CN103635594A - 基于探针的核酸检测 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于通过以下检测靶核苷酸序列的方法：用核苷酸标签将核苷酸序列加标签，提供包含调节序列和核苷酸标签识别序列的具有解链温度Tm1的探针寡核苷酸；在多核苷酸扩增反应中将探针寡核苷酸掺入加标签的多核苷酸，提供包含与调节序列至少部分互补的序列区段的具有解链温度Tm2的调节寡核苷酸，使用探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增加标签的靶核酸序列，并检测该扩增产物；其中Tm1和Tm2高于与多核苷酸扩增反应相关的退火温度。

Description

基于探针的核酸检测

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月9日提交的美国临时申请号61/484,198的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。

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发明领域

本发明涉及适于核苷酸多态性（SNP）基因分型和其他基因分析的基于PCR的检测系统。

发明背景

荧光报告物分子-猝灭剂分子对已被掺入探针寡核苷酸上以便基于被分开或置于彼此最小的猝灭距离内的荧光报告物分子和猝灭剂分子监测生物事件。例如，已开发了探针，其中由于报告物分子从猝灭剂分子的分开，报告物分子荧光的强度增加。还开发了因为猝灭剂被引入与报告物分子接近而失去它们的荧光的探针。这些报告物-猝灭剂分子对探针已被用于通过监测由报告物分子产生的荧光信号的出现或消失而监测杂交分析和核酸扩增反应，特别地聚合酶链式反应（PCR）。

关于包含报告物-猝灭剂分子对的探针的一个特别重要的应用是它们在核酸扩增反应，诸如聚合酶链式反应（PCR）中检测靶核酸序列的存在和扩增的用途。通常，核酸扩增技术为基因检测和DNA分析打开了广泛的新方法。Arnheim和Erlich,Ann.Rev.Biochem.,61:131-156(1992)。特别地，PCR已成为至关重要的研究工具，在例如，克隆、基因表达分析、DNA测序、基因作图和药物发现中应用。Arnheim和Erlich,Ann.Rev.Biochem.,61:131-156(1992)；Gilliland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.87:2725-2729(1990)；Bevan等人，PCR Methods and Applications,1:222-228(1992)；Green等人，PCR Methods and Applications,1:77-90(1991)；Blackwell等人，Science,250:1104-1110(1990)。

因此，对当与靶核酸序列杂交和未杂交时呈现可区别的荧光特征的探针存在需求。对其中报告物分子和猝灭剂分子被定位在检测对上如此以致猝灭剂能够有效猝灭报告物分子的荧光的探针存在另外的需求。对被有效合成的探针存在另外的需求。对检测方法存在另外的需求，其中少数合成的探针可被用于大量的分析。对具有高特异性的检测方法存在又另外的需求。对报告物分子和猝灭剂分子定位在检测对上如此以致当序列特异性杂交时报告物和猝灭剂分子足够靠近彼此的基于接近的猝灭存在另外的需求。

本发明的探针和方法提供了这些和另外的目的。

发明概述

在一个方面，本发明提供了用于检测靶核苷酸序列的方法，包括：

a）用核苷酸标签序列将所述靶核苷酸序列加标签，从而制备加标签的靶核酸序列；

b）提供包含与所述核苷酸标签序列互补的核苷酸标签识别序列和所述核苷酸标签识别序列的5'端的调节序列的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含第一标记物并具有解链温度Tm1；

c）使用所述探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增所述加标签的靶核酸序列，其中所述PCR扩增反应由退火温度Ta表征；

其中在包含与所述调节序列互补的序列区段的调节寡核苷酸存在下实施该PCR扩增反应，其中所述调节寡核苷酸包含第二标记物并具有解链温度Tm2；和

d）检测所述PCR扩增反应的产物；

其中所述第一标记物和所述第二标记物构成荧光报告物/猝灭剂对；且其中Tm1和Tm2二者都高于Ta。

在实施方案中，使用PCR反应将标签序列掺入加标签的靶核酸序列。

在实施方案中，核苷酸标签识别序列与核苷酸标签序列完全互补。在实施方案中，调节寡核苷酸包含与调节序列完全互补的序列区段。在实施方案中，调节寡核苷酸具有15-45个核苷酸范围的长度。在实施方案中，Ta呈55℃-62℃的范围。在实施方案中，Ta呈60℃-64℃的范围。在实施方案中，Ta呈60℃-62℃的范围。在一些实施方案中，Tm1比退火温度（Ta）高至少25℃。在一些实施方案中，Tm2比退火温度（Ta）高至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、或至少10℃。在一些实施方案中，Tm2呈60℃-75℃的范围。在一些实施方案中，通过式：T_m(℃)=4(G+C)+2(A+T)计算Tm1和Tm2。

在一些实施方案中，在大于500nL或大于1μL的反应体积中实施PCR扩增反应。例如，在一些实施方案中，在包含96-1536孔的多孔板中实施PCR扩增反应。在一些实施方案中，Ta为约57℃。

在一些实施方案中，在小于100nL的反应体积中实施PCR扩增反应。在一些实施方案中，在微流控装置（microfluidic device）中实施PCR扩增反应。在一些实施方案中，Ta为约60℃。

在某些实施方案中，Ta是生产（yielding）退火温度。在一些实施方案中，PCR扩增反应包含在退火温度（Ta）下的至少20个循环。

附图简述

图1说明使用本分析用于基因分型。T=靶序列或互补物；X、Y=标签序列或互补物，R_G、R_R=报告物，Q=猝灭剂，z、w=调节序列或互补物。

详述

A.定义

除非另有说明，如以下阐明的定义权利要求和说明书中使用的术语。为了清楚，特定地定义这些术语，但所有的定义都与本领域技术人员将如何理解这些术语一致。

除非上下文另有清楚规定，还指出，如本文和所附权利要求中所用的，单数形式“一（a）”、“一（an）”和“该（the）”包括复数所指。因此，例如，提及“一个细胞”是提及一个或多个细胞和本领域技术人员已知的其等同物。

如本文所用的，“固定的”指不溶的或包含、附着至或可操作地络合至不可溶的、部分不可溶的、胶质的、粒子的、分散的、悬浮的和/或脱水的物质或包含或附着至固体支持体的分子或固相。

如本文所用的，“固体支持体”指包含固定基质的组合物，诸如但不限于，不溶的物质、固相、表面、基底、层、涂层（coating）、织造纤维或非织造纤维、基质、晶体、膜、不可溶聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容或生物可蚀解或生物可降解的聚合物或基质、微米粒子或纳米粒子。固体支持体包括，且不限制，例如单层、双层、商业膜、树脂、基质、纤维、分离介质、色谱支持体、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠、微球、纳米球、硅、砷化镓、有机和无机金属、半导体、绝缘体、微米结构和纳米结构。微米结构和纳米结构可包括，不限制，微型化、纳米级及超分子的探针、管尖、条（bar）、销钉（peg）、塞子、棒（rod）、套筒（sleeve）、金属丝（wire）、细丝和管。

当本文用于指核酸中的两个核苷酸序列时，术语“邻近的”可以指由0至约20个核苷酸、更具体地在约1至约10个核苷酸范围内的核苷酸分开的核苷酸序列，或直接邻接彼此的序列。

术语“核酸”指核苷酸聚合物，且除非另外限制，包括能够以与天然存在的核苷酸相似的方式行使功能（例如，杂交）的天然的核苷酸的类似物。除非另外限制，“核酸”可包括，除了标准的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶之外，多种天然存在的和合成的碱基（例如，肌苷）、核苷酸和/或骨架。

术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括，例如，基因组DNA；通常通过信使RNA（mRNA）的逆转录或通过扩增获得的互补DNA（cDNA），其是mRNA的DNA表示；合成或通过扩增产生的DNA分子；和mRNA。

术语核酸包含双链或三链核酸，及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不需要是同延的（即，双链核酸不需要是沿着两条链的整体长度的双链）。

术语核酸还包含其任何化学修饰，诸如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可包括针对单个核酸碱基或针对核酸作为整体掺入额外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和功能的化学基团的添加。此类修饰可包括碱基修饰，诸如2-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、骨架修饰、异常碱基配对组合诸如异碱基（isobase）异胞嘧啶核苷（isocytidine）和异胍（isoguanidine），等等。

更特别地，在某些实施方案中，核酸可包含聚脱氧核糖核苷酸（包含2-脱氧-D-核糖）、聚核糖核苷酸（包含D-核糖）、和为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型的核酸，及包含normucleotidic骨架的其他聚合物，例如，聚酰胺（例如，肽核酸（PNA））和多吗啉基寡核苷酸（polymorpholino）（从the Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.商业可得，如Neugene）聚合物，和其他合成的序列特异性的核酸聚合物，条件是该核酸聚合物包含处于允许诸如见于DNA和RNA中的碱基配对和碱基堆积的构型中核酸碱基。术语核酸还包含锁核酸（LNA），其在美国专利号6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中被描述，通过引用将这些专利的每一个并入本文。

核酸可源自完全化学合成的过程，诸如固相介导的化学合成，源自生物来源，诸如通过从产生核酸的任何物种的分离，或源自包括通过分子生物学工具操作核酸的过程，诸如DNA复制、PCR扩增、逆转录，或源自那些过程的组合。

本文所用的术语“靶核酸”是指本发明方法中待被检测的特定的核酸。

如本文所用的术语“靶核苷酸序列”指感兴趣的核苷酸序列，诸如，例如，通过扩增靶核酸获得的扩增产物或当逆转录RNA靶核酸时产生的cDNA。在RNA的情况下，靶核苷酸序列可用尿嘧啶（U）取代胸腺嘧啶（T）。

如本文所用的，术语“互补的”指两个核苷酸之间精确配对的能力。即，如果在核酸的给定位置处，核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，那么这两个核酸被认为在那个位置处与彼此互补。“互补物”可以是完全地或部分地互补的序列。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或当单链分子之间存在总的互补性时其可以是完全的。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。部分互补的两条序列可具有，例如跨至少7个核苷酸、更典型地10-30个核苷酸的范围的序列且通常跨至少14-25个核苷酸的序列的至少90%同一性、或至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。将被理解的是，引物序列的3'端碱基将预期地与靶核酸序列的对应的碱基完全互补以允许引导（priming）的发生。

“特异性杂交”指在限定的严格条件下，与存在于杂交混合物中的其他核苷酸序列的基本结合不存在时，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员认识到放松杂交条件的严格性允许容忍序列错配。在特定实施方案中，在严格杂交条件下实施杂交。

“T_m”指“解链温度”，其是双链核酸分子的群体半-离解为单链所处的温度。如本文所用的，单链寡核苷酸的T_m指包含该寡核苷酸和其完全的互补物的双链分子的T_m。报告物或猝灭剂不被包含在T_m的确定中。如本文所用的，可通过计算确定T_m。具体地，寡核苷酸的T_m可以是根据方程：“T_m(℃)=4(G+C)+2(A+T)”（Thein和Wallace,1986,于Human genetic disorders，第33-50页，IRL Press,Oxford UK，通过引用并入本文）计算的T_m。

术语“寡核苷酸”被用于指相对短的，通常短于200个核苷酸，更具体地短于100个核苷酸，最具体地短于50个核苷酸的核酸。典型地，寡核苷酸是单链DNA分子。本发明使用的寡核苷酸可被化学修饰。化学修饰可使寡核苷酸具备额外的功能，诸如化学活性、亲和力或免受例如核酸酶的降解的保护。

术语“引物”指在适当条件下（例如，在4种不同的核苷三磷酸和用于聚合的剂诸如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的存在下）在适当的缓冲液中并在适宜的温度下，能够与核酸杂交（还称为“退火”）并作为核苷酸（RNA或DNA）聚合的起始位点的寡核苷酸。引物的适当的长度取决于引物的预期用途，但引物典型地至少7个核苷酸长且、更典型地为10至30个核苷酸、或甚至更典型地从15至30个核苷酸的范围的长度。其他引物某种程度上可以更长，例如，30至60个核苷酸长。在这个背景下，“引物长度”指与互补的“靶”序列杂交并引导核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短的引物分子通常要求较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不需要反映模板的确切序列但必须足够互补以与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”指引物与其杂交的靶核酸的区段。

引物被称为与另一个核酸退火，如果该引物或其部分与该核酸内的核苷酸序列杂交。引物与特定核苷酸序列的杂交的陈述并不预期暗示该引物完全地或专门地与该核苷酸序列杂交。例如，在某些实施方案中，本文使用的扩增引物被称为“与核苷酸标签退火”。该描述包含与核苷酸标签完全退火的探针/引物，及与核苷酸标签部分退火和与邻近的核苷酸序列部分退火，例如，靶核苷酸序列的探针/引物。此杂交引物可增加扩增反应的特异性。

如本文所用的，选择引物“以避免与靶核酸基本退火”指选择引物以使得扩增之后检测的大部分扩增子在它们由在靶核酸的每一个末端的预期位点的引导造成的意义上讲是“全长”，如与靶核酸内的引导造成的扩增子相反，其产生短于预期的扩增子。在多种实施方案中，选择引物以使得至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的扩增子是全长。

术语“引物对”指包含与待被扩增的DNA序列的5'末端的互补物杂交的5'“上游引物”或“正向引物”和与待被扩增的序列的3'末端杂交的3'“下游引物”或“反向引物”的一组引物。如将被本领域技术人员认识的，术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”并不预期限制，而是在特定的实施方案中提供说明性方向。

“探针”是通过一种或多种类型的化学键，一般通过互补碱基配对能够与具有互补序列的靶核酸结合因此形成双链体结构的核酸，该互补碱基配对通常通过氢键形成。探针与“探针结合位点”结合或杂交。可以用可检测的标记物标记探针以允许探针、特别是在探针已与其互补靶结合之后的简便的检测。可选地，然而，探针可以是非标记的，但通过与标记的配体直接地或间接地特异性结合可以是可检测的。探针的大小可显著不同。通常，探针的长度至少为7至15个核苷酸。其他探针为至少20、30或40个核苷酸长。仍然其他的探针某种程度上更长，为至少50、60、70、80或90个核苷酸长。又其他探针仍然更长，且为至少100、150、200或更多的核苷酸长。探针还可以是由任何以上的值限定的任何范围（例如，15-20个核苷酸长）内的任何长度。

