CN105176971A - Bst DNA聚合酶在RNA扩增中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Bst？DNA聚合酶在RNA扩增中的应用，所述Bst？DNA聚合酶具有反转录酶活性，使RNA在其作用下反转录为cDNA。本发明以Bst？DNA聚合酶具有反转录酶活性这一新发现为基础，构建了新的RNA扩增检测新方法，所述方法将反转录与后续核酸扩增融为一体，全过程无需对温度进行调节，不需要添加额外的反转录酶，操作简单，缩短反应时间，为RNA反转录及扩增检测提供了新的方法学参考和技术支持。发现的Bst？DNA聚合酶可以在较高的温度下进行反转录反应，这有助于打开和结合具有复杂二级结构的RNA，从而解决了AMV等反转录酶难以扩增RNA高级结构区域的问题。
Description
背景技术
RNA是基因组中遗传信息表达的核心和关键，也是生命科学研究的重要对象，对RNA研究的目的、技术手段等虽然各不相同，但获取足够的量进行后续研究却是共同的要求。随着许多先进实验仪器设备以及技术方法的应用，RNA的扩增手段越来越多，但生物医学、检验检疫等方面对RNA的快速扩增提出了更高的要求，使之更满足现场检测的需要。
RNA扩增是以RNA为模板，反转录为cDNA，再在cDNA的基础上进行扩增。目前，扩增RNA的常用方法有反转录PCR(RT-PCR)，滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、指数链置换技术(exponentialSDA)、改良的侵入扩增反应(modifiedinvaderamplification)、发夹介导的二次酶扩增和环介导等温扩增(LAMP)等，但这些方法大多涉及反转录过程，即引物在反转录酶(AMV、MMLV等)的作用下以RNA为模板产生cDNA链，这也是目前RNA扩增最关键的一步。
现有的RNA检测实验存在反转录和后续扩增两个步骤，以RT-PCR为例，提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
反转录酶的最佳反应条件为42℃保温60min，而42℃时，RNA的二级结构难以被打开，需要先在70℃保温5min后立即冰浴，再进行反转录操作，第二步以反转录cDNA为模板的扩增实验所用的酶也有温度要求，两者难以进行温度的统一，得到在同一温度下反应的最佳检测条件。因此现有的RNA扩增检测方法存在反应时间长、操作步骤复杂等限制，无法满足RNA快速检测的需求。
BstDNA聚合酶大片段是BacillusstearothermophilusDNA聚合酶的一部分，具有5′→3′DNA聚合酶活性，但缺失5′→3′核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶大片段最主要的特性是具有超强的链置换功能(stranddisplacement)，可用于要求嗜温链置换的等温扩增实验，富含GC区域的DNA测序，纳克级含量DNA模板的快速测序。需要注意的是，此酶建议反应温度不要超过70℃，不能用于热循环测序或PCR。长期贮存需加入100μg/mlBSA或0.1％TritonX-100。
Bst2.0DNA聚合酶是BstDNA聚合酶,大片段的同源物，并由电脑模拟设计完成。Bst2.0DNA聚合酶具有5′→3′的聚合酶活性和强链置换活性，但没有5′→3′核酸外切酶活性。和野生型BstDNA聚合酶，大片段相比，该酶可有效提高扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等。来源于E.coli菌株，该菌株携带有诱导启动子，可表达Bst2.0DNA聚合酶蛋白。
Bst2.0WarmStartDNA聚合酶在等温聚合酶中是独有的。像“热启动”PCR聚合酶一样，这种特性在低于最适反应温度下可以抑制酶活性。因此，实验操作可以在室温下进行而不至于引发非特异性反应。
单位定义：65℃条件下，30分钟内使10nmol的dNTP掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：50mMKCl,20mMTris-HCl(pH8.8),10mMMgCl2,30nMM13mp18ssDNA,70nMM13测序引物(-47)24mer,200μMdATP,200μMdCTP,200μMdGTP,100μM[3H]dTTP,100μg/mlBSA和酶，65℃温育。BstDNA聚合酶除了其最佳缓冲溶液外，根据后续扩增实验需要的其他缓冲溶液也有一定的活性，例如NEBuffer3.1。
贮存条件：50mMKCl,10mMTris-HCl(pH7.5),1mMDTT,0.1mMEDTA,0.1％TritonX-100和50％甘油。贮存于-20℃。
热失活：80℃，20min。
BstDNA聚合酶包括BstDNA聚合酶大片段(BstlargefragmentDNApolymerase)，Bst2.0DNA聚合酶(Bst2.0DNApolymerase)，Bst2.0WarmStartDNA聚合酶(Bst2.0WarmStartDNApolymerase)
