HUT69772A - Nucletic acid amplification by two-enzyme, self-sustrained sequence replication - Google Patents

Description

TECHNIKAI TERÜLET

Jelen találmány általánosságban nukleinsav mintákban lévő kijelölt nukleinsav részletek szaporításához szükséges eszközökre és módszerekre vonatkozik.

Továbbá, a találmány a módszerek és eszközök alkalmazásaival is foglalkozik a molekuláris biológia, a molekuláris genetika és a nukleinsav hibridizációs vizsgálatok területén, beleértve utóbbiak alkalmazását az orvosi diagnosztikában.

A TALÁLMÁNY HÁTTERE

Sok molekuláris biológiai és molekuláris genetikai feladat megoldásakor és ezek alkalmazása során - mint például a nukleinsav hibridizációs vizsgálatok esetén, amikor vérrel közvetített kórokozók vagy sérült gének kimutatásával betegségeket diagnosztizálunk - egy maghatározott nukleinsav szekvenciát (pontosabban, egy meghatározott szekvenciájú nukleinsav részletet) detektálunk vagy izolálunk egy olyan közegből, ahol igen nagy számú különböző, időnként hasonló szekvenciájú-és azonos vagy közel azonos méretű molekula található.

Alapvető probléma egy ilyen munkánál, hogy egy ilyen közegben hogyan detektáljuk vagy izoláljuk, s ha lehetséges, mennyiségileg is meghatározzuk a szóbanforgó nukleinsav szekvenciát. A probléma mindig is nehéz volt, hiszen a biológiai anyagok, mint például a sejtkultúrák, a szöveti- és vérminták, melyekben azok a vizsgálandó nukleinsav keverékek találhatók, amelyeknek egy meghatározott részét kell vizsgáljuk vagy egy meghatározott részét kell izoláljuk, jellemző módon, összetett RNS- és DNS keverékekből állnak, melyeknek csak egy töredéknyi frakciójában található a vizsgálat szempontjából érdekes molekularészlet.

Két alapvetően különböző megközelítésmód alapján vázolható egy összetett nukleinsav keverékben alacsony koncentrációban található adott nukleinsav részlet (cél szegmentum) kimutatásának vagy klónozást követő izolálásának problematikája.

Az első megközelítésben az analizálandó nukleinsav mintában lévő nukleinsav mennyiséget (ami a cél szegmentumot tartalmazza) változatlanul hagyjuk; s a célszegmentummal összekapcsolunk egy jel előállító rendszert, mely olyan érzékelhető jelet produkál, amely jellemző a cél szegmentum mintában való jelenlétére vagy másolatainak darabszámára. Például, egy úgynevezett kereső nukleinsavat - amely a cél szegmentummal vagy annak legalábbis egy alszegmentumával komplementer szekvenciájú és hozzákapcsoltuk egy enzimhez, például egy alkalikus foszfatázhoz - összehozunk a mintával hibridizációs körülmények között, melynek hatására a kereső nukleinsav lánc és a cél szegmentum hibridizálódnak, és ugyanakkor a lánc és a minta egyéb nukleinsav régiói között nem jön létre érzékelhető kapcsolat. Miután eltávolítottuk a nem hibridizálódott kereső láncokat, a rendszerhez hozzáadjuk az enzim egy szubsztrátját (pl. az alkalikus foszfatáz egyik kromogén szubsztrátját) olyan körülmények biztosítása mellett, melyek lehetővé teszik az enzimes katalízis végbemenetelét, így tehát elvileg az enzimes reakcióban nagy mennyiségben és gyorsan - a cél szegmentummal hibridizálódott összes kereső molekulára vonatkozóan - képződnek analizálható anyagok (az alkalikus foszfatáz kromogén szubsztrátja esetén színes molekulák).

Számos további módszer ismeretes, melyekkel nukleinsav részleteket úgy lehet azonosítani, hogy közben a minta cél nukleinsavának mennyiségét nem változtatjuk • · · · • · · · * J · · meg. Például, azonosítottak célzott nukleinsav régiókat hibridizációs alapon úgy is, hogy a bevitt kereső nukleinsav láncot radioaktív izotóppal (pl. P-32) vagy fluoreszcensz csoporttal jeleölték meg. Továbbá, ismeretes egy olyan kereső nukleinsav láncmolekuía is, mely egy autokatalitikusan replikálódó RNS molekulából áll (pl. egy olyan RNS-ből, mely szubsztrátja a bróm mozaik vírus (BMV, lásd Miele et al., J.Mól.Bioi. 171, 281 (1983)) vagy a QB fág RNS-dependens RNS polimerázának) vagy ehhez van hozzákapcsolva, és miután hibridizáltattuk a láncot a mintában lévő nukleinsavval és kimostuk a nem hibridizálódott kereső láncmolekulákat a mintából, beindítjuk a replikációra képes RNS replikációját a megfelelő RNS polimeráz felhasználásával, és, végezetül, azonosítjuk a replikálódott RNS molekulákat. Egy olyan rendszert, amelyben egy cél szegmentumot kereső láncmolekula egy olyan RNS-hez van kötve, amelyik a QB replikáz által replikációra képes, közölt Chu et al., Nucl.Acids Rés. 14, 5591 (1986) és United States Patent No. 4,957,858, illetve, amelyik a BMV replikáz által replikálódik, azt közölte Marsh et al., Positive Strand RNV Viruses (Proceedings of 1986 UCLA Symposium), Alán R. Liss Publ. Co., New York, New York (1987).

Ezen első megközelítésmódnál, melyben tehát egy adott célszekvenciára vonatkozó jeleket erősítünk fel, két súlyos hátránnyal kell számolnunk. Először is, igen sokszor, a gyakorlati szempontból releváns méretű mintákban a cél szegmentum másolatok száma olyan kevés, hogy - még a meglehetősen gyors jelelöállító rendszereknél is az az idő, ami ahhoz kell, hogy szignifikánsan az alapvonal fölött megjelenő mérhető jelet kapjunk, a gyakorlat szempontjából túl hosszú. Másodszor, egy cél szegmentumra vonatkozó bármilyen vizsgálatnál, elkerülhetetlenül fellép egy, a háttérnek betudható jel. Egy olyan rendszerben, ahol jelerösítés van, a jel előállítása és felerősítése - a dolog lényegéből fakadóan - ugyanolyan sebességgel ··· · • · • · · történik a háttérben meghúzódó jelképző molekulák (pl. olyan kereső molekulák, amelyek a célszegmentum szekvenciájához nagyon hasonló, de azzal nem azonos szekvenciájú szegmentumokkal hibridizálódtak; a rendszerben lévő üveg, műanyag vagy egyéb részekhez tapadt kereső molekulák; stb.) révén, mint a célszekvenciával ténylegesen összekapcsolódó jelképző molekulák által. Mindezek miatt, az első megközelítésmód szerinti vizsgálatok érzékenységét alapvetően behatárolják a háttér elkerülhetetlenül jelenlévő jelképző molekulái.

A második megközelítésmód alapvetően különböző. Magában foglalja a cél szegmentum másolatai számának növelését, előnyös módon lehetőleg egy olyan mértékig, ami már nagyobb a mintában lévő egyéb szegmentum-kópiák számánál, elsősorban azokénál, amelyeket - hibás módon - cél szegmentumokként érzékelhetünk a szekvenciák közötti hasonlóságok miatt.

Ezen második megközelítésre vonatkozó példák közé tartoznak azok a különböző sejtkultúrás technikák, amelyek a cél molekularészleteket tartalmazó sejtek számának növekedését beindítják, alkalmasint gyorsabban, mint más sejtekét, vagy amelyekben a cél szegmentumot tartalmazó meghatározott nukleinsavak (pl. plazmidok, RNS-ek) számának növekedése indul be.

Egy másik példa ezen második megközelítésre a DNS cél szegmentum szaporítása az úgynevezett polimeráz láncreakcióban (PCR). Ez az eljárás a replikáció során természetes módon zajló, és régóta ismert folyamatok - például bizonyos, egyesszálú DNS-t tartalmazó vírusok genomjai replikációjának - adaptációja és az összes lépését tekintve hasonló az alábbi DNS előállításokkal: Hong, Bioscience Reports 1,243 (1981); Cooke et al., J.Bioi.Chem. 255, 6502 (1980); és Zoller et al.,

I * ···«*···

Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983). A POR eljárás során egy meghatározott szegmens kópiáinak száma exponenciálisan növekszik a ciklusok számával, mely ciklusok mindegyike tartalmazza a következő lépéseket: (1) mindegyik cél szegmentum és az azzal komplementer lánc (a cél szegmentum szekvenciájával kiegészítő - komplementer - szekvencia szegmentum ) 3'-terminális alszegmentumához egy DNS primer tapasztása (annealing), (2) a primerek meghosszabbítása DNS polimerázzal, és (3) a (2) lépésben keletkezett kettős-szálú molekulák szétválasztása egyes-szálúvá hődenaturációval. A PCR technikát tárgyalják: Saiki et al., Science 230, 135 (1985) és Mullis et al., European Patent Application Publication Nos. 0 200 362 és 0 201 184 és US Patent Nos. 4,683,195 és 4,683,202.

A második megközelítésmód szerinti másik eljárás nukleinsavak keverékeiben kis koncentrációban található cél szegmentumok kimutatására az úgynevezett transzkripció-alapú erősítési rendszer (TAS) alkalmazása. A TAS-ban egy RNSmásolat-előállító lépés található, az RNS egy olyan DNS-ről íródik át, melyet úgy szintetizáltunk, hogy tartalmazzon egy, a cél szegmentum szekvenciájával megegyező szekvenciájú szegmentumot és egy, a cél-szekvenciát-tartalmazó szegmentumhoz képest megfelelően pozícionált promoter régiót, hogy lehetővé váljék a szegmentum átíródása egy RNS-re, mely ilyen módon tartalmazza majd a cél szegmentummal komplementer szekvenciát. Ciklikus módon ez a folyamat megtöbbszörözhető, mivel a transzkripciós lépésben keletkezett RNS templátként szolgálhat hasonlóan átírható DNS előállításához, melyről pedig újabb komplementer RNS készülhet. Az egyes ciklusok előrehaladásával az erősítési folyamat sebessége nagyon gyorsan fokozódik, hiszen kb. 10 és 1000 darab közötti olyan RNS másolatok, amelyek a cél szegmentum szekvenciáját vagy annak • · · · · • · · · · · · • ·«·····» ·«· ··«· · · · komplementerét tartalmazzák, gyorsan képződnek minden egyes olyan kettősszálú DNS-ről, amely képes a cél szegmentumot tartalmazó szegmentum promótervezérelt transzkripciójára. A TAS módszert az alábbi közkeletű szabadalmi bejelentésekben írták le: United States Patent Application Serial Nos. 064,141, filed June 19, 1987, és 202,978, filed June 6, 1988 (közölve: International Patent Application Publication No. WO88/10315), a közzétett bejelentéseket a továbbiakban referenciaként hivatkozzuk. A célzott nukleinsavak felszaporítása a TAS módszerrel a kiválasztott cél szegmentum másolatai számának gyors növekedését biztosítja a DNS-dependens RNS polimerázok alábbi két tulajdonságának köszönhetően: (1) a transzkripció érezhető iniciációja érzékelhető az egyes polimerázokra specifikus szekvenciákról, már akkor is, ha azok mennyisége kicsiny, lásd pl. Brom et al., Nucl.Acids Rés. 14, 3521 (1986); és (2) nagy mennyiségű átíródott szál gyors előállítása (jellemzően 100-10000 óránként) minden egyes, az RNS polimeráz által felismert promoter kópiáról. Lásd Milligan et al., Nucl.Acids Rés. 15, 8783 (1987). Továbbá, egy standardizáló technika alkalmazásával, a TAS rendszer használatával lehetőség van egy adott mintában található célzott nukleinsav szegmentumok mennyiségének egyértelmű meghatározására.

A TAS módszer RNS-dependens DNS polimeráz- és a DNS-dependens DNS polimeráz aktivitásokat használ, mindkét funkciót elláthatja egy reverz transzkriptáz, továbbá DNS-dependens RNS polimeráz aktivitást és primereket. A primerek a szaporítandó cél szegmentum végeit definiálják. A primerek közül legalább egy, jellemzően az, amelyik a cél szegmentum 3'-végéhez hibridizálódik, tartalmaz egy olyan szegmentumot, mely egy promoter értelmes szálának szekvenciájával rendelkezik és döntően a transzkripció céljából hozzá van kapcsolva a primer azon szegmentumához, amelynek szekvenciája komplementer a cél szegmentum 3' • · végének szekvenciájával, miáltal a kettős szálú DNS-ben, mely tartalmazza a promóter régiót és a cél szegmentumot, megtörténhet a transzkripció iniciációja. A TAS módszernél alkalmazott példaszerű promóterek azok, melyeket a T7 fág, a T3 fág és az SP6 fág RNS-polimerázai ismernek fel.

A TAS módszer alkalmazható RNS cél szegmentum felszaporítására. Ilyen szaporítások során- a cél szegmentumot tartalmazó RNS-ről kettős szálú DNS előállítására - olyan primereket alkalmaznak, melyek olyan DNS promóter vezérelt transzkripcióját teszik lehetővé, mely a cél szegmentummal azonos szekvenciájú szegmentumot tartalmaz, s így a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú szegmentumot tartalmazó RNS nyerhető.

A TAS módszer alkalmazható kettős szálú nukleinsav valamely cél szegmentuma szaporítására is. Röviden, a mintában található kettős szálú nukleinsavat denaturálják, s lehetővé teszik, hogy a primerek megfelelő szálakkal hibridizálódjanak, az egyik primer (az ún. ellenkező értelmű primer) a cél szegmentum 3'- végével, a másik primer (az ún. értelmes primer) a cél szegmentum kiegészítő szála 3'-végével hibridizálódik. A primereket ezután egy alkalmas polimerázzal meghosszabbítják és a keletkező kettős szálakat hőkezeléssel denaturálják majd lehűtik, hogy a megfelelő primerek újra hibridizálódjanak nemcsak a mintából származó, a cél szegmentumot tartalmazó kettős szálú nukleinsav szálaival, de a lánchosszabbított termékekkel is, melyek az előző primerhosszabbítási reakcióban képződtek. A hibridizálódott primer láncokat ismét meghosszabbítják egy megfelelő polimerázzal katalizált reakcióban, s így - az előző primerhosszabbítási reakcióban képződött meghosszabbított láncú termékekkel hibridizálódott primerekkel együtt - tehát kétféle kettős szálú DNS • · · keletkezik, melyek közül legalább az egyikben megtalálható az a cél szegmentumot tartalmazó szegmentum, melyhez - a transzkripció céljára - hozzá van kapcsolva egy promóter. Az ilyen promótereket tartalmazó kettős szálú DNS-ek átíródnak egy, a promótert felismerő DNS-dependens RNS-polimeráz által olyan RNS molekulákba, melyek a cél szegmentummal komplementer szegmentumot tartalmaznak, s ezáltal, végülis, maga a cél szegmentum megsokszorozódik. A hibridizáció, lánchosszabbítás, hődenaturáció, hibridizáció, lánchosszabbítás és átírás előbbi folyamatai megismételhetőek, templátként használva mind az újonnan előállított kettős szálú DNS-ek szálait, mind a transzkripcióban szintetizálódott RNS láncokat.

A szaporítás TAS módszere gyakorlatában - eltekintve attól, ha a folyamatban RNSek autokatalítikus reprodukcióját alkalmazzuk - mások mellett egy első egyes szálú RNS másolat keletkezik, melyben található egy olyan szegmentum, aminek a szekvenciája vagy a cél szegmentuméval vagy pedig annak komplementerével azonos, s ez az RNS másolat relatíve nagy fölöslegben van jelen ahhoz a másodsorban keletkező RNS-hez képest, melynek szekvenciája az első RNS-ével komplementer. így tehát a TAS alkalmazása során bőségesen képződik olyan egyes szálú RNS, melynek kimutatásához nem szükséges a polimerizációs láncreakciós technika (PCR) ismétlődő hőkezeléses ciklusainak vagy a szálak szétválasztásának fáradtságos kivitelezése.

Kívánatos lenne az átírás alapú nukleinsav szaporítás egy olyan formájának a kidolgozása, mely minden egyes erősítési ciklusból kiiktatná a hődenaturációs lépés szükségességét, úgyhogy a többszörös szaporítási körfolyamatok a hődenaturáció nélkül mehetnének végbe. Ezért tehát nagyon kívánatos lenne az átírás alapú szaporítás egy olyan formájának a kidolgozása, mely önfenntartó és izotermikus lefolyású.

A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA

A jelen találmány egy olyan módszer meglepő felfedezésének következménye, mely cél nukleinsav alapjában véve folyamatos, önfenntartó szaporítására vonatkozik, s mely spontán módon és izotermikusan megy végbe. Az önfenntartó szekvencia replikáció (továbbiakban 3SR) eme módszere egy RNS cél szegmentum szaporítását végzi el, felhasználva ehhez RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitást, DNS-dependens DNS-polimeráz aktivitást, RN-áz H aktivitást és DNS-dependens RNS-polimeráz aktivitást, valamint primereket, melyek képesek a cél szegmentummal vagy annak komplementerével hibridizálódni és elindítani egy primer meghosszabbítási reakciót, melyben templátként a cél szegmentum vagy annak komplementere szerepel. Legalább egy a primerek közül rendelkezik egy promóter értelmű szekvenciával. Az RN-áz H aktivitás szükségtelenné teszi a hőkezelési folyamatot, mivel enzimatikusan katalizálja egy RNS-DNS duplex RNS szálának emésztődését, egyes szálúvá alakítva a duplex DNS szálát, mely egy olyan primer láncnövelési reakcióban szintetizálódott, melyben templátként az előbbi RNS lánc szerepelt. E négyféle enzimatikus aktivitás úgy is biztosítható, ha reverz transzkriptáz és DNS-dependens RNS-polimeráz valamilyen kombinációját használjuk. A jelen találmány a 3SR szaporítás azon módszereire vonatkozik, amelyekben a reverz transzkriptáz belső lényegéből fakadó RN-áz H aktivitás biztosítja a szükséges RN-áz H aktivitást, valamint azon módszerekre, melyekben a reverz transzkriptáz RN-áz H aktivitását más forrásból - pl. E. coli RN-áz H származó RN-áz H aktivitással egészítjük ki, miáltal a szaporítás mértékei 105-töl 106-szeresre növelhetők.

«ti* • · « · · · · • · · · « • ·· · · · · • · ··♦·* · • ··· ···· · ··

A jelen találmány azon a meglepő felismerésen is alapszik, hogy meghatározott reakció körülmények között, a reverz transzkriptázok elegendő RN-áz H aktivitással rendelkeznek ahhoz, hogy lehetővé tegyenek különösen érzékeny 3SR szaporítási reakciókat, melyekben egy RNS cél szegmentumot mintegy 105-szerestől mintegy 109-szeresre lehet felszaporítani kevesebb mint 4 óra alatt, anélkül, hogy a reakció közeget a reverz transzkriptázon kívül más RN-áz H aktivitás forrással ki kelljen egészíteni. Ilyen, meghatározott reakció körülmények hiányában 103-tól 104szeresnél nagyobb 3SR szaporítási szintek nem érhetők el, kivéve, ha a reverz transzkriptáz RN-áz H aktivitását kiegészítjük más, pl. E. coli eredetű, RN-áz H aktivitással. így tehát, egy másféle megközelítésmódban, a jelen találmány cél nukleinsav szegmentum szaporításának 2-enzimes 3SR módszereire vonatkozik, melyek lehetővé teszik egy nukleinsav szegmentum szaporítását mintegy 105szerestől mintegy 109-szeresig 4 órán belül, jellemzően 1/2 óra és 2 óra időtartam között.

A jelen találmány további új fejlesztéseket is tartalmaz a 3SR szaporítási módszerek vonatkozásában. Ezek a fejlesztések a reakció közeg és egyéb reakció körülmények javítását jelentik, melyek révén lehetővé válik a cél szegmentum szaporítása a csak két enzimet használó 3SR alkalmazásával, és megnövelhető a szaporítás mértéke mind a 2-enzimes 3SR-, mind pedig a 3-enzimes 3SR reakciókban.

