático" significan un radical que comprende un anillo aromático mono o policíclico, un sistema de anillos o un sistema de anillos condensados en el que al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. También se pretende que heteroarilo incluya sistemas de anillos fusionados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos fusionados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen por lo general un átomo de anillo seleccionado entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolinilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo se pueden unir a una molécula original directamente o mediante una unidad estructural de enlace, tal como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo, como se usan en este documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.

Compuestos oligoméricos

La presente divulgación se refiere a compuestos oligoméricos. Tales compuestos oligoméricos pueden comprender uno o más conjugados y/o grupos terminales y/o una o más modificaciones químicas. Tales modificaciones químicas incluyen modificaciones a uno o más nucleósidos (incluidas modificaciones a la unidad estructural de azúcar y/o la nucleobase) y/o modificaciones a uno o más enlaces internucleosídicos.

Determinadas fracciones de azúcar

En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una unidad estructural de azúcar modificada. Tales compuestos oligoméricos que comprenden uno o más nucleósidos modificados con azúcar pueden tener propiedades deseables, tales como estabilidad de nucleasa mejorada o afinidad de unión aumentada con un ácido nucleico diana en relación con compuestos oligoméricos que comprenden solo nucleósidos que comprenden unidades estructurales de azúcar de origen natural. En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar modificadas son unidades estructurales de azúcar sustituida. En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar modificadas son unidades estructurales de azúcar bicíclicas o tricíclicas. En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar modificadas son sustitutos de azúcar. Dichos sustitutos de azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de las unidades estructurales de azúcar sustituida.

En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar modificadas son unidades estructurales de azúcar sustituida que comprenden uno o más sustituyentes, incluyendo, pero no se limitan a, sustituyentes en las posiciones 2' y/o 5'. Ejemplos de sustituyentes de azúcar apropiados para la posición 2' incluyen, pero no se limitan a: 2'-F, 2'-OCH³ ("OMe" o "O-metil"), y 2'-O(CH²)²OCH³ ("MOE"). En determinadas realizaciones, los sustituyentes de azúcar en la posición 2' se seleccionan de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C¹-C¹⁰, alquilo sustituido O-C¹-C¹⁰; alcoxi O-C¹-C¹⁰; alcoxi sustituido O-C¹-C¹⁰, OCF³, O(CH²)²SCH³ , O(CH²)²-ON(R^m)(Rⁿ), y O-CH²-C(=O)-N(R^m)(Rⁿ), donde cada R^m y Rⁿ es, independientemente, H o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido.

Los ejemplos de sustituyentes de azúcar en la posición 5' incluyen, pero no se limitan a :, 5'-metilo (R o S); 5'- vinilo y 5'-metoxi. En determinadas realizaciones, los azúcares sustituidos comprenden más de un sustituyente de azúcar no puente, por ejemplo, unidades estructurales de azúcar 2'-F-5'-metilo (véase, por ejemplo, la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157, para adicionales unidades estructurales de azúcar 5', 2'-bis sustituidas y nucleósidos).

Los nucleósidos que comprenden unidades estructurales de azúcar sustituida en 2' se denominan nucleósidos sustituidos en 2'. En determinadas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' comprende un grupo sustituyente en

2' seleccionado entre halo, alilo, amino, azido, alcoxi O-C¹-C¹⁰; O-alcoxi C¹-C¹⁰ sustituido, SH, CN, OCN, CF³ , OCF³,

O-alquilo, S-alquilo, N(R^m)-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo o N(R^m)-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo, N(R^m)-alquinilo; O-alquilenil-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH²)²SCH³, O-(CH²)²-O-N(R^m)(Rⁿ) o O-CH²-C(=O)-N(R^m)(Rⁿ), donde cada R^m y Rⁿ es, independientemente, H, un grupo protector de amino o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido. Estos grupos sustituyentes 2' pueden estar sustituidos adicionalmente con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro (NO²), tiol, tioalcoxi (S-alquilo), halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.

En determinadas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' comprende un grupo sustituyente en 2' seleccionado de F, NH², N³ , OCF³, O-CH³, O(CH²)³NH² , CH²-CH=CH², O-CH²-CH=CH² , OCH²CH²OCH³ , O(CH²)²SCH³, O-(CH²)²-ON(R^m)(Rⁿ), O(CH²)²O(CH²)²N(CH³)² , y acetamida (O-CH²-C(=O)-N (R^m) (Rⁿ) N-sustituida donde cada R^m independientemente, H, un grupo protector de amino o alquilo C¹-C¹⁰ sustituido o no sustituido.

En determinadas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' comprende una unidad estructural de azúcar que comprende un grupo sustituyente en 2' seleccionado de F, OCF³, O-CH³, OCH²CH²OCH³, O(CH²)²SCH³, O-(CH²)²-O-N(CH³)², -O(CH²)²O(CH²)²N(CH³)² , y O-CH²-C(=O)-N(H)CH³.

En determinadas realizaciones, un nucleósido sustituido en 2' comprende una unidad estructural de azúcar que comprende un grupo sustituyente en 2' seleccionado entre F, O-CH³ y OCH²CH²OCH³.

Determinadas unidades estructurales de azúcar modificadas comprenden un sustituyente de azúcar en puente que forma un segundo anillo que da como resultado una unidad estructural de azúcar bicíclico. En determinadas de tales realizaciones, la unidad estructural de azúcar bicíclico comprende un puente entre los átomos del anillo de furanosa

4' y 2'. Ejemplos de tales sustituyentes de azúcar 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a: -[C(R^a)(R^b)]ⁿ-, -[C(R^a)(R^b)]ⁿ-O-, -C(R^aR^b)-N(R)-O- o, -C(R^aR^b)-O-N(R)-; 4'-CH²-2', 4'-(CH²)²-2', 4'-(CH²)³-2',. 4'-(CH²)-O-2' (LNA); 4'-(CH²)-S-2'; 4'-(CH²)²-O-² ' (^e N^a ); 4'-CH(CH³)-O-2' (cEt) y 4'-CH(CH2O^c H3)-O-2', y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 7,399,845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH³)(CH³)-O-2' y análogos del mismo, (véase, por ejemplo, el documento WO2009/006478, publicado el 8 de enero de 2009); 4'-CH²-N(OCH³)-2' y análogos del mismo (véase, por ejemplo, el documento WO2008/150729, publicado el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH²-O-N(CH³)-2' (véase, por ejemplo, el documento US2004/0171570, publicado el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH²-O-N(R)-2' y 4'- CH²-N(R)-O-2'-, en la que cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C¹-C¹²; 4'-CH²-N(R)-O-2', en la que R es H, alquilo C¹-C¹² o un grupo protector (véase la Patente de los Estados Unidos 7,427,672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(c H3)-2' (véase, por ejemplo, Chattopadhyaya, et al.,

J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH²-C(= CH²) -2' y análogos de los mismos (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).

En determinadas realizaciones, tales puentes 4' a 2' comprenden independientemente desde 1 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(R^a)(R^b)]ⁿ-, -C(R^a)=C(R^b)-, -C(R^a)=N-, -C(=NR^a)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R^a)²-, -S(=O)^x-, y -N(R^a)-;

en la que:

x es 0, 1 o 2;

n es 1, 2, 3 o 4;

cada R^a y R^b es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C¹² sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, arilo C⁵-C²⁰, arilo C⁵-C²⁰ sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C⁵-C⁷, radical alicíclico C⁵-C⁷ sustituido, halógeno, OJ¹, NJ¹J², SJ¹, N³, COOJ¹, acilo (C(= O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)²-J¹) o sulfoxilo (S(=O)-J¹); y

cada J¹ y J² es, independientemente, H, alquilo C¹-C¹², alquilo C¹-C¹² sustituido, alquenilo C²-C¹², alquenilo C²-C sustituido, alquinilo C²-C¹², alquinilo C²-C¹² sustituido, arilo C⁵-C²⁰, arilo C⁵-C²⁰ sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C¹-C¹², aminoalquilo C¹-C¹² sustituido o un grupo protector.

Los nucleósidos que comprenden unidades estructurales de azúcar bicíclicos se denominan nucleósidos bicíclicos o

BNA. Los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) ^a -L-Metilenoxi (4'-CH²-O-2') BNA, (B) ^p -D-Metilenoxi (4'-CH²-O-2') BNA (también conocido como ácido nucleico bloqueado o LNA), (C) Etilenoxi (4'-(CH²)²-O-2') BNA, (D) Aminooxi (4'-CH²-ON(R)-2') BNA, (E) Oxiamino (4'-CH²-N(R)-O-2') BNA, (F) Metil (metilenoxi) (4'-CH(CH³)-O-2') BNA (también denominado como etilo o cEt restringidos), (G) metilen-tio (4'-CH²-S-2') BNA, (^h ) metilen-amino (4'-CH²-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH²-CH(CH³)-2') BnA, y (J) propileno carbocíclico (4'-(CH²)³-2') BNA como se muestra a continuación.

en las que Bx es una unidad estructural de nucleobase y R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo

C¹-C¹².

