JP2009504782A - 神経疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents
神経疾患を治療するための方法および組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009504782A JP2009504782A JP2008527194A JP2008527194A JP2009504782A JP 2009504782 A JP2009504782 A JP 2009504782A JP 2008527194 A JP2008527194 A JP 2008527194A JP 2008527194 A JP2008527194 A JP 2008527194A JP 2009504782 A JP2009504782 A JP 2009504782A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- irna agent
- rna
- group
- sequence
- irna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 */C(/C=C/C(/O*)=C1)=C\C=C1\OC=N Chemical compound */C(/C=C/C(/O*)=C1)=C\C=C1\OC=N 0.000 description 2
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Abstract
Description
本願は、2005年8月18日に出願された米国仮特許出願番号第60/709,985号および2006年7月25日に出願された米国仮特許出願番号第60/833,234号の優先権を主張する。これらの仮出願の内容はその全体を本願明細書に援用する。
本明細書に記載の研究は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)に
よって授与された助成番号38194の下、米国政府からの資金を少なくとも部分的に使用して実行された。従って米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
RNA干渉または「RNAi」は、二本鎖RNA(dsRNA)が線虫に導入されると遺伝子発現を阻止することが可能であるという観察を説明するために、ファイア(Fire)および共同研究者らによって最初に作られた用語である(非特許文献1)。短いdsRNAは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングをもたらし、かつ遺伝子の機能を研究するための新規なツールを提供してきた。
ファイア(Fire)ら、1998年、Nature 第391巻、p.806〜811(発明の開示) 本発明の態様は、神経障害を治療するための組成物および該組成物の使用方法に関する。1つの態様では、本発明は、神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有する対象を、神経系細胞内で発現される遺伝子の発現を阻害するiRNA剤を投与することにより治療する方法を特徴とする。1つの実施形態では、iRNA剤は神経系細胞内への該iRNA剤の取り込みを促進する結合物を含む。好ましい実施形態において、結合物は親油性部分であり、例えばコレステロールである。別の実施形態では、iRNA剤は、神経疾患または神経障害に関与する神経系細胞内で発現される遺伝子の発現を阻害する。さらに別の実施形態では、iRNA剤は、神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有する患者を治療するために使用される。1つの実施形態では、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾されたiRNA剤は、ハンチントン病(HD)であるかまたはハンチントン病を発症するリスクを有するヒトにおいて、ハンチンチン(htt)遺伝子の発現を阻害するかまたは低下させることができる。
1つの実施形態では、iRNA剤のセンス鎖は該オリゴヌクレオチド剤のアンチセンス鎖内に少なくとも1つのミスマッチを含みうる。このミスマッチは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)によるアンチセンス鎖の選択を増強することなどによりiRNA剤に利点をもたらすことができる。1つの実施形態では、ミスマッチはセンス鎖の3’端ヌクレオチドから少なくとも1、2、3、4または5ヌクレオチド離れている。
別の実施形態では、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾された、例えばコレステロールと結合されたiRNA剤は、少なくとも21ヌクレオチド長であってセンスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、アンチセンスRNA鎖の長さは25ヌクレオチド以下であり、iRNA剤の二重鎖領域の長さは18〜25ヌクレオチドである。iRNA剤はさらに、1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含む場合もあり、非対合ヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエートによるジヌクレオチド結合を有することもある。ヌクレオチド突出部は、例えばiRNA剤のアンチセンス鎖の3’端にあってもよい。
チセンス鎖は、標的遺伝子から発現されるRNAの約18〜25ヌクレオチドの標的配列に十分相補的なヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において親油性部分は、センス鎖の少なくとも一端、例えばセンス鎖の3’端に結合され、別の実施形態では、iRNA剤はホスホロチオエートまたは2’修飾、例えば2’OMe修飾または2’O−フルオロ修飾を含む。1つの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表1または表2に列挙されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から選択された配列を含む。
ス鎖は該センス鎖にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。該方法は、iRNA剤に、例えばiRNA剤のセンス鎖の少なくとも一端に、少なくとも1つの親油性部分を組み込むことを含む。好ましい実施形態では、親油性部分はiRNA剤のセンス鎖の3’端に組み込まれる。1つの実施形態では、カチオン染料(例えばCy3)がiRNA剤の少なくとも一方の鎖に、例えばiRNA剤の3’端または5’端に組み込まれる。1つの実施形態では、2以上の親油性部分、例えば2以上の異なる種類の親油性部分がiRNA剤に組み込まれる。ある実施形態では、iRNA剤は表1または表2に例証されたリガンド結合体を含む。他の実施形態では、iRNA剤を製造する方法は、表1または表2に例証された構成単位の使用を含む。さらに他の実施形態では、本発明において主要な方法は、htt RNAを標的とする表1または表2に列挙されたiRNA剤を製造する方法を含む。1つの実施形態では、該方法はさらに、iRNA剤を、対象に、例えば哺乳類の対象に、例えばヒト対象に、例えば神経疾患もしくは神経障害であるかまたは神経疾患もしくは神経障害を発症するリスクを有するヒトに、投与することを含む。1つの実施形態では、ヒトはHDであるかまたはHDを発症するリスクを有する。
oで投与することと、神経のポリペプチドまたは神経のRNA(例えばhttポリペプチドまたはhtt RNA)のレベルを評価することとを含むこともできる。これらのうちいずれにおいても、神経遺伝子の発現に対する候補剤の作用は、遺伝子発現を所定の標準(例えば対照であって例えば未処置の細胞、組織または動物)と比較することを含むことができる。遺伝子発現は、例えば候補iRNA剤と接触させる前と後とで比較することができる。該方法により、iRNA剤がhtt遺伝子の発現を阻害するのに役立つかどうか測定することが可能になる。
低減する場合、該iRNA剤は神経遺伝子の発現を阻害するために有用であると測定することができる。神経遺伝子は内在性として発現されてもよいし外来性として発現されてもよい。
は病原体由来の標的RNA、の発現を下方制御可能なRNA剤である。理論によって束縛されることは望まないが、iRNA剤は、当技術分野においてRNAiと呼ばれることもある標的mRNAの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前のメカニズムを含む多数のメカニズムのうち1つ以上によって作用する可能性がある。iRNA剤は、二本鎖(ds)iRNA剤であることが好ましい。
断されるか、または神経疾患もしくは神経障害になる素因を有する人である。
神経疾患および神経障害のあらゆる患者が、本明細書に記述された方法または組成物を用いる治療に対する候補である。発症前の対象者も、神経系細胞に対して標的設定されたiRNA剤を用いる治療の候補になりうる。例えば、HDのリスクを有すると判定された発症前のヒトは、神経系細胞への送達のために親油性分子(例えばコレステロール分子)に結合させた抗htt iRNA剤を用いる治療の候補である。1つの実施形態では、発症前の候補者は、リスク要因のプロファイリングおよび機能的な神経画像検査のうちいずれかまたは両方により(例えばフルオロドーパおよび陽電子放射断層撮影により)特定される。例えば、候補対象者はリスク要因のプロファイリング後に機能的な神経画像検査を行うことにより特定することができる。
もの、または酸化的ストレスを生じるものが、ある人がPDを発症するリスクを増大させる可能性があり、かつPDの病因に寄与する可能性がある。これらの要因を、神経系細胞内への取り込み強化のために修飾された(例えば、コレステロール分子に結合させた)iRNA剤を用いる治療の候補対象者のリスク因子を評価する際に考慮することができる。
候補iRNA剤は、例えば遺伝子ウォーキング分析を実行することによって設計可能である。転写される領域の全体または一部に対応する、重複し、隣接し、または近接しているが間隔のあいた候補薬剤を作製し試験することが可能である。各iRNA剤について、標的遺伝子の発現を下方制御する能力に関して試験および評価することが可能である(後述する「候補iRNA剤の評価」を参照のこと)。
候補iRNA剤(例えば親油性部分に結合させた候補iRNA剤)を、神経系細胞内に取り込まれる能力について評価することができる。例えば、親油性部分に結合させた候補iRNA剤を、余分な親油性部分や、細胞内への取り込みを促進するトランスフェクション試薬を含んでいない溶液中に提供する。「トランスフェクション試薬」には、オリゴヌクレオチド剤に対する細胞の透過性を大きく変化させるイオンまたはその他の物質が挙げられる。典型的なトランスフェクション剤には、Lipofectamine(TM)(米国カリフォルニア州カールスバード所在のインビトロジェン(Invitrogen))、Lipofectamine2000(TM)、TransIT−TKO(TM)(米国ウィスコンシン州マディソン所在のマイラス(Mirus))、FuGENE6(米国インディアナ州インディアナポリス所在のロッシュ(Roche))、ポリエチレンイミン、X−tremeGENE Q2(米国インディアナ州インディアナポリス所在のロッシュ)、DOTAP、DOSPER、Metafectene(TM)(ドイツ国ミュンヘン所在のビオンテクス(Biontex))、あるいはその他のトランスフェクション試薬が挙げられる。
、iRNA剤を評価する方法は、同剤が細胞内の標的RNAの発現を減少させるかどうか測定することを含みうる。
褐色細胞腫(例えばPC12細胞)、ニューロン初代培養物(例えばマウスまたはラットから単離してすぐに培養したもの)、および神経芽細胞腫細胞株が挙げられる。神経芽細胞腫の細胞株には、BE(2)−M17、SH−SY5Y(いずれもヒト)、およびN2a(マウス)が挙げられる。
(1)例えば、内在性または外来性の、標的ではない(標的外の)RNAまたはタンパク質の発現と比較することによって、標的遺伝子の発現の減少についてアッセイし、iRNA剤の効力および特異性を試験すること;および
(2)標的遺伝子の発現に対する効果の特異性を、「機能しない」iRNA剤を投与することによって試験すること
が含まれる。
(a)細胞中で発現されない遺伝子を標的とするもの;
(b)ナンセンス配列(例えば、試験iRNAを乱雑化(スクランブル)したもの)であるもの;または
(c)標的遺伝子に対して相補的な配列を有するが、遺伝子発現をサイレンシングする能力を欠くことが事前の実験によってわかっているもの
であってよい。
評価することができる。
神経系細胞への取り込み強化のために親油性物質と結合させた候補iRNA剤を、該iRNA剤が対象の身体に導入される場合などの、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価することができる。修飾、特に切断(例えば、対象の体内に見出される成分による切断)に感受性を有する部位を同定するための方法を利用可能である。この成分(例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ)は、特定の組織、器官、または体液(例えば、血液、血漿、または血清)などの身体の特定の領域に特異的である可能性がある。身体の特定の領域におけるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断のいずれかに感受性を有する、iRNA剤中の部位は、身体の他の領域における切断に対しては耐性である可能性がある。例示的な方法には:
(1)対象の体内に存在する物質、および好ましくは治療用dsRNAが導入されるはずの身体のコンパートメント(治療剤が直接導入されるコンパートメント(例えば、循環系)ならびに治療剤が最終的に標的とするコンパートメントがあるが、場合によっては(例えば、眼および脳)、2つのコンパートメントは同じである))中に存在する成分が、dsRNA(例えば、iRNA剤)を切断する箇所を決定する工程、および
(2)dsRNA中の、(例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはその両方による)1つまたは複数の切断箇所を同定する工程
が含まれる。任意選択で、この方法はさらに、このような部位における切断を阻害するために修飾されたRNAを提供する工程を包含する。
(i)(a)候補dsRNA剤(例えば、iRNA剤)を試験物質(例えば、生体物質)と接触させる、
(b)サイズに基づくアッセイ(例えば、ゲル電気泳動)を使用して、iRNA剤が切断されるか否かを決定する。好ましい実施形態では、経時変化が測定され、異なる時間インキュベートされた多数の試料がサイズに基づくアッセイに供される。好ましい実施形態では、候補のdsRNAは標識されない。この方法は、「ステインオール(stains all)」方法であってもよい。
(b)試験物質と候補dsRNAを接触させる、
(c)サイズに基づくアッセイ(例えば、ゲル電気泳動)を使用して、iRNA剤が切断されるか否かを決定する。好ましい実施形態では、経時変化が測定されるが、その場合は多数の試料が異なる時間インキュベートされてサイズに基づくアッセイに供される。好ましい実施形態において、測定は、フラグメント中に存在するヌクレオチド数の決定が可能な条件下でなされる。例えば、インキュベートされた試料を、切断産物の長さを決定可能にするマーカーを有するゲルで泳動する。このゲルは、「ラダー」状の消化物である標準品を含んでもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識してもよい。好ましくは、一方の鎖のみが特定の実験において標識される。標識は、5’末端、3’末端、または内部の位置に組み込むことが可能である。フラグメントの長さ(およびしたがって切断箇所)は、上記のラダーに基づくフラグメントのサイズ、およびRNAse T1などの部位特異的エンドヌクレアーゼを用いたマッピングから決定可能である。
例示的な修飾には、本明細書に記載される修飾などの、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾が含まれる。特に好ましい修飾には:2’−修飾、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖(とりわけセンス鎖)のUへの2’OMe部分の付与;バックボーンの修飾、例えば、リン酸バックボーン内のOをSに置換する修飾、例えば、特にアンチセンス鎖のUまたはAまたはその両方へのホスホロチオエート修飾の付与;UからC5アミノリンカーへの置換;AからGへの置換(配列の変化はセンス鎖上に配置されアンチセンス鎖上には配置されないことが好ましい);および2’位、6’位、7’位、または8’位の修飾、が含まれる。好ましい実施形態は、これらの修飾のうち1つ以上がセンス鎖上に存在するがアンチセンス鎖上には存在しない実施形態、またはアンチセンス鎖が有するこのような修飾がより少ない実施形態である。
親油性部分と結合され、かつ培養中の神経系細胞に侵入する能力が強化されていると同定されたiRNA剤を、動物モデル(例えば、マウスまたはラットなどの哺乳動物のモデル)においてin vivoでの機能性について試験することができる。例えば、iRNA剤を動物に投与して、該iRNA剤の生体内分布(例えば神経系細胞への取り込み)、安定性、および神経系細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する能力に関して評価することができる。
できる。
本明細書中に記載されているのは、RNAiを仲介する単離iRNA剤(例えば、dsRNA分子)である。このiRNA剤は、神経系細胞への取り込み強化のために、該iRNAを少なくとも1つの親油性部分(例えば、コレステロール分子)に結合させることにより修飾されている。
たらすのを可能にするために十分でなくてはならない。したがって、本発明で着目されるiRNA剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる薬剤を含み、各鎖は、鎖あたり1、2、または3個以下のヌクレオチドがそれぞれ他のヌクレオチドで置換されている(例えばアデノシンがウラシルに置き換えられる)ことを除いて、神経系細胞中で発現される遺伝子の配列と(以下に定義されるように)本質的に同一の、少なくとも16、17または18ヌクレオチドの配列を含んでなり、同時に哺乳動物細胞における標的遺伝子の発現を阻害する能力は本質的に保持している。したがって、典型的なiRNA剤は、標的遺伝子の配列と同一の少なくとも15ヌクレオチドを有するが、ただし標的mRNAの配列に関して、またはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に、1、2または3塩基のミスマッチが導入されているものでよい。特にアンチセンス鎖における、標的mRNAの配列に対するミスマッチは、末端領域において最も寛容性が高く、存在する場合、好ましくは末端領域にあり、例えば、5’末端および/または3’末端の6ヌクレオチド以内、5ヌクレオチド以内、4ヌクレオチド以内、または3ヌクレオチド以内にあり、もっとも好ましくは、センス鎖の5’末端またはアンチセンス鎖の3’末端の6ヌクレオチド以内、5ヌクレオチド以内、4ヌクレオチド以内、または3ヌクレオチド以内にある。センス鎖には、該分子の二本鎖全体の性質を維持するために十分なアンチセンス鎖との相補性があればよい。
(1)後述の式1、2、3、または4のものである;
(2)一本鎖である場合、1つ以上のリン酸基または1つ以上のリン酸基アナログを含
む5’修飾を有する;
(3)非常に多数の塩基が修飾されていても、特異的な塩基対を形成し、かつ標的RNAとともに熱力学的安定性が十分な二重鎖構造を形成して標的RNAの活性を変化させることが可能である;
(4)非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、なお「RNA様の」特性を有する。すなわち、リボヌクレオチドに基づく含量では独占的でなく、または部分的でさえあるにも関わらす、RNA分子の全体的な構造上の特性、化学的特性および物理的特性を有する。例えば、すべてのヌクレオチド糖が2’ヒドロキシルの代わりに例えば2’OMeまたは2’フルオロを含むことが可能である。このようなデオキシリボヌクレオチド含有剤は、なおRNA様の特性を示すことが予測されうる。理論によって束縛されることは望まないが、電気的に陰性のフッ素は、リボースのC2’位に結合されたときに軸方向に配向する傾向がある。このフッ素の空間的な優先傾向は、ひいては、糖のC3’内部にくぼみを形成させる。これは、RNA分子中で観察されるのと同じくぼみ形成様式であり、RNAに特徴的なAファミリー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は良好な水素結合のアクセプターであるので、RNA構造を安定化させることが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与することが可能である。一般的には、糖の2’位で修飾された部分は、デオキシリボヌクレオチドの2’‐H部分よりも、リボヌクレオチドの2’‐OH部分により特徴的である水素結合に参加することができることが好ましい。好ましいiRNA剤は:その糖の全体または少なくとも50、75、80、85、90、もしくは95%において、C3’内部にくぼみを示し;RNAに特徴的なAファミリー型ヘリックスを生じることが可能な程度に十分な量の糖においてC3’内部のくぼみを示し;C3’内部のくぼみ構造ではない20個、10個、5個、4個、3個、2個、または1個以下の糖を有する。これらの制限はアンチセンス鎖において特に好ましく;
糖のC3’内部のくぼみを備えた好ましい2’修飾には:
2’‐OH、2’‐O‐Me、2’‐O‐メトキシエチル、2’‐O‐アミノプロピル、2’‐F、2’‐O‐CH2‐CO‐NHMe、2’‐O‐CH2‐CH2‐O‐CH2‐CH2‐N(Me)2、LNAが含まれる;
(5)修飾の性質にかかわらず、またオリゴヌクレオチド剤がデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であるとしても、DNA分子、あるいは、分子中のヌクレオチドの50、60、もしくは70%より多くがデオキシリボヌクレオチドであるかまたは2’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドである任意の分子は、オリゴヌクレオチド剤の定義から除外することが好ましい。
21を参照のこと)。リン酸化を妨害する他の修飾、例えば、単に5’−OHをO−MeではなくHによって置換することもまた使用可能である。代替例として、大きな嵩高い基が5’リン酸基に付加されてこの基がホスホジエステル結合に転換されてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがこのような結合を切断して機能的なsRNA5’末端を生じる可能性があるので、あまり望ましくないかもしれない。アンチセンス鎖の修飾には、5’リン酸化ならびに本明細書中で議論される任意の他の5’修飾が含まれる。
ることを望まないが、本明細書に記載の作用物質によるサイレンシングは、RNAiの機構またはプロセスおよびガイドRNA(例えば、15〜30ヌクレオチド対のiRNA剤)を使用すると考えられる。
酸部分の結合していないOの修飾)。ある場合において修飾は核酸中の対象位置すべてに存在するが、しかし、多くの場合および実際上大部分においては、そうではない。例として、修飾は、3’または5’末端位置にのみ存在する場合があり、末端領域(例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチド)にのみ存在する場合もある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在することができる。修飾は、RNAの二本鎖領域中にのみ存在してもよいし、またはRNAの一本鎖領域にのみ存在してもよい。リガンドが、3’末端、5’末端、または内側の位置、またはこれらを組み合わせた位置に結合していてもよい。例えば、リガンドは3’末端および5’末端にあってもよいし;3’末端と1以上の内側の位置にあってもよいし;5’末端と1以上の内側の位置にあってもよいし;3’末端、5’末端および1以上の内側の位置にあってもよい。例えば、結合していないOの位置のホスホロチオエート修飾が、一方もしくは両方の末端にのみ存在してもよいし、末端領域(例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチド内)にのみ存在してもよいし、または二本鎖および一本鎖の領域に、特に末端に存在することも可能である。同様に、修飾はセンス鎖上でも、アンチセンス鎖上でも、両方の鎖上にあってもよい。ある場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は同じ修飾または同じ部類の修飾を有するが、別の場合にはセンス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えばある例では一方の鎖(例えばセンス鎖)のみを修飾することが望ましい。5’末端がリン酸化されてもよい。特定の好ましい実施形態では、センス鎖はコレステロールの付加により3’末端が修飾される。
