CN110863036A - 一种ntrk融合突变检测的探针组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NTRK融合突变检测的探针组，该探针组包括核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的一个或多个探针。本发明还公开了一种NTRK融合突变检测的试剂盒，该试剂盒包括所述的探针组。本发明更进一步提供了一种利用所述探针组进行NTRK融合突变检测的方法。利用本发明设计的探针组进行NTRK融合突变检测的方法缩短了杂交时间，可以更加快速地检测非小细胞肺癌患者NTRK基因是否发生融合突变，与检测金标准FISH法相比，具有检测灵敏度高、覆盖面广、通量高等优点，有利于大规模临床开展。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法。
背景技术
NTRK(NeuroTrophin Receptor Kinase)是神经营养因子受体络氨酸激酶。原肌球蛋白受体激酶(TRK)家族包括TRKA、TRKB和TRKC三种蛋白，它们分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码，这些蛋白通常在神经组织中表达。NTRK基因的融合突变促进了肿瘤的形成。TRK途径的失调可导致神经发育障碍和各种中枢神经系统(CNS)疾病，但当NTRK基因与不相关的基因融合时也会诱导癌症发生。据世界卫生组织估计，有0.2％的NSCLC患者存在NTRK融合。TRK融合蛋白将处于持续活跃状态，引发永久性的信号级联反应，驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。因此，NTRK融合蛋白充当致癌驱动因子，促进癌细胞生长和存活。这一发现导致了NTRK基因融合作为癌症治疗的新靶点而出现。
我们在检测NTRK融合的时候，还需要检测其耐药的位点突变。拉罗替尼(Larotrectinib)是一款不分年龄和癌种类型针对NTRK融合的广谱TRK抑制剂，主要抑制酪氨酸激酶的活性。TRK家族蛋白是酪氨酸激酶，如果能抑制激酶活性，就能抑制癌症生长。还有针对其耐药位点的第二代TRK靶向药物LOXO-195已经出炉，专门来对抗耐药的新突变。
目前，有多种方法可用于检测NTRK基因融合突变，包括FISH、RT-PCR和NGS检测。其中，RT-PCR法只可检测已知突变，且由于NTRK融合断点具有多变性，极大可能发生漏检。再者，对于FISH法来说，一组FISH分离探针通常只用于一种基因的融合突变检测，较为单一，缺乏全面性，难以大范围的开展。基于此，有必要提供一种覆盖面广、准确性高、敏感性高且便于开展的NTRK突变检测方案。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法；利用该探针组的检测方法覆盖面广，准确性高，敏感性高且便于开展。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种NTRK融合突变检测的探针组，包括核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的一个或多个探针。
进一步的，上述探针组包括核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的全部探针。
进一步的，该探针组中的探针序列的5’端具有标记物。
本发明还提供了一种NTRK融合突变检测的试剂盒，该试剂盒包括上述探针组。
此外，本发明还提供了一种NTRK融合突变检测的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样本的DNA；
(2)利用步骤(1)提取的DNA构建待检测样本的DNA文库；
(3)获得检测NTRK融合突变的探针组；
(4)使步骤(3)获得的探针组与步骤(2)构建的DNA文库进行杂交，以捕获目标区域的DNA序列；
(5)对步骤(4)获得的杂交产物进行洗脱、分离，对捕获的目标区域的DNA序列进行PCR扩增，获得扩增产物，对扩增产物进行纯化，得到测序文库，然后对测序文库进行质检；
(6)利用高通量测序方法对步骤(5)获得的测序文库进行检测。
进一步的，上述步骤(5)获得的测序文库的DNA片段长度为350-450bp。
更进一步的，步骤(2)中，首先将提取的DNA片段化，然后利用该片段化的DNA构建DNA文库。
上述步骤(5)中，利用探针上的标记物对杂交产物进行分离。
进一步的，探针上的标记物为生物素，具体的，步骤(5)是利用链霉亲和素和生物素的亲和作用对杂交产物进行分离。
本发明的有益效果是：
(1)利用本发明设计的探针组进行NTRK融合突变检测的方法缩短了杂交时间，可以更加快速地检测非小细胞肺癌患者NTRK基因是否发生融合突变，与检测金标准FISH法相比，具有检测灵敏度高、覆盖面广、通量高等优点，有利于大规模临床开展。
(2)本发明通过NGS技术对NTRK基因融合突变进行全面检测，可以一次性检测患者存在的所有类型的突变，通过对基因进行靶向测序，可以发现何段未知基因序列和其他基因发生融合突变，且可以检测到耐药突变，从而可以在分子水平得到非常确凿的证据，与传统的Fish杂交相比，证据更明确与直接，不需要人工的主观经验判断；NTRK基因融合突变是决定患者是否采用拉罗替尼进行治疗的有效指标；而且临床标本检测中是否存在NTRK基因融合突变，可为临床医生选择药物提供参考，做到进一步降低治疗风险，提高患者的生存质量。
附图说明
图1为本发明实施例的探针组与对比探针组在检测时的覆盖率对比结果。
图2为本发明实施例中待测样本1的测序文库的质检结果图。
图3为本发明实施例中待测样本2的测序文库的质检结果图。
图4为本发明实施例中待测样本3的测序文库的质检结果图。
图5为本发明实施例中待测样本4的测序文库的质检结果图。
图6为本发明实施例中待测样本5的测序文库的质检结果图。
图7为本发明实施例中待测样本6的测序文库的质检结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例
该实施例的样本来源为6例主诉为非小细胞肺癌患者的血液样品(患者均已签署知情同意书)，以下为6名患者的基因检测过程。
一、DNA的提取
全血样品使用QIAampTM DNA Mini Kit(Qiagen.Cat.no.51304)试剂盒提取患者的核酸样品。具体的提取过程为:
1.吸取20μL QIAGEN Protease(蛋白酶K100mg/mL)加入至无菌2mL离心管底部；
2.将200μL全血样品加入到上述离心管内，然后加入4μL RNase A(核糖核酸酶A100mg/mL)，吹打混匀，室温孵育5分钟，再加入200μL的Buffer AL(裂解缓冲液)，涡旋混匀15秒；
3.将离心管置于56℃水浴锅中孵育10分钟；
4.瞬时离心，加入200μL乙醇(96-100％)，涡旋混匀15秒，得到样品溶液；
5.转移样品溶液到QIAamp Mini spin column(分离柱)中，室温放置1分钟，8000rpm离心1分钟；
6.将QIAamp Mini spin column放在一个干净的2mL收集管中，丢弃装有滤液的管子；
7.加入500μL buffer AW1(洗涤缓冲液1)，8000rpm离心1分钟；
8.弃滤液，向QIAamp Mini spin column中加入500μL buffer AW2(洗涤缓冲液2)，20000rpm离心3分钟；
