JPH1033198A - 標的核酸を増幅して検出するための方法 - Google Patents

標的核酸を増幅して検出するための方法

Info

Publication number
JPH1033198A
JPH1033198A JP9056337A JP5633797A JPH1033198A JP H1033198 A JPH1033198 A JP H1033198A JP 9056337 A JP9056337 A JP 9056337A JP 5633797 A JP5633797 A JP 5633797A JP H1033198 A JPH1033198 A JP H1033198A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
amplification
amplified
polymerase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP9056337A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5000794B2 (ja
Inventor
John Wesley Backs
ウェスリー バッカス ジョン
Lynn Kramer Marcia
リン クラマー マルシア
Joseph Falvo
ファルボ ジョセフ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ortho Clinical Diagnostics Inc
Original Assignee
Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc filed Critical Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Publication of JPH1033198A publication Critical patent/JPH1033198A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5000794B2 publication Critical patent/JP5000794B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 標的核酸の増幅および検出方法に関する。 【解決手段】 標的核酸を含有すると疑われる試料を、
前記標的核酸に実質的に相補的である２種のプライマー
および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、前記標的核酸が
増幅されるような条件下で接触させることを含む。次い
で増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を形成す
る。増幅に続いて、前記試料を検出前インキュベーショ
ン工程にかける。前記試料を１秒間〜３０分間、９５℃
〜１２０℃でインキュベートして、前記重合剤を不活性
化する。最終的に、増幅された標的核酸の存在もしくは
不存在を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸の増幅お
よび検出方法に関する。詳細には、増幅された核酸生成
物を検出する改良方法に関する。本発明は、種々の医学
的および学術的研究、法医学的調査、ならびに診断方
法、例えば、遺伝子障害もしくは感染症の検出に使用す
ることができる。
【０００２】
【従来の技術】増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）にプローブを用いる非常に精巧なハイブリ
ッド形成アッセイの発展を包含する、微量の核酸を検出
するための技術は、この２０年間で急速に進歩した。研
究者らは、ヒトおよび動物の試験被検体中の疾患および
遺伝的特徴を検出するためのそのような技術の価値を直
ちに認めてきた。核酸の増幅および検出にプライマーお
よびプローブを使用することは、相補性の概念、すなわ
ち、相補的ヌクレオチド（ヌクレオチド対としても既知
である）間の水素結合による二本鎖の核酸の結合に基づ
いている。少量のＤＮＡを増幅し検出する方法を見いだ
すために、多くの研究が行われてきた。種々の方法が既
知であり、それらは、検出するために被検体中の核酸の
数を増幅するかまたは著しく増大するのに使用されてき
た。そのような増幅技術には、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反
応（ＬＣＲ）、および分枝ＤＮＡが含まれる。
【０００３】ＰＣＲは、これらのうち最もよく知られて
いる増幅方法である。ＰＣＲについての詳細は、例え
ば、米国特許第 4,638,195号明細書（Mullis他）、米国
特許第4,683,202号明細書（Mullis）および米国特許第
4,965,188号明細書（Mullis他）を包含する従来技術文
献によく記載されている。あまり詳しくはないが、ＰＣ
Ｒでは、重合剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）および
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が存在しており、適
当な条件下で、ハイブリッド形成プライマーを標的核酸
の鎖に巻き込む。その結果、鋳型に相補的であるヌクレ
オチドを加えたプライマー伸長生成物が、鋳型に沿って
生成する。
【０００４】一度、プライマー伸長生成物を変性し、そ
して鋳型のコピーを１つ作り、標的核酸と同じ配列を有
する核酸の量を指数関数的に増加させるのに望まれる回
数だけ、プライミング、伸長および変性のサイクルを実
施できる。実際には、標的核酸は、それがより容易に検
出されるように何回も複製（または増幅）される。一
度、標的核酸が十分に増幅されると、種々の検出方法を
用いて、標的の存在を定性的および／または定量的に検
出することができる。一度、標的核酸が十分に増幅され
ると、種々の検出方法を用いて、その存在を検出するこ
とができる。ＰＣＲ生成物を検出するのに使用される標
準検出方法には、臭化エチジウム染色アガロースゲルが
用いられる。しかしながら、臭化エチジウム染色ゲルの
使用は、例えば、比較的乏しい感度および特異性を包含
する幾つかの欠点を有する。
【０００５】放射性標識および電気泳動の使用を排除す
る、改良されたＰＣＲ生成物の検出方法が開発された。
これらの非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出方法は、
プローブに対する特異的ハイブリッド形成および酵素的
信号発生による。そのような非同位体オリゴヌクレオチ
ド捕捉検出方法（逆ドット・ブロット検出としても既知
である）は、米国特許第 5,229,297号明細書（Schnepil
sky 他）、同第 5,328,825号明細書（Warren他）および
同第 5,422,271号明細書（Chen他）に記載されている。
また、そのような方法は、Findlay 他，Clinical Chemi
stry, 39:1927-1933 (1993) に記載されている。
【０００６】これらの非同位体検出方法は、臭化エチジ
ウム染色検出よりも高い感度および特異性を有し、そし
て放射能の使用を回避する。これらの方法は、ビオチニ
ル化プライマー（複数）で増幅を行ってまたはビオチニ
ル化プローブを用いて操作することで、増幅された核酸
を検出する。ビオチニル化生成物もしくはプローブは、
次いでアビジンもしくはストレプトアビジン接合酵素、
例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応
する。次いで色素前駆体（もしくは発光性信号試薬）を
酵素と接触状態にして色素（ルミネセンス）に変換し、
それにより検出可能な信号を発生させることができる。
【０００７】しかしながら、非同位体オリゴヌクレオチ
ド捕捉検出方法は、それら自身に欠点を持たない訳では
ない。非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検出が標準ＰＣ
Ｒ変性条件（９５℃）を利用して実施され、濃縮された
かまたは最低限に希釈された増幅された核酸生成物を変
性する場合、増幅反応を行うために利用される酵素、例
えば、熱安定性ポリメラーゼもしくはＤＮＡリガーゼ
は、まだなお存在しかつ活性であるだろう。検出の最中
におけるそのような活性酵素の存在は、酵素とプローブ
との間で増幅生成物に対する結合の競合を引き起こす。
そのような競合は、プローブに結合する増幅された核酸
生成物の量を低減し、そのために検出信号を低減しう
る。
【０００８】この問題に対する１つの解決方法は、高レ
ベルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｍｇ++の
キレート化剤を、増幅を行った後であるが検出する前
に、ＰＣＲ増幅混合物に添加することである。ＥＤＴＡ
は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを包含す
る、活性にＭｇ++を必要とする多数の酵素を阻害するこ
とができる。しかしながら、ＥＤＴＡの使用は、ＰＣＲ
増幅および検出方法に追加段階を加えることになる。加
えて、ＥＤＴＡを使用すると、ＥＤＴＡを添加するため
に反応容器を開ける必要がある。当業者らが承知のよう
に、反応容器を開けることは、汚染を懸念して避けるべ
きである。
【０００９】従って、ＥＤＴＡもしくは別のそのような
酵素阻害剤の添加により検出中の増幅プロセスを妨害す
ることは望ましくない。それよりは、汚染の危険性を増
大することなく、検出する前に増幅酵素を不活性化する
方法が望ましい。
【００１０】
【課題を解決するための手段】検出する前に増幅後イン
キュベーション段階を用いて増幅酵素を不活性化するこ
とにより、前記課題を解決することが本発明の目的であ
る。ある態様では、本発明は、（ｉ）標的核酸を含有す
ると疑われる試料を、前記標的核酸の一部分に実質的に
相補的である少なくとも２種のオリゴヌクレオチドおよ
び熱安定性増幅酵素と、前記標的核酸が増幅されるよう
な条件下で接触させる工程、（ｉｉ）増幅された標的核