(i)変更、例えば、結合していないリン酸の酸素(XおよびY)の一方もしくは両方の置換、および/または結合しているリン酸の酸素(WおよびZ)の1つ以上の置換(リン酸が末端位置にある場合、位置WまたはZの1つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなるエレメントにリン酸を結合しないことになる。しかし、用語の単純化のために、別途注記される場合以外は、核酸の5’末端のW位置および核酸の3’末端のZ位置は、本明細書中で使用される用語「結合していないリン酸の酸素」の範囲内にある);
(ii)変更、例えば、リボース糖の構成成分(例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシル)の置換、またはリボース糖の、リボース以外の構造(例えば、本明細書中に記載されるようなもの)による大規模置換;
(iii)リン酸部分(括弧I)の、「リンを含まない(dephospho)」リンカーによる大規模置換;
(iv)天然に存在する塩基の修飾または置換;
(v)リボース−リン酸バックボーン(括弧II)の置換または修飾;
(vi)RNAの3’末端もしくは5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、または置換、あるいはRNAの3’末端もしくは5’末端のいずれかへの、構成部分(例えば、蛍光標識部分)の結合。
リン酸基は、リン以外のものを含む接続部によって置換可能である(上記の式1中の括弧Iを参照のこと)。理論によって束縛されることは望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、この基を中性の構造模倣物で置換するとヌクレアーゼ安定性が強化されるはずであると考えられる。やはり理論によって束縛されることは望まないが、ある実施形態においては、荷電したリン酸基を中性部分によって置換する変更を導入することが望ましい可能性がある。
リボリン酸バックボーンの置換
リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物によって置換されている、オリゴヌクレオチドを模倣するバックボーンを構築することも可能である(上記の式1の括弧IIを参照のこと)。理論によって束縛されることは望まないが、反復的に荷電したバックボーンが存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)への結合が減少すると考えられる。やはり理論によって束縛されることは望まないが、ある実施形態においては、塩基を中性の代用バックボーンに連結する変更を導入することが望ましい可能性がある。
のヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物はPNA代用物である。
候補の修飾は後述のようにして評価可能である。
オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を修飾することが可能である。このような修飾は、分子の3’末端、5’末端、または両方の末端にあってもよい。該修飾には、末端のリン酸全体の、または末端リン酸基の1つ以上の原子の、修飾または置換が含まれうる。例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を、他の機能的分子実体、例えば標識部分(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素もしくはCy5色素などのフルオロフォア)または保護基(例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルを含む基など)に結合させることが可能である。前記機能的分子実体は、リン酸基またはスペーサーのうち少なくともいずれか一方を介して糖に結合することが可能である。スペーサーの末端原子は、該リン酸基の連結原子または糖のC−3’もしくはC−5’のO、N、S、もしくはC基を接続または置換することが可能である。代替例として、スペーサーは、ヌクレオチド代用物(例えば、PNA)の末端原子を接続または置換することが可能であってもよい。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−(CH2)n−、−(CH2)nN−、−(CH2)nO−、−(CH2)nS−、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH(例えば、n=3または6)、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノなど、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含み得る。「スペーサー/リン酸‐機能的分子実体‐スペーサー/リン酸」という配列構造が、iRNA剤の2つの鎖の間に介在するとき、この配列構造は、ヘアピン型RNA剤中のヘアピンRNAループの代わりに機能することが可能である。3’末端は−OH基であり得る。理論に束縛されることは望まないが、特定の部分を結合することにより、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性についての特性を改善することが可能であると考えられる。やはり理論に束縛されることは望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の変更を導入することが望ましい可能性がある。
ン酸(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’ホスホロチオール酸((HO)2(O)P−S−5’);酸素/硫黄で置換された一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ(例えば、5’−α−チオ三リン酸、5’−γ−チオ三リン酸など)、5’−ホスホロアミデート((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’−アルキルホスホン酸(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’、(OH)2(O)P−5’−CH2−)、5’−アルキルエーテルホスホン酸(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2−)、エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−)が挙げられる。
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合されたiRNA剤のヌクレアーゼ耐性を強化することができる。
飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことである。
ある態様では、iRNA剤のヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼ感受性の部位を特定し、切断を阻害するために当該部位を修飾することによって強化される。例えば、ジヌクレオチド5’−UA−3’、5’UG3’、5’−CA−3’、5’UU−3’、または5’−CC−3’は、切断部位としての役割を果たす可能性がある。したがって、ヌクレアーゼ耐性の強化は、5’ヌクレオチドを修飾して、例えば、ウリジンが2'−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも1つの5'−ウリジン−アデニン−3'(5'−UA−3')ジヌクレオチド;5'−ウリジンが2'−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5'−ウリジ
ン−グアニン−3'(5'−UG−3')ジヌクレオチド;5'−シチジンが2'−修飾ヌク
レオチドである少なくとも1つの5'−シチジン−アデニン−3'(5'−CA−3')ジヌクレオチド;5'−ウリジンが2'−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5'−ウリ
ジン−ウリジン−3'(5'−UU−3')ジヌクレオチド;または5'−シチジンが2'−
修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5'−シチジン−シチジン−3'(5'−CC−
3')ジヌクレオチドを生じることにより達成可能である。iRNA剤は、このようなジ
ヌクレオチドを少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、または少なくとも5個含み得る。ある実施形態では、iRNA剤の全てのピリミジンが2’−修飾を有し、したがって該iRNA剤は高いエンドヌクレアーゼ耐性を有する。
Monomer)と呼ばれ、対応する修飾はNRM修飾と呼ばれる。多くの場合、これらの修飾は、iRNA剤の他の特性、例えばタンパク質(例えば輸送タンパク質(例えば血清アルブミン)またはRISC構成物)と相互作用する能力、または第1および第2の配列が互いに二重鎖を形成するかもしくは別の配列(例えば標的分子)と二重鎖を形成する能力をも同様に変化させることになろう。
たは3ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドを意味する。
リボース模倣体
本明細書に記載のモノマーおよび方法を用いて、リボース模倣体を組み込んだオリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
RNAi剤送達モジュールの1つのサブセットでは、Aは該RNA剤の末端3’または5’リボース糖の炭素を介して、直接的あるいは間接的に結合することが可能である。
RNAi剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、nは1であり、R2とR6が合わさって6原子を含む環を形成し、R4とR5が合わさって6原子を含む環を形成する。環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのRNAi剤送達モジュールは、式(Y−1)の化合物を含むことが可能である:
速液体クロマトグラフィ、または再結晶化などの方法によってさらに精製することが可能である。さらに、様々な合成工程を他の順序または順番で実施して所望の化合物を得ることも可能である。本明細書に記載した化合物を合成する際に有用な、合成化学変換および保護基に関する方法(保護および脱保護)は当分野で知られており、例えばR.ラロック(R.Larock)、「Comprehensive Organic Transformations」、VCH出版(V
CH Publishers)(1989);T.W.グリーン(T.W.Greene)およびP.G.M.ワッツ(P.G.M.Wuts)、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第2版、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley and
Sons)(1991);L.ファイザー(L.Fieser)およびM.ファイザー(M.Fieser)、「Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis」、
ジョンワイリーアンドサンズ(1994);およびL.パケッテ(L.Paquette)編「Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis」、ジョンワイリーアンドサンズ(1995)、ならびにその後続版に記載されたものなどを含む。
神経系細胞への取り込み強化のため修飾されるiRNA剤は、リガンド、例えば親油性リガンドに接続される。該リガンドは該オリゴヌクレオチド剤に対し、モノマー(例えばオリゴヌクレオチド剤の中に組み込まれる化学修飾モノマー)を介して接続される。好ましい実施形態では、この接続は本明細書に記載の係留部またはリンカー(または両方)により行われ、該複合物は式:
リガンド‐[リンカー]任意‐[係留部]任意‐オリゴヌクレオチド剤
で表される。
リガンド‐[リンカー]任意‐[係留部]任意‐モノマー
を有するモノマーサブユニットを包含する。
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド剤の糖(例えば、ヌクレオチド(例えば、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド)の1または複数のリボース糖)サブユニットは、他の構成部分、例えば非糖質の(好ましくは環式の)担体で置換することが可能である。ヌクレオチド・サブユニットであって該サブユニットの糖がそのように置換されているものを、本願明細書では糖置換修飾サブユニット(SRMS)と呼ぶ。これは本明細書において「係留部」と呼ばれることも多い。環式担体は炭素環系(すなわち、すべての環原子が炭素原子)であってもよいし、あるいはヘテロ環系(すなわち、1つまたは複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素、イオウ)であってもよい。環式担体は単環系であってもよいし、あるいは2つ以上の環、例えば縮合環を含むことも可能である。環式担体は完全に飽和した環系であってもよいし、あるいは1つまたは複数の二重結合を含んでいてもよい。
せる構成部分であってよい。最も好ましい構成部分の1つは、細胞内への侵入を促進する構成部分、例えば親油性部分(例えば、コレステロール)である。理論に束縛されることは望まないが、親油性物質の結合によりオリゴヌクレオチド剤の親油性が増大すると考えられる。場合によっては、選択した構成部分を、係留部を介在させて環式担体と接続する。したがって選択した構成部分は、官能基(例えばアミノ基)を含むか、または一般的に、他の化学的実体(例えば構成環に対するリガンド)の取り込みまたは連結に適した結合を与えることが多くなる。
XはN(CO)R7、NR7またはCH2であり;
YはNR8、O、S、CR9R10であるかまたは存在せず;
ZはCR11R12であるかまたは存在せず;
R1、R2、R3、R4、R9、およびR10のそれぞれは独立にH、ORa、ORb、(CH2)nORa、または(CH2)nORbであって、ただし、R1、R2、R3、R4、R9、およびR10のうち少なくとも1つはORaまたはORbであり、かつR1、R2、R3、R4、R9、およびR10のうち少なくとも1つは(CH2)nORa、または(CH2)nORbであり(SRMSが末端に存在するとき、R1、R2、R3、R4、R9、およびR10のうち1つはRaを含み、かつ1つはRbを含み;SRMSSが内部に存在するとき、R1、R2、R3、R4、R9、およびR10のうち2つがそれぞれRbを含む);さらに、ORaは(CH2)nORbとともにのみ存在し、(CH2)nORaはORbとともにのみ存在することが好ましく;
R5、R6、R11、およびR12のそれぞれは独立に、H、任意選択で1〜3個のR13で置換されたC1〜C6アルキル、またはC(O)NHR7であり;あるいは、R5およびR11が合わさって、任意選択でR14により置換されたC3〜C8シクロアルキルをなし;
R7はリガンドであってよく、例えばR7はRdであってもよいし、あるいはR7は担体に間接的に(例えば、係留部分を介して)係留されたリガンド、例えばNRcRdで置換されたC1〜C20アルキル;またはNHC(O)Rdで置換されたC1〜C20アルキルであり;
R8はC1〜C6アルキルであり;
R13はヒドロキシ、C1〜C4アルコキシ、またはハロであり;
R14はNRcR7であり;
Raは、
RcはHまたはC1〜C6アルキルであり;
RdはHまたはリガンド(例えば親油性リガンド、例えばコレステロール)であり;
nは1〜4である。)
実施形態は、以下の特徴のうち1以上を含むことができる。
R1がCH2ORbでR3がORbであるか;R1がCH2ORbでR9がORbであるか;R1がCH2ORbでR2がORbであるか;R1がCH2ORbでR3がORaであるか;R1がCH2ORbでR9がORaであるか;R1がCH2ORbでR2がORaであってよい。
R1がORbでR3がCH2ORbであるか;R1がORbでR9がCH2ORbであるか;R1がORbでR2がCH2ORbであるか;R1がORbでR3がCH2ORaであるか;R1がORbでR9がCH2ORaであるか;R1がORbでR2がCH2ORaであってよい。
R3がCH2ORbでR9がORbであるか;R3がCH2ORbでR4がORbであるか;R3がCH2ORbでR9がORaであるか;R3がCH2ORbでR4がORaであってよい。
R9がCH2ORaでR10がORbであってよい。
好ましい実施形態では、リボースはピロリン骨格または4−ヒドロキシプロリン由来の骨格で置換され、かつXはN(CO)R7またはNR7であり、YはCR9R10であり、かつZは存在しない。
nは1でよい。
R1が(CH2)nORbでR3がORbであるか;R1が(CH2)nORaでR3がORbであってよい。
R1がORaでR9が(CH2)nORbであるか;R1が(CH2)nORbでR9がORbであるか;R1が(CH2)nORaでR9がORbであるか;R1がORbでR9が(CH2)nORbであるか;R1がORbでR9が(CH2)nORaであってよい。
別の実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置換され、かつXはN(CO)R7またはNR7であり、YはCR9R10であり、かつZはCR11R12である。
nは1または2でよい。
R9が(CH2)nORbでR10がORbであるか;R9が(CH2)nORaでR10がORbであってよい。
R7は(CH2)5NHRdまたは(CH2)5NHRdであってよい。Rdは、葉酸基;コレステロール基;糖質基;ビタミンA基;ビタミンE基;ビタミンK基から選択することができる。好ましくは、Rdはコレステロール基である。
R1が(CH2)nORbでR2がORaであるか;R1が(CH2)nORbでR2がORbであるか;R1が(CH2)nORaでR2がORbであってよい。
R3およびR9はシス位にあってもよいし、R3およびR9はトランス位にあってもよい。
R1が(CH2)nORbでR3がORaであってよい。
R3がORaでR9が(CH2)nORbであってよい。
別の実施形態では、リボースはピペラジン骨格で置換され、かつXはN(CO)R7またはNR7であり、YはNR8であり、かつZはCR11R12である。
R1およびR3はシス位にあってもよいし、R1およびR3はトランス位にあってもよ
い。
R1が(CH2)nORbでR3がORbであるか;R1が(CH2)nORaでR3がORbであってよい。
R7は(CH2)5NHRdまたは(CH2)5NHRdであってよい。Rdは、葉酸基;コレステロール基;糖質基;ビタミンA基;ビタミンE基;ビタミンK基から選択することができる。好ましくは、Rdはコレステロール基である。
R1がORaでR3が(CH2)nORbであってよい。
別の実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置換され、かつXはN(CO)R7またはNR7であり、YはOであり、かつZはCR11R12である。
R1およびR3はシス位にあってもよいし、R1およびR3はトランス位にあってもよい。
R1が(CH2)nORbでR3がORbであるか;R1が(CH2)nORaでR3がORbであってよい。
R7は(CH2)5NHRdまたは(CH2)5NHRdであってよい。Rdは、葉酸基;コレステロール基;糖質基;ビタミンA基;ビタミンE基;ビタミンK基から選択することができる。好ましくは、Rdはコレステロール基である。
R1がORaでR3が(CH2)nORbであってよい。
別の実施形態では、リボースはデカリン骨格で置換され、かつXはCH2であり;YはCR9R10であり;かつZはCR11R12であり;かつR5およびR11は一体となってC6シクロアルキルをなす。
R12は水素でよい。
R6およびR12はトランス位にあってよい。
R3およびR9はシス位にあってもよいし、R3およびR9はトランス位にあってもよい。
R3がORbでR9が(CH2)nORbであるか;R3がORbでR9が(CH2)nORaであってよい。
R7は(CH2)5NHRdまたは(CH2)5NHRdであってよい。Rdは、葉酸基;コレステロール基;糖質基;ビタミンA基;ビタミンE基;ビタミンK基から選択す
ることができる。好ましくは、Rdはコレステロール基である。
R12は水素でよい。
R6およびR12はトランス位にあってよい。
R3およびR9はシス位にあってもよいし、R3およびR9はトランス位にあってもよい。
R3がORbでR9が(CH2)nORaであるか;R3がORbでR9が(CH2)nORaであってよい。
R14はN(CH3)R7でよい。R7は(CH2)5NHRdまたは(CH2)5NHRdであってよい。Rdは、葉酸基;コレステロール基;糖質基;ビタミンA基;ビタミンE基;ビタミンK基から選択することができる。好ましくは、Rdはコレステロール基である。
XはN(CO)R7またはNR7であり;
R1およびR2はそれぞれ独立にORa、ORb、(CH2)nORa、または(CH2)nORbであって、ただし、R1およびR2のうち一方がORaまたはORbで他方が(CH2)nORaまたは(CH2)nORbであり(SRMSが末端にあるとき、R1またはR2のうち1つがRaを含み、かつ1つがRbを含むことになり、SRMSSが内部にあるとき、R1およびR2の両方がそれぞれRbを含むことになる);さらに、ORaは(CH2)nORbとともにのみ存在し、(CH2)nORaはORbとともにのみ存在することが好ましく;
R7はNRcRdで置換されたC1〜C20アルキルであり;
R8はC1〜C6アルキルであり;
R13はヒドロキシ、C1〜C4アルコキシ、またはハロであり;
R14はNRcR7であり;
Raは、
RcはHまたはC1〜C6アルキルであり;
RdはHまたはリガンドであり;
nは1〜4である。)
結合体中のオリゴヌクレオチド剤は実質的に一本鎖であり、約12〜約29個のサブユニット、好ましくは約15〜約25個のサブユニットを含んでなる。実質的に一本鎖のオリゴヌクレオチド剤は、少なくとも60%、70%、80%または90%以上の、二重鎖を成さないヌクレオチドを含む。
さらなる態様では、本発明は、式(I)または式(II)を含む少なくとも1つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
別の態様では、本発明は、式(I)または(II)のうち少なくともいずれかを含む少なくとも1つのサブユニットを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤を製造する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。該方法は、式(I)または(II)のうち少なくともいずれかを含む少なくとも1
つのサブユニットを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤を、対象に投与することを含む。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は内側の位置にSRMSを有する場合がある。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、3’末端に1つのSRMS、および内側の位置に1つのSRMSを有する場合がある。
オリゴヌクレオチド剤は、本明細書に記載のアーキテクチャまたは構造をとることができる。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は本明細書に記載のアーキテクチャ(アーキテクチャとは、全長のうち1つ以上を指す)を有する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤のSRMS含有塩基に加えて、ヌクレアーゼ耐性モノマー(NRM)を含むことができる。
ジンから成る群から、選択することができる。好ましい親油性部分はコレステロールである。
種々様々な物をオリゴヌクレオチド剤に(例えばリガンド結合モノマーの担体に)係留することができる。リガンド結合モノマーに関連して以下に例を述べるが、それは単に1つの好ましい実施形態にすぎない。オリゴヌクレオチド剤に対し他の接点で物を接続することもできる。