引物或探针序列可和与其杂交的序列完全互补或可以是少于完全互补的。在某些实施方案中，引物或探针序列跨至少7个核苷酸的序列、更典型地跨10-30个核苷酸的范围的序列、且通常跨至少14-25个核苷酸的序列与靶核酸序列的互补物具有至少65%的同一性、且更通常具有至少75%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、或至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。将被理解的是某些碱基（例如，引物的3'端碱基）通常与靶核酸序列的对应碱基预期地完全互补。

本文所用的术语“核苷酸标签序列”、“核苷酸标签”和“标签序列”是指被添加至靶核苷酸序列的预先确定的核苷酸序列。核苷酸标签可编码关于靶核苷酸序列的一项信息，诸如靶核苷酸序列的身份或靶核苷酸序列所源自的样品的身份。在某些实施方案中，可以在一个或多个核苷酸标签中编码此信息，例如，两个核苷酸标签的组合，在靶核苷酸序列的任一末端各一个，可编码该靶核苷酸序列的身份。

如本文所用的，术语“编码反应”指其中至少一个核苷酸标签被添加至靶核苷酸序列的反应。该过程可被称为“加标签”。例如可通过“编码PCR”添加核苷酸标签，其中至少一条引物包含靶特异性部分和位于靶特异性部分的5'末端的核苷酸标签，和仅包含靶特异性部分或靶特异性部分和位于该靶特异性部分的5'末端的核苷酸标签的第二引物。关于适于编码PCR的PCR操作说明的说明性实例，见，例如PCT公布号WO2004/051218和WO US03/37808及美国专利号6,605,451，其在此通过引用整体被并入。还可通过可包含连接反应的“编码连接”反应添加核苷酸标签，该连接反应中至少一条引物包含靶特异性部分和位于靶特异性部分的5'末端的核苷酸标签，和仅包含靶特异性部分或靶特异性部分和位于该靶特异性部分的5'末端的核苷酸标签的第二引物。说明性的编码连接反应在例如美国专利号7,601,821和专利公布号2005/0260640中被描述，其在此通过引用整体且特别地关于连接反应被并入。还可通过其他扩增方法添加核苷酸标签；见以下。

如本文所用的，“编码反应”产生“加标签的靶核苷酸序列”或“加标签的靶多核苷酸”，其包含与靶核苷酸序列连接的核苷酸标签。

如本文所用的关于引物的部分，术语“靶特异性”核苷酸序列指在适当的退火条件下能够与靶核酸或靶核苷酸序列特异性退火的序列。

如本文所用的关于探针/引物的部分，术语“核苷酸标签识别序列”指在适当的退火条件下能够与核苷酸标签特异性退火的序列。

根据本教导，“扩增”包含通过其复制了至少一种靶核酸的至少一部分的任何方法，典型地以模板依赖性的方式，包括且不限于，用于线性地或指数地扩增核酸序列的广泛范围的技术。用于执行扩增步骤的说明性方法包括连接酶链式反应（LCR）、连接酶检测反应（LDR）、连接随后通过Q-复制酶扩增、聚合酶链式反应（PCR）、引物延伸、链置换扩增（SDA）、超支化链置换扩增、多重置换扩增（MDA）、基于核酸链的扩增（NASBA）、两步多重扩增、滚环扩增（RCA），等等，包括多重版本和其组合，例如，但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR（还称为联合链式反应-CCR），等等。除了其他的来源之外，此类技术的描述可见于Ausbel等人；PCR Primer:A LaboratoryManual,Diffenbach,Ed.,Cold Spring Harbor Press(1995)；The ElectronicProtocol Book,Chang Bioscience(2002)；Msuih等人，J.Clin.Micro.34:501-07(1996)；The Nucleic Acid Protocols Handbook,R.Rapley,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.(2002)；Abramson等人，Curr Opin Biotechnol.1993February;4(1):41-7，美国专利号6,027,998；美国专利号6,605,451，Barany等人，PCT公布号WO97/31256；Wenz等人，PCT公布号WO01/92579；Day等人，Genomics,29(1):152-162(1995)，Ehrlich等人，Science252:1643-50(1991)；Innis等人，PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Academic Press(1990)；Favis等人，Nature Biotechnology18:561-64(2000)；和Rabenau等人，Infection28:97-102(2000)；PHILLIPBELGRADER,MICHAEL M.MARINO,MATTHEW LUBIN,FRANCISBARANY.Genome Science and Technology.1(2):77-87,(1996)；Belgrader,Barany和Lubin,Development of a Multiplex Ligation Detection ReactionDNA Typing Assay,Sixth International Symposium on Human Identification,1995（在万维网的：promega.comigeneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-可得）；LCR Kit Instruction Manual,Cat.#200520,Rev#050002,Stratagene,2002；Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:188-93(1991)；Bi和Sambrook,Nucl.Acids Res.25:2924-2951(1997)；Zirvi等人，Nucl.Acid Res.27:e40i-viii(1999)；Dean等人，Proc Natl Acad Sci USA99:5261-66(2002)；Barany和Gelfand,Gene109:1-11(1991)；Walker等人，Nucl.Acid Res.20:1691-96(1992)；Polstra等人，BMC Inf.Dis.2:18-(2002)；Lage等人，Genome Res.2003February;13(2):294-307，和Landegren等人，Science241:1077-80(1988)，Demidov,V.,Expert Rev Mol Diagn.2002November;2(6):542-8.，Cook等人，J Microbiol Methods.2003May;53(2):165-74，Schweitzer等人，Curr Opin Biotechnol.2001February;12(1):21-7，美国专利号5,830,711，美国专利号6,027,889，美国专利号5,686,243，PCT公布号WO0056927A3和PCT公布号WO9803673A1。通过引用将每一个在前列出的参考文献并入本文。在一些实施方案中，扩增包含以下顺序程序的至少一个循环：至少一条引物与互补的或基本上互补的序列在至少一个靶核酸处退火；使用聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸的至少一条链；和变性新形成的核酸双链体以分开链。可以或可以不重复循环。扩增可包含热循环或可被等温地执行。

“聚合酶链式反应扩增”或“PCR”指其中由用于DNA解链和DNA的酶促复制的反应的重复的加热和冷却的循环组成的热循环的扩增方法。PCR热循环操作说明是本领域众所周知的。典型地，PCR由一系列20-40个循环组成。例如，且不限于，循环可包含变性步骤、退火步骤（允许引物与单链DNA模板退火）和延伸/延长步骤。每一个步骤都可在特定的温度、持续特定长度的时间并在特定反应条件下发生。例如，且不用于限制，变性步骤的温度可以为95℃，退火步骤（Ta）的温度可以为62℃及延伸/延长步骤的温度可以为72℃。在一些PCR操作说明（例如，降落式PCR）中，初始循环中的高退火温度可在初始循环的增加的循环中被降低。为了本发明的目的，在此操作说明中，将Ta定义为在大部分循环中使用的退火温度。

本文所用的术语“qPCR”是指定量实时聚合酶链式反应（PCR），其还被称为“实时PCR”或“动态聚合酶链式反应”。

“试剂”广泛地指用于反应的、除了分析物（例如，被分析的核酸）之外的任何剂。用于核酸扩增反应的说明性试剂包括，但不限于，缓冲液、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料、核酸酶，等等。用于酶反应的试剂包括，例如，底物、辅因子、缓冲液、金属离子、抑制剂和激活剂。

如本文所用的术语“标记物”指可被用于提供可检测的和/或可定量的信号的任何原子或分子。特别地，可将标记物直接地或间接地附着至核酸或蛋白。可被附着至探针的适合的标记物包括，但不限于，放射性同位素、荧光团、生色团、质量（mass）标记物、电子致密粒子、磁粒子、自旋标记物、发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。

术语“染料”具有其在本领域中的标准含义。如本文所用的术语“荧光染料”通常指当被电磁辐射源诸如，灯、光电二极管或激光照射时，通过荧光机制发射较长波长的电磁辐射的任何染料。

术语“报告物分子”指能够产生荧光信号的分子。“猝灭剂分子”指能够吸收被激发的报告物分子的荧光能量，从而猝灭否则将从被激发的报告物分子释放的荧光信号的分子。为了猝灭剂猝灭被激发的荧光团，在起始于报告物分子的激发但在报告物分子释放储存的荧光能量之前的一段时间，猝灭剂在被激发的报告物分子的最小猝灭距离内通常是有利的。在基于接近的猝灭应用中，报告物和猝灭剂分子定位与彼此足够近如此以致无论何时该报告物分子被激发，激发态的能量都转移至猝灭剂分子，其中猝灭剂非辐射地消散或在不同于报告物分子的发射频率的发射频率发射。一些非放射性能量转移机制跨较短的距离起作用并是用于基于接近的猝灭应用合适的。

术语“高弹体”具有用于本领域的一般含义。因此，例如，Allcock等人（Contemporary Polymer Chemistry，第2版）描述了通常作为在它们的玻璃转化温度和液化温度之间的温度存在的聚合物的高弹体。弹体材料呈现弹性性能，因为聚合物链容易经受扭转运动以允许响应于力展开骨架链，而骨架链反冲（recoiling）以假定不存在力时的先验形状。通常，当施加力时使得高弹体变形，但随后当去除力时恢复到它们的初始形状。

“多态性标记”或“多态性位点”是核苷酸序列趋异（divergence）发生所在的位点。说明性的标记具有至少两个等位基因，每一个都以典型地大于选择的群体的1%、或更典型地大于选择的群体的10%或20%的频率出现。多态性位点可小至一个碱基对。多态性标记包括限制性片段长度多态性（RFLP）、可变数目串联重复（VNTR）、高变区、小卫星、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、缺失和插入元件诸如Alu。首先鉴定的等位基因形式被任意地指定为参考形式且其他等位基因形式被指定为可替代的或变体等位基因。在选择的群体中最高频率存在的等位基因形式有时被称为野生型形式。二倍体生物体可以是等位基因形式纯合的或杂合的。双等位基因的多态性具有两种形式。三等位基因的多态性具有三种形式。

“单核苷酸多态性（SNP）”发生在由单个核苷酸占有的多态性位点，其是等位基因序列之间变化的位点。该位点之后和之前通常是等位基因的高度保守的序列（例如，在小于1/100或1/1000群体成员中不同的序列）。SNP通常由于将多态性位点处的一个核苷酸取代为另一个而引起。转换是一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶的取代。颠换是嘌呤被嘧啶或相反的取代。SNP还可由相对于参考等位基因的核苷酸的缺失或核苷酸的插入引起。

B.描述

在一个方面，本发明提供了用于检测靶核苷酸序列的方法，包括：a）用核苷酸标签序列将靶核苷酸序列加标签，从而制备加标签的靶核酸序列；b）提供包含与核苷酸标签序列互补的核苷酸标签识别序列和核苷酸标签识别序列5'的调节序列的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含第一标记物并具有解链温度Tm1；c）使用探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增加标签的靶核酸序列，其中所述PCR扩增反应通过退火温度Ta被表征；其中在包含与调节序列互补的序列区段的调节寡核苷酸的存下实施PCR扩增反应，其中所述调节寡核苷酸包含第二标记物并具有解链温度Tm2；和d）检测PCR扩增反应的产物；其中该第一标记物和该第二标记物构成荧光报告物/猝灭剂对；且其中Tm1和Tm2都高于Ta。不希望被特定的机制限制，实施其中探针寡核苷酸的Tm和调节寡核苷酸的Tm二者都超过Ta的反应，降低了背景信号（荧光）并提供了优越的分析结果。

在一个方面，本发明提供了用于通过以下检测具有靶核苷酸序列的多核苷酸的方法：用核苷酸标签将包含期望的靶核苷酸序列的多核苷酸加标签，提供包含调节序列和核苷酸标签识别序列的具有解链温度Tm1的探针寡核苷酸；在多核苷酸扩增反应中将该探针寡核苷酸掺入加标签的多核苷酸，提供包含与调节序列至少部分互补的序列区段的具有解链温度Tm2的调节寡核苷酸；其中Tm1和Tm2高于与多核苷酸扩增反应相关的退火温度。

加标签

在该方法中，核苷酸标签序列（“标签序列”或“NTS”）与靶核苷酸序列（TNS）在称为“加标签”的过程中缔合。在一个实施方案中，不限制，标签序列在扩增反应中与靶核苷酸序列缔合。例如，可使用聚合酶链式反应（PCR）扩增TNS，其中第一（例如，“正向”）引物包含靶特异性部分5'的核苷酸标签序列，导致包含标签序列和TNS（例如，TNS的5'和邻近TNS的标签序列）二者的扩增子。在一些实施方案中，扩增反应使用第二（例如，“反向”）引物。

在特定实施方案中，本发明提供了用于将每一个标签核苷酸序列引入一个或多个靶核酸的扩增方法。本方法需要扩增典型地多个样品中的一个或多个核酸。样品可以以任何方式与另一个样品不同，例如，不同的样品可来自不同的组织、受试者、环境来源，等等。可引入标签序列作为加标签寡核苷酸的部分。在扩增反应，例如PCR中，加标签寡核苷酸可行使包括靶核苷酸识别序列和核苷酸标签的加标签引物的功能。识别可由靶核苷酸序列和靶核苷酸识别序列之间的部分或全部互补性编码。此外，核苷酸标签可被选择与靶核苷酸识别序列缔合并可编码靶核酸中的靶核苷酸序列。可提供在感兴趣的序列的侧翼的反向引物。

标签序列可被掺入为直接邻近靶特异性序列或其间具有有限数目的连接基核苷酸。连接基核苷酸的数目优选小于25、更优选小于10、仍然更优选小于5。在特定的实施方案中，可通过与加标签的核酸靶杂交从调节寡核苷酸救出（rescue）探针寡核苷酸。杂交可以针对加标签的靶核酸上的核苷酸标签，该核苷酸标签被探针寡核苷酸上的核苷酸标签识别序列识别。