酸を変性して、一本鎖核酸を形成する工程、（ｉｉｉ）
増幅後インキュベーション工程として、前記試料を１秒
間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュベートし
て、前記熱安定性増幅酵素を不活性化する工程、並びに
（ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在
を検出する工程、を含む、標的核酸を増幅して検出する
ための方法に関する。
【００１１】更なる態様では、本発明は、（ｉ）標的核
酸を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオ
シド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および前記
標的核酸に実質的に相補的である少なくとも２種のプラ
イマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接
触させる工程、（ｉｉ）増幅された標的核酸を変性し
て、一本鎖核酸を形成する工程、（ｉｉｉ）増幅後イン
キュベーション工程として、前記試料を１秒間〜３０分
間、９５℃〜１２０℃でインキュベートして、前記重合
剤を不活性化する工程、並びに（ｉｖ）前記増幅された
標的核酸の存在もしくは不存在を検出する工程、を含
む、標的核酸を増幅して検出するための方法に関する。
【００１２】別の態様では、本発明は、（ｉ）標的核酸
を含有すると疑われる試料を、異なる４種のヌクレオシ
ド三燐酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および少なく
とも一方がビオチンで標識されており且ついずれも前記
標的核酸に実質的に相補的である少なくとも２種のプラ
イマーと、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接
触させる工程、（ｉｉ）増幅後インキュベーション段階
として、前記試料を０．５分間〜５分間、約１０５℃で
インキュベートして、前記ポリメラーゼを不活性化する
工程、並びに（ｉｉｉ）前記ビオチニル化され増幅され
た標的核酸を、ストレプトアビジン酵素接合体と反応さ
せ、続いて前記酵素を基質試薬と反応させて、検出可能
な比色または化学ルミネセンス信号を生成することによ
り、前記ビオチニル化され増幅された標的核酸の存在も
しくは不存在を検出する工程、を含む、標的核酸を増幅
して検出するための方法に関する。本発明の様々な別の
目的および利点が、以下の発明の説明から明らかである
だろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】ポリメラーゼ連鎖反応を用いる核
酸の増幅および検出のための一般的な原理および条件は
周知であり、その詳細は、米国特許第 4,683,195号明細
書（Mullis他）、米国特許第 4,683,202号明細書（Mull
is）および米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）
を包含する多数の文献に提供されている。これらはすべ
て引用することにより本明細書中に組み入れられる。従
って、従来技術文献における教示および本明細書中に提
供される特別な教示を考えると、当業者にとって、本明
細書で教示したように、生成物検出の前に増幅後インキ
ュベーション工程を加えて増幅酵素を不活性化すること
により検出感度を増大する本発明の実施に際して困難は
ないはずである。
【００１４】熱安定性酵素を使用する別の増幅および検
出方法を、本発明の実施に際して使用することもでき
る。本発明は、増幅中に使用される熱安定性酵素（複
数）を不活性化する、増幅後，検出前のインキュベーシ
ョン工程を提供する。従って、本発明は、熱安定性酵素
を使用する任意の増幅方法と共に使用するのに適する。
別の熱安定性増幅方法には、例えば、欧州特許第 0 320
308号明細書（1987年12月発行）および欧州特許第 0 4
39 182号明細書（1990年 1月発行）に記載された、熱安
定性ＤＮＡリガーゼを用いて隣接したプローブを結合さ
せそれによって相補的核酸配列を生成する、リガーゼ連
鎖反応（ＬＣＲ）が含まれる。ＬＣＲでは、標的核酸
を、４種のオリゴヌクレオチド・プローブおよび熱安定
性ＤＮＡリガーゼを用いて増幅する。オリゴヌクレオチ
ド・プローブのうち２種が、増幅しようとするＤＮＡ鋳
型の一本鎖上の隣接した部位に相補的である。これらの
プローブは、２つのプローブ間にニックが形成されるよ
うに、そのＤＮＡ鎖とハイブリッド形成する。次いでニ
ックを、熱安定性ＤＮＡリガーゼにより封じ、それによ
って標的に相補的な新しいＤＮＡ鎖を生成する。第３お
よび第４のプローブは、ＤＮＡ鋳型の第２の鎖に相補的
であり、最初のプローブ対のように機能して相補的ＤＮ
Ａを生成する。ＬＣＲの増幅された生成物は、標準検出
方法を用いて検出できる。本発明の増幅後，検出前イン
キュベーション段階をＬＣＲに用いると、検出する前に
ＤＮＡリガーゼを不活性化できる。従って、本明細書に
提供した教示により、当業者は、ＰＣＲで認められた増
幅後酵素変性段階をこれらの別の既知増幅および検出方
法に適応させることが可能だろう。この開示の残りは、
説明の都合上ＰＣＲを用いる本発明の実施に向けられて
いる。
【００１５】本発明は、検出感度を改良するために既知
ＰＣＲ方法を改良するものである。驚くべきことに、本
発明によると、増幅後，検出前インキュベーション工程
を採用することにより、重合剤を不活性化し、プローブ
と重合剤との間における増幅された標的核酸に対する結
合の競合を低減できることがわかった。この競合の低減
により、検出感度が高められる。本発明は、試験被検体
中に存在する１種以上の標的核酸の増幅および検出に向
けられている。試験被検体には、細胞性もしくはウイル
ス性物質、体液または検出できる遺伝子ＤＮＡもしくは
ＲＮＡを含有する別の細胞性物質が含まれうる。
【００１６】増幅し検出しようとする核酸は、プラスミ
ド類並びにいずれかの供給源（例えば、細菌、酵母、ウ
イルス、植物、高等動物、もしくはヒト）由来の天然産
ＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する種々供給源より得るこ
とができる。それは、限定されるものではないが、既知
方法を用いて、血液、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、
組織材料もしくは当該技術分野で既知である別の供給源
を包含する様々な組織から抽出してもよい。本発明は、
ゲノム（genomic ）ＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、
ウイルスＲＮＡまたは細菌もしくはウイルス感染細胞中
に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡ中に見いだされる
１つ以上の核酸配列の増幅及び検出に特に有用である。
【００１７】本明細書に記載された方法を用いて、感染
症、遺伝子障害および細胞障害、例えば、癌に関連する
標的核酸を増幅し検出することができる。また、それを
法医学的調査およびＤＮＡタイピングに使用してもよ
い。感染性病原体、例えば、細菌およびウイルスに関連
した核酸の検出による、それらの検出に特に有用であ
る。非常に高い感度および／または定量性が必要とされ
るとき、それは特に有用である。
【００１８】本発明により検出できる細菌には、限定さ
れるものではないが、ヒトの血液中に見いだされる細
菌、例えば、サルモネラ種（Salmonella species）、ス
トレプトコッカス種（Streptococcus species ）、クラ
ミジア種（Chlamydia species）、ゴノコッカル種（Gon
ococcal species）、マイコバクテリア種（Mycobacteri
a species）（例えば、結核菌（Mycobacterium tubercu
losis）およびトリ型結核菌複合体（Mycobacterium avi
um complex ）、マイコプラズマ種（Mycoplasmaspecie
s）（例えば、マイコプラズマ・ヘモフィルス・インフ
ルエンザ（Mycoplasma Hemophilus influenzae）および
マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumonia
e ，肺炎マイコプラズマ））、在郷軍人病菌（Legionel
la pneumophila）、ボレリア・ブルグドルフェライ（Bo
rrelia burgdorferei ）、ニューモシスチス・カリニ
（Pneumocystis carinii）、クロストリジウム・ディフ
ィシレ（Clostridium difficile ）、カンピロバクテリ
ア種（Camplyobacteri species）、エルシニア種（Yers
inia species）、シゲラ種（Shigella species）ならび
にリステリア種（Listeria species）が含まれる。検出
可能であるウイルスには、限定されるものではないが、
サイトメガロウイルス（cytomegalovirus ）、単純ヘル
ペスウイルス（herpes simplex virus）、ＥＢウイルス
（Epstein Barr virus）、ヒトパピローマウイルス（hu
man papilloma virus ）、インフルエンザウイルス（in
fluenza viruses ）、肝炎ウイルス（hepatitis virus
）ならびにレトロウイルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II
、HIV-I およびHIV-II）が含まれる。原生動物寄生
体、酵母およびかびも、本発明により検出可能である。
別の検出可能な種は、当業者に容易に明らかであるだろ
う。
【００１９】「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必須である
とみなされる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸に