element)に対する親和性が高められている。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド・リガンドのグアニジン・アナログ(グアニジノグリコシド)がオリゴヌクレオチド剤に係留される。グアニジノグリコシドでは、アミノ酸上のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン・アナログを結合させることにより、オリゴヌクレオチド剤(例えば、miRNAまたはプレmiRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤)の細胞透過性を強化することができる。
好ましい構成部分はリガンドであり、リガンドは、好ましくは共有結合により、直接的あるいは係留部を介在させて間接的に、リガンド結合担体に接続される。好ましい実施形態では、リガンドは係留部を介在させて担体に結合される。先に論じたように、リガンドまたは係留リガンドは、モノマーが伸長する鎖に組み込まれるときにモノマー上に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体」リガンド結合モノマーを伸長する鎖に組み込ませた後に、「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットにリガンドを組み込むことが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端を有する係留部(例えばTAP−(CH2)nNH2)を備えたモノマーを、伸長するオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことが可能である。後の操作において、すなわち前駆体モノマーを鎖に組み込ませた後、続いて、求電子基(例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基)を有するリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体モノマーサブユニット係留部の末端求核基とのカップリングによって、前駆体モノマーサブユニットと結合させることが可能である。
ンパク質結合物質、インテグリン指向性分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
ゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+錯体)、ジニトロフェニル、HRP、またはAPがある。
部分はN‐アセチルガラクトサミン、N−Ac−グルコサミンであってもよい。マンノースまたはマンノース−6−リン酸を標的とする部分は、マクロファージへの標的設定のために使用することができる。
クレオチド、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を横切って運ぶことができる「送達」ペプチドとなりうる。例えば、HIV Tatタンパク質由来の配列(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号48))、およびショウジョウバエのアンテナペディア・タンパク質由来の配列(RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号49))は、送達ペプチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリ、または1ビーズ1化合物(OBOC)コンビナトリアル・ライブラリから同定されたペプチドなど、ランダムなDNA配列によってコードされてもよい(ラム(Lam)ら、Nature、354:82〜84、1991)。取り込まれたモノマーユニットを介してiRNA剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)ペプチド、またはRGD模倣体などの、細胞を標的とするペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約5アミノ酸〜約40アミノ酸の範囲であってよい。ペプチド部分は、安定性を増大させるため、あるいは立体構造上の特性を指定するためなどの、構造上の修飾を有することもできる。以下に記載する任意の構造上の修飾を使用することが可能である。
神経系細胞内への取り込み強化のために親油性部分に結合させたiRNA剤は、修飾塩基または非天然塩基、例えば本願明細書に記載の塩基を含むことが可能である。さらに、iRNA剤は、修飾塩基または非天然塩基と、本願明細書に記載するその他の要素とを有することができる。
インコーポレイティッド(Marcel Dekker,Inc.)の中のマノハラン(Manoharan)著「Oligonucleotide Conjugates in Antisense Technology」を参照のこと。
み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、AntペプチドまたはTatペプチドが、オリゴ尿素結合体(またはオリゴチオ尿素結合体)であってもよい。
Res.、62:5139−43、2002年)。RGDペプチドは、オリゴヌクレオチド剤(例えば、miRNAまたはプレmiRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤)を肺、腎臓、脾臓または肝臓を含む様々なその他の組織の腫瘍に対して標的設定するのを容易にすることもできる(アオキ(Aoki)ら、Cancer Gene Therapy 8:783−787、2001年)。好ましくは、RGDペプチドは、オリゴヌクレオチド剤を腎臓に対して標的設定するのを容易にするだろう。RGDペプチドは直線状でも環状でもよく、また、例えば、特定の組織に対する標的設定を容易にするためのグリコシル化またはメチル化など、修飾されていてもよい。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、αvβ3を発現している腫瘍細胞にオリゴヌクレオチド剤を送達することができる(ホーブナー(Haubner)ら、Jour.Nucl.Med.、42:326−336、2001年)。
一部の実施形態では、リガンドは本明細書に記載の核酸塩基のうち任意のものであってよい。
本明細書に記載の異常塩基を含んでいるリボヌクレオシドのリストは、パミラ F.クレイン(Pamela F. Crain)、ジェフ ロゼンスキー(Jef Rozenski)およびジェームズ A.マックロスキー(James A. McCloskey)(米国84112ユタ州ソルトレークシティ所在のユタ大学、Medicinal
Chemistry and Biochemistry)によって維持されている「RNA修飾データベース(RNA Modification Database)」に記載されている。
Schultz, P.G.; Romesberg, F. E., Nucleic Acids Res., 2000, 28, 2911-2914; Ogawa, A. K.; Wu, Y.; McMinn, D. L.; Liu, J.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 3274-3287; Ogawa, A. K.; Wu. Y.; Berger, M.; Schultz, P.
G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 8803-8804; Tae, E. L.; Wu, Y.; Xia, G.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2001, 123, 7439-7440; Wu, Y.; Ogawa, A. K.; Berger, M.; McMinn, D. L.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 7621-7632; McMinn, D. L.; Ogawa. A. K.; Wu, Y.; Liu, J.; Schultz, P. G.; Romesberg, F. E., J. Am. Chem. Soc, 1999, 121, 11585-11586; Brotschi, C; Haberli, A.; Leumann, C, J. Angew. Chem. Int. Ed., 2001,
40, 3012-3014; Weizman, H.; Tor, Y., J. Am. Chem. Soc, 2001, 123, 3375- 3376; Lan, T.; McLaughlin, L. W., J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 6512-13。
で処理して修飾リン酸バックボーンを形成してもよい。本明細書に記載のモノマーとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド鎖との間の結合も、ヨウ素、硫黄、セレン、アミノおよびホウ素試薬で処理して、非修飾および修飾リン酸バックボーンをそれぞれ形成することができる。同様に、本明細書に記載のモノマーを、本明細書に記載の、任意の修飾を含むヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド代用物と結合させてもよい。
コーポレイテッド(Marcel Dekker,Inc.)の中のマノハラン(Manoharan)著「Oligonucleotide Conjugates in Antisense Technology」を参照のこと。
ートであってもよい。
、すなわちR.ラロック(R.Larock)、「Comprehensive Organic Transformations」、VCH出版(VCH Publishers)(1989);T.W.グリーン
(T.W.Greene)およびP.G.M.ワッツ(P.G.M.Wuts)、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第2版、ジョンワイリーアンドサンズ(John Wiley and Sons)(1991);L.ファイザー(L.Fieser)およびM.ファイザー(M.Fieser)、「Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis」、ジョンワイリーアンドサンズ(1994);およびL.パケッテ
(L.Paquette)編「Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis」、ジョンワイリーアンドサンズ(1995)、ならびにその後続版に記載されたものなどがある。
オリゴヌクレオチド剤、例えば、miRNAまたはプレmiRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤にリガンドを結合すると、同剤の調整作用に好ましい影響を及ぼす可能性がある。例えば、オリゴヌクレオチド剤の薬物動態、安定性または組織特異性のうち少なくともいずれかが向上する可能性がある。
れるようにして実施される。ステップ(iv)は、文献(コーリー(Corey)およびベンケイテスバール(Venkateswarlu)、J.Am.Chem.Soc.94:6190、1972年)に報告されるようにして実施される。
コーリー(Corey)およびベンケイテスバール(Venkateswarlu)の報告(J.Am.Chem.Soc.94:6190、1972年)のようにして実施し;ステップ(iii)はフレーザー(Fraser)らの報告(Tetrahedron Lett.41:1523、2000年)のようにして実施し;ステップ(iv)はミラー(Miller)ら著(「Current Protocol in Nucleic
Acids Chemistry」、2000、2.5.1−2.5.36、ジョンワイリーアンドサンズ社)に記載されているようにして実施する。
2000、2.5.1−2.5.36、ジョンワイリーアンドサンズ社)に記載されているようにして実施し;ステップ(ii)は、コーリー(Corey)およびベンケイテスバール(Venkateswarlu)の報告(J.Am.Chem.Soc.94:6190、1972年)のようにして実施し、ステップ(iii)は、フレーザー(Fra
ser)らの報告(Tetrahedron Lett.41:1523、2000年)のようにして実施する。
.5.1−2.5.36、ジョンワイリーアンドサンズ社)に記載されているようにして実施し;ステップ(ii)は、コーリー(Corey)およびベンケイテスバール(Venkateswarlu)の報告(J.Am.Chem.Soc.94:6190、1972年)のようにして実施し、ステップ(iii)は、フレーザー(Fraser)らの報告(Tetrahedron Lett.41:1523、2000年)のようにして実施する。
)のようにして実施し;ステップ(iv)(a)は、文献(Organic Lett.、2001年、第3巻、p.1809)に報告されているようにして実施し;ステップ(v)は、コーリー(Corey)およびベンケイテスバール(Venkateswarlu)の報告(J.Am.Chem.Soc.94:6190、1972年)のようにして実施し、ステップ(vi)は、フレーザーら(Fraser)らの報告(Tetrahedron Lett.41:1523、2000年)のようにして実施する。
)およびオースティン(Austin)の報告(J.Org.Chem.66:8643、2001年)のようにして得られる。ステップ(i)(b)および(iii)(c)は、文献(Chem.Rev.、1954年、第54巻、p.1)に報告されているようにして実施し;ステップ(ii)(a)は、文献の手順(J.Org.Chem.、1993年、第58巻、p.2334)に従って実施し;ステップ(ii)(b)、(iii)(b)および(iv)(b)は、文献(Bioorg.Med.Chem.Lett.、2003年、第13巻、p.1713)に報告されているようにして実施し;ステップ(iii)(d)は、デュボウィック(Dubowchik)およびラディア(Radia)の報告(Tetrahedron Lett.38:5257、1997年)のようにして実施し;ステップ(iv)(a)は、文献(Organic Lett.、2001年、第3巻、p.1809)に報告されているようにして実施し;ステップ(v)は、コーリー(Corey)およびベンケイテスバール(Venkateswarlu)の報告(J.Am.Chem.Soc.94:6190、1972年)のようにして実施し、ステップ(vi)は、フレーザーら(Fraser)らの報告(Tetrahedron Lett.41:1523、2000年)のようにして実施する。
キル部分(例えばペルフルオロアルキル)を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、任意選択でO、N、またはSが挿入されていてもよい。用語「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、2つ以上の水素原子がアリール基によって置換されている基を含む。「アラルキル」の例には、ベンジル基、9−フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基がある。
単環、二環、三環、または多環の5〜12個の炭素(好ましくは5〜8個の炭素)を有する炭化水素基を含み、任意の環原子が置換されていてよい。本明細書に記載のシクロアルケニル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子を共有する環(例えば、スピロ縮合環)である。シクロアルケニル部分の例には、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、またはノルボネニルがあるが、これらに限定はされない。
「保護された」部分とは、反応性を有する官能基(例えばヒドロキシル基もしくはアミノ基)、または1つ以上の官能基を有する分子種(例えば糖)であって、該官能基の反応性が、保護基の結合によって一時的に阻害されているものを指す。本明細書に記載のモノマーおよび方法に有用な保護基は、例えば、グリーン、T.W.(Greene,T.W.)著「Protective Groups in Organic Synthesis」(ジョンワイリーアンドサンズ:ニューヨーク)、1981年に見出すことができる。同文献は参照によって本願に組み込まれる。
2−メチルアデニニル、
N6−メチルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−メチルアデニニル、
N6−イソペンテニルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニニル、
N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
N6−グリシニルカルバモイルアデニニル、
N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
N6,N6−ジメチルアデニニル、
3−メチルシトシニル、
5−メチルシトシニル、
2−チオシトシニル、
5−ホルミルシトシニル、
N2,N2,7−トリメチルグアニニル、
1−メチルグアニニル、
7−シアノ−7−デアザグアニニル、
7−アミノメチル−7−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
5−メチルウラシリル、
1−メチルプソイドウラシリル、
2−チオウラシリル、
4−チオウラシリル、
2−チオチミニル
5−メチル−2−チオウラシリル、
3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシリル、
5−ヒドロキシウラシリル、
5−メトキシウラシリル、
ウラシリル5−オキシ酢酸、
ウラシリル5−オキシ酢酸メチルエステル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリルメチルエステル、
5−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシリル、
5−アミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチルウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−セレノウラシリル、
5−カルバモイルメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
3−メチルウラシリル、
1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウラシリル、
5−カルボキシメチルウラシリル、
5−メチルジヒドロウラシリル、または
3−メチルプソイドウラシリル。
オリゴヌクレオチド剤(例えば結合オリゴヌクレオチド剤)であって、限定するものではないが好適なリガンド結合モノマーサブユニットを含むものを、式(II)として以下に示す。担体(一部の実施形態では「リンカー」とも呼ばれる)は、環式部分でも非環式部分でもよく、2つの「バックボーン結合点」(例えばヒドロキシル基)および1つのリガンドを含んでいる。リガンドは、担体に直接取り付けられてもよいし(例えば、結合させる)、あるいは、係留部(例えば1以上の原子の非環式の鎖;または核酸塩基、例えば任意選択で1以上の化学修飾、例えば異常塩基を有する天然の核酸塩基;またはユニバーサル塩基)を介在させて担体に間接的に取り付けられて(例えば、結合されて)もよい。したがって担体は、それぞれリガンドおよび係留部/係留部付リガンドのための「リガンドまたは係留結合点」も含んでいる。
つの「R」基は上記に列挙された基の任意の組み合わせでよい)から選択することができる。X5’、X5”、およびX5”’はすべて同じであっても異なっていてもよく;X5’、X5”、およびX5”’のうちの2つが同一で3番目が異なっている組み合わせとして考えることもできる。ある実施形態では、X5’、X5”、およびX5”’は少なくとも1つのアルコキシ基またはシロキシ基を含んでいる。好ましい組み合わせとしては、X5’、X5”=トリメチルシロキシおよびX5”’=1,3‐(トリフェニルメトキシ)‐2‐プロポキシまたはシクロドデシルオキシが挙げられる。
る鎖)が該支持体の置かれた溶媒中で可溶化されうるようにすることができる。可溶化されたが固定化されているモノマーは、周囲の溶媒中の試薬と反応することが可能であり;未反応の試薬および可溶性の副産物を、モノマーまたはモノマー由来生成物が取り付けられている固体支持体から容易に洗い流すことができる。別例として、モノマーを可溶性の支持体部分、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)に取り付けることも可能であり、液相合成技術を用いて鎖を構築することができる。リンカーおよび支持媒体の選択は当分野の技術範囲内にある。一般に、リンカーは‐C(O)(CH2)qC(O)‐、または‐C(O)(CH2)qS‐(式中、qは0、1、2、3または4でよい)であってよく;好ましくは、オキサリル、スクシニルまたはチオグリコリルである。標準的な多孔質ガラスの固相合成支持体は、該ガラスがフッ化物によって分解し、完全長の生成物の量が著しく減少するので、フッ化物に不安定な5’シリル保護基と共に使用することはできない。フッ化物に安定なポリスチレン系支持体またはPEGが好ましい。
一部の実施形態では、担体分子は酸素を含んだヘテロ環である。好ましくは、担体は構造LCM−Iに示すようなリボース糖である。この実施形態では、リガンド結合モノマーはヌクレオシドである。
2−メチルアデニニル、
N6−メチルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−メチルアデニニル、
N6−イソペンテニルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニニル、
N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
N6−グリシニルカルバモイルアデニニル、
N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
N6,N6−ジメチルアデニニル、
3−メチルシトシニル、
5−メチルシトシニル、
2−チオシトシニル、
5−ホルミルシトシニル、
N2,N2,7−トリメチルグアニニル、
1−メチルグアニニル、
7−シアノ−7−デアザグアニニル、
7−アミノメチル−7−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
5−メチルウラシリル、
1−メチルプソイドウラシリル、
2−チオウラシリル、
4−チオウラシリル、
2−チオチミニル
5−メチル−2−チオウラシリル、
3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシリル、
5−ヒドロキシウラシリル、
5−メトキシウラシリル、
ウラシリル5−オキシ酢酸、
ウラシリル5−オキシ酢酸メチルエステル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリルメチルエステル、
5−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシリル、
5−アミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチルウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−セレノウラシリル、
5−カルバモイルメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
3−メチルウラシリル、
1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウラシリル、
5−カルボキシメチルウラシリル、
5−メチルジヒドロウラシリル、または
3−メチルプソイドウラシリル。
「オキシ」置換基の例には、アルコキシまたはアリールオキシ(OR、例えばR=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、糖、または保護基);ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;2’ヒドロキシルが例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の4’位の炭素に接続されている「ロックされた」核酸(LNA);O−保護AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)およびアミノアルコキシ、O(CH2)n保護AMINE(例えばAMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)、ならびにオルトエステルが挙げられる。アミン保護基には、ホルミル、アミド、ベンジル、アリルなどがある。