根据本发明，标签序列和TNS定义了复合序列串（composite sequencestretch，CSS），其更通常被称为“加标签的靶核酸序列”，并有时被称为“加标签的多核苷酸靶”。包含加标签的靶核酸序列的扩增子可以是双链或单链的。

包含靶核苷酸识别序列和标签序列的加标签引物被用于将核苷酸标签序列缔合进入“加标签的靶核酸序列”。优选地，加标签引物呈15-60个核苷酸范围的长度。更优选地，加标签引物呈18-45个核苷酸范围的长度。加标签引物的精确的序列和长度部分取决于加标签引物与其结合的靶核苷酸序列的性质。序列和长度可不同以实现用于特定实施方案的适合的退火和解链特征。优选地，加标签引物具有50-85℃范围内的解链温度Tm。更优选地，加标签引物具有60-75℃范围内的解链温度Tm。在特定实施例中，靶核苷酸识别序列的序列和长度可不同以实现与探针的适合的退火和解链特征。

在扩增反应的扩增子产物是双链的实施方案中，第一链将包含标签序列和TNS，且互补链将包含第一链中序列的互补物。为了清楚的目的，以下的讨论指标签序列和TNS，但将被领会的是使用互补序列可实施等效的分析。被本公开内容指导的技术人员将立即认识到如何用对引物和探针序列的适合调整通过检测任一链进行本发明的分析。

将被领会的是，取决于其中标签序列与靶核苷酸序列缔合的步骤的性质，加标签的靶核酸序列可包含另外的序列元件，例如，如果正向引物包含除了标签序列和靶特异性部分之外的序列和/或反向引物包含除了靶特异性序列之外的序列。

探针寡核苷酸

本发明还涉及与加标签的靶核酸序列（CSS）的部分缔合的探针寡核苷酸（有时称为“寡核苷酸探针”）。即，探针寡核苷酸包含与加标签的靶核酸序列的核苷酸标签序列部分互补的“核苷酸标签识别序列”部分，如此以致寡核苷酸探针可与加标签的靶核酸序列杂交并在扩增反应中用作引物。核苷酸标签识别序列可与核苷酸标签序列或其互补物部分地或完全地一致。探针寡核苷酸通常还包含调节序列，通常在核苷酸标签序列的5'，如以下讨论的。

在一个实施方案中，探针寡核苷酸的核苷酸标签识别序列与核苷酸标签序列的互补物杂交。即，核苷酸标签序列可以在加标签的靶核酸序列（或“加标签的多核苷酸”）的一条链的5’末端，且探针寡核苷酸可与在加标签的多核苷酸的第二条链的3’末端的核苷酸标签序列的互补物杂交。

优选地，探针寡核苷酸呈15-60个核苷酸范围的长度。更优选地，探针寡核苷酸呈18-45个核苷酸范围的长度。探针寡核苷酸的精确的序列和长度部分取决于探针寡核苷酸与其结合的核苷酸标签的性质。整体序列和长度可不同以实现用于特定实施方案的适合的退火和解链特征。探针寡核苷酸的解链温度可以大于95℃。探针寡核苷酸的解链温度可落入50-85℃、55-80℃、60-75℃、65-70℃、75℃、60-120℃、75-115℃或更多的范围内或其可落入具有这些值中的一个作为端点的范围（例如，50-75℃）内。优选地，探针寡核苷酸具有55-85℃范围内的解链温度Tm。更优选地，探针寡核苷酸具有65-75℃范围内、甚至更优选地>75℃的解链温度Tm。在一些实施方案中，关于探针寡核苷酸的计算的Tm可以>100℃。在特定实施例中，核苷酸标签识别序列和长度可以不同以当探针首先被掺入多核苷酸时实现扩增反应的初始循环中的适合的退火和解链特征。

通过探针寡核苷酸扩增加标签的靶核酸序列

在一些实施方案中，使用探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增加标签的靶核酸序列（或其部分）。通常，扩增反应包含3'（反向）引物。将被认识到的是，当探针寡核苷酸包含调节序列时，扩增的产物将包含调节序列、核苷酸标签序列和靶核苷酸序列。

在加标签的靶核酸依赖的方法中，还可将探针寡核苷酸掺入较长的核酸构建体。例如，可通过经由与加标签的靶核酸杂交的接近促进将探针寡核苷酸连接至另一个核酸。更通常地，探针寡核苷酸可用作扩增反应中的引物，其中其被掺入加标签的靶核酸。

通过退火温度Ta表征PCR扩增反应（见以下）。根据本发明，探针寡核苷酸的解链温度（Tm1）大于扩增反应的Ta。在一些实施方案中，Tm1比退火温度高至少1℃、至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃、至少20℃、至少21℃、至少22℃、至少23℃、至少24℃、至少25℃、至少35℃或至少50℃。在一些实施方案中，Tm1比退火温度（Ta）高至少50℃。在一些实施方案中，Tm1比Tm2高至少25℃。

在调节寡核苷酸存在下实施PCR扩增反应，如以下讨论的。

调节寡核苷酸

本发明涉及调节寡核苷酸，其包含与探针寡核苷酸的调节序列互补的序列区段。在扩增反应过程中，调节寡核苷酸的序列区段与探针寡核苷酸的调节序列的退火与探针寡核苷酸和加标签的靶核酸序列（或“CSS”）的缔合竞争。

优选地，调节寡核苷酸呈6-60个核苷酸范围的长度。更优选地，调节寡核苷酸呈15-45个核苷酸范围的长度。甚至更优选地，调节寡核苷酸呈18-30个核苷酸范围的长度。

在一些实施方案中，调节寡核苷酸可包含在该序列区段侧翼的核苷酸（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个核苷酸）。见实施例2。在一些实施方案中，序列区段包含调节寡核苷酸的全部或大部分（例如，至少80%或至少90%）的长度。在一些实施方案中，序列区段呈6-60个核苷酸范围的长度，更优选地，呈15-45个核苷酸范围的长度且甚至更优选地呈18-30个核苷酸范围的长度。调节寡核苷酸的精确的序列和长度部分取决于调节寡核苷酸与其结合的探针寡核苷酸的性质。序列和长度可不同以实现用于特定实施方案的适合的退火和解链特征。

调节寡核苷酸的解链温度（Tm2）可落入45-85℃、50-80℃、55-75℃、60-70℃、65-75℃的范围内或其可落入具有这些值中的一个作为端点的范围（例如，50-75℃）内。优选地，调节寡核苷酸具有50-85℃范围内的解链温度Tm。更优选地，调节寡核苷酸具有60-75℃范围内的解链温度Tm。在特定实施例中，识别调节序列的区段的序列和长度可不同以实现与探针的适合的退火和解链特征。在一些实施方案中，可添加竞争性辅助序列以增加探针寡核苷酸对加标签的靶核酸的特异性。

根据本发明，调节寡核苷酸的解链温度（Tm2）大于扩增反应的Ta。在一些实施方案中，Tm2比退火温度高至少1℃、至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃、至少20℃、至少21℃、至少22℃、至少23℃、至少24℃或至少25℃。

优选地，调节寡核苷酸的3’端核苷酸被封闭或使得不能够被核酸聚合酶延伸。通过将报告物或猝灭剂分子通过连接部分附着至探针寡核苷酸的3'端碳方便地实施此封闭。

典型地，探针寡核苷酸将具有与被靶向的加标签的多核苷酸互补的序列，其比调节序列长的多，所述调节寡核苷酸与所述调节序列互补。如此，调节寡核苷酸与被靶向的加标签的多核苷酸竞争与探针寡核苷酸杂交，但从互补性方面将典型地处于劣势。然而，调节寡核苷酸从互补性方面将与未被靶向的核酸具有较高的成功的竞争，探针寡核苷酸可与该未被靶向的核酸非特异性地结合，并因此减少反应中探针的非特异性掺入。另外，可以以较高的浓度提供调节寡核苷酸，进一步增加其与未被靶向的核酸的竞争。

在多种实施方案中，调节寡核苷酸的浓度可超过探针寡核苷酸。在一些实施方案中，可根据反应中总的核酸调整调节寡核苷酸的浓度。可以以超过反应中的寡核苷酸探针或总的核酸至少10%、50%、100%、500%、1000%或更多提供调节寡核苷酸。

辅助序列

调节寡核苷酸可具有用作对靶核酸/探针寡核苷酸杂交的竞争性序列的辅助序列。当沿着调节序列比对探针寡核苷酸和调节寡核苷酸时，辅助序列区段可与探针寡核苷酸、更典型地与核苷酸标签识别序列至少部分重叠。即，调节寡核苷酸可包含与调节序列和探针寡核苷酸的核苷酸标签识别序列的至少部分二者互补的序列。换句话说，调节寡核苷酸的序列区段可以与调节序列和探针寡核苷酸的核苷酸标签识别序列的至少部分是互补的。可调整辅助序列和探针寡核苷酸之间互补性的程度以调节特异性。在其中探针寡核苷酸在扩增反应中被掺入加标签的多核苷酸的实施方案中，辅助序列甚至在扩增反应的初始循环中就可竞争非特异性位点，更具体地未加标签的核酸。由于与游离的核酸相比辅助序列将以增加的局部浓度存在，调节寡核苷酸与探针寡核苷酸沿着调节序列的杂交可增强辅助序列与探针寡核苷酸的杂交。另外，可调整调节寡核苷酸和因此辅助序列的浓度以允许其有效竞争未加标签的核酸。在特定的实施方案中，可以以1.5至4倍过量、1至10倍过量、4至10倍过量、1.5至50倍过量、4至50、100倍过量或具有任何这些值作为端点的任何其他范围（例如，1.5至10倍过量）提供调节寡核苷酸。具有这些优势，辅助序列可以以甚至低至0的互补性调节对探针寡核苷酸的特异性。在辅助序列和探针寡核苷酸之间低至无互补性下，探针寡核苷酸与加标签的核酸的杂交将成功地胜过调节寡核苷酸上的辅助序列。

此外，猝灭剂序列可被掺入调节寡核苷酸序列以增强猝灭。在优选的实施方案中，一个或多个脱氧鸟苷核苷酸将被掺入至探针寡核苷酸上的报告物分子的杂交位点附近的猝灭剂序列。在一些实施方案中，可将脱氧鸟苷尾添加至调节序列杂交的3'的猝灭剂序列。

信号和靶序列存在的对应性

与调节寡核苷酸的缔合影响与探针寡核苷酸缔合的信号。因此，探针寡核苷酸与CSS的相互作用防止探针寡核苷酸与调节寡核苷酸的杂交。结果，探针寡核苷酸相关的信号的变化帮助检测靶核苷酸序列。

标签序列的掺入设计为依赖于特异性TNS的存在。结果，本发明将样品中特异性核苷酸序列（即，特异性靶核酸序列）的存在与信号的变化联系起来。可在用本发明的检测方法询问（interrogate）样品之前和之后采集信号。因此，信号的变化被解读为与特异性TNS的存在有关。此外，本发明还涉及监测靶多核苷酸序列的扩增。因此，本发明涉及用于通过追踪随时间推移信号中的变化监测靶序列的核酸扩增的方法。

在本发明的多种实施方案中，与将探针寡核苷酸掺入加标签的核苷酸有关的变化的信号涉及探针寡核苷酸从调节寡核苷酸的释放。调节寡核苷酸与未掺入的探针寡核苷酸的缔合形成报告物/猝灭剂对，以致在适于该缔合的条件下猝灭可能的信号。将探针寡核苷酸掺入加标签的靶核酸破坏了此报告物/猝灭剂对的形成，导致信号的变化。在多种实施方案中，用报告物分子标记探针寡核苷酸并用猝灭剂分子标记调节寡核苷酸。示例性的报告物/猝灭剂对包含荧光染料和它们的猝灭剂。

在一些实施方案中，多个探针寡核苷酸将特异性针对不同的标签序列。与每一个标签序列有关的信号通过连接识别特定核苷酸标签的每一个探针寡核苷酸至特异性报告物或猝灭剂区分。

在本分析方法中，当存在互补的靶序列时，探针与互补的靶序列的杂交破坏了调节寡核苷酸与探针的杂交，其中猝灭剂分子不再足够靠近报告物分子以猝灭报告物分子。结果，当与靶序列杂交时探针提供了比当未杂交时增强的荧光信号。

退火温度

在多核苷酸扩增反应的退火阶段过程中，引物与多核苷酸退火以引导在延长温度时的延长反应。扩增反应的“退火温度”通常通过实验确定以获得具有期望的特异性的最高产量。通常，较高的退火温度增加对被靶向的多核苷酸的特异性。反应中在靶位点处的被退火的引物的比例（fraction）直接影响总的产量并取决于许多因素，包括反应中靶和其他多核苷酸的竞争性位点、退火时间、与引物和靶位点的互补区相关的解链温度和退火温度。较高的退火温度影响反应中引物与非特异性竞争位点的结合能并因此可将该引物群体转至特异性靶位点。较高的退火温度还增加可被用于引物结合的反应中的单链靶多核苷酸的比例。然而，较高的退火温度通过影响用于靶位点与特异性引物结合的结合自由能对该相互作用具有禁用作用。期望的退火温度通过增加至被靶向的位点的被退火的引物的比例促进反应产量。

“生产退火温度”落入导致反应中期望的靶以高于非期望的多核苷酸序列的扩增的速率扩增的温度范围。用于每一个扩增反应的生产退火温度可被独立选择。生产退火温度可选自温度范围，例如，退火温度可以在15℃-80℃、30℃-75℃、40℃-75℃、50℃-72℃、60℃-64℃、55℃-62℃、63℃、64℃、65℃的范围内或可落入具有这些温度的一个作为端点的任何范围（例如，50℃-62℃）内。

通过减少寡核苷酸与非特异性位点的结合增加寡核苷酸与靶位点的杂交特异性。非特异性靶位点通常是具有较低的互补性的位点，但为了反应的目的，它们通常是其中寡核苷酸的结合不是期望的位点。