9.弃滤液，向QIAamp Mini spin column的滤膜中心加入60μL 56℃水浴预热的Buffer AE(溶解缓冲液)，室温孵育5min，8000rpm离心1分钟；
10.收集洗脱液，在装有洗脱液的1.5mL离心管上做好标记。
11.使用Thermo Fisher公司的NanoDrop One(超微量分光光度计)检测提取的DNA：OD260/OD280在1.8-2.0范围内，浓度不低于5ng/μL；
二、DNA文库的构建
1.使用片段化的酶或者机械打断的方法，将提取的DNA片段化成200bp左右。
2.使用KAPA Hyper Prep Kit文库构建试剂盒进行文库构建：
2-1.DNA末端修补和末端加“A”
2-1-1.取出试剂盒中的End Repair&A-Tailing Buffer和End Repair&A-TailingEnzyme置于冰上自然融解，混合均匀，瞬时离心备用；
2-1-2.按照下表，在置于冰上的0.2ml PCR管中进行反应体系配制：
| 已片段化的DNA | 50μl |
| End Repair&A-Tailing Buffer | 7μl |
| End Repair&A-Tailing Enzyme | 3μl |
| 总体积 | 60μl |
将上述反应体系混合均匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部；
在PCR仪上启动如下反应程序，热盖85℃，等温度稳定至20℃时将反应管放进PCR仪：
| 20℃ | 30min |
| 65℃ | 30min |
| 4℃ | Hold |
该过程利用End Repair Enzyme对DNA的末端补平，将末端修复，通过KAPA A-Tailing Enzyme在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。
2-2.DNA两端加接头
2-2-1取出试剂盒中的Ligation Buffer和DNA Ligase置于冰上自然融解，混合均匀，瞬时离心备用。
2-2-2.从PCR仪上取出PCR反应管，置于冰上，按照下表进行接头连接反应体系配制：
| 上一步反应产物 | 60μl |
| Adapter stock(15μM) | 5μl |
| PCR-grade water | 5μl |
| Ligation Buffer | 30μl |
| DNA Ligase | 10μl |
| 总体积 | 110μl |
将上述反应体系混合均匀，瞬时离心使全部反应液置于PCR管底部，即为连接体系PCR管；
在PCR仪上启动如下反应程序，热盖85℃，等温度稳定至20℃时将反应管放进PCR仪：
| 20℃ | 15min |
| 4℃ | Hold |
该反应过程实现在DNA的双末端连接上接头。
2-3.磁珠纯化
2-3-1.提前将Beads(磁珠)取出涡旋混匀，室温平衡30min后使用；
2-3-2.按照要求向上述连接体系PCR管中加入Beads，进行片段筛选，经纯化过程，具体为：离心后，将PCR管置于磁力架上，弃上清，然后，使用80％的乙醇清洗两遍，然后加入22μl去离子水，孵育5min，把该PCR管置于磁力架上，吸取上清，即为纯化后的产物，并将该纯化后的产物保存在新的PCR管中。
2-4.纯化后的产物扩增
2-4-1.取出试剂盒中的2*HiFi PCR Master Mix和Amplification Primer Mix置于冰上自然融解，混合均匀，瞬时离心备用；
2-4-2.按照下表在置于冰上的PCR管中进行反应体系配制：
| 2*HiFi PCR Master Mix | 25μl |
| Amplification Primer Mix | 5μl |
| 纯化后产物 | 20μl |
| 总体积 | 50μl |
2-4-2.将上述PCR管放入PCR仪中启动以下程序：
2-4-3.向PCR管加入Beads，对扩增后产物进行纯化，纯化过程具体为：离心后，将PCR管置于磁力架上，弃上清，然后使用80％的乙醇清洗两遍，再加入22μl去离子水，孵育5min，将PCR管置于磁力架上，吸取上清到新的PCR管中，即为所得的DNA文库。
三、获得检测NTRK融合突变的探针组
为了实现更高的覆盖率，通过对探针的类型、长度、序列、杂交条件等进行大量实验摸索，并针对NTRK融合基因自身的特征，创造性的设计了核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的探针组。在该实施例中，该探针组包含了核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的全部探针。其中，探针组中的探针序列的5’端具有标记物，在该实施例中，该标记物为生物素。
本发明的探针组中的探针是基于杂交捕获的富集方法进行设计，为序列特异性的捕获探针，其与基因组上特定目标区域互补。探针是溶液形式的、经生物素标记的寡核苷酸序列，能够杂交并捕获预设的区域。本发明的探针组中的探针能够容忍结合位置存在多个错配，不会干扰与目标区域的杂交。可以克服常见的等位基因丢失问题。本发明的探针通常只结合目标区域，因此其测序范围也较为集中，测序深度更深，可有效避免探针分离到非目标的邻近区域，做到靶点区域与非靶点区域的测序数据的有效平衡，这也就提升了目标区域的总体覆盖度。另外，在NTRK发生融合区域中被证明难以富集的区域，通过适当增加相应探针的密度的方法，可以将捕获的特异性提高。本发明实施例的探针组包含了核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的全部探针，适当增大了探针密度，提高了捕获的特异性。
四、杂交捕获
1.在离心管中加入5μL Human Cot DNA，2μL Blocking(试剂购自IDT公司)，再向离心管中加入500ng总量的DNA文库；
2.使用Eppendorf公司的Concentrator plus(真空浓缩机)真空离心抽干离心管中液体；
3.将清洗与杂交试剂盒(试剂购自IDT公司)放于室温融解，并平衡至室温。
4.按下表，向浓缩干燥的离心管中加入相应试剂，得到杂交反应液：
| 2*Hybridization Buffer | 8.5μL |
| Hybridization Buffer Enhancer | 2.7μL |
| Probe mix | 4μL |
| Nuclease-Free Water | 1.8μL |
注：本发明的探针组，即上述加入的Probe mix，是按照等量均匀混合而成的，使用前需涡旋混合均匀，瞬时离心后使用移液枪把Probe mix缓慢加入到杂交混合液(包括杂交缓冲液、杂交缓冲增强剂和无核酸酶水)中。
5.将离心管中的反应液吹打混匀，室温孵育10min；然后涡旋混匀，瞬时离心。
6.将离心管中全部的17μL杂交反应液转移到0.2mL低吸附PCR管中，将PCR管放入PCR仪中启动以下程序：
| 95℃ | 30sec |
| 65℃ | 4h |
| 65℃ | Hold |
利用上述程序杂交反应4小时，得到杂交产物。
五、杂交产物洗脱、分离
首先，取50μL链霉亲和素标记磁珠于室温下静置30min；
按下表，在低吸附1.5mL离心管中配置链霉亲和素标记磁珠重悬液
| 2*Hybridization Buffer | 8.5μL |
| Hybridization Buffer Enhancer | 2.7μL |
