WO2004107244A1 - 核酸分子を使用した情報処理方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、自律的に稼働することができる核酸分子を使用した情報処理方法および該方法によって演算を行うための分子コンピュータを提供することを目的とする。　上記の課題は、以下の方法により実現される。すなわち、本発明は、分子の化学反応により、引数を受け取り戻り値を返す関数による演算を行う情報処理方法であって、（ａ）分解可能な第1の一本鎖核酸に対応付けて定義された第１の符号化核酸を引数として入力し、（ｂ）前記引数に基づき、演算用核酸の化学反応に対応付けて定義された関数による演算を行い、（ｃ）第2の一本鎖核酸に対応付けて定義された第2の符号化核酸を戻り値として得ることを特徴とする情報処理方法を提供する。また、該方法に基づいて設計された分子コンピュータを提供する。

Description

明 細 書

核酸分子を使用 した情報処理方法

技術分野 '

本発明は、 DNA コ ン ピ ュータに関する。

背景技術 '

生体分子が持つ性質を利用する非常にユニーク な試みと し て、 DNA コ ンピュータが知 られている。 DNA コ ン ピュータ と は、 DNA の配列上に入力値や計算プロ グラムなどを人為的に 組み込んでやり 、 その DNA分子に対して様々 な反応、 たと え ば DNA修飾酵素や制限酵素などの酵素反応や核酸同士のハイ プリ ッ ド形成反応な どを う ま く 組み合わせる こ と によって計 算を実行する ものである。

DNA コ ン ピュータの歴史は、 1994年に Adlemanカ DNAを使 用 した実験系で数学的な問題を解く こ とが可能である と実証 し 7こ こ と によ り 台ま つ に (dleman LM、 Molecular computation ot solutions to combinatorial oroblems. 、 Science 、

( USA) 、 1994 年、 266(5187)卷、 ρ·1021-4)。 こ の研究で Adleman は、 有向ハ ミ ル ト ン経路問題とい う数学的な問題を DNA 分子な どを使用 した実験系で解いたのである。 またその 翌年には、 Lipton が DNA コ ン ピュータを使用 した充足可能 性問題の解法を報告 した （Lipton RJ、 DNA solution of hard computational problems.、 " Science 、 ( USA) 、 1995 年、 268(5210)卷、 p.542-5)。 DNA コ ン ピュ ータ の計算アルゴ リ ズ ムはその後にも多く の種類のものが考案され、 単一 DNA分子 上 で の 伸 長反応 を利 用 し た技術 （Sakamoto K, Gouzu H, Komiya K, Kiga D, Yokoyama S, Yokomori T, Hagiya M、 Molecular computation by DNA hairpin formation. 、

"Science" 、 (USA) 、 2000 年、 288(5469)卷、 p.1223-6、 akamoto K, Kiga D, Komiya K, Gouzu H, Yokoyama S, Ikeda S, Sugiyama H, Hagiya M、 State transitions by molecules.、

" Biosystems" 、 1999 年、 52(1-3)巻、 p.81-91)や一本鎖 DNA 分子上のヘア ピン構造を利用 した も の （akamoto K, Kiga D, Komiya K, Gouzu H, Yokoyama S, Ikeda S, Sugiyama H, Hagiya M、 State transitions by molecules.、 Biosystems" 、 1999 年、 52(1 -3)巻、 p.81-91 )、 DNA をメ モ リ ーと して利用 し 固相上で適切な解を探し出す技術や （Liu Q, Wang L, Frutos AG, Condon AE, Corn RM, Smith LM

DNA computing on surfaces.、 Nature" 、 (英) 、 2000 年、 403(6766)卷、 p.175-9、 ang L, Hall JG, Lu M， Liu Q, Smith LM

A DNA computing readout operation based on structure- specific cleavage.、 Nat Biotechnol" 、 (英) 、 2001 年、 19(11)卷、 p.1053-9) プラス ミ ドへの 2 本鎖 DNA の揷入 ' 切 出 しを利用する方法な ど多様な方法が考え られている。 また、 その他でも DNAではな く RNA を使用 した分子コ ンピュータや

( Faulhammer D, Cukras AR, Lipton RJ, Landweber LF

Molecular computation: RNA solutions to chess problems.、

" Proc Natl Acad Sci " 、 ( USA J 、 2000 年、 97(4)卷、 p.1385-9) 、 DNA の 自 己組織化によ るナノ構造を利用 した技 術 (Mao C, LaBean TH, Relf JH, Seeman NC 、 Logical computation using algorithmic self-assembly of DNA triple- crossover molecules. 、 " Nature " ( 英 ) 、 2000 年 、 407(6803)卷、 p.493-6)な ども報告されてお り 、 DNA コ ン ビ ュ ータが包括する範囲は広が り つつある といえる。

Adlema の研究を始めとする従来の多く の DNA コ ン ビユ ー タ技術は、 特定配列の DNA分子な どを入力データ と して扱い、 その後の生物化学的な操作ステ ッ プのプロ ト コルでプロ ダラ ムを規定している。 最近ではロボッ ト を使用 した各種反応の 自動化技術に よ る大規模計算実現の研究も行なわれている (特開 2 0 0 2 — 3 1 8 9 9 2 号公報、 特開 2 0 0 2 — 1 8 1 8 1 3 号公報、 Morimoto N, Kiyohara H, Sugimura N, Karaki S, Nakajima T, Makino T, Nishida N, Suyama A、 Automated processing system for gene expression profiling based on DNA computing technologies. 、 Eighth International Meeting on DNA Based Computers 、 ( Japan) 、 2002 年、 Hokkaido University、 Suyama A、 Programmable DNA computer with application to mathematical and biological problems. 、 " Eighth International Meeting on DNA Based Computers" 、 ( Japan) 、 2002 年、 Hokkaido University) _D これとは異なる方向性と して、 自律的に動作する分子コ ン ビ ユ ータ も研究されている。 これはプロ グラムを進める上で反 応液に対して外から操作を加える必要がな く 、 入力データお よび計算プロ グラムを DNA分子と して反応液中に与える と、 一定条件下で自律的に動作して計算結果を出力する も のであ り 、 チューリ ングマシンをモデルに開発された分子コ ン ビュ ータ技術力 S発表さ れた （Benenson Y, Paz-Elizur T, Adar R, Keinan E, Livneh Z, Shapiro E Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. " Nature "

(英） 、 2001 年、 414(6862)卷、 p.430-4)。 自律的に稼動す る分子コ ン ビュータ は 、 生体細胞内な ど従来の ンピュータ では不可能であつた環境で計算を実行するポテンシャルを有 する こ と力 ら注目 を集めている。

これら DNA ン ピュータ研究の 的は、 主に大規模な並列 計算を実現する とい う こ と にある すなわち 試験管の中に は非常に多数の DNA分子が存在可能であ り その DNA分子一 つ一つに計算の初期値や計算プロ グラム 自身等をあ らカゝじめ 組み込んでおき 、 それら DNA分子の集合体に対して一斉に計 算のプロ セス と なる化学反応を行な う こ と によつて、 非常に 多岐にわたる初期値ない し計算プ グラムによる計算を一度 に並列して行な う こ と ができ る とい う アイ丁ァである。 この よ う に、 DNA ン ピュ ータ の系が持つ特長である並列性を利 用 して並列計算などの数学的計算を効率的に行な う 系を開発 する 目的で研究が行なわれてきた

生体反応を数学的目的で応用する研究は そのユニーク な 発想とポテンシャノレから広く 関心を集める ちのの 、 具体的な 応用技術と なる と研究は未発達であ り 、 その将来性は未知数 である とい う のが現状である。 特に ¾ 1 よる従来型の コ ン ピュータの処理能力は年々拡大してお り れと比べて 分子コ ン ビュ タが処理能力や正確性などの面で上回る こ と は非常に困難である と考え られる 従来型の ン ピュ ータ と は異なる、 分子コ ン ピュータの有用性を発揮でき る適応分野 が開拓される こ と が望まれる。 その よ う な中で、 最近では

DNA コ ン ピュータを遺伝子の発現解析や SNPs 解析に役立て よ う と す る 研究の動 き が 出 て い る （Nishida N, Wakui M, Tokunaga K, Suyama A、 Hignly specific and quantitative gene expression profiling based on DNA computing.、 Genome Informatics" 、 2001 年、 （12)卷、 p.259-260、 Mills AP Jr、 Gene expression profiling diagnosis through DNA molecular computation.、 " Trends Biotechnol" 、 2002 年、 20(4)卷ヽ p.137-40) れは生体分子を直接入力データ と して扱える 分子 ンピュ タ特有の性質を生かした応用分野と して有望 である しかしなが ら生体の解析に応用可能な分子コ ンピュ 一タ と して従来提案されてきたものは自律的に稼動する の ではな < 、 その応用範囲も限られていた。

核酸分子が含有する情報にアクセスする手段と して核酸 士のノヽィブリ ダィゼーシ ョ ン反応が利用されるがヽ 一 /ス情報 にァクセ スする とその部位に核酸同士の安定なハィプリ V ド、 が形成される こ とからそのままでは再びア ク セスできな < な る。 しかしなが ら、 核酸が含有する情報を利用 した分子 ン ピュ一タ を構成する際には繰り 返し連鎖的に情報にァクセス でき る - と が望ま しい。 そのためには、 ひと たび二本鎖と な つてァクセス不能と なった核酸分子上の情報を、 再ぴァクセ ス可能にするプ口セスが必要と なる。 従来の多く の DNA ン ピュ一タは、 熱を加えて核酸を変性させる こ と によ り このプ πセスを実現している。 しかしこの方法では外部からの温度 コ ン ト ロールが必須と な り 、 自律型分子コ ンピュータは実現 しない。 自律型分子コ ンピュータ を実現するためには、 二本' 鎖の核酸に閉 じ込め られた情報を、 酵素な どの分子反応など を活用する こ と で再ぴアクセス可能とする こ とが鍵と なる。 Shapiro ら の分子コ ン ピ ュ ータ （Y. Benenson et al、 DNA molecule provides a computing machine with both data and fuel、

" Proc. Natl. Acad. Sci." 、 2003 年ヽ 100巻、 p.2191-6)はヽ 制限酵素の切断で二本鎖 DNAから一本鎮 DNAの切断面を露出 させる こ と によ り 、 自律型分子 ンピュータの実現を成功さ せた例がある。

発明の開示

上記のよ う な状況に鑑み、 本発明はヽ 自律的に稼働する こ とができ る核酸分子を使用 した情報処理方法おょぴ該方法に よって演算を行 う ための分子コ ンピュ タ を提供する こ と を 目的とする。

上記のよ う な状況に鑑み、 本発明はヽ 自律的に稼働する こ とができ る核酸分子を使用 した情報処理方法および該方法に よって演算を行う ための分子コ ンピュ一タを提供する こ と を 目的とする。

課題を解決するための手段

上記の課題は、 た と えば以下の方法によ り 実現される。 す なわち、 本発明は、 分子の化学反応によ り 、 引数を受け取り 戻り 値を返す関数による演算を行う情報処理方法であって、

( a ) 分解可能な第 1 の一本鎖核酸に対応付けて定義され た第 1 の符号化核酸を引数と して入力 し 、 ( b ) 前記引数に基づき、 演算用核酸の化学反応に対応付 けて定義された関数による演算を行い、

( c ) 第 2 の一本鎖核酸に対応付けて定義された第 2 の符 号化核酸を戻り値と して得る こ と、

を特徴とする情報処理方法を提供する。

図面の簡単な説明

図 1 は、 レ ト ロ .ウ ィ ルス のゲノ ム複製サイ ク ルの模式図を 示す。

図 2は、 本発明の方法の基本的な処理を示す処理フローを 示す。

図 3 は、 本発明の方法の基本的な処理を示す処理フ ローを 示す。

図 4 A〜 4C は、 分子コ ン ピュータに使用する反応の模式図 を示す。

図 5 A、 5 B は、 本発明の情報処理方法の概念図を示す。 図 6A〜 6Eは、 各種基本関数の模式図を示す。

図 7A〜 7C は、 遺伝子のコ ー ド化と論理演算による遺伝子 解析方法の模式図を示す。

図 8 A〜 8 C は、 ニューラ ル ■ ネ ッ ト ワーク による遺伝子解 析方法の概略を示す。

図 9 A、 9B は、 FRET による検出のための演算用核酸を示 す。

図 1 0 は、 高温反応条件における RN A依存 DN A ポリ メ ラ ーゼ活性の測定結果を示す。

図 1 1 は、 高温反応条件における DNA依存 RNA ポリ メ ラ ゼ活性の測定結果を示す。

図 12 は、 高温反応条件における DN A依存 DN A ポ V メ ラ

―ゼ活性の測定結果を示す。

図 13 は、 本発明の方法において使用 した TGTP-P 1 プラィ マ一の概略図を示す。

図 14 は、 TGTP-P1 プライマーを使用 した伸長の活性と特 異性を示す電気泳動写真である。

図 15 は、 TGTP 遺伝子の発現を検出するための遺伝子の 一ド化関数の概略図を示す。

図 16 は、 TGTP 遺伝子の発現を検出するための関数によ る演算の出力結果を示す。

図 17 は、 TGTP 遺伝子の発現を検出するための関数によ る演算の出力結果を示す。

図 18 は、 複数の RN A分子にまたがる経路の逆転写反応に 使用 した符号化核酸の概略図を示す。

図 19 は、 複数の RN A分子にまたがる経路の逆転写反応の 反応産物の電気泳動写真を示す。

図 20 は、 論理演算反応のための演算用核酸の概略図を示 す

図 21 は、 論理演算反応の結果を示す。

図 22 は、 TGTP 遺伝子のセ ンス鎖 RNA を増幅するための

Amplify関数に使用する演算用核酸を示す。

図 23 は、 TGTP 遺伝子のセンス鎖 RNA を増幅するための Amplify関数による演算結果の電気泳動写真を示す。

図 24 は、 関数を多層に重ねた場合の反応の一例を示す。 図 25 は、 反応産物中の Code[4,5，6]RNAの検出結果を示す。 図 26 は、 反応産物中の Code[3,2]RNA の検出結果を示す。 発明を実施するための最良の形態

上記の課題を解決すべく 鋭意研究を行った結果、 以下の思 想に基づいて本発明を完成する に至った。

RNA ゲノ ム を有する ゥイ ノレス の一種である レ ト 口 ウイノレス は、 宿主細胞内にてゲノ ム複製を行な う こ とが知られている (図 1 )。 RNA ゲノ ムの複製は、 逆転写酵素の RNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性によ り RNA を cDNA へと逆転写する こ と によ つて開始する。 これは細胞内の tRNA がゲノ ム上の primer binding site (PBS)に特異的に結合してプライマーと して働 く こ と によって開始される。 こ こから逆転写反応が開始され、 一度ゲノ ムの 3 '末端まで cDNA が合成された後、 さ らにゲノ ム 5'末端への鎖の転移と それに続く 逆転写反応が行なわれ る。 その結果、 全長ゲノ ムの第 1 鎖 cDNA が形成される （Mak et a 1. Primer tRNAs for reverse transcription. J Virol 1997 Nov;71 (ll) :8087_95)。 开$成された DNA-RNAハイプリ ッ ドの う ち の RNA 鎖は逆転写酵素の RNaseH 活性によ り 除去さ れる。 残された一本鎖 DNAは、 さ ら に DNA依存 DNAポリ メ ラ ーゼ活性によ り 二本鎖 DNA と な り 、 これがゲノ ムに組み込ま れてプロモータ部位からゲノ ム配列が転写される。 その結果、 も と のゲノ ム と 同一の配列を有するゲノ ム RNAが生成される。 なお、 細胞内に存在する long terminal repeat (LTR) レ 卜 口 ト ラ ンス ポゾ ンな ども同等の機構によ り 配列を複製する こ とが知られてお り 、 2 本鎖 DNA 上の配列を 1 本鎖 RNAへと転 写した後、 再び逆転写および DNA2 本鎖化がなされて複製さ れ (Wi lhe lm Reverse transcription of retroviruses and LTR retrotransposons. Cell Mol Life Sci 2001 Aug ;58 (9)： 1246-62)。

上記レ ト ロ ウ イ ルス のゲノ ム複製は、 4 つの特徴的な反応 によ り 構成されている。 第 1 は、 RNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ 活性によ る逆転写反応である。 第 2 は、 DNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性によ る DNA2 本鎖化反応である。 第 3 は、 DNA 依 存 RNAポ リ メ ラーゼ活性に よ る転写反応である。 また、 逆転 写反応お よ び DNA2 本鎖化反応の際に、 RNaseH 活性に よ り