存在满足在给定的退火温度下的增加的特异性要求的一些技术。这些技术允许使用较低的退火温度并采用引物和靶核酸结合的竞争性抑制剂。Puskas等人，Genome Research5:309-311(1995)和Harry等人，BioTechniques,24:445-450(1998)，在此通过引用被并入，提供了与靶核苷酸序列互补的引物和与所述靶核苷酸序列部分互补并且3'被修饰以防止延长的寡核苷酸。这些寡核苷酸通过占据引物将与其退火的非特异性位点并反而使得引物群体转向靶核苷酸序列增加特异性。由于它们与靶核苷酸序列部分互补，引物能够与部分互补的寡核苷酸成功地竞争靶核苷酸序列。Kong等人，Biotechnology Letters,26:277-280(2004)，其在此通过引用被并入，采用与引物部分互补的寡核苷酸作为竞争抑制剂。这些寡核苷酸与非特异性位点成功地竞争引物并通过使得引物较少地可用于所述位点增加特异性。由于它们的减少的互补性，靶核苷酸序列在引物结合的竞争中可胜过所述寡核苷酸。

可选择多种寡核苷酸以实现在所选择的退火温度下的特异性的期望的程度。加标签引物上的靶核苷酸识别序列可在适合条件下并在所选择的退火温度下与靶核苷酸序列特异性退火。可选择条件如此以致引物退火将对靶核苷酸序列中的变化是灵敏的。通常，针对引物3'末端的核苷酸错配大大影响了从引物的延长。为了序列变体之间的区分，可设计引物如此以致其3'末端将针对多态性位点。可选地，可选择具有较高解链温度的序列，实现与较广泛的多种靶核苷酸序列的较低特异性退火。

具有高特异性的序列，引物可在靶核酸中多态性之间有效区分。多态性可包含一个或多个多态性位点的单个或多个核苷酸变化。多态性位点的变化可包括单个或多个核苷酸的缺失、插入和取代。从引物的延长对引物3'末端的杂交稳定性特别敏感。设计为与多态性位点在它们的3'末端对齐的引物因此对不同等位基因之间的区分是特别有用的。

加标签和检测反应

可在单独的反应中进行靶核苷酸加标签和检测。可选地，可在共同的反应体积中执行这两个步骤。可将双扩增方法用于掺入包含靶核苷酸识别序列和核苷酸标签的加标签引物和包含核苷酸标签识别序列、调节序列和信号部分的寡核苷酸引物/探针。

报告物和猝灭剂对

在多种实施方案中，本发明提供了与彼此特异性退火的探针寡核苷酸和调节寡核苷酸的一个或多个对，其中用报告物分子标记它们中的一个，并用报告物-猝灭剂对的猝灭剂分子标记另一个。当沿着调节序列比对探针寡核苷酸和调节寡核苷酸时，报告物分子和猝灭剂分子定位在与彼此足够近的寡核苷酸上如此以致无论何时该报告物分子被激发，激发态的能量非辐射地转移至猝灭剂分子，其中猝灭剂分子非辐射地消散或在不同于报告物分子的发射频率的发射频率发射。典型地，探针寡核苷酸将包含报告物分子且调节寡核苷酸将包含猝灭剂分子，然而该定位可以是相反的且该修饰对本领域的技术人员将是明显的。

在一些实施方案中，本发明的分析使用包含报告物分子的探针寡核苷酸和包含猝灭剂分子的调节寡核苷酸，所述报告物和猝灭剂分子是报告物-猝灭剂对的成员。调节寡核苷酸包含与探针寡核苷酸中的调节序列杂交的序列。探针寡核苷酸与具有靶核苷酸序列的靶加标签的多核苷酸的区特异性退火，如此以致核苷酸标签识别序列与加标签的多核苷酸中的核苷酸标签杂交。典型地使用包含核苷酸标签序列和靶核苷酸识别序列的加标签引物将核苷酸标签掺入靶多核苷酸，其中靶核苷酸识别序列与靶核苷酸序列杂交。实施扩增反应，典型地PCR以将加标签引物掺入靶多核苷酸（即，产生包含核苷酸标签序列和靶核苷酸序列的扩增子）。

当调节寡核苷酸与探针寡核苷酸沿着调节序列杂交时，报告物分子和猝灭剂分子被定位与彼此足够近，如此以致无论何时该报告物分子被激发，激发态的能量非辐射地转移至猝灭剂分子，其中猝灭剂分子非辐射地消散或在不同于报告物分子的发射频率的发射频率发射。在通过DNA聚合酶的链延伸过程中，探针寡核苷酸与模板退火并用作引物。结果，探针被掺入扩增子并从猝灭剂分子有效分离报告物分子，如此以致猝灭剂分子不再与报告物分子足够近以猝灭报告物分子的荧光。因此，由于扩增过程中越来越多的探针寡核苷酸被掺入双链多核苷酸，较大数目的报告物分子从与猝灭剂分子极为接近的相互作用中被释放出，因此导致递增数目的未被猝灭的报告物分子，产生越来越强的荧光信号。典型地在其中高于未被掺入的探针寡核苷酸的期望的比例与调节寡核苷酸杂交的条件下实施检测。在检测的任何阶段的过程中，与调节寡核苷酸杂交的未被掺入的探针寡核苷酸的量优选地大于总的未被掺入的探针寡核苷酸的50%、80%、90%、95%、99%、99.5%、99.9%、99.95%或更多。还选择检测条件，如此以致与掺入的探针寡核苷酸相比，不与调节寡核苷酸缔合的未被掺入的探针寡核苷酸的量是低的。在检测的任何阶段的过程中，不与调节寡核苷酸缔合的未被掺入的寡核苷酸的量优选地小于被掺入的探针寡核苷酸的50%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或更少。

在多种实施方案中，本发明提供了使用一种或多种探针寡核苷酸检测一种或多种靶核酸、典型地一种或多种靶多核苷酸的方法。通过从识别探针上调节序列的调节寡核苷酸救出探针可调节探针寡核苷酸的信号。可在具有与探针寡核苷酸上的调节序列部分或完全互补的调节寡核苷酸中的序列区段中编码识别。

多种因素影响杂交和扩增试验中报告物-猝灭剂分子对的利用。第一因素是猝灭剂分子猝灭报告物分子的效率。该第一个因素，本文指定为“RQ^-”，可通过当探针不与完全互补的多核苷酸杂交时报告物分子与猝灭剂分子的荧光发射比被表征。即，RQ^-是当探针寡核苷酸与调节寡核苷酸杂交时，报告物分子的荧光发射与转移至猝灭剂分子的能量的比。对RQ^-值的影响包括，例如，使用的特定的报告物和猝灭剂分子、杂交复合物中报告物和猝灭剂分子之间的间距、核苷酸序列特异性作用和结构的灵活性的程度和杂质的存在。相关的数量RQ⁺，指当探针寡核苷酸与互补的多核苷酸杂交时，报告物分子的荧光发射与转移至猝灭剂分子的能量的比。

第二因素是探针与互补的多核苷酸杂交的效率。该第二因素取决于探针的解链温度Tm、探针或靶多核苷酸中二级结构的存在、反应的温度和其他反应条件。

第三因素是调节寡核苷酸与探针寡核苷酸杂交的效率。

该第三因素取决于调节寡核苷酸的解链温度Tm、调节寡核苷酸和探针寡核苷酸之间互补性的程度、探针或调节寡核苷酸中二级结构的存在、反应的温度和其他反应条件。

第四因素是报告物分子附近的寡核苷酸序列。取决于序列，探针的荧光强度被杂交增强或减弱。通过与包含脱氧鸟苷核苷酸（Gs）的序列的杂交观察到猝灭的强烈程度，给出荧光中序列特异性的减弱。关于该效应另外的讨论，见Crocket等人，Analytical Biochemistry,290:89-97(2001)和Behlke等人，Fluorescence Quenching by Proximal G-bases（在万维网：http:double backslashcdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Fluorescence_quenching_by_proximal_G_bases.pdf可得）。

优选地，报告物分子是衍生化用于通过连接部分附着至探针寡核苷酸和调节寡核苷酸的3’端碳或5’端碳的荧光有机染料。优选地，猝灭剂分子也是有机染料，其可以是或可以不是荧光的，取决于本发明的实施方案。例如，在本发明的优选的实施方案中，猝灭剂分子是荧光的。通常无论猝灭剂分子是荧光的还是通过非放射性衰变仅仅释放从报告物分子转移的能量，猝灭剂的吸收谱带与报告物分子的荧光发射谱带应基本上重叠。吸收来自被激发的报告物分子的能量但并不辐射地释放能量的非荧光猝灭剂分子（NFQM），诸如Black Hole猝灭剂是本领域已知的并可被使用。

文献中具有可得的用于选择用于特定探针的适合的报告物-猝灭剂对的大量的实用指导，如通过下面的参考文献示例的：Clegg（以上引用）；Wu等人（以上引用）；Pesce等人，编者，Fluorescence Spectroscopy(MarcelDekker,New York,1971)；White等人，Fluorescence Analysis:A PracticalApproach(Marcel Dekker,New York,1970)；等等。文献还包含提供荧光分子和NFQM和用于选择报告物-猝灭剂对的它们的相关的光学性质的详细列表的参考文献，例如，Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules，第2版（Academic Press,New York,1971）；Griffiths,Colour and Constitution of Organic Molecules(Academic Press,Mew York,1976)；Bishop，编者，Indicators(Pergamon Press,Oxford,1972)；Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes,Eugene,1992)Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence(IntersciencePublishers,New York,1949)；等等。此外，文献中具有关于衍生化报告物分子和猝灭剂分子，用于通过可被添加至寡核苷酸的常见的反应基团的共价附着广泛的指导，如通过以下的参考文献示例的：Haugland（以上引用）；Ullman等人，美国专利号3,996,345；Khanna等人，美国专利号4,351,760；等等。

报告物-猝灭剂对的示例可选自呫吨染料，包括荧光素和若丹明染料。具有对它们的苯基部分的取代的这些化合物的许多适合的形式是商业广泛可得的，其可被用作用于键合的位点或用作用于附着至寡核苷酸的键合官能。另一组荧光化合物是在α或β位置具有氨基的萘胺。被包括在此萘胺化合物中的是1-二甲氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯、吖啶，诸如9-异硫氰酸吖啶和吖啶橙；N-(对-(2-苯并恶唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并恶二唑、均二苯乙烯、芘，等等。

优选地，报告物和猝灭剂分子选自荧光素和若丹明染料。这些染料和用于附着至寡核苷酸的适合的连接方法在许多参考文献中被描述，例如，Khanna等人（以上引用）；Marshall,Histochemical J.,7:299-303(1975)；Menchen等人，美国专利号5,188,934；Menchen等人，欧洲专利申请87310258.0；和Bergot等人，国际申请PCT/US90/05565。在此通过引用并入后4个文件。

在特定实施方案中，可被用作用于探针的可检测标记物的荧光团包括，但不限于，若丹明、花青3（Cy3）、花青5（Cy5）、荧光素、Vic^TM、Liz^TM、Tamra^TM、5-Fam^TM、6-Fam^TM、6-HEX、CAL Fluor Green520、CALFluor Gold540、CAL Fluor Orange560、CAL Fluor Red590、CAL Fluor Red610、CAL Fluor Red615、CAL Fluor Red635和Texas Red（MolecularProbes）。（Vic^TM、Liz^TM、Tamra^TM、5-Fam^TM、6-Fam^TM从Applied Biosystems,Foster City,Calif都是可得的。6-HEX和CAL Fluor染料从BiosearchTechnologies可得）。

在特定实施方案中，用作猝灭剂的分子包括，但不限于四甲基若丹明（TAMRA）、DABCYL（DABSYL、DABMI或甲基红）蒽醌、硝基噻唑、硝基咪唑、孔雀绿、Black Hole

例如，BHQ1（BiosearchTechnologies）、Iowa或ZEN猝灭剂（来自Integrated DNATechnologies,Inc.）、TIDE Quencher2（TQ2）和TIDE Quencher3（TQ3）（来自AAT Bioquest）。

具有用于将报告物或猝灭剂分子附着至寡核苷酸的5'或3'端的许多连接部分和方法，如通过以下参考文献示例的：Eckstein，编者，Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research,15:5305-5321(1987)（寡核苷酸上的3'硫醇基团）；Sharma等人，Nucleic Acids Research,19:3019(1991)（3'巯基）；Giusti等人，PCR Methods and Applications,2:223-227(1993)和Fung等人，美国专利号4,757,141（经由从Applied Biosystems,Foster City,Calif.可得的Aminolink^TMII的5'磷酸氨基）；Stabinsky,美国专利号4,739,044（3'氨烷基磷酸基团）；Agrawal等人，Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)（通过氨基磷酸酯连接键附着）；Sproat等人，NucleicAcids Research,15:4837(1987)（5'巯基）；Nelson等人，Nucleic AcidsResearch,17:7187-7194(1989)（3’氨基）；等等。

优选地，在合成过程中采用可附着至寡核苷酸的商业可得的连接部分，例如，从Integrated DNA Technologies(Coralvlille,Iowa)或EurofinsMWG Operon(Huntsville,Alabama）可得的。

若丹明和荧光素染料还通过用亚磷酰胺部分衍生化染料的方式在固相合成的结束时方便地附着至寡核苷酸的5'羟基，例如，Woo等人，美国专利号5,231,191；和Hobbs,Jr.，美国专利号4,997,928。

通过审慎地选择标记物，可进行分析，其中在单个反应中不同的波长下激活和/或检测不同的标记物。见，例如，Fluorescence Spectroscopy(Pesce等人，编者)Marcel Dekker,New York,(1971)；White等人，FluorescenceAnalysis:A Practical Approach,Marcel Dekker,New York,(1970)；Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，第2版，AcademicPress,New York,(1971)；Griffiths,Colour and Constitution of OrganicMolecules,Academic Press,New York,(1976)；Indicators(Bishop,Ed.).Pergamon Press,Oxford,19723；和Haugland,Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals,Molecular Probes,Eugene(1992)。可将报告物和猝灭剂策略性地定位在探针寡核苷酸和调节寡核苷酸上以维持这些标记物之间的期望的距离。典型地，报告物和猝灭剂分子之间的距离将被最小化以增加猝灭剂分子的效率。可策略性地选择报告物和猝灭剂分子的定位，如此以致当探针寡核苷酸与调节寡核苷酸杂交时，报告物和猝灭剂分子相距小于20nm、10nm、7.5nm、6nm、5nm、4nm、3nm、1nm、0.8nm、0.6nm、0.4nm或更少。优选地，在探针寡核苷酸/调节寡核苷酸杂交的情况下，报告物分子和猝灭剂分子可沿着调节序列被定位在互补核苷酸处。更优选地，报告物和猝灭剂分子可定位在寡核苷酸探针的5'末端和调节寡核苷酸的3'末端。