A jelen találmány módszereket nyújt a 2-enzimes 3SR szaporításra is, melyek révén viszonylag nagy cél szegmentumok - mintegy 700 bázist meghaladó méretűek olyan szintekre szaporíthatok fel, melyeket különben csak kis cél szegmentumokkal lehetne elérni.

• · · · ·· · ···· • « · · · •«· · ♦ · ·

A jelen találmány eszközöket is nyújt cél nukleinsav szegmentumok 3SR révén való felszaporítására és cél nukleinsavak mintákban való jelenlétének kimutatására 3SR általi szaporítást is tartalmazó módszerekkel, az említett eszközök alatt értendők a 3enzimes 3SR szaporítás javított reakció közege vagy a 2-enzimes 3SR szaporítás komponensei.

A RAJZOK RÖVID LEÍRÁSA

Az 1. ábra a jelen találmány egy megvalósítási formájának vázlatos bemutatása. Az 1. ábra az önfenntartó szekvencia replikáció (3SR) folyamatát mutatja be lépésről lépésre, noha majd világos lesz, hogy a gyakorlatban a különböző lépések mindegyike egyszerre történik jelentős kölcsönhatások kíséretében. A 3SR szaporítási reakcióhoz szükséges enzimaktivitások az RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitás (RT aktivitás 1), a DNS-dependens DNS-polimeráz aktivitás (RT aktivitás 2), az RN-áz H aktivitás (RT aktivitás 3), és a DNS-dependens RNS-polimeráz aktivitás. A besötétített kis téglalapok az első primer (jelezve A) és a második primer (jelezve B) promóter funkciójú szegmentjeit reprezentálják.

A 2a és 2b ábrák a jelen találmány egy megvalósítási formája különféle lépéseinek részletes vázlatai, melyek bemutatják azokat a különböző alszegmentumokat, amik a 3SR szaporítási reakció során stabilan vagy csak átmenetileg jelen lévő nukleinsavféleségeket tartalmazzák, ahogy azt a továbbiakban leírjuk.

«

I · • · · ·♦· · ··« *

A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

Egy közösen birtokolt United States Patent Application Serial No. 285,467, filed December 16, 1988, melyet a továbbiakban, a maga teljességében, idefoglalunk referenciaként, közzétesz egy cél nukleinsav szaporítási módszert, mely lényegében folyamatos, önfenntartó, és spontán módon, izotermikus körülmények között folyik.

Ezen módszer előnyösen küszöböli ki a hibridizálódott nukleinsavak hődenaturációjának szükségességét. Mivel ez a szaporítási módszer spontánul és izotermikusan megy végbe a cél RNS szegmentum, az igényelt primerek, a szükséges enzimatikus aktivitást biztosító enzimek, és a nukleozid trifoszfát szubsztrátok jelenlétében, ezért a módszert önfenntartó szekvencia replikációnak nevezik, a továbbiakban a 3SR rövidítést használjuk.

Az önfenntartó szekvencia replikáció kivitelezhető a teljes végbemenetelig, mert ahogy azt meglepő módon felfedeztük - lehetséges fenntartani a reakció keveréket, benne a négy szükséges enzimaktivitást biztosító enzimmel, primerekkel, ribonukleozid trifoszfátokkal és 2'-dezoxiribonukleozid trifoszfátokkal és RNS-sel olyan reakció körülmények között, melyek megfelelőek mind a primerek hibridizációjához, mind pedig - alkalmas paraméter szintek esetén - a négyféle enzimatikus aktivitás fenntartásához.

A 3SR módszer két DNS prímért alkalmaz, melyek elsődleges láncnövelő reakciói a célszegmentumot, illetve annak komplemeterét használják templátként. Legalább egy a primerek közül tartalmazza egy promoter értelmes szálát. A 3SR módszerrel történő szaporítás, mely folyamatos és lényegében izotermikus, négyféle enzimaktivitást igényel, melyet legalább két enzim biztosít - egy reverz transzkriptáz (mely biztosítja az RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitást és a DNS-dependens

DNS-polimeráz aktivitást, továbbá az RN-áz H aktivitást) és egy DNS-dependens RNS-polimeráz. A 3SR-ben alkalmazott RN-áz H aktivitás egy olyan DNS láncnövelési terméket alakít át egyes szálúvá, melynek láncnövelésénél egy RNS szegmentum szerepelt templátként, tehát, ellenkezőleg, mint a TAS-nál, itt nincs szükség denaturációs lépésre. Azt a reverz transzkriptáz eredetű RN-áz H aktivitást, melyet a találmány szerinti 3SR reakciókban használunk, tetszőlegesen kiegészíthetjük a reverz transzkriptáztól különböző forrásból - például E. coli RN-áz H - származó RN-áz H aktivitással. Mivel azonban az E. coli RN-áz H enzimnek megvannak a saját optimális reakció körülményei, melyek különböznek a másik két enzim optimális reakció körülményeitől, és mivel az E. coli RN-áz H-t nem könnyű elfogadhatóan tiszta formában izolálni, és lényegesen drágább a 3SR szaporításhoz szükséges másik két enzimnél, nagyon is kívánatos kiiktatni egy olyan enzim iránti igényt, mely különbözik egy olyan reverz transzkriptáztól, mely hatékony mennyiségű RN-áz H aktivitást képes biztosítani ahhoz, hogy a felszaporítás előtti nagyon kicsiny koncentrációban jelen lévő nukleinsav cél szegmentumok kimutatásához szükséges nagyérzékenységű szaporítás lehetővé váljék.

Hivatkozunk a molekuláris biológia standard kézikönyveire, melyek tartalmazzák a jelen találmány szempontjából releváns alapvető technikák kivitelezésével kapcsolatos definíciókat, módszereket és eszközöket, mint például: kereső DNS vagy primer előállítása, beleértve a DNS szintézist; hibridizációs módszertan, beleértve a szorossági feltételek variációit a nagyobb vagy kisebb hibridizációs fajlagosság elérésében, mely a primer és a cél DNS szegmentum közötti homológia fokától függ; RNS- és DNS-dependens DNS-polimerizációs reakciók és cDNS-ek szintézise; promoterek azonosítása, izolálása, szekvenálása vagy előállítása, vagy pontosabban, fentiek végrehajtása promoterek vagy olyan régiók vonatkozásában, ···· »* · • · « * « ··· · · ♦ · « * ···« » · • ··· ···· * ·* melyeket bakteriofág eredetű DNS-dependens RNS-polimerázok felismernek és amelyekre rákötődnek, előkészítendő a transzkripció katalízisét, vagy - eukarióta rendszerek vonatkozásában - olyan promóterek vagy régiók, melyeket vírus eredetű DNS- és RNS-dependens RNS-polimerázok ismernek fel, például adenovírusban kódolt RNS-polimeráz és bróm mozaik vírus RNS-polimeráz; RNS átiratok előállítását elősegítő feltételek, beleértve az úgynevezett transzkripciót fokozó szekvenciákat; polimeráz láncreakciós módszerek, beleértve az ezekben használatos reagenseket; és így tovább. Lásd például, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982), s az ebben szereplő temérdek hivatkozást; U.S. Patent 4683195; U.S. Patent 4683202; Beaucage etal., Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981); Caruthers et al., Meth. Enzym. 154, 287 (1985); Lee et al., Science 239, 1288 (1988); Milligan et al., Nucleic Acids Rés. 15, 8783 (1987); Miller et al., Virology 125, 236 (1983); Ahlquist et al., J. Mól. Bioi. 153, 23 (1981); Miller et al., Natúré 313, 68 (1985); Ahlquist et al., J. Mól. Bioi. 172, 369 (1984); Ahlquist et al., Plánt Mól. Bioi. 3, 37 (1984); Ou et al., PNAS 79, 5235 (1982); Chu et al., Nucl. Acids Rés. 14, 5591 (1986); European Patent Application Publn. No. (EPA) 194809; Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses, p. 327-336, Alán R. Liss (publ.; New York) (1987; Proceedings of UCLA Symposium, 1986); Milleretal., J. Mól. Bioi. 187, 537 (1986); Stofletetal., Science 239, 491 (1988); és Murakawa et al., DNA 7, 287 (1988).

Az összes korábban hivatkozott publikációt ebbe a hivatkozás csoportba egyesítettük.

A primer kifejezés alatt - a jelen szövegkörnyezetben - egy olyan egyes szálú nukleinsavat értünk, melynek a 3'-végén található egy olyan szegmentum, mely megfelelő homológiát mutat a cél szegmentum vagy annak komplementere egy szegmentumához, úgy hogy - alkalmas hibridizációs körülmények között - képes hibridizálódni a cél szegmentummal (vagy annak komplementerével) és képes elindítani egy primer láncnövelési reakciót, amelyben a cél szegmentummal (vagy annak komplementerével) megegyező szekvenciával rendelkező nukleinsav a templát. Egy jellegzetes primer hibridizálódó szegmentuma legalább 10 nukleotid hosszúságú, méginkább 15-50 nukleotid, leginkább pedig körülbelül 15-25 nukleotid bázis hosszúságú. Primer-ként leginkább egy DNS-t alkalmazunk.

Ahogy azt korábban használtuk, egy ellenértelmű primer egy olyan prímért jelent, mely rendelkezik egy olyan szekvenciával, ami elegendően komplementer a cél szegmentum 3'-végének egy szekvenciájával, s amit egy olyan láncnövelő reakcióban hosszabbítunk meg, amelyben a cél szegmentum a templát; egy értelmes primer egy olyan prímért jelent, amelynek van egy olyan szekvenciája, ami hasonló módon elegendően homológ egy ilyen cél szegmentum 5'-végének szekvenciájával. A primerek határozzák meg a szaporítandó cél szegmentum végeit. A legelőnyösebb kivitelezési formában az értelmes, illetve az ellenértelmű primerek olyan szegmentumokkal rendelkeznek, melyek legalább a 3'-végüket tartalmazzák, amik részben azonosak vagy nagymértékben homológok a cél szegmentum 5'végével, illetve a cél szegmentum 3'-végének komplementerével. Lásd, például, EPA 128042 (publd. 12 Dec 84).

Legalább egy, vagy tetszőlegesen mindkét primer tartalmaz egy promóter értelmű szekvenciájú szegmentumot. A promóter értelmű szál kifejezés alatt egy olyan egyes szálú nukleinsav értendő, amit, amikor a kettős szálú formában jelen lévő komplementerével (azaz mintegy kettős szálú promóterrel) hibridizálódik, ···· ·· · ···· •·· · · · ·* specifikusan felismer egy RNS-polimeráz, amelyik a promóter egyik polimeráz kötő szekvenciájához kapcsolódik és elindítja az átírás folyamatát, amely révén egy átíródott RNS képződik. Elvileg, bármely értelmes promóter szekvencia alkalmazható, amennyiben létezik ismert és hozzáférhető olyan polimeráz, amelyik képes a szekvencia felismerésére. Jellemző módon, az ismert és használható promóterek azok, melyeket bizonyos bakteriofág RNS-polimerázok, mint például a bakteriofág T3-ból-, T7-ből-vagy SP6-ból izoláltak, ismernek fel. Lásd Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980). Ezek csak példák azokra az RNS-polimerázokra, amelyek alkalmazhatók a jelen találmány gyakorlatában a velük kapcsolódó promóter szekvenciákkal együtt. Továbbá, egy promóter értelmű szál, ahogy azt itt használjuk, lehetőleg egy vagy több nukleotidot, méginkább körülbelül 4-től mintegy 10-ig vagy még több nukleotidot tartalmaz közvetlenül a promóter (értelmes szál) konszenzus szekvenciája (azaz a konszenzus polimeráz kötő hely értelmes szekvenciája) 5'-végén lévő utolsó nukleotid mellett. Ahogyan itt használjuk, egy promóter értelmű szekvenciának elegendő hosszúságúnak kell lennie ahhoz, hogy egy cDNS-t magában foglaló említett szekvencia befejezésekor a promóter konszenzus szekvenciája teljes mértékben kettős szálú. Az ilyen cDNS-ekben akkor indul el a transzkripció a promótertől, amikor egy a promótert felismerő RNSpolimeráz olyan feltételek között van jelen, melyek alkalmasak a promótertől induló átíráshoz.

A bakteriofág promótereket azért helyezik előnybe, mert igen nagy a specificitásuk a velük rokon RNS-polimerázaikhoz. Más promótereket és a hozzájuk tartozó DNSdependens RNS-polimerázaikat, melyek hasonlóan nagy fajlagossággal rendelkeznek, is alkalmazhatunk a találmány szerint a bakteriofág promóter polimerázok helyett, és a találmány tárgyába tartozik ilyen másféle promóterek és

RNS-polimerázok hasznosítása is, feltéve, hogy az említett promoter nagyfokú specificitással bír az említett polimeráz irányában.

A bakteriofág eredetű promoter értelmű szekvenciák közül előnybe helyezzük a T7, T3 és SP6 promóterek (+) szálait, melyekben megtalálható az a szegmentum, amelyikhez a megfelelő RNS-polimeráz kötődik, és ahol legalább egy, de előnyös módon mintegy 4-től 10 darab 5'-nukleotid található ezen polimeráz kötő szegmentum 5'-végéhez kapcsolódva. A kívánatos promóterek s a megfelelő RNSpolimerázok leírását a példákban és az igénypontokban találjuk, de számos más promoter és RNS-polimeráz ismeretes a technikából és alkalmazható.

A változtatható alszegmentumok, melyeket a DNS primerek tetszőlegesen tartalmazhatnak, egy vagy több funkciót látnak el. Először is, egy promoter szekvenciát tartalmazó primer (primerek) esetén, a változtatható alszegmentumok olyan transzkripciót iniciáló szekvenciákat tartalmaznak inkább, melyeket a promóterhez tartozó RNS-polimeráz részesít előnyben. Ugyanakkor pedig, a bakteriofág T7 transzkripciós iniciációs

5'-GGGA-3' szekvencia, mely a 17 nukleotidos T7 promoter konszenzus szekvencia 3' végéhez csatlakozik, feltehetően az in vivő transzkripcióban fontos, és nem tűnik döntő fontosságúnak a 3SR szaporítás alatti transzkripciónál. A IX. példa a mutációknak (nukleotid cserék vagy deléciók) a szaporítás mértékére kifejtett hatását mutatja be alább, ahol a mutációk közvetlenül a T7 promoter 17 nukleotidos konszenzus szekvenciája irányából történnek a transzkripciós iniciációs szekvenciában. Olyan primereknél, amelyek tartalmaznak promoter funkciójú szegmentumot, a transzkripciós iniciációs szekvencia megléte nem kötelező. Az ilyen primerek tehát - amelyeknél a promoter konszenzus szekvencia 3' végén lévő nukleotid egy hibridizációs cél szegmentumhoz csatlakozik - nagyfokú szaporítási (erősítési) szintet eredményezhetnek összehasonlítva azokkal, amelyeknél az 5'GGGA-3' transzkripciós iniciációs szekvencia található. Előnyösebb azonban, ha legalább egytől négy - előnyösen négy - nukleotidból álló szegmentumot kapcsolunk a promóter konszenzus szekvencia 3' végén található nukleotidhoz. Egy példa egy előnyös szekvenciára, melyet a T7 konszenzus szekvencia 3' végén található nukleotidhoz kapcsolódó transzkripciós iniciációs szekvencia helyére építünk, az 5'GAAA-3' szekvencia.

Másodszor, az összes primer vonatkozásában, egy variábilis alszegmentum tetszőlegesen tartalmazhat egy olyan meghatározott nem-cél szegmentumot, amelynek segítségével a szaporításból származó RNS terméket kimutathatjuk nukleinsav hibridizációs vizsgálattal. Valóban, a szaporítás (és a vizsgálat) egyszerre vonatkozhat több különböző cél szegmentumra olyan primerhalmazok felhasználásával, amelyek a 3' végeiknél lévő felismerő (anti-cél vagy anti-cél komplementer) szegmentumaikban különböznek, de tartalmaznak egy közös variábilis alszegmentumot. A változtatható alszegmentum tartalmazhat még egy polilinker szekvenciát is, mely alkalmas módon tartalmaz egy sor restrikciós helyet az egymásutáni klónozást elősegítendő. Továbbá, a változékony alszegmentum tartalmazhatja egy önreplikációra képes RNS szekvenciáját, mint például a QB vírus, amelyik a megfelelő replikáza (pl. QB replikáz) jelenlétében megsokszorozhat és önreplikálhat egy ilyen variábilis alszegmentumot tartalmazó RNS átiratot.

A működőén összekapcsolt kifejezés, főleg olyan vonatkozásban, hogy egy primer promóter szekvenciája e primer hibridizálódó (anti-cél vagy anti-cél komplementer) szekvenciájához kapcsolódik, a jelen találmánybeli szaporítási módszerekkel szintetizált, és a prímért is magában foglaló végső kettős szálú nukleinsav templát vagy cDNS funkcionalitására értendő. Az így keletkező cDNS-ek a promótert felismerő DNS-dependens RNS-polimeráz jelenlétében képesek előállítani RNS átiratokat, amikoris egy, a cél szegmentummal vagy annak komplementerével hibridizálódó primer promóter értelmű szál-szegmentuma a transzkripció szempontjából működőén van összekapcsolva a primer 3'-szegmentumával.

A primer meghosszabbítási reakció, mellyel DNS-RNS vagy DNS-DNS kettős hélixeket állítunk elő, jól ismert. Ismeretes, hogy a reverz transzkriptázok, főleg a retrovírusokból származók, használhatók DNS-dependens DNS-polimeráz- és RNSdependens DNS-polimeráz aktivitás ellátására is.

A nagy érzékenységű szaporításhoz szükséges hatékony RN-áz H aktivitás mennyisége fogalom alatt egy olyan RN-áz H aktivitás mennyiséget értünk, mely képes egy RNS cél szegmentumot legalább körülbelül 105-szeres mennyiségűre szaporítani 2-4 óra alatt egy olyan reakció keverékben, mely tartalmaz megfelelő (egy RNS cél szegmentum 3SR szaporításához szükséges) primereket, RNS-dependens DNSpolimeráz aktivitást, DNS-dependens DNS-polimeráz aktivitást és DNS-dependens RNS-polimerázt (s az ezekhez szükséges szubsztrátokat), s amely reakció keveréket egy olyan hőmérséklet intervallumban inkubáljuk, amelyikben az említett három enzim aktivitása megfelelő. A nagy érzékenységű szaporításhoz szükséges hatékony RN-áz H aktivitás mennyisége fogalom - ahogyan azt az alábbiakban használjuk - egy olyan szaporítási mértékre vonatkozik, amely szükséges ahhoz, hogy egy 3SR reakcióban, ismert nukleinsav hibridizációs teszt módszerek alkalmazásával, kimutassunk egy nukleinsav cél szegmentumot, szaporítás előtt, egy olyan reakció közegben, amely a cél szegmentum 1-től 10000 molekuláját tartalmazza (pl. egy 0.05-től körülbelül 1 ml-ig terjedő reakciótérfogatban). Egy adott mennyiségű RN-áz H aktivitás, mely hatékony a 3SR szaporítási reakció számára, lehet kisebb is, mint a nagy érzékenységű szaporításhoz szükséges hatékony mennyiségű RNáz H aktivitás, és ilyen esetekben, egy 3SR szaporítási reakcióban, elegendő lehet egy olyan cél nukleinsav szegmentum felszaporításához, amelyik egy olyan koncentrációban található, hogy a kimutatáshoz szükséges szaporítási mérték kisebb, mint a körülbelül 102-szeresről a körülbelül 104-szeresre való szaporítás mértéke.

Az RNáz H aktivitás, mellyel, tudjuk, retrovirális reverz transzkriptázok rendelkeznek, ismert módon, meghatározott körülmények között egy RNS-DNS kettős hélix RNS szálát megemészti kis oligonukleotidokká (pl. mintegy 5-10 bázis hosszúságúnál kisebb oligoribonukleotidokká), miközben a DNS szálat érintetlenül hagyja. Azonban, bizonyos reakció körülmények között, melyeket leírtunk a korábbiakban, s az idefoglalt U.S. Serial No. 285,467 anyagban, a reverz transzkriptázok lényegéből adódó RNáz H aktivitás nem elégséges a nagy érzékenységű 3SR szaporítás biztosításához. A Serial No. 285,467-ben leírt reakció körülmények között, E. coli RNáz H kiegészítéssel egy reverz transzkriptáz belső RNáz H aktivitása lehetővé teszi egy, a szaporítás előtt körülbelül 10 attomól/ml koncentrációban jelen lévő nukleinsav cél szegmentum nukleinsav hibridizációval történő kimutatásához szükséges 3SR szaporítási szintek elérését.

A négy ribonukleozid trifoszfátra - rATP, rUTP, rCTP és rGTP - a továbbiakban együttesen mint rNTP-k-re vagy rXTP-k-re hivatkozunk.

» » ··· > . .

Azok az eljárások, melyekkel egy kimutatható jelet állítunk elő, mint például radioaktív jelöléssel vagy színképzéssel - egy kromogén reakciót katalizáló enzim használatával -, jól ismertek- és dokumentáltak a jelen tudományterületen.

Az egyik vonatkozásában, a találmány egy cél RNS molekula cél RNS szegmentumának egy 3SR szaporítási módszerét adja meg, ahol a cél szegmentum egy 5'-alszegmentumot tartalmaz, melyen található egy 5'-terminális nukleotid, és a cél szegmentum legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'-terminális nukleotidtól a 3'-irányba, továbbá az RNS szegmentum tartalmaz egy 3'alszegmentumot is, melynek nincs átfedése az 5'-alszegmentummal, s amely tartalmaz egy 3'-terminális nukleotidot és a cél szegmentum legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5-irányba a 3'-terminális nukleotidtól (lásd pl. 2a ábra, step 1), és ez a módszer az alábbi reakció közegben történő inkubálást tartalmazza:

(a) (1) egy első DNS primer, amely egy egyes szálú DNS, mely a 3'-végén egy első alszegmentumot tartalmaz, mely rendelkezik egy 3'-terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'-irányba, nevezett első primer nevezett első alszegmentuma, mely ugyanolyan hosszú, mint a cél szegmentum 3'alszegmentuma és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően komplementer a cél szegmentum 3'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a reakció közegben egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben egy, a cél szegmentum szekvenciájával rendelkező nukleinsav a templát, és (2) egy második DNS primer, amely egy olyan egyes szálú DNS, amelynek a 3'-végén egy olyan első alszegmentum található, amely rendelkezik egy 3'-terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'-irányba, nevezett második primer nevezett első alszegmentuma ugyanolyan hosszúságú, mint a cél szegmentum 5'-alszegmentuma, és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely . · · · · r ······ ··*···· elegendően homológ a cél szegmentum 5-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a reakció közegben egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú nukleinsav a templát, feltéve, hogy legalább egy az említett primerek közül tartalmaz továbbá egy promótert biztosító alszegmentumot, mely tartalmazza az egyik első promóter értelmes szálát, mely szál annak a primernek az első alszegmentumához kapcsolódik, mely az említett promótert biztosító szegmentumot tartalmazza, s ez a kapcsolódás lehetővé teszi a transzkripciót az említett első promóterről - melyet egy olyan cDNS tartalmaz, mely magában foglalja az említett két primer lánchosszabbítási termékeit - feltéve továbbá, hogy ha az említett első primer nem rendelkezik egy ilyen promótert biztosító alszegmentummal, akkor az említett cél RNS szegmentum ö'-alszegmentumának 5'-terminális nukleotidja a cél RNS molekula 5'-terminális nukleotidja;

(b) legalább két enzimet, mely az említett reakció közegben rendelkezik DNSdependens DNS-polimeráz aktivitással, RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitással, RNáz H aktivitással és egy DNS-dependens RNS-polimerázt, mely utóbbi DNSdependens RNS-polimeráz az adott reakció közegben képes katalizálni az átírást az említett első promótertől; és (c) nukleozid trifoszfátokat, melyek szubsztrátként szükségesek a DNSdependens DNS-polimeráz-, az RNS-dependens DNS-polimeráz- és a DNSdependens RNS-polimeráz aktivitásokhoz;

aholis az említett inkubáció egy olyan hőmérsékleti tartományban valósul meg, amelyikben az említett enzimek az említett reakció közegben aktívak ahhoz, hogy ellássák az említett DNS-dependens DNS-polimeráz-, RNS-dependens DNSpolimeráz-, RNáz H- és DNS-dependens RNS-polimeráz aktivitásokat.

r • · · * ·· · ···· • ♦ · · • · · · • « ··«« · · ♦ · · ♦ · · ·

Egy másik vonatkozásában a találmány megad egy módszert, mellyel egy cél RNS molekula cél RNS szegmentumának rendkívül érzékeny, rendkívül hatékony 2enzimes 3SR szaporítása végezhető el, aholis a cél szegmentum tartalmaz egy olyan S'-alszegmentumot, amelyik a cél szegmentum 5'-terminális nukleotidjától legalább 9 nukleotid hosszúságban terjed ki a 3'-irányba, és egy olyan 3'alszegmentumot, melynek az 5'-alszegmentummal nincs átfedése és tartalmaz egy 3'-terminális nukleotidot, s legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed a cél szegmentum 3'-nukleotidjától az 5'-irányba (lásd pl. 2a ábra, step 1), mely módszer magában foglalja az alábbiak inkubálását a reakció közegben:

(a) (1) egy első DNS primer, egy egyes szálú DNS, mely rendelkezik egy első alszegmentummal a 3'-végén, mely alszegmentumon található egy 3'-terminális nukleotid, s az 5'-irányban legalább 9 nukleotid hosszúságú, nevezett első primer nevezett első alszegmentuma ugyanolyan hosszúságú, mint a cél szegmentum 3'alszegmentuma, és található rajta egy olyan szekvencia, mely elegendően komplementer a cél szegmentum 3'-alszegmentumán lévő szekvenciával ahhoz, hogy - a reakció közegben - elindíthasson egy primer lánchosszabbítási reakciót, amiben egy, a cél szegmentum szekvenciájával rendelkező nukleinsav a templát, és (2) egy második DNS primer, amely egy olyan egyes szálú DNS, melynek a 3'-végén van egy olyan első alszegmentum, mely rendelkezik egy 3'-terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságú az 5'-irányban, nevezett második primer nevezett első alszegmentuma ugyanolyan hosszú, mint a cél szegmentum 5'-alszegmentuma és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően homológ a cél szegmentum 5'-alszegmentuma szekvenciájával ahhoz, hogy elindítson - a reakció közegben - egy primer lánchosszabbítási reakciót, amiben a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú nukleinsav a templát, feltéve, hogy • · · · · · · • « · · « ··· · · · · • · »« · · · « *·« ··«· · · · legalább egy az említett primerek közül tartalmaz továbbá egy promóter funkciót biztosító alszegmentumot, mely tartalmazza egy első promóter értelmes szálát, mely nevezett értelmes szál az első alszegmentumhoz kapcsolódik azon a primeren, amely az említett promóter funkciójú szegmentumot tartalmazza, s ez a kapcsolódás lehetővé teszi a transzkripciót az említett első promóterről melyet egy olyan cDNS tartalmaz, mely magában foglalja az említett két primer lánchosszabbítási termékeit - feltéve továbbá, hogy ha az említett első primer nem rendelkezik egy ilyen promótert biztosító alszegmentummal, akkor az említett cél RNS szegmentum 5'-alszegmentumának 5'-terminális nukleotidja a cél RNS molekula 5'-terminális nukleotidja;

(b) (1) egy reverz transzkriptáz, mely az említett reakció közegben rendelkezik DNS-dependens DNS-polimeráz aktivitással, RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitással és egy nagy érzékenységű szaporításhoz hatékony mennyiségű RNáz H aktivitással, és (2) egy DNS-dependens RNS-polimeráz, amelyik, az említett reakció közegben katalizálja az említett első promóterről való átírást; és (c) nukleozid trifoszfátok, melyek szubsztrátokként szükségesek a DNSdependens RNS-polimeráz-, az RNS-dependens DNS-polimeráz- és a DNSdependens RNS-polimeráz aktivitások számára;

aholis az említett inkubáció egy olyan hőmérsékleti tartományban valósul meg, amelyikben az említett enzimek az említett reakció közegben aktívak ahhoz, hogy ellássák az említett DNS-dependens DNS-polimeráz-, RNS-dependens DNSpolimeráz-, RNáz H- és DNS-dependens RNS-polimeráz aktivitásokat.

A 3SR szaporítási módszerek legalább egy, promóter funkciót biztosító prímért igényelnek, mely primer egy promóter értelmes szekvenciájával rendelkező szegmentumot tartalmaz, mely szegmentum, a transzkripció szempontjából működőképesen, a primer 3'-szegmentumához kapcsolódik, s ezen keresztül a primer a cél szegmentummal vagy annak komplementerével hibridizálódik. Az első primerre, illetve a második primerre az alábbiakban mint ellentétes értelmű primerre, illetve mint értelmes primerre hivatkozunk. Az ellentétes értelmű primer a kedvezőbb, hogy egy promoter szekvenciát tartalmazzon, bár, amint az a jelen találmány leírásából majd kiviláglik, az ellentétes értelmű és az értelmes primerek mindegyike tartalmazhat egy promoter szekvenciát, azonban meghatározott feltételek között a szaporítási reakció csak ott mehet végbe, ahol az értelmes primer tartalmazza a promoter szekvenciát. Az utóbbi kivitelezési formák, amelyekben csak az értelmes primer tartalmazza egy promoter értelmes szálát, egy olyan RNS cél szegmentumot igényelnek, aholis az 5'-alszegmentum ö'-terminális nukleotidja egyben a teljes cél RNS molekula 5'-vége.

A 3SR szaporítás során átmenetileg vagy állandóan jelen lévő különböző nukleinsavak definiálására meghatározott alsó indexeket alkalmazunk. Ezen alsó indexek a következő jelentésekkel bírnak: 1 -- egy első primerrel kapcsolatos szekvencia; 2 -- egy máspdik primerrel kapcsolatos szekvencia; t - a cél szegmentum egy része; c -- a cél szegmentum egy részletével komplementer szekvencia; r -- RNS; és d -- DNS. Például, az alábbi módon definiált szegmentum (3'-alszegmentumtcd) egy DNS (d) szekvencia, mely komplementer (c) az RNS cél (t) szegmentum 3'-alszegmentumával (azaz a primer hibridizáló szegmentummal), mely hibridizáló szegmentumot a következőképpen jelöljük (3'alszegmentumtr).

Az alábbiakban a jelen találmányba tartozó 2-enzimes 3SR szaporítás módszereit aholis az ellentétes értelmű primer egy promoter értelmű szekvenciát tartalmaz • · · · • · · · t ··· · · ♦ · · ···· • · · ·*·« · tárgyaljuk. Az alábbi leírásban feltételezzük, hogy egy RNS cél szegmentum jelen van a reakció közegben. A továbbiakban leírjuk egy RNS cél szegmentum előállítását egy kettős szálú DNS-ből, mely tartalmaz egy a cél RNS szegmentum szekvenciájával azonos szekvenciájú szegmentumot (a 2'-dezoxiribonukleotidokat ribonukleotidokkal és a T-t U-val helyettesítjük), olyan esetekre, ahol a cél RNS szegmentum esetleg kezdetben nincs jelen egy biológiai mintában vagy más olyan nukleinsav mintában, amelyre a találmányt alkalmazni kívánjuk.

Hivatkozva a 1. ábrára, a 2-enzimes 3SR szaporítási reakciót - a jelen találmánynak megfelelően - az I. Képlet szerinti cél RNS szegmentummal iniciáljuk: 5'-(5'-alszegmentumtr)-(átmeneti alszegmentumtr)-(3'-alszegmentumtr)-3'.

A megjelölt (ö'-alszegmentumtr) alszegmentum egy ismert szekvenciájú RNS szegmentum, mely legalább 10 nukleotidot tartalmaz, köztük az RNS cél szegmentum 5'-utolsó nukleotidját és ettől kiindulva a 3'-irányba legalább 9 nukleotidot. A (3'-alszegmentumtr) egy ismert szekvenciájú RNS szegmentum, mely legalább 10 nukleotidot tartalmaz, köztük az RNS cél szegmentum 3'-utolsó nukleotidját és ettől kiindulva a 5'-irányba legalább 9 nukleotidot. Az (átmeneti alszegmentumtr) egy 0 vagy több nukleotidból álló RNS szegmentum, mely összekapcsolja a (3'-alszegmentumtr)-ot és az (5'-alszegmentumtr)-ot. Ha az (átmeneti alszegmentumtr) 0 nukleotiddal rendelkezik, akkor az (5'-alszegmentumtr) 3'-végi nukleotidja a (3'-alszegmentumtr) 5'-végi nukleonjával kapcsolódik.

A 3SR szaporítási folyamat első lépése magában foglalja az első (ellenértelmű) primer hibridizációját az RNS cél szegmentum 3'-alszegmentumára (3'alszegmentumtr) és egy további láncnövelést, melyet egy reverz transzkriptáz RNSdependens DNS-polimeráz aktivitása biztosít a cél RNS-t használva templátként, • · · · • «««« « · • · · · · « egy DNS-RNS kettős spirált eredményezve. Az így képződött DNS-RNS kettős spirál legalább az (5'-alszegmentumtr) 5'-terminális nukleotidjáig tart. Lásd 2a ábra, step 3.

Az első primer egy egyes szálú DNS, amelyik a II Képlet szerinti nukleinsav szegmentumot tartalmazza:

5'-(promóter1 d)-(variábilis alszegmentumld)(3'-alszegmentumtcd)-3'.

II

A (promóterld) jelű szegmentum egy egyes szálú DNS szegmentum egy első promoter értelmes szálának szekvenciájával, lehetőleg azéval, amelyiket egy bakteriofág eredetű DNS-dependens RNS-polimeráz ismer fel; a (3'alszegmentumtcd) egy egyes szálú DNS szegmentum, mely ugyanannyi nukleotiddal rendelkezik, mint a (3'-alszegmentumtr), valamint a szekvenciája is elegendően komplementer ahhoz, hogy hibridizálódhassék és a cél RNS-t templátként használva egy láncnövelési reakciót indítson el; a (változékony alszegmentumld) egy 0-50 nukleotidból álló egyes szálú DNS szegmentum, mely a (promóterld) 3'-terminális nukleotidjához kapcsolódik. Amennyiben az előbbi (változékony alszegmentumld) 0 nukleotiddal rendelkezik, a promoter értelmű szál, (promóterld), 3'-vége a fenti (3'-alszegmentumtcd) 5'-terminálisához kapcsolódik. A (változékony alszegmentuml d) tartalmazhat például egy olyan eredeti transzkripciót iniciáló szegmentumot, melyet a promótert felismerő RNS-polimeráz felismer; bakteriofág eredetű T7 polimeráz esetén ezen eredeti transzkripciót iniciáló szegmentum tartalmazná az 5'-GGGA-3' szekvenciát. Egy jelenleg kívánatos transzkripciót iniciáló szegmentum az 5'-GAAA-3' szekvenciát tartalmazza.

A jelen találmány által továbbfejlesztett reakció közeg lehetővé teszi a jelen találmányban foglalt 2-enzimes 3SR szaporítási eljárások kivitelezését, mivelhogy az ilyen reakció közeg lehetővé teszi a reverz transzkriptáz belső lényegéből fakadó RN-áz H aktivitás kifejeződését. A reverz transzkriptáz eme RN-áz H aktivitása egy DNS-RNS kettős szál RNS szálát bontja le, egy olyan első komplementaritású DNS szálat eredményezve, mely a III. Képlettel jellemzett DNS szegmentumot tartalmazza.

5'-(promóter1 d)-(változékony alszegmentumtcd)(3'-alszegmentumtcd)-(átmeneti alszegmentumtcd)(5'-alszegmentumtcd)-3'.

Ili

Az (átmeneti alszegmentumtcd) és az (5'-alszegmentumtcd) szegmentumok olyan DNS szegmentumok, amelyek komplementerek az (átmeneti alszegmentumtr) illetve az (5'-alszegmentumtr) szegmentumokkal. A (promóterld), a (változékony alszegmentumld) és a (3'-alszegmentumtcd) szegmentumok definícióját all. Képlet adja meg.

Ott, ahol az RNS cél molekula hosszúságban nem azonos az RNS cél szegmentummal, a DNS-RNS kettős szál magában foglalhat egy olyan DNS-RNS kettős szál szegmentumot, mely (az RNS szálhoz viszonyítva) az 5'-irányban túlnyúlik a cél szegmentum 5'-alszegmentumán, és/vagy tartalmazhat egy olyan egyes szálú RNS szekvenciát, mely a 3'-alszegmentumtól a 3'-irányban helyezkedik el.

• 4 · · • · · · · ·*· · · · · I ι ··*«·»·· •♦· ···« · ·«

Egy második DNS primer (értelmes primer) hibridizálódik az egyes szálú első komplementaritású DNS molekulával és elindítja a láncnövelési reakciót ezen első komplementaritású DNS molekulán. A második DNS primer egy egyes szálú DNS, mely egy legalább 10 nukleotid hosszúságú szekvenciából áll és megfelel a IV. Képletnek (promóter-nélküli primer) vagy a IV(a) Képletnek (promótert tartalmazó primer):

5'-(változékony alszegmentum2d)-(5'-alszegmentumtd)-3'

IV

5'-(promóter2d)-(változékony alszegmentum2d)- (5'-alszegmentumtd)-3'

IV(a)

Az (5'-alszegmentumtd) jelölésű szegmentum egy DNS molekula egy olyan szekvenciával, mely elegendően homológ az (5'-alszegmentumtr) szekvenciájával ahhoz, hogy hibridizálódjék egy első komplementaritású DNS molekulával (az (5'alszegmentumtcd) szegmentumnál) és elindítson egy primer lánchosszabbítási reakciót egy a III. Képlettel jellemzett első komplementaritású DNS molekulát használva templátként. A (változékony alszegmentum2d) jelölésű szegmentum egy 0-100 nukleotidból álló szegmentum, mely az (5'-alszegmentumtd) 5'-terminálisához kapcsolódik. A második promoter értelmű szekvenciát (promóter2d) jelöléssel adjuk meg. Ahogy azt a (változékony alszegmentumld) jelölésű szegmentumnál láttuk, a (változékony alszegmentum2d) tartalmazhat például egy olyan eredeti transzkripciót iniciálé szegmentumot, melyet a promótert felismerő RNS-polimeráz felismer; bakteriofág eredetű T7 polimeráz esetén ezen eredeti transzkripciót iniciáló szegmentum tartalmazná az 5'-GGGA-3' szekvenciát. Egy jelenleg kívánatos transzkripciót iniciáló szegmentum az 5'-GAAA-3' szekvenciát tartalmazza. A második promoter értelmű szekvencia, ha jelen van, azonos lehet az első promoter szekvenciával, vagy különbözhet attól. Ott, ahol az első promoter és a második promoter különbözőek (azaz, ahol az első és második promotert nem ugyanaz a

DNS-dependens RNS-polimeráz ismeri fel), a reakció közeg tetszőlegesen tartalmazhat egy második DNS-dependens RNS-polimerázt, mely felismeri a második promotert.

Mivel a (változékony alszegmentum2d) jelölésű szegmentum egy a IV. Képlettel megadott promóter-nélküli értelmes primer egy tetszőleges szegmentuma (noha később megértjük, hogy egy ilyen alszegmentum befoglalása kívánatos lehet, például azért, hogy a hibridizációs vizsgálatok céljára egy nem-cél szekvenciát biztosítsunk), ezen tetszőleges szegmentumot kihagyjuk az alább következő leírásból, mely jelen találmány azon megvalósítási formájára vonatkozik, amelyben egy promóter-nélküli értelmes prímért alkalmazunk.

A reverz transzkriptáz DNS-dependens DNS-polimeráz aktivitása a második primer lánchosszabbítását biztosítja az első komplementaritású DNSt használva templátként, egy olyan első kettős szálú cDNS molekulát (a továbbiakban cDNS I) eredményezve, amelyik tartalmaz egy promotert, mely a transzkripció szempontjából működőén kapcsolódik egy cDNS szegmentumhoz, mely az RNS cél szegmentum komplementere (azaz, a cél szegmentum szekvenciájával tökéletesen komplementer szekvenciával rendelkezik). Lásd 2a Ábra, step 6. A cDNS tartalmazza az első komplementaritású DNS szálat, amint azt a fentiekben a III. Képlettel definiáltuk, valamint a második komplementaritású DNS szálat, mely utóbbi az V. vagy az V(a) Képlettel definiált DNSt tartalmazza:

5'-(5'-alszegmentumtd)-(átmeneti alszegmentumtd)(3'-alszegmentumtd)-(változékony alszegmentuml cd)32 ··· · · · · • · · · · ··· ·«·· · 4 · (promóter1cd)-3',

V

5'-(promóter2d)-(változékony alszegmentum2d)(5'-alszegmentumtd)-(átmeneti alszegmentumtd)(3'-alszegmentumtd)-(változékony alszegmentuml cd)(promóter1cd)-3'.

V(a)

Az (átmeneti alszegmentumtd), (3'-alszegmentumtd), (változékony alszegmentuml cd) és (promóterlcd) szegmentumok olyan szegmentumok, melyek komplementerek az (átmeneti alszegmentumtcd), (3alszegmentumtcd), (változékony alszegmentumld) illetve (promóterld) szegmentumokkal. A (promóter2d), (változékony alszegmentum2d) és (5'-alszegmentumtd) szegmentumok definícióit a IV. és IV(a) Képletek adták meg;

Az első és második komplementaritású DNS szálakból álló cDNS I átíródik az első promótertől a megfelelő DNS-dependens RNS-polimeráz jelenlétében a VI. vagy a Vl(a) Képlettel megadott RNS átirat többszörös másolatait eredményezve (Lásd 2b Ábra, step 7):

5'-(változékony alszegmentuml r)-(3'-alszegmentumtcr)(átmeneti alszegmentumtcr)-(5'-alszegmentumtcr)-3'

VI

5'-(változékony alszegmentuml r)-(3'-alszegmentumtcr)(átmeneti alszegmentumtcr)-(5'-alszegmentumtcr)(változékony alszegmentum2cr)-(promóter2cr)-3'.

Vl(a) ·♦♦· « * · ·«- • · · Λ « • ·· · 1 · · • · ···· · · ··* ···· · *«

A (változékony alszegmentumlr) egy RNS szegmentum, mely megfelel a (változékony alszegmentumld) szegmentumnak; a (3'-alszegmentumtcr), (átmeneti alszegmentumtcr), (5'-alszegmentumtcij, (változékony alszegmentum2cr) és (promóter2cr) szegmentumok komplementerek a (3'-alszegmentumtr), (átmeneti alszegmentumtr), (5'-alszegmentumtr), (változékony alszegmentum2d), illetve (promóter2d) szegmentumokkal.

A VI. vagy Vl(a) Képlettel jellemzett RNS átirat többszörös másolatai mindegyike képes hibridizálódni a IV. illetve IV(a) Képlettel jellemzett második primerrel és templátként funkcionálhat egy primer láncnövelési reakcióban, kialakítandó egy DNS-RNS kettős szálat. Lásd 2b Ábra, steps 8 és 9. A reverz transzkriptáz a belső lényegéből eredő RN-áz H aktivitásával a DNS-RNS kettős szál RNS átirat szálát leemészti, ezáltal egyes szálúvá teszi a harmadik komplementaritású DNSt, melyet a VII. vagy a Vll(a) Képlettel adunk meg:

5'-(5'-alszegmentumtd)-(átmeneti alszegmentumtd)(3'-alszegmentumtd)-(változékony alszegmentumlcd)-3'

VII

5'-(promóter2d)-(változékony alszegmentum2d)(5'-alszegmentumtd)-(átmeneti alszegmentumtd)(3'-alszegmentumtd)-(változékony alszegmentuml cd)-3'.

Vll(a)

A szegmentumok mindegyikét úgy definiáljuk, mint az V. vagy V(a) Képletben tettük a fentiekben.

Ezután, a II Képlet szerinti egyik első primer hibridizálódik az előbbi harmadik komplementaritású DNS szállal és láncnövelési reakcióval egy negyedik ··*· *4 ·*··· • ♦ · 4« • · · · · · · • 4 «««· 4· •4 · 44«« 4«« komplementaritású DNS jön létre. Lásd 2b ábra step 12. A negyedik komplementaritású DNS a Vili Képlettel definiált szegmentum:

3'-(5'-alszegmentumtcd)-(átmeneti alszegmentumtcd)(3'-alszegmentumtcd)-(változékony alszegmentumld)(promóter1d)-5'

Vili vagy a Vlll(a) Képlet szerint

3'-(promóter2cd)-(változékony alszegmentum2cd)(5'-alszegmentumtcd)-(átmeneti alszegmentumtcd)(3'-alszegmentumtcd)-(változékony alszegmentumld)(promóter1d)-5'

Vlll(a)

A szegmentumok mindegyikét a III Képlettel definiáltuk fentebb. A negyedik komplementaritású DNS túlnyúló vége, a promótert kódoló szekvenciá, templátként szolgál a harmadik komplementaritású DNS láncnöveléséhez, a cDNS II molekulát eredményezendő, X. Képlet, mely molekula a VII (illetve Vll(a)) Képlettel definiált harmadik komplementaritású DNS szálból és a Vili (illetve Vlll(a)) Képlettel definiált negyedik komplementaritású DNS szálból épül fel.

A jelen találmány most említett megvalósítási formájában a transzkripció vagy ellenkező értelmű átiratokat (aholis csak az ellenkező értelmű primer tartalmaz egy promoter értelmű szálat) vagy pedig értelmes és ellenkező értelmű átiratokat együttesen (aholis mindegyik primer tartalmaz egy promoter értelmű szálat) produkál.

• ·

Az értelmes átiratokat a IX. Képlet definiálja:

5'-(változékony alszegmentum2r)(5'-alszegmentumtr)-(átmeneti alszegmentumtr)(3'-alszegmentumtr)-(változékony alszegmentuml cr)(promóter1cr)-3'

IX

Az (5'-alszegmentumtr), (átmeneti alszegmentumtr) és (3'-alszegmentumtr) jelölésű szegmentumok azonosak vagy lényegében homológok az I. Képlet szerinti RNS cél szegmentummal. A (változékony alszegmentumlcr) és a (promóterlcr) szegmentumok olyan RNS szekvenciák, melyek komplementerek a (változékony alszegmentum 1d) illetve a (promóterld) szegmentumokkal.

Az ellenkező értelmű átiratok templátként újra belépnek az ellenkező értelmű szálakat szaporító körfolyamatba további cDNS II másolatokat eredményezve. 2b Ábra, steps 7-12.

A IX. Képlet szerinti értelmes átiratok belépnek egy diszkrét értelmes szálakat szaporító körfolyamatba, mely hasonló az előbb említett ellenkező értelmű szálakat szaporító körfolyamathoz. Röviden, az értelmes átirat többszörös másolatai mindegyike képes hibridizálódni a II Képlet szerinti első primerrel és templátként funkcionálhat egy lánchosszabbítási termék előállításánál létrehozandó egy DNSRNS kettős szálat, mely egy ötödik komplementaritású DNSt tartalmaz, amit egyes szálúvá alakít a reverz transzkriptáz belső lényegéből eredő RN-áz H aktivitása. Lásd 2b Ábra, steps 7a-10a. A IV(a) Képlet szerinti egyik második primer azonnal hibridizálódik és láncnöveléssel egy kettős szálú cDNS II molekulát hoz létre, mely azonos azzal a cDNS II molekulával, mely a Vll(a) és Vlll(a) Képletek szerinti DNS ···· ·« · «»·* láncokból épül fel. A cDNS II mindkét végén tartalmaz egy teljesen kettős szálú promótert. (2b Ábra, steps 11a-12). Az átírás tovább haladhat a két DNS szál bármelyikén értelmes átiratok (azaz, a cél szegmentumok szekvenciáját hordozó szegmentumot tartalmazó átiratok) és ellenkező értelmű átiratok (azaz, a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú szegmentumot tartalmazó átiratok) többszörös másolatait eredményezve, s ezzel mintegy táplálva a két komplementer szaporítási körfolyamatot.

A fent említett reakció cikluson keresztül egy cél szegmentumot tartalmazó RNS egy vagy több molekuláját szaporíthatjuk fel - hökezelési ciklusok alkalmazása vagy enzimek ismételt hozzáadása nélkül - 2 óra alatt egy olyan RNS átirat 106 vagy még több darabszámú másolatává, mely RNS átirat a cél szegmentum vagy annak komplementere szekvenciáját hordozó szegmentumot tartalmaz. A jelen találmányban megadott 3SR reakció - a jelen találmányban megadott továbbfejlesztett reakció közegben kivitelezve - csak két enzimet igényel - reverz transzkriptázt és DNS-dependens RNS-polimerázt - biztosítandó a szükséges négyféle enzim aktivitást.

Jóllehet, az eljárás fenti leírása lépésről-lépésre történt, a későbbiekben nyilvánvaló lesz, hogy a gyakorlatban a különböző lépések mindegyike egyszerre folyik nagyon összetett, egymással nagymértékben kölcsönható módon.

Amíg a fent leírt szaporítási mechanizmus egy promoter funkciót biztosító szegmentumot tartalmazó (azaz, egy promoter értelmű szekvenciát magában foglaló) ellentétes értelmű prímért alkalmaz, addig a 3SR szaporítás kivitelezhető úgy is, hogy az értelmes primer tartalmazza a promoter funkciót biztosító ···· ···» ·· 4 • · · · ··· · 0 szegmentumot és az ellentétes értelmű primer nem. Ebben a kivitelezésben az RNS cél molekula az 5'-irányban nem terjedhet túl az RNS cél szegmentum 5'nukleotidján (azaz, az (5'-alszegmentumtr) jelölésű alszegmentum 5’-nukleotidja a cél molekula 5'-nukleotidja kell legyen). Amikor a cél szegmentum 5'-terminális nukleotidja a teljes cél RNS molekula 5'-terminális nukleotidja, a szaporítás a 2a és 2b Ábrákon bemutatott lépésekkel analóg lépések szerint fog lezajlani, azonban a keletkező átiratok olyan értelmes átiratok lesznek, melyek közvetlenül belépnek a 7a-12 lépésekkel ábrázolt szaporítási körfolyamatba. Ellentétes értelmű átiratok nem képződnek.

Egy mód, hogy biztosítsuk, hogy az RNS cél molekula 5'-terminális nukleotidja az RNS cél szegmentum 5'-terminális nukleotidja legyen, az az, hogy olyan előre meghatározott nukleinsav szekvenciájú RNS cél szegmentumot szaporítunk, mely az RNS cél molekula 5’-végénél található. Ezen a módon megfelelő szekvenciát biztosíthatunk a promóter funkciót ellátó értelmes primer számára: Például, egy megfelelő értelmes primer tartalmazhat egy olyan DNS szegmentumot, amelyik magában foglal egy promóter értelmű szálat az átírás szempontjából működőképesen hozzákapcsolva egy olyan szegmentumhoz, amelyik rendelkezik egy olyan szekvenciával, amely homológ pl. az RNS cél molekula 5'-terminális nukleotidját magában foglaló RNS cél molekula 5'-végén található 20 nukleotidból álló szegmentummal és innen számítva 19 nukleotid hosszúságban terjed ki. Az ellentétes értelmű primer egy olyan DNS szegmentumot tartalmazhat, mely a cél szegmentum 3'-végén lévő egy szegmentummal komplementer szekvenciával rendelkezik.

Λ ·

Egy második mód egy olyan RNS szegmentum biztosítására, mely megfelel annak a korlátozásnak, hogy a cél RNS molekula 5'-terminális nukleotidja a cél szegmentum 5'-terminális nukleotidja, az az, hogy egy, a cél szekvenciát magában kódoló DNS szegmentumból egy ilyen RNS cél molekulát állítunk elő a TAS szaporítási eljárás egy ciklusának végigvitelével. így tehát, egy megfelelő cél RNS szegmentum megalkotható egy, a cél szekvenciát bizonyosan magában kódoló kettős szálú DNSből (vagy egyes szálú DNS-ből vagy RNS-ből). Például, amikor a szóbanforgó cél szegmentumot egy kettős szálú DNS kódolja, az első és második DNS prímért hozzáadjuk a reakció elegyhez és az oldatot körülbelül 94- 100 oC-on tartjuk 1 percig, majd 1 perc leforgása alatt 42 oC-ra lehűtjük. Ez a hőkezelés, majd a 42oCon való tartás, kombinálva az oldat összetételével, biztosítják azokat a szorossági feltételeket, melyek elegendőek ahhoz, hogy az első primer és a második primer hibridizálódjék a fentemlített kettős szálú DNS két komplementer szálával olyan, elegendően stabil módon, hogy az iniciáló oligonukleotidokkal elindulhasson a láncnövelési reakció. Reverz transzkriptázt vagy DNS-dependens DNS-polimerázt (valamint, ha korábban még nem adtunk hozzá, a szükséges nukleozid trifoszfátokat) adunk a reakcióhoz, ,hogy a láncnövelési reakció polimerizációs lépése végbemenjen. A Thermus aquaticus-ból kinyert hőstabil DNS-polimerázt (lásd Chien et al. J. Bacteriol. 127, 1550 (1976)), a SequenaseTM márkájú rekombináns T7 DNS polimerázt az U. S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, U.S.A. cégtől, és az E. coli DNS polimeráz I jól ismert Klenow Fragment-jét, valamint a borjú tímusz DNS polimeráz alpha-t használhatjuk.

A nukleinsavat tartalmazó oldatot ismét 1 percre 100 oC-ra melegítjük, majd 1 perc alatt 42 oC-ra hűtjük, mely lépés során az első és második primerek hibridizálódnak a megelőző primer láncnövelési reakció láncnövelési termékeivel. A 2-enzimes 3SR esetében ezután reverz transzkriptázt és DNS-dependens RNS-polimerázt adunk az elegyhez, úgyhogy a hibridizálódott iniciálé oligonukleotidok (primerek) láncnövelésével teljesen végbemegy a cDNS szintézis és a cDNS átíródik, előállítandó a cél RNS átiratokat. Ezáltal iniciálódik a 3SR szaporítás.

A TAS szaporítás egy ilyen ciklusa által előállított cél RNS szegmentumnak megvan a maga 5'-vége és 3'-vége, melyeket a felhasznált iniciáló oligonukleotidok, primerek, határoznak meg. Egy ilyen RNS éppen ezért kielégíti azt az igényt, hogy az RNS cél molekula 5'-terminális nukleotidja a cél RNS 5'-alszegmentumának 5'terminális nukleotidja. Azt is világosan kell látnunk, hogy a TAS szaporítás egy ilyen ciklusa úgyszólván állandóan használható a 3SR szaporításhoz alkalmas RNS cél szegmentum előállítására, függetlenül attól, hogy melyik primer(ek) tartalmaz(nak) egy promóter szekvenciát. Lásd II. Példa.

A jelen találmány kívánatos megvalósítási formáiban a szóbanforgó nukleinsav szaporítható cél szegmentuma rendelkezik egy legalább 20, még inkább legalább mintegy 50 nukleotidot magában foglaló (átmeneti alszegmentumtr) szegmentummal, miáltal tetszőlegesen lehetővé válik egy második 3SR szaporítási ciklus használata a harmadik és negyedik DNS primerek felhasználásával, hogy az (átmeneti alszegmentumtr) szegmentumot felszaporítsuk a szaporítási módszer egy továbbfinomított változatában. Az (átmeneti alszegmentumtr) szegmentumot arra is használhatjuk, hogy 3SR-előállítású átiratokat mutassunk ki egy nukleinsav hibridizációs vizsgálattal, aholis a (változékony alszegmentum) nem rendelkezik egy olyan nem-cél szegmentummal, mely használható lenne erre a célra.

• · · · · · · • · · · • · · · · · • · · · · ·

Többek között, a jelen találmány azt a felismerést tartalmazza, hogy két enzim - egy retrovirális reverz transzkriptáz és egy DNS-dependens RNS-polimeráz önmaguk által és a reverz transzkriptáztól különböző külső eredetű RNáz H aktivitási forrás hiányában - képes biztosítani a nagy érzékenységű 3SR szaporításhoz szükséges négyféle enzim aktivitást, melyhez szükséges az RNáz H aktivitásnak a nagy érzékenységű szaporításhoz hatékony mennyisége. A reverz transzkriptáz belső RNáz H aktivitása növelésének egy ilyen módszerében a reakció kivitelezését egy olyan reakció közegben végezzük, mely tartalmaz körülbelül 20-tól 40 mM magnézium-tartalmú sót, mint például magnézium-kloridot, magnézium-szulfátot és hasonlókat; körülbelül 1-től 25 mM alkáli fém-kloridot, mint például KCI-t vagy NaCI-t és hasonlókat; körülbelül O-tól 20 mM szulfhidril tartalmú redukáló ágenst, mint például ditiotreitolt (DTT), béta-merkaptoetanolt és hasonlókat; körülbelül O-tól 10 mM spermidint; körülbelül 1-től 8 mM ribonukleozid trifoszfátokat; körülbelül 1 mikromól-tól 8 mM 2'-dezoxiribonukleozid trifoszfátokat és körülbelül O-tól 25 térfogat százaléknyi szulfoxid vegyületet, mint például dimetilszulfoxidot.

A kívánatos reakció közeg tartalmaz:

- 40 mM MgCI2

- 25 mM KCI

1-10 mM spermidin

- 20 mM DTT

- 7 mM rNTP

0.01 -2 mM dNTP

-15% dimetilszulfoxid (térfogatra) • · · · · 4 4 • · · · · · ··«· *** és egy alkalmas puffért (Tris, HEPES, stb.) úgy, hogy az említett reakció közeg pH-ja körülbelül 7.5 és körülbelül 8.5 között legyen, kívánatosán pH 8.1. Amikor az AMV reverz transzkriptáz az RNáz H aktivitás forrása, szükség van DMSO-ra.

A jelen találmányt megelőzően a 3SR reakciókról azt tartották, hogy gyakorlatilag kivitelezhetetlenek, ha a négyféle igényelt enzim aktivitás forrásaként csak egy retrovirális reverz transzkriptázt, úgymint AMV reverz transzkriptázt, és egy DNSdependens RNS-polimerázt használunk és ugyanakkor mintegy 103 nagyságrendnél nagyobb szaporítási szintet kívánunk elérni. A feltalálók felismerték, hogy a javított reakció közeg - meglepő módon - lehetővé teszi, hogy a retrovirális reverz transzkriptáz belső lényegű RNáz H aktivitása úgy funkcionáljon, hogy biztosítsa ilyen 3SR szaporítási szintek elérését még akkor is, ha hiányoznak egyéb RNáz H aktivitás források, mint például E. coli RNáz H.

A feltalálók felismerték azt is, hogy ha egy ilyen reakció közeget körülbelül 1-től mintegy 25 tömegszázalékig kiegészítjük hidroxil tartalmú vegyülettel, az egyébként elérhető szaporítási szint meglepő módon megemelkedik. A hidroxil tartalmú vegyületek közé értjük, nem kizárólagosan, a C1 - C10 alkoholokat, mint például a metanolt, etanolt, propánok, izopropanolt, butanolt, izobutanolt és hasonlókat; a glikolokat, mint például az etilén-glikolt, dietilén-glikolt, trietilén-glikolt és polietilénglikolokat, melyek molekulatömege körülbelül 20,000 daltonig terjedhet, s amelyek vízoldhatóak; a mono-, di- és triszacharidokat, mint például a glükózt, galaktózt, mannózt, fruktózt, szukrózt, maltózt, raffinózt és hasonlókat; és cukoralkoholokat, mint például szorbitot, glicerint, glucitot, mannitot, inozitot és hasonlókat.

• · · «

A jelen találmány kifejlesztett reakció közege ezért kívánatos módon tartalmaz egyet vagy többet az alábbi vegyületek közül: (i) egy C1 - C10 alkohol; (ii) a következő képlet szerinti egy vegyület: HOCH2(CHOH)xCH2OH, ahol x: 0 - 20; (iii) egy polietilén-glikol vegyület az alábbi képlet szerint: H(OCH2-CH2)nOH, ahol n: 2 - 600, vagy ilyen vegyületek egy keveréke, ahol az átlagos molekulatömeg körülbelül 1,000 - körülbelül 20,000 közé esik, kívánatosán körülbelül 6,000 - körülbelül 10,000 közötti és (iv) egy cukor a mono-, di- és triszacharidok csoportjából és azok származékai közül. Előnyös vegyületek a fentebb definiált formulákkal megadottak közül: etanol, glicerin, szorbit, szukróz és PEG-8000. Az alább következő példák közül több is mutatja, hogy a szulfoxid és hidroxil tartalmú vegyületek hatással vannak a 2enzimes 3SR- vagy a 3-enzimes 3SR módszerrel elérhető szaporítási szintekre.

A reverz transzkriptázok (RT) közül legelőnyösebbek az AMV reverz transzkriptáz, a rekombináns MMLV reverz transzkriptáz és a HIV-1 reverz transzkriptáz, mely utóbbinak hiányzik az 5' - 3'-irányú exonukleáz aktivitása.

A kifejlesztett reakció közeget ki kell egészíteni egy az alábbi képlet szerinti szulfoxid vegyülettel: R1-(SO)-R2, ahol R1 és R2 - egymástól függetlenül - C1 - C4 alkil csoportok, illetve ahol R1 és R2 összekapcsolódhatnak egy telített gyűrűs csoport részeiként (előnyösen 10 térfogat% dimetilszulfoxid (DMSO)), ahol AMV reverz transzkriptázt alkalmazunk a 2-enzimes 3SR számára, de egy ilyen szulfoxid vegyület elhagyható, ha MMLV-, HIV-1- vagy más retrovírus-eredetű reverz transzkriptázt használunk.

A kifejlesztett reakció közeg további javulást eredményez az E. coli RNáz H jelenlétében kivitelezett 3SR reakciók szaporítási szintjeiben. Újra, DMSO vagy más szulfoxid tartalmú vegyület használható, hogy AMV reverz transzkriptázt alkalmazó 3-enzimes 3SR reakciók szaporítási szintjeit megnöveljük.

A reakció közeget ki kell egészíteni 0.1 -10 mM MnCI2-vel vagy hasonló mangánsóval, ha a jelen találmány szerinti 2-enzimes 3SR reakciókban MMLV reverz transzkriptázt alkalmazunk.

A 2-enzimes 3SR-nél az rNTP koncentráció a jelen találmány szerinti kifejlesztett reakció közegben legelőnyösebben 6 mM körüli kell legyen, bár a 3-enzimes 3SRnél az rNTP-k kisebb koncentrációi is alkalmazhatók a fejlesztett reakció közegben. Váratlan mértékű, 10-szeres vagy még nagyobb szaporítási szint növekedéseket nyertünk azokban a 2-enzimes 3SR reakciókban, ahol az rNTP koncentrációt 4 mMról 6 mM-ra növeltük a kifejlesztett reakció közegben, jóllehet, az rNTP-k kisebb koncentrációja a szubsztrát nagy moláris többletét reprezentálja. Az rNTP-k körülbelül 8 mM-nál vagy 9 mM-nál nagyobb koncentrációi úgy tűnik, csökkentik a két-enzimes 3SR reakciókban nyerhető szaporítási szinteket.

Alii. Példa az alábbiakban demonstrálja a találmánybeli fejlesztett reakció közeg kapacitását, nem közöltek olyan, a technika korábbi állása szerinti reakció közeget, mely alkalmas a 3-enzimes 3SR céljára vagy fenntartana 2-enzimes 3SR-t.

Jelenleg, szaporítási reakciókként (100 mikroliter) a 2-enzimes 3SR reakciókban előnyösen használható megközelítőleg 10 egységnyi AMV reverz transzkriptáz és 20 egységnyi T7 RNS polimeráz. Érdekes módon, a 3-enzimes 3SR szaporításhoz nem csak E. coli RN-áz H szükséges, de szignifikánsan magasabb koncentrációjú reverz transzkriptáz (30 egység) és RNS polimeráz (60 - 100 egység) is.

«

A cél szegmentum hosszúságának vonatkozásában, 1500 nukleotidnál kisebb primerek közötti - inter-primer - távolságok kívánatosak, gyaníthatóan a szorossági feltételek hiányának, mely körülmények jellemzik a 3SR reakciók kivitelezését. Általában, a körülbelül 200 nukleotid hosszúságnál hosszabb cél szegmentumok hatékonyabban szaporíthatok, ha a reakció közeget kiegészítjük körülbelül 1-től körülbelül 25 tömegszázaléknyi alkohol vagy polihidroxi vegyülettel mind a 2enzimes, mind a 3-enzimes módszereknél. Különösképpen kívánatos, hogy a találmány szerinti fejlesztett reakció közeget kiegészítsük körülbelül 5 és körülbelül 15 közötti tömegszázaléknyi - az alábbi formulával megadott - cukoralkohollal: HOCH2(CHOH)xCH2OH, ahol x: 0 - 20, előnyösebben x: 0 - 5, és legelőnyösebben, ahol a vegyület szorbit vagy glicerin.

Egy, a jelen találmány szerinti előnyös reakció közeg a 2-enzimes 3SR szaporítás kivitelezésére egy vizes oldat az alábbi összetétellel:

PUFFER: Tris pH 8.1,40 mM.

MgCI2, 30 mM,

KCI, 20 mM, DTT, 10 mM, Spermidin, 4 mM.

NUKLEOTIDOK: rNTP, 6 mM, dNTP, 1 mM.

• · · • ♦ « · «« ········ ·«· *·♦· · ·,

INICIÁLÓ OLIGONUKLEOTIDOK (PRIMEREK):

0.25 mikrogram értelmes primer, mely tartalmaz egy 15 bázisú cél kötő régiót; és

0.25 mikrogram ellentétes értelmű primer, mely tartalmaz egy 15 bázisú cél kötő régiót működőén összekapcsolva egy promóter szekvenciával (mely körülbelül bázist tartalmaz).

ENZIMEK: AMV Reverz Transzkriptáz, 10 egység/100 mikroliter reakció elegy (10% dimetilszulfoxidot (DMSO) és 15% szorbitot tartalmazó reakció oldat) vagy

MMLV Reverz Transzkriptáz,

1000 egység/100 mikroliter reakció oldat (1 mM MnCI2 és 15% szorbit tartalmú reakció oldat) és

T7 RNS Polimeráz, 20 egység/100 mikroliter reakció oldat.

A reakció keverék hőmérséklete is jelentős hatással van az elérhető szaporítási szintre a 2-enzimes vagy 3-enzimes 3SR szaporítás során. Amíg a szaporítási reakció kivitelezhető ugyan körülbelül 5oC és körülbelül 50oC közötti hőmérsékleten, előnyösebb a szaporítási reakciót körülbelül 37oC és körülbelül 47oC közötti hőmérsékleten kivitelezni, és legelőnyösebb körülbelül 42oC-on. A reakció • 1 • · · ·

hőmérséklet különösképpen fontos a jelen találmány szerinti 2-enzimes 3SR módszereknél, a 42oC-on végzett erősítés megközelítően 100-szorosan hatékonyabb a 37oC-on végzettnél. Ugyancsak, a szaporítási sebességek 2 - 3-szor nagyobbak a 42oC - 45oC hőmérsékleti intervallumban egy alkohol vagy polihidroxil-tartalmú adalék, mint például szóróit, glicerin, etanol és hasonlók jelenlétében, továbbá DMSO vagy hasonló szulfoxid vegyület jelenlétében, amikor reverz transzkriptázt használunk.

A 3SR reakció hatékonyabb lehet az egyik szaporítási ciklusban, mint a másikban. Éppen ezért, amikor mind az értelmes, mind pedig az ellentétes értelmű primer tartalmaz egy promótert kódoló szegmentumot, vagy az értelmes, vagy pedig az ellentétes értelmű termék dominálhat, valószínűleg azért, mert a cDNS kettős szálú promóter szegmentumától leolvasási irányban lévő szekvenciák szignifikáns hatást gyakorolhatnak az átírási sebességekre.

Egy másik aspektusában a jelen találmány egy láncnövelési reakciót elindítani képes iniciáló DNS oligonukleotidokra - primerekre - vonatkozik, melyek egy olyan promóter értelmű szállal rendelkeznek, ami legalább 1-10 nukleotidot tartalmaz 5'-irányból kiterjedve és a szegmentum utolsó 5'-nukleotidjához kapcsolódva a promóter polimeráz kötőhelyének értelmes szálával (előnyösen a promóter konszenzus szekvenciája szekvenciájával). A feltalálók meglepő módon felfedezték, hogy a promóter értelmű szállal rendelkező primer promóter funkciót biztosító szegmentumának hosszúsága és szekvenciája jelentős hatást gyakorol a 3SR-ben történő szaporítás szintjére. Azt találták, hogy az 5'-végükön megcsonkított primerek, tehát amelyek a promóter konszenzus szekvencia 5'-nukleotidjával nem rendelkeznek (a primer 5-vége a konszenzus szekvencia 5'-végi nukleotidja) • · körülbelül 105-szer kisebb szaporítási szintet produkálnak 1 óra alatt 42oC-on a jelen találmánybeli fejlesztett reakció közegben. Amint az ismeretes, egy promoter számos részből áll. Előszöris, egy polimeráz kötő szegmentummal rendelkezik, mely a kettős szálú DNS-nek az a szegmentuma, amihez az átírás iniciálásakor a polimeráz kötődik. Egy promoter legalább egy polimeráz kötő szegmentummal kell rendelkezzék ahhoz, hogy az átírásban funkcióképes legyen. Úgy gondolják, hogy a konszenzus szekvencia az a minimálisan szükséges szekvencia - teljes mértékben kettős szálú formában -, mely az átírás iniciációjának folyamatában az RNSpolimeráz megkötéséhez szükséges. Tetszőlegesen kívánatos lehet, hogy közvetlenül a konszenzus szekvencia mellé (leolvasási irányban) beékeljünk egy szegmentumot, melyet az alábbiakban transzkripciós iniciációs szekvenciaként említünk. A T7 promoterhez tartozó konszenzus szekvenciát mutatjuk be az alábbiakban. A többi promoter konszenzus szekvencia jól ismert a szakirodalomban. Például, a T3 konszenzus szekvencia értelmes szála 5'ATTAACCCTCACTAAA-3' és a T3 transzkripciós iniciációs szekvencia 5'-GGGA-3'. Az SP6 promoter két változata is jól ismert. Az SP6 promoter értelmes szálának konszenzus szekvenciája (1. változat) 5'-ATTTAGGTGACACTATA-3' és az SP6 promoter értelmes szálának konszenzus szekvenciája (2. változat) 5'AATTAGGGGACACTATA-3'; a transzkripciós iniciációs szekvencia az SP6 promoter 1. és 2. változatára egyaránt 5'-GAAG-3'. Ahol a cél szegmentum kezdeti koncentrációja a körülbelül 0.01-1 attomól per 100 mikroliter alikvot koncentráció intervallumba esik - egy olyan koncentrációról van szó, mely nem szokatlan például HIV-1 vírus vagy egy betegségállapotra jellemző hibás gén jelenlétének kimutatásánál ott egy ilyen szaporítási szint az általános nukleinsav hibridizációs vizsgálatokkal nem kimutatható. Azonban, azok a promoter funkciót ellátó primerek, melyek akárcsak 1 további nukleotiddal rendelkeznek, mely a promoter konszenzus • « · szekvencia 5'-végéhez kapcsolódik, meglepő módon mintegy 10-szeres szaporítási növekedést produkálnak; valamint minden további nukleotid, egészen egy 4nukleotidos szekvenciáig, mely a konszenzus szekvencia 5'-végéhez kapcsolódik, egy további 7-től 10-szeres növekedést eredményez. Ha egy oligonukleotidot az 5'végétől kezdve meghosszabbítunk több mint 4 nukleotiddal egészen körülbelül 10 nukleotidig, akkor - egy promoter konszenzus szekvenciához viszonyítva - a szaporítási szint az 1-től 4 nukleotidos meghosszabbítással elért szaporítási szint fölé vihető, ahogy azt a következő Táblázatban bemutatjuk.

Az alábbi Táblázat bemutatja azokat a - 3SR szaporítási szintekre vonatkozó meglepő eredményeket, melyeket azután nyertünk, hogy egy iniciáló DNS oligonukleotid (primer) promoter értelmű szekvenciája hosszát és nukleotid szekvenciáját módosítottuk a leolvasási iránytól (5'-iránytól) kezdve.

Τ7 PROMOTER SZEKVENCIÁKAT TARTALMAZÓ INICIÁLÓ

OLIGONUKLEOTIDOK (PRIMEREK) 5'-VÉGÉNÉL TALÁLHATÓ NUKLEOTID

SZEKVENCIA HATÁSA A 3SR SZAPORÍTÁSOKRA

Oligo- Szekv. hossz

Szap.

nukleo- azon, (nukleomérték tid szám tidokban)

Szekvencia

90-425	1	59	5' -17 +1 3' 5 1AGTAATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	3.1x10®
63-347	2	56	5'	AATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	1.9x10®
90-573	3	56		GATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	6.5x107
90-575	4	56		GCTTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2.3x107
90-577	5	56		GCGTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	5.5x107
90-574	6	56		GCGCTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	1.1X10®
90-427	7	55		ATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	1.2x10®
90-428	8	54		TTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	5.5x107
90-576	9	54		GTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2.5x107
90-579	10	54		CCTAATACGACTCACTÁTAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2.1x107
90-429	11	53		TTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	1.1x107
90-205	12	52		TAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	<105
90-206	13	51		AATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	<105

·»·· *··*··» ' · ·« ···· · ··

1/: A kódoló szál szekvenciáját láthatjuk. Az aláhúzott szekvencia a meghatározó 17 nukleotid hosszúságú T7 promoter szekvenciát jelzi, és az RNS átírás iniciációs helyét a +1 jelzés mutatja. A GGGA szekvencia a T7 szekvenciából nyúlik ki; az előre nyúló +5 nukleotidok a HIV-1 szekvencia; a rákövetkező szekvenciák azonosak mindegyik oligonukleotidnál. Az oligonukleotidokat úgy helyeztük el egymás alá, hogy szembetűnjenek a primerek közötti különbségek.

2/: A 3SR reakciókat az alábbi összetételű 50 mikroliteres térfogatokban folytattuk 1 - 2 órán át, 42 oC-on: 0.05 attomól (kb. 1000 molekula) HIV-1 RNS célmolekula, 30U T7 RNS-polimeráz, 2U E. coli RNáz H, 15U AMV RT, 40 mM Tris, pH 8.1, 30 mM MgCI2, 20 mM KCI, 10 mM DTT, 4 mM spermidin, 1mM dXTP, 7 mM rXTP és 0.125 mikrogram iniciáló oligonukleotid. Ugyanazt az alap prímért - 89-255 (Szekvencia azonosító szám: 14) (5'TTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTA3') (Ratner et al. 1985) - használtuk a táblázatban felsorolt összes prímeméi. Az előállított RNS termék 214 nukleotid hosszúságú. A felszaporított cél molekulák mennyiségi meghatározása ún. gyöngybázisú szendvics hibridizációval (beadbased sandwich hybridization, BBSH) történt, ahol 25 mg gyöngybázist alkalmaztunk, mely tartalmazott 86-273 befogó (capture) oligonukleotidot, és 100 fmólos jelzett 32P alkalmazásával mutattuk ki a 87-81 oligonukleotidokat (Guatelli et al. 1990). Az összes szaporítási érték, a 88-347-re vonatkozóak kivételével, két 3SR reakció átlaga, és ezen szaporítási reakciók mindegyikét duplikált BBSH reakciókkal analizáltuk. A 88-347-tel kivitelezett 3SR szaporítások hat 3SR reakció átlagát reprezentálják.

····

A fentiekben leírt körülmények között kivitelezett szaporítás megmutatta, hogy ahol a T7 konszenzus szekvencia mellett az 5'-végen nem volt legalább egy nukleotid, mely a konszenzus szekvencia végső 5'-nukleotidjához kapcsolódott, 105-szeresnél nagyobb mértékű szaporítást nem lehetett kimutatni. A jelen találmány szerinti promóter tartalmú primerek, melyek a konszenzus szekvencia 5'-végső nukleotidjához kapcsolódóan 1-10 nukleotidot, illetve előnyösen 1 - 4 nukleotidot tartalmaztak, szignifikánsan megnövelték a szaporítási szinteket a technika korábbi állása szerinti promóter funkciót biztosító primerekhez képest.

Bár nincs szándékunkban belemerülni az elméletbe, úgy gondoljuk, hogy a konszenzus szekvencia 5'-végéhez kapcsolódó egy-től tíz nukleotid hosszúságú szekvencia biztosítja, hogy a reverz transzkriptáz legalább addig asszociálódva marad a DNS templát szállal, amíg egy teljesen kettős szálú promóter szegmentummal rendelkező cDNS szintézise be nem fejeződik.

A konszenzus szekvenciát (feltehetően a polimeráz kötő szegmentumot) tartalmazó promóter szegmentum teljesen kettős szálúsága feltehetően lényeges a promóterről történő hatékony átírás szempontjából.

Az alábbiakban következő Példákban használt oligonukleotid primerek - hacsak mást külön nem említünk - azzal a nukleotid szekvenciával rendelkeznek, mely megfelel a HIV-1 genom jelzett régiójának, ahogy azt Ratner et ah, Natúré (London) 313, 277-284 (1985) bemutatták, melyet az alábbiakban, mint referenciát használunk. Hacsak mást külön nem jelölünk, egy csillaggal (*) adjuk meg az 5'AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGA-3' (SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 15) szegmentumot tartalmazó promótert biztosító oligonukleotid prímért, aholis az aláhúzott szekvencia a promóter azon 17 nukleotidot tartalmazó konszenzus szekvenciája, melyet a T7 bakteriofág DNS-dependens RNS-polimeráz felismer. A konszenzus szekvencia 5'-végén lévő 4 nukleotidot tartalmazó szekvenciát (5'-AATT3') a továbbiakban úgy definiáljuk, hogy beleértjük a promóter értelmű szál kifejezésbe, és így - az előbbi kfejezés mintájára - a konszenzus szekvencia 3'végén lévő 4 nukleotidot tartalmazó szegmentumot (pl. 5'-GGGA-3' vagy 5'-GAAA-3', stb.), mely a T7 transzkripciós iniciációs szegmentum, a primer egy változékony alszegmentumának nevezzük. A promóter értelmű szálnak megfelelő promóterről készült átiratok fogják tartalmazni az ezen változékony alszegmentumnak megfelelő szekvenciát. Például, az a promóter tartalmú kereső oligonukleotid, melynek jelzése 88-347*, egy olyan szegmentumot tartalmaz, mely a HIV-1 genom azon szegmentumának a komplementere, mely megfelel a következő nukleotidoknak: 6661-6631 (beleértve) a transzkripciós iniciációs szekvenciának, 5'-GGGA3', megfelelő 4 nukleotidos változékony alszegmentumot és a 21 nukleotidos promóter értelmű szálat a fentiekben megadott szekvenciával, és így áz alábbi teljes szekvenciával rendelkezik:

5'-AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA-3'. (SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 2)

A következő oligonukleotid primerek (jelölve primer #) nukleotid szekvenciáit a fenti konvencióknak megfelelően mutatjuk be. Ezen oligonukleotidok közül többet is meghivatkozunk majd a részletes leírásban és példákban alább. Az értelmes jelölés azt jelenti, hogy a primer egy olyan szegmentumot tartalmaz, melynek szekvenciája megegyezik a H1V-1 genomból kijelölt szegmentum szekvenciájával. Az ellenkező értelmű jelölés azt jelenti, hogy a primer egy olyan szegmentumot i

tartalmaz, melynek szekvenciája komplementer a HIV-1 genomból kijelölt szegmentum szekvenciájával.

Oligonukleotid ÉRTELMES (SENSE)

Nukleotid

Primer # VAGY ELLENKEZŐ ÉRTELMŰ (ANTISENSE) RÉGIÓJA

HIV-1

Pozíciók ENV

88-211* 89-255	1/	(sense) (sense)	6450 - 6450 -	6479 6479
(SEQ ID NO:	14)
88-299			(sense)	6486 -	6515
89-332			(sense)	6494 -	6508
88-33			(sense)	6419 -	6440
90-106*			(sense)	6419 -	6446
88-348*			(sense)	6419 -	6446
88-347*	(SEQ ID NO:	2)	(antisense)	6661 -	6631
89-263*			(antisense)	6830 -	6801
86-274			(antisense)	6691 -	6661
88-346			(antisense)	6830 -	6801
90-66			(antisense)	6918 -	6891
90-69			(antisense)	7101 -	7070
85-237			(antisense)	7255 -	7226
85-235			(antisense)	7335 -	7306
90-72*			(antisense)	7255 -	7226
90-71*			(antisense)	7335 -	7306
90-187*			(antisense)	7899 -	7870
86-273			(sense)	6591 -	6620
87-81			(sense)	6551 -	6577
87-79			(sense)	6419 -	6443

• · · ·

1/ A 88-211 Primer#-ben a transzkripciós iniciációs helynek megfelelő változékony alszegmentum az 5'-GGGATC-3' szekvenciával rendelkezik és nem pedig az 5'-GGGA-3' szekvenciával.

Egy másik vonatkozásában a találmány olyan módszerekre vonatkozik, melyek hasznosak, hogy kimutassunk legalább egy specifikus RNS cél szegmentumot egy nukleinsav tartalmú mintában, felszaporítsuk az említett RNS cél szegmentumot a fentiekben említett módszerek szerint és kimutassuk a jelenlétét olyan RNS átiratoknak, melyek egy olyan szekvenciát tartalmaznak, mely azonos vagy komplementer a szóbanforgó cél szegmentum szekvenciájával. Felszaporított nukleinsav termékek kimutatása kivitelezhető jól ismert nukleinsav hibridizációs eljárásokkal. A II. Példa leírja a gyöngybázisú szendvics hibridizációs eljárást, mely egy előnyös módszer szaporítási termékek kimutatására. Mások mellett, a szaporítás megjelenítésére szolgáló kimutatási módszerekben használhatunk ribonukleozid trifoszfátokat, melyeket megjelöltünk valamilyen radioaktív izotóppal, vagy egy kromogén vagy fluorescensz szubsztráttal, vagy valamilyen csoporttal, mint például biotinillel, mely komplexet képezhet egy színanyag képződéssel járó reakciót katalizáló enzimmel, amint az a technika korábbi állásából jól ismert, és így egy hibridizációs eljárásban kimutathatjuk az ily módon megjelölt rNTP-ket magukban foglaló RNS átiratok jelenlétét.

Ahogy azt korábban említettük, a találmány eszközöket is ad a találmány szerinti szaporítási módszerek kivitelezéséhez. A találmány szerinti egyik ilyen kivitelezési készlet tartalmazhat egy értelmes és egy ellentétes értelmű iniciáló oligonukleotid prímért (egyik vagy mindkettő tartalmaz egy promoter értelmű szálat), a 2-enzimes 3SR szaporításra alkalmas reakció közeg komponenseit, és mindössze a primerek promótereinek megfelelő bakteriofág eredetű DNS-dependens RNS-polimeráz(oka)t és egy reverz transzkriptázt. Alternatív módon, a találmány szerinti másik készlet tartalmazhatja a 3-enzimes 3SR-hez szükséges komponenseket, beleértve egy enzimet, mely ellát RNáz H aktivitást, de nem egy reverz transzkriptáz, és egy olyan vizes oldatot, mely biztosítja a találmány szerinti kifejlesztett reakció közeget, illetve azokat a vegyületeket (pl. sókat, puffereket, hidroxi vegyületeket, DMSO-t, nukleozid trifoszfátokat), melyek egy ilyen javított reakció közeg elkészítéséhez szükségesek.

A találmány magában foglalja a fejlesztett reakció közeget is.

Nukleinsav hibridizációs vizsgálatok (egy cél szegmentumnak a találmány szerinti felszaporításánál) kivitelezésére alkalmas módszerek és eszközök tartalmazhatják továbbá azokat a lépéseket és komponenseket, melyek szükségesek, hogy a találmány szerinti szaporításban keletkező RNS terméket kimutassuk. A gyakorló szakember megérti azokat a különböző további lépéseket, illetve komponenseket, melyeket egy szaporítási eljárásból származó RNS kimutatása igényel, amikor a technika állásából ismert sokféle nukleinsav hibridizációs eljárás bármelyikét alkalmazzuk. Egy előnyös nukleinsav hibridizációs módszert, mely jelzett felszaporított RNS gyöngybázisú befogásán alapul, all. Példában mutatjuk be az alábbiakban.

A találmányt a következőkben Példák útján mutatjuk be nagyobb részletességgel.

• · · · • · · · • · · · • « ··« · · · a · ·«·· «

I. PÉLDA

TRISZAKRIL GYÖNGYHÖZ RÖGZÍTETT KERESŐ OLIGINUKLEOTIDOK ELŐÁLLÍTÁSA

Egy 5'-aminohexil foszforamidát oligonukleotid származékot állítottunk elő úgy, hogy 5'-foszforilált 88-297 oligonukleotidot (5TGGCCTAATTCCATGTGTACATTGTACTGT-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 16) reagáltattunk 1,6-diaminohexánnal 0.25 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimiddel 0.1 M metilimidazolban, pH 6.0, ahogy azt korábban közölték Chu et al., Nucleic Acids Rés. 11,6513-6529 (1983). Elengedhetetlen, hogy ezt a reakciót frissen szilanizált Eppendorf csövekben végezzük, hogy megelőzzük a nukleinsavak aspecifikus kötődését a csövek falára. Az amin származékot kétszeri EtOH/LiCI-os kicsapatással izoláltuk. Jellemzően, az N-szukcinimidil-bromoacetát (lásd Bernatowicz et al., Anal. Biochem. 155, 95-102 (1986)) 10 mg/ml-es N,Ndimetilformamidos oldatának egy 150 mikroliteres alikvotját hozzáadtuk 2.5 nmol 5'aminohexil-foszforamidát oligonukleotid származékhoz 1.1 ml 0.2 M HEPES tartalmú oldatban, pH 7.7. 1 órás reakció idő után az oligonukleotidot kétszer kicsapattuk etanol/LiCI-dal.

Triszakril GF2000 (Réactifs IBF, Pointet Girard, Francé) amino csoportokkal képzett származékát úgy állítottuk elő, hogy a gyanta 20 ml-es szuszpenzióját, melyet egy szinterezett üvegszürőbe pipettáztunk, átmostuk 200 ml H2O-val, és 10 percen át leszivatva szárítottuk. A szárított mintát (kb. 11 g) lassan hozzáadtuk 20 ml desztillált etiléndiaminhoz, melyet egy olajfürdőn előzetesen 90oC-ra melegítettünk. 1 órás 90oC-on való tartás után a reakció keveréket lehűtöttük 30 ml jégdara hozzáadásával. A fölöslegben maradt etiléndiamint eltávolítottuk úgy, hogy a gyantát egy üvegszűröben átmostuk egymás után 400 ml 0.2 M NaCI, 400 ml 0.001 HCI és • » ··· · • · végül 500 ml 0.1 M NaCl oldattal. A mosást addig folytattuk, amíg a szürlet 2,4,6trinitrobenzol-szulfonsav reagenssel negatív eredményt nem adott.

A Triszakril-amin hordozók Triszakril-szulfhidrillá történő átalakítását úgy végeztük el, hogy a gyöngyöket (10 g nedves tömeg) először kiegyensúlyoztuk 0.5 M NaHC03, pH 9.7, alkalmazásával. A térfogatot 40 ml-re beállítottuk egy 50 ml-es Sarstedt kúpos csőben, majd szilárd N-acetil-homocisztein-tiolaktont (2.5 g) adtunk hozzá és a csövet szobahőmérsékleten 1 órán át rázattuk. Ezt követően újabb gramnyi reagenst adtunk hozzá és a mintát egy éjszakán át rázattuk. A gyöngyöket 250 ml 0.1 M NaCl oldattal mostuk és szinterezett üvegtölcsérben átszűrtük. Egy 10 g-os Triszakril-szulfhidril mintát ezután kiegyensúlyoztunk 30 ml 0.1 M NaOAc oldatban, pH 6.0, és 200 mg szilárd szukcinil-anhidriddel kezeltük. 30 perces rázatás után egy további 200 mg anhidridet adtunk a szuszpenzióhoz, és a reakciót további 30 percig futtattuk. A gyöngyöket ezután 50 ml 0.1 M Tris pufferben, pH 8.5, egyensúlyoztuk a tioészter kötések hidrolízise céljából. 1 óra múlva a hordozót TE-vel mostuk, pH 8.0, és 4oC-on tároltuk. A hordozón lévő szulfhidril csoportok koncentrációját 5,5'ditiobis(2-nitrobenzoesav)-val történő titrálással becsültük 412 nm-en mérve a felszabaduló 3-karboxilát-4-nitrotiofenolátot.

Végezetül, az oligonukleotidok 5'-bromoacetil származékainak a szulfhidril Triszakrilhoz való kovalens kapcsolását az alábbi eljárással végeztük. A Triszakrilszulfhidril hordozót (1 g), melyet a fenti reakcióban nyertünk, redukáltuk 30 ml 20 mM DTT-vel 0.05 Μ K2HPO4 oldatban, pH 8.0, és 1 mM EDTA jelenlétében 1 órán át. A hordozót ezután négyszer átmostuk 25 ml 0.05 Μ K2HPO4, pH 8.0, és 1 mM EDTA oldattal, majd kétszer átmostuk 25 ml 0.1 M trietil-ammónumfoszfát (TEAP) és 1 mM EDTA oldattal, pH 9.0. Az oligonukleotid öt nanomólnyi bromoacetil • · · · «

4 ······· • · ···· · * ··♦ ···β « «· származékát feloldottuk 7 ml 0.1 Μ TEAP és 1 mM EDTA oldatban, pH 9.0, és hozzáadtuk a hordozóhoz, s a csövet N2 gázzal átmostuk és leforrasztottuk. Egy forgó rázógépen való egész éjszakai rázatás után 200 mg jódecetsavat adtunk az elegyhez és a keveréket szobahőmérsékleten 1 órán át állni hagytuk. A gyöngyöket ezután átmostuk, kétszer 35 ml 0.1 M Tris-t, pH 8.0, 0.1 M NaCI-t, 1 mM EDTA-t és 0.1% SDS-t tartalmazó oldattal, és négyszer 45 ml 0.1 M Na2P2O7 oldattal, pH 7.5, majd ezt követően kétszer 45 ml TE, pH 8.0, oldattal és 4oC-on tároltuk.

II. PÉLDA

EGY CÉL DNS 3-ENZIMES 3SR SZAPORÍTÁSAKOR MEGFIGYELHETŐ KIMUTATHATÓ SZAPORÍTÁSI SZINTEK

Ez a példa megmutatja, hogy egy cél DNS 3-enzimes 3SR szaporításakor kimutatható szaporítási szintek figyelhetők meg.

A nukleinsavakat mind normál személyekből, mind pedig cisztikus fibrózisos betegekből származó 2.5 x 105 PBMC-ből extraháltuk az I. Példában leírt módon. A kicsapatott nukleinsavakat centrifugálással tömörítettük. A tömörített precipitátumot, a felülúszó elöntése után, egy alkalommal 70%-os etanollal átöblítettük, megszárítottuk és felszuszpendáltuk 100 mikroliter alábbi összetételű elegyben:

• · · · • · · · « • ·· · · · ·

40 mM	Tris-HCI, pH 8.1
10%	DMSO
10%	Glicerin
30 mM	MgCI2
20 mM	KCI
4 mM spermidin
10 mM	ditiotreitol
1-1 mM	dATP, dGTP, dCTP és dTTP
7-7 mM	rATP, rCTP, rGTP és rUTP
250 ng	mindegyik iniciálé) oligonukleotid

90-159 (5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAAATGCTTTGATGACGCTTCTGT A-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 17)

90-161 (5'-TTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGAA-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 18)

A mintákat addig forgattuk, amíg a csapadék teljesen fel nem szuszpendálódott. Kontrolként vizet használtunk a fenti pufferben a nukleinsav csapadék helyett.

A mintákat 100oC-on melegítettük 1 percig, majd egy perc alatt 42oC-ra hűtöttük és 10 egység AMV reverz transzkriptázt (RT) (Life Science, Inc.) adtunk hozzá. A mintákat 42oC-on 15 percig inkubáltuk, majd egy percre 100oC-ra melegítettük. Harminc egység AMV RT-t, 100 egység T7 RNS-polimerázt (Stratagene) és 4 egység E. coli RNáz H-t (Bethesda Research Labs) adtunk a mintákhoz. A mintákat • ♦* * ·· · ···· « · · · · • ·· · · · · • · ·«··« · * · · · · * · · ·«

42oC-on 1 órán át inkubáltuk. A mintákat ezután -20oC-on lefagyasztottuk. A mintákat ezután gyöngybázisú szendvics hibridizációs módszerrel analizáltuk OligobeadsTM 90-294 (5'-GTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGC-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 19) felhasználásával és 32P-jelzésű kimutató oligonukleotidokkal: 90-165 (5'-AAGAAAA TATCATCTTTGGTGTTTCCT-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 20), mely magát a vad típusú cisztikus fibrózis gént mutatja ki, vagy 90-166 (5'-AAAGAAAATATCATTGGTGTTTCCTA-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 21), mely a cisztikus fibrózis génben lévő 3 bázis-deléciós mutációra specifikus.

Egy jellegzetes gyöngybázisú szendvics hibridizációs (BBSH) eljárásban a gyöngy szuszpenzió egy 25 mg-nyi alikvotját egy 2 ml-es mikro-oszlopba (2S-GS, Isolab) töltjük és eltávolítjuk a TE oldatot úgy, hogy egy fecskendővel áteröltetjük-szivatjuk azt az oszlopon. A cél molekulát, 20 mikroliter TE-ben, ráengedjük az oszlopra 42oC-ra melegített 10 mikroliternyi 2x hibridizációs oldattal (20% dextrán-szulfát, 20x SSPE, 0.2% SDS) együtt. A mikro-oszlopokat megforgattatjuk és - időnkénti rázatás mellett - inkubáljuk 42oC-on két órán át. A gyöngyöket ezután hat alkalommal átmossuk 1-1 ml 2x SSC-vel, melyet 42oC-on ekvilibráltattunk. Az oszlopokon Cserenkov-féle számolást és átmosást azért végzünk, hogy meghatározzuk a kimutatott cél molekula mennyiségét. A háttér beütés-számokat levonjuk a mintákból s így a kimutatott cél molekula fm-jét az alábbi módon számítjuk:

((cpm a gyöngybázison)/(cpm a gyöngybázison + cpm mosófolyadék)) x fm hozzáadott kereső molekula • · · · · · • · · ·

rxn	Detektáló oligo	SZEKV.AZON. SZÁM:	fm/mikro liter 3SR
nincs cél	90-165	20	0.016
2.5 x 105 vad típus
pBMC w/w	90-165	20	0.113
nincs cél	90-166	21	0.018
2.5 x 105 mutáns
pBMC Λ/Λ	90-166	21	2.243

III. PÉLDA

MEGFIGYELT SZAPORÍTÁSI SZINTEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA A 2-ENZIMES 3SR REAKCIÓNÁL 37oC-ON EGY, A JELEN TALÁLMÁNY SZERINTI ELŐNYÖS REAKCIÓ KÖZEGBEN ÉS A TECHNIKA EDDIGI ÁLLÁSA SZERINTI, A 3-ENZIMES 3SR REAKCIÓK SZEMPONTJÁBÓL MEGFELELŐ REAKCIÓ KÖZEGBEN

Ez a Példa megmutatja, hogy a szaporítás kimutatható szintjei figyelhetők meg 2enzimes 3SR reakciónál 37oC-on egy, a jelen találmány szerinti előnyös reakció közeg alkalmazásakor, míg a technika korábbi állása szerinti, a 3-enzimes 3SR reakciókra alkalmazható reakció közegnél nem.

0.1 attomólnyi HIV-1 RNS-t szaporítottunk fel 2-enzimes 3SR, illetve 3-enzimes 3SR reakciókban 37oC-on, a technika korábbi állása szerinti reakció feltételek között és a jelen találmány szerinti fejlesztett reakció feltételek között. A javított feltételek között, míg a technika korábbi állása szerinti reakció feltételek között nem, a 2-enzimes 3SR szaporítás kimutatható mennyiségű szaporítási terméket eredményezett. Magasabb • · · · · · · • · · · · •·· · · · · • · ····· · «*« **.· « ·· szaporítási szintek voltak megfigyelhetők a 3-enzimes reakciókban a fejlesztett reakció közeggel, mint például azzal az előnyös közeggel, melyet az alábbiakban ebben a Példában bemutatunk.

Mindegyik reakció oldat tartalmazott 0.25 - 0.25 mikrogram 88-211* és 88-347* iniciáló oligonukleotidot, 10 egység AMV reverz transzkriptázt és 20 egység T7 RNSpolimerázt. A teljes reakció térfogat 100 mikroliter volt. Egy + jel a Kívülről adagolt RNáz H oszlopban 4 U E. coli RNáz H jelenlétét jelenti a reakció közegben, míg a + jel a DMSO/PEG-8000 oszlopban azt jelenti, hogy a reakció közeget 10% dimetilszulfoxiddal és 5% PEG-8000-rel egészítettük ki.

Technika korábbi állása szerinti 3SR reakció közeg 40 mM Tris, pH 8.1 20 mM MgCI2 25 mM NaCI mM DTT mM spermidin mikrogram/ml BSA mM dNTP mM rNTP

Előnyös 3SR reakció közeg mM Tris, pH 8.1 mM MgCI2 mM KCI mM DTT mM spermidin mg/ml BSA mM dNTP mM rNTP

A reakció termékeket gyöngybázisú szendvics hibridizációval (II. Példa) mutattuk ki

OligobeadsTM-nek oligonukleotid #86-273 és oligonukleotid #87-81 mint kereső oligonukleotidokkal képzett származékával.

3SR reakciók az env régión 37oC-on

Puffer/	Kívülről	DMSO/	Szaporítás
Nukleotidok	adagolt	PEG-8000	mértéke
	RNázH
Korábbi techn.	+	-	3.5x107
Korábbi techn	-	-	< 104
Korábbi techn.	-	+	< 104
Előnyös	+	-	1.7x108
Előnyös	-	-	< 104
Előnyös	-	+	1.1x105

IV. PÉLDA

A JELEN TALÁLMÁNY SZERINTI ELŐNYÖS REAKCIÓ KÖZEG 10% DMSO-VAL, 10% GLICERINNEL, ÉS/VAGY 5% POLIETILÉN-GLIKOLLAL (PEG-8000) TÖRTÉNŐ KIEGÉSZÍTÉSÉNEK HATÁSA A 2-ENZIMES VAGY 3-ENZIMES 3SR REAKCIÓKRA

Ez a példa bemutatja a jelen találmány szerinti előnyös reakció közeg (lásd III.

Példa) 10% DMSO-val, 10% glicerinnel, és/vagy 5% polietilén-glikollal (PEG-8000) történő kiegészítésének hatását a 2-enzimes vagy a 3-enzimes 3SR reakciókban elérhető szaporítási szintre.

• · « ·

A 3SR reakcióknál alkalmazott reakció körülmények ugyanazok voltak, mint a III.

Példában bemutatott Előnyös 3SR reakció közeg, kivéve, hogy a reakciókat 42oCon 1 órán át futtattuk.

A 3SR reakciók kivitelezésekor 0.1 attomólnyi HIV-1 RNS-t használtunk cél molekulaként és a következő primer párt: 88-29/89-263* (megközelítőleg 400 bázis távolságra). A szaporítási termékeket gyöngybázisú szendvics hibridizációval (II.

Példa) mutattuk ki OligobeadsTM-nek oligonukleotid #86-273 és oligonukleotid #8781 mint kereső oligonukleotidokkal képzett származékával. Amint azt alább bemutatjuk, fokozott szaporítási szintek nyerhetők 10% DMSO és 10% glicerin jelenlétében.

ADALÉKOK HATÁSA A 3SR SZAPORÍTÁSRA A HIV-1 ENV RÉGIÓJÁN

Primerek	RNáz H	DMSO	Glicerin	PEG	Száp.mérték
88-299/89-263*	-	10%	-	5%	1x105
88-299/89-263*	-	10%	10%	-	2x107
88-211 */88-347*	4U	-	-	-	2.8x108
88-211788-347*	4U	-	10%	-	2.0x108
88-211788-347*	4U	10%	10%	-	3.9x108
88-211788-347*	-	-	-	-	N.D.
88-211788-347*	-	-	10%	-	N.D.
88-211788-347*		10%	10%		1.3x107

N.D.: Terméket nem lehet kimutatni

2-enzimes reakciók: 10 U AMV RT, 20 U T7 RNS-polimeráz • · · « · · • · · ♦

3-enzimes reakciók: 30 U AMV RT, 100 U T7 RNS-polimeráz, 4 U E. coli RNáz H

V. PÉLDA

A 2-ENZIMES 3SR SZAPORÍTÁS ÉS A 3-ENZIMES 3SR SZAPORÍTÁS SZINTJEI 10% DMSO-NAK ÉS 5% PEG-8000-NEK AZ ELŐNYÖS 3SR REAKCIÓ KÖZEGBEN VALÓ JELENLÉTÉBEN, ILLETVE HIÁNYÁBAN

Ez a példa a 2-enzimes 3SR szaporítás és a 3-enzimes 3SR szaporítás (0.1 attomólnyi HIV-1 RNS cél molekula és a következő primer pár: 88-211 */88-347* mindegyik esetben) szintjeit hasonlítja össze 10% DMSO-nak és 5% PEG-8000-nek az előnyös reakció közegben való jelenlétében, illetve hiányában. A termékeket gyöngybázisú szendvics hibridizációval mutattuk ki, mint a II. Példában, OligobeadsTM-nek oligonukleotid 86-273 és oligonukleotid 87-81 mint kereső oligonukleotidokkal képzett származékával.

ADALÉKOK HATÁSA A 2-ENZIMES 3SR REAKCIÓRA

Hőmérs.	Enzimek	DMSO	PEG-8000	Szap.mérték
42oC	Mindhárom	-	-	8.0x107
42oC	RT/T7	-	-	< 104
42oC	RT/T7	+	-	1.1x107
42oC	RT/T7	+	+	5.0X107
45oC	RT/T7	+	+	1.7X107

• · · · • · ·♦ • ··«····· ·*· ···« · »·

U AMV RT-t, 100 U T7 RNS-polimerázt és - amikor jelen van (azaz, Mindhárom)

- 4 U E. coli RNáz H-t használtunk a reakció közegben.

VI. PÉLDA

2-ENZIMES 3SR REAKCIÓK MOLONEY LEUKÉMIA VÍRUSBÓL, HIV-1-BÖL ÉS

AVIAN MYELOBLASTOSIS VÍRUSBÓL SZÁRMAZÓ REVERZ

TRANSZKRIPTÁZOKKAL

Ez a Példa 2-enzimes 3SR reakciókat mutat be, amelyekben a reverz transzkriptázok (RT) Moloney murine leukémia vírusból (MMLV), HIV-1- és avian myeloblastosis vírusból (AMV) származnak. Az MMLV reverz transzkriptáz mangán ion jelenlétét igényli a hatékony mennyiségű belső RNáz H aktivitása kifejtéséhez.

3SR rendszer: env régió 88-211788-347*

Különböző forrásokból származó reverz transzkriptázok összehasonlítása

RT	T7Pol	RNázH	DMSO Glicerin MnCI2	Szap.mérték
MMLV 1000U	60U	4U	5%	-	-	3x106
MMLV 1000U	60U	-	5%	-	1mM	3x107
MMLV 1000U	60U	-	-	-	1mM	2x107
HÍV 5ul1/	60U	-	-	-	-	1x106
HÍV 10ul	60U	4U	-	-	-	9x105
AMV 30U	100U	4U	10%	10%	-	4x108
AMV 10U	20U		10%	10%		1x108

• »· ♦ «· • · · · · • ·« · « * · •β ···*···· • ·· ···· · ··

Reakció idő: 1 óra. Hőmérséklet: 42oC. Templát: 0.1 attomól HÍV RNS.

1/ A HIV-1 reverz transzkriptáz készítmény fajlagos aktivitása ismeretlen volt.

VII. PÉLDA

ELÉRT MEGNÖVELT SZAPORÍTÁSI SZINTEK 3-ENZIMES 3SR REAKCIÓKBAN, 5% PEG-8000/10% DMSO JELENLÉTÉBEN, ILLETVE HIÁNYÁBAN, 42oC-ON VAGY 45oC-ON TÖRTÉNŐ INKUBÁLÁS ESETÉN

Ez a Példa bemutatja a 3-enzimes 3SR reakciókban elért megnövelt szaporítási szinteket, 5% PEG-8000/10% DMSO jelenlétében és hiányában, 42oC-on vagy 45oC-on történő inkubálásnál.

0.1 attomólnyi HIV-1 RNS-t szaporítottunk 3-enzimes 3SR reakcióban 30 egység AMV reverz transzkriptáz, 100 egység T7 Dns-dependens RNS-polimeráz, 4 egység

RNáz H alkalmazásával, 42oC-on 1 órán át a III. Példában bemutatott előnyös reakció közegben, az alábbi env primer párok egyikének felhasználásával: 88211 */88-347* vagy 87-79/88-347*.

A REAKCIÓ HŐMÉRSÉKLET HATÁSA A HIV-1

ENV RÉGIÓJÁNAK FELSZAPORÍTÁSÁRA ···· ·· · • 4 · ·· • 4 4 · ♦ 4· • · 4« · · ·· ··· ·♦·· 4♦·

Primer pár	PEG-8000/DMSO	Szap. mérték
42oC	45oC
88-211 */88-347*	-	4.4x107	8.4x106
	+	2.3x108	1.5x108
87-79/88-347*	-	4.5x107	1.5x107
	+	1.7x108	5.6x108

Vili. PÉLDA

A HŐMÉRSÉKLET HATÁSA 3-ENZIMES 3SR SZAPORÍTÁSRA

AZ ELŐNYÖS REAKCIÓ KÖZEGBEN 10% DMSO

JELENLÉTÉBEN, ILLETVE HIÁNYÁBAN

Ez a Példa bemutatja a hőmérséklet hatását a 3-enzimes 3SR szaporításra az előnyös reakció közegben (lásd III. Példa), 10% DMSO jelenlétében, illetve hiányában. A cél molekula 0.1 attomólnyi HIV-1 RNS volt. Mindegyik 100 mikroliteres reakció keverék tartalmazott 30 U AMV RT-t, 100 U T7 RNS-polimerázt és 4 U E. coli RNáz H-t.

A 3SR reakció hőmérséklet-függése DMSO jelenlétében, illetve hiányában

Primerek: 88-211* és 88-347* (env régió)

0000 ·· 9 0·«0 • 0 « * · ··· · · » «

•	69
Reakció hőm.	-DMSO	+DMSO
42oC	9.1x107	2.7x108
45oC	8.7x107	1.6x108
47oC	7.4x104	< 104
50oC	< 104	< 104

IX. PÉLDA

AT7 PROMÓTER KONSZENZUS SZEKVENCIÁJÁT TARTALMAZÓ INICIÁLÓ OLIGONUKLEOTID PRIMEREK 5'- ÉS 3'-VÉGEIN

LÉVŐ NUKLEOTID ELTÉRÉSEK HATÁSA

Ez a Példa bemutatja a T7 promóter konszenzus szekvenciáját tartalmazó iniciálé oligonukleotid primerek 5'- és 3'-végein lévő nukleotid eltérések hatását.

A 3SR reakciókat 50 mikroliter térfogatokban végeztük 42oC-on, 1-2 órán át, azálábbi összetétel mellett: 0.05 attomól (kb. 1000 molekula) HIV-1 cél RNS, 30U T7 RNS-polimeráz, 2U E. coli RNáz H, 15 U AMV RT, 40 mM Tris, pH 8.1, 30 mM MgCI2, 20 mM KCI, 10 mM DTT, 4 mM spermidin, 1 mM dXTP, 7 mM rXTP és 0.125 mikrogram oligonukleotid primer. Ugyanazt a társ prímért, 89-255 (5'ΤΤΑΤΤΟΤΟΟΟΟΟΟΘΟΤΟΟΤΤΤΤΟΟΟΑΤΤΟΤΑ-3') (SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 14) (Ratner et al. 1985), használtuk a táblázatban szereplő összes primerhez. A felsorolt primerek magukban kódolva tartalmazzák a 17 nukleotidos T7 promóter szekvenciát (kivéve #90-206, aholis hiányzik az 5'-nukleotid) és a 17 nukleotidos konszenzus T7 promóter szekvenciát szegélyező 5'- és 3'- szekvenciák hosszúságának és összetételének • »4W

9999 ·«* • · * · · ··· ♦ · « · • · » ···· *9 • 99 9999 999 vonatkozásában különböznek egymástól. Az elkészült RNS termék 214 nukleotid hosszúságú. A felszaporított cél molekulák mennyiségét gyöngybázisú szendvics hibridizációval (BBSH) határoztuk meg, 25 mg gyöngyöt alkalmazva, mely tartalmazta a 86-273 befogó oligonukleotidot és 100 fmólnyi 32P-jelöléssel mutattuk ki a 87-81 oligonukleotidokat (Guatelli et al. 1990). Az összes szaporítási érték, a 88347*-re vonatkozók kivételével, két 3SR reakció átlaga, valamint ezen szaporítási reakciók mindegyikét duplikált BBSH reakciókkal analizáltuk. A 88-347*-tel kivitelezett 3SR szaporítások hat 3SR reakció átlagát reprezentálják.

T7 PROMOTER SZEKVENCIÁKAT TARTALMAZÓ INICIÁLÓ OLIGONUKLEOTID PRIMEREK TRANSZKRIPCIÓS INICIÁCIÓS SZEKVENCIÁJÁN TALÁLHATÓ NUKLEOTID HATÁSA A 3SR SZAPORÍTÁSOKRA

Szekv.Oligo- hossz azon, nukleo- (nukleoszám tid tidokban)

Szekvencia

Szap. mérték

I

2	88-347	56	AATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACIATTATCGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2x10®
22	90-426	56	aatttaatacgactcactatagaaatgtactatiatggttttagcattgtctgtga	2.4x10*
23	90-199	56	AATTTAATACGACTCACTATAGGTATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	1.1x10*
24	90-200	56	AATTTAATACGACTCACTATAGGAATGIACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTCTGA	2.2x10*
25	90-201	56	AATTTAATACGACTCACTATACCCATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTCA	1.8x10*
26	90-202	55	AATTTAATACGACTCACTATACC ATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2.0x10*
27	90-203	54	AATTTAATACGACTCACTATAG ATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2.5x10*
28	90-204	53	AATTTAATACGACTCACTATAG TGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA	1.9x10*
29	90-430	52	AATTTAATACGACTCACTATA TGTACTATTATCGTTTTAGCATTGTCTGTGA	2.8x10*

,9 .9 ,9 ,9 ,9 ,9 ,9

1/A kódoló szál szekvenciáját mutatjuk be. Az aláhúzott szekvencia a 17 nukleotidos T7 promóter szekvenciára vonatkozik, az RNS transzkripció iniciációs helyét +1 jelzés mutatja. A GGGA szekvencia a T7 szekvenciából van; a +5 nukleotidok leolvasási irányban a HIV-1 szekvencia. Az egyes oligonukleotidoknak csak az 5'végi részeit mutatjuk; az ezután következő szekvenciák az egyes oligonukleotidoknál azonosak. Az oligonukleotidok úgy következnek egymás után, hogy a primerek közötti különbségek jól láthatóak legyenek.

X.PÉLDA

ADALÉKANYAGOK KÜLÖNBÖZŐ KOMBINÁCIÓINAK HATÁSA

A HIV-1-BŐL SZÁRMAZÓ POL GÉN EGY

RÉGIÓJÁNAK FELSZAPORÍTÁSÁRA

Ez a példa bemutatja adalékanyagok különböző kombinációinak hatását a HIV-1-ből származó pol gén egy 707 bázisú régiójának felszaporítására. A reakciók kivitelezése 42oC-on történt, két órán keresztül, 0.1 attomólnyi HIV-1 RNS-sel, mint cél molekulával, és 90-249 (értelmes) 5'-GAAAAAATAAAAGCATTAGTAGA-3' (SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 30) és 89-391* (ellentétes értelmű) 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGATTTCCCCACTAACTTCTGTATGTCATTGACA -3'(SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 31) mint iniciálé oligonukleotidokkal. A három-enzimes reakciók 30 U AMV RT-t, 100 U T7 RNS-polimerázt és 2 U E. coli RNáz H-t tartalmaztak. A két-enzimes reakciók 10 U AMV RT-t és 20 U T7 RNSpolimerázt tartalmaztak. A kereső nukleotid-, illetve az OligobeadTM szekvenciák a következők voltak: 89-534 5'-AGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCA3'(SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 32) és 89-419 5'AGAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTC-3'(SZEKVENCIA AZONOSÍTÓ SZÁM: 33).

ADALÉKANYAG KOMBINÁCIÓK HATÁSA

A HIV-1 POL RÉGIÓJA EGY RÉGIÓJÁNAK

2- ÉS 3-ENZIMES SZAPORÍTÁSÁRA

Adalékok

Szaporítási mérték

3-enzimes

2-enzimes

nincs	7.9x104	n.d.
10%DMSO/10%Glicerin	8.4x106	1.2x105
10%DMSO/5% PEG-8000	4.6x104	n.d.
10%DMSO/15% Szorbit	7.0x106	1.3x106

n.d. = termék nem kimutatható gyöngybázisú szendvics hibridizációval.

Noha a találmány leírásánál bizonyos specifikusságot követtünk, a józan gyakorlat számára nyilvánvaló technikai eltérések megtehetők anélkül, hogy a találmány szellemétől eltérnénk.

A találmány különböző jellegzetességeit az alant következő igénypontokban tesszük közzé.

• « « ·

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:

(i) FOLYAMODÓ: Fahy, Eoin D.

Kwoh, Deborah Y.

Gingeras, Thomas R.

Guatelli, John C.

Whitfield, Kristina M.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: NUKLEINSAV SZAPORÍTÁS

KÉTENZIMES, ÖNFENNTARTÓ SZEKVENCIA REPLIKÁCIÓVAL (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 33 (iv) LEVELEZÉSI CÍMEK:

(A) CÍMZETT: Fitch, Evén, Tabin & Flannery (B) UTCA: 135 S. LaSalle (C) VÁROS: Chicago (D) ÁLLAM: Illinois (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 60603-4277 (v) SZÁMÍTÓGÉPESEN OLVASHATÓ FORMA:

(A) MÉDIUM TÍPUSA: Floppy disk ·«·· · · · ···· « · * · · · ······· (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.24 (vi) JELEN KÉRVÉNY ADATAI:

(A) KÉRVÉNY SZÁM:

(B) BENYÚJTÁSI IDŐPONT:

(C) BESOROLÁS:

(viii) ÜGYVÉD/KÉPVISELET INFORMÁCIÓ:

(A) NÉV: Feder, Scott B.

(C) REFERENCIA/JEGYZÉK SZÁM: 50101 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:

(A) TELEFON: 312-372-7842 (B) TELEFAX: 312-372-7848 (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 1 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 59 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-425 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 1

AGTAATTTAA TACGACTCAC TATAGGGATG TACTATTATG GTTTTAGCAT TGTCTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 2 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 88-347 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 2

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT

TTAGCATTGTCTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 3 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-578 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 3

GATTTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 4 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert • · « · (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-575 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 4

GCTTTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT

CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 5 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-577 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 5 • · ·

GCGTTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 6 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-574 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 6

GCGCTAATAC GACTCACTAT AGGGATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 7 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 55 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-247 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 7

ATTTAATACG ACTCACTATA GGGATGTACT ATTATGGTTT TAGCATTGTC TGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 8 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 54 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-248 ···· ·· · ···* • · · · · ··· · ♦ · · • · ····· · ·«« ···· · ♦· (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 8

TTTAATACGA CTCACTATAG GGATGTACTA TTATGGTTTT AGCATTGTCT

GTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 9 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 54 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-576 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 9

GTTAATACGA CTCACTATAG GGATGTACTA TTATGGTTTT AGCATTGTCT

GTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 10- INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 54 bázis pár ····»·· • · ····· « ···»<··« · ·· (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-579 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 10

GCTAATACGA CTCACTATAG GGATGTACTA TTATGGTTTT AGCATTGTCT

GTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 11 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 53 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-249 «··· « a 9 »·-*« t · * 4 » • ·· 4 4 4 4 • · <»M « 9 ··· ··<·« · 9 9 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 11

TTAATACGAC TCACTATAGG GATGTACTAT TATGGTTTTA GCATTGTCT GTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 12 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 52 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-205 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 12

TAATACGACT CACTATAGGG ATGTACTATT ATGGTTTTAG CATTGTCTG TGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 13 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázis pár ···· * * * *· t * • · W · V • · · · « « · • · «··· « 9 • ·· ···· » ·· (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-206 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 13

AATACGACTC ACTATAGGGA TGTACTATTA TGGTTTTAGC ATTGTCTGT GA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 14 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 89-255 ♦ ·· • ·· · ►··· • · · 4 · ······« • · * 9 •·· ···· · ·· (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 14

TTATTGTGCC CCGGCTGGTT TTGCGATTCT A (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 15 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: T7 Natív Promoter TIS-sel (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 15

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 16 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 88-297 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 16

TGGCCTAATT CCATGTGTAC ATTGTACTGT (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 17 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 48 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-159 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 17

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAAATGC TTTGATGACG CTTCTGTA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 18 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 28 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-161 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 18

TTCACTTCTA ATGATGATTA TGGGAGAA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 19 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-294 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 19 GTTCTCAGTT TTCCTGGATT ATGC (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 20 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-165 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 20 • « · · • · · ·

AAGAAAATAT CATCTTTGGT GTTTCCT (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 21 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 26 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-166 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 21

AAAGAAAATA TCATTGGTGT TTCCTA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 22 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-426 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 22

AATTTAATAC GACTCACTAT AGAAATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 23 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-199 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 23 • · · · · · ·

I · · · · · • · · · · a « • · ··»·· · • · · ···· · ··

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGTATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 24 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-200 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 24

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGAATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT

CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 25 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav

(C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-201 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 25

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGCATGTAC TATTATGGTT TTAGCATTGT

CTGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 26 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 55 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-202 • · · • · · · · (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 26

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGATGTACT ATTATGGTTT TAGCATTGTC

TGTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 27 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 54 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-203 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 27

AATTTAATAC GACTCACTAT AGATGTACTA TTATGGTTTT AGCATTGTCT GTGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 28 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 53 bázis pár ···· ·« · ·»»4 • · · * « ·♦· · « · · • · ·«·« · · ··· ··»♦ · ·« (Β) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-204 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 28

AATTTAATAC GACTCACTAT AGTGTACTAT TATGGTTTTA GCATTGTCTG TGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 29 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 52 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-430 *· · · (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 29

AATTTAATAC GACTCACTAT ATGTACTATT ATGGTTTTAG CATTGTCTGT GA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 30 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 23 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 90-249 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 30

GAAAAAATAA AAGCATTAGT AGA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 31 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 56 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 89-391 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 31

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGATTTCC CCACTAACTT CTGTATGTCA TTGACA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 32 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 89-534 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 32

AGGATCTGAC TTAGAAATAG GGCAGCA (2) SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 33 - INFORMÁCIÓ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 bázis pár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLÚSÁG: egyes szálú (D) TOPOLÓGIA: nem ismert (ii) MOLEKULA TÍPUS: DNS (genom eredetű) (viii) POZÍCIÓ A GENOMBAN:

(A) KROMOSZÓMA/SZEGMENTUM: 89-419 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS:

SZEKVENCIA AZONOSÍTÁSI SZÁM: 33

AGAACZCAAG ACTTCTGGGA AGTTC

Claims (33)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy módszer egy cél RNS szegmentum szaporítására, mely szegmentum tartalmaz egy 5'-alszegmentumot - mely a cél szegmentum 5'-terminális nukleotidjától a 3'-irányba kiterjedő, legalább 9 nukleotidot tartalmaz - és egy 3'alszegmentumot - mely nem fed át az 5'-alszegmentummal és amely a cél szegmentum 3'-terminális nukleotidjától az 5'-irányba kiterjedő, legalább 9 nukleotidot tartalmaz s amely módszer a cél RNS szegmentumot tartalmazó vizes oldatban történő inkubálást foglal magában:

   (a) (1) egy első iniciáló DNS oligonukleotid primer, amely egy egyes szálú DNS, mely a 3-végén egy első alszegmentumot tartalmaz, mely rendelkezik egy 3'terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'-irányba, nevezett első primer nevezett első alszegmentuma, mely ugyanolyan hosszú, mint a cél szegmentum 3'-alszegmentuma és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően komplementer a cél szegmentum 3'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a vizes oldatban egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben egy, a cél szegmentum szekvenciájával rendelkező nukleinsav a templát, és (2) egy második iniciáló DNS oligonukleotid primer, amely egy olyan egyes szálú DNS, amelynek a 3'-végén egy olyan első alszegmentum található, amely rendelkezik egy 3'-terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'irányba, nevezett második primer nevezett első alszegmentuma ugyanolyan hosszúságú, mint a cél szegmentum 5'-alszegmentuma, és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően homológ a cél szegmentum 5'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a vizes oldatban egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú nukleinsav a templát, feltéve, hogy legalább egy az említett primerek közül tartalmaz •··· ·· « ···· • ♦ · · · · « • · ·»· · · · • · · · « e · · «· továbbá egy promótert biztosító alszegmentumot, mely tartalmazza az egyik első promóter értelmes szálát, mely szál annak a primernek az első alszegmentumához kapcsolódik, mely az említett promótert biztosító szegmentumot tartalmazza, s ez a kapcsolódás lehetővé teszi a transzkripciót az említett első promóterről - melyet egy olyan cDNS tartalmaz, mely magában foglalja az említett két primer lánchosszabbítási termékeit - feltéve továbbá, hogy ha az említett első primer nem rendelkezik egy ilyen promótert biztosító alszegmentummal, akkor az említett cél RNS szegmentum 5'-alszegmentumának 5'-terminális nukleotidja a cél RNS molekula 5'-terminális nukleotidja;

   (b) (1) egy reverz transzkriptáz, mely az említett vizes oldatban DNSdependens DNS-polimeráz aktivitást, RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitást és egy nagy érzékenységű szaporításhoz hatékony mennyiségű RNáz H aktivitást fejt ki, és (2) egy DNS-dependens RNS-polimeráz, amelyik, az említett vizes oldatban katalizálja az említett első promóterről való átírást; és (c) nukleozid trifoszfátok, melyek szubsztrátokként szükségesek a DNSdependens RNS-polimeráz-, az RNS-dependens DNS-polimeráz- és a DNSdependens RNS-polimeráz aktivitások számára;

   említett inkubáció egy olyan hőmérsékleti tartományban valósul meg, amelyikben az említett enzimek az említett oldatban aktívak ahhoz, hogy ellássák az említett DNSdependens DNS-polimeráz-, RNS-dependens DNS-polimeráz-, RNáz H- és DNSdependens RNS-polimeráz aktivitásokat.
2. 2. Az 1. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a vizes oldat 20 - 40 mM MgCI2-ot, 1

   - 25 mM KCI-ot, 1-20 mM ditiotreitolt, 1-10 mM spermidint, 1-7 mM rNTP-ket, 0.1

   - 2 mM dNTP-ket tartalmaz, valamint egy hatékony mennyiségű puffért, hogy a vizes oldat pH 8 értéken fenntartódjék.

   • · « ···· ·· 4* • r · « · ·· • · · · * * 4 • · 44*44*
3. 3. A 2. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a cél szegmentum, hosszúságban, kevesebb mint körülbelül 1500 nukleotid, aholis a cél szegmentumnak mind az 5'alszegmentuma, mind a 3'-alszegmentuma körülbelül 15-50 nukleotiddal rendelkezik, és ahol az említett inkubáció körülbelül 37oC és körülbelül 47oC között történik.
4. 4. A 3. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a reverz transzkriptáz egy retrovirális reverz transzkriptáz.
5. 5. A 4. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az rNTP-k koncentrációja körülbelül 6 mM és ahol a vizes oldat tartalmaz továbbá körülbelül 1 és körülbelül 25 súlyszázalék közötti mennyiségű legalább egy vegyületet a következő összetételű csoportból: (1) A jelen találmány kifejlesztett reakció közege ezért kívánatos módon tartalmaz egyet vagy többet az alábbi vegyületek közül: (i) egy C1 - C10 alkohol; (ii) a következő képlet szerinti egy cukoralkohol: HOCH2(CHOH)xCH2OH, ahol x: 0 20; (iii) egy polietilén-glikol vegyület az alábbi képlet szerint: H(OCH2-CH2)nOH, ahol n: 2 - 600; (iv) egy cukor a mono-, di- és triszacharidok csoportjából; és (v) egy, az alábbi képlet szerinti szulfoxid vegyület: R1-(SO)-R2, ahol R1 és R2 - egymástól függetlenül - C1 - C4 alkil csoportok, illetve ahol R1 és R2 összekapcsolódhatnak egy telített gyűrűs csoport részeiként.
6. 6. Az 5. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az említett legalább egy vegyületet szorbit, glicerin, etanol, szukróz, polietilénglikol és dimetilszulfoxid vegyületekböl álló csoportból választjuk.

   4 f · · · · · • · · · · · * • · · · · · · « ··· ···· · ··

   100
7. 7. A 6. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a DNS-dependens RNS-polimeráz aktivitást egy a T7, T3 és SP6 összetételű csoportból választott bakteriofág RNSpolimeráza biztosítja.
8. 8. A 7. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a vizes oldat 30 mM MgCI2-öt, 20 mM KCI-ot, 10 mM ditiotreitolt, 4 mM spermidint, 6 mM rNTP-ket, 1 mM dNTP-ket tartalmaz.
9. 9. A 8. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az RNS cél szegmentum legalább 50 nukleotid hosszúságú és a két iniciáló DNS oligonukleotid primer cél hibridizációs szegmentuma egyenként legalább 15 nukleotid hosszúságú.
10. 10. A 9. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az első primer első alszegmentumának szekvenciája pontosan komplementer a cél szegmentum 3'alszegmentuma szekvenciájával, és ahol a második primer első alszegmentumának szekvenciája ugyanaz, mint a cél szegmentum 5'-alszegmentumának szekvenciája.
11. 11. A 10. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az első DNS primer az említett promóter funkciót biztosító szegmentumot tartalmazza és a második primerböl hiányzik a promóter funkciót biztosító szegmentum.
12. 12. A 11. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a promóter funkciót biztosító szegmentum a T7 promóterből származik.
13. 13. A 12. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a cél RNS szegmentum felszaporítására szolgáló inkubáció után az említett cél RNS szegmentumot vagy az • · · · · · · t · · · · · •·· · · · « • · ····· · ··· ···· · * ·

    101

    RNS szegmentumot azzal a szekvenciával, amely az említett cél RNS szegmentum szekvenciájával komplementer, egy nukleinsav hibridizációs vizsgálatban mutatjuk ki.
14. 14. A 8. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az első iniciáló oligonukleotid primer egy első promoter funkciót biztosító alszegmentumot tartalmaz, s ezáltal biztosít egy első promótert, ami egy cDNS átírását iniciálja, mely cDNS a két primer lánchosszabbítási termékeit tartalmazza, valamint a második primer egy második promoter funkciót biztosító alszegmentumot tartalmaz, ami egy cDNS átírását iniciálja, mely cDNS a két primer lánchosszabbítási termékeit tartalmazza, a szóbanforgó első promótert, a vizes oldatban, egy első DNS-dependens RNSpolimeráz ismeri fel, mely az átírást katalizálja, és a szóbanforgó második promótert, a vizes oldatban, egy második DNS-dependens RNS-polimeráz ismeri fel, mely az átírást katalizálja, az említett első- és második DNS-dependens RNS-polimerázok ugyanazok vagy különbözőek lehetnek; és aholis a vizes oldat tartalmazza az említett második DNS-dependens RNS-polimerázt.
15. 15. A 14. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az első- és második promoter funkciót biztosító szegmentumok közül legalább az egyik a T7 promóterböl van.
16. 16. A 15. Igénypont szerinti egy módszer, aholis az említett első DNS-dependens RNS-polimeráz különbözik az említett második DNS-dependens RNS-polimeráztól, aholis, a vizes oldatban, az említett második DNS-dependens RNS-polimeráz, és nem az említett első DNS-dependens RNS-polimeráz ismeri fel az említett második promótert; és aholis a vizes oldat tartalmazza az említett második DNS-dependens RNS-polimerázt.

    102 ···· <1 * · ···· • · · · · • · · · · · · • · ····· · • · · ···· · ·»
17. 17. A 16. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a cél RNS szegmentum felszaporítására szolgáló inkubáció után az említett cél RNS szegmentumot vagy az RNS szegmentumot azzal a szekvenciával, amely az említett cél RNS szegmentum szekvenciájával komplementer, egy nukleinsav hibridizációs vizsgálatban mutatjuk ki.
18. 18. A 4. -17. Igénypontok bármelyike szerinti egy módszer, aholis a reverz transzkriptáz AMV reverz transzkriptáz és a vizes oldat tartalmaz továbbá körülbelül 1 és körülbelül 25 súlyszázalék közötti mennyiségű egy, az alábbi képlet szerinti szulfoxid vegyületet: R1-(SO)-R2, ahol R1 és R2 - egymástól függetlenül - C1 - C4 alkil csoportok, illetve ahol R1 és R2 összekapcsolódhatnak egy telített gyűrűs csoport részeiként.
19. 19. A 18. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a vizes oldat tartalmaz dimetilszulfoxidot.
20. 20. A 19. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a vizes oldatot kiegészítjük 10% DMSO-val és 15% szorbittal, és ahol az RNS cél szegmentum hosszúsága kisebb, mint körülbelül 700 nukleotid.
21. 21. A 4. - 17. Igénypontok bármelyike szerinti egy módszer, aholis a reverz transzkriptáz Moloney murine leukémia vírus reverz transzkriptáz és ahol a vizes oldat körülbelül 0.1 mM-tól körülbelül 10 mM mangán iont tartalmaz.

    103 • · · · · · · • · »«·«* · * · · · · · · · ♦ »
22. 22. A 4. -17. Igénypontok bármelyike szerinti egy módszer, aholis a vizes oldat tartalmaz továbbá E. coli RNáz H-t.
23. 23. A 22. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a vizes oldat tartalmaz továbbá egy, az alábbi képlet szerinti szulfoxid vegyületet: R1-(SO)-R2, ahol R1 és R2 - egymástól függetlenül - C1 - C4 alkil csoportok, illetve ahol R1 és R2 összekapcsolódhatnak egy telített gyűrűs csoport részeiként.
24. 24. A 23. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a szulfoxid vegyület DMSO.
25. 25. A 24. Igénypont szerinti egy módszer, aholis a reverz transzkriptáz egy retrovirális reverz transzkriptáz, melyet az AMV reverz transzkriptáz, MMLV reverz transzkriptáz és HIV-1 reverz transzkriptáz csoportból választunk.
26. 26. A 25. Igénypont szerinti egy módszer; aholis a reverz transzkriptáz AMV reverz transzkriptáz, aholis az RNS cél szegmentum hosszúsága nagyobb körülbelül 400 nukleotidnál és ahol a vizes oldat tartalmaz továbbá 10% DMSO-t és 15% szorbitot.
27. 27. Egy készlet, mely hasznos egy nukleinsav tartalmú mintában lévő legalább egy specifikus RNS cél szekvencia kimutatására, mely készlet - lényegét tekintve - az alábbi összetételű:

    (a) (1) egy első iniciáló DNS oligonukleotid primer, amely egy egyes szálú DNS, mely a 3'-végén egy első alszegmentumot tartalmaz, mely rendelkezik egy 3'terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'-irányba, nevezett első primer nevezett első alszegmentuma, mely ugyanolyan hosszú, mint a cél szegmentum 3'-alszegmentuma és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely • · » «

    104 elegendően komplementer a cél szegmentum 3'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a vizes oldatban egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben egy, a cél szegmentum szekvenciájával rendelkező nukleinsav a templát, és (2) egy második iniciáló DNS oligonukleotid primer, amely egy olyan egyes szálú DNS, amelynek a 3'-végén egy olyan első alszegmentum található, amely rendelkezik egy 3'-terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'irányba, nevezett második primer nevezett első alszegmentuma ugyanolyan hosszúságú, mint a cél szegmentum 5'-alszegmentuma, és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően homológ a cél szegmentum 5'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a vizes oldatban egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú nukleinsav a templát, feltéve, hogy legalább egy az említett primerek közül tartalmaz továbbá egy promótert biztosító alszegmentumot, mely tartalmazza az egyik első promóter értelmes szálát, mely szál annak a primernek az első alszegmentumához kapcsolódik, mely áz említett promótert biztosító szegmentumot tartalmazza, s ez a kapcsolódás lehetővé teszi a transzkripciót az említett első promóterről - melyet egy olyan cDNS tartalmaz, mely magában foglalja az említett két primer lánchosszabbítási termékeit - feltéve továbbá, hogy ha az említett első primer nem rendelkezik egy ilyen promótert biztosító alszegmentummal, akkor az említett cél RNS szegmentum 5'-alszegmentumának 5'-terminális nukleotidja a cél RNS molekula 5'-terminális nukleotidja;

    (b) (1) egy reverz transzkriptáz, mely az említett vizes oldatban DNSdependens DNS-polimeráz aktivitást, RNS-dependens DNS-polimeráz aktivitást és egy nagy érzékenységű szaporításhoz hatékony mennyiségű RNáz H aktivitást fejt ki, és (2) egy DNS-dependens RNS-polimeráz, amelyik, az említett vizes oldatban katalizálja az említett első promóterről való átírást, aholis az egyetlen enzim konténer • · · ·

    105 mind az említett reverz transzkriptázzal, mind pedig az említett DNS-dependens RNS-polimerázzal együtt rendelkezik; és (c) nukleozid trifoszfátok, melyek szubsztrátokként szükségesek a DNSdependens RNS-polimeráz-, az RNS-dependens DNS-polimeráz- és a DNSdependens RNS-polimeráz aktivitások számára.
28. 28. A 27. Igénypont szerinti egy készlet, mely tartalmaz továbbá:

    (d) egy vizes közeget, mely tartalmaz körülbelül 20-tól 40 mM MgCI2-ot; körülbelül 1-től 25 mM KCI-ot; körülbelül 1-től 20 mM ditiotreitolt; körülbelül 1-től 10 mM spermidint; körülbelül 1-től 8 mM rNTP-ket; körülbelül 0.1-tői 2 mM dNTP-ket; valamint egy hatékony mennyiségű puffért, hogy a közeg körülbelül pH 8 értéken fenntartódjék.
29. 29. A 28. Igénypont szerinti egy készlet, aholis a vizes oldat 30 mM MgCI2-ot, 20 mM KCI-ot, 10 mM ditiotreitolt, 4 mM spermidint, 6 mM rNTP-ket, 1 mM dNTP-ket és 40 mM Tris.HCI-t tartalmaz, és aholis a pH körülbelül 8.1.
30. 30. Egy készlet, mely hasznos egy nukleinsav tartalmú mintában lévő legalább egy specifikus RNS cél szekvencia kimutatására, mely készlet tartalmaz:

    egy vizes közeget, mely tartalmaz körülbelül 20-tól 40 mM MgCI2-ot; körülbelül 1-től 25 mM KCI-ot; körülbelül 1-től 20 mM ditiotreitolt; körülbelül 1-től 10 mM spermidint; körülbelül 1-től 8 mM rNTP-ket; körülbelül 0.1-tői 2 mM dNTP-ket; valamint egy hatékony mennyiségű puffért, hogy a közeg körülbelül pH 8 értéken fenntartódjék.

    ···▼

    106
31. 31. A 30. Igénypont szerinti egy készlet, aholis a vizes oldat 30 mM MgCI2-ot, 20 mM KCI-ot, 10 mM ditiotreitolt, 4 mM spermidint, 6 mM rNTP-ket, 1 mM dNTP-ket és 40 mM Tris.HCI-t tartalmaz, és aholis a pH körülbelül 8.1.
32. 32. Egy iniciáló DNS oligonukleotid primer pár, egy transzkripció alapú szaporítási rendszerben, egy cél nukleinsav szegmentum szaporítására, mely szegmentum tartalmaz egy 5'-alszegmentumot - mely a cél szegmentum 5’-terminális nukleotidjától a 3'-irányba kiterjedő, legalább 9 nukleotidot tartalmaz - és egy 3'alszegmentumot - mely nem fed át az 5'-alszegmentummal és amely a cél szegmentum 3'-terminális nukleotidjától az 5'-irányba kiterjedő, legalább 9 nukleotidot tartalmaz -, nevezett iniciáló DNS oligonukleotid primerek tartalmaznak:

    (1) egy első iniciáló DNS oligonukleotid prímért, amely egy egyes szálú DNS, mely a 3'-végén egy első alszegmentumot tartalmaz, mely rendelkezik egy 3'terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'-irányba, nevezett első primer nevezett első alszegmentuma, mely ugyanolyan hosszú, mint a cél szegmentum 3'-alszegmentuma és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően komplementer a cél szegmentum 3'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a vizes oldatban egy primer lánchosszabbítási reakciót, amelyikben egy, a cél szegmentum szekvenciájával rendelkező nukleinsav a templát, és (2) egy második iniciáló DNS oligonukleotid primer, amely egy olyan egyes szálú DNS, amelynek a 3'-végén egy olyan első alszegmentum található, amely rendelkezik egy 3'-terminális nukleotiddal és legalább 9 nukleotid hosszúságban kiterjed az 5'irányba, nevezett második primer nevezett első alszegmentuma ugyanolyan hosszúságú, mint a cél szegmentum 5'-alszegmentuma, és egy olyan szekvenciával rendelkezik, mely elegendően homológ a cél szegmentum 5'-alszegmentuma szekvenciájával, hogy elindítson a vizes oldatban egy primer lánchosszabbítási *·· • · ··· · · · « » · ·*·· · ··· ··«· · «·

    107 reakciót, amelyikben a cél szegmentum szekvenciájával komplementer szekvenciájú nukleinsav a templát, feltéve, hogy legalább egy az említett primerek közül tartalmaz továbbá egy promótert biztosító alszegmentumot, mely promótert biztosító alszegmentum tartalmaz (i) az 5'-végén egy DNS szegmentumot, mely egy és tíz közötti nukleotiddal rendelkezik, ez az említett egytől tíz nukleotidos szegmentum egy egyetlen foszfodiészter kötésen keresztül hozzákapcsolódik (ii) egy T7 promóter értelmes szála polimeráz kötő szegmentumának az 5'-nukleotidjához, mely említett polimeráz kötő szegmentum ugyanolyan hosszú, mint az említett T7 promóter említett értelmes szálának konszenzus szekvenciája, mely annak a primernek az első alszegmentumához kapcsolódik, mely az említett promótert biztosító szegmentumot tartalmazza, s ez a kapcsolódás lehetővé teszi a transzkripciót az említett T7 promóterről - melyet egy olyan cDNS tartalmaz, mely magában foglalja az említett két primer lánchosszabbítási termékeit - feltéve továbbá, hogy az említett promótert biztosító szegmentumnak vagy nincs transzkripciós iniciációs szekvenciája, vagy pedig van egy olyan szegmentuma, mely egy és négy közötti olyan nukleotiddal rendelkezik, mely egy egyetlen foszfodiészter kötésen keresztül hozzákapcsolódik a promóter konszenzus szekvencia 3'-nukleotidjához, és amely szegmentumot az alábbiakat tartalmazó csoportból választunk: 5'-GAAA-3'; 5'GGTA-3'; 5'-GGAA-3'; 5'-GGCA-3'; 5'-GGA-3'; 5'-GA-3'; és G.
33. 33. A 32. Igénypont szerinti egy iniciáló DNS oligonukleotid primer pár, aholis az említett egytől tíz nukleotidos szegmentum az 5-AGTAATT-3'.