CN101974638B

CN101974638B - 连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法

Info

Publication number: CN101974638B
Application number: CN201010540150A
Authority: CN
Inventors: 周国华; 邹秉杰; 武海萍; 马寅姣
Original assignee: Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Current assignee: Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: CN101974638A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法。本发明核酸信号扩增检测方法包括1)核酸侵入信号扩增阶段，形成flap片段的积累；2)flap连接阶段，将flap片段与分子信标上的另一寡核苷酸相连，形成切刻内切酶位点；3)切刻内切酶信号扩增阶段，切刻内切酶只切割分子信标链，使分子信标的荧光基团与淬灭基团分离，新的完整的分子信标会再次与连接的flap片段杂交，从而使靶核酸信号得到扩增；4)靶核酸信号检测阶段。利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

Description

连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法。

背景技术

核酸检测已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病的预防与控制等很多方面。目前常用的核酸检测技术大多基于模板扩增原理，即扩增产物与靶核酸序列相同，如聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)、环介导的核酸等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP)、滚环扩增技术(Rolling Cycle Amplification，RCA)、基于核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)、转录酶介导的扩增技术(Transcription Mediated Amplification，TMA)、解链酶扩增技术(Helicase DependantAmplification，HDA)、链置换扩增技术(Strand Displacement Amplification，SDA)等。上述核酸扩增方法由于扩增产物与靶核酸序列相同，因此极易造成产物交叉污染，使核酸检测经常出现假阳性的结果。

为了避免扩增产物的交叉污染，近年来发展了一些不扩增靶核酸，而是由靶核酸引发其他信号分子扩增，间接地对靶核酸进行检测的核酸信号扩增检测方法，如分枝DNA法(Branch-DNA，B-DNA)、核酸侵入信号扩增实验(Invader Assay)以及一些基于电化学检测的信号扩增法。其中，B-DNA法及核酸侵入信号扩增实验均有较高的灵敏度，但它们都需要合成特殊结构或特殊荧光标记的探针，提高了检测成本；而基于电化学检测的信号扩增法往往灵敏度较低，达不到核酸检测的要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法。

本发明利用连接反应，将核酸侵入反应(Invasive reaction)与切刻内切酶反应(Nickingreaction)偶联，建立了一种新的高灵敏核酸信号扩增检测方法。在所建立的方法中首先进行核酸侵入反应，该反应利用核酸5’外切酶或5’flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链至少一个碱基形成的探针-靶核酸特异性结构(如附图1所示)，并将下游探针5’不匹配片段(称为flap片段)连同被侵入的碱基切断，其切割位点如附图1中箭头所指位置；之后利用连接反应将切下的flap片段与信号分子(分子信标)上的另一寡核苷酸相连，连接后形成切刻内切酶位点；最后进行切刻内切酶反应。切刻内切酶能够识别DNA双链特定序列但只切割其中一条单链形成一个切口。本发明具体技术方案如下：

利用连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法，依次包括以下步骤(如图2所示)：

1)核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；

2)flap连接阶段：向步骤1)的反应体系中加入连接酶体系及环状部分杂交有一段5’磷酸化的寡核苷酸的分子信标，在所述的连接酶体系中连接酶的作用下，步骤1)核酸侵入信号扩增产生的flap片段会与所述的分子信标环状部分的5’磷酸化的寡核苷酸相连，将分子信标打开发出荧光信号，同时连接好的flap片段与信标形成的双链上的切刻内切酶识别位点形成，得到能发出荧光信号且含有切刻内切酶识别位点的连接产物；

3)切刻内切酶信号扩增阶段：将切刻内切酶反应体系加入到步骤2)得到的连接产物中，所述的切刻内切酶反应体系中的切刻内切酶识别所述的切刻内切酶识别位点，并只切割分子信标链，切割后的分子信标两部分片段与未切割的完整的分子信标相比，解链温度低，在切刻内切酶酶切反应温度下会与连接的flap片段分离，使分子信标的荧光基团与淬灭基团分离，新的完整的分子信标会再次与连接的flap片段杂交，形成新一轮的切刻内切酶切割循环，这一过程使荧光信号逐渐增强，从而使靶核酸信号得到扩增；

4)信号检测阶段：对步骤3)扩增得到的靶核酸信号进行检测。

其中，所述的核酸为DNA或RNA。

所述的核酸侵入反应体系包含MOPS、Tween-20、Nonidet P40、上游探针、下游探针、MgCl₂以及靶核酸。

所述的核酸5’外切酶或5’flap内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN或其他类似的核酸5’外切酶或5’flap内切酶，优选AfuFEN。

所述的连接酶体系包括由132mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，2mM DTT，2mM ATP及15％PEG 6000组成的pH 7.6连接反应缓冲液，5’磷酸化的与分子信标环状区域的一半互补的寡核苷酸片段，分子信标，水及连接酶；所述的切刻内切酶反应体系包括NaCl，20mM、pH7.9的Tris-HCl，MgCl₂，DTT以及切刻内切酶。

所述连接酶选自大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶、9°N DNA连接酶、Ligase-65 DNA连接酶或其他类似的核酸连接酶，优选T4 DNA连接酶。

所述的切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII或其他类似的切刻内切酶，优选Nb.BsmI。

所述的分子信标一端标记荧光基团，选自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Cy5或Cy3以及其他类似的荧光基团，优选FAM；另一端标记淬灭基团，选自DABCYL、ECLIPSE、TAMRA或BHQ以及其他类似的荧光淬灭基团，优选DABCYL。

所述的切刻内切酶反应体系中还可以加入表面活性剂聚乙二醇6000(PEG 6000)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)或抗氧化剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)中的至少一种。这些表面活性剂或抗氧化剂的加入可以显著提高切刻内切酶反应效率。

步骤4)所述的检测可以通过荧光检测装置实现，优选通过荧光分光光度计或实时荧光热循环仪实现，进一步优选通过实时荧光热循环仪实现。

本发明的有益效果：

在本发明整个核酸信号扩增检测方法过程中，只有第一步核酸侵入信号扩增中的上、下游探针需要针对不同模板进行设计，其它各步骤中的成分均可通用，并且上、下游探针不需要任何修饰，成本低。

由于核酸5’外切酶或5’flap内切酶仅识别上下游探针形成的特异结构，对模板序列没有要求，所以本方法可以检测任意模板，而无序列限制。

本发明信号发生分子为已经发展成熟并广泛应用的分子信标，相对于其它信号扩增的信号分子(如b-DNA)更加稳定，廉价。

利用本发明提供的方法进行核酸检测时，扩增产物与靶核酸序列无关，不会造成扩增产物的交叉污染是本发明的一大特色。

利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

附图说明

图1关于核酸侵入反应中核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别的探针-靶核酸特异性结构示意图。

图2是关于本发明的连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法的基本原理图。

图3是关于实施例1检测结果图。

图4是关于实施例2检测结果图。

图5是关于实施例3检测结果图。

有关附图的详细说明参见如下详细描述部分的内容。

具体实施方式

实施例1利用连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法检测人工合成寡核苷酸片段

本实施例检测了不同浓度的人工合成的单链DNA模板，用来验证本发明所陈述的核酸检测方法的可行性并考察了方法的灵敏度，同时本实施例中还检测了与靶核酸序列完全不相关的另外一条寡核苷酸片段，用来验证本发明所陈述的方法对序列的特异性。

反应条件：

1)核酸侵入信号扩增

核酸侵入反应体系组成为10mM MOPS，pH 7.5，0.05％Tween-20，0.05％Nonidet P40，0.1μM上游探针(序列为：5’-ATG TCA CTT CCC CTT GGT TCT CTC C-3’，即SEQ ID NO.1)，1μM下游探针(序列为：5’-AGC AGG ACG GGA TCT GGC CTG GTG C-3’，即SEQ ID NO.2)，7.5mM MgCl₂，向该体系中分别加入1000、100、10、1、0.1及0amol的靶核酸(序列为：5’-CTATTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA T-3’即SEQ ID NO.3)，以及10pmol与靶核酸序列完全不相关的另外一条寡核苷酸干扰片段(序列为：5’-TAC GAGACC TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC AGG CAG T-3’，即SEQ ID NO.4)，经95℃孵育5分钟后，向各管中加入71ng的AfuFEN，63℃反应2小时，各管反应总体积均为10μL。

2)连接反应

核酸侵入反应结束后，向核酸侵入反应各管中分别加入25μL的2×连接反应缓冲液(132mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，2mM DTT，2mM ATP，15％PEG 6000，pH 7.6)，4.8μL 10μM的5’磷酸化的与分子信标环状区域的一半互补的寡核苷酸片段(序列为：5’-P-ATG CAC TCATCTA-3’，SEQ ID NO.5)，4.0μL 10μM的分子信标(序列为：5’FAM-CGC ACG CTA GAT GAGTGC ATT CCC GTC CTG CTG CGT GCG-DABCYL-3’，即SEQ ID NO.6，委托大连宝生物公司合成)以及5.7μL水，45℃孵育5分钟，26℃加入0.5μL T4连接酶(17.5units/μL)，26℃反应15分钟，各管反应总体积为50μL。

3)切刻内切酶反应

连接反应结束后，向各管中加入50μL切刻内切酶反应液，其中包含0.2M NaCl，20mMTris-HCl(pH7.9)，20mM MgCl₂，2mM DTT，Nb.BsmI 50U，在60℃反应，利用MJ Opticon2实时荧光PCR仪每分钟检测一次荧光信号，反应90分钟。

实施例1的结果示于图3中。图3的结果显示，本发明所陈述的方法能够检测到0.1amol的靶核酸序列，并且对于与靶核酸序列完全不相关的另外一条寡核苷酸干扰片段的测定没有得到与空白区分的信号，说明本发明对核酸检测有很好的序列特异性。

实施例2利用连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法实现单碱基差异模板的区分检测

本实施例检测了与靶核酸在不同位置有一个碱基差异的六条人工合成突变模板(a：5’-CTATTG CAC CAG GCC AGA AGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.7；b：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGT TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA T-3’，即SEQID NO.8；c：5’-CTA TTG CAC CAG GCG AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA T-3’，即SEQ ID NO.9；d：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TCA GAG AAC CAA GGG GAA GTGACAT-3’，即SEQ ID NO.10；e：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGT GAG AAC CAA GGGGAA GTG ACA T-3’，即SEQ ID NO.11；f：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AACCAA CGG GAA GTG ACA T-3’，即SEQ ID NO.12)，各突变模板的序列与实施例1中的靶核酸序列仅在不同位置处有一个碱基的差异，各突变点位置如附图4中字母标注所示，各位点均突变为与实施例1中的靶核酸序列对应位点互补的碱基，即a处为A、b处为T、c处为G、d处为C、e处为T、f处为C，用来考察本发明中的方法检测核酸时区分单碱基差异的能力。

反应条件：

1)核酸侵入信号扩增

核酸侵入反应体系组成为10mM MOPS，pH 7.5，0.05％Tween-20，0.05％Nonidet P40，0.1μM上游探针(SEQ ID NO.1)，1μM下游探针(SEQ ID NO.2)，7.5mM MgCl₂，向该体系中分别加入100amol的靶核酸(同实施例1的靶核酸片段SEQ ID NO.3)及含有单碱基突变的模板，以及不含模板的空白对照，经95℃孵育5分钟后，向各管中加入71ng的AfuFEN，63℃反应2小时，各管反应总体积均为10μL。

2)连接反应

核酸侵入反应结束后，向核酸侵入反应各管中分别加入25μL的2×连接反应缓冲液(132mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，2mM DTT，2mM ATP，15％PEG 6000，pH 7.6)，4.8μL 10μM的5’磷酸化的与分子信标环状区域的一半互补的寡核苷酸片段(SEQ ID NO.5)，4.0μL 10μM的分子信标(SEQ ID NO.6)以及5.7μL水，45℃孵育5分钟，26℃加入0.5μL T4连接酶(17.5units/μL)，26℃反应15分钟，各管反应总体积为50μL。

3)切刻内切酶反应

实施例2的检测结果示于图4中。图4结果表明，本专利提供的核酸检测方法能够实现对单碱基差异的不同模板的区分检测，碱基突变位置越靠近侵入位点，与完全匹配的模板的检测结果差异越大，说明本方法具有极高的检测特异性。

实施例3 PEG 6000、Nonidet P-40、Tween-20以及抗氧化剂DTT提高切刻内切酶反应效率

本发明提供了提高切刻内切酶反应效率的方法，通过向切刻内切酶反应体系中分别引入表面活性剂聚乙二醇6000(PEG 6000)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)或抗氧化剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)能够显著提高切刻内切酶信号扩增的效率。本实施例仅针对切刻内切酶反应，考察所述添加剂对切刻内切酶反应的反应效率的提高作用，没有进行本发明提供方法中所述三个步骤中的步骤1)核酸侵入信号扩增和步骤2)flap连接，而是将分子信标和一条与分子信标环状区域互补的人工合成的flap连接产物加入到发明提供方法中所述三个步骤中的步骤3)切刻内切酶信号扩增的反应体系中，然后加入不同的所述添加剂，考察它们对切刻内切酶反应效率的影响。

反应条件：

向切刻内切酶反应液(0.1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.9，10mM MgCl₂，1mM DTT，Nb.BsmI 50U)中加入4.0μL 10μM的分子信标(SEQ ID NO.6)，1.0μL 0.1μM的与分子信标环状区域互补的人工合成的flap连接产物(序列为：5’-AGC AGG ACG GGA ATG CAC TCATCT A-3’即SEQ ID NO.13)，不同浓度的表面活性剂聚乙二醇6000(PEG 6000)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)或抗氧化剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)，反应总体积用水补到100μL，在60℃反应，利用MJ Opticon 2实时荧光PCR仪每2分钟检测一次荧光信号，反应200分钟，与不加表面活性剂及抗氧化剂的反应作对比。其中加入的PEG 6000的浓度为3.75％(％表示g/100mL)，Nonidet P-40的的浓度为0.005％(％表示g/100mL)，Tween-20的浓度为0.005％(％表示g/100mL)，DTT的浓度为0.5mM。

实施例3的检测结果示于图5中。图5结果表明，加入一定量的的表面活性剂聚乙二醇6000(PEG 6000)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脱水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)以及抗氧化剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)能够使切刻内切酶信号扩增的效率显著提高。

Claims

1.利用连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法，其特征在于依次包括以下步骤：

4)信号检测阶段：对步骤3)扩增得到的靶核酸信号进行检测。

2.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的核酸为DNA或RNA。

3.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的核酸侵入反应体系包含MOPS、Tween-20、Nonidet P40、上游探针、下游探针、MgCl₂以及靶核酸。

4.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的核酸5’外切酶或5’flap内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。

5.根据权利要求4所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的核酸5’外切酶或5’flap内切酶为AfuFEN。

6.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的连接酶体系包括由132mM Tris-HCl，20mM MgCl₂，2mM DTT，2mM ATP及15％PEG 6000组成的pH7.6的连接反应缓冲液，5’磷酸化的与分子信标环状区域的一半互补的寡核苷酸片段，分子信标，水及连接酶；所述的切刻内切酶反应体系包括NaCl，20mM、pH7.9的Tris-HCl，MgCl₂，DTT以及切刻内切酶。

7.根据权利要求1或6所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述连接酶选自大肠杆菌DNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶、9°N DNA连接酶或Ligase-65 DNA连接酶.

8.根据权利要求7所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述连接酶为T4 DNA连接酶。

9.根据权利要求1或6所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII.

10.根据权利要求9所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的切刻内切酶为Nb.BsmI。

11.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的分子信标一端标记荧光基团，选自FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Cy5或Cy3；另一端标记淬灭基团，选自DABCYL、ECLIPSE、TAMRA或BHQ。

12.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的分子信标一端标记荧光基团为FAM；另一端标记淬灭基团为DABCYL。

13.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于所述的切刻内切酶反应体系中还可以加入表面活性剂聚乙二醇6000、乙基苯基聚乙二醇、聚氧乙烯-20脱水山梨醇单月桂酸酯或抗氧化剂二硫苏糖醇中的至少一种。

14.根据权利要求1所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于步骤4)所述的检测通过荧光检测装置实现.

15.根据权利要求14所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于步骤4)所述的检测通过荧光分光光度计或实时荧光热循环仪实现。

16.根据权利要求15所述的核酸信号扩增检测方法，其特征在于步骤4)所述的检测通过实时荧光热循环仪实现。