Se conocen en la técnica unidades estructurales de azúcar bicíclicos adicionales, por ejemplo: Singh et al., Chem.

Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org.

Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr.

Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; la Patente de los Estados Unidos Nos. 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 6,670,461, y 7,399,845; WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570, y

WO 2007/134181; las Publicaciones de la Patente de los Estados Unidos Nos. US2004/0171570, US2007/0287831, y US2008/0039618; Patente de los Estados Unidos Serie Nos. 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787, y 61/099,844; y las Aplicaciones Internacionales PCT Nos.

PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, y PCT/US2008/068922.

En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar bicíclicos y los nucleósidos que incorporan tales unidades estructurales de azúcar bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metileno-oxi, puede estar en la configuración ^a -L o en la configuración ^p -D. Anteriormente, los nucleósidos bicíclicos ^a -L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar sustituida comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no puente y uno o más sustituyentes de azúcar puente (por ejemplo, azúcares sustituidos en 5' y azúcares con puente 4'-2'). (véase, Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 11/22/07, en la que LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).

En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar modificadas son sustitutos de azúcar. En determinadas de tales realizaciones, el átomo de oxígeno del azúcar natural está sustituido, por ejemplo, con un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. En determinadas de tales realizaciones, tal unidad estructural de azúcar modificada también comprende sustituyentes puente y/o no puente como se describió anteriormente. Por ejemplo, determinados sustitutos de azúcar comprenden un átomo de azufre 4' y una sustitución en la posición 2' (véase, por ejemplo, la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos publicada US2005/0130923, publicada el 16 de junio de 2005) y/o la posición 5'. A modo de ejemplo adicional, se han descrito nucleósidos carbocíclicos bicíclicos que tienen un puente 4'-2' (véase, por ejemplo, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740).

En determinadas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen distintos átomos de 5. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un tetrahidropirano de seis miembros. Tales tetrahidropiranos se pueden modificar o sustituir adicionalmente. Los nucleósidos que comprenden tales tetrahidropiranos modificados incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MnA) (véase Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), fluoro HNA (F-HNA) y aquellos compuestos que tienen la fórmula VII:

en la que independientemente para cada uno de dicho al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de fórmula VII:

Bx es una unidad estructural de nucleobase;

T³ y T⁴ son cada uno, independientemente, un grupo de unión entre nucleósidos que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de T³ y T⁴ es un grupo de unión entre nucleósidos que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de T³ y T⁴ es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3';

q-ⁱ , q², q³, q⁴, q⁵, q6 y q⁷ son cada uno, independientemente, H, alquilo C¹-C⁶, alquilo C¹-C⁶ sustituido, alquenilo C²-C6, alquenilo C²-C⁶ sustituido, alquinilo C²-C⁶ o alquinilo C²-C⁶ sustituido; y

cada uno de R¹ y R² se selecciona independientemente entre: hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ¹J² , SJ¹, N³, OC(= X J ¹, OC(=X)NJJ NJ³C(=X)NJJ² y CN, en la que X es O, S o NJ¹, y cada J¹, J² y J³ es, independientemente, H o alquilo C¹-C⁶.

En determinadas realizaciones, se describen nucleósidos THP modificados de fórmula VII en los que q¹, q² , q³, q⁴, q⁵, q6 y q⁷ son cada uno H. En determinadas realizaciones, al menos uno de q¹, q² , q³, q⁴, q⁵ , q6 y q⁷ es distinto de H. En determinadas realizaciones, al menos uno de q¹, q², q³, q⁴ , q⁵, q6 y q⁷ es metilo. En determinadas realizaciones, se describen nucleósidos de THP de fórmula VII en la que uno de R¹ y R² es F. En determinadas realizaciones, R¹ es flúor y R² es H, R¹ es metoxi y R² es H, y R¹ es metoxietoxi y R² es H.

Se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar y azúcar bicíclicos y tricíclicos que se pueden usar para modificar nucleósidos (véase, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).

En determinadas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden unidades estructurales de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véase, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503­ 4510; y las Patente de los Estados Unidos 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; y 5,034,506). Como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente estructura:

En determinadas realizaciones, los morfolinos se pueden modificar, por ejemplo, agregando o alterando diversos grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. Tales sustitutos de azúcar se denominan en este documento "morfolinos modificados".

Las combinaciones de modificaciones también se describen sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 8/21/08 para otros 5', 2'- bisnucleósidos sustituidos descritos) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2' (véase la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos Publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 11/22/07 en la que un nucleósido bicíclico 4'-CH²-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un grupo de 5'-metilo o 5'-vinilo). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (véase, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).

Determinadas nucleobases

En determinadas realizaciones, los nucleósidos comprenden una o más nucleobases no modificadas. En determinadas realizaciones, los nucleósidos comprenden una o más nucleobases modificadas.

En determinadas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan de: bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases expandidas por tamaño y bases fluoradas como se definen en este documento. Pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropil-adenina, 5-propiniluracilo; 5-propinilcitosina; 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5 -halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH³) uracilo y citosina y otros derivados alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2- F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3- deazaadenina, bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases expandidas de tamaño y bases fluoradas como se define en este documento. Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas tales como la fenoxazina citidina ([5,4-b] [1,4] benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido [5,4-b] [1,4] benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas G tales como una citidina fenoxazina sustituida (por ejemplo, 9- (2-aminoetoxi)-H-pirimido [5,4-b] [1,4] benzoxazin-2 (3H) -ona), carbazol citidina (2H-pirimido [4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido [3', 2': 4,5] pirrolo [2,3-d ]pirimidin-2-ona). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen las descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 3,687,808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; las descritos por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; y las descritas por Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288.

Las Patentes de los Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente así como otras nucleobases modificadas incluyen, sin limitación, U.S.

3,687,808; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653 y 6,005,096, algunas de las cuales son de propiedad común con la presente solicitud.

Determinados enlaces intemucleosídicos

Los compuestos oligoméricos pueden comprender nucleósidos enlazados. En tales realizaciones, los nucleósidos se pueden unir entre sí usando cualquier enlace internucleosídico. Las dos clases principales de grupos de unión entre nucleósidos se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero sin limitación, fosfodiésteres (P=O), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos (P=S). Los grupos de unión internucleosídicos representativos que no contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, metilenmetilimino (-CH²-N(CH³)-O-CH²-), tiodiéster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)²-O-); y N,N'-dimetilhidrazina (-CH²-N(CH³)-N(CH³)-). Los enlaces modificados, en comparación con los enlaces fosfodiéster naturales, se pueden usar para alterar, por lo general aumentar, la resistencia a nucleasas del compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos que tienen un átomo quiral se pueden preparar como una mezcla racémica o como enantiómeros separados. Los enlaces quirales representativos incluyen, pero no se limitan a, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces internucleosídicos que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Los oligonucleótidos descritos en este documento contienen uno o más centros asimétricos y, de este modo, dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras configuraciones estereoisoméricas que se pueden definir, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), ^a o ^p tales como para anómeros de azúcar, o como (D) o (L) tal como para aminoácidos, etc. Incluidos en los compuestos antisentido descritos en este documento están todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras.

Los enlaces internucleósidos neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'- CH²-N(CH³)-O-5'), amida-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), y tioformacetal (3'-S-CH2-O-5'). Otros enlaces internucleosídicos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster sulfonato y amidas (Véase por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, 40-65). Otros enlaces internucleósidos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes mezcladas de N, O, S y CH².

Determinados motivos

En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden oligonucleótidos. En determinadas realizaciones, tales oligonucleótidos comprenden una o más modificaciones químicas. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden uno o más nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden azúcares modificados. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una o más nucleobases modificadas. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinadas realizaciones, las modificaciones químicas (modificaciones de azúcar, modificaciones de nucleobase y/o modificaciones de enlace) definen un patrón o motivo. En determinadas realizaciones, los patrones de modificaciones químicas de unidades estructurales de azúcar, enlaces internucleosídicos y nucleobases son independientes entre sí. De este modo, un oligonucleótido se puede describir por su motivo de modificación de azúcar, motivo de enlace internucleosídico y/o motivo de modificación de nucleobase (como se usa en este documento, el motivo de modificación de nucleobase describe las modificaciones químicas de las nucleobases independientes de la secuencia de nucleobases).