扩增方法

总述

在说明性实施方案中，可在两个或多个不同的样品的每一个中扩增靶核酸的相同的组。样品可以以任何方式与另一个样品不同，例如，样品可来自不同的组织、受试者、环境来源，等等。

与加标签引物和/或反向引物的丰度相比，可以以不同的丰度在扩增混合物中提供探针寡核苷酸。更具体地，探针寡核苷酸可以以超过加标签引物存在。在说明性实施方案中，反向引物可以以超过加标签引物的浓度在扩增混合物中存在。例如，相对于加标签引物和/或反向引物的浓度，扩增混合物中探针寡核苷酸的浓度可以是至少1.5倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少10³倍、至少5×10³倍、至少10⁴倍、至少5×10⁴倍、至少10⁵倍、至少5×10⁵倍、至少10⁶倍或更高。在说明性实施方案中，加标签引物可以以皮摩尔至纳摩尔的浓度存在，例如，约500nM至5μΜ、约100nM至5μΜ、约50nM至5μΜ、约10nM至5μΜ、约5nM至5μΜ、约1nM至10μΜ、约50μM至500μΜ、约100μM或具有任何这些值作为端点的任何其他范围（例如，10nM至50μΜ）。可在与正向引物的任何这些浓度组合使用的探针寡核苷酸的适合、说明性浓度包括约10nM至约10μΜ、约25nM至约7.5μΜ、约50nM至约5μΜ、约75nM至约2.5μΜ、约100nM至约1μΜ、约250nM至约750nM、约500nM或具有任何这些值作为端点的任何其他范围（例如，10nM至50μΜ）。

可使每一个扩增混合物经受扩增以制备包含加标签的靶核苷酸序列的靶扩增子，该加标签的靶核苷酸序列包含核苷酸标签。在某些实施方案中，选择核苷酸标签以避免与靶核酸的基本退火。在此类实施方案中，加标签的靶核苷酸序列可包括具有以下元件的分子：5'-（来自加标签引物的核苷酸标签）-（靶核苷酸序列）-3'。

在说明性的实施方案中，核苷酸标签序列鉴定特定的多态性变体。因此，例如，可扩增一组T个靶核酸，各包含S个多态性变体，其中S和T是整数，典型地大于1。在此类实施方案中，可单独地执行关于每一个靶核酸的扩增，其中不同的加标签引物被用于每一个多态性变体。具有对应的核苷酸标签的不同的探针寡核苷酸可被用于每一个多态性变体。该实施方案具有减少将需要被合成以鉴定所产生的关于多个靶序列的扩增子中多态性变异的不同的探针寡核苷酸数目的优势。可选地，可采用不同组的加标签引物和反向引物用于每一个靶，其中每一个组具有用于每一个多态性变体的不同于其他组中的引物的一组核苷酸标签，且不同的探针寡核苷酸被用于每一个样品，其中探针寡核苷酸具有对应组的核苷酸标签序列和不同的报告物分子。在任何一种情况下，扩增产生来自每一个样品的具有等位基因特异性的报告物分子的一组T个扩增子。特异性识别每一个探针寡核苷酸中不同的调节序列的调节寡核苷酸提供对应的猝灭剂分子。

在实施方案中，其中相同组的加标签引物和反向引物被用于每一个样品，用于每一个靶的加标签引物和反向引物可以最初与样品分开地组合，且每一个探针寡核苷酸/调节寡核苷酸组可最初与其对应的样品组合。最初组合的加标签引物和反向引物的等份可随后被添加至样品和探针寡核苷酸/调节寡核苷酸组的最初组合的等份。可在能够经受适于扩增的条件的任何物品中形成这些扩增混合物。例如，在扩增之前，扩增混合物可在微流控装置的分开的室中形成或分配入微流控装置的分开的室中。在说明性实施方案中，适合的微流控装置包括矩阵型微流控装置，诸如以下描述的那些。

可采用任何扩增方法以从扩增混合物中制备扩增子。在说明性实施方案中，采用PCR。

PCR热循环操作说明是本领域众所周知的。典型地，PCR由一系列20-40个循环组成。例如，且不限制，循环可包含变性步骤、退火步骤（允许引物与单链DNA模板退火）和延伸/延长步骤。

通常持续至少3个循环实施扩增以引入核苷酸标签。在多种实施方案中，持续5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个循环，或持续落入具有任何这些值作为端点的范围（例如，5-10个循环）内的任何数目的循环实施扩增。在特定实施方案中，持续足够数目的循环实施扩增以根据靶并根据样品标准化靶扩增子拷贝数（例如，15、20、25、30、35、40、45或50个循环，或持续落入具有任何这些值作为端点的范围内的任何数目的循环）。

为了说明且不限制，一个示例性的操作说明包含热启动步骤[95℃，持续5min]、35个循环的降落式PCR策略[95℃持续15sec、64℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；95℃持续15sec、63℃持续45sec和72℃持续15sec的一个循环；95℃持续15sec、62℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；95℃持续15sec、61℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；和95℃持续15sec、62℃持续45sec和72℃持续15sec的34个循环]、和冷却步骤[25℃持续10sec的1个循环]。

以上描述的方法的特定的实施方案提供了基本上一致的扩增，产生一个或多个靶扩增子，其中大部分扩增子以相对接近于对一个或多个靶扩增子计算的平均拷贝数的水平存在。因此，在多种实施方案中，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的靶扩增子以大于靶扩增子的拷贝的平均数的50%并小于靶扩增子的拷贝的平均数的2倍存在。

在某些实施方案中，本发明还提供了用于扩增多个靶核苷酸的方法，其中探针寡核苷酸的掺入任选地被省略且在扩增过程中靶核苷酸序列被加标签。更具体地，本发明提供了用于扩增典型地多个样品中的多个靶核酸的方法，其需要制备用于每一个靶核酸的扩增子混合物。每一个扩增混合物包含含有靶特异性序列的加标签引物和含有靶特异性序列的反向引物。使扩增混合物经受扩增以产生一个或多个靶核苷酸的扩增子。靶核苷酸序列随后被提供了一个或多个组的探针寡核苷酸/调节寡核苷酸，其中探针寡核苷酸识别与每一个多态性变体相关的核苷酸标签。在多种实施方案中，可执行第二扩增反应以掺入探针寡核苷酸。在可选的实施方案中，探针寡核苷酸与加标签的靶核酸杂交，其中调节寡核苷酸用作竞争性剂。在此类实施方案中，调节寡核苷酸具有与探针寡核苷酸上的核苷酸标签识别序列部分重叠的辅助序列将是特别有利的。当沿着调节序列比对探针寡核苷酸和调节寡核苷酸时，沿着相同的核苷酸，与加标签的靶核酸相比，辅助序列具有与探针寡核苷酸的减少的互补性将是进一步有利的。在优选的实施方案中，该辅助序列将位于调节寡核苷酸的5'末端。

可根据调节寡核苷酸和探针寡核苷酸之间的相互作用、及核苷酸标签和探针寡核苷酸之间的相互作用的强度的不同调整调节寡核苷酸对探针寡核苷酸的竞争性。可标准化竞争，如此以致所采集的信号相对于具有特定的多态性变体的加标签的靶核酸的平均拷贝数是成比例的。

长-范围PCR

在多种实施方案中，被扩增的靶核苷酸序列可以是，例如25个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、500个碱基或750个碱基。在以上描述的方法的某些实施方案中，可采用长-范围扩增方法，诸如长-范围PCR以从扩增混合物中产生扩增子。长-范围PCR允许从1或几千碱基（kb）至超过50kb的范围的靶核苷酸序列的扩增。在多种实施方案中，被长-范围PCR扩增的靶核苷酸序列的长度至少约1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或50kb。靶核苷酸序列还可落入具有任何这些值作为端点的任何范围（例如，25个碱基至100个碱基或5kb-15kb）内。在一些实施方案中，在以上描述的方法中使用长-范围PCR可产生多个靶扩增子，其中至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、或至少70%的靶扩增子以大于靶扩增子的拷贝的平均数的50%并小于靶扩增子的拷贝的平均数的2倍存在。

长-范围PCR是本领域众所周知的。见，例如，Cheng S,Fockler C,Barnes W M,Higuchi R(1994年6月)"Effective amplification of long targetsfrom cloned inserts and human genomic DNA".Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(12):5695-9。适于在此处描述的方法中使用的用于长-范围PCR的酶、操作说明和试剂盒是商业可得的；实例包括：SequalPrep^TMLong PCR Kit(Invitrogen,USA)、

II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene)、DNA聚合酶、

Flash High Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes)。

在某些实施方案中，在扩增过程中或之后可，例如，通过定量实时PCR定量扩增混合物中产生的靶扩增子的量。

数字PCR

在一些实施方案中，以包含平均0.8至1.6的扩增模板范围每孔，或在一些实施方案中，一个扩增模板每孔或每室的样品浓度将样品装载入扩增装置中，例如，PCR板或微流控装置。制备装置中每一个孔或室，如此以致其包含适合的加标签引物和反向引物和探针寡核苷酸/调节寡核苷酸组的相关组合。关于“数字PCR”的讨论，见，例如，Vogelstein和Kinzler,1999,Proc Natl Acad Sci USA96:9236-41；McBride等人，美国专利申请公布号20050252773，特别是实施例5（这些出版物的每一个在此都通过引用整体被并入）。数字扩增方法可利用适于数字PCR的特定-高-通量装置，诸如典型包括大量的和/或高密度的小体积反应位点的微流控装置（例如，纳米体积反应位点或反应室）。在说明性实施方案中，使用微流控装置诸如以下描述的数字阵列微流控装置（Digital Array microfluidic device）执行数字扩增。数字扩增可限定分配或划分放置在反应/分析平台或微流控装置中的数以百计至数以千计的反应混合物中的样品。在计数例如在反应端点处的阳性扩增结果的数目时，技术人员逐个计数存在于输入的样品中的个体模板分子。数字扩增的主要优势是定量独立于扩增效率的变化—成功的扩增被计数为1分子，独立于产物的实际的量。

在某些实施方案中，可在样品核酸的预扩增之后实施数字扩增。典型地，持续有限数目的热循环（例如，5个循环或10个循环）执行在数字扩增之前的预扩增。在某些实施方案中，预扩增过程中热循环数可从约4至15个热循环或约4-10个热循环的范围。在某些实施方案中，热循环数可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或大于15。以上描述的产生用于DNA测序的包含接头序列的扩增子的扩增可被典型的预扩增步骤取代。

数字扩增方法在美国专利号20090239308中被描述，其在此通过引用整体且特别地关于其数字扩增方法和装置的公开被并入。通常，在数字扩增中，相同的（或基本上相似的）扩增反应在核酸样品诸如基因组DNA上运行。对于给定的核酸样品的个体反应的数目可从约2至超过1,000,000而不同。典型地，在样品上执行的反应数为约100或更大、更典型地约200或更大且甚至更典型地约300或更大。还可执行较大规模的数字扩增，其中在样品上执行的反应数为约500或更大、约700或更大、约765或更大、约1,000或更大、约2,500或更大、约5,000或更大、约7,500或更大、或约10,000或更大。执行的反应数还可以显著较高，诸如直至约25,000、直至约50,000、直至约75,000、直至约100,000、直至约250,000、直至约500,000、直至约750,000、直至约1,000,000或甚至大于1,000,000分析每基因组样品。

在特定的实施方案中，通常选择使经受数字扩增的核酸的量，如此以致当分布在不连续的反应混合物中时，每一个个体扩增反应预期包括一个或更少的可扩增的核酸。本领域技术人员可确定如以上描述产生的靶扩增子的浓度并计算用于在数字扩增中使用的适合的量。更方便地，可检测一组连续稀释的靶扩增子。例如，从Fluidigm Corp.商业可得的装置，如12.765数字阵列微流控装置允许12个不同的稀释物被同时检测。任选地，可通过产生线性回归图确定适合的稀释。对于最佳的稀释，线应是直的并经过原点。随后，可从图计算初始样品的浓度。

可将靶扩增子的适合的量分布进入不连续的位置或反应孔或室，如此以致每一个反应包括，例如平均不超过约1个扩增子每体积。在分布之前或之后，可将靶扩增子与探针寡核苷酸/调节寡核苷酸组组合。

分配之后，使反应混合物经受扩增以鉴定包含靶扩增子的那些反应混合物。可采用任何扩增方法，但方便地，使用PCR，例如，实时PCR或终点PCR。该扩增可采用能够扩增靶扩增子的探针寡核苷酸。在特定实施方案中，提供了所有的或一些探针寡核苷酸、调节寡核苷酸、加标签引物和反向引物。在可选的实施方案中，探针寡核苷酸可与先前扩增步骤中引入的核苷酸标签退火。

任何靶扩增子的浓度（拷贝/μl）与阳性（即，包含扩增产物）反应混合物的数量相关。见美国专利公布号20090239308，其通过引用被并入用于所有目的，且特别地用于数字PCR结果的分析。还见Bube等人，2008,"Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample UsingDigital PCR on a Nanofluidic Device"PLoS ONE3(8):e2876.doi:10.1371/journal.pone.0002876，其通过引用被并入用于所有目的且特别地用于数字PCR结果的分析。

在通过数字PCR用于DNA测序的样品校准的说明性实施方案中，包含粗略地100-360个扩增子每μl的PCR反应混合物可被装载至以下描述的数字阵列微流控装置，诸如Fluidigm Corporation(South San Francisco,Calif.)的12.765数字阵列微流控装置。微流控芯片具有12块板，且每一块包含765个室。可分析数字芯片上的重复的板以获得靶核酸的初始浓度的绝对定量。