| Nuclease-Free Water | 5.8μL |
| 链霉亲和素标记磁珠 | 50μL |
杂交结束后，向含有杂交文库的PCR管中加入链霉亲和素标记磁珠重悬液，进行洗脱分离，链霉亲和素标记磁珠通过探针吸附目标片段，PCR管涡旋后，放入磁力架，待液体澄清，弃上清，然后使用80％的乙醇清洗两遍，再加入22μl去离子水，孵育5min，将PCR管置于磁力架上，吸取上清到新的PCR管中，得到经洗脱分离后的目标片段。
六、目标片段扩增
1.按照下表向含有20μL的经洗脱分离后的目标片段的PCR管中加入下列试剂，配置扩增体系：
| 2*KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25μL |
| Library Amplification Primer | 1.25μL |
| Nuclease-Free Water | 3.75μL |
将PCR管置于PCR仪中，按下表程序进行扩增：
2.对扩增后的产物进行纯化，得到测序文库。
七、文库质检和NGS测序
采用LabChip GX Touch 24Nucleic Acid Analyzer对纯化后的扩增产物(测序文库)进行质检，如图2-7显示的是6个待测样本的测序文库的质检结果，片段大小都在350-450bp之间，均满足要求；最后通过高通量测序方法，并使用
2000/2500,
systems等二代测序平台对6个测序文库进行检测，使用相对应的软件对检测结果进行全面解读，测序结果如下表所示：
| 患者 | 突变类型 |
| 1 | ETV6-NTRK3 |
| 2 | TPM3-NTRK1 |
| 3 | LMNA-NTRK1 |
| 4 | ETV6-NTRK3 |
| 5 | ETV6-NTRK3 |
| 6 | 未见突变 |
结果表明，本发明检测了6例样品，其中5例样品中检测到了非小细胞肺癌的NTRK融合突变，1例样品未得到阳性结果。
八、不同方法的结果比对
采用Fish杂交方法对5例阳性样品和1例阴性样品进行试验。Fish杂交结果与上面测序的结果一致。
九、不同探针组覆盖率的对比
使用相同的待测样品，分别使用本发明探针组、对比探针组A(Anti-Pan TRK探针)、对比探针组B(anbipin的NTRK基因断裂探针)，进行杂交捕获。使用
2000/2500,
systems等二代测序平台对3个文库进行检测，使用相对应的软件对检测结果进行全面解读。从图1中可以看出，在10×/20×/30×覆盖率上，本发明都优于其他探针组，所以本发明的探针组覆盖均一度更高。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 苏州璞瑞卓越生物科技有限公司
<120> 一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法
<130> 2019
<160> 146
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 33
gcggacggag tcgggcggag cgg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 34
cgcctgcgac cagctccaca gca 23
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 35
caatacccgt gtcggtccat tccctc 26
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 36
tgcggcgagg agcccaggga ggt 23
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 37
gcatttccgc cagtcagctt acccg 25
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 38
agacgatccc agtctcggtt gcgg 24
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 39
ggtcaaccgg caggaaacga ctcaa 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 40
gccagcgacg agcccgtaga cactc 25
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 41
tgggcttgcg ccgttgaagg tac 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 42
cttgggcttg cgccgttgaa ggt 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 43
gaggcttggg cttgcgccgt tga 23
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 44
ctcaggtcaa ccggcaggaa acgac 25
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 45
cgccggtcct actggcctca ctcc 24
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 46
catccatgag taagtgcgtc aagggca 27
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 47
ggtccatgcc ttggcgtgag gataa 25
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 48
cagcgattga atcctgggct ttctgg 26
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 49
gccggtccta ctggcctcac tccctac 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 50
tgggaaagag cggcaatggt agtgttc 27
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 51
ccggcattcg ggcctaagca ctct 24
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 52
cggtcctact ggcctcactc cctacct 27
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 53
gccggtccta ctggcctcac tccct 25
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 54
gcgccggtcc tactggcctc act 23
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 55