DNA-RNA ハイ ブ リ ッ ドの RNA 鎖が除去される こ と も完全長ゲ ノ ムを複製する上で重要な役割を有する。 この 4種の反応の 組み合わせによ り 、 ゲノ ム増幅は実現している このよ う な 一連のシステムを一種の ンピュ一タ と捉える と 、 レ 卜 口 ゥ イ ノレスは 、 宿主細胞と い ノヽ一 ウェア内における上目己 4種 の反応活性を活用 して、 白 らのゲノ + ム RNA と い う 入力に対し て、 複製された同一配列の RNA を返すと い う プ グラ ムを実 行している と 見なすこ と ができ る

また、 上記 4つの反応を巧みに組み合わせる と によ り 、 レ ト ロ ゥイ ノレス の 自 己ゲノ ム複製プロ ダラ ム と は異なつたプ ロ グラ ムを実行させる こ と も可能である と 考 られる。 そこ で、 本発明は、 これら 4つの反応によ って構成される分子コ ンピュー ·> - タ の設計を試みた で設計した分子コ ン ビュ ' ~ タ は、 RNA 依存 DNA ポ リ メ ラ一ゼ活性、 DNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性、 DNA 依存 RNA ポ リ メ ラーゼ活性および RNaseH 活性を |PJ時に実現する反応液をハ一 ドウエア と して使用する。

―、、

この中に入力了ータ と しての RNA サンプルを与え、 RNA 分子 を引数 よび戻 り値とする 「関数 J による演算を行う。 本発 明では 、 のノヽ 一 ドウ ア中で動作する基本的な関数と して、 いく つかの例を定義した。 さ らに 、 これらの関数を適宜糸且み 合わせる と によ り 、 プロ ダラムを構成する こ と が可能と な

、虫

り 、 伝子発現解析な どにも応用でき る。 このよ う な分子コ ンピュ一タは 、 導入するプログラムによ り 異なる効果を示す こ と がでさ る o したがつて、 プ グラム可能な汎用分子コン ピュ一タである といえる。

また レ 卜 ウィルスのゲノ ム増幅システムは逆転写反応 一

活性ヽ DNA 本鎖化反応活性、 転写反応活性および RNaseH 活性よ り 構成されるがヽ この機構を自律的な分子コ ンビユー タに応用するにあた り 最も特徴的な反応と して、 転写反応活 性と RNaseH 活性を挙げる こ とができ る。 レ ト ロ ウイルス型 の分子コ ンビュ ' ~~タでは 、 二本鎖 DNA分子から一本鎖 RNA を 精製する転写反応活性と 、 DNA-RNA ハイプリ ッ ド力、ら RNA 鎖 のみを取り 除いて一本鎖 DNA を残す RNaseH 活性と が、 分子 ンピュータ を自律型に稼動させるための鍵と なる。

上述の思想からヽ 本発明は、 DNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活 性 、 RNA依存 DNA ポ V メ ラーゼ活性および DNA依存 RNA ポリ メ ラーゼ活性などのポ V メ ラーゼ活性および RNas eH 活性等 を有する酵素による分子の化学反応を利用 して、 自律的な反

J心の実行を実現し 、 引数を受け取り 戻 り値を返す関数による 演算を行 う 情報処理方法を開発 した。 ·>- こで、 Γ自律的 J な反 J¾、と は、 分子の化学反 J¾、を行 う 際 に、 外部から核酸の分離、 製等の操作を行わずに反応産物 る こ とができ る こ と を JW、味する。 すなわち、 外部からの 操作を必要とせずに 、 入力 した引数に対する戻 り 値を出力す る関数の演算が可能である ·>- と をい う。

また、 本明細書において使用する 「核酸 J と は 、 c D N A、 ゲノ ム D N A 、 合成 D N A ヽ m R N A、 全 R N A 、 h n R N

Aおよび合成 R N Aを含む全ての D N Aお び R N A ヽ 並び にぺプチ ド、核酸、 モルホ リ ノ核酸 、 メ チルフ ォ ス フ ォネ一ト 核酸およぴ S -才リ ：ゴ核酸な どの .人工合成核酸を含む また、 本明細書に レ、て 「核酸」 ヽ 「核酸分子」 および 厂分子 」 と は交換可能に使用され得る

本明細書において使用される 「塩基配列 J わよび Γ配列」 の語は共に 、 特定の核酸を 成する塩基の並びを示す ので ある。

以下、 図面を参照しなが ら発明の実施形態を説明する

発明の好ま しい態様に従う と 、 核酸を使用 した情報処理 方法が提供される。 本発明は、 核酸分子を用いて計算を実施 する こ と によ り 、 了一タの処理や 、■*· /一、子解析を白律的に実行 可能な方法を開示する た、 核酸分子によ り 丁一タやプ口 グラムを表現し 、 そのプ口 グラムで定義された演算を分子反 応に置き換えて 自律的な反応の実行を実現する

まず最初にヽ 本発明の情報処理方法の開発に当た り 、 実行 する演算の内容を分子の化学反応と して実行可能なデ一タ形 式に変更 して < 。 体的には 、 分子の化学反応によ る演算 を実 ¾aする前にヽ 情報を、 予め分子を特定の符号に結びつけ た符号化核酸に変換する そ して 、 その変換規則を使用 して 演算における変数 よび疋数な どのデータを符号化核酸に変 換しておく 。 次いでヽ れらの符号化核酸による演算処理を 行い、 符号化核酸によ る出力を得る。 得られた符号化核酸を、 予め結びつけた情報に変換する と によ り 、 演算が実行され 本発明の第 1 の態様の方法について、 基本的な処理を図 2 および 3 の処理フ ローに従って説明する。

図 2および 3 は、 引数を受け取り 戻り値を返す関数による 演算を行う情報処理の工程を示す。

(S1) 引数 11 の入力を行う 工程である 具体的には、 分 解可能な一本鎖核酸 21 に対応付けて定義された符号化核酸 を引数と して入力する。

(S2) 関数 12 によ る演算を行う工程である。 具体的には、 引数 21 ί;こ基づき、 演算用核酸の化学反応 22 に対応付けて定 義された関数 12 によ る演算を行う。 「演算用核酸」 は、 入 力 した一本鎖核酸 21 等と反応 し、 所定の反応を経て特定の 反応産物が産生される よ う に設計された種々 の核酸である すなわち 、 関数と しての化学反応を進行させるために必要な 配列を有する核酸であ り 、 たと えば、 ブラィマーおょぴプ Π モータ と して作用する。 演算用核酸は複数であっても よ く ヽ

1 つの関数による演算を行 う ために複数の演算用核酸を使用 する こ と ができ る。

(S3) 数の戻り値 13 を得る工程である 。 具体的にはヽ 一本鎖核酸 2 3 に対応付けて定義された符号化核酸 1 3 を得る こ とである。

こ こで、 上記 「対応づけて定義された」 と は、 核酸の化学 反応における操作が、 情報処理上のどのよ う な操作に該当 し ているかを表している。 すなわち、 情報処理上の符号化核酸 (引数） 1 1 が、 化学反応に使用 される分解可能な一本鎖核 酸 2 2 に該当 し、 情報処理上の関数 1 2 によ る演算が、 化学反 応における演算用核酸および分解可能な一本鎖核酸などによ る化学反応 22 に該当 し、 情報処理上の戻り 値 1 3 が、 化学反 応の反応産物である一本鎖核酸 2 3 に、 それぞれ該当する こ と を表している。

また、 （ S 1 ) における引数の入力は、 必ずしも分解可能な 一本鎖核酸 2 1 に対応づけて定義された符号化核酸を引数と する必要はなく 、 分解可能な一本鎖核酸そのものを直接引数 と して入力する こ と もでき る。 この場合、 分解可能な一本鎖 核酸自体による演算処理を行い、 符号化核酸によ る出力を得 る。 さ らに、 （S 3 ) において得られる関数の戻り 値は、 第 2 の一本鎖核酸 2 3 に対応付けて定義された符号化核酸 1 3 を得 るだけでなく 、 第 2 の一本鎖核酸を直接戻り 値と して得ても よい。 ただし、 情報処理方法と して関数によ る演算を行う場 合、 引数または戻り 値のいずれか一方は、 予め分子を特定の 符号に結びつけた符号化核酸である。

本発明に使用する化学反応の例を図 4Aに示す。

本発明の方法は、 「入力」 を分解可能な一本鎮核酸 （た と えば、 RNA 分子） に よ り 与える。 情報処理上の 「引数の入 力」 は、 分解可能な一本鎖核酸を反応液に添加する こ と に対 応する。 以下、 分解可能な一本鎖核酸と して RNA を使用 した 場合を例に説明する。

入力 した RNA 分子に対する演算用核酸 （図 4A に示したプ ライマー） が存在する と、 逆転写反応が引き起こ されて入力 が読み取 られる。 こ こで、 逆転写反応に よ って形成された DNA-RNAハイプリ ッ ドの RNA鎖は、 RNaseH活性によって分解 される こ と となる。 この RNaseH によ る分解は、 従来の情報 処理における入力情報の消去に該当する。

従来の DNA 分子を使用 した情報処理方法では、 入力 した DNA を読み取った後、 入力 した DNA が分解されずに反応系に 残ったままであった。 したがって、 その後の反応において該 DNA が不要な場合は、 該 DNA を除去するために分離操作など の煩雑な操作が必要であった。 このよ う な分離操作には、 外 部からの一連の操作が必要であ り 、 自律的に稼働させる こ と は困難であった。 た と えば、 分離操作を自動処理する には、 ロボッ ト による分離操作等が必要であった。 しかし、 分解可 能な核酸分子を使用する こ と によ り 、 たと えば RNA分子であ れば、 RNaseH の酵素活性によ り 容易に入力 した RNA 分子の みを消去する こ とができ、 反応系において自律的に反応を実 行でき る。 本発明では、 分解可能な一本鎮核酸と して RNA分 子を使用 したが、 その他の分解可能な核酸分子を使用する こ と もでき る。

本明細書において、 「分解可能」 と は、 所定の反応によ り 「分解可能な一本鎮核酸」 のみが分解され、 その他の核酸は 分解されないこ と をい う。 特に、 演算用核酸が分解されない よ う な条件下で 「分解可能な一本鎖核酸」 のみが選択的に分 解される こ と を意味する。 たと えば、 「演算用核酸」 と して DNA を使用 した場合、 RNA は、 RNaseH によって選択的に分解 される こ とから 「分解可能」 である といえる。 また、 「演算 用核酸」 が RNAである場合に純粋な DNA分解酵素を用いる と、 DNA のみを選択的に分解する こ とができ、 このよ う な条件下 においては DNAが 「分解可能」 な核酸とい う こ と になる。 す なわち、 「分解可能」 と は相対的な概念といえる。

「分解可能」 な核酸のその他の例 と して、 演算用分子が DNA である場合における ゥ ラ シル含有 DNA ( A RACHITT for our toolbox, Nature Biotechnology, Apr 11 2001 Volume 19 Number 4 pp 314 - 315、 DNA shuffling method for generating hi hly recomb ined genes and evolved enzymes, Nature Biotechnology, Apr i 1 2001 Volume 19 Number 4 pp 354 - 359) 、 および演算用分子力 S Peptide Nucleic Acidで ある場合における DNAや RNAな どが挙げられるが、 これらに 限定される ものではない。

また、 本発明の方法において、 引数と して入力する核酸は、 一本鎖の核酸である。 核酸によ る情報処理方法では、 核酸配 列上の情報にアクセスするためにハイ プリ ダイゼーショ ン反 応を利用 している。 したがって、 入力に 2本鎖 DNA を使用す る従来の技術では、 該 2本鎖 DNA に演算用核酸な どをハイブ リ ダイズさせるために、 2 本鎖 DNA を一本鎖にする反応が必 要である。 しかし、 このよ う な反応は、 通常温度の制御が必 要であ り 、 外部から一連の操作を行わなければな らなかつた このため 、 上記分離操作と 同様にヽ 自律的に反応を実行させ る こ とが困難であつた。

またヽ 核酸が分解可能でない場合 、 ハイ ブリ ダイズした核 酸が二本鎖を形成したまま となるため、 一本鎖にするために 温度制御等が必要と なる。

しかし 、 本発明の方法では、 分解可能な一本鎖核酸を使用 するため 、 該核酸は 、 ハイブリ ツ ド、を形成した後に分解され

Ό o したがって、 自律的な演算が可能と なる 。 すなわち 、 定温度のままでも演算用核酸の化学反応を行 う こ とが可能で あ り 、 S律的な分解反応が実行される。 たと えば、 以下の実 施例に いて検討した とお り 、 50 °Cの一定温度において自律 的な反応を行う こ と ができ る。

一方 RNA と して入力 した情報は . 、 RNa s e H によつて分解さ れて消去される と共に、 よ り 安定な核酸分子 (た と えば DNA 分子） に逆転写される こ と によ り ヽ よ り 安定な状態で記 保存する こ と もでき る。 た、 された一本鎖 DNAは 、 さ ら に別の RNA に対するプライマーと して働く 、 すなわちヽ 演算 用核酸と して繰り 返し機能する こ と もでき る 。 したがつて、 該 DNA から さ ら に伸長反応が進行する こ と も考え られる （図 4B )。 本明細書において、 図 4 B のよ う に配列 aのプライマ ー が 1 つ以上の RNA鎖上を逆転写する こ と によって生じた配列 を 「配列 aで開始した RNA上の経路」 と呼ぶ。 得られた一本 鎖 DNAは、 さ らに該一本鎖 DNAに相補的なプライマ ー （これ も演算用核酸の一つである） の存在のも とで二本鎖 DNA と な る。 この二本鎖 DNAか ら転写された RNA分子を、 関数によ る 演算の出力 と して得る こ と ができ る （図 4A)。

T7 RNA ポ リ メ ラ ーゼな どの転写酵素の転写活性が誘導さ れる ためには、 プロモータ部位が 2本鎖 DNAである必要があ る こ と 力 S 知 ら れ て い る （Milligan et al. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res 1987 Nov 11 ; 15 (21) :8783- 98)。 本発明では、 こ の性質を利用 して 出力を コ ン ト ロ ールする （図 4C)。 た と えば、 演算用核酸と して使用するプライ マー上にプロモータ配列をあ らか じめ組 み込んでおき、 該核酸が一本鎖 DNAのままではプロモータ配 列か ら RNA の転写が生 じないが、 二本鎖になった と き にプロ モータ配列が酵素に認識され、 転写活性の起点と して機能す る こ と を利用する。

本発明の情報処理方法は、 RNA によ る入力を受け付け、 各 種反応が生 じた結果と して RNA に よ る 出力を返す一連のシス テム全体が 1 つの コ ンポーネン ト と なっている。 上述 した と お り 、 このよ う なコ ンポーネン ト を、 RNA に よ る 「引数」 を 受け取 り RNA に よ る 「戻 り 値」 を返す 「関数」 と 呼ぶ （図 5A)。

本発明の情報処理方法では、 戻 り 値を一本鎖核酸と して得 ているため、 この戻 り 値に再アク セスする こ と も容易である。 また、 各関数は引数および戻 り 値が同 じ分子 （共に分解可能 な核酸分子である RNA) である こ と か ら、 ある関数の戻 り 値 が他の関数の引数と なる こ と が可能である。 すなわち、 ある 関数によ って得られた戻 り 値を さ らなる関数の引 と して使 用 し 、 さ らなる戻 り 値を得る こ と ができ る 。 またヽ 1 つの関

· 数に ける 引数は一つ と は限られず、 複数の引数を と る と も可能である。 この と き、 複数の関数の戻 り 値を引数と して、 さ ら なる戻 り 値を得る関数を定義する こ と もでき る のよ

·>- う な関数を複数組み合わせて、 所定の戻 り 値を得る と ちで 含、 関数、 引数および戻 り 値の組合せによ り 記述されたプ グラ ムに従って複数の関数によ る演算を行 う こ と によ り 該 プ口 グラ ムの計算結果を戻 り 値と して導出する こ と でさ る。

また 、 上記一連のシステム全体を分子コ ンピュ一タ である とする と 、 所望の関数によ る演算を行 う ための演算用核酸 、 適切な反応液おょぴ適切な酵素で構成される反 J心液は 、 の 関数によ る演算を実現する ための コ ンビュータの Γ ノヽ 一 ド、ク ェァ J に該当する。 DNA (も し く は RNA)プライ マ一な どの演 算用核酸によ って 「プロ グラ ム」 が定義され、 実際に引 き起 こ される反応が決定さ れる こ と と な る （図 5 B ) 。 本発明の情 報処理方法を使用する こ と によ り 、 RNA によ る入力を受けて ノヽ 一 ウェア と しての反応液中で反応を行い、 結果を RNA に よ り 出力する こ と が可能な分子コ ンピュー -タ実現される （図