Determinados motivos de azúcar

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de unidades estructurales de azúcar modificadas y/o unidades estructurales de azúcar de origen natural dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de azúcar. Tales motivos pueden incluir cualquiera de las modificaciones de azúcar discutidas en este documento y/u otras modificaciones de azúcar conocidas.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden o consisten en una región que tiene un motivo de modificación de azúcar gapmero, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región interna o "brecha". Las tres regiones de un motivo gapmero (el ala 5', la brecha y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en la que al menos algunas de las unidades estructurales de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunas de las unidades estructurales de azúcar de los nucleósidos de la brecha. Específicamente, al menos las fracciones de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca de la brecha (la mayoría de los nucleósidos 3' del ala 5' y la mayoría de los nucleósidos 5' del ala 3') difieren de la unidad estructural de azúcar de los nucleósidos de la brecha vecina, definiendo de este modo el límite entre las alas y la brecha. En determinadas realizaciones, las unidades estructurales de azúcar dentro de la brecha son iguales entre sí. En determinadas realizaciones, la brecha incluye uno o más nucleósidos que tienen una unidad estructural de azúcar que difiere de la unidad estructural de azúcar de uno o más de otros nucleósidos de la brecha. En determinadas realizaciones, los motivos de modificación de azúcar de las dos alas son iguales entre sí (gapmero simétrico). En determinadas realizaciones, los motivos de modificación del azúcar del ala 5' difieren del motivo de modificación del azúcar del ala 3' (gapmero asimétrico). En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden nucleósidos modificados con 2'-MOE en las alas y nucleósidos modificados con 2'-F en la brecha.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos están completamente modificados. En determinadas de tales realizaciones, los oligonucleótidos se modifican uniformemente. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son 2'-MOE uniformes. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son 2'-F uniformes. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son morfolino uniforme. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son BNA uniformes. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son LNA uniformes. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son cEt uniforme.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región uniformemente modificada y nucleósidos adicionales que no están modificados o modificados de manera diferente. En determinadas realizaciones, la región uniformemente modificada tiene al menos 5, 10, 15 o 20 nucleósidos de longitud. En determinadas realizaciones, la región uniforme es una región 2'-MOE. En determinadas realizaciones, la región uniforme es una región 2'-F. En determinadas realizaciones, la región uniforme es una región morfolino. En determinadas realizaciones, la región uniforme es una región BNA. En determinadas realizaciones, la región uniforme es una región LNA. En determinadas realizaciones, la región uniforme es una región cEt.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido no comprende más de 4 2'-desoxinucleósidos contiguos no modificados. En determinadas circunstancias, los oligonucleótidos antisentido que comprenden más de 4 2'-desoxinucleósidos contiguos activan la RNasa H, lo que da como resultado la escisión del ARN diana. En determinadas realizaciones, tal escisión se evita al no tener más de 42'-desoxinucleósidos contiguos, por ejemplo, cuando se desea la alteración del empalme y no la escisión de un ARN diana.

Determinados motivos de enlace entre nucleósidos

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos se disponen en un motivo con brechas, como se describió anteriormente para el motivo de modificación del azúcar. En tales realizaciones, los enlaces internucleosídicos en cada una de las dos regiones del ala son diferentes de los enlaces internucleosídicos en la región brecha. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos en las alas son fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos en la brecha son fosforotioato. El motivo de modificación de azúcar se selecciona independientemente, por lo que tales oligonucleótidos que tienen un motivo de enlace internucleosídico con brechas pueden tener o no un motivo de modificación de azúcar con brechas y si tiene un motivo de azúcar con brechas, las longitudes del ala y de la brecha pueden o no ser iguales.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos modificados uniformemente. En determinadas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está unida uniformemente por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido está unido uniformemente por fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleosídico es fosforotioato.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En determinadas de tales realizaciones, al menos uno de tales bloques está ubicado en el extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas de tales realizaciones, al menos uno de tales bloques está ubicado dentro de los 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.

Determinados motivos de modificación de nucleobase

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden modificaciones químicas de nucleobases dispuestas a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de modificación de nucleobases. En determinadas de tales realizaciones, las modificaciones de la nucleobase se disponen en un motivo con brechas. En determinadas realizaciones, las modificaciones de la nucleobase se disponen en un motivo alterno. En determinadas realizaciones, cada nucleobase se modifica. En determinadas realizaciones, ninguna de las nucleobases está químicamente modificada.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden un bloque de nucleobases modificadas. En determinadas de tales realizaciones, el bloque está en el extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, el bloque está dentro de los 3 nucleótidos del extremo 3' del oligonucleótido. En determinadas de tales realizaciones, el bloque está en el extremo 5' del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, el bloque está dentro de los 3 nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido.

En determinadas realizaciones, las modificaciones de la nucleobase son una función de la base natural en una posición particular de un oligonucleótido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones se modifica cada purina o cada pirimidina en un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, cada adenina se modifica. En determinadas realizaciones, cada guanina está modificada. En determinadas realizaciones, cada timina está modificada. En determinadas realizaciones, cada citosina se modifica. En determinadas realizaciones, cada uracilo se modifica. En determinadas realizaciones, algunas, todas o ninguna de las unidades estructurales de citosina en un oligonucleótido son unidades estructurales de 5-metilcitosina. En este documento, la 5-metil citosina no es una "nucleobase modificada". De acuerdo con lo anterior, a menos que se indique lo contrario, las nucleobases no modificadas incluyen tanto residuos de citosina que tienen un 5-metilo como aquellos que carecen de un 5 metilo. En determinadas realizaciones, se especifica el estado de metilación de todas o algunas nucleobases de citosina. Determinadas longitudes generales

En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos incluyen oligonucleótidos de cualquiera de una variedad de intervalos de longitudes. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos u oligonucleótidos consisten en nucleósidos enlazados de X a Y, donde X representa el menor número de nucleósidos en el intervalo e Y representa el mayor número de nucleósidos en el intervalo. En determinadas de tales realizaciones, X e Y se seleccionan cada una independientemente entre 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, y 50; siempre que X < Y. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden oligonucleótidos que consisten en 8 a 9, 8 a 10, 8 a 11, 8 a 12, 8 a 13, 8 a 14, 8 a 15, 8 a 16, 8 a 17, 8 a 18, 8 a 19, 8 a 20, 8 a 21, 8 a 22, 8 a 23, 8 a 24, 8 a 25, 8 a 26, 8 a 27, 8 a 28, 8 a 29, 8 a 30, 9 a 10, 9 a 11, 9 a 12, 9 a 13, 9 a 14, 9 a 15, 9 a 16, 9 a 17, 9 a 18, 9 a 19, 9 a 20, 9 a 21, 9 a 22, 9 a 23, 9 a 24, 9 a 25, 9 a 26, 9 a 27, 9 a 28, 9 a 29, 9 a 30, 10 a 11, 10 a 12, 10 a 13, 10 a 14, 10 a 15, 10 a 16, 10 a 17, 10 a 18, 10 a 19, 10 a 20, 10 a 21, 10 a 22, 10 a 23, 10 a 24, 10 a 25, 10 a 26, 10 a 27, 10 a 28, 10 a 29, 10 a 30, 11 a 12, 11 a 13, 11 a 14, 11 a 15, 11 a 16, 11 a 17, 11 a 18, 11 a 19, 11 a 20, 11 a 21, 11 a 22, 11 a 23, 11 a 24, 11 a 25, 11 a 26, 11 a 27, 11 a 28, 11 a 29, 11 a 30, 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 22, 12 a 23, 12 a 24, 12 a 25, 12 a 26, 12 a 27, 12 a 28, 12 a 29, 12 a 30, 13 a 14, 13 a 15, 13 a 16, 13 a 17, 13 a 18, 13 a 19, 13 a 20, 13 a 21, 13 a 22, 13 a 23, 13 a 24, 13 a 25, 13 a 26, 13 a 27, 13 a 28, 13 a 29, 13 a 30, 14 a 15, 14 a 16, 14 a 17, 14 a 18, 14 a 19, 14 a 20, 14 a 21, 14 a 22, 14 a 23, 14 a 24, 14 a 25, 14 a 26, 14 a 27, 14 a 28, 14 a 29, 14 a 30, 15 a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 a 23, 15 a 24, 15 a 25, 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 16 a 17, 16 a 18, 16 a 19, 16 a 20, 16 a 21, 16 a 22, 16 a 23, 16 a 24, 16 a 25, 16 a 26, 16 a 27, 16 a 28, 16 a 29, 16 a 30, 17 a 18, 17 a 19, 17 a 20, 17 a 21, 17 a 22, 17 a 23, 17 a 24, 17 a 25, 17 a 26, 17 a 27, 17 a 28, 17 a 29, 17 a 30, 18 a 19, 18 a 20, 18 a 21, 18 a 22, 18 a 23, 18 a 24, 18 a 25, 18 a 26, 18 a 27, 18 a 28, 18 a 29, 18 a 30, 19 a 20, 19 a 21, 19 a 22, 19 a 23, 19 a 24, 19 a 25, 19 a 26, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 29, 19 a 30, 20 a 21, 20 a 22, 20 a 23, 20 a 24, 20 a 25, 20 a 26, 20 a 27, 20 a 28, 20 a 29, 20 a 30, 21 a 22, 21 a 23, 21 a 24, 21 a 25, 21 a 26, 21 a 27, 21 a 28, 21 a 29, 21 a 30, 22 a 23, 22 a 24, 22 a 25, 22 a 26, 22 a 27, 22 a 28, 22 a 29, 22 a 30, 23 a 24, 23 a 25, 23 a 26, 23 a 27, 23 a 28, 23 a 29, 23 a 30, 24 a 25, 24 a 26, 24 a 27, 24 a 28, 24 a 29, 24 a 30, 25 a 26, 25 a 27, 25 a 28, 25 a 29, 25 a 30, 26 a 27, 26 a 28, 26 a 29, 26 a 30, 27 a 28, 27 a 29, 27 a 30, 28 a 29, 28 a 30, o 29 a 30 nucleósidos enlazados. En las realizaciones en las que el número de nucleósidos de un compuesto oligomérico u oligonucleótido está limitado, ya sea a un intervalo o a un número específico, el compuesto oligomérico u oligonucleótido puede, no obstante, comprender además otros sustituyentes adicionales. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende 8-30 nucleósidos excluye oligonucleótidos que tienen 31 nucleósidos, pero, a menos que se indique lo contrario, dicho oligonucleótido puede comprender además, por ejemplo, uno o más conjugados, grupos terminales u otros sustituyentes. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido gapmero tiene cualquiera de las longitudes anteriores.

