CN115003828A - 病毒检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在样品中检测和区分靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法、以及包含所述试剂盒和用于所述方法的装置。本发明使用限制酶、聚合酶和寡核苷酸引物，在靶病原体存在时产生扩增产物，所述扩增产物与寡核苷酸探针接触以产生检测物分子。

Description

病毒检测
技术领域
本发明涉及用于检测和区分样品中的甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法，以及含有所述试剂盒和用于所述方法的装置。
背景技术
流感是呼吸道的传染性病毒感染。甲型流感是人类最常见的流感病毒类型，主要导致季节性流感流行，偶尔也会导致大流行。乙型流感病毒是不太常见的流行病原因。呼吸道合胞病毒(RSV)由两种毒株(A亚组和B亚组)组成，也是主要影响婴儿和老年人的传染病的原因。RSV的主要季节与流感季节重叠。使用分子诊断方法来识别感染流感和RSV的患者，有利于流行病和大流行病的有效控制、适当治疗选择和预防。
基于聚合酶的核酸序列扩增方法广泛用于分子诊断领域。最成熟的方法，聚合酶链反应(PCR)，通常涉及每个靶序列使用两个引物，在循环指数扩增过程中通过温度循环实现引物退火、DNA聚合酶延伸和新合成的DNA的变性。温度循环需要复杂设备进行，这限制了基于PCR的方法在某些应用中的使用。
链置换扩增(SDA)(EP0497272；US5455166；US5712124)被开发出来，作为替代PCR的一种等温方法，该方法无需温度循环在聚合酶扩增过程中实现双链DNA的退火和变性，而是用限制酶与链置换聚合酶的组合来分开两条DNA链。
在SDA中，在存在一种或多种α-巯基核苷酸的情况下，位于每个引物5'端的限制酶位点被引入扩增产物中，并且凭借限制酶仅切割其识别位点的半硫代磷酸酯形式的未修饰链的能力，用限制酶在限制位点产生切口。链置换聚合酶延伸每个切口的3'端并置换下游DNA链。通过有义反应和反义反应的偶联，产生指数扩增，其中从有义反应中置换出的链作为反义反应的靶，且反之亦然。SDA通常需要进行1个多小时，这大大限制了其在临床诊断领域的应用潜力。此外，扩增后产物的特异性检测和反应的起始都需要分开的程序来进行，这也增加了该方法的显著复杂性。
Maples等人(WO2009/012246)随后使用切口酶(nicking enzyme)进行SDA，切口酶是限制酶的一个子类，该酶在与其特异性双链识别序列结合后，仅能切割DNA的两条链中的一条。他们将这种方法称为切口和延伸扩增反应(NEAR)。利用切口酶而不是限制酶的NEAR随后也被其他人所利用，他们尝试了使用软件优化的引物(WO2014/164479)、通过温启动或有控制的降温(WO2018/002649)来改进方法。然而，只有极少数的切口酶可得，因此寻找一种对特定应用具有所需性质的酶更具挑战性。
使用限制酶或切口酶(NEAR)的SDA的一个关键缺点是它产生双链核酸产物，因此并不提供可用于有效检测扩增信号的内在过程。这大大限制了它在例如低成本诊断装置中的应用。所产生的扩增产物的双链性质，对于将扩增方法与信号检测偶联，提出了挑战，这是因为在不首先分离两条链的情况下将不可能进行基于杂交的检测。因此，需要更复杂的检测方法，如分子信标和荧光团/淬灭剂探针，这会因要求单独的过程步骤而使测定方案复杂化，并显著降低开发多重测定(multiplex assay)的潜力。
为克服SDA的局限性和允许有效地检测流感和RSV，因此十分需要可以应用增强型扩增方法以快速、灵敏和特异地进行核酸序列检测的分子诊断试验。本发明涉及在样品中检测和区分甲型流感病毒和乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法，所述的试剂盒和方法并入了核酸扩增，并且通过组合使用具有5'限制性位点的引物对和寡核苷酸探针对，产生了能够允许有效信号检测的检测物分子(detector species)。
发明概述
本发明提供用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其中，分别针对每种病原体，所述试剂盒包含以下组分(a)、(b)和(c)：
a)引物对，所述引物对包含：
i.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和
ii.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；
b)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
c)探针对，所述探针对包含：
i.具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
ii.具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且在所述杂交区域中不能被限制酶切割；且
所述试剂盒还包含：
d)逆转录酶；
e)链置换DNA聚合酶；
f)dNTP；和
g)一种或多种修饰的dNTP。
本发明的试剂盒可用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒，在这种情况下，所述试剂盒将另外包含针对病原体呼吸道合胞病毒的组分a)、b)和c)。试剂盒还可以包括试剂，例如反应缓冲液、盐，例如二价金属离子、添加剂和赋形剂。
试剂盒可以另外包括用于检测在存在靶病原体的情况下产生的检测物分子是否存在的工具。例如，试剂盒可以另外包含核酸侧流条(lateral flow strip)、电化学探针和/或比色或荧光染料、和/或用于检测电信号和/或碳或金变化的装置。
根据本发明的试剂盒可以与实施其使用方法的说明书一起提供。
本发明还提供了本发明的试剂盒用于检测和区分靶病原体的用途。
本发明也提供用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其中分别针对每种病原体，所述方法包括以下步骤：
a)使样品与以下组分接触：
i.引物对，所述引物对包含：
第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和
第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；
其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
ii.限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
iii.逆转录酶；
iv.链置换DNA聚合酶；
v.dNTP；和
vi.一种或多种修饰的dNTP，
以在病原体来源RNA存在的情况下产生扩增产物；
b)使a)的扩增产物与如下组分接触：
i.探针对，所述探针对包含：
具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且在所述杂交区中不能被限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触；
其中该第一和第二探针与所述扩增产物中的该至少一个分子的杂交产生病毒体检测物分子(detector species)；和
c)检测在步骤b)中产生的病原体检测物分子是否存在，其中病原体检测物分子的存在指示该样品中存在靶病原体。
本发明的方法可用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒，在这种情况下，所述方法将另外包括针对病原体呼吸道合胞病毒的步骤a)、b)和c)。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒和方法使用相同的引物对检测呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B。所述试剂盒和方法也可以使用相同的探针对用于检测呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B。
所述试剂盒可以另外包含用于进行过程控制的组分并且还可以包含对照核酸。所述方法可以另外包括进行过程控制。
图1中，参照单种靶病原体，显示了本发明方法的实施方案。
在多种实施方案中，在存在靶病原体的情况下，本发明试剂盒和方法可以快速产生许多拷贝的病原体检测物分子，从而理想地适合于灵敏检测。
本发明优于已知的试剂盒和方法，其不仅提供了快速扩增，且提供了一个可用于有效检测扩增产物和因此检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和任选地呼吸道合胞病毒(RSV)的内在过程。
本发明克服了利用SDA(包括使用切口酶的SDA(NEAR))的试剂盒和方法的主要缺点，即由于扩增产物的双链性质，SDA并不能提供一个内在过程用于扩增信号的有效检测。本发明通过利用寡核苷酸探针对，克服了此局限性，所述寡核苷酸探针对与扩增产物中的至少一个分子杂交，从而利于其快速和特异性的检测。使用这些寡核苷酸探针(其中第一寡核苷酸探针连接在允许实现其检测的部分上，且第二寡核苷酸探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上)，也提供了许多其他优势。例如，对于在其杂交区域的3'端被封闭而不能通过DNA聚合酶延伸且不能被限制酶切割的寡核苷酸探针，令人惊讶的是，使用该寡核苷酸探针并不引起对扩增的显著有害抑制，而且含有单链区的病原体前体检测物分子(pre-detector species)可以有效地产生。本发明的这一方面是违反直觉的，因为封闭的探针可能被推测将导致不对称扩增，即，相对于包含在前体检测物分子中的扩增产物链，扩增将偏向于该扩增产物链的相对扩增产物链。但事实上，该前体检测物分子可以被有效地产生，并且由于其暴露的单链区可以容易地与其他寡核苷酸探针杂交，因此理想地适宜进行有效检测。优选地，第一寡核苷酸探针在其杂交区域的3’端封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。
本发明的该内在样品检测方式与先前用于克服SDA的重大局限性的尝试根本上不同，先前的尝试涉及进行“不对称”扩增，例如，通过使用不相等的引物比率，以旨在产生一条扩增子链超过另一条扩增子链。本发明不需要不对称扩增，也不需要使一条扩增子链的生成超过另一条扩增子链，相反它聚焦于产生检测物分子，随后使第一和第二寡核苷酸探针与扩增产物中的检测物分子的相同链杂交。涉及产生检查物分子的本发明该内在样品检测方法，理想地适合于与核酸侧流(nucleic acid lateral flow)等检测方法偶联，例如通过将第二寡核苷酸探针打印在侧流试纸条上，提供一种简单、快速和低成本的检测手段。在与核酸侧流偶联的情况下，本发明也允许基于附着在侧流试纸条上离散位置的多个第二寡核苷酸探针的差异杂交，进行有效多重检测，其中每个探针具有针对样品中不同靶病原体设计的不同序列。在其他实施方案中，可以通过使用单链寡核苷酸作为第二寡核苷酸探针中允许其连接到固体材料的部分，并且通过将该部分的反向互补序列打印在试纸条上，来增强侧流检测的效率。由于在此后一种方法中附着到侧流试纸条上的序列可以是确定的并不需要与病原体来源RNA的序列对应，因此，此后一种方法还允许优化侧流试纸条，将其制造成可以跨多个目标应用使用的单个“通用型”检测系统。因此，寡核苷酸探针对，作为本发明的一个必要组成部分，提供了超出SDA(包括使用切口酶的SDA(NEAR))的许多优点。
由于本发明要求使用非切口酶的(一种或多种)限制酶和一种或多种修饰dNTP，因此本发明根本上不同于用切口酶进行的SDA(NEAR)，并且与此类依赖于切口酶的方法相比具有许多其他优点。例如，与切口酶相比，可以获得多得多的非切口酶的限制酶，这就意味着可从大量潜在酶中选择用于本发明的限制酶，以鉴定对于给定应用，例如反应温度、缓冲液相容性、稳定性和反应速率(灵敏度)而言具有优异性质的那些酶。由于本方法的这一关键优势，我们已经能够选择出比切口酶所可能达到的最适温度和速率具有更低的最适温度和更快的速率的限制酶。这类限制酶更适合在低成本诊断装置中利用。此外，使用一种或多种修饰dNTP是本发明的一个必要技术特征，该特征除了使得限制酶在其限制位点仅切割一条链外，还提供了其他重要的优点。例如，某些修饰的dNTP，如α-巯基dNTP，可以导致其所掺入的DNA的熔解温度(Tm)降低，这就意味着，与在扩增过程中产生的任何含有该修饰dNTP的竞争性互补链相比，扩增产物中的分子与本发明的寡核苷酸引物和探针将具有更高的杂交亲和力。此外，由修饰的dNTP碱基插入引起的扩增产物Tm降低，也将利于双链DNA分子的分离，从而增加扩增速率，降低最适温度，和提高灵敏度。