つき一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポ
リメラーゼ・コファクターおよび１つ以上のデオキシリ
ボヌクレオシド−５′−三燐酸（ｄＮＴＰ類）を称す
る。ＰＣＲに使用される別の任意の試薬および材料を以
下に記載する。「プライマー」の語は、核酸鎖（すなわ
ち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘
導される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作
用できる、天然産又は合成的に生成されたオリゴヌクレ
オチドを称する。そのような条件には、別のＰＣＲ試薬
の存在ならびに適当な温度およびpHが含まれる。
【００２０】本発明のプライマーは、プライムおよび増
幅しようとする特異的核酸配列に対して「実質的に相補
的」であるように選択される。これは、それらが、それ
ぞれの核酸配列とハイブリッド形成するのに十分に相補
的であり、所望のハイブリッド形成生成物を形成し、次
いでＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能でなければなら
ないことを意味する。典型的には、「実質的に相補的」
なプライマーは、標的配列に相補的である塩基を少なく
とも７０％以上含有するだろう。より好ましくは８０％
の塩基が相補的であり、さらにより好ましくは９０％の
塩基が相補的である。最も好ましい状態では、プライマ
ーが標的核酸配列に対して９０％〜１００％の正確な相
補性を有する。
【００２１】プライマーは、増幅で最大効率を発揮させ
るために好ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本
鎖領域を含有することができる。それは、ＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに
十分長くなければならない。各プライマーの正確なサイ
ズは、予測される用途、プライマーの濃度および配列、
標的とされる配列の複雑さ、反応温度、ならびにプライ
マーの供給源に応じて変化するだろう。一般的には、本
発明に使用されるプライマーは、１２〜６０個のヌクレ
オチドを有し、そして好ましくはそれらが１６〜４０個
のヌクレオチドを有する。より好ましくは、各プライマ
ーが１８〜３５個のヌクレオチドを有する。
【００２２】本明細書中の有用なプライマーは、例え
ば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより入手可
能）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリ
ーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Ser
ies Synthesizer ）（Milligen-Biosearch, Inc.より入
手可能）を包含する、既知技法および装置を用いて調製
できる。この装置の使用方法は周知であり、例えば、米
国特許第 4,965,188号明細書（Gelfand 他）に記載され
ている。それは、引用することにより本明細書中に組み
入れられる。また、生物学的供給源から単離された天然
プライマーが有用である（例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）。通常、一組の少なくとも２つのプライマ
ーが各標的核酸に使用される。従って、複数の組のプラ
イマーを用いて、複数の標的核酸を同時に増幅すること
ができる。
【００２３】本明細書中で用いられる「プローブ」と
は、標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり、かつ
増幅された標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリ
ゴヌクレオチドである。本発明に用いられるプライマー
および／またはプローブは、任意に標識することができ
る。当該技術分野で既知である方法を用いて、プライマ
ーおよび／またはプローブを、特異的バインディング・
リガンド（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、グルコ
ースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、お
よびアルカリ性ホスファターゼ）、放射性同位体、高電
子密度試薬、色原体、発蛍光団、リン光体部分、または
フェリチンで標識できる。好ましくは、標識が特異的バ
インディング・リガンドである。より好ましくは、標識
がビオチンもしくはその誘導体、ストレプトアビジンも
しくはその誘導体、またはハプテンである。
【００２４】ＰＣＲに必要な更なるＰＣＲ試薬には、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび適当
なｄＮＴＰ類が含まれる。これらの試薬は、試験キット
の一部として、または試験装置の試薬室に別個に提供で
きる。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型との複
合体中のプライマーの３′−ヒドロキシ末端にデオキシ
リボクレオシド一燐酸分子を加える酵素であるが、しか
しこの添加は、鋳型依存方式である。一般的には、伸長
生成物の合成は、合成が終わるまで新たに合成される鎖
の５′から３′方向に進行する。有用なＤＮＡポリメラ
ーゼには、例えば、大腸菌（E. coli ）ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー（Klenow）
ポリメラーゼ、逆転写酵素、および当該技術分野で既知
の別のものが含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラー
ゼが、熱に安定であり、より高い温度、特にＤＮＡ鎖の
プライミングおよび伸長に用いられる高温で優先的に活
性であることを意味する、熱安定性である。より詳細に
は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載さ
れるポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温で実質的に
不活性化されない。そのような温度は、pH、ヌクレオチ
ド組成、プライマーの長さ、塩濃度および当該技術分野
で既知の別の条件を包含する多数の反応条件により変化
するだろう。
【００２５】数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが従
来技術文献に報告されており、それらには米国特許第
4,965,188号明細書（Gelfand 他）および米国特許第 4,
889,818号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されてい
るものが包含される。両方とも引用することにより本明
細書に組み入れられる。特に有用なポリメラーゼは、種
々のサーマス細菌種、例えば、サーマス・アクアティク
ス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス
（Thermus thermophilus）、サーマス・フィリホルミス
（Thermus filiformis）もしくはサーマス・フラバス
（Thermus flavus）より得られるものである。別の有用
な熱安定性ポリメラーゼが、サーモコッカス・リテラリ
ス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオ
サス（Pyrococcus furiosus ）、サーモトガ種（Thermo
toga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発
行）に記載のものを包含する種々の微生物源より得られ
る。幾つかの有用な熱安定性ポリメラーゼが市販されて
いる、例えば、アプリタック（AppliTaq）（商標）、テ
ィース（Tth ）、およびウルトマ（UlTma ）（商標）が
Perkin Elmerから、フー（Pfu ）がStratageneから、そ
してベント（Vent）およびディープベント（DeepVent）
がNew England Biolabs から市販されている。また、天
然のポリメラーゼを生物体から単離して、組換え技法を
用いて遺伝子工学酵素を生成するための数多くの技法が
既知である。
【００２６】ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターは、活
性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称す
る。従って、酵素はコファクターが存在しないと触媒的
に不活性である。限定されるものではないが、マンガン
塩およびマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢
酸塩および脂肪酸塩を包含する数多くのそのような物質
が既知コファクターである。マグネシウムの塩化物およ
び硫酸塩が好ましい。また、２種以上のデオキシリボヌ
クレオシド−５′−三燐酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰがＰＣＲに必要
とされる。類似体、例えば、ｄＩＴＰおよび７−デアザ
−ｄＧＴＰも有用である。好ましくは、４種の普通の三
燐酸塩（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐ）が一緒に使用される。
【００２７】本明細書中に記載されるＰＣＲ試薬は、標
的核酸を増幅させるのに適する濃度でＰＣＲに用いられ
る。増幅に必要とされるプライマー、ＤＮＡポリメラー
ゼ、コファクターおよびデオキシリボヌクレオシド−
５′−三燐酸の最低量、ならびに各々の適当な範囲は、
当該技術分野で周知である。一般的にはＤＮＡポリメラ
ーゼの最低量は少なくとも約０．５単位／１００μＬの
溶液であるが、約２〜約２５単位／１００μＬの溶液が
好ましく、約７〜約２０単位／１００μＬの溶液がより
好ましい。所定の増幅系には別の量が有用であるかもし
れない。「単位」は、３０分間に７４℃で総ヌクレオチ