tggtccatgc cttggcgtga ggat 24
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 56
cgccattctg gcaattccag tcaaacg 27
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 57
tctcctgact aggcgaccgg caca 24
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 58
atccgccgtg gacccaggga agc 23
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 59
cggcggagga ggaggagcag agggagg 27
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 60
cggcggagga ggaggagcag aggga 25
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 61
cggcggagga ggaggagcag agg 23
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 62
tccatgagta agtgcgtcaa gggcaaa 27
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 63
gtggccttat ttgttgtcgc gggttta 27
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 64
ggtggcctta tttgttgtcg cgggtt 26
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 65
tttccgccag tcagcttacc cgct 24
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 66
cggtacaata cccgtgtcgg tccattc 27
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 67
gcggtacaat acccgtgtcg gtccat 26
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 68
cgggtcccag gttggcaact caa 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 69
atggtccatg ccttggcgtg agg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 70
cccgctcggc ccgtcccttc ctc 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 71
gacccgctcg gcccgtccct tcc 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 72
ccgacccgct cggcccgtcc ctt 23
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 73
tcaaccggca ggaaacgact caacg 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 74
cgatcttcct cgggtcccag gttgg 25
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 75
cgccgccgct cccgccgcca ttt 23
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 76
gcaattccag tcaaacggca agccc 25
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 77
acaccgcctg cgaccagctc cac 23
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 78
cgccgccacc gccgccactc tgc 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 79
aggcagtcct cgatccgctc gcc 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 80
tcccaggttg gcaactcaac gcc 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 81
gccgtggacc cagggaagcg gag 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 82
gccgccgcca ccgccgccac tct 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 83
gctgcggcga ggagcccagg gag 23
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 84
ggccgaaggt ggtggttggt gggagca 27
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 85
ggccgaaggt ggtggttggt gggag 25
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 86
ggccgaaggt ggtggttggt ggg 23
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 87
ccggcttgac agggcctgag ggg 23
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 88
aggctcaggt caaccggcag gaaa 24
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 89
gccgcgttga acggtatgtg ggaac 25
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 90
gccgcgttga acggtatgtg gga 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 91
ccctgccgcg ttgaacggta tgt 23
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 92