PGは、トリアリールメチル基(例えば、ジメトキシトリチル基)またはSi(X5’)(X5”)(X5”’)(式中、(X5’)、(X5”)および(X5”’)については別記のとおり)であってよい。
環式の糖置換系モノマー、例えば糖置換系のリガンド結合モノマーは、本明細書では糖置換モノマーサブユニット(SRMS)モノマー化合物とも呼ばれる。好ましい担体は以下に示す一般式(LCM−2)を有する。その構造では、好ましいバックボーン結合点は、R1またはR2;R3またはR4;あるいはYがCR9R10の場合はR9およびR10から選択することができる(2つのバックボーン結合点を生じるために2つの位置(例えばR1とR4、またはR4とR9)が選ばれる)。好ましい係留結合点には、R7;XがCH2である場合はR5またはR6が挙げられる。該担体については、鎖に組み込むことができる実体として以下に説明する。したがって、当然ながら、該構造はさらに、結合点(例えばR1またはR2;R3またはR4;あるいはR9またはR10(YがCR9R
10である場合))のうちの1つ(末端位置の場合)または2つ(内側位置の場合)が、リン酸バックボーンまたは修飾(例えば硫黄を含む)リン酸バックボーンに接続されている状態をも包含する。例えば、上記に命名されたR基のうちの1つが、‐CH2‐であって結合の1つが担体に、1つがバックボーンの原子(例えば連結している酸素または中央のリン原子)に接続されているものであってもよい。
XはN(CO)R7、NR7またはCH2であり;
YはNR8、O、S、CR9R10であり;
ZはCR11R12であるかまたは存在せず;
R1、R2、R3、R4、R9およびR10の各々は、独立に、H、ORaまたは(CH2)nORbであり、ただしR1、R2、R3、R4、R9およびR10のうち少なくとも2つはORaまたは(CH2)nORbのうち少なくともいずれかであり;
R5、R6、R11およびR12の各々は、独立に、リガンド、H、任意選択で1〜3個のR13で置換されたC1−C6アルキル、またはC(O)NHR7であるか;あるいはR5とR11とが一緒になって、任意選択でR14で置換されたC3−C8シクロアルキルをなし;
R7はリガンドであってもよいし(例えばRはRdであってよい)、あるいはR7は該担体に間接的に(例えば係留部分を介して)係留されたリガンド、例えばNRcRdで置換されたC1−C20アルキルまたはNHC(O)Rdで置換されたC1−C20アルキルであってよく;
R8はHまたはC1−C6アルキルであり;
R13はヒドロキシ、C1−C4アルコキシ、またはハロであり;
R14はNRCR7であり;
R15は、任意選択でシアノで置換されたC1−C6アルキル、またはC2−C6アルケニルであり;
R16はC1−C10アルキルであり;
R17は液相または固相の支持体試薬であり;
Lは‐C(O)(CH2)qC(O)‐、または‐C(O)(CH2)qS‐であり;
Raは保護基、例えばCAr3(例えばジメトキシトリチル基)またはSi(X5’)(X5”)(X5”’)(式中、(X5’)、(X5”)、および(X5”’)は他所で説明したとおり)であり;
Rbは、P(O)(O−)H、P(OR15)N(R16)2またはL−R17であり;
RcはHまたはC1−C6アルキルであり;
RdはHまたはリガンドであり;
Arはそれぞれ独立に、任意選択でC1−C4アルコキシで置換されたC6−C10アリールであり;
nは1−4であり;qは0−4である。
非環式の糖置換系モノマー、例えば糖置換系のリガンド結合モノマーは、本明細書では糖置換モノマーサブユニット(SRMS)モノマー化合物とも呼ばれる。好ましい非環式担体は以下に示す式LCM−3またはLCM−4を有する。
ある実施形態では、構成部分、例えば、リガンドは、介在する係留部を仲介として担体に間接的に接続される場合がある。係留部は担体の係留結合点(TAP)に接続され、任意のC1−C100炭素含有部分(例えばC1−C75、C1−C50、C1−C20、C1−C10;C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9またはC10)
であって好ましくは少なくとも1つの窒素原子を有するものを挙げることができる。好ましい実施形態では、窒素原子は、係留部上の末端のアミノ基もしくはアミド(NHC(O)−)基の一部を形成し、該基はリガンド用の接続点として役立つ場合がある。好ましい係留部(下線部)には、TAP−(CH 2 ) n NH−;TAP−C(O)(CH 2 ) n NH−:TAP−NR””(CH 2 ) n NH−、TAP−C(O)−(CH 2 ) n −C(O)−;TAP−C(O)(CH 2 ) n −C(O)O−;TAP−C(O)−O−;TAP−C(O)−(CH 2 ) n −NH−C(O)−;TAP−C(O)−(CH 2 ) n −;TAP−C(O)−NH−;TAP−C(O)−;TAP−(CH 2 ) n −C(O)−;TAP−(CH 2 ) n −C(O)O−;TAP−(CH 2 ) n −;またはTAP−(CH 2 ) n −NH−C(O)−(式中、nは1〜20(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20)であり、R””はC1−C6アルキルである)がある。好ましくは、nは5、6、または11である。他の実施形態では、窒素は、末端のオキシアミノ基(例えば−ONH2)、またはヒドラジノ基(−NHNH2)の一部を形成しうる。係留部は、任意選択で例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで置換されているか、または1以上の追加のヘテロ原子(例えばN、O、またはS)が任意選択で挿入されているかのうち少なくともいずれかであってよい。好ましい係留リガンドには、例えばTAP−(CH 2 ) n NH(リガンド);TAP−C(O)(CH 2 ) n NH(リガンド);TAP−NR””(CH 2 ) n NH(リガンド);TAP−(CH 2 ) n ONH(リガンド);TAP−C(O)(CH 2 ) n ONH(リガンド);TAP−NR””(CH 2 ) n ONH(リガンド);TAP−(CH 2 ) n NHNH 2 (リガンド)、TAP−C(O)(CH 2 ) n NHNH 2 (リガンド);TAP−NR””(CH 2 ) n NHNH 2 (リガンド);TAP−C(O)(CH 2 ) n −C(O)(リガンド);TAP−C(O)−(CH 2 ) n C(O)O(リガンド);TAP−C(O)−O(リガンド);TAP−C(O)−(CH 2 ) n −NH−C(O)(リガンド);TAP−C(O)−(CH 2 ) n (リガンド);TAP−C(O)−NH(リガンド);TAP−C(O)(リガンド);TAP−(CH 2 ) n −C(O)(リガンド);TAP−(CH 2 ) n −C(O)O(リガンド);TAP−(CH 2 ) n (リガンド);またはTAP−(CH 2 ) n −NH−C(O)(リガンド)がある。いくつかの実施形態では、アミノ末端を有する係留部(例えばNH2、ONH2、NH2NH2)は、リガンドとともにイミノ結合(すなわちC=N)を形成することができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端を有する係留部(例えばNH2、ONH2、NH2NH2)は、例えば、C(O)CF3でアシル化されていてもよい。
)(CH 2 ) n C(O)ONHS;またはTAP−NR””(CH 2 ) n C(O)ONHS(式中、nは1−6であり、R””はC1−C6アルキルである);TAP−(CH 2 ) n C(O)OC 6 F 5 ;TAP−C(O)(CH 2 ) n C(O)OC 6 F 5 ;またはTAP−NR””(CH 2 ) n C(O)OC 6 F 5 (式中、nは1−11であり、R””はC1−C6アルキルである);あるいは、−(CH 2 ) n CH 2 LG;TAP−C(O)(CH 2 ) n CH 2 LG;またはTAP−NR””(CH 2 ) n CH 2 LG(式中、nは別途記載のとおりであり、R””はC1−C6アルキルである)(LGは脱離基、例えばハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートでよい)がある。係留は、リガンドの求核基(例えばチオール基またはアミノ基)を係留部の求電子基とカップリングすることにより行うことができる。
RNA、例えばiRNA剤は、本明細書中に記載するように、かつ2004年3月8日付けで出願された国際特許出願第PCT/US04/07070号(参照により本願に援用される)に記載されるように、非対称的に修飾することができる。
して指定しても、該修飾が他の特性を有していないことを意味するわけではない(例えば、安定化を促進する修飾として言及される修飾が、標的設定を増強することもありうる)。
トを前記のように修飾することもできる。両方の鎖における複数の非対称的修飾の特に好ましい実施形態は、長さが約20〜21サブユニット、好ましくは19サブユニットの二本鎖領域、及び長さが約2サブユニットの1個又は2個の3’突出部を有する。
害する可能性のある標的設定修飾は、センス鎖の非対称的修飾として提供され得る。体内分布を変化させる構成部分(例えばコレステロール)は、センス鎖における1以上(例えば、2つ)の非対称的修飾として提供され得る。比較的大きな分子量(例えば400、500又は1,000ダルトンを上回る分子量)を有する構成部分を導入する標的設定修飾、あるいは電荷を有する構成部分(例えば、2以上の正電荷又は1つの負電荷を有する構成部分)を導入する標的設定修飾は、センス鎖上に配置することができる。
(a)バックボーン修飾(例えば、バックボーンのPの修飾)であって、PをSで置き換えること、またはアルキルもしくはアリル(例えば、Me)で置換されたP、及びジチオエート(S−P=S)を含むもの;これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するのに使用することができる;
(b)2’−Oアルキル(例えば、2’−OMe)、3’−Oアルキル(例えば、3’−OMe)(末端及び内側位置の少なくともいずれかを修飾);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使用することができ、3’位修飾は、RISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することができる;
(c)2’−5’結合(2’−H、2’−OH及び2’−OMeによるもの、及びP=O又はP=Sによるもの);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはRISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することもできる;
(d)L糖(例えば、2’−H、2’−OH及び2’−OMeを有するL−リボース、L−アラビノース);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはRISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することもできる;
(e)修飾糖(例えば、ロックされた核酸(LNA)、ヘキソース核酸(HNA)及びシクロヘキセン核酸(CeNA));これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはRISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することもできる;
(f)核酸塩基修飾(例えば、C−5修飾ピリミジン、N−2修飾プリン、N−7修飾プリン、N−6修飾プリン);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使用することができる;
(g)カチオン基及び双性イオン基(末端にあることが好ましい);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために使用することができる;
(h)結合体基(末端位置にあることが好ましい)、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質;これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又は分子を標的設定するために使用することもできるし、あるいはRISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することもできる。
(a)バックボーン修飾(例えば、バックボーンのPの修飾)であって、PをSで置き換えること、又はアルキルもしくはアリル(例えば、Me)で置換されたP、及びジチオエート(S−P=S)を含むもの;
(b)2’−Oアルキル(例えば、2’−OMe)(末端位置を修飾);
(c)2’−5’結合(2’−H、2’−OH及び2’−OMeによるもの)、例えば3’末端での末端修飾;例えばP=O又はP=Sによる好ましくは3’末端の修飾;これらの修飾は、キナーゼ活性のようなRISC酵素活性を妨害し得るため、5’末端領域からは排除されることが好ましい;
(d)L糖(例えば、2’−H、2’−OH及び2’−OMeを有するL−リボース、L−アラビノース);例えば、3’末端での末端修飾;例えばP=O又はP=Sによる好ましくは3’末端の修飾;これらの修飾は、キナーゼ活性を妨害し得るため、5’末端領域から排除されることが好ましい;
(e)修飾糖(例えば、LNA、HNA及びCeNA);これらの修飾は、センス鎖とアンチセンス鎖との間の対合の望ましくない増強に寄与し得るが、多くの場合は5’領域において「緩い」構造を有することが好ましいので、さらに該修飾はキナーゼ活性を妨害し得るので、5’末端領域からは排除されることが好ましい;
(f)核酸塩基修飾(例えば、C−5修飾ピリミジン、N−2修飾プリン、N−7修飾プリン、N−6修飾プリン);
(g)カチオン基及び双性イオン基(末端にあることが好ましい);
核酸塩基修飾としての、糖の2’位、糖の3’位にあるカチオン基及び双性イオン基(例えば、C−5修飾ピリミジン、N−2修飾プリン、N−7修飾プリン、N−6修飾プリン);
結合体基(末端位置にあることが好ましい)、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質であるが、但し、嵩高い基又は概してRISC活性を阻害する基はあまり好ましくないはずである。
’突出部に包含されるべきである。
一態様では、本発明は、末端における二本鎖の安定性についての差別的修飾(DMTDS)を有することができるiRNA剤を特徴とする。
サブユニット対は、解離又は融解を促進する傾向に基づいて順位付けすることができる(例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単なアプローチは、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる)。解離を促進するという観点では、
A:Uは、G:Cよりも好ましく、
G:Uは、G:Cよりも好ましく、
I:Cは、G:Cよりも好ましく(I=イノシン);
ミスマッチ、例えば非標準的な対合すなわち標準的対合以外の対合(本明細書中の他の箇所に記載するようなもの)は、標準的な対合(A:T、A:U、G:C)よりも好ましく;
ユニバーサル塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
S 5’ R1N1N2N3N4N5[N]N−5N−4N−3N−2N−1R2 3’
AS 3’ R3N1N2N3N4N5[N]N−5N−4N−3N−2N−1R4 5’
S:AS P1P2P3P4P5[N]P−5P−4P−3P−2P−1 5’
Sはセンス鎖を示し、ASはアンチセンス鎖を示し、R1は任意選択の(かつ好ましくない)5’センス鎖突出部を示し、R2は任意選択の(しかし、好ましい)3’センス鎖突出部を示し、R3は任意選択の(しかし、好ましい)3’アンチセンス鎖突出部を示し、R4は任意選択の(かつ好ましくない)5’アンチセンス鎖突出部を示し、Nはサブユニットを示し、[N]は、さらなるサブユニット対が存在し得ることを示し、Pxは、センス鎖のNxとアンチセンス鎖のNxとの対を示す。Pの図では突出部は示していない。一部の実施形態では、本明細書中の他の箇所に記載するように、3’AS突出部は領域Zに相当し、二重鎖領域は領域Xに相当し、3’S鎖突出部は領域Yに相当する。(図は、最大又は最小の長さを暗に示すことを意味するものではない。長さに関する案内は、本明細書中の他の箇所に提供されている)。
数可)(例えば、上記に同定された位置のいずれか)の修飾(複数可)との併用でもよい。上述の領域のうち1つの少なくとも1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群、すなわち
A:U
G:U
I:C
ミスマッチな対、例えば非標準的すなわち標準的なもの以外の対合、あるいはユニバーサル塩基を含む対合
から選ばれることが好ましい。
好ましい実施形態では、P−1〜P−4における少なくとも2個又は3個の対は、A:Uである。
好ましい実施形態では、P−1〜P−4における少なくとも2個又は3個の対は、I:Cである。
好ましい実施形態では、P−1〜P−4における少なくとも2個又は3個の対は、ユニバーサル塩基を含む対である。
サブユニット対は、安定性を促進し、かつ解離又は融解を阻害する傾向に基づいて順位付けすることができる(例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる)。二重鎖の安定性を促進するという観点では、
G:Cは、A:Uよりも好ましく、
ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)は、非標準的な対合すなわち標準的なもの以外の対合よりも好ましく、
安定性を増大させるアナログは、ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)よりも好ましく、
2−アミノ−A:Uは、A:Uよりも好ましく、
2−チオUまたは5Me−チオ−U:Aは、U:Aよりも好ましく、
G−クランプ(4個の水素結合を有するCのアナログ):Gは、C:Gよりも好ましく、
グアナジニウム−G−クランプ:Gは、C:Gよりも好ましく、
プソイドウリジン:Aは、U:Aよりも好ましく、
結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、2’F、ENAまたはLNA)は、非修飾部分よりも好ましく、二重鎖の安定性を増強するために一方又は両方の鎖上に存在することができる。二重鎖を形成する傾向を増大させる対合が、二重鎖のAS鎖の3’末端の1以上の位置に使用されることが好ましい。末端の対(AS鎖から見て最も3’側の対)をP1とし、これに続く二重鎖内の対合の位置(AS鎖から見て5’方向に向かっ
ていく)は、P2、P3、P4、P5等とする。二重鎖形成を調節するための修飾を施すための好ましい領域は、P5〜P1、より好ましくはP4〜P1、さらに好ましくはP3〜P1である。P1での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置(複数可)(例えば、上記に同定された位置のいずれか)の修飾(複数可)と併用されてもよい。上述の領域に存在する少なくとも1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群、すなわち
G:C
ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)よりも安定性を増大させるアナログを有する対
2−アミノ−A:U
2−チオUまたは5Me−チオ−U:A
G−クランプ(4個の水素結合を有するCのアナログ):G
グアナジニウム−G−クランプ:G
プソイドウリジン:A
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、2’F、ENA又はLNA)を有する対
から選ばれることが好ましい。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、G:Cである。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、2−アミノ−A:Uである。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、G−クランプ:Gである。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、プソイドウリジン:Aである。
Acids、第22巻:1259〜1262ページ、2003年;ホルムズ(Holmes)ら「Steric inhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent
trans-activation in vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G-clamp ribonucleoside analogues」、Nucleic Acids Resear
ch、第31巻:2759〜2768ページ、2003年;ワイルズ(Wilds)ら「Structural basis for recognition of guanosine by a synthetic tricyclic cytosine analogue:Guanidinium G-clamp」、Helvetica Chimica Acta、第86巻:966〜978ページ、2003年;ラジェエエフ(Rajeev)ら「High-Affinity Peptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricyclic Cytosine Analogues」、Organic Letters、第4巻:4395〜4398ページ、2002年;アウシン(Ausin)ら「Synthesis of Amino- and Guanidino-G-Clamp PNA Monomers」、Organic Letters、第4巻:4073〜4075ページ、2002年;マイヤー(Maier)ら「Nuclease resistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosine analogues phenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and origins of their nuclease resistance properties」、Biochem
istry、第41巻:1323〜7ページ、2002年;フラナガン(Flanagan)ら「A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides」、Proceedings Of The National Academy
Of Sciences Of The United States Of America、第96巻:3513〜8ページ、1999年。
上述のように、iRNA剤は、二重鎖のAS 5’末端の安定性を減少させ、かつ二重鎖のAS 3’末端の安定性を増大させるように修飾することができる。このことは、二重鎖のAS 5’末端における1以上の安定性を減少させる修飾を、二重鎖のAS 3’末端における1以上の安定性を増加させる修飾と組み合わせることにより達成することができる。したがって、好ましい実施形態は、P−5〜P−1、より好ましくはP−4〜P−1、さらに好ましくはP−3〜P−1における修飾を包含する。P−1での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置(例えば、上記に同定された位置)との併用でもよい。二重鎖領域のAS 5’末端の上述の領域の1つに存在する少なくとも1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群から選ばれることが好ましく、その群とは、
A:U
G:U
I:C
ミスマッチな対、例えば非標準的な対合、すなわち標準的なもの以外のユニバーサル塩基を含む対合、ならびに
P5〜P1、より好ましくはP4〜P1、さらに好ましくはP3〜P1での修飾である。P1での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置(例えば、上記に同定された位置)との併用でもよい。二重鎖領域のAS 3’末端の上述の領域の1つに存在する少なくとも1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群から選ばれることが好ましく、その群とは、
G:C
ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)よりも安定性を増大させるアナログを有する対
2−アミノ−A:U
2−チオUまたは5Me−チオ−U:A
G−クランプ(4個の水素結合を有するCのアナログ):G
グアナジニウム−G−クランプ:G
プソイドウリジン:A