BstDNA聚合酶还包括BstDNA聚合酶大片段为主体突变而成的新酶，或与其他配体结合成的新酶，其催化主体为BstDNA聚合酶大片段。以下统一简称为BstDNA聚合酶。
发明内容
本发明针对现有RNA扩增检测技术上的不足，以新发现的BstDNA聚合酶可以反转录RNA的特性，提出了对RNA扩增的新应用，解决现有RNA扩增技术中反转录反应和后续扩增反应过程复杂，时间长，成本高的问题。
BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用，所述BstDNA聚合酶具有反转录酶活性，使RNA在其作用下反转录为cDNA。
所述BstDNA聚合酶具备反转录功能时的最佳反应条件为：1X等温扩增缓冲液[20mMTris-HCl(pH8.8@25℃)，50mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Tween-20]，根据后续扩增实验其他酶的需要，也可以选择其他的缓冲溶液，如NEBuffer3.1。
所述BstDNA聚合酶具有反转录活性时的适宜温度为55-72℃，优选的55～65℃。
反转录的模板RNA长度为：小于262nt，优选的50-125nt。
根据所述BstDNA聚合酶的反转录活性，RNA扩增的方法，步骤如下：
(1)、以目标RNA为模板，加入BstDNA聚合酶，反转录合成cDNA；进一步的，所述反转录合成温度为55～65℃，所述BstDNA聚合酶加入量为反应体系的1/200。
(2)、以步骤1所得的cDNA为模板，加入DNA聚合酶，扩增cDNA的数量以实现目标RNA的扩增。
进一步的，所述RNA扩增的方法为等温扩增，步骤如下：
(1)、以目标RNA为模板，加入BstDNA聚合酶，反转录合成cDNA；进一步的，所述反转录合成温度为55～65℃，所述BstDNA聚合酶加入量为反应体系的1/200。
(2)、以步骤1所得的cDNA为模板，加入BstDNA聚合酶，扩增cDNA的数量以实现目标RNA的扩增。
所述等温扩增时1XNEBuffer3.1为100mMNaCl,50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100μg/mlBSA(pH7.9@25℃)。根据具体扩增实验，缓冲溶液也可以为NEBuffer1，NEBuffer2，等温缓冲溶液等。
所述方法根据BstDNA聚合酶兼具反转录活性与聚合酶活性，直接在RNA靶标上进行链置换扩增，使得整个体系完全在等温条件下一步进行，无需反转录酶的加入，使反转录与扩增实现一体化，减少了酶的用量，且缩短了反应时间。
有益效果：
(1)本发明以BstDNA聚合酶具有反转录酶活性这一新发现为基础，构建了新的RNA扩增检测新方法，所述方法将反转录与后续核酸扩增融为一体，全过程无需对温度进行调节，不需要添加额外的反转录酶，操作简单，缩短反应时间，为RNA反转录及扩增检测提供了新的方法学参考和技术支持。
(2)发现的BstDNA聚合酶可以在较高的温度下进行反转录反应，这有助于打开和结合具有复杂二级结构的RNA，从而解决了AMV等反转录酶难以扩增RNA高级结构区域的问题。
附图说明
图1非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳反转录验证图
其中，泳道M：20bpDNAMarker；泳道1：750nM的RNA模板；泳道2：750nM的RNA模板，750nM的反转录引物；泳道3：AMV反转录酶参与的反转录扩增反应；泳道4：BstDNA聚合酶大片段参与的反转录扩增反应
图2HCV–RNA(50nt)RT-PCR结果图
其中，曲线1：Bst2.0DNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线2：Bst2.0WarmStartDNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线3：BstDNA聚合酶大片段参与的RT-PCR反应；曲线4：AMV反转录酶参与的RT-PCR反应；曲线5：Blank(即以水为模板进行的PCR)
图3大肠杆菌(K-12)16SrRNA(65nt)RT-PCR结果图
其中，曲线1：Bst2.0DNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线2：Bst2.0WarmStartDNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线3：BstDNA聚合酶大片段参与的RT-PCR反应；曲线4：AMV反转录酶参与的RT-PCR反应；曲线5：Blank(即以水为模板进行的PCR)
图4大肠杆菌(K-12)16SrRNA(125nt)RT-PCR结果图
其中，曲线1：Bst2.0DNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线2：Bst2.0WarmStartDNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线3：BstDNA聚合酶大片段参与的RT-PCR反应；曲线4：AMV反转录酶参与的RT-PCR反应；曲线5：Blank(即以水为模板进行的PCR)
