JP2000083668A - 複数の鋳型一本鎖ｄｎａを使用した長鎖二本鎖ｄｎａの合成方法 - Google Patents
複数の鋳型一本鎖ｄｎａを使用した長鎖二本鎖ｄｎａの合成方法Info
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- JP2000083668A JP2000083668A JP10267227A JP26722798A JP2000083668A JP 2000083668 A JP2000083668 A JP 2000083668A JP 10267227 A JP10267227 A JP 10267227A JP 26722798 A JP26722798 A JP 26722798A JP 2000083668 A JP2000083668 A JP 2000083668A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 複数種の鋳型一本鎖ＤＮＡを使用して長鎖二
本鎖ＤＮＡを合成する方法の提供。 【解決手段】 本発明の合成方法により、３′−末端側
同士又は５′−末端側同士の少なくとも一方において相
補的な結合領域を有し、かつ、上記結合領域においてア
ニールして連続的に連結して上記二本鎖ＤＮＡの塩基配
列の全体を構成することができる複数種の鋳型β−本鎖
ＤＮＡに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて、目的とす
る長鎖二本鎖ＤＮＡを、簡易かつ、迅速に合成すること
ができる。
本鎖ＤＮＡを合成する方法の提供。 【解決手段】 本発明の合成方法により、３′−末端側
同士又は５′−末端側同士の少なくとも一方において相
補的な結合領域を有し、かつ、上記結合領域においてア
ニールして連続的に連結して上記二本鎖ＤＮＡの塩基配
列の全体を構成することができる複数種の鋳型β−本鎖
ＤＮＡに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて、目的とす
る長鎖二本鎖ＤＮＡを、簡易かつ、迅速に合成すること
ができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリメラーゼ連鎖
反応を利用した、複数種の鋳型一本鎖ＤＮＡを使用し
た、非天然塩基配列を含む長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法
に関する。上記鋳型一本鎖ＤＮＡは、天然物からの単離
又は化学合成により調製することができるので、本発明
に係る合成方法により、複数種のかかる鋳型一本鎖ＤＮ
Ａを使用して、天然に存在しない長鎖二本鎖ＤＮＡを合
成し、そのＤＮＡを用いて新規なポリペプチド又はタン
パク質を創製することができる。従って、本発明は、生
理又は薬理活性を有する有用な新規なポリペプチド又は
タンパク質の探索において有用な手段を提供する。
反応を利用した、複数種の鋳型一本鎖ＤＮＡを使用し
た、非天然塩基配列を含む長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法
に関する。上記鋳型一本鎖ＤＮＡは、天然物からの単離
又は化学合成により調製することができるので、本発明
に係る合成方法により、複数種のかかる鋳型一本鎖ＤＮ
Ａを使用して、天然に存在しない長鎖二本鎖ＤＮＡを合
成し、そのＤＮＡを用いて新規なポリペプチド又はタン
パク質を創製することができる。従って、本発明は、生
理又は薬理活性を有する有用な新規なポリペプチド又は
タンパク質の探索において有用な手段を提供する。
【０００２】
【従来の技術】現在、ＤＮＡを合成する方法は、少なく
とも２種類存在する。それは、ＤＮＡ合成酵素を用いる
方法と、ＤＮＡを化学的に合成する方法である。ＤＮＡ
合成酵素を用いる方法は、短い一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ
から成るプライマー及び一本鎖ＤＮＡの鋳型が必要であ
る。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）〔サイキら、
サイエンス、第２３９巻、第４８７〜４９１頁、（１９
８８）〕が開発されており、最近では、４万bp（塩基
対）程度までの増幅が可能になっている。ＰＣＲ法にお
いて、その鋳型ＤＮＡが天然物由来である場合には、増
幅すべき鋳型ＤＮＡの調製は比較的容易である。すなわ
ち、天然ＤＮＡの制限酵素による切断及び再連結によっ
て目的とする鋳型ＤＮＡを合成することができる。一
方、増幅すべき鋳型ＤＮＡが非天然のＤＮＡを含む場
合、すなわち、その天然ＤＮＡの一部が合成ＤＮＡで置
換されたものである場合、その天然ＤＮＡにプロモータ
ー等の他のユニットが結合されたものである場合、又は
その全てが合成ＤＮＡである場合等には、一定の合成Ｄ
ＮＡを化学的に事前に合成して、これらを、何らかの手
段で互いに又は天然ＤＮＡに結合させて増幅すべき鋳型
ＤＮＡを調製する必要がある。
とも２種類存在する。それは、ＤＮＡ合成酵素を用いる
方法と、ＤＮＡを化学的に合成する方法である。ＤＮＡ
合成酵素を用いる方法は、短い一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ
から成るプライマー及び一本鎖ＤＮＡの鋳型が必要であ
る。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）〔サイキら、
サイエンス、第２３９巻、第４８７〜４９１頁、（１９
８８）〕が開発されており、最近では、４万bp（塩基
対）程度までの増幅が可能になっている。ＰＣＲ法にお
いて、その鋳型ＤＮＡが天然物由来である場合には、増
幅すべき鋳型ＤＮＡの調製は比較的容易である。すなわ
ち、天然ＤＮＡの制限酵素による切断及び再連結によっ
て目的とする鋳型ＤＮＡを合成することができる。一
方、増幅すべき鋳型ＤＮＡが非天然のＤＮＡを含む場
合、すなわち、その天然ＤＮＡの一部が合成ＤＮＡで置
換されたものである場合、その天然ＤＮＡにプロモータ
ー等の他のユニットが結合されたものである場合、又は
その全てが合成ＤＮＡである場合等には、一定の合成Ｄ
ＮＡを化学的に事前に合成して、これらを、何らかの手
段で互いに又は天然ＤＮＡに結合させて増幅すべき鋳型
ＤＮＡを調製する必要がある。
【０００３】ＤＮＡを化学的に合成する方法としては、
燐酸ジエステル法、燐酸トリエステル法や亜リン酸法等
があり、これらの方法により、任意の塩基配列をもつＤ
ＮＡを、各種のＤＮＡ自動合成機を使用して化学合成す
ることができる。しかしながら、これらの化学合成法に
おいて合成することができる塩基配列の長さの限界は、
一般に１００bp程度である。長いＤＮＡを一回（１バッ
チ）の反応で化学合成することは不可能に近い。たとえ
合成できたとしても、多くの複雑な工程とかなりの費用
がかかり、さらにそのように合成されたＤＮＡの純度も
極めて低いという欠点がある。数回の反応により長い配
列のＤＮＡを合成できる可能性は残されているが、この
場合も高価な試薬や酵素を使用し、複雑な精製工程が必
要であるという欠点がある。
燐酸ジエステル法、燐酸トリエステル法や亜リン酸法等
があり、これらの方法により、任意の塩基配列をもつＤ
ＮＡを、各種のＤＮＡ自動合成機を使用して化学合成す
ることができる。しかしながら、これらの化学合成法に
おいて合成することができる塩基配列の長さの限界は、
一般に１００bp程度である。長いＤＮＡを一回（１バッ
チ）の反応で化学合成することは不可能に近い。たとえ
合成できたとしても、多くの複雑な工程とかなりの費用
がかかり、さらにそのように合成されたＤＮＡの純度も
極めて低いという欠点がある。数回の反応により長い配
列のＤＮＡを合成できる可能性は残されているが、この
場合も高価な試薬や酵素を使用し、複雑な精製工程が必
要であるという欠点がある。
【０００４】従来、例えば、１，０００bpの長鎖二本鎖
ＤＮＡを一定量最終的に得ようとする場合には、図１に
示すように、目的とするＤＮＡのセンス鎖とアンチセン
ス鎖の全領域を最大約１００bp毎に分割し、それぞれの