ド（ｄＮＴＰ類）１０ナノモルを伸長核酸鎖に組み入れ
るのに必要とされる酵素活性の量として本明細書で定義
される。プライマーの最低量は、少なくとも約０．０７
５マイクロモル濃度であり、約０．１〜約２マイクロモ
ル濃度が好ましいが、別の量が当該技術分野で周知であ
る。一般的には、コファクターは約２〜約１５ミリモル
濃度の量で存在する。各ｄＮＴＰの量は、一般的には約
０．２５〜約３．５ミリモル濃度である。
【００２８】ＰＣＲ試薬は、個別に供給することもでき
るし、または種々の組合せで供給することもできるし、
あるいはすべて任意の適当な緩衝剤を用いて約７〜約９
の範囲のpHを有する緩衝液に含めて供給することもで
き、そのようなことの多くが当該技術分野で既知であ
る。ＰＣＲに使用できる別の試薬には、例えば、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体、エキソヌクレア
ーゼおよび／またはグリコシラーゼが含まれる。抗体を
使用して、増幅の前にポリメラーゼを阻害できる。本発
明に有用な抗体は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異
的であり、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を約５０℃よ
り下の温度で阻害し、そしてより高い温度で非活性化さ
れる。有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクロ
ーナル抗体および抗体断片が含まれる。好ましくは、抗
体がモノクローナルである。本発明に有用な抗体は、既
知方法、例えば、Harlow他，抗体：実験マニュアル（An
tibodies：A Laboratory Manual), Cold Spring Harbo
r, NY (1988) に記載のものを用いて調製できる。
【００２９】代表的なモノクローナル抗体は、米国特許
第 5,338,671号明細書（Scalice 他）に記載されてお
り、その内容は引用することにより本明細書に組み入れ
られる。２つのそのようなモノクローナル抗体が、従来
の方法、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）（Rockville, MD ）に寄託されて
いるハイブリドーマ・セルラインHB 11126もしくは1112
7 のいずれかを包含する出発物質を用いて当業者により
容易に得られる。モノクローナル抗体は、ＤＮＡポリメ
ラーゼに対するモル比約５：１〜約５００：１の量で存
在する。
【００３０】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗
体は、単独で、またはSutherland他により1995年 2月 7
日に出願された、「ポリメラーゼ連鎖反応における特異
性を増強するための、抗ポリメラーゼ抗体に対する捕捉
剤としてのエキソヌクレアーゼおよび／またはグルコシ
ラーゼの使用（Use of Exonuclease and/or Glycosylas
e as Supplements to Anti-Polymerase Antibody to In
crease Specificity in Polymerase Chain Reaction)」
と題する米国特許出願番号第 08/385,019 号明細書に記
載されているように、エキソヌクレアーゼおよび／また
はグリコシラーゼと組み合わせて本発明に使用すること
ができる。抗体、エキソヌクレアーゼおよびグリコシラ
ーゼを組み合わせて使用すると、ゼロ・サイクル・アー
チファクトの生成を低減する。ＰＣＲにおける使用に適
するエキソヌクレアーゼには、限定されるものではない
が、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼ
Ｉ、エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、リ
ボヌクレアーゼＩＩ、ポリヌクレオチド・ホスホリラー
ゼおよびＢＡＬ ３１ヌクレアーゼが含まれる。そのよ
うなエキソヌクレアーゼは、市販されているか、または
当該技術分野で既知の方法により得ることができる。本
発明に有用なグリコシラーゼは、通常のものとは異なる
塩基、すなわち、ＤＮＡ中のＡ、Ｇ、ＣもしくはＴなら
びにＲＮＡ中のＡ、Ｇ、ＣおよびＵ以外の塩基を特異的
に切断するものである。好ましいグリコシラーゼには、
ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサン
チン−ＤＮＡグリコシラーゼおよび３−メチアデニン−
ＤＮＡグリコシラーゼＩおよびＩＩが含まれる。好まし
い態様では、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ
に対するモノクローナル抗体、エキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉおよびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼが使用される。
【００３１】標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれ
か）は、任意の様々な前記供給源から得ることができ
る。一般的には、試料を何らかの方法で処理して、ＤＮ
Ａをプライマーおよび別のＰＣＲ試薬と接触可能にす
る。これは、通常、当該技術分野で既知である種々方法
の１つを用いて試料から望ましくないタンパク質および
細胞性物質を除去することを意味する。増幅し検出しよ
うとする核酸はしばしば二本鎖型であるので、プライミ
ングおよび増幅を行う前に二本鎖を分離（すなわち、変
性）しなければならない。変性は、熱処理のみ単独で用
いて、または従来技術文献に記載されるように鎖を分離
するための任意の別の適当な物理的、化学的もしくは酵
素的手段と組み合わせて用いて達成できる。初期変性
は、一般的には標的核酸を含有することが疑われる試料
を、約８５°〜約１００℃の第１温度で適当な時間、例
えば、約１秒間〜３分間加熱することにより実施され
る。
【００３２】次いで変性した鎖を、一般的には、鎖をプ
ライミングするために約５５°〜約７０℃の範囲内であ
る温度に冷却する。初期変性の後に鎖を冷却するのに要
する時間は、ＰＣＲ方法に使用される機器の型により変
化するだろう。一旦、変性した鎖を第２温度に冷却し、
ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物と共に変性した鎖を、
鎖に対するプライマーのアニーリング（ハイブリッド形
成）およびプライマーの伸長を行ってプライマー伸長生
成物を形成するのに適する温度でインキュベートする。
一般的には、この温度は、少なくとも約５０℃であり、
好ましくは約６２°〜約７５℃の範囲である。インキュ
ベーション時間は、インキュベーション温度および所望
の伸長生成物の長さにより広範に変化できるが、好まし
い態様では、約１〜約１２０秒間である。ＰＣＲの各サ
イクルは、２つまたは３つの異なる温度、１つは変性
用、そして第２または第３の温度はプライミングおよび
／またはプライマー伸長生成物形成用の温度のいずれか
を用いて実施できる。
【００３３】少なくとも１つのプライマー伸長生成物の
生成後の任意の時点で、増幅を停止し標的プライマー伸
長生成物（前記「増幅された標的」）を検出することが
できる。しかしながら、次いでハイブリッド形成された
プライマー伸長生成物を変性する場合、プライミング、
伸長および変性のサイクルを更に所望の回数、ＰＣＲを
実施できる。実施されるＰＣＲサイクルの回数は、幾
分、増幅された所望の標的の量によるであろうし、当業
者らにより容易に決定されうる。一般的には、少なくと
も２０回実施され、２０〜５０回が好ましい。
【００３４】複数の標的核酸を増幅するとき、特に標的
の一方がより低いコピー数の標的でありかつ一方が高い
コピー数の標的である場合、Backus他により1994年 6月
6日に出願され、「中間復元段階を用いる増幅方法（Me
thod of Amplification Using Intermediate Renaturat
ion Step）」と題する米国特許出願番号第08/264,102号
明細書に記載されたように、第２の復元段階を第１ＰＣ
Ｒサイクルを実施した後に使用することができる。少な
くとも１５回の第１増幅サイクルの後（第１増幅サイク
ルは変性、プライミングおよび伸長を含む）、各変性段
階後かつプライマー・アニーリング前に復元段階が含ま
れていることを除いて同じ段階を有する第２増幅サイク
ルを実施する。復元は、米国特許出願番号第08/264,102
号明細書に記載されたように、反応混合物を第４温度に
冷却することにより達成される。
【００３５】本発明では、所望の回数ＰＣＲサイクルを
用いて標的核酸を増幅した後、増幅後，検出前インキュ
ベーション段階を行ってＤＮＡポリメラーゼを不活性化
し、それにより検出感度を増大する。増幅後インキュベ
ーション段階を実施する際の条件は、使用される熱安定
性酵素に依存するが、温度およびインキュベーション期
間を組み合わせて酵素を不活性化するようなものである
だろう。好ましくは、この増幅後インキュベーション段
階が、増幅された標的を含有するＰＣＲ増幅混合物を約
９５℃〜約１２０℃の温度で約１秒間〜約３０分間イン
キュベートすることにより実施される。好ましくは、増
幅後インキュベーション段階が、１００℃〜１１０℃の
温度で１５秒間〜１０分間、より好ましくは約１０５℃
の温度で５分間以下加熱することを含む。
【００３６】一度、増幅後インキュベーションを行う
と、増幅された核酸標的を検出できる。検出は、数多く
の既知方法、例えば、米国特許第 4,965,188号明細書
（Gelfand 他）に記載されたもので達成できる。例え
ば、増幅された核酸を、サザン・ブロッティング、ドッ
ト・ブロット法または標識されたプローブを用いて非同
位体オリゴヌクレオチド捕捉検出を用いて検出できる。
あるいは、適当に標識されたプライマーを用いて増幅を
実施することができ、そして標識を検出するための方法
及び装置を用いて、増幅されたプライマー伸長生成物を
検出できる。
【００３７】好ましい態様では、増幅された標的核酸