样品核酸

可从生物来源获得并使用本领域已知的常规方法制备核酸制品（“样品”）。特别地，在本文描述的方法中有用的DNA或RNA可从任何来源提取和/或扩增，包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器和高等生物诸如植物或动物，特别地哺乳动物、且更特别地人。还可从环境来源（例如，池塘水、空气样品）、从人造产品（例如，食物）、从法医样品，等等获得适合的核酸。可通过多种标准技术的任一种从细胞、体液（例如，血液、血液级分、尿，等）或组织样品中提取或扩增核酸。说明性的样品包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口液（oral fluid）和皮肤的外部切片的样品；来自呼吸器官、肠道、生殖器和尿路的样品；泪液、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样品。例如，胎儿DNA的样品可从胚胎或从母血中获得。可从活的或死亡的生物体或从体外培养物中获得样品。说明性的实例可包括单个细胞、石蜡包埋的组织样品和针吸活检。本发明中有用的核酸还可源自一种或多种核酸文库，包括cDNA、粘粒、YAC、BAC、P1、PAC文库，等等。

可使用本领域众所周知的方法分离感兴趣的核酸，特定方法的选择取决于核酸的来源、性质和相似的因素。样品核酸不需要呈纯化形式，但典型地足够纯以允许本发明方法的扩增步骤被执行。当靶核酸是RNA时，可通过本领域已知的标准方法并如例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,NY，第1、2、3卷（1989）中描述的将RNA逆转录为cDNA。随后根据本发明的方法分析cDNA。

靶核酸

可使用本发明的方法，检测可在本发明的（本文描述的）编码反应中加标签的任何靶核酸。在典型的实施方案中，关于靶核酸的至少一些核苷酸序列信息将是已知的。例如，如果采用的编码反应是PCR，关于给定的靶核酸的每一个末端的足够的序列信息通常是可用的以允许设计适合的扩增引物。在可选的实施方案中，引物中的靶特异性序列可被随机或简并核苷酸序列取代。

靶可包括，例如，与病原体诸如病毒、细菌、原生动物或真菌相关的核酸；RNA，例如其过量或低表达指示疾病的RNA、呈组织或发育特异性的方式表达的RNA；或被特定刺激诱导的RNA；可例如，在基因分型中分析其特定的多态性（诸如SNP）、等位基因或单体型的基因组DNA。具有特定兴趣的是在遗传疾病或其他病理中被改变（例如，扩增、缺失和/或突变）的基因组DNA；与期望的或非期望的性状相关的序列；和/或独特地鉴定个体（例如，法医或亲子鉴定中）的序列。

引物设计

适于核酸扩增的引物足够长以引导在用于聚合的剂的存在下延伸产物的合成。引物的确切长度和组成将取决于许多因素，包括，例如，退火反应的温度、引物的来源和组成，且当采用探针时，将应用与探针寡核苷酸和核苷酸标签的退火相同的原理设计加标签引物的核苷酸标签部分。还可以考虑引物:探针浓度的比。例如，取决于靶核酸序列的复杂性，寡核苷酸引物典型地包含识别靶向的核苷酸序列的约15至约30个核苷酸的范围，尽管其可包含更多或更少的核苷酸。引物应足够互补以与它们各自的链选择性地退火并形成稳定的双链体。本领域技术人员通晓如何选择适合的引物对以扩增感兴趣的靶核酸。

可通过任何适合的方法制备引物，包括，例如，适合的序列的克隆和限制性或通过诸如Narang等人(1979)Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等人(1979)Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981)Tetra.Lett.,22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；美国专利号4,458,066的固体支持体方法，等等的方法直接的化学合成，或可从商业来源提供。

使用Sephadex柱（Amersham Biosciences,Inc.,Piscataway,N.J.）或本领域技术人员已知的其他方法纯化引物。引物纯化可改进本发明方法的灵敏性。

分析格式

可呈多种格式包括多孔格式和微流控格式诸如，但不限于，液滴系统（见，例如，Kiss等人，2008,Anal Chem80:8975-81.)和整合的微流控装置实施本发明的分析。在一些实施方案中，在大于500nL或大于1μL的反应体积中实施PCR扩增反应。例如，在一些实施方案中，在包含96-1536个孔的多孔板中实施PCR扩增反应。在一些实施方案中，Ta为约57℃。在其他实施方案中，在小于100nL的反应体积中实施PCR扩增反应。在一些实施方案中，在微流控装置中实施PCR扩增反应。在一些实施方案中，Ta为约60℃。

微流控装置

在某些实施方案中，可使用微流控装置实施本发明的任何方法。在说明性实施方案中，该装置是矩阵-型的，微流控装置是允许在分开单独的反应室中多种基质溶液和试剂溶液的同时组合的装置。将被认识的是，基质溶液可包含一种或多种基质且试剂溶液可包含一种或多种试剂。例如，微流控装置可允许多种不同的扩增引物和样品的同时成对组合。在某些实施方案中，该装置被配置以在每一个不同的室中包含引物和样品的不同的组合。在多种实施方案中，分开的反应室的数目可以大于50、通常大于100、更通常大于500、甚至更通常大于1000、且有时大于5000或大于10,000。

在特定实施方案中，矩阵-型微流控装置是动态阵列（“DA”）微流控装置，该微流控装置的一个实例在WO05/107938A2的附图21中显示并在其中被描述。DA微流控装置是旨在隔离样品和试剂（例如，扩增引物、检测探针，等）的成对组合并适用于实施定性和定量PCR反应包括实时定量PCR分析的矩阵-型微流控装置。在一些实施方案中，至少部分从高弹体制造DA微流控装置。DA微流控装置在PCT公布WO05/107938A2（Thermal Reaction Device and Method For Using The Same）和美国专利公布US20050252773A1中被描述，关于它们的DA微流控装置的描述，通过引用将二者整体并入本文。DA微流控装置可包括高密度矩阵设计，该设计利用微流控装置的层之间的流体连通孔（fluid communication via）以编织通过装置的和层之间的控制线和流体线。凭借弹性块的多层中的流体线，高密度反应池排列是可能的。可选地，DA微流控装置可被设计以致所有的试剂和样品通道在相同的弹性层，对照通道在不同的层。

美国专利公布号2008/0223721和PCT公布号WO05/107938A2，通过应用将二者并入本文，描述了可被用于实行本文描述的方法的说明性的矩阵-型装置。WO05/107938A2的附图21显示了具有第1弹性层2110（第1层）和第二弹性层2120（第2层）的说明性矩阵设计，每一个层具有在其中形成的流体通道。例如，将第1层2110中的试剂流体通道通过通孔2130连接至第2层2120中的试剂流体通道，同时第2层2120还具有样品通道在其中，样品通道和试剂通道分别终止于样品和试剂室2180中。样品和试剂室2180通过接口通道2150与彼此流体连通，接口通道2150具有与其连接的接口阀2140以控制反应池2160的每一个室2180之间的流体连通。在使用中，首先关闭接口，随后将试剂从试剂进口引入试剂通道并通过样品进口将样品引入样品通道；随后关闭密闭阀2170以隔离每一个反应池2160与其他反应池2160。隔离反应池2160之后，打开接口阀2140以造成样品室和试剂室与彼此流体连通使得期望的反应可发生。从这个（和WO05/107938A2中描述）将是明显的是DA微流控装置可被用于将M数目的不同样品和N数目的不同试剂反应。

尽管WO05/107938中的以上描述的DA微流控装置充分地适用于进行本文描述的方法，但本发明不限于任何特定的装置或设计。可将分开样品和/或允许试剂和样品独立地成对地组合的任何装置都可被使用。美国专利公布号20080108063（其在此通过引用被整体并入）包含图解说明的48.48动态阵列IFC（Integrated Fluidic Circuit），一个从Fluidigm Corp.（SouthSan Francisco Calif.）商业可得的装置。

将被理解的是其他配置是可能的并涉及诸如，例如，48×96；96×96；30×120，等。

在特定实施方案中，微流控装置可以是数字阵列微流控装置，其适于执行数字扩增。此类装置可具有将样品和试剂的混合物分开进入纳升体积反应室中的整合的通道和阀。在一些实施方案中，至少部分从高弹体制造数字阵列微流控装置。说明性数字阵列微流控装置在Fluidigm,Inc.拥有的待审美国专利诸如美国专利公布号20090239308中被描述。一个说明性的实施方案具有对应于输入至装置的12个分开的样品的12个输入端口。装置可具有12块板，且12块板的每一块都可包含765个6nL的反应室，总的4.59μl体积每板。微流控通道可将板上不同的反应室连接至流体源。可施加压力至累加器以打开和关闭将反应室连接至流体源的阀。在说明性的实施方案中，可提供12个进口用于装载样品试剂混合物。可使用48个进口以提供用于试剂的源，当施加压力至累加器时其被提供给芯片。此外，可提供两个或多个进口以提供与生物芯片的水化。水化进口与装置流体连通以促进与反应室有关的湿度控制。作为将被本领域技术人员理解的是，可被用于本装置的制造的一些弹性材料是透气性的，允许从反应室蒸发的气体或蒸汽通过弹性材料进入周围的大气中。在特定实施方案中，位于装置的外围部分的流体线提供了水化流体的屏障，例如，生物芯片的外围的缓冲液或主要的混合物包围反应室的板，因此减少或防止存在于反应室中的液体蒸发。因此，通过向水化进口添加挥发性液体例如水，可增加装置的外围部分的湿度。在特定的实施方案中，第一进口与包围生物芯片的第一侧上的板的水化流体线流体连通且第二进口与包围生物芯片的另一侧上的板的水化流体线流体连通。

尽管数字阵列微流控装置完全适于实施本文描述的数字扩增方法，本领域普通技术人员将认识到这些装置的许多变化形式和替代选择。从Fluidigm Corp.（South San Francisco,Calif.）商业可得的12.765动态阵列的微流控装置，包括12块板，每一块都具有6nL体积每反应室、765个反应室。然而，本文描述的数字扩增方法不需要该几何结构（geometry）。给定的数字阵列微流控装置的几何结构将取决于特定的应用。涉及适于在本文描述的方法中使用的装置的另外的描述在美国专利申请公布号2005/0252773中提供，通过引用将其关于数字阵列微流控装置的公开并入本文。

在某些实施方案中，可使用提供用于反应产物的回收的微流控装置执行本文描述的方法。此类装置在2009年4月2日提交的同时待审的美国申请号61/166,105中被详细描述，在此通过引用将其整体和特别地将其关于允许反应产物回收的微流控装置和相关方法的描述并入。

检测

在特定实施方案中，使用实时定量方法。例如，可使用“定量实时PCR”方法以通过测量扩增过程本身的过程中形成的扩增产物的量确定存在于样品中的靶核酸的量。监测扩增产物的形成的该方法包括在多个时间点的PCR产物积累的测量。

已开发了可用包含荧光指示剂的组合物执行热循环反应，发射特定波长的光束、读取荧光染料的强度并展示每一个循环之后的荧光的强度的装置。包含热循环仪、光束发射器和荧光信号检测器的装置已在例如美国专利号5,928,907、6,015,674和6,174,670中被描述。

在一些实施方案中，可通过单独的装置执行这些功能的每一个。例如，如果技术人员采用Q-β复制酶反应用于扩增，反应可不在热循环仪中发生，但可包括在特定波长发射的光束、荧光信号的检测和扩增产物的量的计算和展示。

在特定实施方案中，组合的热循环和荧光检测装置可被用于靶核酸的精确定量。在一些实施方案中，可在一个或多个热循环过程中或在一个或多个热循环之后检测并展示荧光信号，因此允许监测作为呈“实时”发生的反应的扩增产物。在某些实施方案中，技术人员可使用扩增产物的量和扩增循环数计算扩增之前有多少靶核酸序列存在于样品中。

根据一些实施方案，技术人员可容易监测预先确定的循环数之后扩增产物的量，该预先确定的循环数足够指示样品中靶核酸序列的存在。本领域技术人员可容易确定对于任何给定的样品类型、引物序列和反应条件，多少循环是足够确定给定靶核酸的存在。

典型地在有助于报告物分子和猝灭剂分子缔合的条件下执行检测。可选择适合的温度以改进用于信号采集的探针寡核苷酸和调节寡核苷酸的杂交。在特定实施方案中，选择采集温度，如此以致未被掺入的探针寡核苷酸的显著比例与调节寡核苷酸杂交。该显著比例的限制可根据本申请中另行规定的范围确定。

根据某些实施方案，技术人员可采用内部标准以定量由荧光信号指示的扩增产物。见，例如，美国专利号5,736,333。

在采用预扩增的多种实施方案中，预扩增循环数足够将一个或多个核苷酸标签添加至靶核苷酸序列，以致加标签的靶核苷酸序列的相对拷贝数基本上代表样品中靶核酸的相对拷贝数。例如，可持续2-20个循环实施预扩增以引入样品特异性核苷酸标签。在其他实施方案中，在指数扩增结束时，即，在“稳定”阶段期间，实施检测，或实施端点PCR。在此情况下，预扩增将根据靶并根据样品标准化扩增子拷贝数。在多种实施方案中，可持续约：2、4、10、15、20、25、30、35或40个循环或持续落入由任何这些值限定的任何范围内的循环数实施预扩增和/或扩增。

非期望的反应成分的去除

将被领会的是其中采用了多个反应步骤的包括核酸的复杂混合物的反应，可导致多种未被掺入的反应成分，并且通过多种清除过程的任一种去除此类未被掺入的反应成分或减少它们的浓度可改进随后发生的反应的效率和特异性。在一些实施方案中，例如，在实施本文描述的扩增步骤之前去除或减少预扩增引物或加标签引物的浓度可以是需要的。

在某些实施方案中，非期望的成分的浓度可通过简单的稀释被降低。例如，在扩增之前可将预扩增的样品稀释约2、5、10、50、100、500、1000倍以改进随后扩增步骤的特异性。

在一些实施方案中，可通过多种酶促方法去除非预期的成分。可选地，或除了以上描述的方法之外，可通过纯化去除非期望的成分。例如，可将纯化标签掺入任何以上描述的引物（例如，掺入条形码核苷酸序列中）以促进加标签的靶核苷酸的纯化。