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、2’F、ENA又はLNA)を有する対
である。
その他の実施形態
RNA、例えばiRNA剤は、例えば細胞内へ送達される外来のDNA鋳型から、in
vivoで細胞において産生され得る。例えば、該DNA鋳型をベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与(米国特許第5,328,470号)により、あるいは定位注射(例えば、チェン(Chen)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第91巻:3054〜3057ページ、1994年を参照)により対象へ送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含めることもできるし、あるいは該遺伝子送達ビヒクルを包埋する徐放性マトリックスを含むこともできる。例えば、DNA鋳型は、2つの転写ユニット(1つはiRNA剤の上鎖を包含する転写物を産生するもの、1つはiRNA剤の下鎖を包含する転写物を産生するもの)を包含することができる。鋳型が転写されると、iRNA剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するsRNA剤断片となる。
本明細書中に記載のiRNA剤は、該iRNA剤と、ヒトの配列およびヒト以外の動物の配列の両方との相補性によって、治療上の毒性の測定がより容易になされるように設計することができる。これらの方法では、RNA剤は、ヒト由来の核酸配列および少なくとも1種類のヒト以外の動物(例えばヒト以外の哺乳類、例えば、げっ歯類、反すう類又は霊長類)由来の核酸配列に完全に相補的である配列から構成され得る。例えば、ヒト以外の哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパンジー、アカゲザル又はカニクイザルであり得る。iRNA剤の配列は、ヒト以外の哺乳類及びヒトの相同遺伝子、例えば発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の中の配列に相補的であるということもありうる。ヒト以外の哺乳類におけるiRNA剤の毒性を測定することにより、ヒトにおけるiRNA剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、iRNA剤を、ヒト及び2以上(例えば2種類又は3種類又はそれ以上)のヒト以外の動物に対して相補的とすることができる。
本明細書中に記載のiRNA剤は、本明細書中に記載のものなどの両親媒性送達結合体またはモジュールとともに使用することができる。
200個、500個、1,000個、2,000個、50,000個またはそれ以上のサブユニット(例えば、アミノ酸又は環状サブユニット)を有する。1つの両親媒性ポリマーを、1つ又はそれ以上、例えば2個、3個、5個、10個又はそれ以上のiRNA剤(例えば、本明細書中に記載のiRNA又はsRNA剤)に連結させることもできる。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、アミノ酸および環状サブユニット(例えば、芳香族サブユニット)の両方を含有することができる。
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。該ポリマーは、2以上の両親媒性サブユニットを含みうる。1以上の親水性基及び1以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次構造ならびに第1の面および第2の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が疎水面であるような分布であり得る。
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、1つ以上の環状部分(例えば、1以上の親水性基または1以上の疎水性基のうち少なくともいずれかを有する環状部分)を含有する1つ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部分が交互に疎水性基及び親水性基を有するような環状部分のポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド(例えば、コール酸)を含有してもよい。別の例では、サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すことができるもの、例えば2,2’−ビス(置換)−1,1’−ビナフチルまたは2,2’−ビス(置換)ビフェニルであり得る。サブユニットは、式(M):
R4は、水素であるか、またはR3と一体となって融合フェニル環を形成する。
R5は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはハロで置換されているか、任意選択でO、S、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるC1〜C100アルキル、あるいはC1〜C100ペルフルオロアルキルであり、R6は、任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニルもしくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニルもしくはアルキルスルホニル、
サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換もしくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニルまたはアルコキシカルボニルで置換されているか、任意選択でO、NH、S、S(O)、SO2、アルケニルまたはアルキニルが挿入されているかのうち少なくともいずれかであるC1〜C100アルキルである。
iRNA剤のセンス配列およびアンチセンス配列はパリンドロームであってもよい。パリンドロームiRNA剤の典型的な特徴は、2004年3月8日出願の共願のPCT出願第PCT/US2004/07070号に記載されている。
本発明の方法は、iRNA剤、ならびにiRNA剤の細胞内への取り込みに影響を及ぼす薬物の投与を包含し得る。該薬物は、iRNA剤が投与される前に、iRNA剤が投与された後に、あるいはiRNA剤が投与されるのと同時に投与され得る。薬物は共有結合によりiRNA剤に連結されてもよい。薬物は、細胞に対する一過性の作用を有していてもよい。
神経系細胞内への取り込みを強化するために親油性物質に結合されたiRNA剤を、第2の作用物質にカップリング(例えば、共有結合)させることができる。例えば、特定の神経障害を治療するのに使用されるiRNA剤は、第2の治療薬、例えばiRNA剤以外の作用物質にカップリングさせることができる。第2の治療薬は、同じ神経障害の治療を目的とするものであってよい。例えば、HDを治療するのに使用されるiRNAの場合では、iRNA剤を、HDの治療に有用であることが知られている第2の作用物質にカップリングさせることができる。
iRNAは、例えば大量に、各種方法により生産することができる。例示的な方法としては、有機合成及びRNA切断(例えば、in vitroでの切断)が挙げられる。
iRNAは、二本鎖RNA分子の各々の鎖を別個に合成することにより作製することができる。次に、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
Biotec AB)(スウェーデン国ウプサラ所在)のOligoPilot(商標)II)を用いて、所定のiRNA用の特定のRNA鎖を大量に生産することができる。OligoPilotIIリアクタは、わずか1.5モル濃度過剰のホスホロアミダイトヌクレオチドを使用して、効率的にヌクレオチドをカップリングすることができる。RNA鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的なモノマー添加サイクルを使用して、iRNA用の21〜23ヌクレオチドの鎖を合成することができる。通常、2つの相補的な鎖を別個に生産し、次いで、例えば固体支持体から放出させて脱保護した後にアニーリングさせる。
iRNAはまた、より大きなds iRNAを切断することにより作製することもできる。切断は、in vitroでもin vivoでも実現され得る。例えば、in vitroでの切断によりiRNAを生産するために、以下の方法を使用することができる。
イングランド バイオラブス(New England Biolabs))は、ベクターと、該ベクター内でいずれかの側にT7プロモータが隣接する位置にクローニングされた核酸セグメントに関してdsRNAを生産する方法とを提供する。dsRNA用の2つの相補鎖のT7転写用に、別個の鋳型が生成される。該鋳型は、T7RNAポリメラーゼの添加によりin vitroで転写され、dsRNAが生産される。PCR及び/又は他のRNAポリメラーゼ(例えば、T3ポリメラーゼ又はSP6ポリメラーゼ)を用いる同様の方法を使用することもできる。一実施形態では、この方法により生成されるRNAは、組換え酵素の調製物に混入している可能性のあるエンドトキシンを除去するように慎重に精製される。
1年8月10日;第293巻(5532):1146〜50ページを参照されたい。
製剤化
本明細書中に記載のiRNA剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
又はDNA以外の作用物質)を包含する。例えば、神経疾患、例えば神経変性疾患(例えば、PD)の治療用のiRNA組成物が、既知のPD治療剤(例えば、レバドパ(levadopa)またはデプロニル(depronil))を含むことが考えられよう。
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾iRNA剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のiRNA剤、例えば修飾iRNA剤を用いて実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
一実施形態では、標的設定部分はリポソームに取り付けられる。例えば、米国特許第6,245,427号明細書は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームを標的設定する方法について記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分が、標的設定部分で誘導体化される。例えば、国際公開公報第96/37194号パンフレットは、N−グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをN−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルに変換することについて記載している。該生成物は続いてRGDペプチドにカップリングされた。
神経系細胞で発現する遺伝子を標的とするiRNA剤を含む組成物は、種々の経路によって対象に送達可能である。例示的な経路には、クモ膜下腔内、(例えば、脳内の)実質、鼻、および眼への送達が含まれる。組成物は、例えば静脈内、皮下または筋肉内注射により全身へ送達することも可能であり、これはiRNA剤を末梢ニューロンに送達するのに特に有用である。好ましい送達経路は、脳への直接送達、例えば脳室内または視床下部内、あるいは脳の側部領域または後部領域である。神経系細胞への送達用のiRNA剤は、投与に適した医薬組成物中に組み込まれ得る。例えば、組成物は、1種以上のiRNA剤および薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、薬学的投与に適合しうる任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に許容可能な担体には、本発明のiRNA剤に結合される親油性部分に追加されるトランスフェクション試薬または神経系細胞への取り込みを容易にする試薬は含まれない。薬学的に活性な物質のためにこのような媒体および薬剤を使用することは、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤は、活性化合物とは相容れない場合を除き、本発明の組成物中における使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込み可能である。
経皮投与など)でもよいし、経口でも非経口でもよい。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射、またはクモ膜下腔内もしくは脳(心)室内(例えば、脳室内)への投与がある。
きるようにさらに修飾可能である。例えば、iRNA剤は、該薬剤が血液脳関門を通過できるようにする分子に結合されてもよい。このような修飾iRNA剤は、任意の所望の方法によって、例えば、脳室内もしくは筋肉内注射によって、または肺送達によって投与可能である。
)へのiRNA剤の直接的施用を指すことが可能である。局所投与のための製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、スプレー、およびリキッド剤が含まれうる。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが必要であるか、または望ましい場合がある。局所投与は、対象の表皮もしくは真皮、または表皮もしくは真皮の特定の層、または下層組織にiRNA剤を選択的に送達するための手段としても使用可能である。
用語「生理学的有効量」は、所望の緩和効果または治癒効果を与えるために対象に送達される量である。
担体として有用である医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン(HSA)などの安定剤、糖質、アミノ酸、およびポリペプチドなどの充填剤;pH調整剤または緩衝剤;塩化ナトリウムなどの塩;その他が含まれる。これらの担体は、結晶型でもアモルファス型でもよく、またはこの2つの混合物であってもよい。
1つの実施形態において、単位用量は、1日に1回未満の頻度で、例えば、2日毎、4
日毎、8日毎、または30日毎に1回未満の頻度で投与される。別の実施形態において、単位用量は、一定の頻度で投与されない(例えば、定期的な投与頻度ではない)。例えば、単位用量が単回投与されてもよい。
ならびに存在する他の疾患など(これらに限定されない)の特定の要因は、対象を有効に治療するために必要な投薬量に影響を与える可能性がある。さらに、治療有効量のiRNA剤、例えば、二本鎖iRNA剤、またはsRNA剤(例えば、前駆体、例えば、プロセシングされてsRNA剤となりうる大きなiRNA剤、またはiRNA剤(例えば、二本鎖iRNA剤、またはsRNA剤、またはそれらの前駆体)をコードするDNA)を用いる対象の治療は、単回の治療を含んでもよいし、好ましくは、一連の治療を含んでもよい。当然のことながら、治療のために使用されるiRNA剤(例えば、sRNA剤)の有効投薬量が特定の治療の過程にわたって増加または減少されてもよい。投薬量の変化は、本明細書に記載されるような診断アッセイの結果に起因することもあり、かつ該結果から明らかとなることもある。例えば、iRNA剤組成物の投与後に対象をモニタ可能である。モニタリングからの情報に基づいて、追加量のiRNA剤組成物を投与することができる。
線条体の一次ニューロンを、妊娠15.5日のマウス胎児組織から単離した。この単離細胞を、NeuroBasal(TM)培地(Gibco)で7日間培養した。GFPを標的とする、コレステロールおよびCy3と結合されたsiRNA(Chol−siRNA−Cy3と呼ぶ)のPBS溶液を、マウスから単離された線条体の一次ニューロン培養物に導入した(終濃度=50nM)。細胞をChol−siRNA−Cy3とともに6〜12時間培養し、次に培地を交換して細胞内に取り込まれなかったあらゆるChol−s
iRNA−Cy3を洗い流した。トランスフェクション試薬は使用しなかった。ほぼすべての一次ニューロンが、ニューロンの細胞質にChol−siRNA−Cy3を含んでいることが観察された。siRNA−Cy3(コレステロールの結合なし)は、一次ニューロンが同じ条件下で培養された時、コレステロールが結合したsiRNAよりも非常に少ない程度までしか一次ニューロンに取り込まれないことが見出された。
GFPを標的とするChol−siRNA−Cy3を、単回の直接注射により、ならびにAlzet(R)ポンプ(米国カリフォルニア州クパチーノ所在のデュレクト株式会社(DURECT Corporation))によって7日間にわたり、マウス線条体中に投与した。直接注射にはPBS中50μM溶液1μlを含め、Alzetポンプは1日当たり1μl中50μMを送達するものとした。Chol−siRNAを、高用量の非結合型siRNA−Cy3と、同じ投薬量で比較した。蛍光顕微鏡法によって、いずれのsiRNAセットも多くの脳細胞に入ることが見出された。観察の結果、Chol−siRNA−Cy3は、Alzetポンプによる投与において非結合型siRNAよりも細胞に入る頻度が高かった。Chol−siRNA−Cy3の直接注射では1週間後にCy3 siRNAの存在が示されたが、非結合型siRNAの直接注射では1週間後にCy3標識はほとんど示されなかった。
GFPを標的とするChol−siRNAがGFPの発現をノックダウンできるかどうかを試験し、さらにこのRNAi活性の期間も調べた。GFPに対するChol−siRNA(終濃度50nM)を、100‐Qの増幅を有するヒトmut−httに融合させたGFPで安定的にトランスフェクションされたPC12細胞に加えた(チン(Qin)ら、Hum Mol Genet.、12:3231−44、2003年、電子版2003年10月21日)。プロナステロン(pronasterone)で処理すると、プロモ
ータによるGFP−httタンパク質の発現は増大するが、安定的にトランスフェクションされた細胞におけるGFPの蛍光は著しく縮小する。対照のプロナステロン処理されたPC12培養物を、ルシフェラーゼを標的とするChol−siRNAのPBS溶液(終濃度=100nM)で処理し;試験用のプロナステロン処理されたPC12細胞培養物を、GFPを標的とするChol−siRNA(終末濃度100nM)で処理した。トランスフェクション試薬は使用しなかった。Chol−siRNAを培地中に6〜12時間維持した後、培地を交換し、したがって細胞内に取り込まれなかったChol−siRNAを洗い流した。細胞の蛍光に対する影響を評価するために、1週間後に撮像した。GFPの蛍光は、ルシフェラーゼを標的とするChol−siRNAで処理された細胞中よりも、GFPを標的とするChol−siRNAで処理された細胞においてはるかに大きく減少した。
Chol−siRNAが脳細胞に入って標的遺伝子の発現をノックダウンすることができるという証拠(上記参照)から、100‐Qの増幅を有するヒトmut−httに対してChol−siRNAをin vivoで試験した。ハンチントン病のマウスモデルでは、レンチウイルス−mut−htt(1μl、1×1010個の粒子)を導入すると、5日後にクラスピングが生じる。本発明者らは4匹のマウスの皮質および線条体にレンチウイルス−mut−httを注射した。マウスのうち2匹については、htt mRNAに対するChol−siRNAを同時に注射した。1匹のマウスについては、ルシフェラーゼを標的とするChol−siRNAを同時に注射し、別のマウスについてはビヒクルを同時に注射した。httに対するChol−siRNAを注射された2匹のマウスは、7日目においてクラスピングを示さなかった。対照のマウスは予想通りにクラスピングを起こした。結果を表8に示す。
マウスは、片側の線条体にレンチウイルス−mut−httを投与した後7か月の間クラスピングを示し続ける。他の点では、マウスは予想通りの成長と動きを示した。更に、レンチウイルス−WT−htt(CAGリピートは18個)で処理したマウスは、注射後3週までとした実験計画書の期間ではクラスピングの証拠を示していない。図1A‐1D
の像は、レンチウイルス−mut−httを注射した7か月後のマウスの線条体から得たものである。免疫組織化学分析のために、組織をハンチンチンのN末端に対する抗血清(Ab1)で処理した。顕著な表現型としては、成人発病のヒトHDで見い出だされるのに似た核封入体(矢じり表示)および異栄養神経突起(矢印表示)がある(ディフィリア(DiFiglia)ら、Science、277:1990−3、1997年を参照)。レンチウイルスモデルの使用は、siRNAの同時注射とともに使用するのに便利である。同時注射により、トランスジェニックマウスのモデルにおけるsiRNAの送達を複雑にする可能性のある時間的および空間的不具合を低減することが可能である。
ハンチンチンを標的とするsiRNAの作用を、ハンチントン病のAAVマウスモデルで評価した。このハンチントン病マウスモデルでは、100個のCAGリピートからなるポリグルタミン増幅を有する変異型ヒトハンチンチン遺伝子の一部を、ウイルス(AAV)送達によって脳内に導入する。0.5ナノモル(7.5ug)のsiRNAの線条体内への単回注射を施した場合、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合siRNAであるAL−DP−1799(E1−4)は、ルシフェラーゼを標的とする非生理的なsiRNAであるAL−DP−1956と比較して、線条体(図2,3)および皮質(図3A)における封入体の大きさを縮小し、線条体におけるニューロピル凝集体を縮小した(図3B)。さらに、線条体中のハンチンチン免疫反応性の細胞の数は著しく増加し、これは線条体へのAL−DP−1799の単回注射後における線条体ニューロンの存続の増大と一致していた(図3)。
A)、ヤング C(Young C)、マーティン E(Martin E)、ボンサッテル J−P(Vonsattel J−P)、キャラウェイ R(Carraway
R)、リーブス SA(Reeves SA)、ボイス FM(Boyce FM)、キャラウェイ R(Carraway R)およびアロニン N(Aronin N)、「Huntingtin is a cytoplasmic protein associated with vesicles in human and rat brain neurons.」、Neuron 14:1075−1081、1995年;アロニン N(Aronin N)、チェイス K(Chase K)、ヤング C(Young C)、サップ E(Sapp E)、シュワルツ C(Schwarz C)、マッタ N(Matta N)、コルンライヒ R(Kornreich R)、シース A(Sheth A)、ランドベールマイヤー B(Landwehrmeyer B)、バード E(Bird E)、ボンサッテル J−P(Vonsattel J−P)、スミ
ス T(Smith T)、キャラウェイ R(Carraway R)、ボイス FM(Boyce FM)、ビール MF(Beal MF)、ヤング AB(Young AB)、ペニー JB(Penney JB)およびディフィリア M(DiFiglia M)、「CAG expansion affects the expression of mutant huntingtin in the Huntington' s disease brain.」、Neuron 15:1193−1201、1995年
)。免疫吸着させた抗血清Ab1は、1μg/mlの濃度で使用した。二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体(米国カリフォルニア州所在のベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories))とし、1:10,000で使用した。DABの組織学的処理については、キットを使用した(米国イリノイ州所在のピアスラボラトリ(Pierce Laboratory)。
を注射されたマウスと比較してニューロピル凝集体の数のおよそ3分の2が低減されていた(p<0.02)。ニューロピル凝集体の総数を、マウス1匹当たり6つの切片を使用して2500um2の面積について計測した。これらのデータは、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合siRNAの線条体への単回注射の結果、神経病理が減少し、かつ該注射がハンチントン病の有効治療の提供への新たなアプローチを表わすという、さらなる証拠を提供するものである。
ハンチンチンを標的とするsiRNAの作用を、ハンチントン病のAAVマウスモデルにおいて、クラスピング行動(ハンチントン病の動物モデルに特徴的な常同かつ異常行動)の評価によってさらに検討した。後で病理学的に評価される同じマウスにおいて、クラスピングを14日間にわたり毎日のyes/noの二択の評価としてスコア化し、次いでクラスピングが観察された日の割合(%)をマウスごとに測定した。クラスピングした日の割合(%)の平均は、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合siRNA(AL−DP−1799)で処理されたマウス(「Htt」、図5)では、ルシフェラーゼを標的とする非生理学的なsiRNA(AL−DP−1956)で処理されたマウス(「Luc」、図5)と比較して、およそ半分(p<0.01)が低減された。これらのデータは、ハンチンチンを標的とするコレステロール結合siRNAの線条体への単回注射の結果、機能が改善し、したがって該注射はハンチントン病の有効治療の提供への新たなアプローチを表わしていることを実証するものである。