が、検出のために標識され、かつ増幅された標的と直接
的または間接的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレ
オチド・プローブを用いて検出される。プローブは、可
溶性であってもまたは固形支持体に付着していてもよ
い。別の好ましい態様では、標的核酸を増幅するのに用
いられる１つ以上のプライマーが、例えば、特異的バイ
ンディング部分で標識される。標識されたプライマーが
組み入れられている得られたプライマー伸長生成物は、
プローブで捕捉することができる。プローブとハイブリ
ッド形成した増幅された標的の検出は、当該技術分野で
周知である適当な検出装置および方法を用いて、標識さ
れたプローブもしくは標識され増幅された標的の存在を
検出することにより達成できる。検出装置を使用するこ
となく、所定の標識を目視可能にしてもよい。
【００３８】より好ましい態様では、標的核酸を増幅す
るのに使用される１つ以上のプライマーをビオチンで標
識し、そしてビオチニル化され増幅された標識核酸を、
固形支持体に付着されたプローブに対してハイブリッド
形成させる。次いで結合した標的を、酸化剤、例えば、
過酸化水素および適当な色素生成性組成物の存在下スト
レプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させる
ことにより、それらを検出する。例えば、有用な色素提
供性試薬には、テトラメチルベンジジンおよびその誘導
体、ならびにロイコ色素、例えば、米国特許第 4,089,7
47号明細書（Bruschi ）に記載されたようなトリアリー
ルイミダゾールロイコ色素が含まれる。
【００３９】本明細書中で用いられる語句「約」が時間
に関する場合、その制限時間の±１０％を意味する。温
度に関して用いられる場合、語句「約」は±５℃を意味
する。以下の実施例は、本発明の実施を具体的に示すた
めに含めるものであって、いずれにしても限定すること
を意味するものではない。すべてのパーセンテージは、
特に断らないかぎり重量パーセントである。
【００４０】
【実施例】材料 サーマス・アクアティクス由来の組換えＤＮＡポリメラ
ーゼは、既知方法、例えば、EP-A-0 482 714に記載され
たものを用いて調製したものであり、約２５０，０００
単位／タンパク質１mgの活性を有するものであった。
【００４１】以下の実施例で用いたプライマーは、以下
の配列を有するものであった。 ５′−CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT −３′（配列番号：１） ５′−TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT −３′（配列番号：２） 捕捉プローブは以下の配列を有する。 ５′−GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG−３′（配列番号：３） 以下の実施例で用いたプライマー及びプローブは、標準
ホスホルアミダイト化学及びABI １μモル濃度スケー
ル、第１サイクル・プロトコールを用いてApplied Bios
ystems Model 380B ，スリー・カラムＤＮＡ合成器（th
ree column DNA synthesizer）を使用して、既知出発物
質及び方法を用いて調製した。制御された孔質ガラス支
持体（controlled pore glass supports）に導入された
ヌクレオシド−３′−ホスホルアミダイト及びヌクレオ
シドは、Applied Biosystemsより入手した。プライマー
は先に同定した配列を有するものであった。それらを、
米国特許第 4,962,029号明細書に従って５′末端を２つ
のアミノテトラエチレングリコール・スペーサーで機能
化し、続いて１つのDuPont市販のビオチンホスホルアミ
ダイトで機能化した。プローブは、３′末端を２つのテ
トラエチレングリコール・スペーサーで機能化し、続い
て米国特許第 4,914,210号明細書に従って１つのアミノ
ジオール連結基で機能化した。核酸精製カラム、続いて
逆相ＨＰＬＣ技法を用いて、すべての精製を実施した。
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ類）は、Sigma Ch
emical Co.より入手した。
【００４２】ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接
合体溶液は、市販（Sigma ChemicalCo.) のストレプト
アビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの接合体、カゼ
イン（ 0.5％）およびメルチオレート（ 0.5％）を燐酸
緩衝溶液（２４ミリモル濃度の燐酸ナトリウムおよび７
５ミリモル濃度の塩化ナトリウム）に含むものを用い
た。１０ミリモル濃度の４′−ヒドロキシアセトアニリ
ドを接合体安定剤として添加した。実施例１および２で
は、最終接合体濃度は１．１nMであった。実施例３で
は、最終接合体濃度は０．２８nMであった。
【００４３】サイトメガロウイルス、菌株AD 169ＤＮＡ
は、Applied Biotechnology Inc.より受け取った。簡単
には、従来の方法を用いてヒト包皮線維芽細胞セルライ
ンからＤＮＡを抽出した。ウイルス・ロット明細書 ウイルス：サイトメガロウイルス，菌株AD 169 増殖のセルライン：ヒト包皮線維芽細胞 ウイルス調製：ショ糖密度勾配精製，１０００×濃縮 ウイルス粒子カウント：１０００×で１．６５×１０10
vp/mL 活性ウイルスにおけるＴＣＩＤ50力価：１０００×で１
０7 ＴＣＩＤ50単位／mLＤＮＡ抽出明細書 容量：０．１mL 懸濁緩衝液：１０mMトリス／１mMＥＤＴＡ，pH８．０ 抽出法：ＳＤＳ、プロテイナーゼＫ消化、続いてフェノ
ール／クロロホルム抽出そしてエタノール沈殿。１mLの
抽出物を１mLの精製ウイルスから調製した。 輸送および保管：６×０．１mLを−７０℃で凍結して輸
送した。−２０℃以下で保管した。
【００４４】ロイコ色素分散体は、アガロース（０．５
％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−
２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダ
ゾールロイコ色素（２５０マイクロモル濃度）、ジエチ
レントリアミン五酢酸（１００マイクロモル濃度）、
３′−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミ
リモル濃度）、ポリビニルピロリドン（１１２ミリモル
濃度）、および燐酸ナトリウム，一塩基性，一水和物
（10ミリモル濃度）、ならびに過酸化水素（Ｈ2 Ｏ 2 ）
（８．８２ミリモル濃度）を含有するものであった。
【００４５】洗浄溶液（pH７．４）は、塩化ナトリウム
（３７３ミリモル濃度）、（エチレンジニトリロ）四酢
酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル濃度）、デシル硫酸
ナトリウム（３８ミリモル濃度）およびエチルセリチオ
サリチル酸ナトリウム塩（２５マイクロモル濃度）を燐
酸ナトリウム，一塩基性一水和物緩衝液（２５ミリモル
濃度）に含有するものであった。モノクローナル抗体を
反応混合物に用いた。これらの抗体「ＴＰ１−１２．
２」および「ＴＰ４−９．２」は、サーマス・アクアテ
ィクス由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、Suth
erland他により1995年 2月 7日に出願され、「ポリメラ
ーゼ連鎖反応における特異性を増強するための抗ポリメ
ラーゼ抗体に対する捕捉剤としてのエキソヌクレアーゼ
および／またはグリコシラーゼの使用（Useof Exonucle
ase and/or Glycosylase as Supplements to Anti-Poly
merase Antibody to Increase Specificity in Polymer
ase Chain Reaction)」と題する米国特許出願番号第 08
/385,019 号明細書により詳細に記載されている。
【００４６】ポリメラーゼ連鎖反応混合物（７５mL）に
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（１０ミリモル濃度，pH８）、塩化カリウム（５０ミリ
モル濃度）、塩化マグネシウム（４ミリモル濃度）、ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各々０．
３mM）、配列番号：１および配列番号：２のプライマー
（各々０．４マイクロモル濃度）、ＩＶ型ゼラチン（１
００mg/mL ）、Ｔａｑポリメラーゼ（１６単位／１００
μL ）、およびグリセロール（９．５％）を含有するも
のであった。モル濃度が５０倍過剰な（ポリメラーゼを
越える）ＴＰ１−１２．２および５×過剰なＴＰ４−
９．２を用いた。ＰＣＲ増幅は、米国特許第 5,089,233
号明細書に記載の自動ＰＣＲ処理装置を用いて実施し
た。
【００４７】捕捉試薬を形成するために、従来の乳化重
合法を用いてポリ〔スチレン−コ−３（ｐ−ビニルベン
ジルチオ）プロピオン酸〕（重量比９５：５，平均直径
１μm ）から調製したポリマー粒子（平均直径１μm ）
にプローブを共有結合させた。粒子の水への懸濁液を２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１
モル濃度，pH６）で洗浄し、そして約１０％固体になる
ように懸濁した。洗浄した粒子の試料（３．３mL）を、
緩衝液（０．１モル濃度）中３．３３％固体になるよう
に希釈し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミド ヒドロクロリド（８４mg/mL の
水溶液を２．１mL）およびプローブ（４４．４４OD/mL
のナノピュア水で調製したものを９８３μL ）を混合し
た。得られた懸濁液を水浴中５０℃で約２時間時々混ぜ
ながら加熱し、そして遠心分離した。次いで粒子を、