ctgggctttc tgggagccac tgtcatc 27
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 93
ctgccgccgc caccgccgcc act 23
<210> 94
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 94
gagtaaacca gtgtcctgtg ccgtgaaa 28
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 95
ggtcagagga cagaaaggtc agcgagg 27
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 96
tgaggtcaga ggacagaaag gtcagcga 28
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 97
ccagaaccgc tccttcctca tccca 25
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 98
tcccagaacc gctccttcct catcc 25
<210> 99
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 99
tgtatcccag aaccgctcct tcctcat 27
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 100
tcagaggaca gaaaggtcag cgagggt 27
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 101
ggtcggtctt cactcagccc atcgt 25
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 102
gctcagccct actccaacaa actgtcaaa 29
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 103
tgacaacctg gtgagggcag aaagc 25
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 104
gggattgtgg agccgaatgc ctttt 25
<210> 105
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 105
gctttcccga gtatgctgct gacctg 26
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 106
gagggacaag ggcaagggtt gaaaa 25
<210> 107
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 107
atgggcttgg agggagatga tggacact 28
<210> 108
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 108
atgggcttgg agggagatga tggacac 27
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 109
cctctgcctg gaccctttgg gaatg 25
<210> 110
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 110
gaaggcagaa gttgggttac aaggcaga 28
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 111
aagggctatc agttggcaga ggcaggg 27
<210> 112
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 112
caagggctat cagttggcag aggcag 26
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 113
aggctactcc tctggttggt tgcgg 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 114
ctgacctcag gttatccacc cgcct 25
<210> 115
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 115
aaagccgtat cactggcata aggaaag 27
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 116
tgcggcactc tgggaaggaa ctctg 25
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 117
gttatccacc cgcctctgcc tccca 25
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 118
cccggctggt tcctgctagg actac 25
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 119
gggtgagtgc ccaaagtgct gaaaa 25
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 120
attctgcggc actctgggaa ggaac 25
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 121
tatccacccg cctctgcctc ccaaa 25
<210> 122
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 122
cctcaggtta tccacccgcc tctgc 25
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 123
tcactctgtt gcccaggcta aatgc 25
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 124
aaacattctg cggcactctg ggaag 25
<210> 125
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 125
gctggcacat gactccctcg tgtatgg 27
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 126
gctggcacat gactccctcg tgtat 25
<210> 127