Un experto en la técnica apreciará que determinadas longitudes pueden no ser posibles para determinados motivos. Por ejemplo: un gapmero que tiene una región de ala 5' que consiste en cuatro nucleótidos, una brecha que consiste en al menos seis nucleótidos y una región de ala 3' que consiste en tres nucleótidos no puede tener una longitud total menor de 13 nucleótidos. De este modo, se entendería que el límite de longitud inferior es 13 y que el límite de 10 en "10-20" no tiene ningún efecto en esa realización.

Además, cuando un oligonucleótido se describe por un intervalo de longitud total y por regiones que tienen longitudes específicas, y donde la suma de las longitudes especificadas de las regiones es menor que el límite superior del intervalo de longitud total, el oligonucleótido puede tener nucleósidos adicionales, más allá de los de las regiones especificadas, siempre que el número total de nucleósidos no exceda el límite superior del intervalo de longitud total. Por ejemplo, un oligonucleótido que consiste en 20-25 nucleósidos enlazados que comprende un ala 5' que consiste en 5 nucleósidos enlazados; un ala 3' que consiste en 5 nucleósidos enlazados y una brecha central que consiste en 10 nucleósidos enlazados (5+5+10 = 20) puede tener hasta 5 nucleósidos que no forman parte del ala 5', el ala 3', o la brecha (antes de alcanzar la limitación de longitud total de 25). Tales nucleósidos adicionales pueden ser 5' del ala 5' y/o 3' del ala 3'.

Determinados oligonucleótidos

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos se caracterizan por su motivo de azúcar, motivo de enlace internucleósido, motivo de modificación de nucleobase y longitud total. En determinadas realizaciones, tales parámetros son independientes entre sí. De este modo, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmero de azúcar se puede modificar o no modificar y puede seguir o no el patrón de modificación gapmero de las modificaciones de azúcar. De este modo, los enlaces internucleósidos dentro de las regiones de ala de un azúcar-gapmero pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces internucleosidos de la región brecha. Asimismo, tales oligonucleótidos azúcar-gapmero pueden comprender una o más nucleobase modificada independientemente del patrón de gapmero de las modificaciones del azúcar. En este documento, si una descripción de un oligonucleótido o compuesto oligomérico es silenciosa con respecto a uno o más parámetros, tal parámetro no está limitado. De este modo, un compuesto oligomérico descrito sólo por tener un motivo gapmero de azúcar sin descripción adicional puede tener cualquier longitud, motivo de enlace entre nucleósidos y motivo de modificación de nucleobase. A menos que se indique lo contrario, todas las modificaciones químicas son independientes de la secuencia de nucleobase.

Determinados grupos conjugados

En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos se modifican mediante la unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto oligomérico unido incluyendo, pero sin limitarse a, farmacodinámica, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación, carga y aclaramiento celular. Los grupos conjugados se usan de forma rutinaria en la técnica química y se unen directamente o mediante una unidad estructural de unión conjugada opcional o un grupo de unión conjugado a un compuesto original tal como un compuesto oligomérico, tal como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, unidades estructurales de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceína, rodaminas, cumarinas y colorantes. Se han descrito previamente determinados grupos conjugados, por ejemplo: unidad estructural de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos do-decan-diol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una unidad estructural palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una unidad estructural de octadecilamina o hexilaminocarbonil oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).

En determinadas realizaciones, un grupo conjugado comprende una sustancia farmacéutica activa, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fen-bufen, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

En determinadas realizaciones, los grupos conjugados se unen directamente a oligonucleótidos en compuestos oligoméricos. En determinadas realizaciones, los grupos conjugados se unen a los oligonucleótidos mediante un grupo de enlace conjugado. En determinadas de tales realizaciones, los grupos de enlace conjugado, que incluyen, pero no se limitan a, unidades estructurales de enlace bifuncionales tales como los conocidos en la técnica, son susceptibles para los compuestos descritos en este documento. Los grupos de enlace conjugado son útiles para la unión de grupos conjugados, tales como grupos estabilizantes químicos, grupos funcionales, grupos indicadores y otros grupos a sitios selectivos en un compuesto original tal como por ejemplo un compuesto oligomérico. En general, una unidad estructural de enlace bifuncional comprende una unidad estructural hidrocarbilo que tiene dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales se selecciona para unirse a una molécula original o compuesto de interés y el otro se selecciona para unirse esencialmente a cualquier grupo seleccionado tal como un grupo funcional químico o un grupo conjugado. En algunas realizaciones, el enlazante conjugado comprende una estructura de cadena o un oligómero de unidades repetidas tales como etilenglicol o unidades de aminoácidos. Los ejemplos de grupos funcionales que se usan de forma rutinaria en una unidad estructural de unión bifuncional incluyen, pero no se limitan a, electrófilos para reaccionar con grupos nucleófilos y nucleófilos para reaccionar con grupos electrófilos. En algunas realizaciones, las unidades estructurales de enlace bifuncionales incluyen amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, insaturaciones (por ejemplo, enlaces dobles o triples) y similares.

Algunos ejemplos no limitantes de unidades estructurales de unión conjugada incluyen pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX). o AHA). Otros grupos de enlace incluyen, pero no se limitan a, alquilo C¹-C¹⁰ sustituido, alquenilo C²-C¹⁰ sustituido o no sustituido o alquinilo C²-C¹⁰ sustituido o no sustituido, en el que una lista no limitante de grupos sustituyentes preferidos incluye hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.

Los grupos conjugados se pueden unir ya sea a uno o ambos extremos de un oligonucleótido (grupos conjugados terminales) y/o en cualquier posición interna.

En determinadas realizaciones, los grupos conjugados están en el extremo 3' de un oligonucleótido de un compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, los grupos conjugados están cerca del extremo 3'. En determinadas realizaciones, los conjugados se unen en el extremo 3' de un compuesto oligomérico, pero antes de uno o más nucleósidos del grupo terminal. En determinadas realizaciones, los grupos conjugados se colocan dentro de un grupo terminal.

Se describen compuestos oligoméricos. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido y uno o más conjugados y/o grupos terminales. Tales grupos conjugados y/o terminales se pueden agregar a oligonucleótidos que tengan cualquiera de los motivos químicos discutidos anteriormente. De este modo, por ejemplo, un compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido que tiene una región de nucleósidos alternos puede comprender un grupo terminal.

Compuestos antisentido

En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. Tales compuestos antisentido son capaces de hibridar con un ácido nucleico diana, dando como resultado al menos una actividad antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido se hibridan específicamente con uno o más ácidos nucleicos diana. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido que se hibrida específicamente tiene una secuencia de nucleobase que comprende una región que tiene suficiente complementariedad con un ácido nucleico diana para permitir la hibridación y dar como resultado una actividad antisentido y una complementariedad insuficiente con cualquier no diana para evitar la hibridación no específica con cualquier secuencias no diana de ácido nucleico diana en condiciones en las que se desea una hibridación específica (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para usos in vivo o terapéuticos, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro).

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden oligonucleótidos que son completamente complementarios al ácido nucleico diana en toda la longitud del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son complementarios al 99 % del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos son complementarios en un 95 % al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, tales oligonucleótidos son complementarios en un 90 % al ácido nucleico diana.

En determinadas realizaciones, tales oligonucleótidos son complementarios en un 85 % al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, tales oligonucleótidos son complementarios en un 80 % al ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido comprende una región que es completamente complementaria a un ácido nucleico diana y es al menos un 80 % complementaria al ácido nucleico diana en toda la longitud del oligonucleótido. En determinadas de tales realizaciones, la región de complementariedad completa tiene una longitud de 6 a 14 nucleobases.

Determinados mecanismos y ácidos nucleicos diana

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden o consisten en un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico diana es una molécula de ARN endógena. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico diana es un pre-ARNm. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico diana es un transcrito IKBKAP. En determinadas realizaciones, el ARN diana es un pre-ARNm de IKBKAP.

En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario a una región de un pre-ARNm de IKBKAP. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario dentro de una región de un pre-ARNm de IKBKAP que comprende el intrón 19, intrón 20 o exón 20. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario a una región de un pre-ARNm de IKBKAP que consiste en un intrón 19, intrón 20 o exón 20. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario a una región de un pre-ARNm de IKBKAP que consiste en el exón 20 o intrón 20. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario a una región de un pre-ARNm de IKBKAP dentro del intrón 19. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario a una región de un pre-ARNm de IKBKAP dentro del intrón 20. En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido es complementario a una región de un pre-ARNm de IKBKAP dentro del exón 20.

En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido modula el empalme de un pre-ARNm. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido modula el empalme de un pre-ARNm de IKBKAP. En determinadas de tales realizaciones, el pre-ARNm de IKBKAP se transcribe a partir de una variante mutante de IKBKAP. En determinadas realizaciones, la variante mutante comprende un sitio de empalme aberrante. En determinadas realizaciones, el sitio de empalme aberrante de la variante mutante comprende una mutación que debilita el sitio de empalme 5' del exón 20. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido reduce el empalme aberrante de un pre-ARNm de IKBKAP. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido aumenta la cantidad de exón 20 incluido en el ARNm de IKBKAP normalmente empalmado. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido aumenta la cantidad de ARNm de IKBKAP omitido en el exón 20.

Determinadas composiciones farmacéuticas

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, tal composición farmacéutica comprende un diluyente o portador apropiado farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica comprende una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, tal composición farmacéutica consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, la solución salina estéril es una solución salina de calidad farmacéutica. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En determinadas realizaciones, la solución salina estéril es agua de calidad farmacéutica. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos antisentido y solución salina regulada con fosfato (PBS). En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica consiste en uno o más compuestos antisentido y solución salina regulada con fosfato (PBS) estéril. En determinadas realizaciones, la solución salina estéril es PBS de calidad farmacéutica.

En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas y/o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de un número de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, vía de administración, extensión de la enfermedad o dosis que se va a administrar.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquiera de las sales, los ésteres o las sales farmacéuticamente aceptables de dichos ésteres. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido comprenden uno o más oligonucleótidos que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. De acuerdo con lo anterior, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.

Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto oligomérico que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto oligomérico antisentido activo.

Se han usado unidades estructurales lipídicas en terapias de ácidos nucleicos en una variedad de métodos. En algunos de estos métodos, el ácido nucleico se introduce en liposomas o lipoplejos preformados hechos de mezclas de lípidos catiónicos y lípidos neutros. En determinados métodos, los complejos de ADN con lípidos mono o policatiónicos se forman sin la presencia de un lípido neutro. En determinadas realizaciones, se selecciona una unidad estructural lipídica para incrementar la distribución de un agente farmacéutico a una célula o tejido particular. En determinadas realizaciones, se selecciona una unidad estructural lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico al tejido graso. En determinadas realizaciones, se selecciona una unidad estructural lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico en el tejido muscular.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento comprenden uno o más oligonucleótidos modificados y uno o más excipientes. En determinadas de tales realizaciones, los excipientes se seleccionan de agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en este documento comprende un sistema de administración. Los ejemplos de sistemas de administración incluyen, pero no se limitan a, liposomas y emulsiones. Determinados sistemas de administración son útiles para preparar determinadas composiciones farmacéuticas, incluidas las que comprenden compuestos hidrófobos. En determinadas realizaciones, se usan determinados disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en este documento comprende una o más moléculas de administración específicas de tejido diseñadas para administrar uno o más agentes farmacéuticos descritos a tejidos o tipos celulares específicos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico de tejido.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en este documento comprende un sistema codisolvente. Determinados de tales sistemas de codisolventes comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En determinadas realizaciones, tales sistemas de codisolventes se usan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitante de dicho sistema de codisolvente es el sistema de codisolvente de VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende un 3 % p/v de alcohol bencílico, un 8 % p/v del surfactante no polar Polysorbate 80™ y 65 % p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de tales sistemas codisolventes pueden variar considerablemente sin alterar significativamente sus características de solubilidad y toxicidad. Adicionalmente, la identidad de los componentes del codisolvente puede variar: por ejemplo, se pueden usar otros surfactantes en lugar de Polysorbate 80™; se puede variar el tamaño de la fracción de polietilenglicol; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en este documento se prepara para administración oral. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para la administración bucal.

En determinadas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para su administración mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En determinadas de tales realizaciones, una composición farmacéutica comprende un portador y se formula en solución acuosa, tal como agua o soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o solución reguladora salina fisiológica. En determinadas realizaciones, se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En determinadas realizaciones, las suspensiones inyectables se preparan usando portadores líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. Determinadas composiciones farmacéuticas para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis. Determinadas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Determinados disolventes apropiados para su uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, pero no se limitan a, disolventes lipófilos y aceites grasos, tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, y liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, tales suspensiones también pueden contener estabilizantes o agentes apropiados que aumentan la solubilidad de los agentes farmacéuticos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

En determinadas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica para la administración transmucosa. En determinadas de tales realizaciones, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en este documento comprende un oligonucleótido en una cantidad terapéuticamente eficaz. En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

En determinadas realizaciones, uno o más oligonucleótidos modificados descritos en este documento se formulan como profármacos. En determinadas realizaciones, tras la administración in vivo, un profármaco se convierte químicamente en la forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente más activa de un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, los profármacos son útiles porque son más fáciles de administrar que la forma activa correspondiente. Por ejemplo, en determinados casos, un profármaco puede ser más biodisponible (por ejemplo, mediante administración oral) que la forma activa correspondiente. En determinados casos, un profármaco puede tener una solubilidad mejorada en comparación con la forma activa correspondiente. En determinadas realizaciones, los profármacos son menos solubles en agua que la forma activa correspondiente. En determinados casos, tales profármacos poseen una transmisión superior a través de las membranas celulares, donde la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad. En determinadas realizaciones, un profármaco es un éster. En determinadas de tales realizaciones, el éster se hidroliza metabólicamente a ácido carboxílico tras la administración. En determinados casos, el compuesto que contiene ácido carboxílico es la forma activa correspondiente. En determinadas realizaciones, un profármaco comprende un péptido corto (poliaminoácido) unido a un grupo ácido. En determinadas de tales realizaciones, el péptido se escinde tras la administración para formar la forma activa correspondiente.

Se describen composiciones y métodos para reducir la cantidad o actividad de un ácido nucleico diana en una célula. Opcionalmente, la célula está en un animal. Opcionalmente, el animal es un mamífero. Opcionalmente, el animal es un roedor. Opcionalmente, el animal es un primate. Opcionalmente, el animal es un primate no humano. Opcionalmente, el animal es un ser humano.

Se describen métodos para administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto oligomérico descrito a un animal. Las vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, oral, rectal, transmucosa, intestinal, enteral, tópica, supositorio, por inhalación, intratecal, intracerebroventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratumoral y parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular, y subcutáneo). Opcionalmente, se administran intratecales farmacéuticos para lograr exposiciones locales en lugar de sistémicas. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden inyectar directamente en el área del efecto deseado (por ejemplo, en los ojos, oídos).

Opcionalmente, se administra una composición farmacéutica a un animal que tiene al menos un síntoma asociado con la disautonomía familiar. Opcionalmente, tal administración da como resultado la mejora de al menos un síntoma. Opcionalmente, la administración de una composición farmacéutica a un animal da como resultado una disminución del ARNm de IKBKAP empalmado de forma aberrante en una célula del animal. Opcionalmente, tal administración da como resultado un aumento en el ARNm de IKBKAP normalmente empalmado y/o un aumento en el ARNm que contiene el exón 20. Opcionalmente, tal administración da como resultado un aumento en el ARNm de IKBKAP normalmente empalmado y/o un aumento en el ARNm que contiene los exones 20-37. Opcionalmente, tal administración da como resultado un aumento en el ARNm de IKBKAP normalmente empalmado y/o una disminución en el ARNm omitido del exón 20. Opcionalmente, tal administración da como resultado una disminución de la proteína IKAP truncada y un aumento de la proteína IKAP normal. Opcionalmente, la administración de una composición farmacéutica da como resultado una mejora de: anhidrosis, disminución del gusto, reflejos tendinosos profundos deprimidos, hipertensión postural, pérdida de la percepción del dolor y la temperatura, alacrima, reflujo gastroesofágico y escoliosis. Opcionalmente, tal mejora es la reducción de la gravedad de tales defectos. Opcionalmente, la mejora es la aparición tardía de tales defectos. Opcionalmente, la mejora es la progresión lenta de tales defectos. Opcionalmente, la mejora es la prevención de tales defectos. Opcionalmente, la mejora es la progresión lenta de tales defectos. Opcionalmente, la mejora es la reversión de tales defectos.

Opcionalmente, se prueba un animal para detectar defectos en el gen IKBKAP. Opcionalmente, se identifica un animal que tiene uno o más defectos de empalme en el gen IKBKAP. Opcionalmente, se administra una composición farmacéutica a un animal identificado por tener un defecto en el gen IKBKAP. Opcionalmente, el animal se prueba después de la administración.

Opcionalmente, se prueban los defectos en un transgén de IKBKAP humano. Opcionalmente, se identifica un animal que tiene uno o más defectos de empalme en un transgén de IKBKAP humano. Opcionalmente, se administra una composición farmacéutica a un animal identificado por tener un defecto en un transgén de IKBKAP humano. Opcionalmente, el animal se prueba después de la administración.

Opcionalmente, se prueba un animal para detectar defectos en un gen Ikbkap de ratón. Opcionalmente, se identifica un animal que tiene uno o más defectos de empalme en un gen Ikbkap de ratón. Opcionalmente, se administra una composición farmacéutica a un animal identificado por tener un defecto en el gen IKBKAP. Opcionalmente, el animal se prueba después de la administración.

La divulgación también describe un compuesto antisentido como se describe en este documento, para su uso en cualquiera de los métodos como se describe en este documento. Por ejemplo, se describe un compuesto antisentido que comprende un oligonucleótido antisentido para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a FD mediante la administración del compuesto antisentido directamente en el sistema nervioso central (CNS) o líquido cefalorraquídeo (CSF).

Opcionalmente, el compuesto antisentido se administra por vía sistémica. Opcionalmente, la administración sistémica es mediante inyección intravenosa o intraperitoneal. Opcionalmente, la administración sistémica y la administración en el sistema nervioso central se realizan al mismo tiempo. Opcionalmente, la administración sistémica y la administración en el sistema nervioso central se realizan en diferentes momentos.

Opcionalmente, la administración de compuestos antisentido es sistémica, ya sea sola o en combinación con la administración en el CSF. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía sistémica. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía subcutánea. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas se administran mediante inyección intramuscular.

Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas se administran tanto directamente al CSF (por ejemplo, inyección y/o infusión IT y/o ICV) como sistémicamente.

Divulgación no limitativa

Los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar la invención reivindicada y no pretenden limitar la misma. Aunque la lista de secuencias que acompaña a esta presentación identifica cada secuencia como ya sea "ARN" o "ADN" según se requiera, en realidad, esas secuencias se pueden modificar con cualquier combinación de modificaciones químicas. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que tal designación como "ARN" o "ADN" para describir oligonucleótidos modificados es, en determinados casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende una unidad estructural de azúcar 2'-OH y una base de timina podría describirse como un ADN que tiene un azúcar modificado (2'-OH para el 2'-H natural del ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metilado) para el uracilo natural de ARN).

De acuerdo con lo anterior, las secuencias de ácido nucleico enumeradas en este documento, incluidas, pero no se limitan, las de la lista de secuencias, pretenden abarcar ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de ARN y/o ADN natural o modificado, incluidos, pero no se limita a, dichos compuestos nucleicos. ácidos que tienen nucleobases modificadas. A modo de ejemplo adicional y sin limitación, un compuesto oligomérico que tiene la secuencia de nucleobase "ATCGATCG" abarca cualquier compuesto oligomérico que tenga tal secuencia de nucleobase, ya sea modificado o sin modificar, incluidos, pero no se limitan a, tales compuestos que comprenden bases de ARN, tales como los que tienen secuencia "AUCGAUCG" y las que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN como "AUCGATCG" y los compuestos oligoméricos que tienen otras bases modificadas o de origen natural, tales como "ATmeCGAUCG", en la que meC indica una base de citosina que comprende un grupo metilo en el 5- posición.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar la invención reivindicada y no pretenden limitar la misma. Esta sección puede contener ejemplos de la invención reivindicada y ejemplos de referencia útiles para comprender la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Construcción de minigenes que contienen fragmentos genómicos del gen inhibidor de la proteína asociada a la quinasa kappa B (IKBKAP)

La disautonomía familiar (FD) está causada por una mutación puntual en el sitio de empalme 5' del intrón 20, que conduce a un empalme aberrante y la omisión del exón 20 de la secuencia genómica de IKBKAP (Anderson, S.L. et al., 2001. Am J Hum Genet 68:753-758). Por consiguiente, los minigenes de IKBKAP se construyeron clonando los fragmentos genómicos que comprenden el exón 19 al exón 21 (designado en este documento como wt19-21) o el exón 19 al exón 22 (designado en este documento como wt19-22).

Los fragmentos genómicos de IKBKAP que abarcan los exones 19-21 y 19-22 se amplificaron usando cebadores específicos. El fragmento genómico para wt19-21 se amplificó usando la secuencia del cebador directo IKAP19F6 (GGGGAAGGATCCGCCATGGAGTTAATGGTGTGTTTAGCATTACAGG, designada en este documento como SEQ ID NO: 2) y la secuencia del cebador inverso IKAP21R3 (GGGGAAT CT AGACTTAGGGTTAT G ATCATAAATCAGATTGAG, designada en este documento como SEQ ID NO: 3). El fragmento genómico para wt19-22 se amplificó usando la secuencia del cebador directo IKAP19F6 y la secuencia del cebador inverso IKAP22R (GGGGAATCTAGATTACTTCAATTCTGTAAAAAACAAGTTAATATG, designada en este documento como SEQ ID NO: 4). El gen IKBKAP en ADN genómico humano (Promega) se usó como plantilla. La mutación principal encontrada en FD (IVS20+6T^-C) (Dong, J. et al., 2002. Am. J. Med. Genet. 110: 253-257) se introdujo tanto en minigenes wt19-21 como en wt19-22 mediante mutagénesis dirigida al sitio para crear los minigenes mt19-21 y mt19-22. Los cuatro fragmentos de minigen se clonaron individualmente en el vector de expresión de mamífero, pCADN3.1 (Invitrogen). Un ATG en marco como primer codón dentro de una secuencia consenso de Kozak en el extremo 5', aguas abajo del promotor del citomegalovirus, así como un codón de parada en el extremo 3', aguas arriba de una señal poli(A) del vector pCADN3.1, también se introdujeron (Figura 4).

Cada construcción de vector minigen se transfectó individualmente en células HEK-293 cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v). La transfección se realizó mediante electroporación (aparato Gene Pulsar II, Bio-Rad) para cotransfectar 3 |ig de la construcción en 7 X 105 células HEK-293 resuspendidas en un volumen de 70 |iL de Optimem (Invitrogen) y sembradas en placas de 6 pocilios, como se describió previamente (Hua, Y., et al., 2007. PLoS Biol 5:e73). Después de 72 horas, se amplificó el ADNc sintetizado a partir del ARN total extraído de células HEK-293, como se describió anteriormente (Hua, Y., et al., 2007. PLoS Biol 5:e73). wt19-21 y mt19-21 se amplificaron con el cebador directo pCDNAF (TAATACGACTCACTATAGGG, designado en este documento como SEQ ID NO: 5) y cebador inverso IKAP21R4 (CTTAGGGTTATGATCATAAATCAG, designado en este documento como SEQ ID NO: 6). wt19-22 y mt-19-22 se amplificaron con cebador directo pCDNAF y cebador inverso IKAP22R2 (TTCAATTCTGTAAAAAACAAG, designado en este documento como SEQ ID NO: 7). Se observó una omisión predominante constante del exón 20 en las versiones mutantes de los minigenes, recapitulando de este modo el empalme aberrante observado en pacientes con FD.