（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（０．０
０１モル濃度）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（０．０１モル濃度，pH８）で３回
洗浄し、そして４％固体となるように再懸濁した。次い
で粒子を、膠を加えて２％固体の状態で臨床診断用（Cl
inical Diagnostic's)ＰＣＲパウチの不連続なスポット
に固定化した。ＰＣＲ生成物を、臨床診断用パウチ検出
システムを用いて検出した。別の試薬および材料は、商
業的供給源から入手するか、または容易に入手可能な出
発物質および従来の方法を用いて調製した。
【００４８】検出感度を増強するための生成物検出前の
増幅後インキュベーション段階 実施例１ 本実施例は、ＰＣＲを用いて生成された核酸生成物を、
増幅後インキュベーション段階を使用して、ポリメラー
ゼを変性することにより検出する本発明を具体的に示す
ものである。陽性プールは、以下のＰＣＲプロトコール
を４０〜４５サイクル用いてＣＭＶ標的を増幅すること
により生成した。 １．９５℃で１５秒間加熱することによる変性、そして ２．７０℃で３０秒間プライミングおよび伸長するサイ
クル。 生成物濃度は、既知濃度のＤＮＡ鎖と共にゲル電気泳動
することにより定量した。次いで、得られた増幅後ＰＣ
Ｒ反応混合物を下記のように用いた。
【００４９】ＰＣＲ後反応混合物を生成することに加え
て、前記ＰＣＲプロトコールを用いてＣＭＶ ＤＮＡ標
的を添加していないＰＣＲ反応混合物でＰＣＲ増幅を実
施することにより、ＣＭＶ陰性生成物プールを調製し
た。増幅後ＰＣＲ反応混合物（１０-7〜１０-8M ）を、
ＣＭＶ陰性生成物プールで１：１００〜１：５０００に
希釈して最終ＣＭＶ ＤＮＡ濃度が１×１０-10 M、
２．５×１０-11 M 、または５×１０-11 M となるよう
にした。次いで希釈した増幅後ＰＣＲ反応混合物を、増
幅後インキュベーションにかけてポリメラーゼを不活性
化した。増幅後インキュベーション段階を２分間９７℃
もしくは１００℃で、または５分間１００℃で実施し
た。
【００５０】増幅後インキュベーションの後に、５８℃
で５分間臨床診断用ＰＣＲパウチの内部で捕捉試薬を用
いて標的核酸を捕捉することにより、増幅された生成物
を検出した。次いで捕捉された生成物を、５５℃で１分
間ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液と
接触させてインキュベートした。洗浄溶液を用いて１分
間５５℃で洗浄を実施し、その後色素提供性組成物を添
加し、そして４分間４０℃でインキュベートした。得ら
れた信号を線配列スキャナーで読み取った。スキャナー
は反射率濃度（ΔＤｒ）の変化を測定した。ΔＤｒは、
色素発色開始前の初期読み取り値と色素発色４分後の最
終読み取り値との間の反射率濃度における差である。目
視的に陰性な捕捉ビーズにおけるスキャナーのバックグ
ラウンドは、０．０５〜０．１Ｄｒ単位の範囲であっ
た。
【００５１】以下の結果は、増幅後インキュベーション
段階が検出感度を増強することを示している。 増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ （スキャナー） ９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１７５ ９７℃で２分間 ５×１０-11 M ０．１４ ９７℃で２分間 ２．５×１０-11 M ０．１１ １００℃で２分間 １×１０-10 M ０．２６５ １００℃で２分間 ５×１０-11 M ０．１９ １００℃で２分間 ２．５×１０-11 M ０．１３ １００℃で５分間 １×１０-10 M ０．４３５ １００℃で５分間 ５×１０-11 M ０．３１ １００℃で５分間 ２．５×１０-11 M ０．２１
【００５２】これらの結果は、１００℃で５分間増幅後
インキュベーション段階を行うと、バックグラウンドを
越えて少なくとも４倍そして恐らく少なくとも５倍有効
検出限界を増強することを示している。これらの結果に
基づいて、特に、１００℃でのインキュベーション期間
を２分間から５分間に増加することによる改良の結果に
基づいて、第２実験は、増幅後インキュベーションを１
００℃で１５分間実施した。
【００５３】実施例２ この第２実験では、ＣＭＶ ＤＮＡの増幅を、実施例１
に記載されたように実施した。実施例１に記載したよう
に、得られた増幅後ＰＣＲ反応混合物を、ＣＭＶ陰性生
成物プールで希釈し、増幅後インキュベーションにかけ
てポリメラーゼを不活性化した。増幅後インキュベーシ
ョン段階を１５分間１００℃で実施した。増幅後インキ
ュベーションの後に、実施例１に記載したように増幅さ
れた生成物を検出した。以下の結果は、増幅後インキュ
ベーション段階が検出感度を増強することを示してい
る。 増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ （スキャナー） ９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１４０ ９７℃で２分間 １×１０-10 M ０．１２２ １００℃で５分間 １×１０-10 M ０．３３６ １００℃で５分間 １×１０-10 M ０．３４６ １００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．５０３ １００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．４８０ これらの結果は、１００℃での増幅後インキュベーショ
ン時間を増加すると、更なる利益が得られることを示唆
している。
【００５４】実施例３ インキュベーション温度を増加することにより更なる検
出感度向上が実現できるかどうか測定するために、ＣＭ
Ｖ ＤＮＡの増幅を、実施例１に記載されたように実施
し、１００℃もしくは１０３℃で増幅後インキュベーシ
ョンを行った。１０３℃で様々なインキュベーション時
間について調査した。加えて、最終接合体濃度もしくは
０．２８nM の低感度検出化学についてこの実験を実施
した。この実験の結果は以下のとおりであった。 増幅後インキュベーション条件 生成物濃度 ＣＭＶ ΔＤｒ （スキャナー） １００℃で５分間 １×１０-10 M ０．１５２ １００℃で１５分間 １×１０-10 M ０．２７０ １０３℃で２分間 １×１０-10 M ０．２６４ １０３℃で５分間 １×１０-10 M ０．３１８ これらの結果は、少なくとも更に２倍増強そして恐らく
３倍増強が、増幅後インキュベーション段階温度を１０
０℃から１０３℃に増加することにより、そして５分間
インキュベーション期間を維持することにより達成され
うることを具体的に示している。
【００５５】以上本明細書中に言及したすべての刊行物
は、これにより引用することによって組み入れられる。
前記本発明を、明瞭にし理解する目的で幾らか詳細に記
載してきたが、様式および細部の様々な変化が本発明の
真の範囲から逸脱することなく可能であることは、この
開示の解釈から当業者らに認められるだろう。
【００５６】
【配列表】
（１）一般情報 （ｉ）出願人：バッカス，ジョン ダブリュ．（Backu
s, John W. ） クラマー，マルシア エル．（Kramer, Marcia L. ） ファルボ，ジョセフ（Falvo, Joseph ） （ｉｉ）発明の名称：標的核酸を増幅して検出するため
の方法 （ｉｉｉ）配列の数：３ （ｉｖ）通信用住所： （Ａ）名宛人：ステーシア エル．オグデン（Stasia
L. Ogden ） （Ｂ）ストリート：ワン ジェイアンドジェイ プラザ
（One J&J Plaza ） （Ｃ）シティー：ニューブロンスウィック（New Brunsw
ick ） （Ｄ）ステート：ニュージャージー（New Jersey） （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：０８９３３ （ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換性 （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース（Pate
nt In Release ）＃１．０，バージョン＃１．２５ （ｖｉ）最新の出願データ： （Ａ）出願数： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／代理業者情報 （Ａ）氏名：オグデン，ステーシア エル．（Ogden, S
tasia L.） （Ｂ）登録番号：３６，２２８ （Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＤＳ−９２ （ｉｘ）遠距離通信情報： （Ａ）電話：９０８−５２４−２８１９ （Ｂ）テレファックス：９０８−５２４−２８０８
【００５７】配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（genomic ） 配列 CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT 25
【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（genomic ） 配列 TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT 25
【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（genomic ） 配列 GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG 30
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルシア リン クラマー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14615, ロチェスター，ラモナ パーク 50−ジー (72)発明者 ジョセフ ファルボ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，スタントン レーン 192