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 127
aactgacata ttgttgtgac attcagggg 29
<210> 128
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 128
aggttatcca cccgcctctg cctcc 25
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 129
gacctcaggt tatccacccg cctct 25
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 130
ccaaacattc tgcggcactc tggga 25
<210> 131
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 131
ggacctcctc ccttctttct tcccc 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 132
gagatgagga tcttcgctct tgccc 25
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 133
gaatttcaac actttgtatg gtctcccg 28
<210> 134
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 134
gagtctcact ctgttgccca ggctaaat 28
<210> 135
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 135
cttgctggat agagttacct gtagccca 28
<210> 136
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 136
cccggctggt tcctgctagg actacaatt 29
<210> 137
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 137
ttgctggata gagttacctg tagcccact 29
<210> 138
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 138
tatggctggc acatgactcc ctcgt 25
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 139
tctatggctg gcacatgact ccctc 25
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 140
catctatggc tggcacatga ctccc 25
<210> 141
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 141
cccaggcaac cactaatcta ctttctgtc 29
<210> 142
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 142
gcctggcctc attctggtct gtagttg 27
<210> 143
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 143
ggcctggcct cattctggtc tgtagt 26
<210> 144
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 144
tggcctggcc tcattctggt ctgta 25
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 145
agaaggaaat ggtctgttta atacgccac 29
<210> 146
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 146
ggctcactgc aacctccatc tcccg 25
Claims (9)
1.一种NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如Seq ID NO.1～146所示的一个或多个探针。
2.根据权利要求1所述的NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如Seq ID NO.1～146所示的全部探针。
3.根据权利要求1所述的NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，该探针组中的探针序列的5’端具有标记物。
4.一种NTRK融合突变检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的探针组。
5.一种NTRK融合突变检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测样本的DNA；
(2)利用步骤(1)提取的DNA构建待检测样本的DNA文库；
(3)获得检测NTRK融合突变的探针组；
(4)使步骤(3)获得的探针组与步骤(2)构建的DNA文库进行杂交，以捕获目标区域的DNA序列；
(5)对步骤(4)获得的杂交产物进行洗脱、分离，对捕获的目标区域的DNA序列进行PCR扩增，获得扩增产物，对扩增产物进行纯化，得到测序文库，然后对测序文库进行质检；
(6)利用高通量测序方法对步骤(5)获得的测序文库进行检测。
6.根据权利要求5所述的一种NTRK融合突变检测的方法，其特征在于，步骤(5)获得的测序文库的DNA片段长度为350-450bp。
7.根据权利要求5所述的一种NTRK融合突变检测的方法，其特征在于，步骤(2)中，首先将提取的DNA片段化，然后利用该片段化的DNA构建DA文库。
8.根据权利要求5所述的一种NTRK融合突变检测的方法，其特征在于，步骤(5)中，利用探针上的标记物对杂交产物进行分离。
9.根据权利要求8所述的一种NTRK融合突变检测的方法，其特征在于，
探针上的标记物为生物素，步骤(5)是利用链霉亲和素和生物素的亲和作用对杂交产物进行分离。
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| CN110331189A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-10-15 | 南京世和基因生物技术有限公司 | 一种ntrk融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库 |
| CN110527710A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-03 | 上海润安医学科技有限公司 | 一种用于检测ntrk基因融合突变的引物、探针及试剂盒 |
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