Ejemplo 2: Efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la omisión del exón 20 en los minigenes IKBKAP

Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico IKBKAP humano y se probaron sus efectos sobre el pre-ARNm de IKBKAP in vitro. Juntos, los oligonucleótidos antisentido superpuestos abarcaron la región completa de 74 nucleótidos de la secuencia del exón 20 de IKBKAP, así como las regiones intrónicas de 100 nucleótidos inmediatamente aguas arriba y aguas abajo del exón 20. Los oligonucleótidos antisentido se presentan en la tabla 1 y se diseñaron como oligonucleótidos uniformes de 2'-O-metoxietil ribosa (MOE) con esqueletos de fosfato. Cada oligonucleótido tiene 15 nucleósidos de longitud. Todos los residuos de citosina en todo el oligonucleótido son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica la mayoría de los nucleósidos en 5' a los que se dirige el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica la mayoría de los nucleósidos en 3' a los que se dirige el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido enumerado en la tabla 1 se dirige a la secuencia genómica IKBKAP humana (el complemento de GENBANK No. de acceso NT_008470.16 truncado de los nucleótidos 13290828 a 13358424, designado en este documento como SEQ ID NO:1). ISIS 414161 tiene un desajuste con SEQ ID NO:1.

Se transfectaron células HEK-293 cultivadas que albergaban la construcción del vector minigen mt19-21 a una densidad de 7 X 105 células por pocillo usando electroporación (aparato Gene Pulsar II, Bio-Rad) con 0.007 nmol de oligonucleótido antisentido, como se describió anteriormente (Hua, Y., et al., 2007. PLoS Biol 5:e73). ISIS 383548, ISIS 383553, e ISIS 383874, que se usaron como oligonucleótidos de control que no provocan ninguna omisión del exón, se transfectaron de forma similar. Estos oligonucleótidos sirvieron como controles para efectos no específicos de oligonucleótidos MOE uniformes con esqueletos de fosfato. También se cultivaron células que albergaban el minigen wt19-21 y el minigen mt19-21 solo y se usaron como controles para los niveles de inclusión del exón 20. Dos días después, el ADNc sintetizado a partir del ARN total extraído de las células HEK-293 se amplificó usando el cebador directo pCDNAF y la secuencia del cebador inverso IKAP21R4 para analizar el patrón de empalme de los ARN expresados mediante RT-PCR. Para calcular los niveles de inclusión del exón 20, los amplicones de PCR se marcaron con ^a 32P-dCTP. A continuación, los productos de PCR se separaron mediante PAGE nativo, seguido de análisis de imágenes de fósforo en un instrumento FUJIFILM FLA-5100 (Fuji Medical Systems USA Inc.). Las intensidades de banda se cuantificaron usando el software Multi Gauge versión 2.3 (FUJIFILM) y los valores se normalizaron para el contenido de G C de acuerdo con la secuencia de ADN.

Los resultados se presentan en la tabla 1 y la figura 4. Los resultados indican que 6 oligonucleótidos antisentido consecutivos, ISIS 414161, ISIS 414162, ISIS 414163, ISIS 414164, ISIS 414165, e ISIS 414166, se dirigen inmediatamente a una región intrónica de 40 nucleótidos aguas abajo del sitio de empalme 5' del exón 20, la inclusión del exón 20 aumentó notablemente. Esto sugiere la presencia de múltiples elementos silenciadores de empalme o estructuras secundarias inhibidoras dentro de esta región, designada en este documento como ISS-40. Otros tres oligonucleótidos antisentido, ISIS 414135, ISIS 414136, e ISIS 414137, que se dirigen a una región de 20 nucleótidos en el intrón 19 aguas arriba (designado en este documento como ISS-20) también tuvieron un efecto positivo en la inclusión del exón 20 (Tabla 1 y Figura 4). Los oligonucleótidos antisentido dirigidos al exón 20 dieron como resultado una omisión casi completa del exón. El tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos a los sitios de empalme 3' y 5' provocó una mayor omisión del exón 20. Determinados otros oligonucleótidos antisentido dirigidos a regiones intrónicas también provocaron una mayor omisión porque se dirigieron a importantes elementos de empalme que actúan en cis, el tracto de polipirimidina o el sitio de empalme 5' del intrón 20. ISIS 414167 e ISIS 414168, que se dirigen a un potenciador de empalme intrónico (designado en este documento como ISE-20), también disminuyeron significativamente los niveles de la isoforma de ARN incluida en comparación con el control no tratado. Los resultados de los tres conjuntos de células tratadas con oligonucleótidos de control se combinaron y el promedio se presenta en la tabla 1, designado como "oligonucleótidos de control". "n/a" indica "no aplicable. "n.d." indica que no hay datos para ese oligonucleótido en particular.

La omisión del exón 20 provoca un desplazamiento del marco de lectura que introduce un codón de terminación prematura (PTC) en el exón 21, lo que hace que el ARNm sea potencialmente susceptible a la degradación de según las reglas caracterizadas de la vía de desintegración del ARNm mediada sin sentido (NMD) (Nagy, E., and Maquat, L.E. 1998. Trends Biochem Sci 23:198-199). Se realizó un experimento similar al descrito anteriormente usando los minigenes wt19-22 y mt19-22 para determinar si la ruta NMD controla la estabilidad de la isoforma omitida de ARNm. Se observó el mismo patrón de inclusión u omisión del exón 20 con los minigenes wt19-22 y mt19-22 que se observó con los minigenes 19-21 correspondientes. Por lo tanto, no hay evidencia de que la isoforma de ARNm omitida resultante del minigen mt19-22 estuviera sujeta a NMD.

Para confirmar este hallazgo, se eliminó un solo nucleótido en el exón 21 del minigen mt19-22 para restaurar el marco de lectura y eliminar el codón de terminación prematura (PTC). Este minigen se denominó minigen mt19-22FC (Figura 3). Los tres minigenes, wt19-22, mt19-22 y mt19-22FC, se transfectaron individualmente en células HEK-293 usando el mismo protocolo descrito anteriormente. El ARN expresado se analizó mediante RT-PCR. De acuerdo con la observación realizada en el estudio con transfección de oligonucleótidos antisentido descrito anteriormente, los ARNm omitidos con o sin PTC eran igualmente estables (Figura 5). Esto confirma que al menos en las células HEK-293, la isoforma de ARNm omitida no está sujeta a NMD.

Ejemplo 3: Efecto de oligonucleótidos diseñados por microwalk sobre la omisión de exón en los minigenes IKBKAP

Se diseñaron oligonucleótidos adicionales dirigidos al primer tramo de 30 nucleótidos de ISS-40. Estos oligonucleótidos se diseñaron eligiendo secuencias desplazadas en incrementos de un nucleótido aguas arriba y aguas abajo (esto es, un "microwalk") de ISS-40, comenzando desde la posición 6 en el exón 20. Los oligonucleótidos antisentido se presentan en la tabla 2 y la figura 4D, y se diseñaron como oligonucleótidos uniformes de 2'-O-metoxietil ribosa (MOE) con esqueletos de fosfato. Cada oligonucleótido tiene 20 nucleósidos de longitud. Todos los residuos de citosina en todo el oligonucleótido son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica la mayoría de los nucleósidos en 5' al que se dirige el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. "Sitio de parada" indica la mayoría de los nucleósidos en 3' al que se dirige el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido enumerado en la tabla 2 se dirige al intrón 20 de la secuencia genómica IKBKAP humana (el complemento de GENBANK No. de acceso NT_008470.16 truncado de los nucleótidos 13290828 a 13358424, designado en este documento como SEQ ID NO:1). Estos oligonucleótidos se probaron in vitro. ISIS 414161, ISIS 414162, ISIS 414163, ISIS 414163, ISIS 414164, ISIS 414165, e ISIS 414166, que mostraron un alto porcentaje de inclusión, también se incluyeron en el ensayo.

Se transfectaron células HEK-293 cultivadas que albergaban la construcción del vector minigen mt19-21 a una densidad de 7 X 105 células por pocillo usando electroporación (aparato Gene Pulsar II, Bio-Rad) con 0.007 nmol de oligonucleótido antisentido, como se describió anteriormente (Hua, Y., et al., 2007. PLoS Biol 5:e73). Los oligonucleótidos de control que no causan ninguna omisión del exón se transfectaron de manera similar y sirvieron como controles para los efectos no específicos de los oligonucleótidos MOE uniformes con esqueletos de fosfato. También se cultivaron células que albergaban el minigen wt19-21 y el minigen mt19-21 solo y se usaron como controles para los niveles de inclusión del exón 20. Dos días después, el ADNc sintetizado a partir del ARN total extraído de las células HEK-293 se amplificó usando el cebador directo pCDNAF y la secuencia del cebador inverso IKAP21R4 para analizar el patrón de empalme de los ARN expresados mediante RT-PCR. Para calcular los niveles de inclusión del exón 20, los amplicones de PCR se marcaron con ^a 32P-dCTP. A continuación, los productos de la PCR se separaron mediante PAGE nativo, seguido de análisis de imágenes de fósforo. Se cuantificaron las intensidades de las bandas y se normalizaron los valores del contenido de G+C según la secuencia de ADN. Los resultados se presentan en la tabla 2. Se observó que el tratamiento de las células con ISIS 421992 restauró los niveles de inclusión del exón 20 al 96 % en el minigen mutante. También se observó que los oligonucleótidos antisentido de 20 mer tienen un efecto positivo más fuerte en el empalme del exón 20 que los oligonucleótidos antisentido de 15 mer que se dirigen a la misma región.