总之，本发明相对于使用限制酶或切口酶(NEAR)的SDA具有众多优点，这些优点使得本发明可应用在低成本、一次性使用的诊断装置中，实现在已知方法中不可能达成的改善扩增速率和扩增信号的简单可视化。
下文更详细地描述本发明的上述方面和其他方面的多种实施方案。
附图简述
图1.本发明所用方法的示意图。
图2.方法示意图，其中第一寡核苷酸探针在其杂交区域的3'端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割，并且在步骤a)中与样品接触。
图3.方法步骤b)和c)的示意图，其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是单链寡核苷酸。
图4.方法步骤a)的一部分的示意图，其中在步骤a)中样品还与第三和第四寡核苷酸引物接触。
图5.本发明所用方法的性能，其中第二寡核苷酸探针连接到固体材料硝化纤维素侧流试纸条(参见实施例1)。
图6A和6B.用于本发明的方法的性能，其中第一寡核苷酸探针在其杂交区域3'端封闭从而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割，并且在步骤a)中与样品接触(参见实施例2)。
图7A、7B、7C和7D.本发明所用方法的性能，其中在同一样品中检测两种或更多种不同靶核酸的存在(参见实施例3)。
图8.本发明所用方法的性能，其中靶核酸中的第一和第二杂交序列相隔5个碱基(参见实施例4)。
图9.本发明所用方法的性能，其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是抗原，并且相应的抗体连接在硝化纤维素侧流试纸条固体表面(参见实施例5)。
图10A和10B.本发明所用方法的性能，其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是单链寡核苷酸，其包含三碱基DNA序列基序的四个重复拷贝，并且该单链寡核苷酸序列的反向补序列连接在固体材料上(参见实施例6)。
图11.本发明所用方法用于检测临床样本中的RNA病毒的用途(参见实施例7)。
图12A和12B.本发明所用方法在不同温度下的性能(参见实施例8)。
图13A和13B.本发明方法与已知方法用于甲型流感病毒检测的性能比较(参见实施例9)。
图14A和14B.使用本发明检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒(参见实施例10)。
发明详述
本发明提供了用于检测和区分样品中的甲型流感病毒和乙型流感病毒以及任选的呼吸道合胞病毒的试剂盒和方法。
病原体来源的RNA可以是单链RNA，包括病毒基因组RNA、通过转录自单链RNA产生的单链RNA、自样品中的双链RNA(例如，通过自发解离或通过酶促降解或通过热变性)在两条链解离后产生的单链RNA、或(例如通过转录)自双链DNA产生的单链RNA。
当存在时，对照核酸可以是RNA、DNA、包含RNA和DNA碱基的嵌合体，或RNA/DNA杂交体。在一个实施方案中，对照核酸包含RNA，由此过程控制包括逆转录酶活性。
通常，本发明中使用的寡核苷酸引物是DNA引物，其与病原体来源的RNA形成包含RNA和DNA链的杂交双链体。然而，也可以使用包含其他核酸，例如非天然碱基和/或替代骨架结构的引物。
在病原体来源RNA存在的情况下，第一寡核苷酸引物与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交。杂交后，第一引物的3'羟基被逆转录酶(例如M-MuLV)延伸，以产生包含延伸的第一引物和病原体来源RNA的双链分子(见图1，其中病原体来源RNA被称为“靶”)。逆转录酶在所述延伸中使用dNTP和所述的一种或多种修饰的dNTP。在对照核酸存在的情况下发生相同的过程，除了当其是DNA时，第一引物由DNA聚合酶延伸，该DNA聚合酶在所述延伸中使用dNTP和所述的一种或多种修饰的dNTP。位于第一引物5'端的限制酶识别序列和切割位点通常不杂交，因为病原体来源RNA或对照核酸序列中通常不存在其反向互补序列。因此，第一引物通常用于将限制酶识别序列和切割位点引入随后的扩增产物分子中。第一引物延伸后，进行“靶去除”。通过靶去除，可获得该延伸的第一引物分子，以允许第二寡核苷酸引物与第二杂交序列的反向互补序列杂交。对于病原体来源RNA，可通过例如RNase H降解该RNA、通过逆转录酶的RNase H活性、或通过单独添加该酶，来实现靶的去除。备选地，对于单链DNA(包括双链DNA中的单链区域)，例如在对照核酸中，可通过使用附加的上游引物或Bump引物进行链置换，来实现“靶去除”。备选地，这种靶去除可在自发解离后发生，特别是当仅从给定的病原体来源RNA产生短延伸产物时；或者可以通过链侵入发生，其中在双链的第一引物延伸分子中发生的一个或多个DNA碱基对的瞬时打开，足以允许第二寡核苷酸引物的杂交和3'羟基的延伸以及链置换。在第二寡核苷酸引物与第二杂交序列的反向互补序列杂交之后，链置换DNA聚合酶使用dNTP和一种或多种修饰的dNTP延伸该引物的3'羟基。形成限制酶的双链限制识别序列和切割位点，其中掺入反向互补链中的一种或多种修饰的dNTP碱基发挥作用，阻断所述限制酶对该链的切割。限制酶识别其识别序列并仅在切割位点切割第一引物链，产生3'羟基，该羟基通过链置换DNA聚合酶使用dNTP和一种或多种修饰的dNTP延伸并置换第一引物链。形成限制酶的双链限制识别序列和切割位点，其中掺入反向互补链中的一种或多种修饰dNTP碱基发挥作用，阻断所述限制酶对该链的切割。由此产生双链分子，两个引物序列并置在所述分子中并且存在限制酶的部分阻断的限制位点。然后发生限制酶对第一引物链和第二引物链的切割，并产生两个双链分子，一个包含第一引物序列，另一个包含第二引物序列。然后在循环扩增过程中，发生第一引物链和第二引物链的相继切割和置换，其中置换出的第一引物链用作第二引物的靶标，置换出的第二引物链用作第一引物的靶标。
在病原体来源RNA存在时，例如无需温度循环，即可以产生扩增产物。
本发明的一个方面是，使第一和第二寡核苷酸探针二者与扩增产物中的至少一个分子特异性杂交以产生检测物分子，而不是直接检测扩增产物。连接在允许实现其检测的部分上的第一寡核苷酸探针，与该至少一个分子中的第一单链检测序列杂交。连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上的第二寡核苷酸探针，与该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中该第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游。
参考图1，本领域技术人员明了，对于任何靶病原体，扩增产物可以包含许多不同的分子，如包含单链检测序列的分子，所述分子可以由第一引物和第二引物二者的全部或部分序列或反向互补序列组成，其中，这些序列可以在如下情况下被来自病原体来源RNA的序列分隔开，其中所述情况为：与引物结合的第一和第二杂交序列在病原体来源RNA中相隔一个或多个碱基时。进一步可以明了的是，可以选择任何所述分子与第一和第二寡核苷酸探针杂交来形成检测物分子。
在检测所述检测物分子时，检测物分子的存在指示样品中存在靶病原体。
通过利用寡核苷酸探针对(一个探针用于检测，一个探针用于连接到固体材料上)，本发明提供了快速而有效的信号检测，克服了对更复杂的二次检测方法的需要，并且允许对靶病原体存在时产生的信号进行有效可视化，如通过核酸侧流的方式可视化。
在本发明中，针对至少一种靶病原体的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域的3'端被封闭从而不能通过链置换DNA聚合酶延伸并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。该表述“不能被限制性酶切割”是指，在寡核苷酸探针的杂交区域与所述扩增产物中的该至少一个分子杂交后，限制酶不能切割所述寡核苷酸探针；否则，如果该寡核苷酸探针能够被限制酶切割，则将导致在链置换酶的置换反应后去除该寡核苷酸探针的杂交区域的封闭3’端。如果在试剂盒或方法中使用一种以上的限制酶，则可能期望该封闭的探针不能被试剂盒或方法中使用的任何一种限制酶切割。在一个实施方案中，所述封闭的寡核苷酸探针可以通过存在一个或多个序列错配和/或一个或多个修饰如硫代磷酸酯键，而不能被限制酶切割。限制性酶识别序列和切割位点可任选地从封闭的寡核苷酸探针中删除，或在所述寡核苷酸探针的杂交区域与所述扩增产物中的该至少一个分子杂交后，以其他方式丧失作用。在本发明试剂盒的另一个实施方案中，用于靶病原体的封闭探针可以与用于该病原体的引物对和/或限制酶混合提供。在进一步的实施方案中，在进行方法步骤a)的同时，即在步骤a)进行的过程中，封闭的寡核苷酸探针与样品接触，由此在(病原体来源RNA存在时产生的)扩增产物的产生过程中将存在所述探针。
类似地，封闭探针可用于对照核酸。
例如，在图2所示的实施方案中，第一寡核苷酸探针被封闭，并与扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，以形成包含单链区域的前体检测物分子。该至少一个分子可通过链置换DNA聚合酶延伸，延伸其3'羟基，从而进一步稳定该前体检测物分子。因此，在该实施方案中，该封闭的寡核苷酸探针包含附加区域(前体检测物分子稳定化区域)，由此与该封闭的寡核苷酸探针杂交的扩增产物分子的3'端可通过链置换DNA聚合酶延伸。如图2所示，产生“稳定化的前体检测物分子”。在该封闭的寡核苷酸探针中，该附加前体检测物分子稳定化区域将位于与扩增产物中的该至少一个分子中的第一或第二单链检测序列杂交的区域的上游。可以优化该封闭寡核苷酸探针的杂交区域序列和引物的相关浓度，使得在每个循环中扩增产物中产生的一定比例的相关分子与该封闭的寡核苷酸探针杂交，而该分子的其余拷贝仍可参与循环扩增过程。该寡核苷酸探针可以通过使用例如3'磷酸修饰来阻断延伸，并且在此举例说明性实施方案中，还连接到允许实现其检测的部分，如5'生物素修饰上。备选地，可以使用单独3'修饰，来阻断延伸和作为允许实现检测的部分。多种其他修饰可用于封闭寡核苷酸的3'端，如C-3间隔子(C-3spacer)；备选地，可利用(一个或多个)错配和/或修饰的碱基。例如，寡核苷酸探针可以包含一个或多个碱基位于杂交区域的下游，所述的碱基是修饰的碱基或与扩增产物中该至少一个分子错配，从而阻断该杂交区域的3’端通过DNA聚合酶延伸。因此，该寡核苷酸探针可以在其3’末端包含未封闭的羟基，但其杂交区域3’端仍被阻断通过DNA聚合酶延伸。所述前体检测物分子理想地适合于有效检测，因为暴露的单链区域仍可容易地用于与第二寡核苷酸探针杂交。第二寡核苷酸探针可连接在核酸侧流试纸条的硝酸纤维素表面，由此当前体检测物分子流过时，容易发生序列特异性杂交，将检测物分子固定在试纸条上的确定位置。连接在检测部分上的染料，如与链霉抗生物素蛋白结合的碳、金或聚苯乙烯颗粒，可以存在于核酸侧流试纸条的缀合物垫中、或存在于扩增反应期间，从而可以基于颜色快速地可视化显示是否存在在靶病原体存在下产生的检测物分子。
在另一实施方案中，第二寡核苷酸探针在其杂交区域3'端封闭以不能通过链置换DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。该第二寡核苷酸探针可在与样品接触之前连接到固体材料，如电化学探针、96孔板、珠或阵列的表面，或可连接到允许其连接到固体材料的部分上。在扩增过程中产生的一定比例的该至少一个分子，在其产生后与该第二寡核苷酸探针杂交，而不与相关引物杂交以进一步参与循环扩增过程。在与第二寡核苷酸探针杂交后，所述的至少一个分子通过聚合酶在该寡核苷酸探针上延伸以产生稳定化的前体检测物分子。第一寡核苷酸探针和检测部分也可在步骤a)进行的同时与样品接触，并且被固定到所述表面上第二寡核苷酸探针所在的位置处。通过在扩增过程中检测所述检测部分在该位置的累积，将获得实时信号，提供对样品中存在的靶病原体拷贝数的定量。因此，根据本发明方法的一个实施方案，同时进行步骤a)、b)和c)中的两步或更多步。