本発明のいくつかの実施形態に関して説明してきた。しかしながら、本発明の思想および範囲を逸脱することなく種々の変更を施すことが可能であることは理解されよう。従っ
て、その他の実施形態は添付の特許請求の範囲内にある。
Claims (29)
- 投与部位よりも遠位の神経系細胞における標的遺伝子の発現を下方制御する方法であって、該方法は、
iRNA剤と神経系細胞とを、該iRNA剤の該細胞内への取り込みと該iRNA剤の軸索輸送とが可能な十分な時間接触させることを含み、
(i)iRNA剤はRNA二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、(ii)iRNA剤は親油性部分を含み、かつ(iii)iRNA剤のアンチセンス鎖の配列は、標的遺伝子から発現されるRNAのうち約18〜25ヌクレオチドの標的配列に対し十分相補的なヌクレオチド配列を含むを特徴とする方法。 - 親油性部分はコレステロールである、請求項1に記載の方法。
- 親油性部分はセンス鎖に結合される、請求項1に記載の方法。
- 親油性部分はセンス鎖の3’末端に結合される、請求項1に記載の方法。
- アンチセンス配列は表2に列挙されたアンチセンス配列との違いが4ヌクレオチド以下である、請求項1に記載の方法。
- アンチセンス鎖は表2に列挙されたアンチセンス鎖から選択される、請求項1に記載の方法。
- iRNA剤はホスホロチオエートまたは2’‐OMe修飾をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- iRNA剤はトランスフェクション試薬を含まない溶液中に提供される、請求項1に記載の方法。
- ヒトを治療する方法であって、該方法は、
神経障害を有するかまたは神経障害を発症するリスクを有するヒトを特定すること、および
前記ヒトに、投与部位よりも遠位の神経系細胞において発現される遺伝子を標的とするiRNA剤を投与すること、を含み、
該遺伝子の発現が神経障害の症状と関連し、ならびに(i)iRNA剤はRNA二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、(ii)iRNA剤は親油性部分を含み、かつ(iii)iRNA剤のアンチセンス鎖は、標的遺伝子から発現されるRNAのうち約18〜25ヌクレオチドの標的配列に対し十分相補性なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする方法。 - 親油性部分はコレステロールである、請求項9に記載の方法。
- 親油性部分はセンス鎖に結合される、請求項9に記載の方法。
- 親油性部分はセンス鎖の3’端に結合される、請求項9に記載の方法。
- iRNA剤はホスホロチオエートまたは2’‐OMe修飾をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- アンチセンス配列は表2に列挙されたアンチセンス配列との違いが4ヌクレオチド以下
である、請求項9に記載の方法。 - アンチセンス鎖は表2に列挙されたアンチセンス鎖から選択される、請求項9に記載の方法。
- iRNA剤のアンチセンス鎖は、ハンチンチン(htt)RNAの多型を含む配列に対し相補的な配列を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ヒトはParkin遺伝子またはユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素L1(UCHL1)遺伝子に遺伝的変異を有する、請求項9に記載の方法。
- 神経障害はハンチントン病である、請求項9に記載の方法。
- 神経障害はパーキンソン病である、請求項9に記載の方法。
- 神経障害はアルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴呆である、請求項9に記載の方法。
- iRNA剤は1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含む、請求項7に記載の方法。
- iRNA剤はトランスフェクション試薬を含まない溶液中に提供される、請求項9に記載の方法。
- 対象の神経系細胞中のハンチンチン(htt)RNAの量を低減する方法であって、該方法は、
神経系細胞をiRNA剤と接触させることを含み、
前記神経系細胞は作用部位よりも遠位にあり、iRNA剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖はRNA二重鎖を形成し、アンチセンス鎖は表2に列挙されたアンチセンス配列との違いが4ヌクレオチド以下であるヌクレオチド配列を含み、かつiRNA剤は親油性部分を含むことを特徴とする方法。 - iRNA剤はホスホロチオエートまたは2’‐OMe修飾をさらに含む、請求項23に記載の方法。
- iRNA剤は、表2に列挙されたアンチセンス鎖から選択された配列を含むアンチセンス鎖を含む、請求項23に記載の方法。
- iRNA剤は、表2に列挙されたセンス鎖から選択されたセンス鎖を含む、請求項23に記載の方法。
- iRNA剤は、htt RNAの多型を含む配列に対し相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む、請求項23に記載の方法。
- 多型は、GenBank登録番号NM_002111の配列の171位におけるA→Cである、請求項27に記載の方法。
- iRNA剤は1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含む、請求項23に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US70998505P | 2005-08-18 | 2005-08-18 | |
US83323406P | 2006-07-25 | 2006-07-25 | |
PCT/US2006/032499 WO2007022470A2 (en) | 2005-08-18 | 2006-08-18 | Methods and compositions for treating neurological disease |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012263073A Division JP2013049714A (ja) | 2005-08-18 | 2012-11-30 | 神経疾患を治療するための方法および組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009504782A true JP2009504782A (ja) | 2009-02-05 |
Family
ID=37562149
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008527194A Pending JP2009504782A (ja) | 2005-08-18 | 2006-08-18 | 神経疾患を治療するための方法および組成物 |
JP2012263073A Pending JP2013049714A (ja) | 2005-08-18 | 2012-11-30 | 神経疾患を治療するための方法および組成物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012263073A Pending JP2013049714A (ja) | 2005-08-18 | 2012-11-30 | 神経疾患を治療するための方法および組成物 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US20070161591A1 (ja) |
EP (2) | EP1937066A4 (ja) |
JP (2) | JP2009504782A (ja) |
AU (1) | AU2006279280A1 (ja) |
CA (1) | CA2619534A1 (ja) |
WO (2) | WO2007022470A2 (ja) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015518721A (ja) * | 2012-05-22 | 2015-07-06 | オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドOlix Pharmaceuticals Inc. | 細胞内貫通能を持ってrna干渉を誘導する核酸分子およびその用途 |
JP2017182102A (ja) * | 2010-05-27 | 2017-10-05 | エメラルド セラピューティクス,インコーポレーテッド | 修飾した核酸を用いる情報伝播のシステムおよび方法 |
JP2018516091A (ja) * | 2015-04-03 | 2018-06-21 | ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツUniversity Of Massachusetts | ハンチンチンmRNAをターゲティングするオリゴヌクレオチド化合物 |
WO2019142883A1 (ja) * | 2018-01-18 | 2019-07-25 | 第一三共株式会社 | ジヒドロインドリジノン誘導体 |
US11345917B2 (en) | 2015-04-03 | 2022-05-31 | University Of Massachusetts | Oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders |
JP7105065B2 (ja) | 2014-12-15 | 2022-07-22 | ダイセルナ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | リガンド修飾二本鎖核酸 |
US11702659B2 (en) | 2021-06-23 | 2023-07-18 | University Of Massachusetts | Optimized anti-FLT1 oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders |
US11753638B2 (en) | 2016-08-12 | 2023-09-12 | University Of Massachusetts | Conjugated oligonucleotides |
US11827882B2 (en) | 2018-08-10 | 2023-11-28 | University Of Massachusetts | Modified oligonucleotides targeting SNPs |
US11896669B2 (en) | 2016-01-31 | 2024-02-13 | University Of Massachusetts | Branched oligonucleotides |
JP7470107B2 (ja) | 2018-09-28 | 2024-04-17 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | トランスサイレチン(TTR)iRNA組成物及びTTR関連眼疾患を治療又は予防するためのその使用方法 |
Families Citing this family (51)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8680063B2 (en) | 2003-09-12 | 2014-03-25 | University Of Massachusetts | RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders |
WO2008005562A2 (en) * | 2006-07-07 | 2008-01-10 | University Of Massachusetts | Rna silencing compositions and methods for the treatment of huntington's disease |
WO2005027980A1 (en) | 2003-09-12 | 2005-03-31 | University Of Massachusetts | Rna interference for the treatment of gain-of-function disorders |
US20080206869A1 (en) * | 2005-01-24 | 2008-08-28 | Avaris Ab | Nucleic Acid Complex |
WO2007022470A2 (en) * | 2005-08-18 | 2007-02-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating neurological disease |
CN101365801B (zh) | 2005-10-28 | 2013-03-27 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 抑制亨廷顿基因表达的组合物和方法 |
US20070259827A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-11-08 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for enhancing discriminatory RNA interference |
EP3210633B1 (en) | 2006-01-26 | 2019-06-19 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and their uses directed to huntingtin |
US20080039415A1 (en) * | 2006-08-11 | 2008-02-14 | Gregory Robert Stewart | Retrograde transport of sirna and therapeutic uses to treat neurologic disorders |
WO2008134646A2 (en) * | 2007-04-26 | 2008-11-06 | University Of Iowa Research Foundation | Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof |
WO2008143774A2 (en) * | 2007-05-01 | 2008-11-27 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for locating snp heterozygosity for allele specific diagnosis and therapy |
EP2530152B1 (en) | 2007-05-31 | 2017-12-27 | University of Iowa Research Foundation | Reduction of off-target RNA interference toxicity |
TW200927177A (en) * | 2007-10-24 | 2009-07-01 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect |
BRPI0820564A2 (pt) * | 2007-11-13 | 2017-05-23 | Phoenix Biotechnology Inc | método para determinar a probabilidade de uma resposta terapêutica na quimioterapia do câncer com glicosídeo cardíaco |
US9040492B2 (en) * | 2008-03-31 | 2015-05-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Double-stranded lipid-modified RNA having high RNA interference effect |
US8901095B2 (en) | 2008-07-29 | 2014-12-02 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Selective inhibition of polyglutamine protein expression |
US10138485B2 (en) * | 2008-09-22 | 2018-11-27 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Neutral nanotransporters |
WO2010141511A2 (en) | 2009-06-01 | 2010-12-09 | Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof |
KR102173836B1 (ko) | 2009-09-11 | 2020-11-05 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | 헌팅틴 발현의 조절 |
JP5795072B2 (ja) | 2010-10-22 | 2015-10-14 | ソンギュングヮン ユニバーシティ ファウンデーション フォー コーポレート コラボレーション | Rna干渉を誘導する核酸分子及びその用途 |
US8569254B2 (en) * | 2010-12-10 | 2013-10-29 | National Yang Ming University | Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and methods for identifying agents useful for doing the same |
US9181544B2 (en) | 2011-02-12 | 2015-11-10 | University Of Iowa Research Foundation | Therapeutic compounds |
CA2839896A1 (en) * | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject |
US20140315795A1 (en) * | 2012-10-26 | 2014-10-23 | Nlife Therapeutics, S.L. | Compositions and Methods for Selective Delivery of Oligonucleotide Molecules to Cell Types |
US20150197534A1 (en) * | 2013-09-05 | 2015-07-16 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase |
JP6519842B2 (ja) * | 2013-10-04 | 2019-05-29 | 国立大学法人神戸大学 | 福山型筋ジストロフィー治療用アンチセンス核酸 |
CA2949437C (en) | 2014-05-20 | 2023-08-15 | University Of Iowa Research Foundation | Huntington's disease therapeutic compounds |
WO2015190922A1 (en) | 2014-06-10 | 2015-12-17 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease |
EP3218484A4 (en) | 2014-11-14 | 2018-05-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
SG11201703419UA (en) | 2014-11-14 | 2017-05-30 | Voyager Therapeutics Inc | Modulatory polynucleotides |
MX2017015302A (es) | 2015-05-29 | 2018-03-28 | Univ Leland Stanford Junior | Agentes nucleosidos para la reduccion de la actividad perjudicial de los genes que contienen repeticiones de nucleotidos extendidas. |
JP6229867B2 (ja) * | 2015-06-05 | 2017-11-15 | 視空間工房株式会社 | 軽度認知症の早期発見・予防プログラム及びシステム |
WO2017007825A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach |
MX2018002090A (es) | 2015-08-24 | 2018-09-12 | Halo Bio Rnai Therapeutics Inc | Nanoparticulas de polinucleótido para modulación de expresión génica y sus usos. |
WO2017053999A1 (en) | 2015-09-25 | 2017-03-30 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated antisense compounds and their use |
JP2019511471A (ja) * | 2016-03-02 | 2019-04-25 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | インフルエンザウイルスに対する汎遺伝子型薬剤及びその使用方法 |
US11339392B2 (en) | 2016-03-02 | 2022-05-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Pan-genotypic agents against influenza virus and methods of using the same |
KR102522059B1 (ko) | 2016-04-18 | 2023-04-14 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 안티센스 올리고머, 및 산성 알파-글루코시다제 유전자와 연관된 질환을 치료하기 위한 이의 사용 방법 |
WO2017201258A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating huntington's disease |
EP3458588A4 (en) | 2016-05-18 | 2020-01-15 | Voyager Therapeutics, Inc. | MODULATING POLYNUCLEOTIDES |
JP2020518258A (ja) | 2017-05-05 | 2020-06-25 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 筋萎縮性側索硬化症(als)治療組成物および方法 |
WO2018204803A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating huntington's disease |
AU2018352236A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-04-23 | The Curators Of The University Of Missouri | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
WO2019181946A1 (ja) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 国立大学法人東京医科歯科大学 | 毒性が軽減した核酸 |
WO2020257194A1 (en) * | 2019-06-17 | 2020-12-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Delivery of oligonucleotides to the striatum |
AR125230A1 (es) * | 2021-03-29 | 2023-06-28 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | COMPOSICIONES DE AGENTES DE ARNi CONTRA HUNTINGTINA (HTT) Y SUS MÉTODOS DE USO |
CA3226019A1 (en) | 2021-07-20 | 2023-01-26 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses |
WO2023144127A1 (en) | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses |
WO2023232976A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses |
WO2024058196A1 (en) * | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Okinawa Institute Of Science And Technology School Corporation | New synthetic drugs for treating alzheimer's disease |
Family Cites Families (104)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2782242A (en) * | 1954-09-23 | 1957-02-19 | B A Shawinigan Ltd | Purification of phenol |
FR2569407B1 (fr) * | 1984-08-22 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Sondes comportant des groupements adenine modifiee, leur preparation et leurs utilisations |
US5328470A (en) | 1989-03-31 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor |
EP0942000B1 (en) * | 1989-10-24 | 2004-06-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-Modified oligonucleotides |
US5965722A (en) * | 1991-05-21 | 1999-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides |
US5843641A (en) | 1993-02-26 | 1998-12-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for the daignosis, of familial amyotrophic lateral sclerosis |
CA2116280A1 (en) * | 1993-03-05 | 1994-09-06 | Marcy E. Macdonald | Huntingtin dna, protein and uses thereof |
US6358932B1 (en) * | 1994-05-31 | 2002-03-19 | Isis Pharmaceticals, Inc. | Antisense oligonucleotide inhibition of raf gene expression |
WO1996033761A1 (en) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Medtronic, Inc. | Intraparenchymal infusion catheter system |
CA2220950A1 (en) | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Somatix Therapy Corporation | Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes |
US20030069195A1 (en) * | 1996-03-01 | 2003-04-10 | Farrar Gwenyth Jane | Suppression of polymorphic alleles |
US5735814A (en) | 1996-04-30 | 1998-04-07 | Medtronic, Inc. | Techniques of treating neurodegenerative disorders by brain infusion |
US20040171030A1 (en) * | 1996-06-06 | 2004-09-02 | Baker Brenda F. | Oligomeric compounds having modified bases for binding to cytosine and uracil or thymine and their use in gene modulation |
US5898031A (en) * | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US6361940B1 (en) * | 1996-09-24 | 2002-03-26 | Qiagen Genomics, Inc. | Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity |
WO1998048009A2 (en) | 1997-04-21 | 1998-10-29 | University Of Florida | Materials and methods for ribozyme treatment of retinal diseases |
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
US6245427B1 (en) * | 1998-07-06 | 2001-06-12 | DüZGüNES NEJAT | Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles |
DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
US7829693B2 (en) * | 1999-11-24 | 2010-11-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
DE10160151A1 (de) | 2001-01-09 | 2003-06-26 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens |
US7037676B2 (en) * | 2000-03-21 | 2006-05-02 | Bristol-Myers Squibb | Drosophila tumor necrosis factor class molecule polynucleotides and variants thereof |
WO2001075164A2 (en) * | 2000-03-30 | 2001-10-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Rna sequence-specific mediators of rna interference |
US20030190635A1 (en) | 2002-02-20 | 2003-10-09 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA |
TR200401292T3 (tr) * | 2000-12-01 | 2004-07-21 | Max@Planck@Gesellschaft�Zur�F�Rderung�Der�Wissenschaften | RNAÁgirişimineÁyolÁaçanÁküçükÁRNAÁmolekülleri |
WO2003035869A1 (de) | 2001-10-26 | 2003-05-01 | Ribopharma Ag | Verwendung einer doppelsträngigen ribonukleinsäure zur gezielten hemmung der expression eines vorgegebenen zielgens |
US20050277133A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-12-15 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20040219671A1 (en) * | 2002-02-20 | 2004-11-04 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20050137155A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-06-23 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of Parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20050191638A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-09-01 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA) |
EP1627061B1 (en) | 2001-05-18 | 2009-08-12 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2003001335A2 (en) | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Gene Logic, Inc. | Platform for management and mining of genomic data |
US20030162734A1 (en) * | 2001-06-28 | 2003-08-28 | Miller Carol A. | Modulation of DENN-MADD expression and interactions for treating neurological disorders |
CA2921821A1 (en) | 2001-07-12 | 2003-01-23 | University Of Massachusetts | In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing |
WO2003013437A2 (en) | 2001-08-07 | 2003-02-20 | University Of Delaware | Compositions and methods for the prevention and treatment of huntington's disease |
US20030198627A1 (en) | 2001-09-01 | 2003-10-23 | Gert-Jan Arts | siRNA knockout assay method and constructs |
EP2428571B1 (en) * | 2001-09-28 | 2018-07-18 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | MicroRNA molecules |
DE10163098B4 (de) * | 2001-10-12 | 2005-06-02 | Alnylam Europe Ag | Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren |
WO2003050305A1 (en) | 2001-12-08 | 2003-06-19 | Seegene, Inc. | Annealing control primer and its uses |
GB0130955D0 (en) * | 2001-12-24 | 2002-02-13 | Cancer Res Ventures | Expression system |
CA2476530A1 (en) | 2002-02-14 | 2003-08-21 | City Of Hope | Methods for producing interfering rna molecules in mammalian cells and therapeutic uses for such molecules |
US20050096284A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-05-05 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA) |
US20030180756A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-09-25 | Yang Shi | Compositions and methods for suppressing eukaryotic gene expression |
AU2003254334A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-02-02 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Rna-interference by single-stranded rna molecules |
US20040241854A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-12-02 | Davidson Beverly L. | siRNA-mediated gene silencing |
US20040023390A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-05 | Davidson Beverly L. | SiRNA-mediated gene silencing with viral vectors |
US20080274989A1 (en) * | 2002-08-05 | 2008-11-06 | University Of Iowa Research Foundation | Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof |
AU2003260370B2 (en) | 2002-08-05 | 2008-05-22 | Silence Therapeutics Gmbh | Further novel forms of interfering RNA molecules |
EP1389637B1 (en) | 2002-08-05 | 2012-05-30 | Silence Therapeutics Aktiengesellschaft | Blunt-ended interfering RNA molecules |
US20050042646A1 (en) * | 2002-08-05 | 2005-02-24 | Davidson Beverly L. | RNA interference suppresion of neurodegenerative diseases and methods of use thereof |
US20050106731A1 (en) | 2002-08-05 | 2005-05-19 | Davidson Beverly L. | siRNA-mediated gene silencing with viral vectors |
US20050255086A1 (en) * | 2002-08-05 | 2005-11-17 | Davidson Beverly L | Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene |
JP2005534696A (ja) | 2002-08-06 | 2005-11-17 | イントラディグム、コーポレイション | 干渉性rnaの導入によるターゲット遺伝子発現のイン・ビボでのダウンレギュレーション方法 |
AU2003261449A1 (en) * | 2002-08-07 | 2004-02-25 | Compositions for rna interference and methods of use thereof | |
US20050020521A1 (en) * | 2002-09-25 | 2005-01-27 | University Of Massachusetts | In vivo gene silencing by chemically modified and stable siRNA |
US20040192629A1 (en) * | 2002-11-04 | 2004-09-30 | University Of Massachusetts | Allele-specific RNA interference |
US7892793B2 (en) | 2002-11-04 | 2011-02-22 | University Of Massachusetts | Allele-specific RNA interference |
JP2006507841A (ja) * | 2002-11-14 | 2006-03-09 | ダーマコン, インコーポレイテッド | 機能的siRNAおよび超機能的siRNA |
AU2003295539A1 (en) | 2002-11-15 | 2004-06-15 | University Of Massachusetts | Allele-targeted rna interference |
US7829694B2 (en) | 2002-11-26 | 2010-11-09 | Medtronic, Inc. | Treatment of neurodegenerative disease through intracranial delivery of siRNA |
US7605249B2 (en) * | 2002-11-26 | 2009-10-20 | Medtronic, Inc. | Treatment of neurodegenerative disease through intracranial delivery of siRNA |
US7618948B2 (en) * | 2002-11-26 | 2009-11-17 | Medtronic, Inc. | Devices, systems and methods for improving and/or cognitive function through brain delivery of siRNA |
US20040248299A1 (en) * | 2002-12-27 | 2004-12-09 | Sumedha Jayasena | RNA interference |
DE602004030315D1 (de) * | 2003-01-17 | 2011-01-13 | Max Planck Gesellschaft | Induzierbare sirna expressionskonstrukte zur gezielten genabschaltung |
DE10302421A1 (de) | 2003-01-21 | 2004-07-29 | Ribopharma Ag | Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit |
US20070104688A1 (en) * | 2003-02-13 | 2007-05-10 | City Of Hope | Small interfering RNA mediated transcriptional gene silencing in mammalian cells |
US20050233342A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-10-20 | Muthiah Manoharan | Methods of preventing off-target gene silencing |
EP1605978B1 (en) | 2003-03-07 | 2010-09-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Therapeutic compositions |
EP2669377A3 (en) * | 2003-04-17 | 2015-10-14 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Modified iRNA agents |
ES2864206T3 (es) | 2003-06-02 | 2021-10-13 | Univ Massachusetts | Métodos y composiciones para mejorar la eficacia y la especificidad del ARNi |
US7750144B2 (en) * | 2003-06-02 | 2010-07-06 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing |
EP3502252B1 (en) | 2003-06-02 | 2023-04-05 | University of Massachusetts | Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing |
CA2542232A1 (en) * | 2003-06-09 | 2005-01-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating neurodegenerative disease by inhibiting alpha-synuclein |
US7595306B2 (en) * | 2003-06-09 | 2009-09-29 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Method of treating neurodegenerative disease |
AU2004247729A1 (en) | 2003-06-12 | 2004-12-23 | Applera Corporation | Combinatorial nucleobase oligomers comprising universal base analogues and methods for making and using same |
CA2528963A1 (en) | 2003-06-27 | 2005-01-13 | Sirna Therapeutics, Inc. | Rna interference mediated treatment of alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (sina) |
WO2005007877A2 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-27 | University Of Massachusetts | Regulatable promoters for synthesis of small hairpin rna |
WO2005007875A2 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-27 | University Of Massachusetts | Enhanced promoters for synthesis of small hairpin rna |
WO2005023991A2 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-17 | The General Hospital Corporation | Small hairpin rna libraries |