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試
    料を、前記標的核酸の一部分に実質的に相補的である少
    なくとも２種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性増幅
    酵素と、前記標的核酸が増幅されるような条件下で接触
    させる工程、 （ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を
    形成する工程、 （ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記
    試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュ
    ベートして、前記熱安定性増幅酵素を不活性化する工
    程、並びに （ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在
    を検出する工程、を含む、標的核酸を増幅して検出する
    ための方法。
  2. 【請求項２】 ４種のオリゴヌクレオチドおよび熱安定
    性ＤＮＡリガーゼを使用する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 （ｉ）標的核酸を含有すると疑われる試
    料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼ、および前記標的核酸に実質的に相補的
    である２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅される
    ような条件下で接触させる工程、 （ｉｉ）増幅された標的核酸を変性して、一本鎖核酸を
    形成する工程、 （ｉｉｉ）増幅後インキュベーション工程として、前記
    試料を１秒間〜３０分間、９５℃〜１２０℃でインキュ
    ベートして、前記重合剤を不活性化する工程、並びに （ｉｖ）前記増幅された標的核酸の存在もしくは不存在
    を検出する工程、を含む、標的核酸を増幅して検出する
    ための方法。
  4. 【請求項４】 前記増幅後インキュベーション工程を、
    １５秒間〜１０分間、１００℃〜１１０℃で実施する、
    請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記増幅後インキュベーション工程を、
    ０．５分間〜５分間、約１０５℃で実施する、請求項３
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであ
    る、請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記標的核酸がＤＮＡである、請求項６
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記標的核酸がＲＮＡである、請求項６
    に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ヌクレオシド三燐酸がデオキシリボ
    ヌクレオシド三燐酸である、請求項３に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記デオキシリボヌクレオシド三燐酸
    が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰであ
    る、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、
    サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus ）ポリ
    メラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermo
    philus）ポリメラーゼおよびサーモコッカス・リトラリ
    ス（Thermococcus litoralis）ポリメラーゼからなる群
    より選択される、請求項３に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記プライマーの少なくとも一方が標
    識されている、請求項３に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記プライマーが標識されている、請
    求項３に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記プライマーの少なくとも一方が、
    特異的バインディング・リガンドで標識されている、請
    求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記特異的バインディング・リガンド
    がビオチンである、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記増幅された標的核酸を、１種以上
    の標的核酸のうちの１つとハイブリダイズし得る標識さ
    れたプローブを用いて検出する、請求項３に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】 前記標識されたプローブを、固形支持
    体に付着してある、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記プライマーの少なくとも一方を、
    特異的バインディング部分で標識し、そして前記増幅さ
    れた標的核酸を、１種以上の標的核酸のうちの１つとハ
    イブリダイズし得るプローブを用いて検出する、請求項
    ３に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記プローブを、固形支持体に付着し
    てある、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 （ｉ）標的核酸を含有すると疑われる
    試料を、異なる４種のヌクレオシド三燐酸、熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメラーゼ、および少なくとも一方がビオチンで
    標識されており且ついずれも前記標的核酸に実質的に相
    補的である２種のプライマーと、前記標的核酸が増幅さ
    れるような条件下で接触させる工程、 （ｉｉ）増幅後インキュベーション段階として、前記試
    料を０．５分間〜５分間、約１０５℃でインキュベート
    して、前記ポリメラーゼを不活性化する工程、並びに （ｉｉｉ）前記ビオチニル化され増幅された標的核酸
    を、ストレプトアビジン酵素接合体と反応させ、続いて
    前記酵素を基質試薬と反応させて、検出可能な比色また
    は化学ルミネセンス信号を生成することにより、前記ビ
    オチニル化され増幅された標的核酸の存在もしくは不存
    在を検出する工程、を含む、標的核酸を増幅して検出す
    るための方法。
  21. 【請求項２１】 前記ビオチニル化され増幅された標的
    核酸を、アビジン−ペルオキシダーゼ接合体を接触さ
    せ、続いて酸化剤の存在下、ペルオキシダーゼをルミノ
    ールと反応させて検出可能な化学ルミネセンス信号を生
    成するか、またはロイコ色素と反応させて検出可能な比
    色信号を生成することにより、前記ビオチニル化され増
    幅された標的核酸を検出する、請求項２０に記載の方
    法。
JP05633797A 1996-03-11 1997-03-11 標的核酸を増幅して検出するための方法 Expired - Fee Related JP5000794B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61357196A 1996-03-11 1996-03-11
US08/613571 1996-03-11