一本鎖ＤＮＡを化学合成し、これらを混合してリガーゼ
（連結酵素）で連結する。すなわち、１，０００bpの長
鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを得るためには、２，０００bp分の
一本鎖ＤＮＡを化学合成する必要がある。通常、このよ
うな操作においては、化学合成に１日、精製に１から２
日、連結反応に３０分から一晩を要する。また、連結後
のＤＮＡの精製処理、例えば、電気泳動、液体クロマト
グラフィー等が必要になる場合もある。従って、最終的
に得ようとする二本鎖ＤＮＡの長さが長くなればなる
程、長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを得るまでの時間が長くな
り、コストと複雑な操作が必要とされる。さらにいえば
このような方法では目的とするＤＮＡ中にホモロジーの
ある領域が存在する場合でも相補鎖全てを合成する必要
がある。このため全ての断片が誤りなくアニールし、目
的どおりの長鎖二本鎖ＤＮＡが構成される確率は低くな
らざるを得ず、例えばプロモータ領域のようにホモロジ
ーの高い領域が多数存在する場合には合成が不可能な場
合もあった。
ＤＮＡを一定量最終的に得ようとする場合には、図１に
示すように、目的とするＤＮＡのセンス鎖とアンチセン
ス鎖の全領域を最大約１００bp毎に分割し、それぞれの
一本鎖ＤＮＡを化学合成し、これらを混合してリガーゼ
（連結酵素）で連結する。すなわち、１，０００bpの長
鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを得るためには、２，０００bp分の
一本鎖ＤＮＡを化学合成する必要がある。通常、このよ
うな操作においては、化学合成に１日、精製に１から２
日、連結反応に３０分から一晩を要する。また、連結後
のＤＮＡの精製処理、例えば、電気泳動、液体クロマト
グラフィー等が必要になる場合もある。従って、最終的
に得ようとする二本鎖ＤＮＡの長さが長くなればなる
程、長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを得るまでの時間が長くな
り、コストと複雑な操作が必要とされる。さらにいえば
このような方法では目的とするＤＮＡ中にホモロジーの
ある領域が存在する場合でも相補鎖全てを合成する必要
がある。このため全ての断片が誤りなくアニールし、目
的どおりの長鎖二本鎖ＤＮＡが構成される確率は低くな
らざるを得ず、例えばプロモータ領域のようにホモロジ
ーの高い領域が多数存在する場合には合成が不可能な場
合もあった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、非天然塩基配
列を含む長鎖二本鎖ＤＮＡを、複数の鋳型一本鎖ＤＮＡ
を使用して、簡易、かつ、迅速に合成する方法の必要性
が存在する。
列を含む長鎖二本鎖ＤＮＡを、複数の鋳型一本鎖ＤＮＡ
を使用して、簡易、かつ、迅速に合成する方法の必要性
が存在する。
【０００６】従来、３′末端側同士に相補的な配列を有
するプライマーにＤＮＡポリメラーゼを作用させると、
３′末端側から相補鎖の伸長が起こり、二本鎖ＤＮＡが
合成されることが知られていた。この反応はＰＣＲ法に
おいてはその特徴であるＤＮＡの特異的増幅を阻害する
要因として、プライマー設計上避けなければならない重
要事項と認識されていた。本願発明者らは、今般、驚ろ
くべきことに、３′末端側同士又は５′末端同士の少な
くとも一方に相補的な配列を有する一本鎖鋳型ＤＮＡを
複数種用いることにより長鎖二本鎖ＤＮＡが合成可能で
あることを発見した。一見、本願発明に係るＤＮＡの合
成方法に類似していると思われる方法が、組換えＰＣＲ
法で利用されている。当該方法は天然のＤＮＡを鋳型と
し、変異箇所を有するプライマーを用いて３′末端側に
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを合成し、これにＤ
ＮＡポリメラーゼを作用させて変異箇所を有する二本鎖
ＤＮＡを合成する方法である。従って、組換えＰＣＲ法
は、本発明に係る方法と目的において異なる。さらに本
願発明に係る方法は鋳型となる天然のＤＮＡを本質的に
必要としない点で当該組換えＰＣＲ法と異なる。また、
上述のようなリガーゼを用いる従来のＤＮＡ合成方法で
は、ホモロジーがある領域が存在する場合でも相補鎖全
てを合成する必要があった。このため、全ての断片が誤
りなくアニールし、目的どおりの長鎖二本鎖ＤＮＡが構
成される確率は低いものにならざるを得ず、例えば、プ
ロモータ領域のようにホモロジーの高い領域が多数存在
する場合には合成が不可能な場合があった。本発明に係
る方法によれば全ての相補鎖を合成する必要が無いた
め、あらかじめ相補的に結合させる領域を選定すること
が可能であり、このため上記の欠点を解消することがで
きる。相補的に結合させる領域の選定に当たってはホモ
ロジーのある領域を避けることが重要であり、このため
合成したい配列間のホモロジー検索を事前に実施するこ
とが好ましい。また、相補的な結合領域のＴｍをほぼ一
定に調整することも可能であり、この操作によって、最
適のアニール温度が決まり、従来法で起っていた相補鎖
のミスマッチの確率を著しく減少させることができる。
このように本発明によれば、合成時の自由度が著しく向
上することにより、従来法の欠点を確実に解消すること
ができる。この際に化学合成すべき一本鎖鋳型ＤＮＡは
従来法の約半分で良いのでコスト、時間および工程が著
しく軽減されることは言うまでもない。
するプライマーにＤＮＡポリメラーゼを作用させると、
３′末端側から相補鎖の伸長が起こり、二本鎖ＤＮＡが
合成されることが知られていた。この反応はＰＣＲ法に
おいてはその特徴であるＤＮＡの特異的増幅を阻害する
要因として、プライマー設計上避けなければならない重
要事項と認識されていた。本願発明者らは、今般、驚ろ
くべきことに、３′末端側同士又は５′末端同士の少な
くとも一方に相補的な配列を有する一本鎖鋳型ＤＮＡを
複数種用いることにより長鎖二本鎖ＤＮＡが合成可能で
あることを発見した。一見、本願発明に係るＤＮＡの合
成方法に類似していると思われる方法が、組換えＰＣＲ
法で利用されている。当該方法は天然のＤＮＡを鋳型と
し、変異箇所を有するプライマーを用いて３′末端側に
相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡを合成し、これにＤ
ＮＡポリメラーゼを作用させて変異箇所を有する二本鎖
ＤＮＡを合成する方法である。従って、組換えＰＣＲ法
は、本発明に係る方法と目的において異なる。さらに本
願発明に係る方法は鋳型となる天然のＤＮＡを本質的に
必要としない点で当該組換えＰＣＲ法と異なる。また、
上述のようなリガーゼを用いる従来のＤＮＡ合成方法で
は、ホモロジーがある領域が存在する場合でも相補鎖全
てを合成する必要があった。このため、全ての断片が誤
りなくアニールし、目的どおりの長鎖二本鎖ＤＮＡが構
成される確率は低いものにならざるを得ず、例えば、プ
ロモータ領域のようにホモロジーの高い領域が多数存在
する場合には合成が不可能な場合があった。本発明に係
る方法によれば全ての相補鎖を合成する必要が無いた
め、あらかじめ相補的に結合させる領域を選定すること
が可能であり、このため上記の欠点を解消することがで
きる。相補的に結合させる領域の選定に当たってはホモ
ロジーのある領域を避けることが重要であり、このため
合成したい配列間のホモロジー検索を事前に実施するこ
とが好ましい。また、相補的な結合領域のＴｍをほぼ一
定に調整することも可能であり、この操作によって、最
適のアニール温度が決まり、従来法で起っていた相補鎖
のミスマッチの確率を著しく減少させることができる。
このように本発明によれば、合成時の自由度が著しく向
上することにより、従来法の欠点を確実に解消すること
ができる。この際に化学合成すべき一本鎖鋳型ＤＮＡは
従来法の約半分で良いのでコスト、時間および工程が著
しく軽減されることは言うまでもない。
【０００７】ＰＣＲ法に用いられるＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼは、内因性の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
はもっていないので（従って、誤って合成されたＤＮＡ
は修正されない）、かかるＤＮＡポリメラーゼは生化学
的に極めて正確であるとは考えられていない。従って、
ＰＣＲ法においては、かかるＤＮＡポリメラーゼの正確
さ（フィデリティー）を確保するために、ｄＮＴＰの濃
度等を考慮すべきであるとされている。このために、従
来、当業者は、ＰＣＲ法により増幅されるべき鋳型を、
上記ＤＮＡポリメラーゼを用いて得るということをため
らっていたものと思われる。しかしながら、本発明に係
るＤＮＡの合成方法は、以下に記載するようにＰＣＲ法
と組み合わせることにより、さらに有効な長鎖二本鎖Ｄ
ＮＡの合成法となる。すなわちＰＣＲ法で増幅すべき長
鎖二本鎖鋳型ＤＮＡを構成するに必要な複数の短鎖一本
鎖ＤＮＡ及びプライマーを化学合成し、ＰＣＲを行なう
ことにより、複雑な操作や工程を経ることなく、従来法
と比較して著しく安価、短時間に非天然型の長鎖二本鎖
ＤＮＡを大量に調製することができる。
ラーゼは、内因性の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性
はもっていないので（従って、誤って合成されたＤＮＡ
は修正されない）、かかるＤＮＡポリメラーゼは生化学
的に極めて正確であるとは考えられていない。従って、
ＰＣＲ法においては、かかるＤＮＡポリメラーゼの正確
さ（フィデリティー）を確保するために、ｄＮＴＰの濃
度等を考慮すべきであるとされている。このために、従
来、当業者は、ＰＣＲ法により増幅されるべき鋳型を、
上記ＤＮＡポリメラーゼを用いて得るということをため
らっていたものと思われる。しかしながら、本発明に係
るＤＮＡの合成方法は、以下に記載するようにＰＣＲ法
と組み合わせることにより、さらに有効な長鎖二本鎖Ｄ
ＮＡの合成法となる。すなわちＰＣＲ法で増幅すべき長
鎖二本鎖鋳型ＤＮＡを構成するに必要な複数の短鎖一本
鎖ＤＮＡ及びプライマーを化学合成し、ＰＣＲを行なう
ことにより、複雑な操作や工程を経ることなく、従来法
と比較して著しく安価、短時間に非天然型の長鎖二本鎖
ＤＮＡを大量に調製することができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の１の態様におい
ては、３種以上の鋳型一本鎖ＤＮＡを使用して長鎖二本
鎖ＤＮＡを合成する方法であって、（１）少なくとも
３′−末端又は５′−末端のどちらか一方に互いに相補
的な結合領域を有し、かつ、上記結合領域においてアニ
ールして連続的に連結して上記二本鎖ＤＮＡの塩基配列
の全体を構成することができる３種以上の鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡに、連結後の鋳型一本鎖ＤＮＡの末端に、３′−末
端が突き出た場合には、その３′−末端側に相補的にア
ニールするプライマーＤＮＡの存在下、ＤＮＡポリメラ
ーゼを作用させて、上記二本鎖ＤＮＡの全体長の長さを
もつ長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成する第１の工程を有す
るＤＮＡの合成方法が提供される。そして本発明の他の
態様においては、（２）前記第１の工程において得られ
た長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを、ａ）上記の３′−末端側に
相補的にアニールするプライマーＤＮＡと、ｂ）上記の
アニールして連続的に連結した複数種の鋳型一本鎖の連
結物の末端に、５′−末端が突き出た鋳型一本鎖が存在
する場合には、その５′−末端側の塩基配列をもつプラ
イマーＤＮＡの存在下、ポリメラーゼ連鎖反応に供し
て、目的とする長鎖二本鎖ＤＮＡを得る、第２の工程を
さらに有することを特徴とするＤＮＡの合成方法が提供
される。
ては、３種以上の鋳型一本鎖ＤＮＡを使用して長鎖二本
鎖ＤＮＡを合成する方法であって、（１）少なくとも
３′−末端又は５′−末端のどちらか一方に互いに相補
的な結合領域を有し、かつ、上記結合領域においてアニ
ールして連続的に連結して上記二本鎖ＤＮＡの塩基配列
の全体を構成することができる３種以上の鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡに、連結後の鋳型一本鎖ＤＮＡの末端に、３′−末
端が突き出た場合には、その３′−末端側に相補的にア
ニールするプライマーＤＮＡの存在下、ＤＮＡポリメラ
ーゼを作用させて、上記二本鎖ＤＮＡの全体長の長さを
もつ長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成する第１の工程を有す
るＤＮＡの合成方法が提供される。そして本発明の他の
態様においては、（２）前記第１の工程において得られ
た長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを、ａ）上記の３′−末端側に
相補的にアニールするプライマーＤＮＡと、ｂ）上記の
アニールして連続的に連結した複数種の鋳型一本鎖の連
結物の末端に、５′−末端が突き出た鋳型一本鎖が存在
する場合には、その５′−末端側の塩基配列をもつプラ
イマーＤＮＡの存在下、ポリメラーゼ連鎖反応に供し
て、目的とする長鎖二本鎖ＤＮＡを得る、第２の工程を
さらに有することを特徴とするＤＮＡの合成方法が提供
される。
【０００９】本発明の原理を以下の図２に示す。例とし
て、鋳型一本鎖ＤＮＡの種類（以下、ｎとする。）が３
の場合と４の場合を示しているが、ｎは、これに限定さ
れるものではない。図２に示すｎが３の場合には、３′
末端が突き出た（３′末端同士に相補的な結合領域をも
たない）鋳型一本鎖ＤＮＡが存在し、この場合には、こ
の鋳型一本鎖ＤＮＡの３′末端に相補的に結合するプラ
イマーＤＮＡが必要である。また、この場合には、２回
の反応サイクルで長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡが合成される。
一方、図２に示すｎが４の場合には、３′末端が突き出
た（３′末端同士に相補的な結合領域をもたない）鋳型
一本鎖ＤＮＡが存在しないので、この場合には、この鋳
型一本鎖ＤＮＡの３′末端に相補的に結合するプライマ
ーＤＮＡが必要ではない。また、この場合にも、２回の
反応サイクルで長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡが合成される。
て、鋳型一本鎖ＤＮＡの種類（以下、ｎとする。）が３
の場合と４の場合を示しているが、ｎは、これに限定さ
れるものではない。図２に示すｎが３の場合には、３′
末端が突き出た（３′末端同士に相補的な結合領域をも
たない）鋳型一本鎖ＤＮＡが存在し、この場合には、こ
の鋳型一本鎖ＤＮＡの３′末端に相補的に結合するプラ
イマーＤＮＡが必要である。また、この場合には、２回
の反応サイクルで長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡが合成される。
一方、図２に示すｎが４の場合には、３′末端が突き出
た（３′末端同士に相補的な結合領域をもたない）鋳型
一本鎖ＤＮＡが存在しないので、この場合には、この鋳
型一本鎖ＤＮＡの３′末端に相補的に結合するプライマ
ーＤＮＡが必要ではない。また、この場合にも、２回の
反応サイクルで長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡが合成される。
【００１０】長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを得るためには、少
なくとも（ｌｏｇ ｎ／ｌｏｇ ２）回以上（ここで、
ｎは、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの種類の数であり、そして
式の値は小数点以下を切り上げた整数である。）のサイ
クルが必要である。この式は、１サイクルで鋳型一本鎖
ＤＮＡの数が半分になるということに基づくものであ
る。従って、ｎ＝１００、すなわち、１００種の１００
bpの鋳型一本鎖ＤＮＡを使用した場合には、たった７回
のサイクルで約１万塩基対の長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合
成することができることになる。
なくとも（ｌｏｇ ｎ／ｌｏｇ ２）回以上（ここで、
ｎは、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの種類の数であり、そして
式の値は小数点以下を切り上げた整数である。）のサイ
クルが必要である。この式は、１サイクルで鋳型一本鎖
ＤＮＡの数が半分になるということに基づくものであ
る。従って、ｎ＝１００、すなわち、１００種の１００
bpの鋳型一本鎖ＤＮＡを使用した場合には、たった７回
のサイクルで約１万塩基対の長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合
成することができることになる。
【００１１】本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合成方法に
おいては、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの各々の前記反応液中
の濃度がほぼ等しいものであることができる。本発明に
おいては、長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成した後に、引き
続きＰＣＲを行うので、プライマーは、鋳型一本鎖ＤＮ
Ａよりも過剰量、好ましくは、プライマーＤＮＡの量
が、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの濃度に比較して、１０倍以
上で存在する。
おいては、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの各々の前記反応液中
の濃度がほぼ等しいものであることができる。本発明に
おいては、長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成した後に、引き
続きＰＣＲを行うので、プライマーは、鋳型一本鎖ＤＮ
Ａよりも過剰量、好ましくは、プライマーＤＮＡの量
が、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの濃度に比較して、１０倍以
上で存在する。
【００１２】さらに、本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合
成方法においては、前記プライマーＤＮＡの溶融温度
（Ｔｍ）を、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの相補的な結合領域
のＴｍよりも高くなるように、それらの相補的領域の塩
基配列を設定し、前記第１の工程において、少なくとも
（ｌｏｇ ｎ／ｌｏｇ ２）回以上（ここで、ｎは、前
記鋳型一本鎖ＤＮＡの種類の数であり、そして式の値は
小数点以下を切り上げた整数である。）、前記鋳型一本
鎖ＤＮＡの相補的な結合領域のＴｍの内最も低い温度以
下でアニーリングさせ、そしてそれに見合う温度で前記
プライマーを伸長させて、ポリメラーゼ反応を行い、そ
の後、前記第２の工程において、前記プライマーＤＮＡ
のＴｍの内最も低い温度付近でアニーリングさせ、そし
てそれに見合う温度で前記プライマーを伸長させて、ポ
リメラーゼ連鎖反応を行うことが望ましい。前記第１の
工程におけるアニーリング温度を低く設定する理由は、
ポリメラーゼ連鎖反応における長鎖の鋳型が正しく合成
されていることを保証するためである。
成方法においては、前記プライマーＤＮＡの溶融温度
（Ｔｍ）を、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの相補的な結合領域
のＴｍよりも高くなるように、それらの相補的領域の塩
基配列を設定し、前記第１の工程において、少なくとも
（ｌｏｇ ｎ／ｌｏｇ ２）回以上（ここで、ｎは、前
記鋳型一本鎖ＤＮＡの種類の数であり、そして式の値は
小数点以下を切り上げた整数である。）、前記鋳型一本
鎖ＤＮＡの相補的な結合領域のＴｍの内最も低い温度以
下でアニーリングさせ、そしてそれに見合う温度で前記
プライマーを伸長させて、ポリメラーゼ反応を行い、そ
の後、前記第２の工程において、前記プライマーＤＮＡ
のＴｍの内最も低い温度付近でアニーリングさせ、そし
てそれに見合う温度で前記プライマーを伸長させて、ポ
リメラーゼ連鎖反応を行うことが望ましい。前記第１の
工程におけるアニーリング温度を低く設定する理由は、
ポリメラーゼ連鎖反応における長鎖の鋳型が正しく合成
されていることを保証するためである。
【００１３】さらに、本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合
成方法においては、前記鋳型一本鎖ＤＮＡが、５０〜１
２０塩基対の長さであり、そして前記鋳型一本鎖ＤＮＡ
の種類の数が、２〜４００であることができる。
成方法においては、前記鋳型一本鎖ＤＮＡが、５０〜１
２０塩基対の長さであり、そして前記鋳型一本鎖ＤＮＡ
の種類の数が、２〜４００であることができる。
【００１４】本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法
においては、上記以外の反応条件においては、ＰＣＲの
標準的なプロトコールに従うことができる。これらの諸
条件には、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの濃度、鋳型ＤＮ
Ａの濃度、ｄＮＴＰの濃度、マグネシウム濃度、緩衝液
の種類、アニーリングの温度・時間、プライマーの伸長
時間・伸長温度、ＤＮＡの変性の温度・時間、サイクル
数、プライマーの濃度、Ｔｍ及び塩基配列、プラトー効
果、並びにＰＣＲの正確さの考慮等、がある。
においては、上記以外の反応条件においては、ＰＣＲの
標準的なプロトコールに従うことができる。これらの諸
条件には、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの濃度、鋳型ＤＮ
Ａの濃度、ｄＮＴＰの濃度、マグネシウム濃度、緩衝液
の種類、アニーリングの温度・時間、プライマーの伸長
時間・伸長温度、ＤＮＡの変性の温度・時間、サイクル
数、プライマーの濃度、Ｔｍ及び塩基配列、プラトー効
果、並びにＰＣＲの正確さの考慮等、がある。
【００１５】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Perkin-Elm
er Cetus社のGeneAmp PCR Core Reagents のAmplitaqＤ
ＮＡであることができる。ＤＮＡポリメラーゼの濃度
は、製造元によって異なるが、一般に、１．０〜３．０
単位、好ましくは、２．０〜２．５単位であることがで
きる。ＤＮＡポリメラーゼの濃度が高いと、非特異的な
ＰＣＲ生成物が生じ、また、低濃度では収量が低下する
ことがある。
er Cetus社のGeneAmp PCR Core Reagents のAmplitaqＤ
ＮＡであることができる。ＤＮＡポリメラーゼの濃度
は、製造元によって異なるが、一般に、１．０〜３．０
単位、好ましくは、２．０〜２．５単位であることがで
きる。ＤＮＡポリメラーゼの濃度が高いと、非特異的な
ＰＣＲ生成物が生じ、また、低濃度では収量が低下する
ことがある。
【００１６】鋳型ＤＮＡの濃度は、反応溶液１００μｌ
当たり１０5 〜１０6 分子に相当する量であることがで
き、又はその最終濃度は、０．１〜１，０００nM、好ま
しくは１〜１００nMであることができる。ｄＮＴＰの濃
度は、２〜３００μＭ、好ましくは２〜２５０μＭであ
ることができる。ｄＮＴＰの濃度を２０〜２００μＭの
間とすると、ＰＣＲ反応が、その効率、特異性、正確さ
からみて、満足のいく結果が得られることが多い。４種
のデオキシヌクレオチドの濃度を均一にしないと、ミス
インコーポレーションの割合が高くなることが知られて
いる。
当たり１０5 〜１０6 分子に相当する量であることがで
き、又はその最終濃度は、０．１〜１，０００nM、好ま
しくは１〜１００nMであることができる。ｄＮＴＰの濃
度は、２〜３００μＭ、好ましくは２〜２５０μＭであ
ることができる。ｄＮＴＰの濃度を２０〜２００μＭの
間とすると、ＰＣＲ反応が、その効率、特異性、正確さ
からみて、満足のいく結果が得られることが多い。４種
のデオキシヌクレオチドの濃度を均一にしないと、ミス
インコーポレーションの割合が高くなることが知られて
いる。
【００１７】マグネシウム濃度は、０．５〜２．５mM、
好ましくは、１．０〜２．０mMである。マグネシウム濃
度は、プライマーのアニーリング状態、鋳型及びＰＣＲ
生成物のＤＮＡ解離温度、合成されたＤＮＡの正確さ、
プライマー二量体の形成状況、酵素活性、に関与するこ
とが知られている。緩衝液は、５〜５０mM、好ましく
は、５〜２０mM Tris-HCl(pH 8.3) であることができ
る。また、塩化カリウムは、１０〜１００mMであること
ができ、好ましくは、約５０mMまで添加されることがで
き、プライマーのアニーリングを促進することが知られ
ている。
好ましくは、１．０〜２．０mMである。マグネシウム濃
度は、プライマーのアニーリング状態、鋳型及びＰＣＲ
生成物のＤＮＡ解離温度、合成されたＤＮＡの正確さ、
プライマー二量体の形成状況、酵素活性、に関与するこ
とが知られている。緩衝液は、５〜５０mM、好ましく
は、５〜２０mM Tris-HCl(pH 8.3) であることができ
る。また、塩化カリウムは、１０〜１００mMであること
ができ、好ましくは、約５０mMまで添加されることがで
き、プライマーのアニーリングを促進することが知られ
ている。
【００１８】アニーリングの温度は、プライマー又は前
記一本鎖鋳型ＤＮＡの塩基の内容と長さ及び濃度によっ
て決定されるが、一般に、Ｔm の５℃下の温度が選ばれ
る。一般に、アニーリング温度を上昇させると、プライ
マーと鋳型ＤＮＡのミスマッチが減少し、プライマー
３′側のミスインコーポレーションを防ぐことができ
る。従って、正確さを高めるためには、長いプライマー
を用い、反応温度を一定にして伸長反応を行うことが望
ましいといえるが、本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合成
反応の第１の工程においては、上述のように、増幅され
るべき完全長の長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡの形成を保証する
ために、アニーリング温度を下げることが望ましい。以
下の実施例においては、前記第１の工程においては、３
７℃、そして前記第２の工程においては、６３℃とした
が、それぞれ、３０〜５５℃、及び５５〜７２℃である
ことができる。
記一本鎖鋳型ＤＮＡの塩基の内容と長さ及び濃度によっ
て決定されるが、一般に、Ｔm の５℃下の温度が選ばれ
る。一般に、アニーリング温度を上昇させると、プライ
マーと鋳型ＤＮＡのミスマッチが減少し、プライマー
３′側のミスインコーポレーションを防ぐことができ
る。従って、正確さを高めるためには、長いプライマー
を用い、反応温度を一定にして伸長反応を行うことが望
ましいといえるが、本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合成
反応の第１の工程においては、上述のように、増幅され
るべき完全長の長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡの形成を保証する
ために、アニーリング温度を下げることが望ましい。以
下の実施例においては、前記第１の工程においては、３
７℃、そして前記第２の工程においては、６３℃とした
が、それぞれ、３０〜５５℃、及び５５〜７２℃である
ことができる。
【００１９】プライマーの伸長時間は、鋳型ＤＮＡの濃
度と長さ、及び伸長温度はによって左右される。標準的
な反応では、伸長温度は、７２℃であり、最適温度に近
いものである。７２℃におけるＤＮＡの合成速度は、緩
衝液、pH、塩濃度、鋳型ＤＮＡの性質によって異なる
が、１秒当たり３５〜１００塩基である。従って、２kb
以内のＤＮＡ合成については、７２℃で１分間行えば十
分である。本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合成反応の第
１の工程において、増幅されるべき完全長の長鎖鋳型二
本鎖ＤＮＡの形成を保証するためにアニーリング温度を
下げたために、それに見合うようにプライマーの伸長温
度も上記最適温度から低下したものとなっている。以下
の実施例においては、前記第１の工程おける伸長温度
は、５０℃であるが、４５〜６５℃であることができ
る。
度と長さ、及び伸長温度はによって左右される。標準的
な反応では、伸長温度は、７２℃であり、最適温度に近
いものである。７２℃におけるＤＮＡの合成速度は、緩
衝液、pH、塩濃度、鋳型ＤＮＡの性質によって異なる
が、１秒当たり３５〜１００塩基である。従って、２kb
以内のＤＮＡ合成については、７２℃で１分間行えば十
分である。本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡ合成反応の第
１の工程において、増幅されるべき完全長の長鎖鋳型二
本鎖ＤＮＡの形成を保証するためにアニーリング温度を
下げたために、それに見合うようにプライマーの伸長温
度も上記最適温度から低下したものとなっている。以下
の実施例においては、前記第１の工程おける伸長温度
は、５０℃であるが、４５〜６５℃であることができ
る。
【００２０】ＤＮＡの変性の温度・時間は、９５℃３０
秒、９７℃１５秒、又は９４℃１５秒等の標準的なもの
であることができる。また、サイクル数は、一般的に、
４０回以下であることができる。
秒、９７℃１５秒、又は９４℃１５秒等の標準的なもの
であることができる。また、サイクル数は、一般的に、
４０回以下であることができる。
【００２１】プライマーの濃度は、０．１〜２．０μ
Ｍ、好ましくは、０．１〜１．０μＭであることができ
る。プライマーがあまりに高濃度になるとアニーリング
に誤りが生じ、鋳型ＤＮＡと無関係な非特異的なＤＮＡ
が合成されたり、プライマー自体が二量体を形成したり
するアーティファクトが出現する可能性が高くなり、そ
れ自体がＰＣＲ反応の鋳型となるので、正しく合成され
るべきＤＮＡの伸長を阻害して、収率が著しく低下す
る。標準的なプライマーは、１８〜２８塩基対の長さで
あり、５０〜６０％のグアニン／シトシンを含んでい
る。また、使用する２つのプライマーのＴm は同一にす
べきである。目安として、アデニンとチミンでは２℃、
グアニンとシトシンでは４℃と計算すればよいとされて
いる。一般に、プライマーのＴm は、５５〜８０℃が望
ましく、プライマー同士の３′側は、相補性を有しない
ものとしなければならない。そうでないとプライマーは
二量体を形成し、ＰＣＲの収率が低下するからである。
また、３′側にはシトシン又はグアニンを３つ以上続け
ない方が、グアニン／シトシンの豊富な塩基配列でのプ
ライミングを誤りを防ぐためによいとされている。さら
に、プライマー内でパリンドロームを形成しない塩基配
列にすべきであるとされる。
Ｍ、好ましくは、０．１〜１．０μＭであることができ
る。プライマーがあまりに高濃度になるとアニーリング
に誤りが生じ、鋳型ＤＮＡと無関係な非特異的なＤＮＡ
が合成されたり、プライマー自体が二量体を形成したり
するアーティファクトが出現する可能性が高くなり、そ
れ自体がＰＣＲ反応の鋳型となるので、正しく合成され
るべきＤＮＡの伸長を阻害して、収率が著しく低下す
る。標準的なプライマーは、１８〜２８塩基対の長さで
あり、５０〜６０％のグアニン／シトシンを含んでい
る。また、使用する２つのプライマーのＴm は同一にす
べきである。目安として、アデニンとチミンでは２℃、
グアニンとシトシンでは４℃と計算すればよいとされて
いる。一般に、プライマーのＴm は、５５〜８０℃が望
ましく、プライマー同士の３′側は、相補性を有しない
ものとしなければならない。そうでないとプライマーは
二量体を形成し、ＰＣＲの収率が低下するからである。
また、３′側にはシトシン又はグアニンを３つ以上続け
ない方が、グアニン／シトシンの豊富な塩基配列でのプ
ライミングを誤りを防ぐためによいとされている。さら
に、プライマー内でパリンドロームを形成しない塩基配
列にすべきであるとされる。
【００２２】このようなプライマーの設計条件は、本発
明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法において使用され
る複数種の鋳型一本鎖ＤＮＡの前記結合領域の設計にも
同様に適用される。
明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法において使用され
る複数種の鋳型一本鎖ＤＮＡの前記結合領域の設計にも
同様に適用される。
【００２３】従って、本発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡの
合成方法においては、２つのプライマー及び全ての鋳型
一本鎖ＤＮＡの結合領域の塩基配列を、上記プライマー
の設計条件を全て満足するように事前に決定しておき、
かかる設計に基づいて、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの全て及
び２つのプライマーを合成する必要がある。かかる設計
が、本願発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法を実施
する際に、決定的なものとなる。
合成方法においては、２つのプライマー及び全ての鋳型
一本鎖ＤＮＡの結合領域の塩基配列を、上記プライマー
の設計条件を全て満足するように事前に決定しておき、
かかる設計に基づいて、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの全て及
び２つのプライマーを合成する必要がある。かかる設計
が、本願発明に係る長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法を実施
する際に、決定的なものとなる。
【００２４】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、これにより本発明が限定されるものではない。以下
の実施例１と２は、３種及び４種の鋳型一本鎖ＤＮＡを
用いた長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡの合成例であるが、先に記
載した反応条件を満たす限り、１００種まで、さらに４
００種までの鋳型一本鎖ＤＮＡにも拡張することができ
る。
が、これにより本発明が限定されるものではない。以下
の実施例１と２は、３種及び４種の鋳型一本鎖ＤＮＡを
用いた長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡの合成例であるが、先に記
載した反応条件を満たす限り、１００種まで、さらに４
００種までの鋳型一本鎖ＤＮＡにも拡張することができ
る。
【００２５】実施例１：奇数（３種）の鋳型一本鎖ＤＮ
Ａを用いた長鎖二本鎖ＤＮＡの合成（３′末端が突き出
た鋳型を有する場合） 以下の配列番号１〜８に表す鋳型１〜５並びにプライマ
ー１及び２を、化学合成機を使用して化学合成した。こ
のうち、鋳型１（配列番号：１）、鋳型２（配列番号：
２）及び鋳型３（配列番号：３）（各々最終濃度１０nM
又は１nM）、プライマー１（配列番号：６）及びプライ
マー２（配列番号：７）（各々最終濃度１μＭ）、並び
に緩衝液〔１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM
ＫＣｌ, １．５mM ＭｇＣｌ2 、各々最終濃度〕、Pe
rkin-Elmer Cetus社のGeneAmp PCR Core Reagents のア
ンプリタクＤＮＡポリメラーゼ（最終濃度２．５Ｕ）、
デオキシリボヌクレオチド〔ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（各々最終濃度２００μＭ）〕から
成る反応液１００μｌを、ＰＣＲ装置 Perkin Elmer Ce
tus Gene Amp CRS System 9600 (2400) 内で、以下の表
１に示す反応条件下で反応させた。
Ａを用いた長鎖二本鎖ＤＮＡの合成（３′末端が突き出
た鋳型を有する場合） 以下の配列番号１〜８に表す鋳型１〜５並びにプライマ
ー１及び２を、化学合成機を使用して化学合成した。こ
のうち、鋳型１（配列番号：１）、鋳型２（配列番号：
２）及び鋳型３（配列番号：３）（各々最終濃度１０nM
又は１nM）、プライマー１（配列番号：６）及びプライ
マー２（配列番号：７）（各々最終濃度１μＭ）、並び
に緩衝液〔１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM
ＫＣｌ, １．５mM ＭｇＣｌ2 、各々最終濃度〕、Pe
rkin-Elmer Cetus社のGeneAmp PCR Core Reagents のア
ンプリタクＤＮＡポリメラーゼ（最終濃度２．５Ｕ）、
デオキシリボヌクレオチド〔ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（各々最終濃度２００μＭ）〕から
成る反応液１００μｌを、ＰＣＲ装置 Perkin Elmer Ce
tus Gene Amp CRS System 9600 (2400) 内で、以下の表
１に示す反応条件下で反応させた。
【００２６】
【表１】
【００２７】この反応液１０μｌを、１％アガロース、
トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡゲルに電気泳動後、臭化エチ
ジウムで染色して、紫外線ランプ下で観察したところ、
図３の図面に代わる写真上に、約１９０bpのバンドを確
認した。このバンド上の生成物を配列決定したところ以
下の配列番号：９に示す配列をもつことが判明した。こ
の結果から、鋳型１、鋳型２、鋳型３及びプライマー２
から長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡが合成され、これにプライマ
ー１とプライマー２が結合してポリメラーゼ連鎖反応が
正確に行われたことが確認された。尚、配列番号：１の
６７〜７９位と配列番号：２の５３〜６５位、そして配
列番号：２の１〜１５位と、配列番号：３の１〜１５位
が相補領域である。
トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡゲルに電気泳動後、臭化エチ
ジウムで染色して、紫外線ランプ下で観察したところ、
図３の図面に代わる写真上に、約１９０bpのバンドを確
認した。このバンド上の生成物を配列決定したところ以
下の配列番号：９に示す配列をもつことが判明した。こ
の結果から、鋳型１、鋳型２、鋳型３及びプライマー２
から長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡが合成され、これにプライマ
ー１とプライマー２が結合してポリメラーゼ連鎖反応が
正確に行われたことが確認された。尚、配列番号：１の
６７〜７９位と配列番号：２の５３〜６５位、そして配
列番号：２の１〜１５位と、配列番号：３の１〜１５位
が相補領域である。
【００２８】実施例２：偶数個（４種）の鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡを用いた長鎖二本鎖ＤＮＡの合成（５′末端が突き
出た鋳型を有しない場合） 鋳型２（配列番号：２）、鋳型３（配列番号：３）、鋳
型４（配列番号：４）及び鋳型５（配列番号：５）（各
々最終濃度１００nM，１０nM又は１nM）、プライマー２
（配列番号：７）及びプライマー３（配列番号：８）
（各々最終濃度１μＭ）、並びに緩衝液〔１０mMトリス
−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ，１．５mM Ｍ
ｇＣｌ2 、各々最終濃度〕、アンプリタクＤＮＡポリメ
ラーゼ（最終濃度２．５Ｕ）、デオキシリボヌクレオチ