WO2005027980A1 (en) * | 2003-09-12 | 2005-03-31 | University Of Massachusetts | Rna interference for the treatment of gain-of-function disorders |
WO2008005562A2 (en) | 2006-07-07 | 2008-01-10 | University Of Massachusetts | Rna silencing compositions and methods for the treatment of huntington's disease |
US8680063B2 (en) | 2003-09-12 | 2014-03-25 | University Of Massachusetts | RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders |
WO2005045034A2 (en) | 2003-10-23 | 2005-05-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA) |
WO2005054494A2 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-16 | University Of Massachusetts | Sequence-specific inhibition of small rna function |
WO2005062937A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-14 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna |
US20060134787A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-22 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA |
WO2005069987A2 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | City Of Hope | Amplifying interfering rna (rnai) expression and effects |
US20050176045A1 (en) * | 2004-02-06 | 2005-08-11 | Dharmacon, Inc. | SNP discriminatory siRNA |
US20050256072A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-11-17 | University Of Massachusetts | Dual functional oligonucleotides for use in repressing mutant gene expression |
US20050182005A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-08-18 | Tuschl Thomas H. | Anti-microRNA oligonucleotide molecules |
US20060069050A1 (en) * | 2004-02-17 | 2006-03-30 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for mediating gene silencing |
US20050273868A1 (en) * | 2004-02-17 | 2005-12-08 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing RISC activity in vitro and in vivo |
EP1742958B1 (en) * | 2004-03-15 | 2017-05-17 | City of Hope | Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna |
US20070265220A1 (en) * | 2004-03-15 | 2007-11-15 | City Of Hope | Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA |
US20060178334A1 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | City Of Hope | Double-stranded and single-stranded RNA molecules with 5 ' triphosphates and their use for inducing interferon |
EP1885854B1 (en) * | 2005-05-06 | 2012-10-17 | Medtronic, Inc. | Methods and sequences to suppress primate huntington gene expression |
US7902352B2 (en) | 2005-05-06 | 2011-03-08 | Medtronic, Inc. | Isolated nucleic acid duplex for reducing huntington gene expression |
EP2062980B1 (en) * | 2005-06-28 | 2011-08-31 | Medtronic, Inc. | Methods and sequences to preferentially suppress expression of mutated huntingtin gene. |
WO2007022470A2 (en) * | 2005-08-18 | 2007-02-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating neurological disease |
CN101365801B (zh) * | 2005-10-28 | 2013-03-27 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 抑制亨廷顿基因表达的组合物和方法 |
US20070259827A1 (en) * | 2006-01-25 | 2007-11-08 | University Of Massachusetts | Compositions and methods for enhancing discriminatory RNA interference |
US9273356B2 (en) | 2006-05-24 | 2016-03-01 | Medtronic, Inc. | Methods and kits for linking polymorphic sequences to expanded repeat mutations |
US20080039415A1 (en) | 2006-08-11 | 2008-02-14 | Gregory Robert Stewart | Retrograde transport of sirna and therapeutic uses to treat neurologic disorders |
WO2008143774A2 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-27 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for locating snp heterozygosity for allele specific diagnosis and therapy |
-
2006
- 2006-08-18 WO PCT/US2006/032499 patent/WO2007022470A2/en active Application Filing
- 2006-08-18 US US11/506,448 patent/US20070161591A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-18 EP EP06813584A patent/EP1937066A4/en not_active Withdrawn
- 2006-08-18 EP EP10162816A patent/EP2239328A3/en not_active Withdrawn
- 2006-08-18 WO PCT/US2006/032589 patent/WO2007022506A2/en active Application Filing
- 2006-08-18 CA CA002619534A patent/CA2619534A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-18 AU AU2006279280A patent/AU2006279280A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-18 JP JP2008527194A patent/JP2009504782A/ja active Pending
- 2006-08-18 US US11/506,518 patent/US20070105803A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-01-29 US US12/697,117 patent/US20110027882A1/en not_active Abandoned
- 2010-06-25 US US12/823,917 patent/US20100267810A1/en not_active Abandoned
- 2010-10-08 US US12/901,458 patent/US20110251257A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-09-21 US US13/238,991 patent/US20120214861A1/en not_active Abandoned
-
2012
- 2012-11-30 JP JP2012263073A patent/JP2013049714A/ja active Pending
-
2013
- 2013-01-23 US US13/747,901 patent/US20130261166A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-01-05 US US14/589,807 patent/US9914924B2/en active Active
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6011026529; CHEN,Z.J. et al: 'Sleeping Beauty-mediated down-regulation of huntingtin expression by RNA interference' Biochem Biophys Res Commun Vol.329, No.2, 2005, p.646-52 * |
JPN6011026533; LORENZ,C. et al: 'Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells' Bioorg Med Chem Lett Vol.14, No.19, 2004, p.4975-7 * |
JPN7011001842; HARPER,S.Q. et al: 'RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse' Proc Natl Acad Sci U S A Vol.102, No.16, 2005, p.5820-5 * |
JPN7011001843; SOUTSCHEK,J. et al: 'Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs' Nature Vol.432, No.7014, 2004, p.173-8 * |
JPN7011001844; EPA,W.R. et al: 'Enhanced downregulation of the p75 nerve growth factor receptor by cholesteryl and bis-cholesteryl a' Antisense Nucleic Acid Drug Dev Vol.8, No.6, 1998, p.489-98 * |
Cited By (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017182102A (ja) * | 2010-05-27 | 2017-10-05 | エメラルド セラピューティクス,インコーポレーテッド | 修飾した核酸を用いる情報伝播のシステムおよび方法 |
JP2018152080A (ja) * | 2010-05-27 | 2018-09-27 | エメラルド セラピューティクス,インコーポレーテッド | 修飾した核酸を用いる情報伝播のシステムおよび方法 |
JP6999590B2 (ja) | 2012-05-22 | 2022-01-18 | オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 細胞内貫通能を持ってrna干渉を誘導する核酸分子およびその用途 |
JP2017093448A (ja) * | 2012-05-22 | 2017-06-01 | オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドOlix Pharmaceuticals Inc. | 細胞内貫通能を持ってrna干渉を誘導する核酸分子およびその用途 |
JP2019122379A (ja) * | 2012-05-22 | 2019-07-25 | オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドOlix Pharmaceuticals Inc. | 細胞内貫通能を持ってrna干渉を誘導する核酸分子およびその用途 |
JP2015518721A (ja) * | 2012-05-22 | 2015-07-06 | オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドOlix Pharmaceuticals Inc. | 細胞内貫通能を持ってrna干渉を誘導する核酸分子およびその用途 |
JP7105065B2 (ja) | 2014-12-15 | 2022-07-22 | ダイセルナ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | リガンド修飾二本鎖核酸 |
JP7009356B2 (ja) | 2015-04-03 | 2022-01-25 | ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツ | ハンチンチンmRNAをターゲティングするオリゴヌクレオチド化合物 |
US11345917B2 (en) | 2015-04-03 | 2022-05-31 | University Of Massachusetts | Oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders |
JP2018516091A (ja) * | 2015-04-03 | 2018-06-21 | ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツUniversity Of Massachusetts | ハンチンチンmRNAをターゲティングするオリゴヌクレオチド化合物 |
US11230713B2 (en) | 2015-04-03 | 2022-01-25 | University Of Massachusetts | Oligonucleotide compounds for targeting huntingtin mRNA |
US11896669B2 (en) | 2016-01-31 | 2024-02-13 | University Of Massachusetts | Branched oligonucleotides |
US11753638B2 (en) | 2016-08-12 | 2023-09-12 | University Of Massachusetts | Conjugated oligonucleotides |
WO2019142883A1 (ja) * | 2018-01-18 | 2019-07-25 | 第一三共株式会社 | ジヒドロインドリジノン誘導体 |
US11530211B2 (en) | 2018-01-18 | 2022-12-20 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Dihydroindolizinone derivative |
CN111630052B (zh) * | 2018-01-18 | 2023-04-18 | 第一三共株式会社 | 二氢吲嗪酮衍生物 |
JPWO2019142883A1 (ja) * | 2018-01-18 | 2021-01-14 | 第一三共株式会社 | ジヒドロインドリジノン誘導体 |
JP7359697B2 (ja) | 2018-01-18 | 2023-10-11 | 第一三共株式会社 | ジヒドロインドリジノン誘導体 |
TWI818948B (zh) * | 2018-01-18 | 2023-10-21 | 日商第一三共股份有限公司 | 啉酮衍生物 |
CN111630052A (zh) * | 2018-01-18 | 2020-09-04 | 第一三共株式会社 | 二氢吲嗪酮衍生物 |
US11827882B2 (en) | 2018-08-10 | 2023-11-28 | University Of Massachusetts | Modified oligonucleotides targeting SNPs |
JP7470107B2 (ja) | 2018-09-28 | 2024-04-17 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | トランスサイレチン(TTR)iRNA組成物及びTTR関連眼疾患を治療又は予防するためのその使用方法 |
US11702659B2 (en) | 2021-06-23 | 2023-07-18 | University Of Massachusetts | Optimized anti-FLT1 oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20070105803A1 (en) | 2007-05-10 |
EP2239328A3 (en) | 2011-01-05 |
CA2619534A1 (en) | 2007-02-22 |
AU2006279280A1 (en) | 2007-02-22 |
WO2007022470A3 (en) | 2007-06-14 |
US20120214861A1 (en) | 2012-08-23 |
US20070161591A1 (en) | 2007-07-12 |
US20110251257A1 (en) | 2011-10-13 |
EP1937066A2 (en) | 2008-07-02 |
WO2007022506A3 (en) | 2007-05-03 |
US9914924B2 (en) | 2018-03-13 |
EP1937066A4 (en) | 2008-12-24 |
US20110027882A1 (en) | 2011-02-03 |
US20150232840A1 (en) | 2015-08-20 |
WO2007022470A2 (en) | 2007-02-22 |
US20100267810A1 (en) | 2010-10-21 |
WO2007022506A2 (en) | 2007-02-22 |
US20130261166A1 (en) | 2013-10-03 |
EP2239328A2 (en) | 2010-10-13 |
AU2006279280A8 (en) | 2008-04-17 |
JP2013049714A (ja) | 2013-03-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9914924B2 (en) | Methods and compositions for treating neurological disease | |
JP4716517B2 (ja) | 神経変性疾患を治療する方法 | |
US7595306B2 (en) | Method of treating neurodegenerative disease | |
TWI788312B (zh) | 絲胺酸蛋白酶抑制因子A1 iRNA組成物及其使用方法 | |
CN113454222A (zh) | 淀粉样前体蛋白(APP)RNAi剂组成物及其使用方法 | |
JP5881970B2 (ja) | iRNA複合体 | |
US20050233342A1 (en) | Methods of preventing off-target gene silencing | |
CN116234585A (zh) | 微管相关蛋白TAU(MAPT)iRNA剂组合物及其使用方法 | |
CN115955972A (zh) | 载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法 | |
TW202305131A (zh) | 用於治療或預防超氧歧化酶1-(SOD1-)相關的神經退化疾病的超氧歧化酶1(SOD1)iRNA組成物及其使用方法 | |
TW202305134A (zh) | 杭丁頓蛋白(HTT)iRNA劑組成物及其使用方法 | |
CN117222739A (zh) | 朊病毒蛋白(prnp)irna组合物和其使用方法 | |
CN117120610A (zh) | 用于治疗或预防超氧化物歧化酶1(SOD1)相关神经退行性疾病的超氧化物歧化酶1(SOD1)iRNA组合物以及其使用方法 | |
CN116583602A (zh) | G蛋白偶联受体75(GPR75)iRNA组合物及其使用方法 | |
CN117561335A (zh) | 富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)iRNA药剂组合物和其使用方法 | |
TW202334413A (zh) | 第十二因子(F12)iRNA組成物及其使用方法 | |
CN117561334A (zh) | 人染色体9开放阅读框72(C9ORF72)iRNA药剂组合物和其使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110531 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110823 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110830 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110922 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110930 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111014 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111021 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111130 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120227 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120731 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121130 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20130206 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20130405 |