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012019550A Division JP2012105663A (ja) 1996-03-11 2012-02-01 標的核酸を増幅して検出するための方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH1033198A true JPH1033198A (ja) 1998-02-10
JP5000794B2 JP5000794B2 (ja) 2012-08-15

Family

ID=24457826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP05633797A Expired - Fee Related JP5000794B2 (ja) 1996-03-11 1997-03-11 標的核酸を増幅して検出するための方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6280930B1 (ja)
EP (1) EP0795612B1 (ja)
JP (1) JP5000794B2 (ja)
KR (1) KR100442196B1 (ja)
CN (1) CN1309838C (ja)
AT (1) ATE248928T1 (ja)
AU (1) AU1514397A (ja)
CA (1) CA2199213C (ja)
DE (1) DE69724487T2 (ja)
DK (1) DK0795612T3 (ja)
ES (1) ES2205121T3 (ja)
NO (1) NO324530B1 (ja)
PT (1) PT795612E (ja)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPO524897A0 (en) * 1997-02-21 1997-03-20 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Method of amplifying specific nucleic acid target sequences
US6558901B1 (en) * 1997-05-02 2003-05-06 Biomerieux Vitek Nucleic acid assays
IL124275A (en) * 1997-05-02 2002-03-10 Bio Merieux Vitek Inc A method to produce sequences of nucleic acids
NZ528967A (en) 1999-06-22 2005-03-24 Invitrogen Corp Improved primers and methods for the amplification and discrimination of nucleic acids
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US8841069B2 (en) * 2005-12-29 2014-09-23 Korea Materials & Analysis Corporation Dendron-mediated DNA virus detection
ATE463585T1 (de) * 2005-12-29 2010-04-15 Ind Cooperation Agency Ein-schritt-diagnose mit dna-chip
GB0806041D0 (en) 2008-04-03 2008-05-14 Genomica S A Method for detection of herpesvirus in test sample
CN112322793A (zh) * 2020-11-30 2021-02-05 中国科学院化学研究所 一种基于ccp-fret的rna病毒快速检测的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5635347A (en) * 1986-04-30 1997-06-03 Igen, Inc. Rapid assays for amplification products
CA1317535C (en) 1987-06-30 1993-05-11 Nanibhushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
US5229297A (en) * 1989-02-03 1993-07-20 Eastman Kodak Company Containment cuvette for PCR and method of use
ATE151112T1 (de) * 1989-12-22 1997-04-15 Hoffmann La Roche Bei hoher temperatur aktive reverse transkriptasen
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5344045A (en) * 1990-12-17 1994-09-06 The Coca-Cola Company Liquid container system
CA2065719A1 (en) * 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
IT1255737B (it) * 1992-05-19 1995-11-15 Reattore multitubolare a film cadente
WO1994003635A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Institute Of Molecular Biology & Biotechnology Rapid amplification and detection of nucleic acids
US5645801A (en) * 1993-10-21 1997-07-08 Abbott Laboratories Device and method for amplifying and detecting target nucleic acids
JP3102800B2 (ja) * 1994-08-19 2000-10-23 パーキン−エルマー コーポレイション 増幅及び連結反応の共役法

Also Published As

Publication number Publication date
DE69724487D1 (de) 2003-10-09
NO324530B1 (no) 2007-11-12
CN1309838C (zh) 2007-04-11
CA2199213A1 (en) 1997-09-11
CN1165862A (zh) 1997-11-26
KR100442196B1 (ko) 2004-11-20
CA2199213C (en) 2007-04-17
EP0795612A3 (en) 1999-03-24
PT795612E (pt) 2004-02-27
KR970065730A (ko) 1997-10-13
EP0795612A2 (en) 1997-09-17
JP5000794B2 (ja) 2012-08-15
DE69724487T2 (de) 2004-07-01
DK0795612T3 (da) 2003-12-15
NO971086L (no) 1997-09-12
US6280930B1 (en) 2001-08-28
ATE248928T1 (de) 2003-09-15
NO971086D0 (no) 1997-03-10
AU1514397A (en) 1997-09-18
EP0795612B1 (en) 2003-09-03
ES2205121T3 (es) 2004-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6001558A (en) Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2
EP0592035B1 (en) Thermostable DNA polymerase composition comprising a temperature sensitive polymerase inhibitor, diagnostic test kits and methods of use
JP3514630B2 (ja) 核酸配列の増幅および検出
US5403707A (en) Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures
US6936415B1 (en) Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of two or more DNA's using primers having matched melting temperatures
JP2003510017A (ja) 核酸の検出および識別のために改良されたプライマーおよび方法
JP4298814B2 (ja) 播種性マイコバクテリウム・アビウム複合体感染を検出するための多重化ｐｃｒアッセイ
JP3426262B2 (ja) 迅速なｐｃｒサイクルを用いる核酸の増幅方法及び検出方法
JP4047395B2 (ja) 核酸の同時増幅方法
JP5000794B2 (ja) 標的核酸を増幅して検出するための方法
JPH06319597A (ja) 似通った融点を有する２つ以上のｄｎａを増幅及び検出するための診断用組成物、要素、方法並びに試験キット
JPH04229200A (ja) 改良ｌｃｒ法
JPH1118785A (ja) ナイセリア・コノルホエア−特異的オリゴヌクレオチド
US5559013A (en) Method of amplification using intermediate renaturation step
AU768981B2 (en) Amplifying and detecting target nucleic acids using a post amplification incubation step
JP2012105663A (ja) 標的核酸を増幅して検出するための方法
JPH074275B2 (ja) 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット
EP0586011A2 (en) Methods for production and amplification of nucleic acids
KR20240023114A (ko) Lida(lesion induced dna amplification)에 의한 sars-cov-2 분석

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20040218

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20071113

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080212

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080215

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080509

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090804

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091127

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20091211

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20100226

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110112

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110117

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20111101

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111107

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120201

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120314

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120517

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150525

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees