JP2001517458A - 核酸を合成および増幅する方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Abstract
(57)【要約】
本発明は、複製すべき核酸への１本鎖イニシエータ核酸のハイブリダイゼーションを起こさずに、核酸をイニシエータ核酸に基づいて複製することを特徴とする、酵素触媒反応により核酸を合成および増幅する方法に関する。従って、本発明は、線状核酸を少なくとも３’−端に１本鎖領域を有するイニシエータ核酸に基づいてポリメラーゼの活性により複製し、しかも、イニシエータ核酸が複製すべき核酸との相同性を有している必要のない方法に関する
Description
【０００１】 本発明は、複製すべき核酸へのイニシエータ核酸のハイブリダイゼーションを
起こさずに、核酸を１本鎖イニシエータ核酸に基づいて複製する酵素触媒反応に
より、核酸を合成および増幅する方法に関する。従って、本発明は、線状核酸を
最小限３’端に１本鎖領域を有するイニシエータ核酸に基づいてポリメラーゼ活
性により複製し、しかも、イニシエータ核酸が複製すべき核酸との相同性を有す
る必要がない方法に関する。この方法の基礎となっている反応は以下ではイニシ
エータ誘導増幅（initiator-directed amplification、ＩＤＡ）と呼ぶことにす
る。
起こさずに、核酸を１本鎖イニシエータ核酸に基づいて複製する酵素触媒反応に
より、核酸を合成および増幅する方法に関する。従って、本発明は、線状核酸を
最小限３’端に１本鎖領域を有するイニシエータ核酸に基づいてポリメラーゼ活
性により複製し、しかも、イニシエータ核酸が複製すべき核酸との相同性を有す
る必要がない方法に関する。この方法の基礎となっている反応は以下ではイニシ
エータ誘導増幅（initiator-directed amplification、ＩＤＡ）と呼ぶことにす
る。
【０００２】 ＤＮＡ複製、ＤＮＡ合成およびＲＮＡ転写のプロセスと、これらのプロセスの
基礎となている反応メカニズムおよび原理に対する理解の深まりとが、様々なイ
ンビトロ核酸増幅戦略にとっての土台を提供してきた。
基礎となている反応メカニズムおよび原理に対する理解の深まりとが、様々なイ
ンビトロ核酸増幅戦略にとっての土台を提供してきた。
【０００３】 一般的にはポリメラーゼ連鎖反応（polymerase-chain-reaction、ＰＣＲ）と して公知である最初に実現された方法は、目標ＤＮＡ塩基配列と相同した２つの
オリゴヌクレオチドプライマにより開始される目標ＤＮＡ塩基配列の両方の鎖の
ＤＮＡポリメラーゼ触媒複製に基づくものである。この場合、ＤＮＡテンプレー
トの変性と、それに続く目標塩基配列へのプライマのハイブリダイゼーションと
、最後のポリメラーゼ触媒ＤＮＡ合成とを可能にするために、反応温度が循環的
に変化させられる。従って、このインビトロ増幅技術は、特別な循環的温度領域
とともに、特定のＤＮＡテンプレート塩基配列への特定のオリゴヌクレオチドプ
ライマのハイブリダイゼーションを必要とする。ＰＣＲによるインビトロ増幅な
らびにこの反応の改良およびさらなる発展については、例えば、Saiki, R.K. et
al. (1985) Science 230, 1350-1354; Mullis, K.B. and Faloona, A. (1987)
Methods Enzymol. 155, 335-350; EP-A2-0 200 362のように、各種の文献がある
。
オリゴヌクレオチドプライマにより開始される目標ＤＮＡ塩基配列の両方の鎖の
ＤＮＡポリメラーゼ触媒複製に基づくものである。この場合、ＤＮＡテンプレー
トの変性と、それに続く目標塩基配列へのプライマのハイブリダイゼーションと
、最後のポリメラーゼ触媒ＤＮＡ合成とを可能にするために、反応温度が循環的
に変化させられる。従って、このインビトロ増幅技術は、特別な循環的温度領域
とともに、特定のＤＮＡテンプレート塩基配列への特定のオリゴヌクレオチドプ
ライマのハイブリダイゼーションを必要とする。ＰＣＲによるインビトロ増幅な
らびにこの反応の改良およびさらなる発展については、例えば、Saiki, R.K. et
al. (1985) Science 230, 1350-1354; Mullis, K.B. and Faloona, A. (1987)
Methods Enzymol. 155, 335-350; EP-A2-0 200 362のように、各種の文献がある
。
【０００４】 リガーゼ連鎖反応（ligase-chain-reaction、ＬＣＲ）と呼ばれるもう１つの 増幅方法は、上記のＰＣＲと同様に、熱循環プロセスに基づくものであり、ＬＣ
Ｒの場合は、２対の相補オリゴヌクレオチドの合成生成物が蓄積する。ＰＣＲの
場合と同様に、この場合も、増幅すべき塩基配列区間へのプライマの特定のハイ
ブリダイゼーションが起こることができるように、テンプレート核酸の塩基配列
と同一または最小限基本的には同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマを使用しなければならない。添加されたオリゴヌクレオチドにより代表され
る塩基配列だけしか増幅することができないＬＣＲ法については、特に、Barany
, F. (1991) PCR Methods Appl.1, 5-16; EP-A2-0 439 182に詳細に記載されて いる。
Ｒの場合は、２対の相補オリゴヌクレオチドの合成生成物が蓄積する。ＰＣＲの
場合と同様に、この場合も、増幅すべき塩基配列区間へのプライマの特定のハイ
ブリダイゼーションが起こることができるように、テンプレート核酸の塩基配列
と同一または最小限基本的には同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマを使用しなければならない。添加されたオリゴヌクレオチドにより代表され
る塩基配列だけしか増幅することができないＬＣＲ法については、特に、Barany
, F. (1991) PCR Methods Appl.1, 5-16; EP-A2-0 439 182に詳細に記載されて いる。
【０００５】 さらに、WO 90/01069から、ＰＣＲとＬＣＲとの特徴を兼ね備えた、すなわち 、ポリメラーゼ触媒反応とリガーゼ触媒反応とに基づく増幅法（Ｐ＆ＬＣＲ）が
公知である。
公知である。
【０００６】 ＰＣＲ、ＬＣＲおよびＰ＆ＬＣＲは熱循環増幅法であるが、一方、等温戦略を
実用化することにも成功している。ここでは特に、Guatelli, J.C. et al. (199
0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878; Fahy, E. et al. (1991) PCR Methods Appl. 1
, 25-33;EP-A2-0 373 960およびWO 92/08800他に記載された「自立塩基配列複製
」（３ＳＲ）と、Compton, J. (1991) Nature 350, 91-92に記載された「核酸塩
基配列に基づく増幅」（ＮＡＳＢＡ）とを挙げるものとする。
実用化することにも成功している。ここでは特に、Guatelli, J.C. et al. (199
0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878; Fahy, E. et al. (1991) PCR Methods Appl. 1
, 25-33;EP-A2-0 373 960およびWO 92/08800他に記載された「自立塩基配列複製
」（３ＳＲ）と、Compton, J. (1991) Nature 350, 91-92に記載された「核酸塩
基配列に基づく増幅」（ＮＡＳＢＡ）とを挙げるものとする。
【０００７】 ３ＳＲ戦略もＮＡＳＢＡ戦略もレトロウイルス内で観察される複製原理に基づ
くものである。いずれの場合も、目標ＲＮＡ塩基配列の３’端を相補するプライ
マのハイブリダイゼーションが逆転写酵素触媒ＤＮＡ合成（第１鎖ｃＤＮＡ合成
）を開始する。次の段階では、ＲＮＡテンプレートが大腸菌からのＲＮＡ分解酵
素Ｈの活性により分解され、それにより、例えばＴ７−ＲＮＡポリメラーゼのよ
うな、ウイルスＲＮＡポリメラーゼの識別塩基配列を５’−端に含む第２のプラ
イマにより、新たに合成されたｃＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションが可能
になる。ＤＮＡ２本鎖が逆転写酵素の活性（第２鎖ｃＤＮＡ合成）により完成し
、Ｔ７プロモータ領域の２本鎖になった後に、ＲＮＡポリメラーゼが、元の目標
ＲＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有し、後続の増幅サイクルにおいて再度
テンプレートとしての役割を果たす多数のＲＮＡ分子を合成する。このようにし
て、目標塩基配列の指数増幅においては、温度を一定にしたままで、逆転写酵素
触媒反応とＲＮＡ分解酵素Ｈ触媒反応とＲＮＡポリメラーゼ触媒反応との自発的
交代が行われる。
くものである。いずれの場合も、目標ＲＮＡ塩基配列の３’端を相補するプライ
マのハイブリダイゼーションが逆転写酵素触媒ＤＮＡ合成（第１鎖ｃＤＮＡ合成
）を開始する。次の段階では、ＲＮＡテンプレートが大腸菌からのＲＮＡ分解酵
素Ｈの活性により分解され、それにより、例えばＴ７−ＲＮＡポリメラーゼのよ
うな、ウイルスＲＮＡポリメラーゼの識別塩基配列を５’−端に含む第２のプラ
イマにより、新たに合成されたｃＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションが可能
になる。ＤＮＡ２本鎖が逆転写酵素の活性（第２鎖ｃＤＮＡ合成）により完成し
、Ｔ７プロモータ領域の２本鎖になった後に、ＲＮＡポリメラーゼが、元の目標
ＲＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有し、後続の増幅サイクルにおいて再度
テンプレートとしての役割を果たす多数のＲＮＡ分子を合成する。このようにし
て、目標塩基配列の指数増幅においては、温度を一定にしたままで、逆転写酵素
触媒反応とＲＮＡ分解酵素Ｈ触媒反応とＲＮＡポリメラーゼ触媒反応との自発的
交代が行われる。
【０００８】 さらなる等温増幅法として、Walker, G.T. et al. (1992) Nucl. Acids Res.
20, 1691-1696 and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396の「鎖排除増幅」
（ＳＤＡ）と呼ばれる技術がある。EP-A1-0 497 272およびEP-A2-0 500 224も参
照。この戦略では、等温増幅法に伴う新しい鎖の合成中の目標塩基配列の相補性
ＤＮＡ鎖の排除（"displacement"）による形成された核酸２本鎖の鎖解離の問題
が解決される。ＳＤＡ法の場合にも、目標塩基配列の相補性オリゴヌクレオチド
プライマは始めに変性された目標ＤＮＡの鎖とハイブリダイゼーションする。Ｄ
ＮＡポリメラーゼが、好ましくは、５’−エクソヌクレアーゼ欠落（Ｅｘｏ−Ｋ
ｌｅｎｏｗ）のある大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片が、５’端
に特定の制限界面を含むプライマの５’−端の複製により、プライマとテンプレ
ート分子の双方を延長する。ＤＮＡ合成中には特定の変更ｄＡＴＰヌクレオチド
が提供され、組込まれるので、特別な制限酵素の添加後には、プライマに含まれ
る制限消化用切断部位だけにアクセス可能になり、制限消化用ＤＮＡ複製にはア
クセス不能である（いわゆる半制限）。この「ニック」のところで、ニックトラ
ンスレーション能力のないＤＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡ合成が開始され、
テンプレートの役割を果たさないストランドはＤＮＡ合成中の鎖排除により分解
される。
20, 1691-1696 and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396の「鎖排除増幅」
（ＳＤＡ）と呼ばれる技術がある。EP-A1-0 497 272およびEP-A2-0 500 224も参
照。この戦略では、等温増幅法に伴う新しい鎖の合成中の目標塩基配列の相補性
ＤＮＡ鎖の排除（"displacement"）による形成された核酸２本鎖の鎖解離の問題
が解決される。ＳＤＡ法の場合にも、目標塩基配列の相補性オリゴヌクレオチド
プライマは始めに変性された目標ＤＮＡの鎖とハイブリダイゼーションする。Ｄ
ＮＡポリメラーゼが、好ましくは、５’−エクソヌクレアーゼ欠落（Ｅｘｏ−Ｋ
ｌｅｎｏｗ）のある大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片が、５’端
に特定の制限界面を含むプライマの５’−端の複製により、プライマとテンプレ
ート分子の双方を延長する。ＤＮＡ合成中には特定の変更ｄＡＴＰヌクレオチド
が提供され、組込まれるので、特別な制限酵素の添加後には、プライマに含まれ
る制限消化用切断部位だけにアクセス可能になり、制限消化用ＤＮＡ複製にはア
クセス不能である（いわゆる半制限）。この「ニック」のところで、ニックトラ
ンスレーション能力のないＤＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡ合成が開始され、
テンプレートの役割を果たさないストランドはＤＮＡ合成中の鎖排除により分解
される。
【０００９】 WO 90/10064、91/03573および91/16446から、Blanco et al. (1994) Proc. Na
tl. Acad.Sci. USA 91, 12198-12202も参照、バクテリオファージφ２９のＤＮ Ａ複製タンパク質を使用し、その助けにより非常に長いＤＮＡセグメント（＞７
０ｋｂ）も増幅することができる別の等温ＤＮＡ増幅法も公知である。この方法
は、特に、プライマの役割を果たす φ２９のいわゆる末端タンパク質（ＴＰ） と、φ２９のＤＮＡポリメラーゼと、ＳＳＢ（１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）お
よびＤＢＰ（２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）のようなその他の複製タンパク質と
の存在を必要とする。この増幅法の場合は、上記の各方法とは違って、複製すべ
き核酸への特定のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは起こらず、そ
の代わりに、φ２９からの末端タンパク質（ＴＰ）がプライマの役割を果たす。
tl. Acad.Sci. USA 91, 12198-12202も参照、バクテリオファージφ２９のＤＮ Ａ複製タンパク質を使用し、その助けにより非常に長いＤＮＡセグメント（＞７
０ｋｂ）も増幅することができる別の等温ＤＮＡ増幅法も公知である。この方法
は、特に、プライマの役割を果たす φ２９のいわゆる末端タンパク質（ＴＰ） と、φ２９のＤＮＡポリメラーゼと、ＳＳＢ（１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）お
よびＤＢＰ（２本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）のようなその他の複製タンパク質と
の存在を必要とする。この増幅法の場合は、上記の各方法とは違って、複製すべ
き核酸への特定のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは起こらず、そ
の代わりに、φ２９からの末端タンパク質（ＴＰ）がプライマの役割を果たす。
【００１０】 Kramer, F.R. and Lizarde, P.M. (1989) Nature 339, 401-402およびLomeli,
H. (1989) Clin. Chem. 35, 1826-1831から、さらに、バクテリオファージＱβ
（Ｑβ−レプリカーゼ）からのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する等温
ＲＮＡ増幅法が公知である。この方法で使用されるＲＮＡゾンデは、Ｑβ−レプ
リカーゼによる複製に必要な塩基配列要素と、探知すべき目標塩基配列を相補す
る内部セグメントとを含んでいる。特定の反応条件の下では、Ｑβ−レプリカー
ゼの活性により、添加された試料中の対応する目標塩基配列とハイブリダイゼー
ションする分子だけが複製される。作られた複製は、後続の合成段階において、
原分子とともに、以降の複製サイクル用のテンプレートの役割を果たす。この方
法により、温度を一定にした状態での１５分間の培養中に、ソンデ分子の１０８
倍の増幅を実現することができる。
H. (1989) Clin. Chem. 35, 1826-1831から、さらに、バクテリオファージＱβ
（Ｑβ−レプリカーゼ）からのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する等温
ＲＮＡ増幅法が公知である。この方法で使用されるＲＮＡゾンデは、Ｑβ−レプ
リカーゼによる複製に必要な塩基配列要素と、探知すべき目標塩基配列を相補す
る内部セグメントとを含んでいる。特定の反応条件の下では、Ｑβ−レプリカー
ゼの活性により、添加された試料中の対応する目標塩基配列とハイブリダイゼー
ションする分子だけが複製される。作られた複製は、後続の合成段階において、
原分子とともに、以降の複製サイクル用のテンプレートの役割を果たす。この方
法により、温度を一定にした状態での１５分間の培養中に、ソンデ分子の１０８
倍の増幅を実現することができる。
【００１１】 全ての公知の増幅技術は、目標塩基配列へのゾンデの役割を果たすプライマ分
子のハイブリダイゼーションまたはバクテリオファージからの特殊な複製タンパ
ク質の使用（タンパク質プライマ使用複製）を必要とする。もし増幅すべき核酸
分子への特殊なオリゴヌクレオチドプライマのハイブリダイゼーションを必要と
せず、上記のバクテリオファージからの複雑な複製メカニズムを不要である増幅
法を提供することができるのであれば、それは非常に好ましいことである。従っ
て理論的にはあらゆる任意の核酸の合成と増幅とを可能にするような方法があれ
ば、例えば、分子バイオテクノロジーの分野、特に、核酸の遺伝子工学的インビ
トロ処理、進化バイオテクノロジー、組合わせ化学および分子情報処理の分野に
おける数多くの用途にとって計り知れない価値があることになる。特に特定の塩
基配列を増幅しなければならない場合は、かかる方法は公知のプライマ依存増幅
法と組合わせて利用することもできる。
子のハイブリダイゼーションまたはバクテリオファージからの特殊な複製タンパ
ク質の使用（タンパク質プライマ使用複製）を必要とする。もし増幅すべき核酸
分子への特殊なオリゴヌクレオチドプライマのハイブリダイゼーションを必要と
せず、上記のバクテリオファージからの複雑な複製メカニズムを不要である増幅
法を提供することができるのであれば、それは非常に好ましいことである。従っ
て理論的にはあらゆる任意の核酸の合成と増幅とを可能にするような方法があれ
ば、例えば、分子バイオテクノロジーの分野、特に、核酸の遺伝子工学的インビ
トロ処理、進化バイオテクノロジー、組合わせ化学および分子情報処理の分野に
おける数多くの用途にとって計り知れない価値があることになる。特に特定の塩
基配列を増幅しなければならない場合は、かかる方法は公知のプライマ依存増幅
法と組合わせて利用することもできる。
【００１２】 本発明の課題は、複製すべき核酸への相補性核酸分子のハイブリダイゼーショ
ンを起こす必要のない、核酸の合成および場合によっては増幅を可能にする方法
を提供することにある。
ンを起こす必要のない、核酸の合成および場合によっては増幅を可能にする方法
を提供することにある。
【００１３】 発明のもう１つの課題は、かかるハイブリダイゼーション非依存合成および増
幅技術の用途を示すことにある。
幅技術の用途を示すことにある。
【００１４】 これらの課題は本発明の独立請求項により解決される。副請求項は発明の効果
的な実施態様を定義する。
的な実施態様を定義する。
【００１５】 実験により、ポリメラーゼ触媒反応において、２本鎖テンプレートの鎖が１本
鎖核酸（イニシエータ）の遊離３’−ＯＨに基づいて複製され、しかも、２本鎖
ＤＮＡ分子に関するこれまでに公知のこの種の全ての反応とは違って、テンプレ
ートへの１本鎖核酸のハイブリダイゼーションを含まないことが驚くべきことに
確認されている。
鎖核酸（イニシエータ）の遊離３’−ＯＨに基づいて複製され、しかも、２本鎖
ＤＮＡ分子に関するこれまでに公知のこの種の全ての反応とは違って、テンプレ
ートへの１本鎖核酸のハイブリダイゼーションを含まないことが驚くべきことに
確認されている。
【００１６】 この観察結果の出発点は、２本鎖テンプレートを上記の３ＳＲ反応により増幅
する実験であった。反応は、ｄＮＴＰおよびＮＴＰ、緩衝液およびテンプレート
とともに、各２０塩基対の長さを有する２つの非ホスホリル化オリゴヌクレオチ
ドプライマ、逆転写酵素およびＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを含んでいた。特定の
反応条件の下で、得られた２本鎖反応生成物は、２０塩基対の単位で延長されて
いた点が優れていた。反応生成物は複製され、塩基配列を分析された。この塩基
配列分析により、これらの分子が、その端の予想されたテンプレート塩基配列と
ともに、両プライマ塩基配列のいくつかの複製を直接の繰返しとして含んでいる
ことが明らかになった。テンプレート塩基配列とプライマ塩基配列ならびに上下
のプライマ塩基配列は大部分が直接的に、すなわち重なり合いなしに、相互に結
合されているか、ないしは、結合場所における各塩基の欠失または挿入を示して
いた。続いて行われた増幅実験では、同じ条件の下でオリゴヌクレオチドプライ
マだけが添加され、テンプレートは添加されず、その長さが２０塩基対の単位で
変化する反復ＤＮＡ分子が形成された。これらの分子は、３’−端に関する両プ
ライマの一方の２つの複製のハイブリダイゼーションと後続の２本鎖への補充と
により生じた３３塩基長の中心エレメントと、両プライマの多数の直接相互に融
合された塩基配列とを含んでいた。
する実験であった。反応は、ｄＮＴＰおよびＮＴＰ、緩衝液およびテンプレート
とともに、各２０塩基対の長さを有する２つの非ホスホリル化オリゴヌクレオチ
ドプライマ、逆転写酵素およびＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを含んでいた。特定の
反応条件の下で、得られた２本鎖反応生成物は、２０塩基対の単位で延長されて
いた点が優れていた。反応生成物は複製され、塩基配列を分析された。この塩基
配列分析により、これらの分子が、その端の予想されたテンプレート塩基配列と
ともに、両プライマ塩基配列のいくつかの複製を直接の繰返しとして含んでいる
ことが明らかになった。テンプレート塩基配列とプライマ塩基配列ならびに上下
のプライマ塩基配列は大部分が直接的に、すなわち重なり合いなしに、相互に結
合されているか、ないしは、結合場所における各塩基の欠失または挿入を示して
いた。続いて行われた増幅実験では、同じ条件の下でオリゴヌクレオチドプライ
マだけが添加され、テンプレートは添加されず、その長さが２０塩基対の単位で
変化する反復ＤＮＡ分子が形成された。これらの分子は、３’−端に関する両プ
ライマの一方の２つの複製のハイブリダイゼーションと後続の２本鎖への補充と
により生じた３３塩基長の中心エレメントと、両プライマの多数の直接相互に融
合された塩基配列とを含んでいた。
【００１７】 下記の実施例において補足的な説明を行うが、これらおよびその他の実験にお
いて得られたデータから、１本鎖核酸がテンプレートとのハイブリダイゼーショ
ンを起こさずに、使用されたポリメラーゼがテンプレート依存性反応において自
由３’−ＯＨを有する１本鎖核酸分子を非常に効果的に延長する反応メカニズム
が存在するとの結論を得ることができる。従って、１本鎖の塩基配列はテンプレ
ート塩基配列配列との相同性を有する必要はない。従って、１本鎖は典型的なプ
ライマの役割を果たしているのではなく、イニシエータと呼ぶ方がよい。テンプ
レートの役割を果たすのは線状２本鎖ＤＮＡである。反応生成物は、テンプレー
トの５’−端と直接融合されているイニシエータの塩基配列を含んでいる。プロ
セスは反復推移し、塩基配列の漸進的延長とテンプレートの純増幅とで終わる。
ハイブリダイゼーション依存性増幅方式との違いを明瞭にするために、この反応
はイニシエータ誘導またはイニシエータ依存性増幅（"initiator directed ampl
ification"または"initiator dependant amplification"）と呼ぶことができる 。
いて得られたデータから、１本鎖核酸がテンプレートとのハイブリダイゼーショ
ンを起こさずに、使用されたポリメラーゼがテンプレート依存性反応において自
由３’−ＯＨを有する１本鎖核酸分子を非常に効果的に延長する反応メカニズム
が存在するとの結論を得ることができる。従って、１本鎖の塩基配列はテンプレ
ート塩基配列配列との相同性を有する必要はない。従って、１本鎖は典型的なプ
ライマの役割を果たしているのではなく、イニシエータと呼ぶ方がよい。テンプ
レートの役割を果たすのは線状２本鎖ＤＮＡである。反応生成物は、テンプレー
トの５’−端と直接融合されているイニシエータの塩基配列を含んでいる。プロ
セスは反復推移し、塩基配列の漸進的延長とテンプレートの純増幅とで終わる。
ハイブリダイゼーション依存性増幅方式との違いを明瞭にするために、この反応
はイニシエータ誘導またはイニシエータ依存性増幅（"initiator directed ampl
ification"または"initiator dependant amplification"）と呼ぶことができる 。
【００１８】 発明に関する理論的説明は省略することとして、現在では、図１に示した反応
メカニズムが存在するものと考えられる。図式は最初の２回の反応サイクルにつ
いてのＩＤＡ反応の推定メカニズムを示したものである。ポリメラーゼは同時に
２本鎖テンプレートの端と１本鎖イニシエータ分子（垂直ハッチング）とに結合
する。テンプレートの３’−端が延長され、その結果、イニシエータは２本鎖に
補充される。イニシエータの３’−端を出発点として、ＤＮＡ２本鎖への合成が
始まるが、この合成はポリメラーゼとイニシエータとの結合に応じて「左側」（
黒い矢印）に起こることもあるし、「右側」（水平ハッチングの矢印）に起こる
こともある。一方の鎖がテンプレートの役割を果たし、もう一方の鎖が１本鎖と
して分解されると推測される。反応の結果が、元の２本鎖テンプレートの塩基配
列がイニシエータの塩基配列と直接融合されているＤＮＡ２本鎖である。「左側
」および「右側」のサイクルにおいて生じる１本鎖は相補的であり、２本鎖にハ
イブリダイゼーションすることができる（灰色の矢印）。第２のサイクルにおい
ては、「左側」または「右側」（括弧内の矢印、図示せず）に延長されたテンプ
レートを出発点として、再び「左側」（黒い矢印）または「右側」（水平ハッチ
ングされた矢印）への延長が起こる。メカニズムは第１のサイクルの場合と相同
しているが、しかしながら、１本鎖の一部がイニシエータを相補する塩基配列を
含んでいる。これらの１本鎖は、イニシエータの結合の後に、プライマとしてポ
リメラーゼにより２本鎖に補充することができる（斜めハッチングの矢印）。
メカニズムが存在するものと考えられる。図式は最初の２回の反応サイクルにつ
いてのＩＤＡ反応の推定メカニズムを示したものである。ポリメラーゼは同時に
２本鎖テンプレートの端と１本鎖イニシエータ分子（垂直ハッチング）とに結合
する。テンプレートの３’−端が延長され、その結果、イニシエータは２本鎖に
補充される。イニシエータの３’−端を出発点として、ＤＮＡ２本鎖への合成が
始まるが、この合成はポリメラーゼとイニシエータとの結合に応じて「左側」（
黒い矢印）に起こることもあるし、「右側」（水平ハッチングの矢印）に起こる
こともある。一方の鎖がテンプレートの役割を果たし、もう一方の鎖が１本鎖と
して分解されると推測される。反応の結果が、元の２本鎖テンプレートの塩基配
列がイニシエータの塩基配列と直接融合されているＤＮＡ２本鎖である。「左側
」および「右側」のサイクルにおいて生じる１本鎖は相補的であり、２本鎖にハ
イブリダイゼーションすることができる（灰色の矢印）。第２のサイクルにおい
ては、「左側」または「右側」（括弧内の矢印、図示せず）に延長されたテンプ
レートを出発点として、再び「左側」（黒い矢印）または「右側」（水平ハッチ
ングされた矢印）への延長が起こる。メカニズムは第１のサイクルの場合と相同
しているが、しかしながら、１本鎖の一部がイニシエータを相補する塩基配列を
含んでいる。これらの１本鎖は、イニシエータの結合の後に、プライマとしてポ
リメラーゼにより２本鎖に補充することができる（斜めハッチングの矢印）。
【００１９】 図面は理想化され、簡素化された図式を示したものである。現実には、いくつ
かのサイクルが１つの分子について同時に進行することがあり、１本鎖中間体の
間には図示したよりもはるかに多くの相互作用が存在する可能性があるので、反
応ははるかに複雑なものになる。いずれにせよ、図１に示した反応図式は、反復
性塩基配列の形成が観察されたここと、塩基配列相同性のないＤＮＡ配列の融合
が観察されたこととを明らかにしている。これらの観察結果は従来の合成メカニ
ズムによっては説明することができない。すなわち、プライマとテンプレートと
のハイブリダイゼーションを伴わないポリメラーゼ触媒テンプレート依存性プラ
イマ延長は本発明により始めて提供されたのである。
かのサイクルが１つの分子について同時に進行することがあり、１本鎖中間体の
間には図示したよりもはるかに多くの相互作用が存在する可能性があるので、反
応ははるかに複雑なものになる。いずれにせよ、図１に示した反応図式は、反復
性塩基配列の形成が観察されたここと、塩基配列相同性のないＤＮＡ配列の融合
が観察されたこととを明らかにしている。これらの観察結果は従来の合成メカニ
ズムによっては説明することができない。すなわち、プライマとテンプレートと
のハイブリダイゼーションを伴わないポリメラーゼ触媒テンプレート依存性プラ
イマ延長は本発明により始めて提供されたのである。
【００２０】 本発明によるＩＤＡ反応は等温性であり、反復により純増幅をもたらす。この
反応の効果的な特性は、特に、特定のハイブリダイゼーションに依存しておらず
、それにより、反応の進行中に、潜在的にあらゆる任意の塩基配列をあらゆる別
の塩基配列と融合させることができることにある。さらに、ＩＤＡ反応は２本鎖
テンプレート分子の合成を可能にする。特性のこの固有の組合わせにより、ＩＤ
Ａ反応は幅広い潜在的用途を有しており、核酸の遺伝子工学的インビトロ処理、
進化バイオテクノロジーならびに関連分野の全ての領域に全く新たな可能性をも
たらすことになる。
反応の効果的な特性は、特に、特定のハイブリダイゼーションに依存しておらず
、それにより、反応の進行中に、潜在的にあらゆる任意の塩基配列をあらゆる別
の塩基配列と融合させることができることにある。さらに、ＩＤＡ反応は２本鎖
テンプレート分子の合成を可能にする。特性のこの固有の組合わせにより、ＩＤ
Ａ反応は幅広い潜在的用途を有しており、核酸の遺伝子工学的インビトロ処理、
進化バイオテクノロジーならびに関連分野の全ての領域に全く新たな可能性をも
たらすことになる。
【００２１】 例えば、本発明によるＩＤＡ反応は一般的に核酸の増幅に使用することができ
る。全ての公知の増幅法に対するＩＤＡ反応の利点は、特に、テンプレートの端
の構造に依存していないことにある。これにより、あらゆる特定の増幅の問題に
対して特定のプライマ塩基配列を製造する必要がなくなる。同様に、ＩＤＡ反応
により、異種端を有する核酸のプールを１回の反応で増幅することができる。
る。全ての公知の増幅法に対するＩＤＡ反応の利点は、特に、テンプレートの端
の構造に依存していないことにある。これにより、あらゆる特定の増幅の問題に
対して特定のプライマ塩基配列を製造する必要がなくなる。同様に、ＩＤＡ反応
により、異種端を有する核酸のプールを１回の反応で増幅することができる。
【００２２】 実験により、本発明による反応だけで増幅法としての役割を果たすことができ
ることが確認されている。この場合、テンプレートの５’−端を再生する活性を
有するレストリクターゼの添加により、反応中のテンプレートの段階的延長を妨
げることができる。この効果は、例えばＲＮＡ分解酵素ＨのようなＲＮＡ分解酵
素と組合わせてＲＮＡイニシエータ分子を使用することによっても得ることがで
きる。この場合、ＲＮＡイニシエータは、２本鎖への補充の後に、ＲＮＡ分解酵
素Ｈにより少なくとも部分的に分解される。イニシエータ核酸として、例えばペ
プチド核酸のような核酸類似物（ＰＮＡ； Wittung et al. (1994) Nature 368,
561-563）を使用することもできる。
ることが確認されている。この場合、テンプレートの５’−端を再生する活性を
有するレストリクターゼの添加により、反応中のテンプレートの段階的延長を妨
げることができる。この効果は、例えばＲＮＡ分解酵素ＨのようなＲＮＡ分解酵
素と組合わせてＲＮＡイニシエータ分子を使用することによっても得ることがで
きる。この場合、ＲＮＡイニシエータは、２本鎖への補充の後に、ＲＮＡ分解酵
素Ｈにより少なくとも部分的に分解される。イニシエータ核酸として、例えばペ
プチド核酸のような核酸類似物（ＰＮＡ； Wittung et al. (1994) Nature 368,
561-563）を使用することもできる。
【００２３】 さらに、本発明による反応はＰＣＲまたは別のプライマ依存性増幅反応に前置
することもできる。第１段階では、それにより、各テンプレートがイニシエータ
塩基配列と融合させられる。続いて、イニシエータをプライマとして使用するこ
とができる特定の増幅が行われる。
することもできる。第１段階では、それにより、各テンプレートがイニシエータ
塩基配列と融合させられる。続いて、イニシエータをプライマとして使用するこ
とができる特定の増幅が行われる。
【００２４】 その特別な特性に基づいて、本発明による反応は、すでに確立された増幅技術
によっては対応することができない数多くの用途に使用することができる。実例
として、ここでは、例えば診断目的またはインビトロ進化の方法（例えば、ＳＥ
ＬＥＸプロセス（「指数濃縮によるリガンドの系統的進化」；例えば、WO 95/30
775を参照）またはその他のインビトロ選択法）との関連での総ＤＮＡあまたは 核酸混合物の増幅ないし複製を挙げることにする。本発明による反応が、一般的
に、試料中に含まれた全ての核酸分子の複製または一般的に核酸分子の偶然の合
成および増幅が望ましいあらゆる任意のプロセスにおいて使用可能であることは
明白である。
によっては対応することができない数多くの用途に使用することができる。実例
として、ここでは、例えば診断目的またはインビトロ進化の方法（例えば、ＳＥ
ＬＥＸプロセス（「指数濃縮によるリガンドの系統的進化」；例えば、WO 95/30
775を参照）またはその他のインビトロ選択法）との関連での総ＤＮＡあまたは 核酸混合物の増幅ないし複製を挙げることにする。本発明による反応が、一般的
に、試料中に含まれた全ての核酸分子の複製または一般的に核酸分子の偶然の合
成および増幅が望ましいあらゆる任意のプロセスにおいて使用可能であることは
明白である。
【００２５】 ２本鎖核酸に代わって、または２本鎖核酸とともに、１本鎖核酸も当初テンプ
レートの役割を果たすことができる。この場合は、例えば、複製すべき１本鎖の
３’−端に対する相補性を有するイニシエータ核酸を使用することができ、その
結果、テンプレート分子へのイニシエータ核酸のハイブリダイゼーションと、そ
れに続く２本鎖のポリメラーゼ触媒補充により、２本鎖テンプレートが生じ、こ
の２本鎖テンプレートが続いて本発明によるＩＤＡメカニズムにより増幅される
。この方法は同時に増幅を行いつつＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに書換えるために使用
することができ、従って、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）の代替策となる。 一般的に、本発明による反応はさらに、開始反応として塩基配列固有過程を必
要とする複製過程にこれまで基づいていた全ての方法およびプロセスにとっての
土台としての役割を果たすことができる。かかる方法は、例えば、塩基配列決定
法およびフットプリント法と、標識付き核酸の製造と、例えば選択法（例えば、
ＳＥＬＥＸプロセス）と結合させることができる１本鎖核酸の製造とを含んでい
る。
レートの役割を果たすことができる。この場合は、例えば、複製すべき１本鎖の
３’−端に対する相補性を有するイニシエータ核酸を使用することができ、その
結果、テンプレート分子へのイニシエータ核酸のハイブリダイゼーションと、そ
れに続く２本鎖のポリメラーゼ触媒補充により、２本鎖テンプレートが生じ、こ
の２本鎖テンプレートが続いて本発明によるＩＤＡメカニズムにより増幅される
。この方法は同時に増幅を行いつつＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに書換えるために使用
することができ、従って、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）の代替策となる。 一般的に、本発明による反応はさらに、開始反応として塩基配列固有過程を必
要とする複製過程にこれまで基づいていた全ての方法およびプロセスにとっての
土台としての役割を果たすことができる。かかる方法は、例えば、塩基配列決定
法およびフットプリント法と、標識付き核酸の製造と、例えば選択法（例えば、
ＳＥＬＥＸプロセス）と結合させることができる１本鎖核酸の製造とを含んでい
る。
【００２６】 さらに、本発明によるＩＤＡ反応は非相補性核酸の融合に使用することができ
る。これにより、特に分子バイオテクノロジーに関して、一連の新たな可能性が
開けることになる。例えば、本発明による方法は、短いランダム化オリゴヌクレ
オチドからのランダム塩基配列の製造を、従って、これまでは事実上アクセス不
能であった塩基配列空間を開くことを可能にする。
る。これにより、特に分子バイオテクノロジーに関して、一連の新たな可能性が
開けることになる。例えば、本発明による方法は、短いランダム化オリゴヌクレ
オチドからのランダム塩基配列の製造を、従って、これまでは事実上アクセス不
能であった塩基配列空間を開くことを可能にする。
【００２７】 本発明による方法のもう１つの用途が、オリゴヌクレオチドの酵素テンプレー
ト非依存性合成である。この用途は、組合わせ化学と分子情報処理（ＤＮＡコン
ピューティング、ＤＮＡチップ技術）とに幅広い可能性の分野を開くことになる
。結果として核酸の組換えを伴うプロセスとの共同作業において、任意の塩基配
列と長さとを有する塩基配列を製造することができる。同様に、本発明による方
法は、長い２本鎖ＤＮＡ分子（例えば、合成遺伝子）を塩基配列相補性のない１
本鎖から製造することを可能にする。
ト非依存性合成である。この用途は、組合わせ化学と分子情報処理（ＤＮＡコン
ピューティング、ＤＮＡチップ技術）とに幅広い可能性の分野を開くことになる
。結果として核酸の組換えを伴うプロセスとの共同作業において、任意の塩基配
列と長さとを有する塩基配列を製造することができる。同様に、本発明による方
法は、長い２本鎖ＤＮＡ分子（例えば、合成遺伝子）を塩基配列相補性のない１
本鎖から製造することを可能にする。
【００２８】 本発明による方法のその他の用途としては、種々のコドン成分の誘導またはラ
ンダム化融合によるタンパク質コード化塩基配列の製造がある。プロテイノーゲ
ンアミノ酸の全スペクトルは２１の成分によりカバーすることができる。例えば
、本発明による方法と翻訳法との結合が可能になり、その結果、タンパク質コー
ド化塩基配列とタンパク質自体とを同時に製造することができる。かかる翻訳法
としては、古典的な翻訳法（例えば、Baranov et al. (1989) Gene 84, 463-466
; Morozov et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9325-9329を参照) と、例えば、現在精力的に開発作業が行われているタンパク質のリボザイム触媒
合成のような、代替的なメカニズムに基づく方法（例えば、Illangasekare et
al. (1995) Science 267, 643-647; Lohse and Szostak (1996) Nature 381, 44
2-444; Hager et al. (1996) Chem. Biol. 3, 717-725を参照）とがあり、タン
パク質のリボザイム合成の場合、リボザイムは各段階で融合された核酸と同一で
あることができる。
ンダム化融合によるタンパク質コード化塩基配列の製造がある。プロテイノーゲ
ンアミノ酸の全スペクトルは２１の成分によりカバーすることができる。例えば
、本発明による方法と翻訳法との結合が可能になり、その結果、タンパク質コー
ド化塩基配列とタンパク質自体とを同時に製造することができる。かかる翻訳法
としては、古典的な翻訳法（例えば、Baranov et al. (1989) Gene 84, 463-466
; Morozov et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9325-9329を参照) と、例えば、現在精力的に開発作業が行われているタンパク質のリボザイム触媒
合成のような、代替的なメカニズムに基づく方法（例えば、Illangasekare et
al. (1995) Science 267, 643-647; Lohse and Szostak (1996) Nature 381, 44
2-444; Hager et al. (1996) Chem. Biol. 3, 717-725を参照）とがあり、タン
パク質のリボザイム合成の場合、リボザイムは各段階で融合された核酸と同一で
あることができる。
【００２９】 特に価値があるのが、シャッフリング技術（例えば、Stemmer (1994) Nature
370, 389-391; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10757;
WO-A1-95/22625を参照）との関連における本発明によるＩＤＡ法である。ＩＤ Ａ法は塩基配列相同性のないＤＮＡ断片のシャッフリングを可能にする。塩基配
列固有シャッフリングとの組合わせで遺伝子量調節注入を行えば、生体分子の包
括的改造が可能になる。この技術は、タンパク質にも、官能性核酸および核酸類
似物にも適用可能である。これにより、一方では、多官能生体分子を所望の形態
に最適化し、適当な選択法により好ましくない官能性を除去することが可能にな
る。他方では、相互に接続された多官能分子が生じるように、異なる官能性およ
び構造を有する種々の生体分子を相互に融合させることも可能である。この新し
い方法の成果としては、多官能タンパク質、触媒核酸またはアプタメーレを考え
ることができる。
370, 389-391; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10757;
WO-A1-95/22625を参照）との関連における本発明によるＩＤＡ法である。ＩＤ Ａ法は塩基配列相同性のないＤＮＡ断片のシャッフリングを可能にする。塩基配
列固有シャッフリングとの組合わせで遺伝子量調節注入を行えば、生体分子の包
括的改造が可能になる。この技術は、タンパク質にも、官能性核酸および核酸類
似物にも適用可能である。これにより、一方では、多官能生体分子を所望の形態
に最適化し、適当な選択法により好ましくない官能性を除去することが可能にな
る。他方では、相互に接続された多官能分子が生じるように、異なる官能性およ
び構造を有する種々の生体分子を相互に融合させることも可能である。この新し
い方法の成果としては、多官能タンパク質、触媒核酸またはアプタメーレを考え
ることができる。
【００３０】 本発明による方法の可能な用途のこの例示は、ＩＤＡ法の大きな潜在的可能性
を明らかにしている。それだけに、この方法の実施が比較的簡単であることと、
そのために必要な成分が少数であることとが一層注目される。
を明らかにしている。それだけに、この方法の実施が比較的簡単であることと、
そのために必要な成分が少数であることとが一層注目される。
【００３１】 本発明によれば、ＩＤＡ反応は、下記の成分を含む、すなわち、ポリメラーゼ
活性を有する酵素、つまり、比較的小さな成分からの核酸分子の合成の触媒とな
る酵素と、対応する成分ないしモノマー、従って通常はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＰ（場合によっては変異形態）と、３’−端に１本鎖領域を
有する少なくとも１つのイニシエータ核酸と、少なくとも１つの線状テンプレー
ト核酸分子とを含む反応沈殿物中で進行する。この場合、線状テンプレートはイ
ニシエータ分子の２つの複製に基づくものとすることもできる。
活性を有する酵素、つまり、比較的小さな成分からの核酸分子の合成の触媒とな
る酵素と、対応する成分ないしモノマー、従って通常はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＰ（場合によっては変異形態）と、３’−端に１本鎖領域を
有する少なくとも１つのイニシエータ核酸と、少なくとも１つの線状テンプレー
ト核酸分子とを含む反応沈殿物中で進行する。この場合、線状テンプレートはイ
ニシエータ分子の２つの複製に基づくものとすることもできる。
【００３２】 それに対応して、典型的なＩＤＡ反応沈殿物は下記の成分を含んでいる。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １６．６ｍＭ ＮａＣｌ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ
、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 ０．４ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛肉血清アルブミン） ２０ μＭ イニシエータ核酸 ２０ ｎＭ テンプレート核酸 ０．２５ｍｇ／ｍｌ ポリメラーゼ、例えば、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素
（ｐ６６−およびｐ５１−サブユニットからのヘテロダイマー、両Ｎ末端基はヒ
スチジン標識を備える； Le Grice et al. (1995) Methods Enzymol. 262, 130-
144を参照） 通常、ポリメラーゼ活性を有する酵素は４０ｍｇ／ｍｌ〜１０-6ｍｇ／ｍｌの
濃度で使用される。好ましい実施態様によれば、酵素は４ｍｇ／ｍｌ〜１０-5ｍ
ｇ／ｍｌの最終濃度で使用され、しかも、０．４ｍｇ／ｍｌ〜０．００２ｍｇ／
ｍｌの最終濃度が特に好ましい。
、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 ０．４ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛肉血清アルブミン） ２０ μＭ イニシエータ核酸 ２０ ｎＭ テンプレート核酸 ０．２５ｍｇ／ｍｌ ポリメラーゼ、例えば、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素
（ｐ６６−およびｐ５１−サブユニットからのヘテロダイマー、両Ｎ末端基はヒ
スチジン標識を備える； Le Grice et al. (1995) Methods Enzymol. 262, 130-
144を参照） 通常、ポリメラーゼ活性を有する酵素は４０ｍｇ／ｍｌ〜１０-6ｍｇ／ｍｌの
濃度で使用される。好ましい実施態様によれば、酵素は４ｍｇ／ｍｌ〜１０-5ｍ
ｇ／ｍｌの最終濃度で使用され、しかも、０．４ｍｇ／ｍｌ〜０．００２ｍｇ／
ｍｌの最終濃度が特に好ましい。
【００３３】 本発明によれば、任意の１本鎖核酸、ないし３’−端に配置された１本鎖領域
を有する任意の核酸が、イニシエータとして使用される。一般的には、イニシエ
ータ核酸は少なくとも１つのヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、少なく
とも３つのヌクレオチドの長さを有するイニシエータ核酸が、特に好ましくは、
少なくとも１５のヌクレオチドの長さを有するイニシエータ核酸が使用される。
を有する任意の核酸が、イニシエータとして使用される。一般的には、イニシエ
ータ核酸は少なくとも１つのヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、少なく
とも３つのヌクレオチドの長さを有するイニシエータ核酸が、特に好ましくは、
少なくとも１５のヌクレオチドの長さを有するイニシエータ核酸が使用される。
【００３４】 通常は、イニシエータ核酸の最終濃度は０．２ｍＭ〜２ｐＭとすることができ
る。好ましい実施態様においては、イニシエータ核酸は０．２ｍＭ〜２０ｎＭの
最終濃度で、特に好ましくは２０μＭ〜２μの最終濃度で使用される。
る。好ましい実施態様においては、イニシエータ核酸は０．２ｍＭ〜２０ｎＭの
最終濃度で、特に好ましくは２０μＭ〜２μの最終濃度で使用される。
【００３５】 少なくとも１つの線状テンプレート分子は、本発明によれば、０．２ｍＭ〜た
った１つの分子の最終濃度で一定の容積単位が使用される。テンプレートの最終
濃度は好ましくは５μＭ〜２０ｐＭ、特に好ましくは２００ｎＭ〜２ｎＭである
。
った１つの分子の最終濃度で一定の容積単位が使用される。テンプレートの最終
濃度は好ましくは５μＭ〜２０ｐＭ、特に好ましくは２００ｎＭ〜２ｎＭである
。
【００３６】 一般的には、ポリメラーゼ活性を有するあらゆる酵素がＩＤＡ反応における使
用に適している。もちろん、特定のポリメラーゼを使用することにより、反応の
進行効率、各反応沈殿物中における最終濃度、特定の用途における特別な課題設
定、または反応沈殿物中に存在するその他の成分に関しては、相違ないし様々な
要件が出てくることがある。
用に適している。もちろん、特定のポリメラーゼを使用することにより、反応の
進行効率、各反応沈殿物中における最終濃度、特定の用途における特別な課題設
定、または反応沈殿物中に存在するその他の成分に関しては、相違ないし様々な
要件が出てくることがある。
【００３７】 好ましい実施態様においては、ポリメラーゼは、逆転写酵素、または、例えば
大腸菌からのＫｌｅｎｏｗ−Ｅｘｏ-のような、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー ゼ（Derbyshire et al. (1988) Science 240, 199-201）であり、特に好ましく はＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素であり、最も好ましくはヒスチジン標識を備えたＨＩＶ
−Ｉ逆転写酵素である。
大腸菌からのＫｌｅｎｏｗ−Ｅｘｏ-のような、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー ゼ（Derbyshire et al. (1988) Science 240, 199-201）であり、特に好ましく はＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素であり、最も好ましくはヒスチジン標識を備えたＨＩＶ
−Ｉ逆転写酵素である。
【００３８】 本発明によれば、ＩＤＡ反応は温度０℃〜１００℃で、場合によってはさらに
高い温度で行われる。好ましくは反応温度は２０℃〜５５℃であり、特に好まし
くは反応温度は３０℃〜４５℃である。例えばＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼのよ
うな、熱安定性ポリメラーゼを使用した場合は、反応温度は通常は少なくとも０
℃、好ましくは少なくとも５０℃である。
高い温度で行われる。好ましくは反応温度は２０℃〜５５℃であり、特に好まし
くは反応温度は３０℃〜４５℃である。例えばＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼのよ
うな、熱安定性ポリメラーゼを使用した場合は、反応温度は通常は少なくとも０
℃、好ましくは少なくとも５０℃である。
【００３９】 培養期間は、所望の反応生成物、ＩＤＡ反応の個別の用途ないし所望の増幅規
模に応じて決まることになる。
模に応じて決まることになる。
【００４０】 下記の実施例は発明を説明することだけを目的としたものである。実施例１ ： ２０ヌクレオチド長の２つのオリゴヌクレオチドが、５０μｌ反応沈殿物中に
おける濃度が２μＭで、濃度が異なるＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素により、４２℃で２
時間培養された。反応沈殿物は下記の成分を含んでいた。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０ ５ ｍＭ ＫＣｌ ５ ｍＭ ジチオスレイトール ２ ｍＭ スペルミジン １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 使用されたプライマは下記の塩基配列を有していた。 ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’ （Ｐ１ＣＡＴＣＨ、非ホスホリル化）および ５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＣＧ−３’ （Ｐ２ＣＡＴＣＨ、非ホスホリル化）。
おける濃度が２μＭで、濃度が異なるＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素により、４２℃で２
時間培養された。反応沈殿物は下記の成分を含んでいた。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０ ５ ｍＭ ＫＣｌ ５ ｍＭ ジチオスレイトール ２ ｍＭ スペルミジン １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 使用されたプライマは下記の塩基配列を有していた。 ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’ （Ｐ１ＣＡＴＣＨ、非ホスホリル化）および ５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＣＧ−３’ （Ｐ２ＣＡＴＣＨ、非ホスホリル化）。
【００４１】 ポリメラーゼとして、通常のタンパク質純粋化法（Protein Purification, Pr
incip.High Res. Meth. and Appl., Janson and Ryden, VCH Publishrers, New
York, 1989を参照）により準備されたヒスチジン標識を備えたＨＩＶ−Ｉ逆転写
酵素が使用された。この組換えＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素とその純粋化および特徴付
けについては、Le Grice et al. (1995) Methods Enzymol. 262, 130-144に詳細
に記載されている。
incip.High Res. Meth. and Appl., Janson and Ryden, VCH Publishrers, New
York, 1989を参照）により準備されたヒスチジン標識を備えたＨＩＶ−Ｉ逆転写
酵素が使用された。この組換えＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素とその純粋化および特徴付
けについては、Le Grice et al. (1995) Methods Enzymol. 262, 130-144に詳細
に記載されている。
【００４２】 両プライマの一方の量の１／２５が蛍光標識付き成分として添加された（プラ
イマ、Ｐ２ＣＡＴＣＨ、５’−端が色素ＩＲＤ−４１（MWG Biotec, Ebersberg ）と結合）。蛍光標識付き反応生成物の分析のために、Ｍｏｂｉｓｐｉｎ柱（MO
BITEC, Gottingen）により脱塩された全反応沈殿物の１／４がＬＩ−ＣＯＲ自動
塩基配列決定器の中の１０％変性ポリアクリルアミドゲル上で切断された。２本
鎖反応生成物の各２０塩基対の段階的延長の結果が図２に分子量ラダーとして示
されている。
イマ、Ｐ２ＣＡＴＣＨ、５’−端が色素ＩＲＤ−４１（MWG Biotec, Ebersberg ）と結合）。蛍光標識付き反応生成物の分析のために、Ｍｏｂｉｓｐｉｎ柱（MO
BITEC, Gottingen）により脱塩された全反応沈殿物の１／４がＬＩ−ＣＯＲ自動
塩基配列決定器の中の１０％変性ポリアクリルアミドゲル上で切断された。２本
鎖反応生成物の各２０塩基対の段階的延長の結果が図２に分子量ラダーとして示
されている。
【００４３】 パス１はＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素の最終濃度が０．４μｇ／μｌの反応沈殿物を
、パス２は最終濃度が０．１６μｇ／μｌの反応沈殿物を、パス３は最終濃度が
０．０４μｇ／μｌの反応沈殿物を、パス４は最終濃度が０．００８μｇ／μｌ
の反応沈殿物を示している。 塩基配列分析のために、反応生成物はサブクロー
ン化され、各クローンについて塩基配列決定が行われた。この分析により、生じ
た分子が、３’−端に関するプライマＰ２ＣＡＴＣＨの自己ハイブリダイゼーシ
ョンと後続の２本鎖への補充とにより生じた３３塩基長の中心エレメントと、両
プライマの多数の相互に融合された塩基配列とを含んでいることが明らかになっ
た。 初期の２本鎖形成がプライマのオリゴマー化にとっての不可欠の前提条件
であった。自己ハイブリダイゼーションを排除する塩基配列を有するプライマだ
けにより反応を起こした場合は、反応生成物は得られなかった。反応生成物を絶
対に不可欠な成分にまで連続的に減少させることにより、反応に対しては逆転写
酵素が触媒の役割を果たすことと、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰおよびｄＴＴＰ）の全てが存在する場合に限って反応が起こることとが明ら
かになった。
、パス２は最終濃度が０．１６μｇ／μｌの反応沈殿物を、パス３は最終濃度が
０．０４μｇ／μｌの反応沈殿物を、パス４は最終濃度が０．００８μｇ／μｌ
の反応沈殿物を示している。 塩基配列分析のために、反応生成物はサブクロー
ン化され、各クローンについて塩基配列決定が行われた。この分析により、生じ
た分子が、３’−端に関するプライマＰ２ＣＡＴＣＨの自己ハイブリダイゼーシ
ョンと後続の２本鎖への補充とにより生じた３３塩基長の中心エレメントと、両
プライマの多数の相互に融合された塩基配列とを含んでいることが明らかになっ
た。 初期の２本鎖形成がプライマのオリゴマー化にとっての不可欠の前提条件
であった。自己ハイブリダイゼーションを排除する塩基配列を有するプライマだ
けにより反応を起こした場合は、反応生成物は得られなかった。反応生成物を絶
対に不可欠な成分にまで連続的に減少させることにより、反応に対しては逆転写
酵素が触媒の役割を果たすことと、４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰおよびｄＴＴＰ）の全てが存在する場合に限って反応が起こることとが明ら
かになった。
【００４４】 下記の実験において確認することができたのは、逆転写酵素だけではなく、そ
の他の公知のポリメラーゼもＩＤＡ反応に対して触媒の役割を果たすということ
であった。実施例２ ： テンプレートの両５’−端の一方との相同性を有するイニシエータに基づく２
本鎖テンプレートの反復複製。 １０６塩基対長の２本鎖ＤＮＡテンプレート（ＳＰ６ＣＡＴＣＨ）が、５０μ
ｌ反応沈殿物中における最終濃度が２０ｎＭで、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素（最終濃
度０．４μｇ／μｌ）と、テンプレートの両５’−端の一方との相同性を有する
２０塩基長の１本鎖イニシエータ（Ｐ１ＣＡＴＣＨ、最終濃度５μｍ）とにより
、４２℃で２時間培養された。反応沈殿物はさらに下記の成分を含んでいた。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １６．６ｍＭ ＮａＣｌ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 ０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛肉血清アルブミン） 使用されたテンプレートおよび使用されたイニシエータは下記の塩基配列を有
していた。 イニシエータ： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’ （Ｐ１ＣＡＴＣＨ、非ホスホリル化、ＰｓｔＩ−識別塩基配列
には下線） テンプレート： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＧＧ−３’ （ＳＰ６ＣＡＴＣＨ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ−識別塩基配
列には下線）。
の他の公知のポリメラーゼもＩＤＡ反応に対して触媒の役割を果たすということ
であった。実施例２ ： テンプレートの両５’−端の一方との相同性を有するイニシエータに基づく２
本鎖テンプレートの反復複製。 １０６塩基対長の２本鎖ＤＮＡテンプレート（ＳＰ６ＣＡＴＣＨ）が、５０μ
ｌ反応沈殿物中における最終濃度が２０ｎＭで、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素（最終濃
度０．４μｇ／μｌ）と、テンプレートの両５’−端の一方との相同性を有する
２０塩基長の１本鎖イニシエータ（Ｐ１ＣＡＴＣＨ、最終濃度５μｍ）とにより
、４２℃で２時間培養された。反応沈殿物はさらに下記の成分を含んでいた。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １６．６ｍＭ ＮａＣｌ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 ０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛肉血清アルブミン） 使用されたテンプレートおよび使用されたイニシエータは下記の塩基配列を有
していた。 イニシエータ： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’ （Ｐ１ＣＡＴＣＨ、非ホスホリル化、ＰｓｔＩ−識別塩基配列
には下線） テンプレート： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＧＧ−３’ （ＳＰ６ＣＡＴＣＨ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ−識別塩基配
列には下線）。
【００４５】 反応の過程で、テンプレートおよびイニシエータの３’−端に基づいて、イニ
シエータ複製の数個分のテンプレートの段階的延長および純増幅を伴う反復複製
過程が行われた。 反応生成物はＭｏｂｉｓｐｉｎ柱により脱塩され、ゲル電気
泳動により分析された（図３）。全反応沈殿物の各１／１０が、直接に（パス７
）、または制限酵素ＥｃｏＲＩ（パス６）、ＰｓｔＩ（パス５）またはＰｓｔＩ
およびＥｃｏＲＩ（パス４）による処理の後に、３％アガロースゲル上で切断さ
れた。パス１は１．５μｇの１００塩基対分子量ラダー（MBI Fermentas、リト アニア）を示している。関連横じまの大きさは欄外に示されている。パス２およ
び３には、量が１ｐｍｏｌないし０．２ｐｍｏｌの初期テンプレート（パス４〜
７の初期テンプレートの量に対応）が塗布された。
シエータ複製の数個分のテンプレートの段階的延長および純増幅を伴う反復複製
過程が行われた。 反応生成物はＭｏｂｉｓｐｉｎ柱により脱塩され、ゲル電気
泳動により分析された（図３）。全反応沈殿物の各１／１０が、直接に（パス７
）、または制限酵素ＥｃｏＲＩ（パス６）、ＰｓｔＩ（パス５）またはＰｓｔＩ
およびＥｃｏＲＩ（パス４）による処理の後に、３％アガロースゲル上で切断さ
れた。パス１は１．５μｇの１００塩基対分子量ラダー（MBI Fermentas、リト アニア）を示している。関連横じまの大きさは欄外に示されている。パス２およ
び３には、量が１ｐｍｏｌないし０．２ｐｍｏｌの初期テンプレート（パス４〜
７の初期テンプレートの量に対応）が塗布された。
【００４６】 反応の結果、反応生成物は初期テンプレート長よりも上方の大きな分子量範囲
にわたって分布している（パス７）。テンプレートの一端の近くにその識別塩基
配列が配置されているＥｃｏＲｉによる制限消化により、反応生成物の異種性が
除去されることはないが、しかしながらその長さが短縮する。イニシエータの５
’−端の近くにも、テンプレートの他端の近くにもその識別塩基配列が配置され
ているＰｓｔＩによる切断は、初期テンプレートよりも数塩基分だけ延長された
生成物を表す優勢な特定の横じまをもたらす。両制限酵素による処理は、初期テ
ンプレートよりも数塩基分だけ短縮された生成物をもたらす。 データは、反応
の過程でイニシエータのいくつかの複製がテンプレートの両側により融合させら
れたという仮定を裏付けるものになっている。
にわたって分布している（パス７）。テンプレートの一端の近くにその識別塩基
配列が配置されているＥｃｏＲｉによる制限消化により、反応生成物の異種性が
除去されることはないが、しかしながらその長さが短縮する。イニシエータの５
’−端の近くにも、テンプレートの他端の近くにもその識別塩基配列が配置され
ているＰｓｔＩによる切断は、初期テンプレートよりも数塩基分だけ延長された
生成物を表す優勢な特定の横じまをもたらす。両制限酵素による処理は、初期テ
ンプレートよりも数塩基分だけ短縮された生成物をもたらす。 データは、反応
の過程でイニシエータのいくつかの複製がテンプレートの両側により融合させら
れたという仮定を裏付けるものになっている。
【００４７】 ＥｃｏＲＩ処理により、テンプレートの片側で融合させられたイニシエータだ
けが除去され、その結果、生成物については、同時に短縮を伴いつつ、その異種
性が維持される。ＰｓｔＩによる制限消化の結果、テンプレートのＰｓｔＩ側で
は、テンプレート塩基配列の４つの塩基とそれらと融合させられた全てのイニシ
エータとが除去される。テンプレートのＥｃｏＲＩ側では、テンプレート塩基配
列に加えて、４塩基分だけ短縮されたイニシエータ塩基配列が保持されている。
イニシエータが直接に、すなわち、テンプレート塩基配列との重なり合いなしで
融合させられたという仮定の下で、１１８塩基長を有する生成物が予想される。 ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによる反応生成物の切断により、テンプレートの両
側で、テンプレートの各４つの塩基と、それらと融合させられた全てのイニシエ
ータが除去される。得られる生成物の予想長さは９８塩基長である。
けが除去され、その結果、生成物については、同時に短縮を伴いつつ、その異種
性が維持される。ＰｓｔＩによる制限消化の結果、テンプレートのＰｓｔＩ側で
は、テンプレート塩基配列の４つの塩基とそれらと融合させられた全てのイニシ
エータとが除去される。テンプレートのＥｃｏＲＩ側では、テンプレート塩基配
列に加えて、４塩基分だけ短縮されたイニシエータ塩基配列が保持されている。
イニシエータが直接に、すなわち、テンプレート塩基配列との重なり合いなしで
融合させられたという仮定の下で、１１８塩基長を有する生成物が予想される。 ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによる反応生成物の切断により、テンプレートの両
側で、テンプレートの各４つの塩基と、それらと融合させられた全てのイニシエ
ータが除去される。得られる生成物の予想長さは９８塩基長である。
【００４８】 反応生成物のクローン化とその後の塩基配列分析により、テンプレートの両端
におけるテンプレートとイニシエータ塩基配列との大部分に重なり合いのない直
接融合を確認することができ、しかも、若干の場合には、少数の塩基の挿入ない
し欠失が発見された。反応の過程でのテンプレートの純増幅はパス３と４との比
較により明らかになる。
におけるテンプレートとイニシエータ塩基配列との大部分に重なり合いのない直
接融合を確認することができ、しかも、若干の場合には、少数の塩基の挿入ない
し欠失が発見された。反応の過程でのテンプレートの純増幅はパス３と４との比
較により明らかになる。
【００４９】実施例３ ： テンプレートとの相同性のないイニシエータに基づく２本鎖テンプレートの反
復複製。 １０６塩基対長の２本鎖ＤＮＡテンプレート（ＳＰ６ＣＡＴＣＨ）が、５０μ
ｌ反応沈殿物中における最終濃度が２０ｎＭで、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素（最終濃
度０．４μｇ／μｌ）と、テンプレートの両５’−端のいずれとも相同性のない
３５塩基長の１本鎖イニシエータ（ＬＯＯＰ、最終濃度２０μｍ）とにより、４
２℃で２時間培養された。反応沈殿物はさらに下記の成分を含んでいた。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １６．６ｍＭ ＮａＣｌ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 ０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛肉血清アルブミン） 使用されたテンプレートおよび使用されたイニシエータは下記の塩基配列を有
していた。 イニシエータ： ５’−ＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴ−３’ （ＬＯＯＰ、非ホスホリル化） テンプレート： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＧＧ−３’ （ＳＰ６ＣＡＴＣＨ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ−識別塩基配
列には下線）。 反応の過程で、テンプレートおよびイニシエータの３’−端に
基づいて、イニシエータ複製の数個分のテンプレートの段階的延長および純増幅
を伴う反復複製過程が行われた。 反応生成物はＭｏｂｉｓｐｉｎ柱により脱塩
され、ゲル電気泳動により分析された（図４）。全反応沈殿物の各１／１０が、
直接に（パス４）、または制限酵素ＥｃｏＲＩ（パス６）、ＰｓｔＩ（パス５）
またはＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ（パス７）による処理の後に、３％臭化エチジ
ウム染色アガロースゲル上で切断された。パス１は１．５μｇの１００塩基対分
子量ラダー（MBI Fermentas、リトアニア）を示している。関連横じまの大きさ は欄外に示されている。パス２および３には、量が１ｐｍｏｌないし０．２ｐｍ
ｏｌの初期テンプレート（パス４〜７の初期テンプレートの量に対応）が塗布さ
れた。
復複製。 １０６塩基対長の２本鎖ＤＮＡテンプレート（ＳＰ６ＣＡＴＣＨ）が、５０μ
ｌ反応沈殿物中における最終濃度が２０ｎＭで、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素（最終濃
度０．４μｇ／μｌ）と、テンプレートの両５’−端のいずれとも相同性のない
３５塩基長の１本鎖イニシエータ（ＬＯＯＰ、最終濃度２０μｍ）とにより、４
２℃で２時間培養された。反応沈殿物はさらに下記の成分を含んでいた。 ４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ2 １６．６ｍＭ ＮａＣｌ １ ｍＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 ０．４ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛肉血清アルブミン） 使用されたテンプレートおよび使用されたイニシエータは下記の塩基配列を有
していた。 イニシエータ： ５’−ＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴ−３’ （ＬＯＯＰ、非ホスホリル化） テンプレート： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＧＧ−３’ （ＳＰ６ＣＡＴＣＨ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ−識別塩基配
列には下線）。 反応の過程で、テンプレートおよびイニシエータの３’−端に
基づいて、イニシエータ複製の数個分のテンプレートの段階的延長および純増幅
を伴う反復複製過程が行われた。 反応生成物はＭｏｂｉｓｐｉｎ柱により脱塩
され、ゲル電気泳動により分析された（図４）。全反応沈殿物の各１／１０が、
直接に（パス４）、または制限酵素ＥｃｏＲＩ（パス６）、ＰｓｔＩ（パス５）
またはＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ（パス７）による処理の後に、３％臭化エチジ
ウム染色アガロースゲル上で切断された。パス１は１．５μｇの１００塩基対分
子量ラダー（MBI Fermentas、リトアニア）を示している。関連横じまの大きさ は欄外に示されている。パス２および３には、量が１ｐｍｏｌないし０．２ｐｍ
ｏｌの初期テンプレート（パス４〜７の初期テンプレートの量に対応）が塗布さ
れた。
【００５０】 反応の結果、反応生成物は初期テンプレート長よりも上方の大きな分子量範囲
にわたって分布している（パス４）。テンプレートの両端の一方の近くにその識
別塩基配列が配置されているＥｃｏＲｉないしＰｓｔＩだけによる処理により、
反応生成物の異種性が除去されることはないが、しかしながらその長さが短縮す
る（パス６ないし５）。両制限酵素による処理は、初期テンプレートよりも数塩
基分だけ短縮された生成物をもたらす。
にわたって分布している（パス４）。テンプレートの両端の一方の近くにその識
別塩基配列が配置されているＥｃｏＲｉないしＰｓｔＩだけによる処理により、
反応生成物の異種性が除去されることはないが、しかしながらその長さが短縮す
る（パス６ないし５）。両制限酵素による処理は、初期テンプレートよりも数塩
基分だけ短縮された生成物をもたらす。
【００５１】 データは、反応の過程でイニシエータのいくつかの複製がテンプレートの両側
により融合させられたという仮定を裏付けるものになっている。
により融合させられたという仮定を裏付けるものになっている。
【００５２】 ＥｃｏＲＩないしＰｓｔＩ処理だけにより、テンプレートの片側で融合させら
れたイニシエータだけが除去され、その結果、生成物については、同時に短縮を
伴いつつ、その異種性が維持される。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによる反応生成
物の制限消化により、テンプレートの両側で、テンプレートの各４つの塩基と、