在特定的实施方案中，清除包括期望的核酸的选择固定。例如，期望的核酸可优先地固定在固相支持体上。在说明性实施方案中，亲和部分，诸如生物素（例如，光敏生物素）被附着至期望的核酸，且所得的生物素标记的核酸固定在包含亲和部分结合物诸如链霉亲和素的固相支持体上。可用探针查询（queried）经固定的核酸，并通过洗涤去除未杂交的和/或未连接的探针（见，例如，公布的P.C.T.申请WO03/006677和美国专利公布号20030036064。可选地，可洗涤经固定的核酸以去除其他成分并随后从固相支持体释放经固定的核酸用于进一步分析。在特定的实施方案中，亲和部分诸如生物素可被附着至扩增引物，如此以致扩增产生亲和部分标记（例如，生物素标记的）的扩增子。因此，例如，如以上描述的，当采用加标签引物、反向引物和探针寡核苷酸时，则所述寡核苷酸的至少一种可包含亲和部分。

数据输出和分析

在某些实施方案中，当在矩阵-型的微流控装置上实施本发明的方法时，可将数据输出作为热矩阵（还称为“热图”）。在热矩阵中，代表矩阵上的反应室的每一个方块已被分配一个颜色值，其可以呈灰度显示，但更典型地呈彩色显示。在灰度中，黑色方块指示没有检测到扩增产物，而白色方块指示最高水平的扩增产物，灰色阴影指示两者之间的扩增产物的水平。在另外的方面，可使用软件程序以将在热矩阵中产生的数据编辑为更易读取的格式。

应用

本发明的方法适用于旨在检测核酸样品中一种或多种靶核酸的存在或量的任何技术。因此，例如，这些方法适于鉴定特定多态性（诸如SNP）、等位基因或单体型或染色体异常诸如扩增、缺失或非整倍性的存在。可在基因分型中采用本方法，其可在包括遗传疾病或疾患的诊断、药物基因组学（个人化医疗）、农业中的质量控制（例如，关于种子或牲畜）、植物或动物的群体（例如，水产养殖和渔业管理中或种群多样性的确定中）的研究和管理、物种或菌种确定或亲子或法医鉴定的一些环境中被实施。本发明的方法可被应用于指示生物或环境样品中特定的病症或生物体的序列的鉴定。例如，该方法可被用于鉴定病原体，诸如病毒、细菌和真菌的分析。该方法还可被用于旨在表征环境或微环境，例如，表征人类肠道中微生物种类的研究。

还可在确定DNA或RNA的拷贝数中采用这些方法。基因组DNA中异常的DNA拷贝数的确定，在例如遗传缺陷和疾病诸如癌症的诊断和/或预后中是有用的。RNA“拷贝数”，即，表达水平的确定对于例如，在不同的个体、组织或细胞中，在不同的条件下（例如，不同的外部刺激或疾病状态）和/或在不同的发育阶段，感兴趣的基因的表达监测是有用的。

此外，可采用该方法制备核酸样品用于进一步分析，诸如，DNA测序。可检测具有遗传组分的疾病以确定携带者状态或受试者中疾病发生风险。本发明的一个方面涉及预测携带者状态或受试者中疾病发生风险。具有遗传组分的疾病的列表在增长并包含血友病、半乳糖血症、杜性肌营养不良、多囊性肾病、I型神经纤维瘤病、遗传性球形红细胞症、马凡氏综合征、亨廷顿病、腹主动脉瘤、老年性黄斑变性、酒精依赖、斑秃、强直性脊柱炎、哮喘、异位性皮炎、心房颤动、心房颤动：初步研究、注意力不集中的过度反应症、背痛、基底细胞癌、白塞氏病、双相型障碍、双相型障碍：初步研究、膀胱癌、脑动脉瘤、乳腺癌、乳糜泻、慢性肾病、慢性淋巴细胞白血病、慢性阻塞性肺病（COPD）、唇裂和腭裂、丛集性头痛、结肠直肠癌、Creutzfeldt-Jakob病、克罗恩病、发展性阅读障碍、子宫内膜异位、食管癌、食管鳞状细胞癌（ESCC）、特发性震颤、剥脱性青光眼、滤泡性淋巴瘤、胆结石、泛发的白癜风、妊娠糖尿病、痛风、桥本氏甲状腺炎、心脏病发作（Heart Attack）、高血压、霍奇金淋巴瘤、高甘油三脂血症、妊娠肝内胆汁淤积症、疤痕疙瘩、肾病、肾结石、喉癌、Lou Gehrig病（ALS）、肺癌、狼疮（全身性红斑狼疮）、男性不育症、黑色素瘤、多发性硬化、发作性睡病、鼻咽癌、神经管缺陷、成神经细胞瘤、尼古丁依赖、非酒精性脂肪肝疾病、肥胖症、强迫性精神障碍、口腔和咽喉癌、骨关节炎、耳硬化症、Paget骨病、帕金森氏病、帕金森氏病：初步研究、外周动脉疾病、胎盘早剥、多囊性卵巢综合征、先兆子痫、原发性胆汁性肝硬化、进行性核上性麻痹、前列腺癌、牛皮癣、多动腿综合征、类风湿性关节炎、精神分裂症、局限性皮肤硬皮病型、选择性IgA缺陷、

综合征、胃癌、贲门癌、中风、迟发性运动障碍、甲状腺癌、Tourette综合征、1型糖尿病、2型糖尿病、溃疡性结肠炎、子宫平滑肌瘤、和静脉血栓栓塞、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、癌症、Bloom综合征、卡纳万病、连接蛋白26相关的感音神经性听力损失、囊性纤维化病、因子XI缺乏症、家族性自主神经功能异常、家族性高胆固醇血症B型、家族性地中海热、FANCC相关的范可尼贫血、G6PD缺乏症、戈谢病、糖原积累病1a型、血色沉着病、肢节型肌营养不良症、枫糖尿病1B型、粘脂沉积症IV、尼-皮二氏病A型、苯丙酮尿症、Rhizomelic软骨发育异常点状的1型（RCDP1）、镰状细胞性贫血和疟疾耐药性、泰-萨二氏病和扭转张力障碍。还可检测受试者中与遗传性状相关的基因型。本发明的又另一个方面涉及预测携带者状态或受试者中性状发生的可能性。与基因型相关的遗传性状包含脂联素水平、饮酒脸红反应、芦笋代谢物检测、避免错误（Avoidance of Errors）、出生体重、苦味的感知、血糖、依赖母乳喂养的IQ、C反应性蛋白水平、慢性乙型肝炎、耳垢类型、眼睛颜色、食物偏好、长雀斑、HDL胆固醇水平、HIV进展、头发颜色、头发卷曲、头发密度、身高、尿道下裂、乳糖不耐症、麻风易感性、寿命、对疟疾并发症的易感性、疟疾耐药性（杜菲抗原）、男性型秃、非语言IQ、肥胖症、情景记忆、月经初潮年龄、早期绝经、肌肉表现、Diego、Kidd、和凯尔血液型、诺瓦克病毒耐药性、气味检测、疼痛敏感性、持续胎儿血红蛋白、旋光性喷嚏反射、前列腺特异性抗原、阅读能力、屈光不正、对HIV/AIDS耐受性、对饮食和锻炼的响应、性激素调节、吸烟行为和结核病易感性。

此外，个体对药物治疗的响应可与特定的基因型有关。本发明的另外的方面涉及预测个体对与特定基因型相关的药物治疗的响应。可预测关于包含以下的药物治疗的列表的药物应答：α1-抗胰蛋白酶缺乏症、乳腺癌、Bloom综合征、卡纳万病、连接蛋白26相关的感音神经性听力损失、囊性纤维化病、因子XI缺乏症、家族性自主神经功能异常、家族性高胆固醇血症B型、家族性地中海热、FANCC相关的范可尼贫血、G6PD缺乏症、戈谢病、糖原积累病1a型、血色沉着病、肢节型肌营养不良症、枫糖尿病1B型、粘脂沉积症IV、尼-皮二氏病A型、苯丙酮尿症、Rhizomelic软骨发育异常点状的1型（RCDP1）、镰状细胞性贫血和疟疾耐药性、泰-萨二氏病和扭转张力障碍。

最后，在随后的分析之前，作为第一步，核酸样品可被加标签以减少将损害结果的样品的错标或交叉污染的风险。例如，任何医师办公室、实验室或医院可在收集之后立即给样品加标签，并可在分析时确认标签。相似地，在可行的范围内尽快将在犯罪现场（crime scene）收集的包含核酸的样品加标签以确保样品不会被错标或被篡改。当样品从一方转移至另一方的每一次转移时的标签的检测可被用于建立样品的保管链。

试剂盒

根据本发明的试剂盒包含用于实行本发明的一个或多个分析方法的一种或多种试剂。试剂盒通常包括具有容纳作为一种或多种分开的组合物或当试剂的相容性允许时任选地作为混合物的试剂（例如，引物和/或探针）的一个或多个容器的包装。试剂盒还可包含从用户的角度是期望的其他物质，诸如缓冲液、稀释剂、标准品、和/或用于样品处理、洗涤或进行任何其他分析步骤的任何其他物质。

根据本发明的试剂盒通常包含用于实施本发明的一种或多种方法的使用说明。被包括在本发明的试剂盒中的使用说明可被粘帖在包装材料上或可被包含作为包装说明书。尽管使用说明典型地为书面或打印材料，但它们不限于此形式。能够储存此类使用说明并将它们传播至最后的用户的任何介质被本发明所包含。此介质包括，但不限于，电子储存介质（例如，磁盘、磁带、磁带盒（cartridge）、芯片）、光学介质（例如，CD ROM）、RF标签，等等。如本文所用的，术语“使用说明”可包括提供使用说明的互联网网站的网址。

被理解的是本文描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且根据其的多种修饰或变化将是对本领域的技术人员暗示的并被包含在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。

另外，本文引用的所有其他出版物、专利和专利申请在此通过引用整体被并入用于所有目的。

实施例

实施例1

图1说明在基因分型分析中使用该方法以检测样品中特定等位基因的存在。在漫画中，两条靶核酸序列（T和T’）存在于样品中，T由特定SNP处的A等位基因表征且T’由G等位基因表征。使用一对加标签引物在PCR反应中将T和T’加标签，一条引物包含核苷酸标签序列X和与A等位基因杂交并用作A等位基因的引物的靶核苷酸识别序列，且另一条引物包含核苷酸标签序列Y和与G等位基因杂交并用作G等位基因的引物的靶核苷酸识别序列。编码或加标签PCR反应（显示为编码PCR反应）将x标签“掺入”A等位基因的扩增子（如果有的话），并将y标签“掺入”G等位基因的扩增子（如果有的话）。编码扩增可利用单个反向引物。

如在图中显示的，该反应包含两个探针寡核苷酸-调节核苷酸对。首先，探针寡核苷酸包含报告物分子（R_G）、调节序列（z）和与被掺入A等位基因扩增子的标签序列杂交并用作PCR扩增反应的引物的引物序列，而调节寡核苷酸包含猝灭剂（Q）和与调节序列互补的序列区段（z）。其次，探针寡核苷酸包含报告物分子（R_R）、调节序列（w）和与被掺入G等位基因扩增子的标签序列杂交并用作PCR扩增反应的引物的引物序列，而调节寡核苷酸包含可以与第一对的猝灭剂相同或不同的猝灭剂（Q）和与调节序列互补的序列区段（w）。每一对的探针寡核苷酸和调节寡核苷酸都包含报告物-猝灭剂对，以致当探针寡核苷酸与调节寡核苷酸杂交时报告物发射可检测的（例如，荧光）信号，但当探针和调节寡核苷酸与彼此杂交时则不发射信号，报告物分子被猝灭。

如在图中显示的，加标签的靶核酸序列的探针寡核苷酸引导的PCR扩增产生其中报告物分子被掺入的扩增子，从而将报告物分子与猝灭剂分开。可检测所得的报告物信号，并且该信号指示样品中对应的等位基因的存在。

实施例2

设计了用于不同的多态性位点的每一个多态性变体的加标签引物。除了靶特异性序列之外，设计加标签引物以在5'末端包含核苷酸标签序列。当检测多态性位点时，用于第一个等位基因的加标签引物包含与用于第二个等位基因的加标签引物不同的核苷酸标签序列。包含核苷酸标签序列和靶特异性序列二者的引物的序列在表1中列出。

设计反向引物以位于靶多核苷酸的侧翼并且该反向引物在表2中被列出。

设计了多组探针寡核苷酸/调节寡核苷酸对。探针寡核苷酸在3'末端包含对应于加标签引物上的核苷酸标签序列的多种核苷酸标签序列。探针寡核苷酸在3'末端包含被对应的调节寡核苷酸识别的调节序列。用荧光报告物分子在3'末端标记探针寡核苷酸。荧光染料选自FAM、CalOrange和HEX。用对应的猝灭剂在5'末端标记调节寡核苷酸。

当检测多态性位点时，使用两组探针寡核苷酸/调节寡核苷酸对。每一组包含不同的报告物猝灭剂对和对应于加标签引物中的核苷酸标签序列的不同的核苷酸标签序列。

探针寡核苷酸/调节寡核苷酸对的序列在表3和4中被列出。

寡核苷酸通过Operon以10nmol规模合成，并以100μM的浓度重悬在TE缓冲液（Teknova）中提供。

将来自Coriell样品收集的人基因组DNA样品以60ng/μl重悬在低-EDTA的TE缓冲液（Teknova）中，并将其如下制备用于PCR。

如下制备探针混合物：在具有30mM EDTA的DNA悬浮缓冲液（10mM Tris,pH8.0,0.1mM EDTA,TEKnova,PN T0221）中以6μM的终浓度制备每一种探针寡核苷酸。在相同的缓冲液中以30μM的终浓度制备每一种调节寡核苷酸。