使用封闭的寡核苷酸探针，我们没有观察到对扩增速率的任何显著抑制，表明前体检测物分子在实时累积，最佳循环扩增过程未被中断。这与设计不对称SDA的尝试形成对比，在所述SDA中旨在通过利用不相等的引物比率来使一条扩增子链的产生超过另一条链。本发明并不试图利用封闭的寡核苷酸探针来从反应中去除一条扩增子链从而增加另一条链的比例，相反地，本发明聚焦于检测物分子的产生和检测，其中利用封闭的探针来促进单链区域在扩增过程中暴露。因此，我们不仅在该实施方案中未观察到对扩增过程的任何抑制作用，而且在某些实施方案中，我们观察到与增加量的检测物分子相对应的所产生信号的令人惊奇的增强，至少为100倍，参见实施例2(图6)。
此外，与所报道的在多步骤过程中整合NEAR与核酸侧流但不使用封闭探针的尝试相比，使用封闭寡核苷酸呈现了根本的优势。例如，在WO2014/164479中，为使用核酸侧流来显示扩增产物，需要在48℃进行30分钟的长时间孵育，这就构成了一个主要障碍，阻碍了该方法用于护理点诊断装置，特别是低成本或一次性装置。形成鲜明对比的是，本发明可以容易地在5分钟内和较低的孵育温度(例如40-45℃)下实现等同的扩增。在进一步的直接比较研究(参见实施例9)中，与已知方法(WO2014/164479)相比，通过组合使用非切口酶的限制酶、修饰的dNTP碱基和所述的封闭寡核苷酸探针，本发明所用方法展示了惊人的显著优越的速率。
在一个实施方案中，针对每种病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一，任选地在存在对照核酸时，都在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶在所述杂交区域切割。
还可以理解的是，第一和第二寡核苷酸探针中的另一个(即寡核苷酸中的一个或两个)也可以，如上所述，在其杂交区域的3'端被阻断通过DNA聚合酶延伸并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。因此，在一个进一步的实施方案中，用于病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针都在其杂交区域的3'端被阻断从而不能通过DNA聚合酶延伸并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。在该进一步的实施方案中，当在本发明的试剂盒中混合提供针对靶病原体的封闭探针与针对该病原体的引物对和/或限制酶时，两种封闭的探针无需混合提供，并且在本发明的方法中，无需两种封闭的探针都在步骤a)进行的同时与样品接触。
本发明的另一个方面是使用限制酶，该限制酶不是切口酶，但在其识别序列和切割位点为双链时能够识别该识别序列，并仅切割该切割位点的一条链，其中反向互补链的切割因一种或多种修饰的存在而被阻断，其中所述一种或多种修饰通过链置换DNA聚合酶使用一种或多种修饰的dNTP(例如可以在其通过聚合酶掺入后赋予核酸酶抗性的dNTP)而掺入到所述反向互补链中。
“限制酶”[或“限制性内切核酸酶”]是一类广泛的酶，所述酶可以在结合到特定的识别序列后，在特定切割位点处断裂双链核酸分子的一条或两条链上的一个或多个磷酸二酯键。有大量限制酶可得，已报道超过3000种，市售超过600种，涉及多种不同的理化性质和识别序列特异性。
“切口酶”(nicking enzyme)[或“切口内切核酸酶”]是限制酶的一个特殊亚类，所述酶在结合到特定的识别序列后，只能在特定的切割位点处断裂双链核酸分子的一条链，而使另一条链保持完整。只有极少数(c.10)切口酶可得，包括天然存在的酶和改造的酶。切口酶包括底部链切割酶Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI和Nb.BtsI以及顶部链切割酶Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI和Nt.CviPII。
专门地用于本发明中的非切口酶的限制酶，尽管能够切割双链核酸的两条链，但在某些情况下，在结合到其识别序列后，只能切割或切刻其双链DNA切割位点的一条链。这可以通过多种方式达到。与本发明特别相关的是，这可以通过如下方式达到：用抵抗核酸酶的修饰(如硫代磷酸酯(PTO)、硼磷酸酯、甲基磷酸酯或肽核苷酸间键)来修饰双链核酸靶位点的一条链，使得其中一条链上的切割位点的磷酸二酯键得到保护，从而造成双链核酸中的一条链在切割位点处不能被切割。某些经修饰的核苷酸间键，例如PTO键，可在寡核苷酸探针和引物内化学合成，或例如通过使用一种或多种α-巯基修饰的脱氧核苷酸，通过聚合酶整合到双链核酸中。因此，在一个实施方案中，所述一种或多种修饰的dNTP是α-巯基修饰的dNTP。通常，利用S异构体，其可以更有效地掺入并且赋予核酸酶抗性。
由于有数量非常多的不是切口酶的限制酶可得，因此，针对本发明在给定应用中的使用，可以得到大量具有不同性质的酶，用于筛选出具有期望性能特征(例如温度曲线、速率、缓冲液相容性、聚合酶交叉相容性、识别序列、热稳定性、可制造性)的酶。相比之下，只有少量切口酶可用的事实限制了使用切口酶的已知试剂盒和方法的潜力，并可能导致例如较低的反应速率(灵敏度、出结果的时间)和较高的反应温度。选择用于本发明的非切口酶的限制酶可以是天然存在的酶或工程化酶。
在选择不是切口酶的限制酶用于本发明时，本领域技术人员将明了，有必要鉴定具有适当切割位点的酶，以确保在正确位置掺入修饰来阻断相关链的切割而不阻断另一链的切割。例如，在其中使用修饰dNTP(如α-巯基dNTP)的实施方案中，可能优选的是，选择具有位于识别序列之外的切割位点的限制酶，如具有非回文识别序列的不对称限制酶，以便提供足够的灵活性来放置引物，使得病原体来源RNA在适当位置包含修饰的核苷酸碱基以在所述修饰并入后阻断相关链的切割。例如，如果使用α-巯基dATP，则相关寡核苷酸引物中的限制酶切割位点的反向互补序列将在该反向互补链中的该切割位置下游包含腺苷碱基，但在引物序列中的该切割位点下游不包含腺苷碱基，以确保引物被适当地切割。因此，在其识别序列之外进行切割的、具有非回文识别序列的不对称限制酶，理想地适合用于本发明。也可使用在其识别位点内进行切割的、识别部分或简并回文序列的限制酶。抵抗核酸酶的核苷酸键修饰，例如PTO，可用于阻断一系列多种不同类别的市售双链切割试剂(包括具有部分或简并回文和不对称限制识别序列的IIS型和IIG型限制酶)对一链的切割，从而使其可以用于本发明中。
限制酶(一种或多种)通常以0.1-100单位的量用于本发明中，其中一个单位定义为在给定温度(例如37℃)下在50μl的总反应体积中在1小时内消化1μg T7 DNA所需的试剂量。然而，该量取决于许多因素，如所选酶的活性、酶的浓度和形式、病原体来源RNA的预期浓度、反应体积、引物浓度和反应温度，该量不应视为以任何方式限构成限制。本领域技术人员将理解，在本发明中使用的限制酶将需要合适的缓冲液和盐，例如二价金属离子，用于有效和高效的功能、pH控制和酶的稳定化。
在一个实施方案中，用于一种以上病原体(例如每种病原体)和任选地对照核酸(如果存在)的限制酶，是相同的限制酶。通过仅使用单种限制酶，本发明可以在许多方面得到简化。例如，仅需要针对与其他反应组分相容的单一一种酶进行鉴定、就发明性能进行优化、制造和稳定化。利用单种限制酶也简化了寡核苷酸引物的设计，并支持扩增过程的对称性。
在本发明中，限制酶仅切割核酸双链体的一条链，因此在切割之后，它们呈现暴露的3'羟基，其可作为聚合酶的有效引发位点。聚合酶是一种酶，它通过延伸引物并利用碱基配对相互作用产生DNA或RNA模板链的反向互补“拷贝”来合成核酸链或聚合物。本发明使用了具有链置换能力的聚合酶，以便适当地置换链来影响扩增过程。术语“链置换”是指聚合酶在合成过程中置换所遇到的下游DNA的能力。一系列在不同温度下操作的具有链置换能力的聚合酶已被表征并市售可得。例如，Phi29聚合酶具有非常强的链置换能力。来自芽孢杆菌物种的聚合酶，如Bst-DNA聚合酶大片段，典型地表现出高的链置换活性，并且非常适用于本发明。大肠杆菌(E.coli)Klenow片段(exo-)是另一种广泛应用的链置换聚合酶。链置换聚合酶可以容易地进行工程化构建，例如KlenTaq，如通过仅克隆内源性酶的相关活性聚合酶结构域和敲除任何外切核酸酶活性来构建。在本发明中，还需要RNA依赖性DNA合成(逆转录酶)活性，该活性可由步骤a)中的链置换DNA聚合酶和/或单独的附加逆转录酶(例如M-MuLV或AMV)执行。因此，在本发明的试剂盒和方法中，逆转录酶和链置换DNA聚合物可以是相同的酶。
聚合酶典型地以适当的量用于本发明中，可以根据酶、试剂浓度和所希望的反应温度，对所述量进行优化。例如，可以使用0.1-100单位的芽孢杆菌聚合酶，其中一个单位定义为在65℃下30分钟内将25nmol dNTP掺入酸不溶性物质中所需的酶量。然而，该量取决于许多因素，如聚合酶的活性、其浓度和形式、病原体来源RNA的预期浓度、反应体积、寡核苷酸引物的数量和浓度以及反应温度，并且不应视为以任何方式构成限制。
本领域技术人员将知晓，聚合酶需要dNTP单体来发挥聚合酶活性，并且还需要适当缓冲液以及诸如缓冲盐、二价离子和稳定剂等组分。此外，在本发明中使用一种或多种修饰的dNTP，以便在通过链置换聚合酶掺入该修饰dNTP后阻断引物的反向互补链的切割。通常，在使用单一修饰dNTP时，用于本发明的dNTP应省略掉该相应的碱基。例如，在其中修饰dNTP为α-巯基dATP的实施方案中，dNTP应仅包括dTTP、dCTP和dGTP，且不应包括dATP。去除相应的天然dNTP碱基可确保引物的反向互补序列内所需的底链切割位点均被封闭，这是因为在此情况下通过聚合酶掺入的只有该修饰的碱基，但是完全或部分地去除相应的天然dNTP碱基并不是必需的。dNTP典型地可以按照用于其他聚合酶方法中的相似浓度，如10微摩尔到1毫摩尔的浓度，用于本发明中，但用于本发明的dNTP浓度可针对任何给定的酶和试剂进行优化，以使活性最大化并使从头合成最小化，从而避免背景信号产生。考虑到某些聚合酶用一种或多种修饰dNTP碱基可显示较低的掺入速率，该一种或多种修饰碱基可以以高于未修饰的dNTP的相对浓度(如高5倍的浓度)用于本发明，但这不应视为构成限制。
一种或多种修饰dNTP的使用是本发明的一个必要特征，除了使得限制酶仅切割其限制性位点的一条链之外，该特征还提供了其他重要的优势。例如，一些修饰dNTP，如α-巯基dNTP，可以导致其并入的DNA的熔解温度(Tm)降低，这意味着，本发明的寡核苷酸引物和探针可以比扩增过程中产生的任何竞争性修饰dNTP互补链，对扩增产物分子，具有更大的杂交亲和力。由于如下原因，这一关键特征增强了扩增速率：例如，在置换链之一与其反向互补序列杂交产生“非生产性”终点分子时，由于一个或多个修饰碱基的存在导致杂交Tm降低，该分子将比该置换链与引物的“生产性”杂交分子更容易解离。已经报道，硫代磷酸酯核苷酸间键可以降低Tm(即双链体的正好一半单链发生杂交的温度)，每添加一个硫代磷酸酯核苷酸间键导致Tm降低1-3℃，这是理化性质的实质性变化。我们还观察到，在DNA序列中存在硫代磷酸酯核苷酸键时，链置换的速率增强。此外，本发明使用的寡核苷酸探针(无论是在实施步骤a)的同时或是之后与样品接触)，与任何竞争性修饰分子相比，都对扩增产物中的分子具有更高的亲和力，因此可以优先杂交或甚至置换杂交链以促进检测物分子的产生。扩增产物分子因其所含的修饰核苷酸间键而具有降低的Tm和增强的置换，这在根本上增强了本发明方法的速率并降低了发生快速扩增所需的温度。
除了由于使用一种或多种修饰核苷酸而导致的速率增强之外，本发明的寡核苷酸引物和探针的杂交特异性也增强。鉴于通常在扩增产物内一种特定核苷酸的所有碱基都被取代，引物和探针的杂交位点将典型地包含修饰碱基，而(由例如硫代磷酸酯核苷酸间键引起的)Tm降低意味着来自非特异性杂交的序列错配将不太可能被耐受。
因此，使用一种或多种修饰dNTP的本发明该特征，导致了增强扩增的灵敏度和特异性的根本益处，并且与不需要修饰核苷酸的已知方法形成鲜明对比，例如NEAR(WO2009/012246)，包括使用软件优化的引物(WO2014/164479)或温启动或有控制的降温(WO2018/002649)的NEAR变型方案。
存在许多不同的修饰dNTP，例如在其通过聚合酶掺入后赋予核酸酶抗性的修饰dNTP，其可用于本发明中以赋予对限制酶切割的抵抗性，并且在一些实施方案中，赋予其它特征以增强本发明在给定应用中的性能。除了提供核酸酶抗性和降低Tm的α-巯基dNTP外，据报道具有聚合酶掺入潜能并赋予核酸酶抗性的修饰dNTP还包括等同的核苷酸衍生物，如硼烷衍生物、2'-O-甲基(2'OMe)修饰的碱基和2'-氟碱基。可通过聚合酶掺入并用于本发明中增强本发明特定方面的其他修饰dNTP或等同化合物，包括降低结合亲和力的那些，例如肌苷-5'-三磷酸或2'-脱氧泽布拉林(zebularine)-5'-三磷酸，提高结合特异性的那些，例如5-甲基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸盐或5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸，以及增强GC富集区合成的那些，例如7-脱氮杂-dGTP。某些修饰可以提高Tm，从而在本发明实施方案中提供控制杂交事件的进一步潜力。
本发明方法的步骤a)、b)和c)可在宽泛的温度范围内进行。每个步骤的最佳温度由相关聚合酶和限制酶的最适温度以及寡核苷酸引物杂交区域的熔解温度决定。值得注意的是，方法在步骤a)中无需使用温度循环。此外，扩增步骤a)不需要任何受控的温度振荡，也不需要任何温启动或热启动、预热或受控降温。本发明允许在较宽的温度范围内进行这些步骤，例如15℃到60℃，如20℃到60℃，或15℃到45℃。根据一个实施方案，步骤a)在不超过50℃或在约50℃的温度下进行。鉴于可用于本发明的非切口酶的限制酶的范围很广，与使用切口酶的备选方法相比，可选择出在相对较低的温度下具有快速率的限制酶。一种或多种修饰核苷酸的使用也降低了所需的扩增温度。除了与已知方法相比潜在地具有较低的最适温度特征之外，本发明的方法和本发明试剂盒还可以在异常宽的温度范围内进行。这些特征对于在低成本诊断装置中使用本发明具有高度吸引力，对于此类装置，受控加热将引入复杂的物理约束性，使得此类装置的商品成本增加到不可能在商业上使用一次性装置或无仪器装置的地步。使用本发明已经开发了一系列测定试验，其可以在例如环境温度或大约37℃进行靶病原体的快速检测。因此，在另一实施方案中，步骤a)在不超过45℃的温度或在约45℃执行。为了简化用户步骤和减少产生结果的总时间，优选在低于目标温度的温度下启动该方法。因此，在该方法的另一实施方案中，步骤a)的温度在扩增期间升高。例如，该方法的温度可在环境温度(如20℃)下开始，并在一段时间(如2分钟)内升高到最终温度(如约45℃或50℃)。在一个实施方案中，温度在步骤a)实施期间升高，如从环境起始温度(如在15-30℃范围内)升高到40-50℃的温度。
本发明的低温潜能和多功能性意味着，与已知试剂盒和方法相比，它与一系列其他测定所需的条件兼容，所述其他测定如用于检测其他生物标记物(如蛋白质或小分子)的免疫测定或酶学测定。因此，本发明方法可用于例如同时检测样品内的多种分子，包括目的核酸和蛋白质或小分子。本发明所需的组分，包括不是切口酶的限制酶、链置换DNA聚合酶、单独的逆转录酶(如果存在)、寡核苷酸引物、寡核苷酸探针、dNTP和一种或多种修饰的dNTP，可冻干或冷冻干燥以稳定储存，然后如在加入样品中时，可通过再水化触发反应。这种用于稳定储存的冻干或冷冻干燥通常需要在干燥组分之前添加一种或多种赋形剂，如海藻糖。已知有非常多的此类赋形剂和稳定剂可用于冻干或冷冻干燥，并可以获得用于测试中，以鉴定对于本发明方法实施所需的组分而言适宜的组合物。
对本领域技术人员而言显而易见的是，本发明的试剂盒和方法，应用基于聚合酶的扩增方法，可通过添加一种或多种如下添加剂来增强，所述添加剂已经被证实可增强PCR或其它基于聚合酶的扩增方法。此类添加剂包括但不限于四氢噻吩1-氧化物、L-赖氨酸游离碱、L-精氨酸、甘氨酸、组氨酸、5-氨基戊酸、1,5-二氨基-2-甲基戊烷、N,N′-二异丙基乙二胺、四亚甲基二胺(TEMED)、四甲基氯化铵、四甲基氧化铵、甲砜基乙酰胺、十六烷基三甲基溴化铵、甜菜碱醛、四乙基氯化铵、(3-羧丙基)三甲基氯化铵、四丁基氯化铵、四丙基氯化铵、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基甲酰胺、N-甲基乙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、L-苏氨酸、N,N-二甲基乙二胺、2-吡咯烷酮，HEP(N-羟乙基吡咯烷酮)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)和1-甲基或1-环己基-2-吡咯烷酮(吡咯烷酮类)、δ-戊内酰胺、N-甲基琥珀酰亚胺、1-甲酰基吡咯烷、4-甲酰基吗啉、环丁砜、海藻糖、甘油、吐温-20、DMSO、甜菜碱和BSA。
我们的研究揭示，本发明在宽范围的靶病原体水平有效，包括检测低到非常低，甚至单个的拷贝数。通常以大大超过病原体来源RNA的量提供寡核苷酸引物。通常，每种引物的浓度在10至200nM范围内，但这应视为非限制性的。较高的引物浓度可以提高杂交效率，从而提高反应速率。然而，在高浓度下也可以观察到非特异性背景效应，如引物二聚体，因此寡核苷酸引物的浓度是对利用本发明的任何给定测定试验进行优化的一部分。在一个实施方案中，以相同浓度提供每个引物对的第一和第二寡核苷酸引物。在备选实施方案中，引物对中的第一和第二寡核苷酸引物之一以超过另一个的量提供。在一个引物的提供量超过另一个的实施方案中，由于循环扩增过程的天然对称性，反应速率可能降低，然而，在某些情况下，这可用于减少本发明中的非特异性背景信号和/或增强第一和第二寡核苷酸探针杂交产生检测物分子的能力。期望的是，在产生足够的检测物分子以供使用所选择的检测手段检测之前，两个引物都以不构成限制的水平存在。
用于本发明的寡核苷酸引物的设计有多个考虑因素。第一和第二寡核苷酸引物中的每一个都必须在5'到3'方向上包含具有限制酶识别序列和切割位点以及杂交区域的一条链，其中在第一引物的情况下，该杂交区域能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交，在第二引物的情况下，该杂交区域能够与靶核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交。由此设计一对引物来扩增病原体来源RNA的区域。这些引物的限制酶识别序列通常不存在于病原体来源RNA序列内，因此在引入扩增子之前在初始杂交事件期间形成突出端(参见图1)。在使用不对称限制酶的情况下，切割位点通常位于识别序列的下游，因此可以可选地存在于引物的杂交序列内。
设计寡核苷酸引物，使得其在被切割后，切割位点5′的序列形成具有足够熔解温度(Tm)的上游引物，以在期望的反应条件下保持与其反向互补链杂交，并在通过链置换DNA聚合酶延伸3'羟基后置换切割位点下游的链。因此，可以在寡核苷酸引物的5'端包含附加的“稳定化”区域，其最适长度由相关限制酶的切割位点相对于识别序列的位置和其他因素(如用于方法步骤a)中扩增的温度)决定。因此，在一个实施方案中，一个或多个引物对(例如，所有引物对)的第一和/或第二寡核苷酸引物在限制酶识别序列和切割位点上游(如在5'端)包含(长度为例如5或6个碱基的)稳定化序列。
在引物设计过程中，有必要确定每个杂交区域的序列和长度，以允许最佳的序列特异性杂交和链置换，从而确保特异和灵敏的扩增。可以改变引物在待检测的病原体来源RNA序列中的定位，以确定引物杂交区域的序列，从而选择具有最佳的扩增灵敏度和特异性以及与寡核苷酸探针相容的引物。因此，可以筛选不同的引物对，以鉴定对于本发明性能而言最佳的序列和定位。通常，设计引物杂交区域的长度，以便其理论Tm可以允许引物在所希望的反应温度下实现有效杂交，但在切割后也容易被置换。在引物设计过程中，在可能的反应温度和所选择的限制酶的背景下考虑杂交序列的理论Tm和置换链的序列，并与理论上通过序列长度增加可导致的、源于序列的结合特异性改进进行平衡。我们的多种研究表明，在设计可以有效用于本发明的引物方面，可以具有相当大的变化性。在一个实施方案中，第一和/或第二寡核苷酸引物对的杂交区域长度在6到30个碱基，例如9到16个碱基之间。在其他实施方案中，可在引物的杂交区域中使用修饰，如非天然碱基和替代的核苷酸间键或无碱基位点，以改善其性质。例如，增加Tm的修饰，如PNA、LNA或G-clamp，可允许较短且更特异的引物杂交区域，从而允许较短的扩增子和由此增强扩增速率。
我们的多种研究揭示，可通过短扩增子来增加使用本发明可达到的速率及其灵敏度，因此在某些实施方案中，可能优选的是，缩短两个引物(包括其杂交序列)的总长度，并确定引物位置以使病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列之间仅具有短间隔，如10或15个核苷酸碱基或更少。在一个实施方案中，病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列相隔0到15个或0到6个碱基，在某些实施方案中，相隔3到15个或3到6个碱基，例如5、7或11个碱基。在另一实施方案中，杂交序列重叠例如1到2个碱基。
在本发明中，甲型流感和/或乙型流感来源RNA中的第一和第二杂交序列可以位于或来源于流感病毒基因组的区段1、2、3、5、7或8之一。源自甲型流感病毒的RNA和源自乙型流感病毒的RNA的序列可以位于或源自相同或不同的区段。呼吸道合胞病毒来源的RNA中的第一和第二杂交序列可以位于或源自呼吸道合胞病毒A和/或B的NS2(非结构蛋白2)、N(核蛋白)、F(融合糖蛋白)、M(基质)或L(聚合酶)基因之一。呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B来源的RNA中的第一和第二杂交序列可以来自相同的基因。呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B来源的RNA中的第一和第二杂交序列优选在呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B的基因组中是保守的。
在本发明中使用的寡核苷酸探针对的序列设计有多个考虑因素。首先，第一寡核苷酸探针中的杂交区域与第一单链检测序列杂交，第二寡核苷酸探针中的杂交区域与第二单链检测序列杂交，这两个杂交区域通常设计为两者不重叠或具有最小的重叠，以便允许两个寡核苷酸探针同时与扩增产物中的至少一个分子结合。通常两个杂交区域还被设计为主要杂交到位于如下两个位置之间的序列上，其中一个位置是扩增产物分子的一条链上的切割位点的位置，另一个位置是与其反向互补链上的切割位点相对的位置，从而确保扩增产物中的一个或多个分子可以被有效靶向并且两个寡核苷酸探针可以结合到同一条链上。对于任何给定的引物对，可选择任一条链作为寡核苷酸探针的靶。鉴于寡核苷酸探针在方法中通常不被聚合酶延伸，基于扩增产物分子的相关序列(所述序列确定其Tm、％GC)和获得的实验性能数据,设计杂交序列。在一个实施方案中，第一和第二寡核苷酸探针的杂交区域为9到20个核苷酸碱基长。在靶病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列由0个碱基分开的实施方案中，寡核苷酸探针之一的杂交区域的序列可以对应于寡核苷酸引物之一，而另一个寡核苷酸探针的杂交区域可以或将对应于另一个寡核苷酸引物的反向互补序列。然而，可以截短杂交区域的长度，以优化寡核苷酸探针在本发明的期望实施方案中的性质，并且在所述寡核苷酸探针与用于病原体的引物对和/或限制酶混合提供的情况下，或者在步骤b)的全部或部分与步骤a)同时进行的情况下，避免任何抑制效应。在用于病原体的第一或第二寡核苷酸探针包含限制酶的识别序列和切割位点、并且该寡核苷酸探针与用于病原体的引物对和/或限制酶混合提供的情况下或该寡核苷酸探针在步骤a)实施的同时与样品接触的情况下，通常封闭该探针内的切割位点，例如，通过在探针的化学合成期间纳入经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯键，或引入错配以去除该识别序列。除了杂交区域之外，对于寡核苷酸探针的序列以及它们可以包含的任何修饰的核苷酸碱基、核苷酸键或其他修饰而言，可以有相当大的变化性。可化学插入寡核苷酸中以改变其性质且可用于本发明实施方案的修饰碱基，如2-氨基-dA、5-甲基-dC、Super
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2-氟碱基及G钳，可导致Tm的增加，而其它如Iso-dC及Iso-G可增强结合特异性而不增加Tm。其他修饰如肌苷或无碱基位点可降低结合的特异性。已知赋予核酸酶抗性的修饰包括反向dT(inverted dT)和ddT以及C3间隔子。在本发明实施方案中，可通过修饰，增加或降低Tm并提供控制杂交事件的潜力。在寡核苷酸探针的杂交区域中使用修饰碱基提供了改善寡核苷酸探针性能的机会，例如增强其结合亲和力而不增加杂交区域的长度。在一个实施方案中，一个或两个寡核苷酸探针中的修饰碱基，将允许所述探针比扩增产物中具有互补性的任何分子都更有效地杂交到相关单链检测序列上，从而竞争胜出。
在用于病原体的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域3'端封闭而不能延伸并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割的实施方案中，典型地，该封闭的寡核苷酸探针将包含附加的5'区域，其为前体检测物分子的稳定化提供了机会(参见图2)。在一个实施方案中，该封闭寡核苷酸探针包含与寡核苷酸引物之一的序列同源的序列(例如确却的序列)，但在其杂交区域3'端包含阻断其通过链置换DNA聚合酶延伸的修饰，且包含封闭限制酶切割位点的单个硫代磷酸酯核苷酸间键。这样的实施方案简化了测定试验的设计，并确保不引入可导致非特异性背景扩增的附加序列基序。
产生检测物分子的第一和第二寡核苷酸探针对，优选以这样的水平提供，其中所产生的检测物分子的拷贝数充分高于用于该检测物分子的检测手段的检测限，以便容易被检测。此外，第一和/或第二寡核苷酸探针的杂交效率受其浓度的影响。通常，在步骤a)进行的同时与样品接触的寡核苷酸探针的浓度可类似于寡核苷酸引物的浓度，例如10至200nM，但这不应视为限制性的。在一个实施方案中，寡核苷酸探针对中的一个或两个寡核苷酸探针以超过相应的寡核苷酸引物对中的一个或两个寡核苷酸引物的浓度提供，而在另一个实施方案中，寡核苷酸探针对中的一个或两个寡核苷酸探针以低于相应的寡核苷酸引物对中的一个或两个寡核苷酸引物的浓度提供。在寡核苷酸探针对中的一个或两个寡核苷酸探针在扩增步骤a)进行之后与样品接触的情况下，根据需要，可允许更高的浓度以达到最有效的杂交，而无需考虑可能引起的对扩增步骤a)的抑制。
杂交序列是用于本发明的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的关键特征。杂交是指序列特异性杂交，即寡核苷酸引物或探针通过核酸序列中的互补碱基之间的氢键碱基配对，与靶核酸(病原体来源RNA或对照核酸)或扩增产物中的分子结合的能力。典型的碱基配对是腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)，或在RNA或RNA/DNA杂交双链体的情况下是腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)，以及胞嘧啶-鸟嘌呤(C-G)，但具有特定的结合偏好的一系列天然和非天然的核酸碱基类似物也是已知的。此外，在本发明中，寡核苷酸探针或引物的该互补区域无需在序列上包含完全天然的核酸碱基、并与其在靶核酸中或在扩增产物分子中的杂交序列完全和确切的互补；相反，对于本发明方法的性能而言，寡核苷酸探针/引物只需要能够与它们的靶杂交序列进行序列特异性杂交，足以形成本发明正确执行功能(包括通过限制酶切割和通过链置换DNA聚合酶延伸)所需的双链序列即可。因此，这种杂交可以没有精确的互补性，也可以具有非天然碱基或无碱基位点。在一个实施方案中，用于本发明的寡核苷酸引物或寡核苷酸探针的杂交区域，与病原体来源RNA、对照核酸、或扩增产物分子或其反向互补序列(视情况而定)的相关区域的序列，具有完全互补性。在其他实施方案中，存在一个或多个非互补碱基对。在某些情况下，在本发明中使用寡核苷酸引物和/或探针的混合物可能是有利的。因此，举例来说，在病原体来源RNA包含具有两个多态性位置的单核苷酸多态性(SNP)位点的情况下，可采用在该位置不同的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的1:1混合物(每个组分与各自的SNP碱基具有互补性)。在寡核苷酸的制备过程中，常规做法是在合成过程中随机化一个或多个碱基。用于本发明的寡核苷酸(例如引物和探针)的长度可以容易地由本领域技术人员确定，例如，该寡核苷酸的长度可以为不超过200个,例如不超过大约100个碱基。
本领域技术人员将理解，涉及聚合酶的扩增过程可能遭受非特异性背景扩增，如由从头合成和/或引物-引物结合产生的背景扩增。在将扩增子的长度设计为尽可能短时(例如通过最小化引物的杂交序列、病原体来源RNA中第一和第二杂交序列之间的间隔以及任何稳定化区域的长度，达到可能但仍在给定反应温度下保持功能的程度)，本发明的方法通常表现出更快速的扩增。然而，对于较短的扩增子，由于寡核苷酸引物提供了产生扩增产物分子所必需的所有序列，非特异性背景可能加剧。在以非靶标特异性方式通过从头合成的DNA或引物-引物结合而产生包含“连接”的第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的扩增子的情况下，可出现假阳性结果。通过在本发明中使用寡核苷酸探针对，可以允许本发明的多种实施方案包括附加特征，以使非靶标特异性背景信号出现的任何可能性最小化。在此方面，通过使用寡核苷酸探针对而建立的此类实施方案，呈现出相对于已知试剂盒和方法的实质性优势。
一种方式是分隔开病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列，以便使用寡核苷酸探针提供基于靶标的序列特异性检查。因此，在一个实施方案中，病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列相隔3到15个碱基或3到6个碱基(例如5、7或11个碱基)。引物之间的这种间隔提供了最佳大小的间隔，在保持短扩增子的增强速率的同时，还允许对扩增产物中的分子实现特异性检查。因此，在一个实施方案中，在扩增产物的至少一个分子中第一或第二单链检测序列包括对应于所述3至15个或3至6个碱基的至少3个碱基序列。例如，我们已经证明了区分特异性靶病原体依赖性扩增产物和非靶标特异性背景扩增产物的潜力，如实施例4(图8)中所示。
在一个实施方案中，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针之一的杂交区域，与用于该病原体的第一或第二引物的杂交区域或该杂交区域的反向互补序列，具有5个或更多个互补的碱基。
在另一个实施方案中，用于本发明的第一寡核苷酸探针的杂交区域与第一和第二寡核苷酸引物之一的杂交区域具有一定的互补性，例如5个或更多个互补碱基，和/或第二寡核苷酸探针的杂交区域与第一和第二寡核苷酸引物中另一个的杂交区域的反向互补序列具有一定的互补性，例如5个或更多个互补碱基。
在进一步的实施方案中，第一和/或第二寡核苷酸探针的杂交区域可以与如上所述的病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列之间的间隔具有一定的互补性或反向互补性。
在一个备选的方式中，降低第一和/或第二寡核苷酸引物的浓度，以降低因从头扩增和引物-引物结合产生背景的可能性。为了确保扩增速率的保持，可以使用在3'端封闭而不能通过链置换DNA聚合酶延伸的附加寡核苷酸引物对。在此实施方案中，虽然未封闭的第一和第二寡核苷酸引物可有足够浓度用于初始杂交和延伸事件以从病原体来源RNA产生扩增子，但随后的扩增用优选以更高浓度提供的封闭引物进行，其中封闭引物的切割发生在其延伸和链置换之前，以去除3'封闭修饰并允许扩增过程在不受损害的情况下进行(参见图4)。因此，在一个实施方案中，针对至少一种靶病原体，本发明还利用：(A)第三寡核苷酸引物，该第三寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含具有限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域的一条链，其中该第三引物在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸；和/或(B)第四寡核苷酸引物，该第四引物在5'至3'方向上包含具有限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域的一条链，其中该第四引物在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸。在包含此实施方案的本发明方法中，第三和第四引物在方法步骤a)中与样品接触。在另一实施方案中，第三寡核苷酸引物，如果存在，则以超过第一寡核苷酸引物的量提供；并且，第四寡核苷酸引物，如果存在，则以超过第二寡核苷酸引物的量提供。通过实质性地降低第一和第二寡核苷酸引物的浓度(被第三和第四寡核苷酸引物的存在所补偿)，获得在去除非靶标依赖性背景扩增方面的最大潜在益处。除了存在阻断聚合酶延伸的3'修饰之外，第三和第四引物适用第一和第二引物所采用的相同设计参数，其中所述3'修饰可以在寡核苷酸引物合成期间通过例如使用3'磷酸或C-3修饰而容易达到。
本发明方法的实施方案，如上文所述提供增强的特异性并去除背景扩增，可以改善序列验证的严格性，允许在不损失特异性的情况下进行低温反应，和/或增加多重检测，其中可以进行多个反应以同时检测多个靶标。由这种严格特异性带来的益处还意味着，本发明方法可以耐受广泛的温度范围和次优条件(例如试剂浓度)，而不丧失特异性。例如，我们在所有组分浓度增加或减少20％的情况下实施了本发明，并且我们实施了在步骤a)中进行扩增后在环境温度下保持了相当长的一段时间的本发明方法，在每种情况下均没有观察到任何特异性损失。因此，这些实施方案呈现了本发明相对于已知试剂盒和方法的显著优势，表明本发明理想地适合于在低成本和/或一次性诊断装置中利用。
检测物分子的检测可以通过任何技术来完成，该技术可以从样品中存在的其他试剂和组分中区别性地检测出检测物分子的存在。为了区分靶病原体和对照核酸(如果存在)，检测方法区别性检测每一种病原体检测分子和对照检测分子。用于检测每种病原体检测分子和任选地对照检测物分子的方法，优选相同。在可用于检测所述检测物分子的各种理化技术中，本发明优选使用能够产生如下灵敏信号的技术，其中所述信号仅在第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针与扩增产物中的相关分子杂交之后才存在。对本领域技术人员而言显而易见的是，存在一系列比色或荧光染料，其可容易地连接到第一寡核苷酸探针上并形成其检测的基础，所述检测可以是目测、或使用诸如吸光度或荧光光谱的仪器。
因此，在一个实施方案中，允许检测第一寡核苷酸探针的部分是比色或荧光染料或能够连接比色或荧光染料的部分如生物素。在使用比色染料时，用于每种靶病原体和任选地对照核酸的染料可以相同或不同。在一个实施方案中，相同的染料用于所有的靶病原体和对照核酸(如果存在)。
采用比色染料的本发明实施方案的优势是不需要仪器来执行荧光激发和检测，并且潜在地允许通过目测来确定靶核酸的存在。比色检测可以通过在第一寡核苷酸探针用于本发明之前将比色染料或能够连接比色染料的部分直接连接到第一寡核苷酸探针上来实现，或者可以通过在探针结合到扩增产物分子上后特异地将所述染料或所述部分连接或结合到所述探针上来实现。例如，第一寡核苷酸探针可包含生物素部分，该生物素部分将允许其结合到链霉抗生物素蛋白缀合的比色染料上以用于其后续检测。可用于检测的比色染料的一个例子是金纳米颗粒。可以使用具有各种其他内在比色部分的类似方法，大多数的这些比色部分是已知的，如碳纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、聚苯乙烯小球、量子点等。也可以使用高消光系数染料在该方法中实现灵敏的实时定量。
在为给定的应用选择合适的染料时，要考虑多个因素。例如，在预期在溶液中进行可见光比色检测的实施方案中，通常有利的是选择较大尺寸的颗粒和/或具有较高消光系数的颗粒以便于检测；而对于并入侧流膜用于目测检测的实施方案，可能将得益于较小尺寸的颗粒更快地沿膜扩散的能力。多种尺寸和形状的金纳米颗粒是可获得的，也可以获得许多其他目的比色部分，包括基于聚苯乙烯或乳胶的微球/纳米颗粒。这种性质的颗粒也有多种颜色，可用于在本发明方法实施过程中标记和区别性地检测不同的检测物分子，或在检测反应中产生“多重”的比色信号。
荧光检测可以使用任何可以在适当的激发刺激下发出荧光信号从而导致随后对检测物分子的检测的染料来实现。例如，用于直接荧光检测的染料包括但不限于：量子点、ALEXA染料、荧光素、ATTO染料、罗丹明和得克萨斯红。在使用连接到寡核苷酸探针的荧光染料部分的方法实施方案中，还可基于荧光共振能量转移(FRET)进行检测，如用于核酸检测的Taqman定量PCR或基于分子信标的策略，其中染料结合到检测物分子上后信号会增加或减少。通常，在使用荧光测量方法时，可以使用许多不同的检测装置来记录产生的荧光信号，例如CCD相机、荧光扫描仪、基于荧光的微板读数仪或荧光显微镜。
在另一实施方案中，允许检测第一寡核苷酸探针的部分是在与底物接触后产生可检测信号(如比色或荧光信号)的酶。对本领域技术人员而言显而易见的是，有许多酶-底物系统可得，并且常规地使用在诊断领域，如在ELISA和免疫组织化学检测中。辣根过氧化物酶(HRP)是一个实例。通过利用连接到第一寡核苷酸探针的酶来检测检测物分子，提供了许多潜在的优势，例如可以通过涉及底物添加的单独步骤，来提高检测的灵敏度和增加对信号产生的控制。其他合适的比色酶可包括：糖基水解酶、肽酶或淀粉酶、酯酶(例如羧基酯酶)、糖苷酶(例如半乳糖苷酶)和磷酸酶(例如碱性磷酸酶)。该列表不应视为以任何方式构成限制。
在另一方法中，病原体或对照检测物分子的存在通过电检测，如通过在检测物分子存在的情况下阻抗的变化、或电导、安培、伏安或电位测量信号的变化来检测。因此，在一个实施方案中，通过电信号的变化来检测检测物分子。电信号变化可通过允许实现第一寡核苷酸探针检测的部分，如导致电信号变化增强的化学基团来促进。由于电信号检测可以十分灵敏，所述检测部分可以仅仅是寡核苷酸序列，但在某些实施方案中，也可以存在已知增强电信号的化学基团如金属(如金)和碳，来增强信号。
在一个实施方案中，可在扩增期间在水性反应中检测由于检测物分子的累积而导致的电信号变化；在其他实施方案中，可以通过将检测物分子定位到用于检测的特定位置(如电化学探针表面)以利于电信号检测，其中该定位由第二寡核苷酸探针介导。
在一个实施方案中，使用碳或金(优选碳)产生比色或电化学信号，以检测所述检测物分子的存在。
在一个实施方案中，通过核酸侧流，检测所述检测物分子。核酸侧流(其中核酸通过其扩散通过通常由硝酸纤维素制成的膜而与其他反应组分分离)是一种快速且低成本的检测方法，能够与一系列信号读出方式耦合，包括比色、荧光和电信号。核酸侧流非常适合用于本发明中检测物分子的检测，并且提供了许多优势。在一个实施方案中，进行核酸侧流检测，其中检测物分子中的第一寡核苷酸探针用于连接比色或荧光染料，检测物分子中的第二寡核苷酸探针用于将该染料定位到侧流条上确定的位置。通过这种方式，可以进行快速检测，通过目测或读出仪器读取结果。核酸侧流可以使用抗原作为第二寡核苷酸探针中的检测部分，相关抗体固定在侧流条上。或者，可以通过将前体检测物分子或检测物分子杂交到侧流条上，容易地进行序列特异性检测，从而提供具有改进的多重检测潜力的、可替代抗体测定试验的、简单低成本方案。已知的试剂盒和方法如SDA不使用本发明的寡核苷酸探针对，通常产生不能基于序列特异性杂交检测的双链DNA产物。与之不同，在本发明中，使用基于位置特异性杂交的检测，本发明检测物分子特别适合于多重检测。碳或金纳米颗粒可容易地用于核酸侧流。检测物分子的定位导致碳或金的局部集中，分别导致出现黑色或红色。在一个实施方案中，第一寡核苷酸探针在通过序列特异性杂交固定于试纸条上之前，包含允许其与比色染料结合的部分，例如生物素。
因为允许例如检测物分子基于杂交结合在特定位置，检测物分子的空间定位将与用于检测该检测物分子的技术密切相关。除了有助于快速和特异性检测之外，这种物理连接可以增强本发明在多重检测多种不同靶病原体中的应用。在一个实施方案中，第二寡核苷酸探针连接在核酸侧流条上或电化学探针、96孔板、小球或阵列的表面上。因此，扩增产物中的至少一个分子可以被定位到相应的第二寡核苷酸探针所在的物理位置，检测物分子在此位置形成之后可以容易地被检测。备选地，可能有利的是，使用单链寡核苷酸作为连接到第二寡核苷酸探针的部分，所述部分将允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料上。这样，固相连接的寡核苷酸的序列可以独立于靶核酸序列来定义，以增强结合效率。因此，在一个实施方案中，允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是单链寡核苷酸。该单链寡核苷酸可设计为具有改进的亲和力和杂交效率，以增强本发明的性能。例如，在本发明的某些实施方案中，不是将第二寡核苷酸探针直接连接到侧流条，而是采用具有针对侧流条上杂交优化的序列的单独捕获寡核苷酸，其能够与第二寡核苷酸探针内存在的单链寡核苷酸部分有效杂交。
在多种研究中，我们通过核酸侧流,使用单链寡核苷酸作为第二寡核苷酸探针的连接部分(这提供增强侧流条杂交的序列)，显著增强了本发明的性能。例如，可以使用富含G-C的序列用于侧流条上杂交，或者可以使用具有较高Tm的较长序列来补充第二寡核苷酸探针的长度。或者，该单链寡核苷酸部分可包含一个或多个修饰碱基或核苷酸间键以增强其亲和力，如PNA、LNA或G-钳(G-clamp)。我们已经观察到，在单链寡核苷酸部分中使用重复序列基序时，观察到杂交效率的惊人增强，这是由其预测Tm所不能预测的。因此，在一个实施方案中，单链寡核苷酸部分的序列包含2到4个碱基DNA序列基序的三个或更多个重复拷贝。例如，在采用这种序列基序的多种研究中，我们观察到通过核酸侧流的检测灵敏度显著增强，通常100倍或更高的信号增强。
因此，在通过核酸侧流检测所述检测物分子存在的实施方案中，核酸侧流可以利用一种或多种如下核酸，所述核酸能够与允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分进行序列特异性杂交。
通过将病原体来源RNA序列与用于连接的固体材料解偶联或与检测手段解偶联(这可以通过使用单链寡核苷酸作为第一寡核苷酸探针内的检测部分和/或第二寡核苷酸探针中的连接部分来实现)，可以赋予另一个优势。以此方式，可以优化和确定用于连接的相关固体材料或包含该固体材料的装置，如核酸侧流条，和/或检测手段，而无需考虑病原体来源RNA的序列。这种“通用”检测装置无需进行改变，即可以在不同的靶标之间使用。例如，可独立于用于检测多种靶病原体的本发明寡核苷酸引物和探针的开发，来确定、优化和有效地制造这样的核酸侧流条，所述的测流条具有相应于相容的一组寡核苷酸序列的印刷线，该组寡核苷酸序列能够有效地用于测流条上的杂交并且不产生不想要的交互干扰。
在许多实施方案中，可以实施定量检测。因此，可在方法步骤c)中定量样品中单链靶核酸的水平。定量可以例如，通过在反应时程中在多个时间点而不是在单个终点、通过比色法、荧光法或电学方法测量检测物分子来达到。替代定量策略包括类似于液滴数字PCR的样品系列稀释。在另一实施方案中，可半定量测定样品中靶病原体的水平。例如，核酸侧流条上的比色信号强度将对应于样品中靶病原体的近似水平。或者，可以使用抑制剂，其中靶病原体的拷贝数必须超过某个确定的拷贝数，来克服抑制剂的抑制作用并产生检测物分子的可检测拷贝数。
在本发明中，第二寡核苷酸探针连接在固体材料上或连接在允许其连接到固体材料的部分上。可选地，在一些实施方案中，一个或多个其他寡核苷酸引物和探针也可连接在固体材料或允许其连接到固体材料的部分上。对本领域技术人员而言显而易见的是，寡核苷酸与固体材料的连接可以有多种不同的方式。例如，可获得许多不同的固体材料，其已经或可以与足够密度的官能团连接或官能化，以用于连接适当修饰的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针反应的目的。此外，这类固体材料的形状、尺寸和形式多种多样，包括小球、树脂、表面包被的平板、载玻片和毛细管。用于共价连接寡核苷酸的此类固体材料的实例包括但不限于：载玻片、玻璃小球、铁氧体芯聚合物包被的磁性微球、二氧化硅微粒或磁性二氧化硅微粒、基于二氧化硅的毛细管、3D反应性聚合物载玻片、微孔板、聚苯乙烯小球、聚乳酸(PLA)颗粒、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微粒、控孔玻璃树脂、氧化石墨烯表面和官能化琼脂糖或聚丙烯酰胺表面。诸如聚丙烯酰胺的聚合物具有进一步的优势，在用于产生聚合物的单体(例如丙烯酰胺单体)聚合反应期间，可以共价连接官能化的寡核苷酸。在聚合反应中包括官能化的寡核苷酸以产生包含共价连接的寡核苷酸的固体聚合物。这种聚合是一种将寡核苷酸连接到固体材料上的高效手段，并可以控制所产生的连接寡核苷酸的固体材料的大小、形状和形式。
通常，为了将寡核苷酸探针连接到任何此类固体材料上，可以合成在3'或5'端带有官能团的寡核苷酸；但官能团也可在寡核苷酸的生产过程中添加到几乎任何的碱基位置上。然后可在寡核苷酸的官能团与相关固体材料上的官能团之间进行特异性反应以形成稳定的共价键，从而导致寡核苷酸连接到固体材料。通常，这种寡核苷酸通过5'或3'端连接到固体材料上。举例来说，两种常用且可靠的连接化学利用巯基(SH)或胺(NH3)基团和寡核苷酸中的官能团。巯基可与固体支持物上的马来酰亚胺部分反应以形成硫酯键，而胺可与琥珀酰亚胺酯(NHS酯)修饰的羧酸反应以形成酰胺键。许多其他化学物质也可以使用。除了寡核苷酸探针与固体材料的化学缀合之外，在固体材料上直接合成寡核苷酸探针以用于本发明，是可能的并且潜在有利的。
在其他实施方案中，第二寡核苷酸探针连接在允许其连接到固体材料的部分上。一种策略是采用亲和结合的方法，其中允许特异性结合的部分可以连接在寡核苷酸探针上，以促进其连接到相关亲和配体。这可以例如使用抗体-抗原结合或亲和标签(例如聚组氨酸标签)来进行，或者通过使用基于核酸的杂交来进行，其中互补核酸连接到固体材料，例如硝酸纤维素核酸侧流条。示例性的此类部分是生物素，其能够与链霉抗生物素蛋白或亲和素高亲和力结合，而链霉抗生物素蛋白或亲和素本身连接于小球或另一固体表面。
本发明检测和区分两种或更多种靶病原体。在一个实施方案中，同时针对所有的靶病原体实施本发明的方法。为检测在存在两种或更多种病原体来源RNA时产生的检测物分子，可以将其分别与特定的信号(例如，不同的比色或荧光染料或酶)偶联，以允许多重检测。或者，可以通过将第二寡核苷酸探针直接或间接地(通过允许其连接到固体材料的部分)连接在固体材料上，进行多重检测。这种方法利用的是病原体和对照(如果存在)检测物分子的物理分离，而非依赖于不同的检测手段。因此，例如，可在核酸侧流上使用单一染料来检测多种病原体(和对照核酸)，其中产生的每种不同的检测物分子分别定位到侧流条的特定印刷线位置，与第二寡核苷酸探针的直接或间接的基于序列的杂交形成了差异检测的基础。或者，可以使用电检测阵列，其中多种不同的第二寡核苷酸探针连接到阵列的特定区域上，因此在同时产生多种不同的检测物分子的多重反应中，每种检测物分子可以通过杂交到阵列的不同离散区域而定位，从而允许多重检测。
前述检测过程，如核酸侧流和电检测，及其能够容易地检测在同一样品中的多种不同靶病原体能力，是通过本发明本身的必要特征寡核苷酸探针对来实现的。因此，有力地证明了本发明相对于已知试剂盒和方法的优势。
本发明的试剂盒还可以包括用于实施过程控制的组分，例如：
a)引物对，所述引物对包含：
i.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域，和
ii.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；
其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
b)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
c)探针对，所述探针对包含：
i.具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与对照核酸存在时产生的扩增产物中的至少一个分子的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
ii.具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中该第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接于固体材料的部分上。
本发明的方法还可以包括实施过程控制，例如：
a)使对照核酸与以下组分接触：
i.引物对，所述引物对包含：
第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域，和
第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；
其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
ii.限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
iii.链置换DNA聚合酶；
iv.dNTP；和
v.一种或多种修饰的dNTP，
以在对照核酸存在的情况下产生对照扩增产物；
b)使步骤a)的对照扩增产物与如下组分接触：
i.探针对，所述探针对包含：
具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与对照扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述对照扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中该第一和第二探针与所述对照扩增产物中的该至少一个分子的杂交产生对照检测物分子；和
c)检测在步骤b)中产生的对照检测物分子是否存在，其中对照检测物分子的存在构成对本发明方法的过程控制。
在该方法的此实施方案中，对照核酸也可以与逆转录酶接触。
过程控制优选与靶病原体的检测同时进行。优选内对照，其与本发明的方法在相同的容器/装置/设备等中并行运行。样品中靶病原体的定性检测是重要的，例如对于识别患者中的感染而言，因此可能希望避免出现假阴性或假阳性结果，因为这样的结果可能会导致诸如患者治疗的后果。内部过程控制可以帮助确认测试结果的有效性。检测到存在对照检测物分子，表明即使在没有源自靶病原体的扩增产物/检测物分子的情况下，方法例如扩增已成功执行。在靶病原体检测结果为阴性的情况下，应检测定性内对照，否则该方法可能被认为未正常运行。然而，在靶病原体检测结果为阳性结果的情况下，不一定需要独立地检测定性内对照。
当存在时，对照核酸可以是RNA、DNA、包含RNA和DNA碱基的嵌合体，或RNA/DNA杂交体。在一个实施方案中，对照核酸包含RNA，过程控制包括可用于本发明的任何逆转录酶活性。对照核酸可以设计为与病原体来源RNA使用相同的引物之一或两者和/或限制酶和/或寡核苷酸探针之一或两者。用于对照核酸的寡核苷酸探针之一优选不同于用于病原体来源RNA的探针，以允许差异检测在对照核酸存在时产生的与在病原体来源RNA存在时产生的扩增产物/检测物分子。当用于对照核酸和病原体来源RNA的寡核苷酸探针之一相同时，优选第一寡核苷酸探针相同。作为非限制性实例，对照核酸的长度可以高达500个碱基，例如长度可达200或100个碱基。
应当理解，除非另有特别说明，否则与病原体来源RNA相关的前述试剂盒和方法特征描述，在适当的情况下，也适用于对照核酸和对照核酸引物、探针、限制酶、扩增产物、检测物分子等。因此，例如，用于对照核酸的探针对的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针中的一个，优选第一寡核苷酸探针，在其杂交区域的3'端被封闭以防止通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域内切割，并且还优选在方法步骤a)进行的同时与对照核酸接触。
本发明的试剂盒、装置和方法可用于流感和RSV感染的诊断、预后或监测。本发明的试剂盒、装置和方法还可以配置为额外检测一种或多种其他疾病，例如其他传染病，例如呼吸道感染，例如鼻病毒、腺病毒、冠状病毒(如SARS-CoV-2)或副流感病毒感染。
本发明适用于广泛的样品类型。合适地，样品是生物样品或环境样品，例如人类样品，例如：鼻拭子或抽吸物、鼻咽拭子或抽吸物、咽拭子或抽吸物、口咽拭子或抽吸物、或痰、或源自前述任何一种的样品、来自任何形式的组织活检物或体液的人类或动物样品。我们还在包含至少10-20％以下临床样本的广泛样品中实施了本发明方法：VTM中的鼻拭子、VTM中的鼻咽拭子、ThinPrep Media、液体Amies中的咽拭子、通过2M NaOH/异丙醇处理然后通过DNA捕获珠处理的痰，液体Amies中的口腔拭子。这些实验证明了本发明在不同临床应用中明显的通用性，并且在相关样品中未观察到抑制。这与其他方法形成鲜明对比，在其他方法中生物样本中发现的抑制PCR的抑制剂对方法形成抑制；这说明，无需复杂的样品制备程序，本发明的试剂盒和方法可以用于低成本或一次性装置中。样品在用于本发明方法之前可以进行处理或可以不进行处理。合适的方法为本领域技术人员所熟知。例如，在将样品用于本发明的方法之前，可以对样品进行处理、纯化、过滤、化学或物理裂解、缓冲液更换、外显子组捕获、或去除，例如部分去除污染物。
在本发明中，当靶病原体基因组是负链单链RNA病毒时，正链转录物也可以存在于样品中，并且可以与本发明中的单链靶核酸一样，使用相同的寡核苷酸引物和探针，扩增和检测其中的一条链或两条链。
如前所述，本发明的方法和试剂盒理想地适合在装置诸如一次性(或单次使用的)诊断装置中使用。因此，本发明还提供了包含如上所述试剂盒的装置，尤其是其中所述试剂盒可以包括检测在病原体来源RNA存在时产生的检测物分子是否存在的工具，如核酸侧流条。该装置可以是动力装置，例如电动装置，该装置还可以包括加热工具并且可以是自含式装置，即不需要辅助测试仪器的装置。
本发明的方法也可独立于检测步骤c)用于扩增病原体来源RNA信号，例如，可以使用这样的方法，其中将扩增的信号存储和/或传输以根据需要在未来日期和/或替代位置检测和区分靶病原体。所述扩增的信号包括通过实施方法产生的前体检测物分子或检测物分子。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了在样品中扩增病原体来源RNA(如上定义)的信号的方法，其包括本发明方法的步骤a)和步骤b)的全部或部分。也应理解，本文中描述的与本发明试剂盒相关的所有可选和/或优选的发明实施方案，也适用于本发明的方法和装置及其用途，反之亦然。
以下实施例用于进一步举例说明本文描述的本发明(实施例10)和用于本发明的方法(实施例1-9)的各方面和实施方案。这些实施例不应视为构成任何限制。
实施例
材料和方法
除非另有说明，在以下实施例中使用以下材料和方法。
寡核苷酸：除非另有说明，定制寡核苷酸由Integrated DNA Technologies用亚磷酰胺法制备。
核酸侧流：碳纳米颗粒通过非共价吸附缀合到多种生物素结合蛋白，例如链霉抗生物素蛋白。通常，在硼酸盐缓冲液中制备胶体碳悬浮液，然后使用探头超声仪进行超声处理。随后通过在室温下孵育使碳吸附到生物素结合蛋白上。碳直接用于反应混合物，或应用于玻璃纤维缀合物垫。按照厂家的指南，通过将含有冻干糖和用于改善外观的添加剂的缀合物垫与样品垫、硝酸纤维素膜和吸附垫(Merck Millipore)组合，来构建侧流条。在将其用于侧流条之前，将(一种或多种)相关寡核苷酸印刷在硝酸纤维素膜上的确定位置上并通过UV交联而连接在膜上，其中所述相关寡核苷酸含有待在本发明方法中检测的检测物分子中的序列的反向互补序列。
实施例1
其中第二寡核苷酸探针连接在固体材料硝酸纤维侧流条上的本发明所用方法的性能
此实施例展示了本发明所用方法的性能，其中第二寡核苷酸探针连接在固体材料硝化纤维素侧流条上，并且第一寡核苷酸探针不在扩增步骤a)进行的同时与样品接触。
设计了总长度为24个碱基的第一寡核苷酸引物，其在5′到3′方向上包含：7碱基的稳定化区；不是切口酶的限制酶的5碱基识别序列；以及12碱基杂交区域，其包含靶核酸中第一杂交序列的反向互补序列。第二寡核苷酸引物设计为包含相同的稳定化区和限制酶识别序列，但具有能够与靶核酸中的第二杂交序列的反向互补序列杂交的12碱基杂交区域。在本实施例中，第一限制酶和第二限制酶是相同的限制酶。该限制酶是不对称双链切割限制酶，具有在其5碱基识别序列下游的顶部链切割位点。靶核酸中的第一和第二杂交序列由1个碱基分开。
这些寡核苷酸引物是利用靶核酸设计的，因此在引物的反向互补序列中位于切割位点下游的核苷酸碱基是腺苷，从而在该方法中采用α-巯基dATP作为修饰dNTP。通过链置换聚合酶插入硫代磷酸酯修饰以阻断该反向互补链的切割。
设计总长度为20个碱基的第一寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包含：与扩增产物中的至少一个分子互补的12碱基区；6碱基中性间隔区；以及在合成期间添加的3'生物素修饰，其中该生物素修饰允许第一寡核苷酸探针连接到比色染料碳纳米颗粒上。制备吸附在生物素结合蛋白上的碳，并用第一寡核苷酸探针饱和。设计总长度为49个碱基的第二寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包含：含有10个胸腺嘧啶核苷碱基的中性间隔区；能够与扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交的13碱基区的3个重复，其中第二单链检测序列位于第一单链检测序列的下游。将约30pmol的该第二寡核苷酸探针打印在核酸流动条上。
制备包含以下的反应：1.6pmol第一引物；0.1pmol第二引物；250μM 2'-脱氧腺苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)Sp异构体(Sp-dATP-α-S)，来自Enzo Life Sciences；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；2U限制酶；2U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶。将核酸靶标(单链DNA靶标)以多个水平(++＝1amol，+＝10zmol，NTC＝无靶标对照)添加到10μl总反应体积的适当反应缓冲液中。将反应在45℃下孵育7分钟或10分钟。然后将6.5μl终止的反应混合物加到60μl含有0.056mg mL-1缀合碳的侧流缓冲液中，然后上样到第二寡核苷酸探针结合在其打印线中的核酸侧流条上。
图5显示了在进行此实施例时获得的侧流条的照片。箭头指示第二寡核苷酸探针已经打印在硝酸纤维素条上并因此出现阳性信号的位置。在两个靶水平和两个时间点，都仅在存在靶核酸的情况下观察到对应于碳信号存在的清晰黑线，表明本发明的方法可以快速且灵敏地检测靶核酸序列。
实施例2
其中第一寡核苷酸探针在其杂交区域3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸并且不能被限制酶在所述杂交区域中切割并且在步骤a)中与样品接触的本发明所用方法的性能
此实施例展示了本发明所用方法的性能，其中第一寡核苷酸探针在其杂交区域3'端被封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，不能被限制酶在所述杂交区域中切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。在此实施方案中，我们没有观察到对扩增速率的任何显著抑制，表明前体检测物分子实时累积，没有干扰最佳循环扩增过程。我们不仅没有在该实施方案中观察到对扩增过程的任何抑制效应，而且我们还观察到与检测物分子的量增加相对应的、所产生信号的令人惊奇的增强，至少为100倍。