それらと融合させられた全てのイニシエータが除去される。得られる生成物の予
想長さは９８塩基長である。
れたイニシエータだけが除去され、その結果、生成物については、同時に短縮を
伴いつつ、その異種性が維持される。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによる反応生成
物の制限消化により、テンプレートの両側で、テンプレートの各４つの塩基と、
それらと融合させられた全てのイニシエータが除去される。得られる生成物の予
想長さは９８塩基長である。
【００５３】 反応生成物のクローン化とその後の塩基配列分析により、テンプレートの両端
におけるテンプレートとイニシエータ塩基配列との大部分に重なり合いのない直
接融合を確認することができ、しかも、若干の場合には、少数の塩基の挿入ない
し欠失が発見された。特に度々発見されたのが、クローン化後のイニシエータ塩
基配列の内部での突然変異であった。反応の過程でのテンプレートの純増幅はパ
ス３と４との比較により明らかになる。
におけるテンプレートとイニシエータ塩基配列との大部分に重なり合いのない直
接融合を確認することができ、しかも、若干の場合には、少数の塩基の挿入ない
し欠失が発見された。特に度々発見されたのが、クローン化後のイニシエータ塩
基配列の内部での突然変異であった。反応の過程でのテンプレートの純増幅はパ
ス３と４との比較により明らかになる。
【００５４】例４ ： ＩＤＡ反応を従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組合わせることにより
、ＰＣＲにおけるテンプレートを、テンプレートとの相同性のないプライマによ
り増幅することが可能になる。 １０６塩基対長の２本鎖ＤＮＡテンプレート（ＳＰ６ＣＡＴＣＨ）が、５０μ
ｌ反応沈殿物中における最終濃度が２０ｎＭで、量の異なるＨＩＶ−Ｉ逆転写酵
素と、テンプレートの両５’−端のいずれとも相同性のない３５塩基長の１本鎖
イニシエータ（ＬＯＯＰ、最終濃度１０μｍ）とにより、４２℃で１０分間培養
された。反応沈殿物はさらに下記の成分を含んでいた。 ４ × Ｔａｑ−緩衝液（Promega, Madison, WI, USA） ２ ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２００ μＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各２００μＭのｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 その後に、２．５単位のＴａｑ−ポリメラーゼ（Promega）が添加され、反応 沈殿物に４０μｌの鉱物油が積層された。沈殿物はサーモサイクラーの中で２０
サイクルにわたり下記の温度範囲で培養された。
、ＰＣＲにおけるテンプレートを、テンプレートとの相同性のないプライマによ
り増幅することが可能になる。 １０６塩基対長の２本鎖ＤＮＡテンプレート（ＳＰ６ＣＡＴＣＨ）が、５０μ
ｌ反応沈殿物中における最終濃度が２０ｎＭで、量の異なるＨＩＶ−Ｉ逆転写酵
素と、テンプレートの両５’−端のいずれとも相同性のない３５塩基長の１本鎖
イニシエータ（ＬＯＯＰ、最終濃度１０μｍ）とにより、４２℃で１０分間培養
された。反応沈殿物はさらに下記の成分を含んでいた。 ４ × Ｔａｑ−緩衝液（Promega, Madison, WI, USA） ２ ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２００ μＭ ｄＮＴＰ、すなわち、各２００μＭのｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの混合物 その後に、２．５単位のＴａｑ−ポリメラーゼ（Promega）が添加され、反応 沈殿物に４０μｌの鉱物油が積層された。沈殿物はサーモサイクラーの中で２０
サイクルにわたり下記の温度範囲で培養された。
【００５５】 第１サイクル： ５分 ９５℃、１分 ４５℃、１分 ７２℃ 第２〜第２０サイクル： １分 ９５℃、１分 ４５℃、１分 ７２℃ 使用されたテンプレートおよび使用されたイニシエータは下記の塩基配
列を有していた。 イニシエータ： ５’−ＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴ−３’ （ＬＯＯＰ、非ホスホリル化） テンプレート： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＧＧ−３’ （ＳＰ６ＣＡＴＣＨ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ−識別塩基配
列には下線）。 反応の終了後に、反応沈殿物の１／１０が分析のために３％アガロースゲル上
で切断された（図５）。
列を有していた。 イニシエータ： ５’−ＧＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＴ
ＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴ−３’ （ＬＯＯＰ、非ホスホリル化） テンプレート： ５’−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴ
ＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＴＣ ＡＧＧ−３’ （ＳＰ６ＣＡＴＣＨ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ−識別塩基配
列には下線）。 反応の終了後に、反応沈殿物の１／１０が分析のために３％アガロースゲル上
で切断された（図５）。
【００５６】 図５は、添加された逆転写酵素の量だけが異なる並行実験の反応生成物を示し
たものである。この量は、最終濃度０．４μｇ／μｌ（パス２）、最終濃度０．
１２μｇ／μｌ（パス３）、最終濃度０．０４μｇ／μｌ（パス４）、最終濃度
０．０１２μｇ／μｌ（パス５）、最終濃度０．００４μｇ／μｌ（パス６）、
最終濃度０．００１２μｇ／μｌ（パス７）、およびＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素の添
加（パス８）であった。
たものである。この量は、最終濃度０．４μｇ／μｌ（パス２）、最終濃度０．
１２μｇ／μｌ（パス３）、最終濃度０．０４μｇ／μｌ（パス４）、最終濃度
０．０１２μｇ／μｌ（パス５）、最終濃度０．００４μｇ／μｌ（パス６）、
最終濃度０．００１２μｇ／μｌ（パス７）、およびＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素の添
加（パス８）であった。
【００５７】 ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素による予備培養の後に、ＰＣＲの過程で、テンプレート
の長さとイニシエータの長さの２倍との合計（約１７６塩基長）に相当する長さ
を有する断片が増幅される。この生成物の増幅は、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素の濃度
が中程度（パス４〜６）の場合に特に効率的である。ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素を使
用しないテンプレートの予備培養はテンプレートを変化させることはなく、ＰＣ
Ｒの過程でその増幅は行われない（パス８）。 反応生成物には制限酵素による
処理による特徴付けが行われた。それぞれ両端の一方に配置された識別塩基配列
を有するＥｃｏＲＩないしＰｓｔＩだけによる反応生成物の切断の場合は、両イ
ニシエータの一方と、テンプレートの４つの追加塩基とが除去され、反応生成物
が約３９塩基分だけ短縮されることになる。両酵素による反応生成物の切断の場
合は、両イニシエータと、テンプレートの８つの追加塩基とが除去され、反応生
成物が約７８塩基分だけ短縮されることになる。 さらなる分析のために、反応生成物はクローン化され、塩基配列決定された。
塩基配列分析により、反応の過程でテンプレートの両端においてテンプレートと
イニシエータ塩基配列との大部分に重なり合いのない直接融合が起こることが確
認され、しかも、若干の場合には、少数の塩基の挿入ないし欠失が発見された。
の長さとイニシエータの長さの２倍との合計（約１７６塩基長）に相当する長さ
を有する断片が増幅される。この生成物の増幅は、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素の濃度
が中程度（パス４〜６）の場合に特に効率的である。ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素を使
用しないテンプレートの予備培養はテンプレートを変化させることはなく、ＰＣ
Ｒの過程でその増幅は行われない（パス８）。 反応生成物には制限酵素による
処理による特徴付けが行われた。それぞれ両端の一方に配置された識別塩基配列
を有するＥｃｏＲＩないしＰｓｔＩだけによる反応生成物の切断の場合は、両イ
ニシエータの一方と、テンプレートの４つの追加塩基とが除去され、反応生成物
が約３９塩基分だけ短縮されることになる。両酵素による反応生成物の切断の場
合は、両イニシエータと、テンプレートの８つの追加塩基とが除去され、反応生
成物が約７８塩基分だけ短縮されることになる。 さらなる分析のために、反応生成物はクローン化され、塩基配列決定された。
塩基配列分析により、反応の過程でテンプレートの両端においてテンプレートと
イニシエータ塩基配列との大部分に重なり合いのない直接融合が起こることが確
認され、しかも、若干の場合には、少数の塩基の挿入ないし欠失が発見された。
【００５８】例５ ： 例１の場合と同様に、同じ反応条件の下で反応が行われたが、ただし、ＨＩＶ
−Ｉ逆転写酵素の代わりに、０．２５単位／μｌの大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大きな断片のエキソヌクレアーゼ欠失変異体（Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ-； De
rbishire et al. (1988) Science 240, 199-201; New England Biolabs, Schwal
bach）が使用された。結果として、ＩＤＡ反応に内在する反応メカニズムをうか
がわせる類似のプライマラダーが得られた。 使用された核酸分子との関連で、例えば Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, New York に記載されているような通常の分子 生物学標準法（塩基配列決定、制限消化、ゲル電気泳動、その他）が使用された
。タンパク質化学法との関連で、例えば、使用される酵素の純粋化に関しては、
Manual Protein Purification, Princip. High Res. Meth. and Appl., Janson
and Ryden, VCH Publishrers, New York, 1989 を参照されたい。制限酵素（MBI
Fermentas、リトアニア）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Promega）等の使用はメー カーの指示に従って行われた。
−Ｉ逆転写酵素の代わりに、０．２５単位／μｌの大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大きな断片のエキソヌクレアーゼ欠失変異体（Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ-； De
rbishire et al. (1988) Science 240, 199-201; New England Biolabs, Schwal
bach）が使用された。結果として、ＩＤＡ反応に内在する反応メカニズムをうか
がわせる類似のプライマラダーが得られた。 使用された核酸分子との関連で、例えば Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, New York に記載されているような通常の分子 生物学標準法（塩基配列決定、制限消化、ゲル電気泳動、その他）が使用された
。タンパク質化学法との関連で、例えば、使用される酵素の純粋化に関しては、
Manual Protein Purification, Princip. High Res. Meth. and Appl., Janson
and Ryden, VCH Publishrers, New York, 1989 を参照されたい。制限酵素（MBI
Fermentas、リトアニア）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Promega）等の使用はメー カーの指示に従って行われた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 エーリヒト ラルフ ドイツ連邦共和国 デー09306 ロッホリ ッツ オーベル リンデンベルクシュトラ ーセ 40
Claims (37)
- 【請求項１】 核酸を合成および場合によっては増幅する方法において、ハ
イブリダイゼーションには依存しておらず、少なくとも最小限３’端が１本鎖で
ある核酸により開始されるポリメラーゼ触媒反応という特徴を有する方法。 - 【請求項２】 最小限３’端が１本鎖であるイニシエータ核酸が鋳型塩基配
列に依存して延長されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 最小限部分的に２本鎖の鋳型核酸の少なくとも１つの鎖がイ
ニシエータ核酸の自由３’−ＯＨに基づいて複製されることを特徴とする請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 最小限部分的に２本鎖の鋳型核酸の少なくとも１つの鎖がイ
ニシエータ核酸に依存して延長されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 少なくとも最小限３’端に１本鎖領域を有するイニシエータ
核酸が最小限部分的に２本鎖の鋳型核酸の自由３’−ＯＨに基づいて複製される
ことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。 - 【請求項６】 その反応生成物が核酸分子を含み、核酸分子の塩基配列が少
なくともイニシエータ核酸塩基配列分だけ延長された鋳型核酸に対応しているこ
とを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 イニシエータ核酸の最終濃度が０．２ｍＭ〜２ｐＭであるこ
とを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 イニシエータ核酸の最終濃度が０．２ｍＭ〜２０ｎＭである
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 複製すべき鋳型核酸の最終濃度が０．２ｍＭ〜たった１つの
分子であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】 複製すべき鋳型核酸の最終濃度が５μＭ〜２０ｐＭである
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素の最終濃
度が４０ｍｇ／ｍｌ〜１０-6ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜１０
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 ポリメラーゼ活性を有する酵素の最終濃度が４ｍｇ／ｍｌ
〜１０-5ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ポリメラーゼ活性を有する酵素が逆転写酵素であることを
特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 逆転写酵素がＨＩＶ−Ｉ−逆転写酵素であることを特徴と
する請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＨＩＶ−Ｉ−逆転写酵素がヒスチジン標識を備えているこ
とを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 ポリメラーゼ活性を有する酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１７】 ＤＮＡポリメラーゼが大腸菌からのKlenow Exo-であるこ
とを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 ポリメラーゼ触媒反応が等温性であることを特徴とする請
求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】 反応中の鋳型核酸の連続的な延長が、鋳型核酸の５’端を
再生する活性を有するリストリクターゼの添加により妨げられることを特徴とす
る請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２０】 少なくとも１つのイニシエータ核酸がリボ核酸であること
を特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２１】 ＲＮＡイニシエータが２本鎖への補充の後に少なくとも部
分的にリボヌクレアーゼにより分解されることを特徴とする請求項２０に記載の
方法。 - 【請求項２２】 少なくとも１つのイニシエータ核酸が核酸類似物であるこ
とを特徴とする請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２３】 核酸類似物がペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴と
する請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 鋳型核酸の混合物が複製され、場合によっては増幅される
ことを特徴とする請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２５】 イニシエータ核酸の混合物が使用されることを特徴とする
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２６】 請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法がＰＣＲ反応
または別のプライマ依存性増幅反応に前置されていることを特徴とする核酸の増
幅方法。 - 【請求項２７】 核酸分子が塩基配列相補なしで相互に融合させられること
を特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２８】 １本鎖核酸が基本鋳型の役割を果たし、ハイブリダイゼー
ション非依存性反応段階に先行して、鋳型の３’端を相補するイニシエータ核酸
の鋳型へのハイブリダイゼーションと２本鎖のポリメラーゼ触媒補充とが行われ
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法を含む、同時に増幅を行いつつＲ
ＮＡを２本鎖ＤＮＡに書換える方法。 - 【請求項３０】 請求項１に記載の方法を含む、核酸を塩基配列不特有融合
させる方法。 - 【請求項３１】 請求項１に記載の方法を含む、塩基配列相同性のないＤＮ
Ａをシャッフルする方法。 - 【請求項３２】 請求項１に記載の方法を含む、長いランダムＤＮＡを製造
する方法。 - 【請求項３３】 請求項１に記載の方法を含む、任意の塩基配列のオリゴヌ
クレオチドを酵素合成する方法。 - 【請求項３４】 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法により製造さ
れる核酸分子。 - 【請求項３５】 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法により生じる
中間生成物。 - 【請求項３６】 少なくとも１つの核酸とポリメラーゼ活性を有する少なく
とも１つの酵素との錯体を含むことを特徴とする請求項３５に記載の中間生成物
。 - 【請求項３７】 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法を使用して製
造されたタンパク質分子、ならびに対応する遺伝子。
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|---|---|---|---|
| DE19741714A DE19741714C2 (de) | 1997-09-22 | 1997-09-22 | Verfahren zur Synthese und Amplifikation von Nukleinsäuren |
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| PCT/EP1998/006006 WO1999015698A2 (de) | 1997-09-22 | 1998-09-21 | Verfahren zur synthese und amplifikation von nukleinsäuren |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001517458A true JP2001517458A (ja) | 2001-10-09 |
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ID=7843182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000512986A Pending JP2001517458A (ja) | 1997-09-22 | 1998-09-21 | 核酸を合成および増幅する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2001517458A (ja) |
| AT (1) | ATE476519T1 (ja) |
| AU (1) | AU9745298A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004107244A1 (ja) * | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Olympus Corporation | 核酸分子を使用した情報処理方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN100379699C (zh) | 2002-05-03 | 2008-04-09 | Ppg工业俄亥俄公司 | 用于绝缘玻璃块体的具有热控制镀层的基材 |
| DE102004029051C5 (de) * | 2004-06-11 | 2011-09-15 | Schunk Gmbh & Co. Kg Spann- Und Greiftechnik | Befestigungseinrichtung zur Befestigung einer Aufsatzbacke an einer beweglich gelagerten Grundbacke eines Linear- oder Zentrischgreifers und Linear- oder Zentrischgreifer |
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|---|---|---|---|---|
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| DE4428651C1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-29 | Inst Molekulare Biotechnologie | Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von Nukleinsäuren |
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| US5962271A (en) * | 1996-01-03 | 1999-10-05 | Cloutech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end |
| WO1997035026A1 (en) * | 1996-03-18 | 1997-09-25 | Molecular Biology Resources, Inc. | Target nucleic acid sequence amplification |
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- 1997-09-22 DE DE19741714A patent/DE19741714C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-09-21 DE DE59814461T patent/DE59814461D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1998-09-21 EP EP98951443A patent/EP1015640B1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1998-09-21 AT AT98951443T patent/ATE476519T1/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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