如下制备样品混合物：

如在表5中描述的将Biotium Fast Probe Master Mix(Biotium,PN31005)、20X SNPtype Sample Loading Reagent(Fluidigm,PN100-3425)、探针混合物、50X ROX(Invitrogen,PN12223-012）和PCR-合格的水组合以制备样品预混物。将2.5μL、60ng/μL的每一种基因组DNA（gDNA）样品添加至3.5μL的样品预混物以制备总的6μL的样品混合物溶液。持续最少20秒涡旋样品混合物，并随后持续至少30秒离心以旋转沉降（spindown）所有成分。

如下制备分析混合物：

如在以下的表6中描述的制备包含两种加标签引物，每一个等位基因一条引物，对应的反向引物和DNA悬浮缓冲液缓冲液（10mM Tris,pH8.0,0.1mM EDTA,TEKnova,PN T0221）的分析混合物。

如下制备10X分析物：

使用在以下表7中的体积在无DNA的罩（hood）中制备等份的10X分析物。将2X Assay Loading Reagent(Fluidigm,PN85000736）与PCR-合格的水组合以产生分析预混物。将4μL的分析预混物与1μL的每一种单个分析预混物预混物组合以获得总的5μL10X分析混合物。

运行48.48Dynamic Array ^TM IFC

用300μL的对照线流体（Control Line Fluid，Fluidigm PN89000020）填充密闭和接口累加器储液器。将5μL的每一个样品混合物装载入样品进口，并将4μΑ的适合的10X分析混合物装载进入48.48Dynamic Array^TMIFC(Fluidigm,PN BMK-M-48.48)上的每一个分析进口。

热循环IFC并使用由Fluidigm Corporation制造的FC1^TMCycler成像IFC。IFC热循环操作说明包含热启动步骤[95℃，持续5min]、35个循环的降落式PCR策略[95℃持续15sec、64℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；95℃持续15sec、63℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；95℃持续15sec、62℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；95℃持续15sec、61℃持续45sec和72℃持续15sec的1个循环；和95℃持续15sec、62℃持续45sec和72℃持续15sec的34个循环]、和冷却步骤[25℃持续10sec的1个循环]。在由Fluidigm Corporation制造的EP1^TMReader中采集数据并使用SNP Genotyping Analysis Softwarev.3.1.0分析数据。

表5-样品预混物

成分	体积每进口（μL）
		Biotium2X Fast Probe Master Mix	3.0
20X SNPtype Sample Loading Reagent	0.3
		探针混合物	0.1
50X ROX	0.036
		PCR-合格的水	0.064
总量	3.5

表6-分析混合物

成分	体积(μL）
		加标签引物（100μM每一种）	3.0
反向引物	8.0
		DNA悬浮缓冲液	29.0
总量	40.0

表7-10X分析物

成分	体积每进口（μL）
		2X Assay Loading Reagent	2.5
PCR-合格的水	1.5
		分析混合物	1.0
总量	5.0

为了说明且不限制，以下的示例性实施方案也被包含：

实施方案1.一种检测具有靶核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包含：用核苷酸标签将包含期望的靶核苷酸序列的所述多核苷酸加标签；提供包含调节序列和核苷酸标签识别序列的具有解链温度Tm1的探针寡核苷酸；在多核苷酸扩增反应中将所述探针寡核苷酸掺入加标签的多核苷酸；提供包含与所述调节序列至少部分互补的序列区段的具有解链温度Tm2的调节寡核苷酸；其中Tm1和Tm2高于与多核苷酸扩增反应相关的退火温度且与所述探针寡核苷酸相关的信号取决于其从所述调节核苷酸的救出。

实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述多核苷酸扩增反应是PCR。

实施方案3.根据实施方案1所述的方法，其中所述探针寡核苷酸和所述调节寡核苷酸在互补的位点处被标记。

实施方案4.根据实施方案1所述的方法，其中通过以下在单个反应内分析多个靶核苷酸序列：用编码所述靶核苷酸序列的不同的核苷酸标签将包含期望的靶核苷酸序列之一的每一种多核苷酸加标签；提供至少一种探针寡核苷酸，其中所述核苷酸标签识别序列优先与所述核苷酸标签之一杂交；并提供至少一种调节寡核苷酸，其中所述调节寡核苷酸的部分优先地与所述调节序列之一杂交。

实施方案5.根据实施方案4所述的方法，其中确定所述靶核苷酸序列的相对丰度。

实施方案6.根据实施方案1所述的方法，其中通过从加标签引物的延长将所述多核苷酸加标签。

实施方案7.根据实施方案1或6所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含至少一个多态性位点。

实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述多态性位点位于所述靶核苷酸序列内部。

实施方案9.根据实施方案7所述的方法，其中所述多态性包含点突变。

实施方案10.根据实施方案7所述的方法，其中所述多态性包含插入。

实施方案11.根据实施方案7所述的方法，其中所述多态性包含缺失。

实施方案12.根据实施方案10或11所述的方法，其中所述多态性跨越不止一个核苷酸。

实施方案13.根据实施方案1所述的方法，其中当将所述调节寡核苷酸与所述探针寡核苷酸上的调节序列比对时，所述调节寡核苷酸包含完全非互补的辅助序列区段。

实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述辅助序列区段与所述探针寡核苷酸至少部分重叠。

实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中所述辅助序列区段与所述核苷酸标签识别序列至少部分重叠。

实施方案16.根据实施方案1或2所述的方法，其中随时间推移检测所述信号。

实施方案17.根据实施方案1或16所述的方法，其中调整温度以促进未掺入的探针寡核苷酸与所述调节寡核苷酸的杂交，如此以致未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于1。

实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于0.5。

实施方案19.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与所述掺入的探针寡核苷酸的比小于0.2。

实施方案20.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于0.1。

实施方案21.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于0.05。

实施方案22.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于0.02。

实施方案23.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于0.01。

实施方案24.根据实施方案17所述的方法，其中所述未杂交的未掺入的探针寡核苷酸与掺入的探针寡核苷酸的比小于0.005。

实施方案25.根据实施方案1或2所述的方法，其中在液滴中进行所述分析的至少一部分。

实施方案26.根据实施方案1、2或16-24中任一项所述的方法，其中所述调节寡核苷酸附着至支持体。

实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中所述支持体是珠。

实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中所述珠是磁性的。

实施方案29.根据实施方案27或28所述的方法，其中所述支持体从信号被检测的区域转出。

实施方案30.根据实施方案1所述的方法，其中用报告物分子标记所述探针寡核苷酸和调节寡核苷酸中的一个并用报告物-猝灭剂对的猝灭剂分子标记另一个，其中加帽所述猝灭剂以提供免受核酶的保护。

实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述加帽在3'末端。

实施方案32.根据实施方案6所述的方法，其中所述多态性位点预测遗传性状。

实施方案33.根据实施方案6所述的方法，其中所述多态性位点预测疾病风险。

实施方案34.根据实施方案6所述的方法，其中所述多态性位点预测关于疾病的携带者状态。

实施方案35.根据实施方案6所述的方法，其中所述多态性位点预测关于遗传性状的携带者状态。

实施方案36.根据实施方案6所述的方法，其中所述多态性位点预测对药物治疗的反应。

实施方案37.根据实施方案37所述的方法，其中所述对药物治疗的反应选自由以下组成的组：阿巴卡韦过敏、响应于饮酒和吸烟的食道癌风险、抗抑郁药物反应、β-阻断剂反应、咖啡因代谢、氯吡格雷

疗效、氟氯青霉素毒性、氟尿嘧啶毒性、海洛因成瘾、罗美昔布

副作用、二甲双胍反应、纳曲酮治疗的反应、响应于口服避孕药和激素替代治疗的静脉血栓栓塞风险、术后恶心和呕吐（PONV）、假胆碱酯酶缺乏、对丙型肝炎治疗的反应、对β干扰素治疗的反应、他汀类药物反应和新双香豆素

敏感性。

实施方案38.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育域（phylogenetic domain）。

实施方案39.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育界。

实施方案40.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育门。

实施方案41.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育纲。

实施方案42.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育目。

实施方案43.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育科。

实施方案44.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育属。

实施方案45.根据实施方案1或4所述的方法，其中所述多核苷酸序列预测系统发育种。

实施方案46.一种用于检测靶多核苷酸的多核苷酸检测试剂，包含：包含调节序列和核苷酸标签识别序列的具有解链温度Tm1的探针寡核苷酸；和包含与所述调节序列至少部分互补的序列区段的具有解链温度Tm2的调节寡核苷酸；其中Tm1和Tm2高于与扩增所述多核苷酸的反应相关的生产退火温度且与所述探针寡核苷酸相关的信号取决于其从所述调节核苷酸中的救出。

实施方案47.根据实施方案46所述的试剂，其中扩增所述多核苷酸的反应是PCR。

实施方案48.根据实施方案46所述的试剂，其中所述探针寡核苷酸和所述调节寡核苷酸在互补的位点处被标记。

实施方案49.根据实施方案46所述的试剂，用于检测多种多核苷酸，还包含多种探针寡核苷酸，不同的核苷酸标签识别序列与不同的调节序列可鉴别地配对；和多种调节寡核苷酸，其中所述调节寡核苷酸的部分优先地与所述调节序列之一杂交。

实施方案50.根据实施方案49所述的试剂，其中所述核苷酸标签识别序列优先地与编码靶多核苷酸上的靶核苷酸序列的核苷酸标签杂交。

实施方案51.根据实施方案50所述的试剂，其中所述靶核苷酸序列的相对丰度被确定。

实施方案52.根据实施方案46或49所述的试剂，其中所述靶多核苷酸序列包含至少一个多态性位点。

实施方案53.根据实施方案46所述的试剂，其中所述多态性位点位于所述靶核苷酸序列内。

实施方案54.根据实施方案52所述的试剂，其中所述多态性包含点突变。

实施方案55.根据实施方案52所述的试剂，其中所述多态性包含插入。

实施方案56.根据实施方案52所述的试剂，其中所述多态性包含缺失。

实施方案57.根据实施方案55或56所述的试剂，其中所述多态性跨越不止一个核苷酸。

实施方案58.根据实施方案46所述的试剂，其中当将所述调节寡核苷酸与所述探针寡核苷酸上的所述调节序列比对时，所述调节寡核苷酸包含完全非互补的辅助序列区段。

实施方案59.根据实施方案46或47所述的试剂，其中所述信号被检测。

实施方案60.一种用于检测具有靶核苷酸序列的靶多核苷酸的系统，包含：探针寡核苷酸，包含调节序列和核苷酸标签识别序列，具有解链温度Tm1；调节寡核苷酸，包含与所述调节序列至少部分互补的序列区段，具有解链温度Tm2；其中Tm1和Tm2高于与扩增所述多核苷酸的反应相关的生产退火温度，其中所述探针寡核苷酸在多核苷酸扩增反应中被掺入所述多核苷酸，且其中与所述探针寡核苷酸相关的信号取决于其从所述调节核苷酸的救出；和检测器，所述检测器可操作地放置以采集与所述探针寡核苷酸相关的信号。

实施方案61.根据实施方案60所述的系统，其中通过热循环执行所述多核苷酸扩增反应。

实施方案62.根据实施方案61所述的系统，其中可操作地放置热循环仪以热循环反应的内容物。

实施方案63.根据实施方案60所述的系统，其中提供了用于扩增反应的试剂。

将被理解的是本发明不限于本文描述的特定的方法、操作说明和试剂等，由于这些可被技术人员改变。还被理解的是本文使用的术语仅用于描述特定说明性实施方案的目的，并不预期限制本发明的范围。本发明的实施方案和其多种特征和有利的细节通过参考非限制性的实施方案和实施例被更全面地解释，该非限制性的实施方案和实施例在附图中被描述和/或被说明并在以下的描述中被详细说明。应注意的是在附图中说明的特征不必然地按比例绘制，且一个实施方案的特征可被其他实施方案采用，如技术人员将认识到的，即使本文没有明确规定。众所周知的成分和处理技术的描述可被省略以便使得本发明的实施方案无不必要地难理解。

Claims (18)

1.一种用于检测靶核苷酸序列的方法，所述方法包含：

a）用核苷酸标签序列将所述靶核苷酸序列加标签，从而制备加标签的靶核酸序列；

b）提供包含与所述核苷酸标签序列互补的核苷酸标签识别序列和在所述核苷酸标签识别序列的5'的调节序列的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含第一标记物并具有解链温度Tm1；

c）使用所述探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增所述加标签的靶核酸序列，其中所述PCR扩增反应由退火温度Ta表征；

其中在包含与所述调节序列互补的序列区段的调节寡核苷酸的存在下实施所述PCR扩增反应，其中所述调节寡核苷酸包含第二标记物并具有解链温度Tm2；和

d）检测所述PCR扩增反应的产物；

其中所述第一标记物和所述第二标记物构成荧光报告物/猝灭剂对；且其中Tm1和Tm2二者都高于Ta。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使用PCR反应将所述标签序列掺入所述加标签的靶核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸标签识别序列与所述核苷酸标签序列完全互补。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节寡核苷酸包含与调节序列完全互补的序列区段。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述调节寡核苷酸具有15-45个核苷酸范围的长度。

6.根据权利要求1所述的方法，其中Ta呈55-62℃的范围。

7.根据权利要求1所述的方法，其中Ta呈60-64℃的范围。

8.根据权利要求1所述的方法，其中Ta呈60℃-62℃的范围。

9.根据权利要求权利要求1-5所述的方法，其中Tm1比所述退火温度（Ta）高至少25℃。

10.根据权利要求9权利要求所述的方法，其中Tm2比所述退火温度（Ta）高至少至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、或至少10℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其中Tm2呈60-75℃的范围。

12.根据权利要求6所述的方法，其中在大于500nL、或大于1μL的反应体积中实施所述PCR扩增反应。

13.根据权利要求12所述的方法，其中在包含96-1536孔的多孔板中实施所述PCR扩增反应。

14.根据权利要求13所述的方法，其中Ta为约57℃。

15.根据权利要求8所述的方法，其中在小于100nL的反应体积中实施所述PCR扩增反应。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在微流控装置中实施所述PCR扩增反应。

17.根据权利要求15所述的方法，其中Ta为约60℃。

18.根据权利要求6、7或8所述的方法，其中所述PCR扩增反应包含在退火温度（Ta）下的至少20个循环。

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