5 Β ) 。

(各種基本関数の設計）

次に 、 上述 した関数によ る演算の具体例を以下に示す。

発明の情報処理方法で実現される 関数は、 演算用核酸に よ って定義される 。 演算用核酸は 、 た と えば、 一本鎖核酸に 対 してプライマ一 と して作用する配列 、 プ口モータ配列およ び任意の核酸のプライマーと して作用する配列から選択され る一以上の配列を有するプライマーである こ とが好ま しい。 分解可能な核酸分子と して RNA分子を引数とする場合、 本発 明による関数の演算には、 この一本鎖 RNA にプライ ミ ングし て DNA の伸長反応を引き起して第 1 鎖 cDNA を形成させる第 1 プライマー（P1) と、 第 1 鎖 cDNA にハイプリ ダイ ズする第 2 プライマー（P2)と の 2種類の演算用核酸が必要である。 これ らのプライマー上のいずれかの位置にプロモータ配列を組み 込むこ と によ り 、 そのプライマーが二本鎖 DNA と なった と き に転写活性が誘起される。 その結果、 特定の RNAが出力され る。 上記関数の例と して、 プロモータ配列を配置する際の位 置および向きによ り 、 たと えば以下に示す 4通り の関数が考 え られる （図 6A, B, C， D) 。 また、 引数を と らない関数も考 え られる （図 6E)。 その他、 当業者であれば、 上記関数に基 づいて種々 の関数を定義する こ と が可能であろ う。

以下、 上記 5 つの関数について詳細に解説する。

基本関数 A ： Path (a -〉 b) => X

配列 a よ り始ま り 配列 b を通過する RNA上の経路が存在す る場合に、 指定した配列 X の RNA を返す関数である。

P1 は、 5'末端方向のプロモータ配列と、 その下流に X の 逆相補鎖配列と、 その 3'末端に a の相補鎖配列と を有する プライマーであ り 、 プライマー P2 の塩基配列は、 b である (図 6A) 。 こ の よ う に設計した P 1、 P2 を含む反応液中に配 列 a を有する RNA 分子が存在する と、 P 1 から逆転写反応が 起こ る。 この反応の際に、 図 4B に示したよ う に複数の RNA 分子上を迪る反応が生じても よい。 具体的には、 プライマー よ り 逆転写反応が起こった際に生成された一本鎖 cDNA の 3， 末端が他の RNA と結合してプライマーと して働き、 再び逆転 写反応が開始する場合が含まれる。 この と き、 逆転写反応が 迪つた塩基配列 （図 4B の場合 a→b→ c→ d)を、 特に 「配列 a よ り 開始した RNA 上の経路」 と呼ぶこ と とする。 またその 経路を構成する RNA分子上の配列（この場合 a→ b, b→ c及び c→ d)を 「経路素子」 と呼ぶ。

次に、 P 1 からの逆転写反応によって形成された一本鎖 DNA 上に配列 B と相補的な配列が存在する と、 プライマー P2 力 S 結合して第 2 鎖 DNA の合成が開始される。 これによ り 、 P 1 上のプロモータ配列が二本鎖化されて転写が誘発されて、 プ 口モータの下流に配置された配列 Xの RNA分子が出力される。 すなわち、 本反応は、 配列 a よ り 開始した RNA上の経路が配 列 b を通過する場合に配列 X の RNA を返す関数となる。

基本関数 B : Path (a-# b [； b' ； b" … ]) => X 配列 a よ り 始ま り 配列 b で終結する RNA上の経路が存在す る場合に、 指定した配列 X の RNA を返す関数である。 なお、 終結条件は、 「 b も し く は b，、 b ' '…」 のよ う に、 並列的に 拡張する こ と もでき る。

P1 は、 a の相補鎖配列を有するプライマーであ り 、 P2 は、 5 '末端方向のプロモータ配列と、 その下流に配列 X と、 その 3'末端側に配列 b と を有するプライマーである （図 6B) 。 ここに配列 a を有する RNA 分子が入力される と、 そこ力、ら RNA 上の経路に沿って逆転写反応が起こ る。 その経路が配列 b の相補鎖で終結した場合、 その末端の配列は P2 の配列 B と結合してプライマーと して機能し、 その結果二本鎖と なつ たプロモータ配列の下流に配置された配列 Xが転写される。 なお、 P2 上には、 プライマーが結合する配列が b、 b，、 b" …とい う よ う に複数配置されていても よい。 この場合は、 経 路の終結条件が b、 b'、 b"… と並列的に拡張される。 また、 この関数では P2 その ものは伸長反応を起こす必要がない。 したがって、 P2 の 3 '末端に特殊な修飾や塩基配列を付加 し てお く こ と もでき る。

基本関数 C : Amplify (a -# b [-- add5 P] [_-add3 Q]) 配列 a よ り 始ま り 配列 b で終結する RNA上の経路が存在す る場合に、 その配列の RNA を増幅する関数である。 また、 増 幅配列の 3'末端または 5'末端に、 任意の配列 P または Q が 付加された RNA を増幅するする こ と もでき る。

P1 は、 a の相補鎖配列を有するプライマーであ り 、 P2 は、 3 '末端方向のプロモータ配列と、 3 '末端の配列 b とから構成 される （図 6D ) 。 こ こ に配列 a に相補的な配列を有する RNA 分子が入力される と 、 RNA 上の経路に沿って逆転写反応が起 こ る。 こ の経路が b の相補鎖配列で終結した場合、 その末端 配列が P2 の配列 b と結合してプライマーと して機能し、 そ の結果二本鎖と なったプロモータ配列の下流に配置された a から b までの経路の相補鎖 （も と の入力 RNA と 同一の鎖） の 配列を有する RNAが転写される。 さ らにこの関数の戻り 値は 再帰して同一関数の引数と なるため、 ループを形成して遺伝 子配列の増幅を引き起こす。 また、' 必要に応じて Pl、 P2 各 プライマーに配列 P、 および Q の相補鎖配列を組み込むこ と によ り 、 出力される RNA 分子の 5 ' 末端または 3 ' 末端に任 意の配列 P または Q を付加する こ とができ る。

基本関数 D ： RevAraplif y (a _> b [-- add5 P] [-- add3 Q])

配列 a よ り 始ま り 配列 b を通過する RNA上の経路が存在す る場合に、 その逆相捕鎖配列の RNAを増幅する。 また、 増幅 配列の 3，末端または 5'末端に、 任意の配列 P, Q を付加する こ と もでき る。

P 1 は、 3 '末端方向のプロモータ配列と、 3 '末端の配列 a相 補鎖とから構成され、 P2 は、 配列 b を有する （図 6D) 。 こ こに配列 a を有する RNA が入力される と、 RNA上の経路に沿 つて逆転写される。 さ らにその経路が配列 b の相補鎖配列を 通過する と、 P2 が該配列に結合 してプライマーと して機能 し、 DNA2 本鎖化反応を誘起する。 その結果、 P1 上のプロモ ータ配列も二本鎖 DNA とな り 、 配列 a から b までの経路配列

(も と の入力 RNA の逆相補鎖配列） の RNA を転写する。 なお、 出力された逆相補鎖 RNA には、 さ らに P2 が結合して逆転写 反応が行わる。 転写された DNA には、 P 1 が結合して DNA 二 本鎖化反応が生じ、 再び同一の RNAが出力される。 この反応 は、 本関数を実装するプライマ ー P 1 および P2 の役割が入れ 替わる こ と によ り 、 も とのプライ マーが逆相補鎖 RNAを引数 とする基本関数 C: Amplify (b -# a)と して機能する と表現 する こ と もでき る。 この関数も、 基本関数 C と同様に、 出力 される RNA 分子の 5 ' 末端または 3 ' 末端に任意の配列 P ま たは Q を力 Bえる こ とができ る。

基本関数 E : Output () RNA X

引数を必要とせず、 常に配列 Xの RNA を出力する。

基本関数 Eは、 引数と しての RNA分子を必要とせず、 常に 配列 Xの RNA を転写する よ う に設計してある。 こ の関数は、 プロモータ配列と その下流に続く 配列 X からなる二本鎖の

DNA分子によって実現される。

(基本関数の組み合わせによ るプロ グラム構築）

上記基本関数を組み合わせる こ と によ り 、 高次な関数を構 築する こ と こ と ができ る。 さ らに、 上記関数、 引数および戻 り値を組み合わせてプロ グラムを構築する こ と こ と もでき る。 し力 し、 図 5 に示したよ う なプロ グラムを化学反応によ り 実 行する際に、 特に演算用核酸の設計に注意する必要がある。 上記基本関数 A、 B、 Cおよび D は、 最初に逆転写反応を引き 起こす演算用核酸をプライマ ー P1 と し、 続く DNA 二本鎖化 反応を引 き起こす演算用核酸をプライマ ー P2 と して分類し ている。 しかし、 関数の実体と して反応液中に加えられるプ ライマーは、 基本関数 A と B とでは同等であ り 、 また C と D と で同等であ る。 た と えば、 基本関数 A ： Path (a -〉 b) => X を実装するプライマ ー ' ペアは、 プライマ ー P2 が第 1 プライ マーと して機能して しま えば、 基本関数 B: path (b 一 # a) => X と して働く 。 あるいは、 プライマ ー P1 が第 1、 第 2 プライマーと して機能すれば、 path (a -〉 a) => X な る出力を与える こ と も考え られる。

あるいは、 プライマーがダイマ ーを形成する こ とでプロモ きお

ータ配列が二本鎖と な り ヽ つた戻り 値を返して しま う 可能 性も考え られる。 さ らに複数の関数を単一の反応液中にて同 時に実行する場合、 相互作用を起こ し るプライマーの組み 合わせは、 関数の種類に応じて増大しヽ 副反応の可能性がさ らに広がる。 副反応の影纏を受けずに 、 狙った関数反応を効 果的に実行するプロ グラムを実装するために、 プロ グラムを 組む際に副反応が発生し難いと考える関数の組み合わせを使 用する こ とや、 反応に用いるプライマ の配列を特に注意し て設計する こ と などといつた配慮が特に鱼要 [、'ある。

た と えば、 演算用核酸と して 、 正規直交化配列を含む核酸 を使用する こ とができ る Γ正規直交化配列」 における 「正 規」 の語は、 複数の配列にねいて熱的性質の正規性を維持す る こ と、 即ち、 融解温度が一定の範囲内で揃ってレヽる こ と を

- 示す。 熱的性質の正規性を維持する と によって、 た と えば 多く の配列を纏めて使用 して反応を行つ こ と が有利に実行さ れる。 「正規直交化配列」 における 厂直交化」 の語は、 配列 に直交性を持たせる こ とであ り 、 1 つの直交化配列群に含ま れる全ての配列は、 夫々独立して反応する、 すなわち、 1 つ の正規直交化配列群に含まれる配列は 、 所望の組み合わせ以 外の配列間および自 己配列内において反応が生じ難いか、 ま たは反応が生じない。 言い換えれば 、 1 つの直交化配列群に 含まれる配列は、 配列間でのク ロスノヽィブリ ダイゼーショ ン や、 自 己配列内での望まないハィ プ V ダィゼーショ ンが従来 よ り も生じ難いか、 生じない。

上記 の よ う な 正規直交化配列 は 、 H . Y s h i da a n Suy ama, "Solution to 3 - SAT by breadth firs search ， DIMACS Vol.54 9一 20 ( 2000)およぴ特願 2003— 108126 に詳糸田力 S 記載されている。 これらの文献に記載の方法を使用 して正規 直交化配列を設計する こ と ができ る。 簡単には、 予め無作為 に塩基配列を複数作出する こ と と、 それらの融解温度の平均 値を求める こ と と、 その平均値の ± t °Cで制限される閾値を 基に候補配列を得る こ と と、 独立して反応する配列であるか 否かを指標に得られた候補配列から正規直交化配列群を得る こ と を具備する方法によって作製する こ と ができ る。

正規直交化配列である核酸群は、 そこに含まれる夫々 の塩 基配列または核酸の融解温度がほぼ均一であ り 、 互いにク ロ スハイプリ ダイゼーショ ンを起こ し難く 、 その自 己二次構造 が安定ではない。 正規直交化配列は、 たと えば、 以下の実施 例にコー ド配列と して示す核酸にも使用する こ と ができ る。

また、 本発明の符号化核酸も、 上記正規直交化配列である こ と が好ま しい。 しカゝ し、 た と えば、 細胞か ら精製 した総 RNA などを直接第 1 の符号化核酸と して使用する こ と もでき る。 すなわち、 予め結びつけた情報を符号化核酸に変換して 演算を行う のではな く 、 得られた核酸 （た と えば、 総 RNA の よ う な、 符号化されていない分解可能な核酸など） 自体を情 報と して、 そのまま符号化核酸と して使用する こ と もでき る。 たと えば、 以下に示した遺伝子発現解析において本発明の方 法を使用する場合な どである。 また、 演算によって得られる 第 2 の符号化核酸にさ らなる演算を適用 して、 符号化してい ない一本鎖核酸を戻 り 値と して直接得る こ と もでき る。 この 核酸は、 raRNA であっても よい し、 タ ンパク 質に結合するァ プタマー核酸であっても よい。 さ らに、 特定の遺伝子 mRNA にハイプリ ダイ ズするアンチセ ンス RNAであってもよい。 た と えば、 以下に示した細胞内分子コ ン ビユ ーティ ングにおい て本発明の方法を使用する場合などである。

このよ う な場合、 入力に使用 した RNA は、 たと えば以下に 示したよ う に、 ー且上記正規直交化配列を有する符号化核酸 に変換してから、 さ らなる反応を行う こ と が好ま しい。

(遺伝子発現解析プロ グラム）

以下に、 上記基本関数の組み合わせによ るプロ グラムの一 例と して、 遺伝子発現解析に応用 した例について記述する。

(遺伝子のコ ー ド化）

DNA マイ ク ロア レイ等による遺伝子解析において、 ハイブ リ ッ ド形成を的確にコ ン ト ロ ールする こ と を 目的と して、 特 定の遺伝子を対応するジップ · コ ー ドまたは内部コ ー ドに置 き換え る 技術力 ^s開発 さ れてい る (Gerry et al. Universal DNA mi croarr ay method for multiplex detection of lo abundance point mutations. J Mol Biol 1999 Sep 17； 292 (2) ： 251-62 _s Nishida et al. Highly specific and quantitative gene expression profiling based on DNA computing. Genome Informatics 2001 (12) 259-260 、 Whar am et al. Specific detection of DNA and RNA targets using a novel sotherma丄 nucleic acid amplification assay based on the formation of a three-way junction structure. Nucleic Acids Res 2001 Ju 1； 29 (11)： E54-4) 本プロ グラムでは、 基本関数 A ( path (a -〉 b) => X ) を使用する （図 7A) 。 ターゲッ ト遺伝子の RNA を特異的に 認識するプライマー ■ ペア配列と して、 配列 a および配列 b を使用する。 これらの配列を演算用核酸の 3'末端に組み込 む。 また、 出力される RNAの配列 X と して、 対応させたいコ ー ド配列をプロモータ の下流に組み込んでプライマーを設計 する。 このよ う なプライマー · ペアを使用する こ と によ り 、 ターゲッ ト遺伝子 RNA を入力する と対応する コー ド配列 RNA に変換される関数を作成する こ とが可能である。 また、 基本 関数 C (Amplify) や基本関数 D (RevAmplify) を使用する こ と によ り 、 ターゲッ ト遺伝子の部分配列の 5'末端または 3' 末端にラベルのための配列を付加する こ と も可能である。

本プロ グラムを使用する こ と によ り 、 遺伝子のコー ド化が 自律的な反応条件で実現される。 たと えば、 DNA マイ ク ロア レイ等によ る遺伝子検出に応用する こ と もでき る。 さ らに、 コー ド配列 RNA を他の関数による演算プロ グラムの入力と し て使用 して、 た と えば遺伝子発現解析プロ グラムを構築する こ と もでき る。

(各遺伝子の経路素子への変換と論理演算によ る遺伝子発 現解析）

こ こでは、 各遺伝子を経路の素子にコー ド化する こ と によ り 遺伝子発現解析を行う方法について説明する。 図 7B に、 遺伝子 A と遺伝子 B とが存在する場合に遺伝子 X を返すプロ グラム例を示す。

本プロ グラムは、 遺伝子 Aおよび B の ' RNA をコー ド配列へ 変換する関数と、 経路を認識して遺伝子 X を返す関数よ り な る。 すなわち、 遺伝子 RNA をコー ド化 し、 該コー ド化配列に よる演算を行な う。 第一に、 基本関数 Aを使用 して、 遺伝子 A が存在する場合にコー ド配列 Code [2， 1]を返すとい う コー ド化関数を考える。 こ こ で、 Code [2， 1]は、 各々 5，末端から 3'末端に向かって コー ド配列 Code [2]、 Code [l]が並んだ配 列を有する。 同様に、 遺伝子 B が存在する場合に Code [3]、 Code [2]を並べた配列を有する Code [3， 2]を返す関数を加え る。 なお、 Code [l]、 [2]および [3]は、 任意の配列であって よい。 しかし、 反応液の条件でミ ス ' プライ ミ ングな どを起 こ しにく く 、 プライ ミ ング効率が均一な配列を有する こ とが 好ま しい。 すなわち、 上述した正規直交化配列である こ とが 好ま しい。

上記関数を組み合わせる こ と によ り 、 遺伝子 Aが存在する 場合にのみ経路素子 Code[l]→Code [2]が形成され、 遺伝子 B が存在する場合にのみ経路素子 Code [2]→ Code [3]が形成さ れる。 したがって、 遺伝子 A と遺伝子 Bの両方が存在 してい る場合に限 り 、 Code [1]よ り 始ま り Code [3]で終結する と い う RNA上の経路が形成される （図 7B) 。 こ こで、 基本関数 B (も しく は基本関数 A) を使用 して、 該経路が存在する場合 に RNA Xを返す関数をさ らに加える。 その結果、 両遺伝子が 存在する場合に限り 遺伝子 Xを返すプロ グラムが実現する。

本方法の本質は、 各遺伝子を、 コー ド配列によって構成さ れた仮想的な経路 （この場合 1→ 2→ 3 なる経路） を構成する 各経路素子 （1→ 2 および 2→ 3) に変換し、 その経路の存在 を検出する こ と によって遺伝子の解析を行 う こ とでめる 経 路の規模や対応付けを行な う遺伝子の種類を増加させれば、 よ り 複雑な演算を行 う こ と ができ る （図 7C) あるいは、 出力される配列 Xの RNA をさ らに別の経路への入力とする こ と によ り 、 経路を多重に重ねる こ と もでき る。

(ニューラル · ネ ッ ト ワーク による遺伝子発現解析） 論理演算によ る遺伝子発現解析では、 あ らかじめ遺伝子の 発現パターンが既知である必要がある。 また、 基本的に遺伝 子の有無のみを解析する ものであ り 、 濃度の情報を評価でき ない。 こ こでは、 未知の遺伝子発現パターンについて遺伝子 の濃度情報をも評価する こ とができ る方法と してヽ 本発明の 情報処理方法を使用 して構築 したニューラル 'ネ ッ ト ワーク の例を示す。

遺伝子の発現解析において、 DNA コ ンビユ ータによって構 成された -ユ ーラル 'ネ ッ ト ワーク を応用するァィデァは以 目 IJにもあった (Mills Gene expression profiling diagnosis through DNA molecular computation. Trends Biotechnol 2002 Apr ; 20 (4) : 137-40)。 し力 し、 従来のアイデアは、 中間 層を持たない一層の単純パーセプ ト 口 ンのモデルであ り 、 複 雑な解析は原理的に困難であった。 さ らに、 複数ステ ップの 操作が必要と した。 一方、 本発明の情報処理方法を使用する こ と によ り 、 複雑な解析を実行し う る多層パーセプ ト ロ ンを 自律的に稼動する反応系にて実現する こ と ができ る （図 8A)。 遺伝子の解析を行な う ために、 まず遺伝子のコー ド化を行 な う 。 コ ー ド化関数に よ り RNA A が存在す る 場合 に 、 Code [a 1, ST]が出力される よ う にする。 これは経路 ST→al に 対応付け られる。 RNA B, C, D についても同様のコー ド化関数 を設定し、 各々経路 ST→ a2, a3, a4 へと置き換える よ う にす る。 これら のコー ド化関数によ り 、 各遺伝子 RNA の存在に応 じてニューラル 'ネ ッ ト ワークへの入力が行なわれる。 パ一 セプ ト ロ ンの中間層を結ぶ経路ユニ ッ ト ： al→bl, al→b2， al→b3， … ， b4→ c4 および cl→ X, cl→Y, c2→ X, ··· , c4 → Y は、 全て基本関数 E : Output () を使用 して、 対応する RNA を出力させる こ と によ り形成する こ と ができ る。 さ らに . 基本関数 B を使用 して、 経路 ST→Xの存在に応じて X を返す 関数（ path ( ST - # X ) X )および経路 ST→Yの存在に応じ て y を返す関数（ Path ( ST -# Y ) y )を導入したプロ グラ ムを構築する。 その結果、 入力 RNA に応 じて出力 X と yの割 合が変化するェユ ーラル ·ネッ ト ワーク が形成される （図 8A) , 入力層、 中間層および出力層の数は、 適宜変更する こ とがで き る。 さ ら に、 各 RNA 経路ユニ ッ ト の強度は、 対応する Output ()関数の濃度を調整する こ と によって制御する こ とが でき る。

図 8B に示す方法を使用する こ と によ り 、 ニューラル ·ネ ッ ト ワーク に対する学習プロセスが実行でき る。 具体的には、 第一に、 入力および中間層を結ぶ経路に係る関数と ST ブラ イマ一と を含む反応液に、 入力 と してサンプル A 群および B 群の RNA を与えて、 ST プライマーの伸長反応を実行させる， 各反応液中では、 与え られた入力 RNAおよび中間層経路の状 況に応じて、 ST よ り 開始し X または Y で終結する各経路が 逆転写されて、 対応する cDNA が合成される （①）。 こ こで、 得られた S Tプライマー伸長産物の末端配列が Xの と き と、 Y の と き に分けて経路の解析を行な う 。 A， B 群における各中 間経路ユニ ッ ト （a l→b l， a l→b 2 , … ）の濃度比較を行な う (②）。 この作業は、 たと えば、 複合する経路を含んだサンプ ルを使用 して、 リ アルタイ ム P C R法や DNAマイ ク ロア レイ法 などによって行な う こ とが想定される。 この結果をも と に、 望ま しい経路が増強される よ う Ou tpu t ( )関数の濃度を調製 する （③）。 たと えば、 A 群を出力 X に、 B 群を出力 y に対応 付けたい場合には、 A群サンプル- X終結経路および B群サン プル- Y 終結経路と、 A 群サンプル- Y 終結経路および B 群サ ンプル -X ： 終結経路と の比較を行ない、 前者に特 的な経路 ュニッ 卜 を増加 して後者に特異的な経路を減少させる。 の サイ クル ①→®→③を繰り 返すこ と によ り 、 学習させる こ と ができる

こ の分子コ ンピュータ の二ユーラノレ 'ネ ッ 卜 ヮ ク に よ る m izs 発現解析技術を利用 して、 新規な遺伝子診断技術を実 現する こ と もでき る （図 8 C)。 た と えば、 上 §己 R応を行 う た めに必要な演算用核酸を含む反応液を準備する。 次いで、 反 応液に 床サンプルよ り得られた RNA を添加して反応を進行 させる 所定の遺伝子が所定の組合せで発現している場合に 所定の出力が得られる よ う にプロ グラムを構築しておけばヽ 遺伝子が どのよ う なパターンおよび発現量で発現しているの か容易に解析する こ とができ る。

( 数の拡張） 本発明に使用する関数は、 上記 5つの関数に限定されない。 種 - 々 の演算用核酸を使用 して 、 多様な関数を定義する とが でき る。

た と えば、 上記基本関数は 全て、 P 1 が逆転写反応を引 き起こ し 、 そこで形成された c DNA に P 2 がハイプリ ダィ ズす る とい う構造と しているが、 P 2 を RNA に対するプラィマ と して機能させる こ と もでき る 。 この と き、 伸長反応に従つ て P 2 の 3 '末端配列が変化している。 この変化は、 3，末端配 列の変化につれて関数の内容が変化している と と らえられる この よ う な変化を利用する こ と によ り 、 関数の概念を拡張す る こ とができ る。 その他にも ハー ドウエアの反応液中で以 下に例示する よ う な化学反応を実現する こ と によ り 、 5 つの 基本関数以外にもプロ グラムに利用可能な関数の定義を拡張 する こ と が可能であろ う。

また、 コ ンピュータ と してプロ グラムの結果を返すために は 、 一 mの関数反応の結果得られた出力を検出する必要があ る -t RL基本関数は、 全て RNA を戻り 値とするため、 基本関 数のみで構成されたプログラムの最終出力も RNA分子と なる。 この出力 RNAは、 分子生物学的手法によ り 精製する こ と が可 能である 。 また R T -P C R やノ ザン . プロ ッ ト、 DNA マィ ク

Πア レイ等な どの技術を使えば出力 RNAを検出する こ と 可 能である 。 しかし、 本発明の分子コ ンピュータの特長は 自 律的コ ンピューティ ングが可能である点であ り 、 結果の検出 までのステ ツプを単一反応液内にて同時に行なえればよ り 効 果的である。 したがって、 コンピューティ ング反応液内で出 力された RNA分子を直接検出する こ とが望ま しい。 た と えば、 RNA 分子 を 直接検 出 の た め に 、 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)技術を応用する こ と 力 Sできる。 FRET 技術は、 蛍光を外部から検出 して情報を取り 出すこ とが可能 であ り 、 非常に有用である。 蛍光標識した DNAプローブを用 いる こ と によ り 、 FRET 技術を リ アルタイ ム PCR 法などにも 応 用 し た 例 力 S あ る (Didenko, DNA probes using iluorescence resonance energy transfer (FRET) : designs and applications. Bio techniques 2001 Nov；31 (5)： 1106-16, 1118， 1120-1)。 たと えば、 図 9A に示す FRET プローブを使 用すれば、 蛍光出力関数と して分子コ ンピュータ の出力に応 用 ^Βί 能 で あ る 。 Adjacent hybridization probes お よ ぴ Molecular beacon probe は、 特定のターゲッ ト配歹【J力 S存在 する場合に蛍光を返す特性を有するため、 そのまま分子コ ン ピュータの出力検出関数と して利用するこ と ができ るであろ う （図 9A-a, b；)。 また、 Hairpin probe は、 DNA 伸長反応に よ り プライ マーが二本鎖化 した際に蛍光を発する こ と か ら (図 9A- c)、 基本関数 A のプライマー PI も しく は基本関数 B のプライマー P2 の代替と してこの構造のプライ マーを使用 する こ と によ り 、 該当する経路が存在する場合にのみ蛍光を 返す関数を構成する こ とが可能である。

これらの蛍光出力関数を用いれば、 出力の検出までを単一 ステ ップで行な う こ とが可能な遺伝子診断プロ グラムな ども 設計する こ とができ る。 たと えば、 図 8C について、 ニュー ラル ·ネ ッ ト ワーク によ る遺伝子発現解析の結果は、 X およ び y の濃度を比較する こ と によ り 行なわれるが、 X および y の各々 を認識する蛍光プローブを異なる蛍光色素を用いて形 成する こ と によ り 出力の検出が可能と なる。 あるいは、 「経 路 ST→ Xが存在すれば X を返す関数」 などの変わり にへアビ ン .プローブを使用 した蛍光出力関数 「経路 _ST→X が存在す れば蛍光を返す関数」 などを構築する こ と も考えられる。 最 終の出力ごと に異なる蛍光を割 り 当てれば、 その蛍光強度を 比較する こ と によって出力の検出が可能と なる。

その他の反応と して、 た と えば Wharam らカ 2001年に発表 した 3- way junction (3WJ)構造を利用 したプライ マーを使 用 しても よい （図 9B)。 これは、 ターゲッ ト配列が存在する 場合に、 指定した配列の RNAを発現する とい う プライマーで ある。 DNA依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性と DNA依存 RNA ポリ メ ラーゼ活性が存在すれば反応が実現する こ と から、 本発明の 情報処理方法に応用する こ と もできる。 特に、 遺伝子のコー ド化反応な どに使用する こ とができ る。

また、 関数の拡張の例と して、 ある関数によ り 出力された RNA を関数によ る演算に使用する こ と もでき る。 たと えば、 各関数によ り 出力される RNA分子自体もプライマーと して機 能する こ とができ るので、 これ自体を関数による演算の演算 用核酸と して機能させる こ と もでき る。

さ らに、 リ ボザィ ムを分子コ ンピュータの素子と して利用 な 开 究 も あ る (Wickiser e t a 1. Oligonucleotide Sensitive Hammerhead Ribozyraes As Logic Gates. Eighth International Meeting on DNA Based Computers, 2002 June 10-13； Hokkaido University, Japan) ₀ ジ ボザィ ム は、 酵素活性を有する RNA分子 と して知 られている。 こ の よ う な リ ポザィ ムを使用すれば、 関数の出力 と して生成された RNA 分子 自体が リ ボザィ ム と して働き、 その出力 RNA が直接新た な関数機能を発揮する こ と ができ る。 本発明の情報処理方法 に使用する関数と して、 こ のよ う な リ ボザィ ムを使用する こ と も でき る。

以上に例示 した基本関数以外の反応を本分子コ ン ピュータ のハー ドウェア中で実行する こ と によ り 、 コ ン ピュータ の機 能が さ ら に拡張されるであろ う 。

上述 したよ う に、 レ ト ロ ウイ ルス がゲノ ム増幅に用いる反 応活性と して重要な RNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性、 DNA 依 存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性、 DNA 依存 RNA ポ リ メ ラーゼ活性お よび RNas eH 活性の 4 種の反応を組み合わせて、 自律的に稼 動するプロ グラ ム可能な分子コ ン ピュータ を実現する こ と カ でき る。

具体的には、 上記情報処理方法によ って演算を行 う ための 分子コ ン ピュータ と して、 所望の関数によ る演算を行 う ため の演算用核酸と 、 適切な反応液と 、 適切な酵素と を含む容器 から なる こ と を特徴とする分子コ ン ピュータ が提供される。 分子コ ン ピュータ上でプロ グラ ムを構成する要素 と なる 関数 と して、 便宜上 5 つの基本関数を定義 したが、 よ り 一般化す る と 、 プロ グラ ム と して分子コ ン ピュータ のハー ドウ ェア中 に加え られる のは 3 種類のオ リ ゴ核酸、 即ち 5，方向に配置 されたプロモータ を含む核酸と 、 3'方向に配置されたプロモ ータ を含む核酸と、 プロモータ配列を含まない核酸である。 これらのオリ ゴ核酸が含まれる反応系に対して RNAによ る入 力を与える と、 オリ ゴ核酸の伸長反応が適宜進行し、 ある点 でプロモータ配列が二本鎖 D NA と なる と その下流の配列が RNA と して返される とい う シス テ ムである と もいえる。

一方、 分子コ ン ピュータ に使用する容器と しては、 た と え ば核酸の反応において通常使用 されるサンプルチューブ、 試 験管、 微細流路を使用する こ とができ る。 また、 使用する容 器は、 単一の容器であればよいが、 複数の容器を使用 しても よい。

また、 容器と して、 細胞または組織などを使用すれば、 生 体細胞内において遺伝子の発現量およびパターンを自律的に 検出 し、 その結果に応じて所望の遺伝子の転写を制御する こ と もでき る。 したがって、 生体細胞内で RNAの出力をコ ン ト ロールする こ と が可能であ り 、 新たな細胞コ ン ト ロール機序 を実現する こ と ができ るであろ う。 た と えば、 特定の発現パ ター ンをもつ細胞のみで特定の遺伝子を発現させる こ とが可 能であ り 、 癌細胞な どターゲッ ト と した細胞のみで細胞を正 常化させるための遺伝子を発現させる にこ と もできる。 こ の よ う な技術は、 遺伝子治療などの技術に応用可能である。

また、 本発明の情報処理方法によ り 情報処理を行う ために、 必要な演算用核酸をキッ ト と して提供する こ と もでき る。 該 キッ ト には、 所望の関数による演算を行う ための演算用核酸 が含まれる。 演算用核酸と しては、 第 1 の一本鎖核酸に対し てプライマーと して作用する配列、 プロモータ配列および任 意の核酸のプライマーと して作用する配列から選択される一 以上の配列を有する核酸が含まれる こ とが好ま しい。

また、 該キッ トには、 演算用核酸だけでな く 、 適切な反応 液と、 適切な酵素とが含まれていても よい。 適切な反応液と しては、 た と えば、 合成反応、 増幅反応、 逆転写反応、 転写 反応および分解反応に適したバッファーであ り 、 適切な酵素 は、 たと えば、 DNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性を有する酵素、 RNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性を有する酵素、 DNA 依存 RNA ポリ メ ラーゼ活性を有する酵素および RNa s e Hである。

上記キッ トは、 たと えば上記 （遺伝子発現プロ グラム） の 節に記載したよ う な遺伝子発現解析のためのキッ トであれば、 コー ド化に必要な演算用核酸、 DNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活 性を有する酵素、 RNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性を有する酵 素、 DNA 依存 RNA ポ リ メ ラ ーゼ活性を有する酵素お よび RNa s e H , 並び に適切 な反応 ί夜 と し て 40mM Tr i s— HC 1 (pH 8. 0 )、 50 mM NaC l、 8 mM M gC lい 5 mM DTT を含む。 上記酵素は、 予め反応液に添加されていても よい。 該キッ トは、 た と えば 50 °Cにて全ての酵素を含むバッフ ァー液に RNAサンプルを添 加し、 よ く 混ぜた後に、 50 °Cでイ ンキュベー ト して使用すれ ばよい。 た と えば、 試験管 1 本あた り 酵素バッフ ァーを 3 μ 1 添加 して反応液の総液量を 25 μ 1 と し、 反応時間は 30 分 である。

また、 プロ グラムの実行に必要な反応はレ ト ロ ウィルスや レ ト ロ ト ラ ンス ポゾ ンが生体細胞内にて実際に行なっている 反応と本質的に同一である こ と から、 本シス テ ムによ る分子 コ ン ピュータが生体細胞内にて実現する可能性もある こ の 細胞内分子 コ ン ビュ 一テ ィ ングが実現する と、 た と えば生体 細胞内での遺伝子発現解析プロ グラム と蛍光出力関数と の組 み合わせによ り 、 生きた細胞内の遺伝子発現パターンを外部 から非破壊的にモニターする技術にも応用でき る。

あるいは、 細胞の活動を ン ト ロールする遺伝子の RNAを 出力する こ と によ り 、 逾伝子パター ンに応じて細胞の活動を コ ン ト ローノレするプ口 グラムを実現する こ と もでき る。 たと えば、 癌な どの疾患マーカ一遺伝子を入力 とする と 、 問 題のある細胞内のみで導入 した特定遺伝子を発現させ

とい

·>- つた遺伝子治療を実現する と もでき る。

(発明の効果）

本発明の情報処理方法を使用する こ と によ り 、 プ グラム

· - 可能な自律型分子コ ン ビユ ータ を作製する こ とがでさ る のよ う なコ ン ピュータは、 同一ハー ドウエアを用いて異なる プロ グラムを実行でき る汎用性を有する。 特に、 今後必要性 がますます拡大する と考え られる遺伝子の機能解析 する 研究開発や遺伝子診断などの用用途途にに応応用用すするる ここ ととがができ る。

論理演算によ る遺伝子発現解析またはニ ュ ー ラ ル ·ネ ッ 卜 ワーク によ る遺伝子発現解析を実行するプロ グラムを蛍光出 力関数と組み合わせる こ と に よ り 、 遺伝子の計測 ·解析ねよ び結果の出力を全て自律的に行な う こ とが可能と なる。 また 上記ニ ュ ー ラ ル 'ネ ッ ト ワーク によ る方法を使用すれば、 遺 伝子の発現パターンと フエノ タイ プと の関係が明 らかでない 場合でも、 原理的に遺伝子発瑰解析が可能である。 さ らに、 遺伝子発現の濃度情報も評価する こ と もでき る。

(実施例）

(材料と方法）

(機器および試薬）

2 本鎖 DNA 分子は、 ゲル電気泳動を行った後、 Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) に よ っ て検出 し た。 ま た、 本方法の実施 に使用 し た試薬は、 DNA 500 LabChip ^{( R)} kits または DNA 7500 LabChip ^{( R)} kits である。 リ アルタ イ ム PCR は、 LightCycler^TM ク イ ッ ク シス テ ム 330 (口 ッシュ ·ダイ ァグノ スティ ッ ク ス株式会社）を使用 して行 な っ た 。 該 PCR の た め の 試薬 は 、 同 社 よ り 購入 し た LightCycler" FastStart DNA Master SYBR ^{( R)} Green I を 使用 した。 試薬の調整および機械の操作方法については、 生 産者のプロ ト コルに準じて行なった。

(遺伝子特異的配列の設計）

TGTP 遺伝子および Vitronectin 遺伝子を特異的に認識す るプライマーは、 三島隆らが開発 した特異的プライマー設計 プロ グラム （大規模遺伝子発現計測のためのプローブ及びプ ライマー配列設計法に関する研究、 東京大学大学院理学系研 究科修士論文 2001 年度）およびプライマー設計ソ フ ト ゥェ ァ と して公開 されている Primer 3 (Rozen and Skaletsky、 Primer 3 on tne WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol 2000 ; 132 : 365— 86)などを使 用 して設計し、 作製したプライマーから適当なものを選んで 使用 した。. 使用 した TGTP 遺伝子および Vitronectin 遺伝子 2

41 に特異的な配列を以下にま と める。 （なお、 カ ツ コ内の数字 は、 TGTP, Vitronectin 両遺伝子 RNA 分子上のプライマーの 位置を表す。 また S はセ ンス鎖配列、 A はア ンチセ ンス鎖配 列である こ と を示す。

TGTP特異的プライマー配列

配列名一 -配列

TGTP-S1 5 CAGATATATATGGTCCCACC -3' (1302,

A) (配列番号 1)

TGTP-S2 5 ACTTACTATCGCATGGCTTA -3' (1201,

S) (配列番号 2)

TGTP-AF 5 CAGGATTTGAACATGTCTGTGGAT -3' (1051,

S) (配列番号 3)

TGTP-AR 5 GCTTGTCTTCTAAGGACTCATCATTG - 3' (1119，

A) (配列番号 4)

TGTP-PS 5 GGGGATGAATTTCTACTTTG - 3' (582,

S) (配列番号 5)

TGTP-PE 5 AGAGTGAACACTGATTGGAA -3' (1364,

A) (配列番号 6)

Vi tronect i _n特異的プライマー配列

配列名 - - 配列

Vitronect i n- PI 5 ' - TTTGTCTCCAGAGAAGAAAT 一 3,

(1313， A) (配列番号 7)

Vitronectin - P2 5 ' 一 GCT AGGAACCTACAACAACT - 3

(1236， S) (配列番号 8)

Vitronectin - PS 5' 一 GTACCCCAAACTTATCCAAG 一 3 (570 2

42

A) (配列番号 9)

Vitronectin - PE 5 ' - GTAGGGAGGATTCACAGAGT -3'

(1367， S) (配列番号 10)

必要に応 じて、 これらの配列の 5'末端にプロモータ配列 およぴコー ド配列な どを追加したも のをプライマ ー DNA と し て使用 した。 なお、 原則と して 30 塩基長未満のプライマ ー DNA の合成は、 プロ リ ゴ ■ ジヤ ノヽ。ン株式会社に E@sy Oligos ( ^R) と して委託合成 した。 それ以上の長さ のプライマ ーは、 HPLC 精製品も しく は PAGE 精製品 と して株式会社サヮディ 一 · テク ノ ロジ一に合成依頼した。

(コー ド配列の設計）

本実施例では、 人為的に作成された 「コー ド配列」 を含む オリ ゴ DNA を使用 した。 こ こで、 コー ド配列と は、 nearest - neighbor 法 に よ る 算 (SantaLucia A unified view o I polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest— neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Feb 17 ;95 (4) : 1460-5)によ り 2本鎖 DNAの融解温度が均一に 揃え られている こ と、 安定した二次構造やミ スハイブリ ッ ド の形成を起こ しにく いよ う に計算されている こ と等の特徴を 有す る よ う に設計 さ れた 同一塩基長 の配列 の組を 指す (Yoshida e t a 1 Solution t o 3 - SAT by breadth first search. DIMA CS Series in Discre te Ma them a tics and Theoretical Computer Science, 2000 54: 9—22， American Mathematical Society)。 こ こ では、 以下に示す 5 つの 25塩 基長の配列を使用 した。 配列名 -- • --配列

Code [1] 一 TGAAGTCACCACAACACACAGTACA 一 3 (配列番 号 11)

Code [2] GACAAACACCCCGAATACAAACAGC

号 12)

Code [3] AGTATCGAAGCGTGTGTCTGAAGAT

号 13)

Code [4] CAAAAGAGTTAGGATGGGAGCTGGA

号 14)

Code [5] 一 TCGATATGGGTGGTACATGAGAGGT

号 15)

Code [6] CTCCGCTCCTCTATTCATTCCCTAG - 3⁵ (配列番 号 16)

(コ ンビ 一ティ ング反応に使用 したプライマー配列） コ ンビュ ティ ング反応には、 遺伝子特異的配列およびコ ー ド配列、 T7 プロモータ配列な どを組み合わせた特殊なォ リ ゴ DNAを使用 した。 それらの名称、 構造および配列を以下 に列挙する。 （ 「構造」 の項目で、 [ ]は遺伝子特異的配列の 配列名、 く >はコー ド配列配列名、 {T7}は T7 プロモータ配列 を表す。 Tg は 6 塩基長の配列 5，-GGGAGA- 3'、 Tc は 9 塩基長 の配列 5'_ATAGGGAGA- 3'のこ とである。 またこれらの頭に、a， が付いている ものは逆相補鎖配列を示す。 S はその他の配列 名称 ： TGTP-P1

構造 ： 5-S-a {T7} -S- [TGTP-S1] -3 '

配 列 5' - CTGAGGTTATCTTGGTCTGGGGAGA TCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA CTGAGGTTATCTTGGTCTGGGG AGA CAGATATATATGGTCCCACC - 3' (配歹 U番号 17)

名称 ： TGTP-T21

構造 ： 5， -a<Code[l] >-Tg-a<Code [2] >-a {T7} - [TGTP-S1] -3' 配 列 ： 5 ' - TGTACTGTGTGTTGTGGTGACTTCA TCTCCC GCTGTTTGTATTCGGGGTGTTTGTC TCTCCCTATAGTG AGTCGTATTA CAGATATATATGGTCCCACC -3' (配列番号 18)

名称 ： Vitronectin - T32

構造 ： 5， - aく Code [2] >-Tg-aく Code [3]〉 - a {T7} - [Vitronectin- PI] - 3，

配 列 ： 5' - GCTGTTTGTATTCGGGGTGTTTGTC TCTCCC ATCTTCAGACACACGCTTCGATACT TCTCCCTATAGTG AGTCGTATTA TTTGTCTCCAGAGAAGAAAT -3' (配歹 U番号 19)

名称 ： aT21

構造 ： 5' _Tc - <Code [2] > - aTg -く Code [1]〉- 3，

配列 ： 5 ' - ATAGGGAGA GACAAACACCCCGAATACAAACAGC GGGAGA TGAAGTCACCACAACACACAGTACA -3' (配歹 (J番号 20)

コ メ ン ト ： TGTP- T21 プラ イ マーの 5，末端側 と相補的な配列。 名称 ： aT32

構造 ： 5' _Tc -く Code [3]〉 - aTg -く Code [2] >- 3'

配歹【】 ： 5⁵ - ATAGGGAGA AGTATCGAAGCGTGTGTCTGAAGAT GGGAGA GACAAACACCCCGAATACAAACAGC - 3 ' (配歹 U番号 21 )

コ メ ン ト ： Vitronectin— T 32 プラ イマーの 5'末端供 j とネ目補白勺 な配列。

名称 ： TGTP-PT 構造 ： 5， - " GATGCA" - {T7} - [TGTP - PS] - 3，

配 列 ： 5 ' -GATGCA TAATACGACTCACTATAGGGAGA GGGGATGAATTTCTACTTTG-3' (配歹 U番号 22)

コ メ ン ト ： TGTP 遺伝子をィ ンビ ト 口 合成する 際に使用 した プライ マー。 3'末端の 20 塩基は合成 した TGTP の RNA分子の 5，末端と 同一の配列である。

名称 ： Vitronectin- PT

構造 ： 5， - " GATGCA" - {T7} - [ V i tron e c t i n - PS ] - 3，

配 列 ： 5' - GATGCA TAATACGACTCACTATAGGGAGA

GTACCCCAAACTTATCCAAG -3' (配列番号 23)

コ メ ン ト ： Vitronectin 遺伝子をイ ン ビ ト 口合成する際に使 用 し た プ ラ イ マ ー 。 3' 末 端 の 20 塩 基 は 合 成 し た Vitronectin の RNA分子の 5，末端と 同一の配列である。

名称 ： 20/aCode [1]

配列 ： 5， - TGTACTGTGTGTTGTGGTGA - 3' (配歹 U番号 24) コ メ ン ト ： Code [1] 配列の 5'末端側 20 塩基配列で、 コ ンビ ユ ーティ ング反応液中での Ttn値が 48°C程度 と なっている。 名称 ： aC3-T45

構 造 ： 5， - a<Code [5] >-aTg-a<Code [ 4] > -a { T7 } -T g- <Code [3] > - 3'

配 歹 IJ ： 5 ' - ACCTCTCATGTACCACCCATATCGA TCTCCC TCCAGCTCCCATCCTAACTCTTTTG TCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA GGGAGA AGTATCGAAGCGTGTGTCTGAAGAT -3 ' (配列番号 25) 名称 ： aT45

構造 ： 5， - Tc -く Code [4」〉 - aTg - <Code [5J〉-3 配歹 [J ： 5 ' - ATAGGGAGA CAAAAGAGTTAGGATGGGAGCTGGA GGGAGA TCGATATGGGTGGTACATGAGAGGT -3' (配列番号 26)

コ メ ン ト ： aC3- T45 の 5'末端側と相補的な配列。

名称 ： aC3-T465

構造 ： 5' - a<Code [5] >- aTg-a<Code [6] >-aTg-a<Code [4] >- a {T7} - Tg -く Code [3] >- 3，

配 歹 IJ ： 5 ' - ACCTCTCATGTACCACCCATATCGA TCTCCC CTAGGGAATGAATAGAGGAGCGGAG TCTCCC TCCAGCTCCCATCCTAACTCTTTTG TCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA GGGAGA AGTATCGAAGCGTGTGTCTGAAGAT -3' (配歹 [J番号 27) 名称 ： aT465

構 造 ： 5' - Tc -く Code [4] > - aTg - <Code [6]〉 - aTg -く Code [5]〉 - 3，

配列 ： 5' - ATAGGGAGA CAAAAGAGTTAGGATGGGAGCTGGA GGGAGA CTCCGCTCCTCTATTCATTCCCTAG GGGAGA TCGATATGGGTGGTACATGAGAGGT - 3' (配歹 !j番号 28)

コ メ ン ト ： aC3- T465 の 5 '末端側と相補的な配列。

( RNAサンプルの調整）

コ ン ビ ユ ーテ ィ ング反応に使用 した TGTP 遺伝子および Vitronectin 遺伝子の RNA 分子、 並びに Code [2， l]および Code [3, 2] RNA 分子は、 イ ンビ ト ロ転写法によって調整した

TGTP 遺伝子および Vitronectin 遺伝子は、 以下の手順で 調製した。 BALB/c マウスに、 C57/BL10 マウス由来脾臓細胞 を移植する こ と によ り 移植片対宿主反応（GVHR)を誘発する。 C57/BL10 マ ウス 由来脾臓細胞は、 東京大学医学部の徳永勝 士教授ら よ り 譲り 受けた。 次いで、 移植後 2 日 目 の肝臓から total RNA を精製する。 なお、 このサンプルと 同等のものが TGTP 遺伝子および Vitronectin 遺伝子の RNA を含むこ と は 半定量リ アルタイ ム PCR 法によ り 確認されている （Wakui et al. 2001)。 次いで、 Total RNA をテ ンプ レー ト と して逆転 写反応を行い、 TGTP 遺伝子お よび Vitronectin 遺伝子の cDNA を作成した。 逆転写反応のプライマーと して、 TGTP 遺 伝子 に つ レヽ て ¾ TGTP-PE を 、 Vitronectin 遺伝子 で fま Vitronectin-PE を使用 した。 逆転写反応の反応液は、 50mM Tris-HCl (pH 8.3) 、 4mM DDT、 lOmM MgClい lOOraM KC1、 0.5mM dNTPs、 800nM の各プ ラ イ マーおよび 0.3 Units/ μ 1 の AMV Reverse Transcriptase XL (タカラバイオ株式会社） を使用 し、 これに total RNAを力 Bえて反応を行った。 なお、 反応は、 ホ ッ ト ' ス ター ト法で行なった。 具体的には、 酵素 を除く 反応液 9.5 μ 1 を 65°Cで 5 分間イ ンキ ュベー ト した後、 50°Cにて酵素を含む 3 μ 1 の溶液を加えた。 酵素を添加後、 50 °C で 60 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 に 0.5 μ 1 の Ribonuclease H (2U/1; I n v i tro gen)を添カロ し、 37°Cで 20分 間反応した。 次いで、 得られた cDNA をテ ンプ レー ト と して PCR反応を個別に行なった。 TGTP については TGTP- PEおよび TGTP-PT を、 Vitronectin 【こつレヽて fま Vitronectin-PEおよび Vnct-PT を各々 プライマー ■ ペア と して添加 して反応を行つ た。 ここで、 TGTP-PT および Vitronectin— PT プライマーは、 遺伝子特異的配列の TGTP - PS およぴ Vitronectin- PS の 5'末 端に、 それぞれ 6 塩基長のク ラ ンプ配列（5'- GATGCA- 3' (配 列番号 26) )および 23 塩基長の T7 プロ モータ配列 （5'- TAATACGACTCACTATAGGGAG A-3' (配列番号 27) )を付力 [I した オリ ゴ DNA である。 PCR 反応には TaKaRa Ex Taq" (タカ ラ バイ オ株式会社）を使用 した。 操作は、 添付のプロ ト コ ル (Cool Start法）に準じて行なった。 簡単には、 25 μ 1 の反応 バ ッ フ ァ一中に 0. 8 /z lM の各プライマー DNA と、 0. 2mM の各 dNTP、 40 U/ml の酵素と、 1 _μ 1 の cDNA サンプルと を力 Bえて 調整した溶液を、 94°C _30 秒、 60°C _90 秒、 72°C - 60 秒を 31 サイ クル繰り 返した後、 さ らに 72°Cで 10 分間反応させた。 なお、 この反応によ り 、 TGTP については 831 塩基の 2 本鎖 DNA 力 S得ら；^、 Vitronectin につレヽては 846 塩基の 2 本鎖 DNA が得られる もの と期待されるが、 実際に得られた PCR 産 物を電気泳動によ り 検出 したと ころ、 期待される塩基長のシ グナルが各 々 シ ン グル ■ バ ン ドで碓認、 さ れた （data not shown)。

上記 PCR 反応によ り 得られた T7 プロモータ配列を含有す る TGTP、 Vitronectin両遺伝子の 2本鎖 DNAを使用 したィ ン ビ ト 口転写を各々行ない、 両遺伝子の RNA分子を作成した。 反応は各遺伝子について 100 1 の反応液を 4 つの試験管に 分けて行なレヽ、 各々 につレヽて、 40mM Tris-HCl (pH8. 0) _s 8mM MgCl₂、 2mM Spermidine- (HC1) ₃ 25mM NaCl、 5mM DDT、 0. 4mM NTPs よ り な る 反 応 バ ッ フ ァ ー に 500U/ml T7 RNA Polymerase (Invitrogen)および 1 μ 1 の 2本鎖 DNAテ ンプレ ー ト を加えた。 37°Cで 1 時間イ ンキュベー ト した後に 1U/ μ 1 の Deoxyribonuclease I ^ Amp lirication wade ; Invitrogen)を 2.5 μ 1 添力 tlし、 さ らに 37°Cで 15 分間イ ンキ ュペー ト した。 得られた反応物はエタ ノ ール沈殿法によ り 精 製した。 なおエタ ノ ール沈殿の際には Pellet Paint (^R) Co- Precipitant (Novagen)を用い、 製品に添付の使用説明に添 つて実験操作を行なった。 得られた沈殿物は DEPC 処理水に 溶解したものを _20°Cで保存して使用 した。

Code[2， l]および Code [3, 2] RNA 分子は、 合成委託したォ リ ゴ DNA の TGTP-T21 およぴ Vitronect in-T32 を用いてィ ン ビ ト ロ合成 した。 各々 について、 オリ ゴ DNA の 3 '末端に相 補的な 20 塩基長のプライマー と を PCR 反応液に混入し、 94°Cで 5 分イ ンキュベー ト した後に 80°Cにて酵素を含むバ ッフ ァーを投与、 その後 60°Cで 5 分、 72°Cで 60 分間ィ ンキ ュペー ト した。 こ こで得られた T7 プロモータ配列を含む二 本鎖 DNAを使用 したイ ンビ ト ロ転写反応によ り コー ド RNA を 生成した。 なお、 転写反応、 Deoxyribonuclease I 処理およ び エ タ ノ ー ル 沈 殿 法 の 方 法 は 、 TGTP 遺 伝 子 お よ び Vitronectin遺伝子の場合と 同様である。

(コンピューティ ング反応）

DNA プライマーによ る各種関数反応を実現する コ ンビユ ー ティ ング反応は、 単一バッファー内に RNA依存 DNAポリ メ ラ ーゼ活性を有する酵素、 DNA 依存 DNA'ポリ メ ラーゼ活性を有 する酵素および DNA依存 RNAポリ メ ラーゼ活性を有する酵素 を共存させ、 同時に活性を持たせる こ と によ り 実現される も のである。 反応液の組成は 40mM Tris-HCl (pH 8.0)、 50mM NaCl、 8mM MgClい 5mM DTT および 0.3 U/ μ 1 AMV Reverse Transcriptase XL (タカラノ ィォ株式会社）、 0.04 ]/ μ 1 Ex Taq™ (タ カ ラバイ オ株式会社）、 3.2 U/ μ 1 Thermo T7 RNA Polymerase (T0Y0B0)よ り 成る。 こ の反応液に適宜、 DNA プ ライマーおよび RNAテンプレー ト を添加する。 なお、 特に断 り がない限り 、 DNA プライマーは各々最終濃度 1 nM で添加し ている。 本反応はホッ ト ' スター ト法で行ない、 酵素を除い た反応液を 65°Cで 5 分間イ ンキュベー ト した。 続いて 50°C にて全ての酵素を含むバッ フ ァ ー液を添加し、 よ く 混ぜた後 に、 50°Cでイ ンキュベー ト した。 なお特に断り がない限り 、 試験管 1 本あた り 添加 した酵素バッフ ァ一は 3 μ 1 であ り 、 反応液の総液量を 25 μ 1 と し、 反応時間は 30 分である。 反 応後速やかに、 転写酵素等の活性を失わせる 目的で、 85°Cで 10分間ィ ンキュベー ト した。

(コ ンビユ ーティ ン反応後の RNA産物の検出）

コ ンピューティ ング反応後の RNA 生成物は、 DNA を酵素で 分解した後に逆転写 -PCR を行な う こ と で検出 した。

DNA の酵素分解に先立ち、 DNA に結合する こ と で酵素分解 を妨げる と考え られる Taqポリ メ ラーゼな どの酵素類を除去 する 目的でカラムによる精製を行なった。 コ ンビユ ーティ ン グ反応液に DEPC 処理水を加えて液量を 50 μΐ と したサンプ ル を 、 分 画 分子 量 100, 000 の カ ラ ム MICR0C0N ΥΜ - 100 (Millipore)にのせて、 4°C , 12000rcf で 10 分間遠心した。 カ ラ ム を通過 した溶液を回収 し、 さ ら に、 MICR0C0N YM-10 (Millipore, 分画分子量 10, 000)にのせて 4°C , 12000RCF で 50 分間遠心 した後、 カ ラムを新しい試験管に逆さ に乗せて 4°C , 12000RCF で 10 分間遠心 し、 カ ラムの上部に残った濃 縮液を回収 した。

DNA の分解 は、 20mM Tris-HCl (pH 8.4) 、 2mM MgClい 50mM KC1 お よ び 0. 1U/ μ 1 D eoxy r ib onu c 1 ea s e I (Amplification Grade； Invitrogen)に上で回収さ れたサン プルを各々 1 // 1 添加 した 10 μ 1 の反応液中で、 室温で 15 分 間反応させる こ と によ り行なった。 反応後、 25mM の EDTA を 1 μ 1力 [Iえた後に 65°Cで 10分間イ ンキュベー ト した。

逆転写反応は 50mM Tris-HCl (pH 8.3) 、 4mM DDT、 lOraM MgClい lOOmM KC1、 0.5mM dNTPs お よび 0.3 Units/ μ 1 の AMV Reverse Transcriptase XL (タカ ラ ノ ィ ォ株式会社） よ り なる溶液に、 最終濃度 600nM のプライマー DNA と上で得ら れた DNase I 反応物を 1 t 1 加えた、 試験管 1本あた り 12.5 μ 1 の反応液中で行なった。 なお反応はホッ ト ' ス ター ト法 で行ない、 酵素を除いた組成物よ り なる溶液を 65°Cで 5 分 間イ ンキ ュベー ト した後に、 バ ッ フ ァーに酵素を加えた溶液 を加えた 3 Z 1 の溶液を 50°Cにて添加した。 その後 50°Cで 1 時間反応させたのち、 94°Cで 10分間ィ ンキ ュベー ト した。

得られた cDNA はリ アルタイ ム PCR 法によ り 定量分析した。 生産者のプロ ト コルに添って調整した 20 / 1 の反応液に逆転 写反応産物を Ι μ ΐ加えて、 94°Cで 10分間イ ンキュベー ト し た後に PCR 反応を実行した。 PCR 反応は、 コー ド配列および 300 塩基長未満の遺伝子配列を増幅する際には 94°C- 3 秒， 60°C -10 秒， 72°C -5 秒のサイ クルを 40 回操り 返すものと し、 300 塩基長以上の遺伝子配列については 94°C- 25 秒， 60°C- 10 秒， 72°C -25 秒のサイ クルを 40 回繰り 返すものと した。 なお、 濃度の定量解析の際には、 最終濃度が 0. 1ηΜ、 0.03nM、 0. OlnM と なる よ う に調整した一本鎖 DNA を同時に反応させ、 PCR 增幅曲線を機械に付属のソ フ ト ウ アを用いて比較する こ と によ り 行なった。 また、 PCR 増幅産物をゲル電気泳動に て検出する際には、 PCR 反応を適当な時点で停止 し、 その増 幅 途 中 の 産 物 を Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて検出、 解析した。

(コ ンビユ ーティ ン反応の中間 DNA産物の検出）

コ ンビユ ーティ ング反応の進行を確認するため、' 反応液中 にて生成される一本鎖および二本鎖 DNA よ り なる中間産物の 検出を行なった。

逆転写反応によ り 生成される一本鎖も しく は二本鎖 DNAの 検出の際には、 サンプルを精製後に PCR反応で増幅する こ と によ り 行なった。 コ ンビユ ーティ ング反応液に DEPC 処理水 を力 Π えて液量 を 50 1 と した サ ン プルを、 分画分子量 100, 000 のカ ラ ム MICR0C0N YM-100 (Mi 11 ipore)にのせて、 4°C， 12000rcf で 10 分間遠心 した。 カラムを通過 した溶液 を回収 し、 さ ら に、 MICR0C0N YM-100 (Millipore, 分画分 子量 10， 000)にのせて 4°C, 12000RCF で 50 分間遠心 した後、 カラムを新しい試験管に逆さに乗せて 4°C, 12000RCF で 10 分間遠心 し、 カ ラ ムの上部に残った濃縮液を回収した。 こ こ で得られた液に対 して、 適当なプライ マーおよび Ex Taq^(R) (タカ ラバイオ株式会社）をバッフ ァ一に添加 した反応液中で PCR 反応を行ない、 一本鎖 DNA の増幅を行なった。 増幅は cool start 法で行ない、 94°C - 30 秒， 60°C -60 秒， 72。C - 60 秒のサイ クル 31 回の後に、 さ らに 72°Cで 10 分間イ ンキュ ベー ト した。 得られた増幅産物はゲル電気泳動によ り 検出 し た。

DNA 二本鎖反応によ り形成される二本鎖 DNA の検出の際に ま、 Agilent 2100 b ioanalyzer (Agilent Technologies)【こ よるゲル電気泳 ftを行なつた。 一本鎖 DNA の塩基； ¾および濃 度の計測は、 装置のプ口 卜 3ノレに準じて行なった。

(ハー ドゥエァの開発 )

レ 卜 ロ ウィルスのゲノ ム増幅システムにおける反応を模し た分子コ ンピュ一タ を実際に試験管内にて実現するために、 第一に分子コ ンピュ一タの実現に必要と なる化学反応を全て 実現する反応液の条件検討を行なつた。 この反応液は 、 分子 コ ンビュータを構成するハ一ドゥユア と なる重要なものであ る。

こ こで用いるノ、一ドウエ アは、 DNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ 活性、 RNA依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性および DNA依存 RNA ポ リ メ ラーゼ活性と、 さ らに RNaseH 活性と が、 一定温度に保 たれた単一試験管内にて同時に実現する必要がある。 同様な 反 応 液 は 核 酸 増 幅 技 術 で あ る 3SR (Guatelli et al. Isothermal, in vitro amplification o i nuc丄 eic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc Natl Acad Sci U S A 1990 0ct ;87 (19) : 7797)において実現されていたので、 この反応条 件に沿って実験を行なった。 しかしなが ら 3SRやこれに類似 する技術での反応条件は 37°Cから 42°Cとい う 、 PCR 反応に おけるァニーリ ング温度な どと比較する と低い温度設定と な つてお り 、 実際にこの条件で実験した と ころ、 逆転写反応お よび DNA 二本鎖化反応に用いるプライマー DNA の特異性を確 保する こ と が困難であ り 、 特にターゲッ トが存在しないプラ イマ一がダイマーを形成しやすいほか、 非特異的な反応が期 待 さ れる反応を抑制する こ と が明 ら か と な っ た （data not s no wn)。

本分子コ ンピュータではプライマー DNA によ り プロ グラム を入力するため、 このよ う な性質はハー ドウェア と しては不 適当である こ とから、 プライ ミ ングの特異性を上げるために 反応温度を高く 設定する こ と を考えた。 3SR では酵素と して AMV 逆転写酵素、 T7 RNA ポリ メ ラーゼおよび RNaseH 用いる が、 T7 RNA ポリ メ ラーゼと RNaseH は反応温度を高く 設定す る と活性を失う。 そのため、 高い反応温度条件下で DNA依存 RNA ポ リ メ ラ ーゼ活性 を示す酵素 と して Thermo T7 RNA Polymerase (TT7； T0Y0B0)を、 また RNaseH 活性を示す酵素 と して Thermus therraoph i 1 u s RibonucleaseH ( Tth RNaseH; T0Y0B0)を用いて検討を行なった。 酵素が活性を持つ と確認 されている反応温度は、 AMV 逆転写酵素が 65°C以下、 TT7 は 50°C以下、 RNase Hは 90°C以下であった。 いずれも低温 度では 37°C程度まで活性が確認されてお り 、 こ こではよ り 高温での反応条件が望まれたこ と か ら、 反応条件の検討は 50°C以上にて行なった。 50°Cか ら 62°Cの各反応温度において、 耐熱性酵素を使用 した反応条件下で各反応活性のア ツセィ を行なった と こ ろ、 RNA依存 DNA ポ リ メ ラー活性は 50°C〜 58°Cではほぼ一定 して いる が （図 10)、 DNA 依存 RNA ポ リ メ ラ一活性は 50°Cよ り 温 度が上が る に従って急激に活性が低下する こ と が明 らかと な り （図 11)、 反応温度を 50°C以上に設定する のは困難である と考え られた。 さ ら に DNA依存 DNAポ リ メ ラーゼ活性も温度 に応 じて低下するが、 これは Taq DNA ポ リ メ ラーゼを添加す る こ と に よ り 改善さ れる こ と が実験的に示 された （図 12)。 と こ ろで、 AMV 逆転写酵素は、 一本鎖の RNA 鎖あるいは DNA 鎖を铸型 と した DNA ポリ メ ラーゼ活性をもつほか、 DNA- RNA ハイ プ リ ッ ドカ ら RNA鎖を除去する RNas e H活性も有する こ と カ 失卩 られてお り （Baltimore et al. 1972, Charapoux et al 1984, Verma 1977)、 さ ら に Taq DNA ポ リ メ ラーゼはェキソ ヌ ク レァ一ゼ活性を持つこ と が知 られている。 これら の酵素 を用いる際には RNaseH は特に無 く て も反応が進行する こ と が、 実験的にも明 らかと なつた (.data not shown;

以上の検討結果を も と に、 ノヽ 一 ドウ エア と しては AMV逆転 写酵素わ よぴ TT7 RNA ポリ メ ラ一ゼ、 Taq DNA ポ Vメ ラーゼ によ り 構成される反応液を用い 、 50°Cの一定温度に保たれた 反応条件においてコ ンビ >·

ユ ーテ ィ ング反応を行な Ό もの と し た。

(プラ イ マー伸長反応の特異性評価）

コ ンピューテ ィ ング反応では、 RNA および DNA を鑤型 と し たプライ マー伸長反応によ ってデータ の入力や演算な どを行 な う。 そのためプライ ミ ングの特異性が確保されている こ と は非常に重要である。 こ こでは、 移植片対宿主反応 （GVHR) が引き起こ される際に遺伝子発現が上昇する こ と が知 られて い る TGTP/Mg21 遺伝子 （以下、 TGTP 遺伝子 と表記）お よび Vitronectin 遺伝子について、 イ ンビ ト ロ合成した両遺伝子 断片をターゲッ ト と して、 特異的に設計されたプライマーの 逆転写反応におけるプライマー伸長反応の活性おょぴ特異性 を評価する実験を行なった。

TGTP-P1 は、 TGTP 遺伝子を特異的な配歹 IJ TGTP-P1 を 3'末 端に持のプライマーである。 このプライマーの伸長活性およ び特異性を評価するために、 このプライマーと TGTP 遺伝子 と を混和 して 15， 30 および 45 分間のコンビユーティ ング反 応を実行し、 さ らにそこで形成されたプライマー伸長産物を PCR反応で増幅（図 13_ (a) )した際の反応生成物をゲル電気泳 動で確認したと ころ、 期待される 842bp の位置にバン ドが確 認された（図 14, レーン 1〜3)。 同様な実験を、 TGTP 遺伝子 の変わり に Vitronectin 遺伝子を用いて行なった と ころ （図 13- (b) )、 ノ ン ドは確認されなかった。 なお、 PCR 反応によ る増幅の際には、 伸長させたプライマーと、 铸型と して加え た両 RNA 分子の 5'末端を含むプライ マー （TGTP-PT および Vitronectin— PT)と をプライマー · ペア と してカロ免た（A)。 こ の た め、 ミ ス · プラ イ ミ ングに よ り 伸長 して精製 さ れた cDNA も この方法で検出 される と考え られる。 この結果から、 プ ラ イ マ ー TGTP-P1 は、 少 な く と も TGTP 遺伝子お よ び Vitronectin遺伝子の中においては、 TGTP遺伝子上のターゲ ッ ト部位に特異的に結合して伸長反応を引き起こすこ とが確 認された。

同等な実験を Vitronectin遺伝子 RNAに特異的なプライマ 一 で あ る Vitronectin -PI を用 い て行 な っ た と こ ろ 、 Vitroenctin 遺伝子が存在す る 場合に の み、 期待 さ れ る 792bp にピーク が認め られた（レーン 7〜 12)。 これよ り 、 こ のプライマーもターゲッ ト部位と のみ特異的にプライ ミ ング を起こすこ とが確認される。 ただし一部にス メ ァ状のシグナ ルも確認される こ と から、 若干非特異的な反応も起きている もの と考えられる。

以上の結果よ り 、 TGTP-P1 および Vitronectin-Pl プライ マーは、 本ハー ドウェア中で特異的プライマーと して利用で き る こ と が確認された。 また、 同等な実験を 37°Cの反応条 件で行なった際には、 プライ マー 'ダイ マーと考え られるパ ン ドゃ非特異的な ス メ ァが強 く 検出 さ れていた こ と か ら (data not shown) , こ こで開発 した 50°Cの反応条件がよ り 適当である こ とが改めて示された。

(コー ド化関数の実行）

コー ド化関数と は、 特定の RNA分子が存在する場合に対応 する コ ー ド RNA を生成する ものである。 遺伝子発現解析プロ グラムを実現する際に、 まず重要となるのがこの コ ー ド化関 数の実行である。 こ こでは TGTP 遺伝子おょぴ Vitronectin 遺伝子 RNA に対する コー ド化関数を設計し、 それを使用 した 実験を行なった。

TGTP コ ー ド化関数の構造を図 2- 5A に示す。 これは基本関 数 A (図 6A 参照）を元 と して、 引数と して TGTP 遺伝子上の 配列の aTGTP-Sl (TGTP - SI の相補鎖配歹 lj )お よび TGTP - S2 を、 戻 り 値 と して Code [2, 1]配列を設定 した も の と な っ てい る ( Path ( aTGTP-Sl 〉 TGTP-S2) => Code [2, 1] ；)。 すなわち、 第 1 鎖 cDNA 合成に関わる プライ マー（PI)は配列 TGTP- S1 の ほか T7 プロ モータ配列お よびコ ー ド配列を含み、 第 2 鎖 cDNA 合成に関与するプライ マー（P2)は配列 TGTP- S2 よ り な る。 TGTP 遺伝子 RNA が存在する と P 1 が逆転写反応を起こ し、 さ ら に S2 によ る第 2 鎖合成反応が起き て T7 プロモータ配列 力 S二本鎖 DNA と なる こ と に よ り Code [2, 1 ]酉己歹 lj RNA (Code [2] と Code [ 1]配列 と が Tg 配列を挟んで並んだも の） が転写さ れる も の と期待さ れる。 なお、 T7 転写酵素の転写開始点は プロモータ配列中にあ り 、 出力 される コー ド RNA の 5 '末端 には Tg 配列 （5'_GGGAGA- 3，）が常に付加 される と 考え られる。 また、 P 1 の 5 '末端の配列が一本鎮 DNA の状態だと 、 出力 さ れた コー ド RNA が未反応の P1 と結合 して DNA-RNA ハィ ブリ ッ ドを形成 し RNas eH 活性によ り 分解されて しま う 可能性が 考え られ、 また実際に P1 を一本鎖のままで反応させる と 出 力 RNA カ 検出 さ れな力 つ た こ と 力 ら （data not shown)、 PI の 5，末端配列（コー ド配列の相補鎖部分お ょぴプロ モータ配 列の一部）に相捕的なオ リ ゴ DNA をあ らか じめハイ プリ ダィ ズさせて二本鎖 DNA と してお く と が効果的である と 考え ら れた。

こ こで示 した TGTP 遺伝子コ ー ド化関数を実行するため、 P1 と して TGTP— T21 および aT21 オ リ ゴ DNA のハイ プ リ ッ ド を、 P2 と して TGTP- S2 を用いてコ ンビユーティ ング反応液 中で実行し、 出力されたコー ド配列 Code [2， 1]の RNA を定量 する実験を行なった（図 16)。 コー ド配列 RNA は、 コ ンビュ 一ティ ング反応産物を DNasel 処理した後に逆転写反応、 リ アルタイ ム PCR 反応する こ とで検出 した。 TGTP を投与した 場合（白丸）にはコー ド配列 RNA の増加が確認されるのに対し、 TGTP が存在 しない場合（斜線丸）では時間を追っても変化が 見られなかった。 なお、 検出反応での DNasel 処理が不十分 だと P 1 上のコー ド配列が検出されて しま う 可能性も考えら れたため逆転写反応時に酵素を添加しない実験も行なったが (白四角および黒四角）、 その場合はほとんどコー ド配列は検 出されず、 バック グラ ウン ドは十分に低いといえる。 以上よ り 、 TGTP 遺伝子コ ー ド化関数が本コ ンビュ ティ ング反応 液中で確かに活性を有する こ とが確認された。 なお、 コー ド 配列 RNA は反応時間 40 分程度をピーク と してその後は徐々 に減少 しているが、 その理由 と しては時間の経過に伴って RNA 合成反応活性が低下し、 RNA 分解反応がこれを上回って しま う こ とが考えられる。 こ こで入力 した TGTP 遺伝子 RNA の濃度は 0. 17nM であ り 、 またこの定量結果をも と にコ ンビ ユーティ ング反応液中のコー ド配列 RNA産物濃度を計算する と、 反応時間 36分産物で 1. 58nM となった。 同等な実験を複 数回行なったと ころ (data not shown)、 30 分力、ら 60 分のコ ンピューティ ング反応で、 コー ド配列 RNA の出力は TGTP 遺 伝子の一倍から数十倍程度得られた。

さ らにコ一ド化関数の反応特異性を評価する実験を行なつ た。 TGTP 遺伝子コー ド化関数に対して、 TGTP 遺伝子 RNA、 Vitronectin 遺伝子 RNA およびネガテ ィ ブ ·コ ン ト ローノレと して同量の水（N. C. )を加えて 30 分間コ ンピューティ ング反 応を実行し、 その産物と して得られたコ ー ド配列 RNAの濃度 を測定した（図 17C)。 この結果と しては TGTP 遺伝子サンプ ルが与えられた時のみコー ド配列の出力が得られる こ と が期 待されるが、 こ こでは Vitronectin遺伝子を投与した場合で も コー ド配列のシグナルが認め られた。 また、 同様な実験を Vitronectin 遺伝子コー ド化関数についても行なったと ころ、 こち らでも特異性は認め られなかった（図 17D；)。

(複数 RNA分子にまたがる経路の逆転写反応と演算反応） 本分子コ ンピュータ上で論理演算や -ユ ーラル .ネ ッ ト ヮ ーク によ る遺伝子発現解析プロ グラムなどを実行する際には、 複数の RNA分子で構成される経路を逆転写する反応が必須と なる。 複数の RNAで構成される経路の逆転写反応と は、 プラ イマ一が第 i の RNA分子にプライ ミ ングして逆転写反応を起 こ し、 そこで形成された cDNA の 3，末端がさ ら に第 2 の RNA 分子にプライ ミ ングする、 とい う プロセスであ り 、 この実行 には RNaseH 活性によ る第 1 の RNA 分子の除去が重要と なる。

こ こ で は 、 図 18 に示す よ う に イ ン ビ ト ロ 合成 し た Code[2, l]および Code [3, 2] RNA 分子、 および Code[l]配歹 IJ と相補的な 20/aCode[l]プライマーを用いる こ とで、 2 つの RNA 分子にまた力 Sる Code [1]→ Code [2] →Code[3]なる RNA 上の経路を逆転写する反応の評価を行なった。 コ ンビユ ーテ ィ ング反応液に 20/aCode [1]プライマーと RNA サンプルを投 与して 0分、 15分および 30分間反応させ、 形成された cDNA 産物を PCR 増幅 してゲル電気泳動にて確認 した と こ ろ、 Code [2, 1]および Code [3, 2] RNA分子を投与して 15分以上反 応させた場合に、 期待される cDNA の形成が確認された （図 19)。

複数の RNA分子上をたどる逆転写反応が実現する こ と が碓 認されたこ とから、 この経路を引数とする関数と して基本関 数 B よ り 「Path ( Code [1] -# Code [3] ) => Code[4，5]」 な る関数を構築 した （図 20)。 この関数は、 TGTP 遺伝子を引 数と して Code [2, 1]を返す関数、 および Vitronectin 遺伝子 を引数と して Code [3， 2]を返す関数と組み合わせる こ と によ り 、 TGTP 遺伝子と Vitronectin 遺伝子が共に存在する場合 に の み Code [4, 5] を 返 す 、 「 TGTP Λ Vitronectin → code [4， 5]」 なる論理演算プロ グラ ムが実現する こ と が期待 された（図 7 参照）。 こ こでは図 19 の実験で使用 した RNA サ ンプルを用いて、 Code[2， l]および Code [3, 2] RNA 分子が共 に存在する場合にのみ Code[l]で開始し Code [3]で終結する 経路が実現されて Code [4, 5] RNA分子を返す反応を評価する 実験を行な っ た。 関数には、 P 1 に図 19 の実験 と 同様に 20/aCode [1]を、 P2 には aC3— T45 と aT45 と をノ、イブリ タ、、ィ ズさせたものを使用 した。 その結果、 Code [2, 1]、 Code [3, 2] RNA 分子を両方投与した場合においても Code [4， 5]の有意な 発現は認め られなかっ た （図 21)。 コー ド配列 RNA 分子と 20/aCode [1]プライ マーの代わ り に Co de [ 3 ]の相補鎖配列ォ リ ゴ DNA を 直接投入す る 実験 を 別 途行 な っ た と こ ろ Code [4, 5]の宪現カ S言忍め られたこ と 力、 ら （data not shown)、 反応効率や特異性に問題があったもの と考え られる。

(セ ンス鎖 RNA増幅関数の実行）

基本関数 C: Amplify (a - # b) を用いて、 TGTP 遺伝子の 配列を増幅する関数を設計し、 実験によ り 反応の確認を行な

TGTP-PT は TGTP 遺伝子 RNA をイ ン ビ ト ロ合成した際に使用 したプライマーである ためこのプライ マーの 3'末端に配置 された配列 TGTP- PS は TGTP 遺伝子 RNA の 5'末端と 同一であ り 、 さ らにその 5 '末端側に T7 プロモータ配列を含む。 また、 TGTP-AR プライマーは、 イ ン ビ ト ロ合成 TGTP 遺伝子 RNA の 538 塩基よ り 始まる 26 塩基長の部分の逆相補鎖配列よ り な る。 これら TGTP- PTおよび TGTP- AR両プライマーを組み合わ せる と 「 Amplify (aTGTP-AR _# TGTP - PS)」 なる、 TGTP 遺伝 子を引数とする遺伝子増幅関数が構成され、 これに TGTP 遺 伝子 RNAが渡される と配列 TGTP- PSおよび TGTP- ARで囲まれ た部分のセ ンス鎖 RNA 配列が増幅される と期待された （図 22) ₀

この TGTP 遺伝子セ ンス鎖 RNA 増幅関数に対して、 イ ンビ ト ロ合成した TGTP 遺伝子あるいは Vitronectin 遺伝子を与 えた場合と 同量の水を与えた場合（N. ）について 0, 15およ び 30 分のコ ン ピ ューティ ング反応を実行し、 その RNA 産物 を検出する実験を行なった。 検出は、 コ ンピューティ ング反 応産物を DNasel 処理する こ とでプライマー DNA や反応中間 体 DNA を除去した後に、 TGTP-AR プライマーを使用 した逆転 写反応とそれに続く TGTP-AR, TGTP- PT 両プライマーを使用 した PCR反応で増幅し、 ゲル電気泳動する こ と によ り 行なつ た（図 23, レー ン M:マーカー）。 こ の方法によ り 、 TGTP - AR および TGTP- PT の非特異的な反応によ り 生成された RNA分子 も検出される と考えられた。 TGTP 遺伝子 RNA の増幅産物が 存在する場合はこの RT- PCR によ り 5Θ2 塩基長の二本鎖 DNA が検出される と期待されるが、 そのバン ドは反応時間に従つ て増加してお り 、 A の反応でターゲッ ト と した RNA 分子が増 幅されている こ と が確認された（レー ン 1〜 3)。 ただしポジ ティ ブ .コ ン ト ロ ーノレ （レー ン P)と比較する と 592bp のパン ドの下にスメ ァ状のシグナルが検出されている こ とから、 若 干ではあるが非特異的な反応も起きている可能性もある。 ま た Vitronectin遺伝子 RNA を加えた場合や（図 23 レー ン 4〜 6)、 等量の水のみを与えた場合（N. ； 図 23 レーン 7〜9)に ついては、 全く シグナルが検出されていない。 lOObp 未満に 見られるス メ ァ状のシグナルは PCR反応時にサンプルの変わ り に等量の水を加えた場合（レー ン N)にも認め られている こ と から、 PCR 反応において形成されたプライマー 'ダイ マー である と考えられる。

考察

レ ト ロ ウィルスのゲノ ム増幅反応を模した分子コ ンビユ ー タを in _ro の反応系で実装する 目的で研究を行なった。 こ の分子コ ン ピュータ のハー ド ウ ェア と しては、 DNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性、 RNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性およ び DNA 依存 RNA ポリ メ ラーゼ活性と、 さ らに RNaseH 活性と が共存する こ と が必要であ り 、 さ らに正確にコ ンピュ一ティ ング反応が実行されるために各反応について特異性が十分に 確保されている こ と が必須と なった。 こではその条件を満 たす反応条件を新規に開発し、 これをノヽ一ドウエア と して採 用 して実験を行なつた。

このハー ドクェァを用いて遺伝子コ一ド化反応を行なつた と ころ、 単一 ^ ■in曰n.度条件下で 30〜40 分程度とい う短時間反応 させる こ とでヽ 確かにコー ド配列 RNAの生成が確認され /こ これは非常に簡便な遺伝子コー ド化技術と して遺伝子発現計 測への活用が考え bれるほか、 遺伝子発現解析な どさ らに高 次な分子コ ンピュ ¹ ~タのプロ グラムへの入力 と して利用でき る と考え られた 。 TGTP 遺伝子および V i t ro n e c t i n 遺伝子の コー ド化関数で使用 した第一プライマ一 (P 1 )の遺伝子特異的 配列部位は、 いずれも図 2 - 4でプライ マ一伸長の特異性を確 認したものである こ と力ゝら、 そのプラィ ミ ングのターグッ ト 特異性に問題がある と は考えにく い。 さ らに Amp l i f y関数で もターゲッ ト特異性に問題は見られなかつた。 遺伝子コー ド 化反応について十分な特異性が得られない理由 と しては、 プ ライマー .ダイマーの形成や遺伝子 RNA と の非特異的な反応 が影響している可能性が高いと考えられる。 こ こで使用 した コー ド化関数は、 プロモータ部位が二本鎖化される と ターゲ ッ ト遺伝子を認識した場合と 同一のコー ド配列 RNA を出力 し て しま う ため、 何らかの非特異的反応によ り P 1 上のプロモ ータ配列が二本鎖化される と 、 本来の出力 と 区別でき ない RNA を誤って転写して しま う 可能性が内在するのである。 そ で、 両コー ド化関数のプライ マーおよび遺伝子 RNAが 形成するハイ ブ リ ッ ドの構造および安定性を計算 した と こ ろ 両コ ド化関数の P 1 について、 プロモータ P 2 および遺伝子