ド〔ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ
（各々最終濃度２００μＭ）〕から成る反応液１００μ
ｌを、ＰＣＲ装置Perkin Elmer Cetus Gene Amp CRS Sy
stem 9600 (2400)内で、表１に示す反応条件下で反応さ
せた。この反応液１０μｌを、１％アガロース、トリス
／ホウ酸／ＥＤＴＡゲルに電気泳動後、臭化エチゾウム
で染色して、紫外線ランプ下で観察したところ、図４の
図面に代わる写真上に、約２７０bpのバンドを確認し
た。このバンド上の生成物を配列決定したところ以下の
配列番号：１０に示す配列をもつことが判明した。この
結果から、鋳型２、鋳型３、鋳型４及び鋳型５から長鎖
鋳型二本鎖ＤＮＡが合成され、これにプライマー２とプ
ライマー３が結合してポリメラーゼ連鎖反応が正確に行
われたことが確認された。尚、配列番号：２の１〜１５
位と配列番号：３の１〜１５位、配列番号：２の５１〜
６５位と配列番号：５の６９〜８３位、そして配列番
号：５の１〜１０位と配列番号：４の１〜１０位が相補
領域である。
ＮＡを用いた長鎖二本鎖ＤＮＡの合成（５′末端が突き
出た鋳型を有しない場合） 鋳型２（配列番号：２）、鋳型３（配列番号：３）、鋳
型４（配列番号：４）及び鋳型５（配列番号：５）（各
々最終濃度１００nM，１０nM又は１nM）、プライマー２
（配列番号：７）及びプライマー３（配列番号：８）
（各々最終濃度１μＭ）、並びに緩衝液〔１０mMトリス
−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ，１．５mM Ｍ
ｇＣｌ2 、各々最終濃度〕、アンプリタクＤＮＡポリメ
ラーゼ（最終濃度２．５Ｕ）、デオキシリボヌクレオチ
ド〔ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ
（各々最終濃度２００μＭ）〕から成る反応液１００μ
ｌを、ＰＣＲ装置Perkin Elmer Cetus Gene Amp CRS Sy
stem 9600 (2400)内で、表１に示す反応条件下で反応さ
せた。この反応液１０μｌを、１％アガロース、トリス
／ホウ酸／ＥＤＴＡゲルに電気泳動後、臭化エチゾウム
で染色して、紫外線ランプ下で観察したところ、図４の
図面に代わる写真上に、約２７０bpのバンドを確認し
た。このバンド上の生成物を配列決定したところ以下の
配列番号：１０に示す配列をもつことが判明した。この
結果から、鋳型２、鋳型３、鋳型４及び鋳型５から長鎖
鋳型二本鎖ＤＮＡが合成され、これにプライマー２とプ
ライマー３が結合してポリメラーゼ連鎖反応が正確に行
われたことが確認された。尚、配列番号：２の１〜１５
位と配列番号：３の１〜１５位、配列番号：２の５１〜
６５位と配列番号：５の６９〜８３位、そして配列番
号：５の１〜１０位と配列番号：４の１〜１０位が相補
領域である。
【００２９】
【発明の効果】本発明によって、従来制限酵素部位の導
入、結合反応、精製工程等の複雑な工程と多大なコスト
がかかっていた長鎖ＤＮＡ合成を、極めて簡単に、か
つ、低コストで行うことができるようになった。例え
ば、本発明によれば、従来、事実上不可能であった１万
bp程度のＤＮＡの全合成も、１００塩基程度の鋳型ＤＮ
Ａを１００種程度使用すれば、僅か７回のサイクルで長
鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成することができるので、引き
続きＰＣＲを行うことで、目的とする長鎖二本鎖ＤＮＡ
を簡易、かつ、迅速に調製することができる。
入、結合反応、精製工程等の複雑な工程と多大なコスト
がかかっていた長鎖ＤＮＡ合成を、極めて簡単に、か
つ、低コストで行うことができるようになった。例え
ば、本発明によれば、従来、事実上不可能であった１万
bp程度のＤＮＡの全合成も、１００塩基程度の鋳型ＤＮ
Ａを１００種程度使用すれば、僅か７回のサイクルで長
鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成することができるので、引き
続きＰＣＲを行うことで、目的とする長鎖二本鎖ＤＮＡ
を簡易、かつ、迅速に調製することができる。
【００３０】
【配列表】 ＜１１０＞ Denso Co., Ltd. ＜１２０＞ A method for synthesizing a long-chain double-strand DNA usi ng a plurality of template single-strand DNAs ＜１３０＞ ９８３６３７ ＜１６０＞ １０ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ７９ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (templete 1) ＜４００＞ １ gcgaattcga gcttggacta gaaaaaaact tcacaaaatg ctatactagg taggtaaaaa 60 aatattcgga ggaattttg 79
【００３１】 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ６５ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (templete 2) ＜４００＞ ２ gcgactgtac cggctaacaa gatcgatagc cctttctttt tcctttgcat ttcaaaattc 60 ctccg 65
【００３２】 ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ ７２ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (templete 3) ＜４００＞ ３ agccggtaca gtcgctttag gggcgctggc tgtcttgcca gtcggcgaaa tccaagcaaa 60 ggcggtcgac gc 72
【００３３】 ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ ７９ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (templete 4) ＜４００＞ ４ acaaaaatcc aaagtaaccg ctttattaag ccattcttaa ataaaaataa aaaaagatta 60 atagctaaaa ctattaatc 79
【００３４】 ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ８３ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (templete 5) ＜４００＞ ５ ggatttttgt gagcttggac tagaaaaaaa cttcacaaaa tgctatacta ggtaggtaaa 60 aaaatattcg gaggaatttt gaa 83
【００３５】 ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ２１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (primer 1) ＜４００＞ ６ gcgaattcga gcttggacta g 21
【００３６】 ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ ２１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (primer 2) ＜４００＞ ７ gcgtcgaccg cctttgcttg g 21
【００３７】 ＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ ２５ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (primer 3) ＜４００＞ ８ gcgaattcag attaatagtt ttagc 25
【００３８】 ＜２１０＞ ９ ＜２１１＞ １８６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (a long-chain DNA product in Example 1) ＜４００＞ ９ gcgaattcga gcttggacta gaaaaaaact tcacaaaatg ctatactagg taggtaaaaa 60 aatattcgga ggaattttga tgcaaaggaa aaagaaaggg ctatcgatct tgttagccgg 120 tacagtcgct ttaggggcgc tggctgtctt gccagtcggc gaaatccaag caaaggcggt 180 cgacgc
【００３９】 ＜２１０＞ １０ ＜２１１＞ ２６８ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Artificial Sequence (a long-chain DNA product in Example 2) ＜４００＞ １０ gcgaattcag attaatagtt ttagctatta atcttttttt atttttattt aagaatggct 60 taataaagcg gttactttgg atttttgtga gcttggacta gaaaaaaact tcacaaaatg 120 ctatactagg taggtaaaaa aatattcgga ggaattttga aatgcaaagg aaaaagaaag 180 ggctatcgat cttgttagcc ggtacagtcg ctttaggggc gctggctgtc ttgccagtcg 240 gcgaaatcca agcaaaggcg gtcgacgc 268
【図１】図１は従来技術により長鎖二本鎖ＤＮＡを得よ
うとする場合の化学合成すべき一本鎖ＤＮＡの分割状態
を示す概略図である。
うとする場合の化学合成すべき一本鎖ＤＮＡの分割状態
を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の原理を説明した概略図であ
る。
る。
【図３】図３は、実施例１において合成したＤＮＡの、
臭化エチジウム染色されたアガロース・ゲル電気泳動写
真である。
臭化エチジウム染色されたアガロース・ゲル電気泳動写
真である。
【図４】図４は、実施例２において合成したＤＮＡの、
臭化エチジウム染色されたアガロース・ゲル電気泳動写
真である。
臭化エチジウム染色されたアガロース・ゲル電気泳動写
真である。
フロントページの続き (72)発明者 平井 正名 愛知県刈谷市昭和町１丁目１番地 株式会 社デンソー内 (72)発明者 梶野 勉 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 HA19 4B063 QA20 QQ42 QR08 QR38 QR42 QR62 QS16 QS25 QX01
Claims (6)
- 【請求項１】 ３種以上の鋳型一本鎖ＤＮＡを使用して
長鎖二本鎖ＤＮＡを合成する方法であって、 （１）少なくとも３′−末端又は５′−末端のどちらか
一方に互いに相補的な結合領域を有し、かつ、上記結合
領域においてアニールして連続的に連結して上記二本鎖
ＤＮＡの塩基配列の全体を構成することができる３種以
上の鋳型一本鎖ＤＮＡに、連結後の鋳型一本鎖ＤＮＡの
末端に、３′−末端が突き出た場合には、その３′−末
端側に相補的にアニールするプライマーＤＮＡの存在
下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて、上記二本鎖ＤＮ
Ａの全体長の長さをもつ長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを合成す
る第１の工程を有するＤＮＡの合成方法。 - 【請求項２】 （２）前記第１の工程において得られた
長鎖鋳型二本鎖ＤＮＡを、ａ）上記の３′−末端側に相
補的にアニールするプライマーＤＮＡと、ｂ）上記のア
ニールして連続的に連結した複数種の鋳型一本鎖の連結
物の末端に、５′−末端が突き出た鋳型一本鎖が存在す
る場合には、その５′−末端側の塩基配列をもつプライ
マーＤＮＡの存在下、ポリメラーゼ連鎖反応に供して、
目的とする長鎖二本鎖ＤＮＡを得る、第２の工程をさら
に有することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡの
合成方法。 - 【請求項３】 前記鋳型一本鎖ＤＮＡの全てが化学合成
ＤＮＡである、請求項１又は２に記載のＤＮＡの合成方
法。 - 【請求項４】 前記鋳型一本鎖ＤＮＡの各々の前記反応
液中の濃度がほぼ等しく、かつ、前記プライマーＤＮＡ
の量が、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの濃度に比較して１０倍
以上で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
ＤＮＡの合成方法。 - 【請求項５】 前記プライマーＤＮＡの溶融温度（Ｔ
ｍ）を、前記鋳型一本鎖ＤＮＡの相補的な結合領域のＴ
ｍよりも高くなるように、それらの相補的領域の塩基配
列を設定し、前記第１の工程において、少なくとも（ｌ
ｏｇ ｎ／ｌｏｇ ２）回以上（ここで、ｎは、前記鋳
型一本鎖ＤＮＡの種類の数であり、そして式の値は小数
点以下を切り上げた整数である。）、前記鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡの相補的な結合領域のＴｍの内最も低い温度以下で
アニーリングさせ、そしてそれに見合う温度で前記プラ
イマーを伸長させて、ポリメラーゼ反応を行い、その
後、前記第２の工程において、前記プライマーＤＮＡの
Ｔｍの内最も低い温度付近でアニーリングさせ、そして
それに見合う温度で前記プライマーを伸長させて、ポリ
メラーゼ連鎖反応を行う、請求項１〜４のいずれか１項
に記載のＤＮＡの合成方法。 - 【請求項６】 前記鋳型一本鎖ＤＮＡが、５０〜１２０
塩基対の長さであり、そして前記鋳型一本鎖ＤＮＡの種
類の数が、３〜４００である、請求項１〜５のいずれか
１項に記載の長鎖二本鎖ＤＮＡの合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10267227A JP2000083668A (ja) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | 複数の鋳型一本鎖ｄｎａを使用した長鎖二本鎖ｄｎａの合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10267227A JP2000083668A (ja) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | 複数の鋳型一本鎖ｄｎａを使用した長鎖二本鎖ｄｎａの合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000083668A true JP2000083668A (ja) | 2000-03-28 |
Family
ID=17441916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10267227A Pending JP2000083668A (ja) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | 複数の鋳型一本鎖ｄｎａを使用した長鎖二本鎖ｄｎａの合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000083668A (ja) |
-
1998
- 1998-09-07 JP JP10267227A patent/JP2000083668A/ja active Pending
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