图5大肠杆菌(K-12)16SrRNA(262nt)RT-PCR结果图
其中，曲线1：Bst2.0DNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线2：Bst2.0WarmStartDNA聚合酶参与的RT-PCR反应；曲线3：BstDNA聚合酶大片段参与的RT-PCR反应；曲线4：AMV反转录酶参与的RT-PCR反应；曲线5：Blank(即以水为模板进行的PCR)
图6大肠杆菌(K-12)16SrRNA不同长度RT-PCR结果图
其中，泳道M：20bpDNAMarker；泳道1：AMV反转录酶参与的模板为65nt的RT-PCR；泳道2：BstDNA聚合酶，大片段参与的模板为65nt的RT-PCR；泳道3：AMV反转录酶参与的模板为125nt的RT-PCR；泳道4：BstDNA聚合酶，大片段参与的模板为125nt的RT-PCR；泳道5：AMV反转录酶参与的模板为262nt的RT-PCR；泳道6：BstDNA聚合酶，大片段参与的模板为262nt的RT-PCR；泳道7：以水模板进行PCR
图7.不同浓度cDNA荧光信号,由Bst2.0聚合酶反转录得到的cDNA稀释不同浓度进行实时荧光定量RCR的结果图
其中，曲线1：1.0pmolcDNA作为模板进行PCR；曲线2：100fmolcDNA作为模板进行PCR；曲线3：10fmolcDNA作为模板进行PCR；曲线4：1.0fmolcDNA作为模板进行PCR；曲线5：100amolcDNA作为模板进行PCR；曲线6：0pmolcDNA作为模板进行PCR。
图8.不同浓度cDNAPOI值线性关系图,cDNA浓度的负对数和其信号曲线斜率最大值对应的时间(POI)之间作关系曲线
具体实施方式
1、BstDNA聚合酶具有反转录活性的验证实验
BstDNA聚合酶具有反转录酶活性，使RNA在其作用下反转录为cDNA。
验证实验一：扩增HCV–RNA-聚丙烯酰胺电泳检测
利用人工合成的HCV(丙型肝炎病毒)中的一段50ntRNA作为模板，分别用AMV反转录酶和BstDNA聚合酶大片段进行反转录。
RNA模板序列为：GUGGUACUGCCUGAUAGGGUGCUUGCGAGUGC-CCCGGGAGGUCUCGUAGA
反转录引物序列为：TCTACGAGACCTCCC
实验分为5组:
组1(泳道M)：20bpDNAMarker
组2(泳道1)：750nM的RNA模板
组3(泳道2)：750nM的RNA模板，750nM的反转录引物
组4(泳道3)：AMV反转录酶参与的反转录扩增反应
反转录体系为750nM的RNA模板，750nM的反转录引物，70℃保温5min后立即冰浴，向该体系分别加入0.15U/μLAMV反转录酶，1×AMV反转录反应液(50mMTris-HCl,50mMKCl,10mMMgCl2,0.5mMspermidine,10mMDTT,pH8.3@25℃)，150uMdNTPs。依次30℃保温5min，42℃反应60min，再80℃20min使酶失活；
组5(泳道4)：BstDNA聚合酶大片段参与的反转录扩增反应
反转录体系为750nM的RNA模板，750nM的反转录引物。70℃保温5min后立即冰浴，然后向该体系分别加入0.05U/μLBstDNA聚合酶大片段，1×NEB等温扩增反应液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，15mMKCl，2mMMgSO4，0.1％Tween-20，pH8.8@25℃)，150uMdNTPs。依次30℃保温5min，65℃反应55min，再80℃20min使酶失活。
将组1的Marker与组2-5获得的产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为17.5％，电压138V，电泳55分钟，EB染色。
结果如图1所示，结果显示，泳道3(AMV)与泳道4(BstDNA聚合酶大片段)有目的条带(50bp的DNA-RNA杂交带)，且4比3的目的条带更亮，说明均有反转录的产物，即BstDNA聚合酶大片段有反转录活性，且在50nt时，反转录能力比AMV反转录酶强。
验证实验二：扩增HCV–RNA-荧光定量PCR检测
如验证实验一中的反转录体系，设置5组实验，将反转录产物进行荧光定量PCR检测。
组1(曲线1)：Bst2.0DNA聚合酶参与反转录的RT-PCR反应；
组2(曲线2)：Bst2.0WarmStartDNA聚合酶参与反转录的RT-PCR反应；
组3(曲线3)：BstDNA聚合酶大片段参与反转录的RT-PCR反应；
组4(曲线4)：AMV反转录酶参与的RT-PCR反应；
组5(曲线5)：以水模板进行PCR的空白对照。
上游引物序列为：CTGTGTACTGCCTGATAG
下游引物序列为：AGTGATCTACGAGACCTC