RNA が P 1 のプロモータ配列 と 安定なハイ ブ リ ッ ド、を形成 し た り 、 遺伝子 RNA断片が非特異的プライ マー と して機能 した り する可能性が示された （d a t a n o t s h o wnノ。 コー ド、化関数で 用いるプライ マーは、 ターゲッ ト特異的配列に T 7 プ口 モ一 タ配列を加えた長い一本鎖 D NA部分が含まれるため非特異的 なハィ プ リ ッ ドが起こ り やすい '上に、 プラ イ マー - .ダイ マ一 な どの形成によ り プモータ配列が二本鎖化される と誤つてコ 一 ド配列 RNA を出力 して しま う ため、 配列の設計には特に注 意を払 う 必要がある と考え られる。 さ ら に、 こ こで報告 した レ 卜 π ウ ィ ルス型分子コ ン ビュータ に用いる 関数は添加され るォ V ゴ DNA で定義される も ので、 同一反応液中に複数のプ ラィ マ一を添加する こ と に よ り 原理的に複数の関数を同時に 実行する こ と が可能と なる。 これによ り 遺伝子の 現解祈な どよ り 複雑なプロ グラ ムが実現 し う る力 S、 同一反応液中に多 数の関数を共存させる と反応液中に力 [1えるオ リ ゴ DNA の種類 もそれに応 じて増大 し、 非特異的な反応の問題はさ ら に大き く な る 。 そのため、 高度なプロ グラ ムを構築する には適切 な核酸の配列設計する技術の開発が望ま しい。 た と えば 、 上 述 した正規直交化配列 とする こ と が好ま しい。

本研究に よ り 、 レ ト ロ ウィルス型分子コ ン ビュ一タ を実装 する ために必要 と なる反応が in vi tro にて実現 し う る こ と が示された。 さ ら に、 本研究でタ ーゲッ ト と した T GTP 、 /— 子おょぴ Vitronectin遺伝子は、 移植手術後に移植片対宿主 反応（GVHR)の遺伝子診断を行な う ためのマーカー遺伝子と し て利用が期待される ものである。 今回はこれらの遺伝子を引 数とする コー ド化関数と、 その出力を受け取って演算関数を 実行する関数で構成される遺伝子発現解析プロ グラムを設計 し、 さ らに この反応の一部が確かに実行される こ とが実験的 に示された。 この分子コンピュータのシステムを用いる こ と によ り 、 単一試験管内で一定温度条件下での反応を実行させ る操作を行な う だけで、 試験管内の各分子が 自律的に複数遺 伝子の発現パターンを解析してその結果を出力する技術が確 立される と期待され、 簡便で正確な遺伝子診断技術と しての 応用が期待される。 さ らに捋来的には、 生体細胞内にて同様 の分子コ ン ピュータ 'システムを実行するための研究へと発 展する こ と も期待され、 本研究成果によ り 分子コ ンピュータ 研究に新たな方向性が示されたといえる。

(複数の関数の多層化）

本分子コ ンピュータでは、 ある関数の戻り 値を他の関数の 引数とする こ とが考えられる。 こ こでは、 Vitronectin 遺伝 子が存在する場合に Code [3， 2]配列 RNA を出力するコー ド化 関数と、 その関数の戻り値が存在する場合に Code [4， 6， 5]配 列 RNAを出力する関数と によ り 構成されるプロ グラムが、 単 一のコンビユーティ ング反応液中にて動作する こ と を確認す る実験を行なった。 こ こでの反応の概略を図 24 に示す。 本 実験では、 このプロ グラムに対する入力と して Vitronectin 遺伝子をカロえた場合 (Vitronectin +) と 、 Vitronectin 遺 伝子はカロえずに同量の水のみを力 tlえた場合 （Vitronectin - ) と についてコ ン ピューティ ング反応を実行し、 結果と して 得られた RNA 産物を検出 した。 検出は、 Code [4, 6, 5]配列を、 Code [4] , Code [5]に対するプライマーペアを用いた リ アルタ ィ ム PCR 法によ り行なった。 その結果を図 25 に示す。 RNA 産物検出時において、 逆転写反応時に通常濃度の酵素を添加 したサンプル （ RT+；白棒） と、 酵素は添加しなかったサンプ ル （ R_T一；黒棒） と に分けて実験 した と こ ろ、 Vitronectin

RNA を入力 と して与えた場合では RT+のサンプルは RT-と比 較 し て 非 常 に 高 い レ ベ ル で 出 力 が 検 出 さ れ た が

(Vitronectin +) 、 入力を与えな力、つた場合には RT+と RT— と で は ほ と ん ど 出 力 の レ ベ ル に 変 化 は な カゝ っ た

( Vitronectin 一） 。 こ こ で RT -サンプノレ よ り 得られた出力 は実験上のノ ック グラ ウ ン ドであ り 、 RT+と RT-と における 検出結果の差が出力 と して得られた RNA分子の量を反映する もの と考えられる。 また、 上の反応産物について、 図 24 に 示すプロ グラムの中間産物である Code[3， 2]RNA についても 同様に検出反応を行なった と ころ、 Vitronectin を与えた と きに確かに Code [3， 2]の濃度も上昇している こ と が確かめ ら れた （図 26， 白棒： RNA +，黒棒： RNA- ) 。

以上の結果から、 図 24 に示した 2 種類の関数よ り なるプ ロ グラムは確かに実行され、 複数の関数を単一のコ ン ビユ ー ティ ン反応液中にて組み合わせて実行する こ と が可能である こ と が示された。 関数を多層に重ねる こ と によ り複雑なプロ グラムが実現する こ と も考え られる こ と力ゝら、 このよ う に関 数の戻 り 値が実際に他の関数の引数と なる こ と は重要である。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 分子の化学反応によ り 、 引数を受け取り 戻 り 値を返す 関数によ る演算を行う 情報処理方法であって、

( a ) 分解可能な第 1 の一本鎖核酸に対応付けて定義され た第 1 の符号化核酸を引数と して入力 し、

( b ) 前記引数に基づき、 演算用核酸の化学反応に対応付 けて定義された関数による演算を行い、

( c ) 第 2の一本鎖核酸に対応付けて定義された第 2 の符 号化核酸を戻り 値と して得る こ と、

を特徴とする情報処理方法。

2 . 請求項 1 に記載の情報処理方法であって、 前記第 2 の 一本鎖核酸は、 分解可能な核酸である方法。

3 . 請求項 2 に記載の情報処理方法であって、 前記 （c ) で 得られた第 2 の符号化核酸を、 さ らなる関数における第 1 の 符号化核酸と して使用 して演算を行い、 さ らなる第 2 の符号 化核酸を戻り値と して得る こ と を含む情報処理方法。

4 . 請求項 2 に記載の情報処理方法であって、 前記関数に よ る演算を複数機能させる こ と によ り 、 戻り値と しての第 2 の符号化核酸を得る こ と を含む情報処理方法。

5 . 請求項 4 に記載の情報処理方法を使用 して、 前記関数、 引数および戻り値の組合せによ り 記述されたプロ グラムに従 つて、 複数の関数によ る演算を行う こ と によ り 前記プロ グラ ムの計算結果を導出する情報処理方法。

6 . 請求項 1 に記載の情報処理方法であって、

前記 （ a ) の入力は、 前記第 1 の一本鎖核酸を、 前記演算 用核酸と適切な酵素を含む反応液中に添加する こ とであ り 、 前記 （ b ) の演算は、 前記演算用核酸と前記適切な酵素と 前記第 1 の一本鎖核酸を化学反応させる こ と であ り 、

前記 （ c ) の戻り 値は、 前記化学反応の反応産物と して得 られるこ と、

を特徴とする情報処理方法。

7. 請求項 6 に記載の情報処理方法であって、

前記第 〗 の一本鎖核酸および第 2 の一本鎖核酸は RNA で あ り 、

前記化学反応は、 合成反応、 増幅反応、 逆転写反応、 転写 反応、 分解反応であ り 、 それぞれ DNA 依存 DNA ポリ メ ラ ーゼ活性を有する酵素によ る合成反応または増幅反応、 RNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性を有する酵素による逆転写反応、 および DNA依存 RNAポリ メ ラーゼ活性を有する酵素による 転写反応、 および RNaseH による分解反応である情報処理方 法。

8. 請求項 7 に記載の情報処理方法であって、 前記演算用 核酸は、 前記第 1 の一本鎖核酸に対してプライマーと して作 用する配列、 プロモータ配列および任意の核酸のプライマー と して作用する配列から選択される一以上の配列を有する こ と を特徴とする情報処理方法。

9. 請求項 8 に記載の情報処理方法であって、

前記関数は、 配列 a よ り 始ま り 配列 b を通過する経路を有 する RNA を引数と して入力 した と き に、 指定した配列 X の RNA を戻 り 値と して返す関数であ り 、 前記演算用核酸は、 5 '末端方向のプロモータ配列と、 その 下流に X の逆相補配列と、 その 3 '末端側に a の相補配列と を 有する第 1 の演算用核酸、 並びに配列 b を有する第 2 の演算 用核酸の 2つであ り 、

前記化学反応は、 前記第 1 の演算用核酸の aの相補配列か ら前記 RNA の逆転写反応が起こ り 、 次いで、 逆転写された 一本鎖 DNA に前記第 2 の演算用核酸の配列 b が結合して該 第 2 の演算用核酸の 3 '末端から第 2 鎖 DNA の合成反応が起 こ り 、 次いで、 該第 2 鎖 DNA と前記第 1 の演算用核酸のプ 口モータ配列が二本鎖化される こ と によ り 、 該プロモータ配 列の下流に配置された配列 Xの転写反応が起こ り 、 反応産物 と して配列 X の RNA 分子が合成される反応である情報処理 方法。

10. 請求項 8 に記載の情報処理方法であって、

前記関数は、 配列 a よ り始ま り 配列 b で終結する経路を有 する RNA を引数と して入力 した と き に、 指定した配列 X の

RNA を戻り値と して返す関数であ り 、

前記演算用核酸は、 配列 a を有する第 1 の演算用核酸、 並 びに 5 '末端方向のプロモータ配列 と、 その下流に配列 X と 、 その 3 '末端側に配列 b と を有する第 2 の演算用核酸の 2 つ であ り 、

前記化学反応は、 前記第 1 の演算用核酸の配列 aから前記 RNA の逆転写反応が起こ り 、 次いで、 逆転写された一本鎖 DNA に前記第 2 の演算用核酸の配列 b が結合 して該一本鎖 DNA の 3 '末端から さ らなる合成反応が起こ り 、 次いで、 前 記第 2の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖化される こ と によ り 、 該プロモータ配列の下流に配置された配列 Xの転写 反応が起こ り 、 反応産物と して配列 X の RNA 分子が合成さ れる反応である情報処理方法。

1 1 . 請求項 8 に記載の情報処理方法であって、

前記関数は、 配列 a よ り 始ま り 配列 b を通過する RNA を 引数と して入力 した と きに、 該 RNAまたは該 RNAに任意の 配列が付加された RN Aを戻り値と して返す関数であり 、

前記演算用核酸は、 a の相補配列と 、 任意に配列 q の相補 配列と を有する第 1 の演算用核酸、 並びに 3 '末端方向のプ 口モータ配列と 、 任意にその 3 '末端側に配列 p と、 その 3 ' 末端に配列 b と を有する第 2の演算用核酸の 2つであ り 、 前記化学反応は、 前記第 1 の演算用核酸の a の相補配列か ら前記 RNA の逆転写反応が起こ り 、 次いで、 逆転写された 一本鎖 DNA に前記第 2 の演算用核酸の配列 b が結合して該 一本鎖 DNA の 3 '末端から さ らなる合成反応が起こ り 、 次い で、 前記第 2の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖化され る こ と によ り 、 該プロモータ配列の下流に配置された配列の 転写反応が起こ り 、 反応産物と して前記 RN A 分子または任 意に配列 p も しく は配列 q が付加された前記 RNA 分子が合 成される反応である情報処理方法。

12. 請求項 8 に記載の情報処理方法であって、

前記関数は、 配列 a よ り 始ま り 配列 b を通過する経路を有 する RNA を引数と して入力 した と きに、 該 RNAの逆相捕配 列を有する RNAまたは該 RNAの逆相補配列に任意の配列が 付加された RNAを戻 り 値と して返す関数であ り 、 前記演算用核酸は、 3 '末端方向のプロモータ配列と、 任意 にその 3¹末端側に配列 p と、 その 3 '末端に aの相補配列と を 有する第 1 の演算用核酸、 並びに配列 b と、 任意にその 3 ' 末端に配列 q と を有する第 2の演算用核酸の 2つであ り 、

前記化学反応は、 前記第 1 の演算用核酸の aの相補配列か ら前記 RNA の逆転写反応が起こ り 、 次いで、 逆転写された 一本鎖 DNA に前記第 2 の演算用核酸の配列 b が結合して該 第 2 の演算用核酸の 3 '末端か ら合成反応が起こ り 、 次いで、 該 DNA と前記第 1 の演算用核酸のプロモータ配列が二本鎖 化される こ と によ り 、 該プロモータ配列の下流に配置された 配列 X の転写反応が起こ り 、 反応産物と して前記 RNA の逆 相補配列を有する RNA 分子または任意に配列 p も しく は配 列 qが付加された前記 RNAの逆相補配列を有する RNA分子 が合成される反応である情報処理方法。

13 . 請求項 8 に記載の情報処理方法であって、

前記関数は、 引数と しての RN A を必要とせず、 常に配列 X の RNAを戻り 値と して返す関数であ り 、

前記演算用核酸は、 3 '末端方向のプロモータ配列と、 その 下流に配列 X と を有する第 1 の演算用核酸、 および 5 '末端 方向のプロモータ配列と、 その下流に Xの相補配列と を有す る第 2 の演算用核酸であ り 、

前記化学反応は、 前記第 1 の演算用核酸と前記第 2 の演算 用核酸が結合する こ と によ り 、 該プロモータ配列の下流に配 置された配列 X の転写反応が起こ り 、 反応産物と して配列 X の RN A分子が合成される反応である情報処理方法。

14. 請求項 8 に記載の方法に従つて複数の関数による演算 を行 う こ と によ り 前記プ グラ ムの計弁 木を導出する情報 処理方法。

15. 核酸分子を使用 して情報処理を行う ためのキッ トであ つて、 所望の関数によ る演算を行う ための演算用核酸を含む こ と を特徴とするキッ 卜

16. 請求項 15 に記載のキッ 卜であつて、 記演昇用核酸 は、 前記第 1 の一本鎮核酸に対してプライマ一と して作用す る配列、 プロモータ配列 よぴ任意の核酸のプライマ一 と し て作用する配列から選択される一以上の配列を有する核酸で あるキッ ト。

17. 請求項 15 に記載のキッ 卜であつて、 さ らに適切な反 応液と、 適切な酵素と を含むこ と を特徴とするキッ ト

18. 請求項 17 に記載のキッ 卜であつて、 前記適切な反応 液は、 合成反応、 增幅反応ヽ 逆転写反 j心、 転 · 反 )心および分 解反応に適 したバ ッ フ ァ一であ り 、 前記適切 な酵素は、

DNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性を有する酵素、 RNA 依存 DNAポ リ メ ラーゼ活性を有する酵素、 DNA依存 RNAポリ メ ラーゼ活性を有する酵素および RNaseHである キッ ト。

19. 請求項 1 に記載の情報処理方法によって演算を行 う た めの分子コ ンピュータであって、 所望の関数によ る演算を行 う ための演算用核酸と、 適切な反応液と、 適切な酵素と を含 む容器からなる こ と を特徴とする分子コ ンピュータ。

20. 請求項 19 に記載の分子コ ンピュータであって、 前記 演算用核酸は、 前記第 1 の一本鎖核酸に対してプライマ と して作用する配列、 プロモータ配列おょぴ任意の核酸のブラ イマ一と して作用する配列から選択される一以上の配列を有 する核酸であ り 、 前記適切な反応液は、 合成反応、 増幅反応、 逆転写反応、 転写反応および分解反応に適したバ ッ フ ァ ーで あ り 、 前記適切な酵素は、 DNA 依存 DNA ポ リ メ ラーゼ活性 を有する酵素、 RNA 依存 DNA ポリ メ ラーゼ活性を有する酵 素、 DNA 依存 RNA ポ リ メ ラーゼ活性を有する酵素おょぴ RNaseHである分子コ ン ピュータ。