Tabla 2

continuación

Ejemplo 4: Efecto de ISIS 421992 en fibroblastos derivados de FD

Para investigar el efecto de ISIS 421992 sobre fibroblastos derivados del paciente, se usó la línea de fibroblastos cutáneos del paciente GM04899 (Coriell Cell Repository). La línea celular se derivó de un homocigoto individual para la principal mutación FD.

Se cultivó GM04899 en medio esencial mínimo (Invitrogen) suplementado con aminoácidos no esenciales (Invitrogen) y suero bovino fetal al 20 % (v/v). Las células se cultivaron hasta una confluencia del 40-50 % en placas de 10 cm. Las células se transfectaron con concentraciones 2 nM, 5 nM, 25 nM o 125 nM de ISIS 421992 usando 12 |ⁱ L de reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dos días después, el ADNc sintetizado a partir del ARN total extraído de las células HEK-293 se amplificó usando el cebador directo pCDNAF y la secuencia del cebador inverso IKAP21R4 para analizar el patrón de empalme de los ARN expresados mediante RT-PCR. Para calcular los niveles de inclusión del exón 20, los amplicones de PCR se marcaron con ^a 32P-dCTP. A continuación, los productos de la PCR se separaron mediante PAGE nativo, seguido de análisis de imágenes de fósforo. Se cuantificaron las intensidades de las bandas y se normalizaron los valores del contenido de G+C según la secuencia de ADN. Los resultados se presentan en la tabla 3 y la figura 1. Los carriles múltiples para cada condición representan experimentos independientes.

El tratamiento con ISIS 421992 suprimió casi por completo el defecto de empalme, como se demostró por el porcentaje de inclusión del exón 20 en la tabla 3 y el panel izquierdo de la figura 1A. Se ha demostrado que la kinetina (6-furfurilaminopurina) mejora el empalme y aumenta la expresión de ARNm de IKBKAP de tipo salvaje y de proteína IKAP en líneas celulares FD (Hims, M.M. et al., 2007. J. Mol. Med. 85: 149-161). El tratamiento con ISIS 421992 fue tan eficaz como el tratamiento con kinetina durante 3 días para restaurar los niveles de ARNm de longitud completa (Figura 1A, panel derecho). Se trató un lote de células con disolvente (NaOH) solo de la solución de kinetina como control. Como control positivo se usó ARN de IMR90, una línea celular de fibroblasto pulmonar diploide normal de tipo salvaje. Los resultados se expresan como porcentaje de inclusión del exón 20 en comparación con la inclusión del exón 20 (100 %) de ARNm de IKBKAP en células IMR90.

El tratamiento con ISIS 421992 a 5 nM también dio como resultado un aumento significativo en los niveles de proteína IKAP, cuando se ensayó 3 días después de la transfección. Las muestras de proteínas se obtuvieron mediante extracción con Trizol y se separaron mediante SDS-PAGE. Las bandas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con un anticuerpo anti-IKAP (abcam # ab56362) (dilución 1:1,000 en leche al 5 % en TBST) durante 12 h. La membrana se lavó 5 veces con TBST durante 5 min cada una y luego se sondeó con anticuerpo secundario LiCor de 800 nm (1:5,000 en leche al 5 % en TBST) durante 1 hora en la oscuridad. Posteriormente, la membrana se lavó 5 veces con TBST durante 5 min cada una. A continuación, las bandas se expusieron a 800 nm y se cuantificó la intensidad de la banda usando un instrumento Odyssey (LiCor). Los resultados se presentan en la tabla 4 como aumento porcentual de la intensidad de la banda en comparación con las bandas tratadas con oligonucleótidos de control. Los datos indican que el tratamiento con ISIS 421992 aumentó significativamente los niveles de proteína IKAP en comparación con el control. Tenga en cuenta que en estas condiciones, la kinetina no aumentó los niveles de proteína IKAP.

Tabla 3

Tabla 4

Ejemplo 5: Efecto de ISIS 421992 en un modelo de ratón transgénico

Para investigar el efecto de ISIS 421992 en un modelo animal, se obtuvieron ratones transgénicos que portan el gen IKBKAP humano completo con la mutación principal de FD, además de ser de tipo salvaje homocigótico en el locus Ikbkap del ratón, de una instalación central de los NIH. Aunque los ratones transgénicos no muestran ningún fenotipo de enfermedad evidente, debido a la presencia del gen Ikbkap de ratón de tipo salvaje, el ARNm expresado por el transgén IKBKAP humano mutante muestra un patrón de omisión similar al de los pacientes con ^fD (Hims, M.M. et al., 2007. Genomics. 90: 389-396).

Se trataron ratones adultos con ISIS 421992 administrado mediante infusión intracerebroventricular a una velocidad de 50 pg/día, 100 pg/día o 200 pg/día. El protocolo ha sido descrito previamente por Hua et al. (Genes Dev. 2010.

24: 1634-1644). Se anestesiaron ratones adultos de 3-4 meses de edad y 20-30 g de peso y se colocaron en un instrumento estereotáxico digital (David Kopf Instruments). Se perforó un pequeño orificio de trépano en el sitio quirúrgico 1.8 mm lateral a la sutura sagital y 0.3 mm posterior a la sutura bregma a través del cráneo por encima del ventrículo lateral derecho. Se colocó una cánula con un estilete de 2.2 mm en el orificio. La cánula se conectó a una bomba microosmótica Alzet (modelo 1007D, Durect Corporation) con un catéter de vinilo. La bomba, precargada con la solución de oligonucleótidos o solo PBS, se implantó por vía subcutánea en la espalda y se infundió continuamente la solución a través de la cánula en el ventrículo lateral a una velocidad de 0.5 pL por hora. Después de una semana de infusión de ICV, los ratones se sacrificaron el día 8 y se extrajo el ARN de la médula espinal torácica de los ratones transgénicos usando Trizol y siguiendo el protocolo del fabricante. Se midieron los niveles de ARNm de IKBKAP humano y los resultados se presentan en la tabla 5 y la figura 2A. Los carriles múltiples para cada condición representan experimentos independientes. Los datos indican que hubo un aumento dependiente de la dosis en la inclusión del exón 20 en los niveles de ARNm de IKBKAP humano en estos ratones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 10 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 10 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 34801 a 34828 de SEQ ID NO:1, en el que el oligonucleótido modificado comprende en al menos un nucleósido modificado, en el que el al menos un nucleósido modificado comprende una unidad estructural de azúcar modificada, y en el que el compuesto es capaz de aumentar la inclusión del exón 20 en un transcrito IKBKAP en una célula.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido modificado tiene de 12 a 20 nucleósidos de longitud, y en el que la secuencia comprende una porción de al menos 12 nucleobases contiguas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 34801 a 34828 de SEQ ID NO:1.

3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleobase que comprende una porción de al menos 10 nucleobases de SEQ ID NO:40, 41, 42, 43, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, o 68.

4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada nucleósido del oligonucleótido modificado es un nucleósido modificado, comprendiendo cada uno independientemente una unidad estructural de azúcar modificada.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende al menos una unidad estructural de azúcar sustituida en 2' y en el que el sustituyente de 2' de al menos una unidad estructural de azúcar sustituida en 2' se selecciona del grupo que consiste en 2'-OMe, 2'-F, y 2'-MOE.

6. El compuesto de la reivindicación 4, en el que la unidad estructural de azúcar modificada es una unidad estructural de azúcar sustituida en 2', y en el que el sustituyente en la unidad estructural de azúcar sustituida en 2' es 2'-MOE.

7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos un nucleósido es un nucleósido bicíclico.

8. El compuesto de la reivindicación 7, en el que el nucleósido bicíclico es un nucleósido de etilo restringido o un nucleósido de ácido nucleico bloqueado.

9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que:

(i) al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado, o

(ii) cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico modificado,

y en el que, opcionalmente, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.

10. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el oligonucleótido modificado comprende al menos una unidad estructural de citosina y en el que al menos una unidad estructural de citosina es una 5-metilcitosina o en el que cada unidad estructural de citosina es una 5-metilcitosina.

11. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto comprende uno o más grupos conjugados, conjugados con el oligonucleótido modificado.

12. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

13. Un método in vitro de modulación del empalme de un transcrito de IKBKAP en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.

14. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12 para su uso en un método para aumentar la inclusión del exón 20 en una transcrito de IKBKAP.

15. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de la disautonomía familiar.