荧光定量PCR体系为：1μL10-8M的模板，加入200nM的上游引物，200nM的下游引物，1×Taqbuffer(10mMTris-HCl，50mMKCl，1.5mMMgCl2，pH8.3@25℃),0.5×SrbrGreenI荧光染料,TaqDNA聚合酶0.025U/μL，200uM的dNTPs。
利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，程序为94℃3min，然后94℃30seconds，57℃30seconds，72℃20seconds，进行20个循环。
实验结果如图2所示，荧光曲线1-3的Ct值略小于曲线4，说明由BstDNA聚合酶反转录得到的cDNA浓度比由AMV反转录得到的cDNA浓度大，即在模板RNA长50nt时，BstDNA聚合酶的反转录活性比AMV略高。
验证实验三扩增大肠杆菌K-12的16SrRNA
利用RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒(博迈德生物Biomed)提取的大肠杆菌K-12的16SrRNA作为模板，分别用AMV反转录酶和BstDNA聚合酶大片段进行反转录PCR(RT-PCR)，通过荧光信号和电泳结果验证方法的可行性和原理的正确性。
65ntRNA模板序列为：
AAUUGAAGAGUUUGAUCAUGGCUCAGAUUGAACGCUGGCGGCAGGCCUAACACAUGCAAGUCGAA
对应的反转录引物RP1序列为：TTCGACTTGCATGTGTTAGG
125ntRNA模板序列为：
AAUUGAAGAGUUUGAUCAUGGCUCAGAUUGAACGCUGGCGGCAGGCCUAACACAUGCAAGUCGAACGGUAACAGGAAACAGCUUGCUGUUUCGCUGACGAGUGGCGGACGGGUGAGUAAUGUCUG
对应的反转录引物RP2序列为：CAGACATTACTCACCCGTCC
262ntRNA模板序列为：
AAUUGAAGAGUUUGAUCAUGGCUCAGAUUGAACGCUGGCGGCAGGCCUAACACAUGCAAGUCGAACGGUAACAGGAAACAGCUUGCUGUUUCGCUGACGAGUGGCGGACGGGUGAGUAAUGUCUGGGAAACUGCCUGAUGGAGGGGGAUAACUACUGGAAACGGUAGCUAAUACCGCAUAACGUCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCCUCGGGCCUCUUGCCAUCGGAUGUGCCCAGAUGGGAUUAGCUUGUUGGUGGGGUAA
对应的反转录引物RP3序列为：TTACCCCACCAACAAGCTAA
扩增时的上游引物FP序列为：AATTGAAGAGTTTGATCATGGC
65nt模板反转录产物扩增时下游引物序列为：RP1：TTCGACTTGCATGTGTTAGG
125nt模板反转录产物扩增时下游引物序列为：RP2：CAGACATTACTCACCCGTCC
262nt模板反转录产物扩增时下游引物序列为：RP3：TTACCCCACCAACAAGCTAA
反转录体系组成为50nM的RNA模板，50nM的反转录引物。70℃保温5min后立即冰浴，然后向该体系分别加入1)0.15U/μLAMV反转录酶，1×AMV反转录反应缓冲液(50mMTris-HCl,50mMKCl,10mMMgCl2,0.5mMspermidine,10mMDTT,pH8.3@25℃)，150uMdNTPs；2)0.05U/μLBstDNA聚合酶大片段，1×NEB等温扩增反应液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，15mMKCl，2mMMgSO4，0.1％Tween-20，pH8.8@25℃)，150uMdNTPs。
将反转录的产物分别稀释500倍作为PCR的模板，即模板浓度为0.1nM。加入200nM的上游引物，200nM的下游引物，1×Taqbuffer(10mMTris-HCl，50mMKCl，1.5mMMgCl2，pH8.3@25℃),0.5×SrbrGreenI荧光染料,TaqDNA聚合酶0.025U/μL，200uM的dNTPs。
利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，程序为94℃3min，然后94℃30seconds，62℃30s，72℃20s，进行20个循环。
结果如图3-6所示，当RNA模板长度为65nt时，曲线1-3分别为以Bst2.0聚合酶，Bst聚合酶大片段，Bst2.0warmstart聚合酶，将大肠杆菌K-1216SrRNA(65nt)进行反转录，并将得到的cDNA为模板进行的PCR。曲线5为PCR的空白对照。由图可知，荧光曲线1-3的起峰时间略早于曲线4-AMV反转录酶得到的cDNA进行PCR的荧光曲线，说明由BstDNA聚合酶反转录得到的cDNA浓度比由AMV反转录得到的cDNA浓度大，即在模板RNA长65nt时，BstDNA聚合酶的反转录活性比AMV强。
如图4所示，当RNA模板长度为125nt时，曲线1-3分别为以Bst2.0聚合酶，Bst聚合酶大片段，Bst2.0warmstart聚合酶将大肠杆菌K-1216SrRNA进行反转录得到的cDNA为模板进行的荧光定量PCR。5为PCR的空白对照。由图可知，荧光曲线1-3的Ct值比曲线4的Ct值略大，说明由BstDNA聚合酶反转录得到的cDNA浓度比由AMV反转录酶反转录得到的cDNA浓度略低，即在模板RNA长125nt时，BstDNA聚合酶具有反转录活性，活性与AMV反转录酶活性接近，但是略低于AMV的反转录活性。
如图5所示，当RNA模板长度为262nt时，曲线1-3分别为以Bst2.0聚合酶，Bst聚合酶大片段，Bst2.0warmstart聚合酶将大肠杆菌K-1216SrRNA进行反转录得到的cDNA为模板进行的荧光定量PCR。5为PCR的空白对照。由图可知，荧光曲线1-3的Ct值与曲线4的Ct值相差约9个循环，说明由BstDNA聚合酶反转录得到的cDNA浓度比由AMV反转录酶反转录得到的cDNA浓度低大约1000倍，即在模板RNA长262nt时，BstDNA聚合酶的反转录活性仅为AMV反转录酶的1/512。
以Bst聚合酶大片段参与的反转录扩增为例，对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证。
结果如图6所示，与AMV反转录酶参与的反转录扩增反应相比，在RNA模板长度在65nt、125nt、262nt时，BstDNA聚合酶大片段参与的RT-PCR扩增反应均有条带，与AMV反转录酶参与的反转录扩增反应条带位置一致，在262bp处时，BstDNA聚合酶大片段的目的条带已经不明显，反转录能力已经很弱。结果说明，BstDNA聚合酶对不同长度RNA都有反转录活性，在125nt以内，具有较好的反转录能力。
验证实验四以50nM的大肠杆菌K-12-RNA为模板，利用Bst2.0WarmStartDNA聚合酶进行一系列浓度梯度的RT-PCR。
模板RNA序列为：
AAUUGAAGAGUUUGAUCAUGGCUCAGAUUGAACGCUGGCGGCAGGCCUAACACAUGCAAGUCGAA
反转录引物FP1序列为：TTCGACTTGCATGTGTTAGG
扩增上游引物序列为：AATTGAAGAGTTTGATCATGGC
扩增下游引物序列为：FP1：TTCGACTTGCATGTGTTAGG
反转录体系为50nM的大肠杆菌K-12-RNA模板，50nM的反转录引物。70℃保温5min后立即冰浴，然后向该体系分别加入0.5UBst2.0WarmStartDNA聚合酶，1×NEB等温扩增反应液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，15mMKCl，2mMMgSO4，0.1％Tween-20，pH8.8@25℃)，150uMdNTPs。
再将反转录的产物分别稀释一系列浓度梯度作为PCR的模板，即模板浓度分别为1.0pmol；100fmol；10fmol；1.0fmol；100amol；0pmol。加入200nM的上游引物，200nM的下游引物，1×Taqbuffer(10mMTris-HCl，50mMKCl，1.5mMMgCl2，pH8.3@25℃),0.5×SrbrGreenI荧光染料,TaqDNA聚合酶0.025U/μL，200uM的dNTPs。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，程序为94℃3min，然后94℃30s，62℃30s，72℃20seconds，进行30个循环。
结果如图7、图8所示，在模板长度65nt时，Bst2.0WarmStartDNA聚合酶具有反转录活性，呈良好的线性，线性方程为：POI＝-51.553-4.00547lgA(mol)；R2＝0.99119。
验证实验4说明BstDNA聚合酶反转录得到的cDNA可作为RT-PCR后续扩增实验的有效模板.，以cDNA为后续扩增的方法包括RT-PCR而不仅限于此。
根据所述BstDNA聚合酶的反转录活性，可以设计将RNA反转录与核酸扩增合为一体的RNA等温扩增的方法，可以包括任意使用BstDNA聚合酶将RNA反转录为cDNA的扩增方法，这里只列出一种，步骤如下：
(1)、以目标RNA为模板，加入BstDNA聚合酶，反转录合成cDNA，反应温度为55℃，所述BstDNA聚合酶加入量为反应体系的1/200。(10μL体系里加0.05μL)
(2)、以步骤1所得的cDNA为模板，加入BstDNA聚合酶，扩增cDNA的数量以实现目标RNA的扩增。
需要指出的是，以上所述，仅为本发明的其中一种具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化相替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
核苷酸序列表
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<120>BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用
<130>2010
<160>11
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>50
<212>RNA
<213>HepatitisCvirus
<400>1
gugguacugccugauagggugcuugcgagugccccgggaggucucguaga50
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tctacgagacctccc15
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctgtgtactgcctgatag18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agtgatctacgagacctc18
<210>5
<211>65
<212>RNA
<213>Escherichiacoli
<400>5
aauugaagaguuugaucauggcucagauugaacgcuggcggcaggccuaacacaugcaag60
ucgaa65
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttcgacttgcatgtgttagg20
<210>7
<211>125
<212>RNA
<213>Escherichiacoli
<400>7
aauugaagaguuugaucauggcucagauugaacgcuggcggcaggccuaacacaugcaag60
ucgaacgguaacaggaaacagcuugcuguuucgcugacgaguggcggacgggugaguaau120
gucug125
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cagacattactcacccgtcc20
<210>9
<211>262
<212>RNA
<213>Escherichiacoli
<400>9
aauugaagaguuugaucauggcucagauugaacgcuggcggcaggccuaacacaugcaag60
ucgaacgguaacaggaaacagcuugcuguuucgcugacgaguggcggacgggugaguaau120
gucugggaaacugccugauggagggggauaacuacuggaaacgguagcuaauaccgcaua180
acgucgcaagaccaaagagggggacccucgggccucuugccaucggaugugcccagaugg240
gauuagcuuguuggugggguaa262
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ttaccccaccaacaagctaa20
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
aattgaagagtttgatcatggc22。
Claims (7)
1.BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用，其特征在于：所述BstDNA聚合酶具有反转录酶活性，参与RNA的反转录，使RNA在其作用下反转录为cDNA。
2.如权利要求1所述的BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用，其特征在于：所述BstDNA聚合酶具有反转录活性时的适宜温度为55-72℃。
3.如权利要求2所述的BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用，其特征在于：所述BstDNA聚合酶具有反转录活性时的适宜温度为优选的55-65℃。
4.如权利要求1-3任一所述的BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用，其特征在于：所述BstDNA聚合酶反转录的RNA模板长度小于262nt。
5.如权利要求4所述的BstDNA聚合酶在RNA扩增中的应用，其特征在于：所述BstDNA聚合酶反转录的RNA模板长度为50-125nt。
6.一种基于如权利要求1所述应用扩增RNA的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)、以目标RNA为模板，加入BstDNA聚合酶，反转录合成cDNA；
(2)、以步骤1所得的cDNA为模板，加入DNA聚合酶，扩增cDNA的数量以实现目标RNA的扩增。
7.一种基于如权利要求1所述应用等温扩增RNA的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)、以目标RNA为模板，加入BstDNA聚合酶，反转录合成cDNA；
(2)、以步骤1所得的cDNA为模板，加入BstDNA聚合酶，扩增cDNA的数量以实现目标RNA的扩增。
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