实施例2.1：利用方法的该实施方案，设计了实施例1中所用测定法的变型形式，其中第一寡核苷酸探针在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。使用与实施例1中相同的寡核苷酸引物、限制酶、dNTP、修饰的dNTP和聚合酶，但是，设计了总长度为21个碱基的替代第一寡核苷酸探针，其在5'到3'方向上包含：5'生物素修饰；8碱基中性区；能够与扩增产物中的至少一个分子杂交的13碱基区；以及3'磷酸修饰，其中该生物素修饰允许第一寡核苷酸探针连接到比色染料碳纳米颗粒上，并且该磷酸修饰阻断探针通过链置换DNA聚合酶延伸。制备吸附在生物素结合蛋白上的碳，并用第一寡核苷酸探针饱和。
设计总长度为51个碱基的替代第二寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包含：能够与扩增产物中的该至少一个分子中的第一单链检测序列上游的第二个单链检测序列杂交的14碱基区域；6碱基中性间隔子序列；14碱基杂交区域的重复序列；第二6碱基中性间隔子序列；和10个胸腺嘧啶核苷碱基间隔子。将约30pmol的该第二寡核苷酸探针打印在核酸流动条上。
制备包含以下的反应：0.8pmol第一引物；0.8pmol第二引物；0.6pmol第一寡核苷酸探针；300μMSp-dATP-α-S；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；2U限制酶；2U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶。将核酸靶标(单链DNA靶标)以多个水平(++＝1amol，+＝10zmol，NTC＝无靶标对照)添加到10μl总反应体积的适当反应缓冲液中。反应在45℃下孵育6分钟。然后将5μl终止的反应混合物加到60μl含有0.03mg mL-1缀合碳的侧流运行缓冲液中，然后上样到核酸侧流条上。进行对照反应，以证明在反应期间不存在第一寡核苷酸探针的情况下不产生检测物分子。在步骤a)之后将同等水平(0.6pmol)的该探针加至该对照，以控制在侧流条检测期间由该探针存在带来的任何非期望的影响。
图6A展示了核酸侧流条在其显影后的照片。在反应过程中提供第一寡核苷酸探针时，在两个靶水平都观察到了与碳纳米颗粒沉积相对应的清晰信号。正如预期的那样，在反应期间不提供第一寡核苷酸探针时，在任一个靶水平都没有检测到信号。此实验清楚地证明了在方法的该实施方案中实质性增强了检测物分子产生的潜力，在所述实施方案中第一寡核苷酸探针在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被第一或第二限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。值得注意的是，与实施例1相比，提供了同等浓度的第一和第二寡核苷酸引物，这使得能够更快速地扩增。
实施例2.2：接下来使用完全不同的靶核酸设计了单独的测定试验，以证明所述方法实施方案的通用性。以实施例1和2.1中所述类似的方式，为相关靶核酸(单链DNA)设计了寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。
制备包含以下的反应：0.8pmol第一引物；0.4pmol第二引物；0.6pmol第一寡核苷酸探针；300μMSp-dATP-α-S；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；2U限制酶；2U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶。将核酸靶标(单链DNA靶标)以多个水平(+＝1amol，NTC＝无靶标对照)添加到10μl总反应体积的适当反应缓冲液中。将反应在45℃下孵育6分钟。然后将5μl终止的反应混合物加到60μl含有0.08mg mL-1缀合碳的侧流运行缓冲液中，然后上样到核酸侧流条上。进行包含第一寡核苷酸探针的截短变体的对照反应，该截短变体也在步骤a)进行的同时与样品接触。
图6B展示了核酸侧流条在其显影后的照片。清晰的阳性信号在靶核酸存在时可见，而在无靶标对照中不可见，证明了该测定试验的正确设计和功能以及该方法实施方案的可靠潜力，其中第一寡核苷酸探针在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被第一或第二限制酶切割，并在步骤a)进行的同时与样品接触。如预期的那样，在采用第一寡核苷酸探针的截短形式的对照测定中，仅观察到非常微小的信号，表明检测物分子的有效产生需要在步骤a)扩增进行的同时第一寡核苷酸探针正确杂交。
实施例3
在同一样品中检测两种或多种不同靶核酸存在的本发明所用方法的性能
本实施例展示了方法用于检测样品中两种或多种不同靶核酸的潜力。除了引物之外，方法中还使用两个寡核苷酸探针，这使得可以提供一个完整的方法用于在方法中检测扩增产物，由此所述方法理想地适合于检测相同样品中的两种或多种不同的靶核酸。在本实施例中，证明了基于第二寡核苷酸探针的序列特异性杂交来差异检测替代性检测物分子的能力。
首先，为了证明方法用于检测两种或多种不同的靶核酸的能力，我们开发了用于检测两种不同靶标(A和B)的相容寡核苷酸引物和探针组。在每种情况下，第一寡核苷酸探针设计为在5'-3'方向包含以下特征：5'生物素修饰，7碱基稳定化区域，5碱基限制性内切核酸酶识别位点，在限制酶切割位点处包含硫代磷酸键的与靶标A或B的3'端互补的11-13碱基区域，以及3'磷酸修饰。第二寡核苷酸探针设计为在5'-3'方向包含：与靶标A或B的5'端互补的12-14碱基区域，5个胸腺嘧啶核苷碱基的中性间隔区，以及12个碱基的单链寡核苷酸部分作为允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料上的部分。利用不同的序列设计用于每种靶标的单链寡核苷酸连接部分的序列，以允许每种检测物分子分别结合在侧流条上的不同位置。制备核酸侧流条，其在分开的位置含有30pmol寡核苷酸的离散点，各离散点的所述寡核苷酸分别含有各单链寡核苷酸检测部分的反向互补序列。
在65μl含有0.032mgml-1吸附到生物素结合蛋白上的碳的适当缓冲液中，组装包含以下的反应：0.5pmol用于靶标A和靶标B的第一寡核苷酸探针；0.5pmol用于靶标A和靶标B的第二寡核苷酸引物。将不同水平的每种靶标(+＝0.1pmol；++＝1pmol)以及两种靶标的组合，分别添加到分开的反应中。还进行了无靶标对照(NTC)。
图7A显示了在实验中获得的侧流条的照片。在两个靶标水平和两个测定中都观察到了与含碳检测物分子的沉积相对应的清晰黑点。此外，在两个反应同时进行时，观察到对应于靶标A和B两者的信号。未观察到背景信号或不同测定之间的串扰。
为了证明该方法的稳健性，继续进行进一步实验，开发三个分开的测定试验来证明该方法用于检测样品中三种不同的具有确定序列的靶核酸的潜力。采用了如上所述的类似方法。图7B显示所获得的侧流条的照片。按所示单独地及以多种组合加入靶标P1、P2和P3。将第二寡核苷酸探针的单链寡核苷酸检测部分的反向互补序列印刷在核酸侧流条上的分开线中。黑色信号指示碳连接的检测物分子的沉积，在所有情况下都定位到预期的位置，可用于快速灵敏检测，在测定之间无不期望的串扰，也没有任何背景信号。包含四个分开的测定试验的等同实验，证明了该方法用于检测样品中四种不同的具有确定序列的靶核酸(P1、P2、P3和P4)的潜力，结果如图7C所示。在这个四靶标实验中，P4作为阳性对照存在于所有反应中，将其他靶标单独添加至分开的反应中。所显示的侧流条照片表明，在预期位置有清晰的黑色条带，对应于与碳结合的相关检测物分子的存在。此多重测定证明了该方法用于由多种不同病原体引起的疾病诊断的潜力，其中对照测定中检测到检测物分子的存在指示该方法已经成功地进行，而一种或多种其他检测物分子在侧流条上的显现则指示了在适当的临床样品中存在相关的(一种或多种)致病病原体。虽然在此类诊断应用中(如在感染性疾病领域)很少观察到在同一样本中存在一种以上病原体的共感染，但对于在多重反应中检测任何靶标的组合，本发明的方法是高度通用的。图7D显示了添加四种靶标(P1、P2、P3和P4)的不同组合的实验的结果。在没有非特异性背景的情况下，能够单独检测到每种靶标的能力以及能够在省略各单种靶标时检测到其他三种靶标的能力，证明了本发明方法的显著检测特异性。
在上述和多个其他实验中，我们也进行了多重测定试验，在非常低的靶标浓度(例如1zmol(600个拷贝)或17ymol(10个拷贝))下检测3-5种靶标。在此实施例中，我们已经清楚地证明了本方法可以检测样品中两种或多种不同的具有确定序列的靶核酸的存在，并且可以例如通过核酸侧流用于快速低成本的信号检测。本方法的不寻常且有利的特征是，在同一样品中可以容易地检测两种或多更种不同的靶核酸。对于添加的每一种待检测的靶核酸，需要添加一组寡核苷酸引物，在检测两种或更多种不同靶核酸的已知方法中这呈现了重大挑战，因为增加的引物将导致形成非特异性扩增产物的倾向性增加。在本方法中，这一问题通过特异性的增强而得以克服，这种特异性的增强可归于例如使用修饰碱基、改进的酶选择、和使用寡核苷酸探针来形成检测物分子，其中所述探针利用了额外的序列特异性杂交事件。
实施例4
靶核酸中的第一和第二杂交序列相隔5个碱基的本发明所用方法的性能
此实施例展示方法的性能，其中靶核酸中的第一和第二杂交序列由5个碱基分开。在两个寡核苷酸引物被设计为在第一和第二杂交序列之间具有间隔的情况下，病原体来源序列将不存在于所述的寡核苷酸引物中，并且其仅以病原体依赖性方式在病原体扩增产物中产生，通过使用此病原体来源序列，可以在本发明的方法中增强特异性，克服由从头合成或引物-引物结合导致的任何背景信号。在该实施方案中，利用所述两个杂交区域之间的间隔，设计第一或第二寡核苷酸探针的序列特异性杂交，以便仅在扩增产物包含正确的病原体来源序列时才产生病原体检测物分子。
在本实施例中，我们设计了一系列测定试验，来证明第二寡核苷酸探针与多种不同的扩增产物的杂交，这些扩增产物仅在病原体来源RNA的第一和第二杂交序列之间的间隔序列上不同。第二寡核苷酸探针设计为在其5'端包含针对扩增产物中的至少一个分子的11碱基杂交区域。该区域由一个7碱基序列和一个5碱基序列组成，该7碱基序列是第一寡核苷酸引物的反向互补序列，该5碱基序列是扩增产物中从两个引物之间的间隔区来源的另外病原体来源序列的反向互补序列。第二寡核苷酸探针在5'到3'方向上还包含5个胸腺嘧啶核苷碱基的中性间隔区和用于连接到固体材料的12碱基单链寡核苷酸部分。制备了硝酸纤维素核酸流动条，其上打印有30pmol的具有该部分的反向互补序列的寡核苷酸。第一寡核苷酸探针设计为包含与第二寡核苷酸引物相同的序列，但具有5'生物素修饰、3'磷酸修饰和位于限制酶切割位点的位置处的硫代磷酸酯核苷酸间键。
设计了四种不同的人工靶核酸序列(T1、T2、T3和T4)，每种序列都具有与第一和第二杂交序列对应的精确序列，但第一和第二杂交序列之间的五个碱基不同：T1包含与第二寡核苷酸探针的11碱基杂交区域完全互补的用于检测的正确碱基；T2在间隔区的五个碱基中包含四个错配；T3被设计为去除了间隔区的五个碱基中的四个碱基，由此扩增产物的分子将缩短四个碱基。T4在间隔区的五个碱基中包含两个错配。
在总反应体积60μl的适当反应缓冲液中组装包含以下的反应：3.6pmol第一寡核苷酸引物；1.8pmol第二寡核苷酸引物；2.4pmol第一寡核苷酸探针；300μM Sp-dATP-α-S；60μM dTTP、dCTP、dGTP；12U限制酶；12U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶。在每个反应中加入1amol靶标(T1、T2、T3或T4)，然后在45℃孵育6.5分钟，然后在侧流条上运行60μl反应物中的53.5μl。在将反应物加到侧流条上之前，将1.5pmol第二寡核苷酸探针和2μg吸附到生物素结合蛋白上的碳沉积在缀合物垫上并干燥5分钟。
图8显示了在实验中获得的核酸侧流条的照片。用靶标T1获得的侧流条显示了一条清晰的黑线，对应于结合在硝酸纤维素固体材料上的碳连接的检测物分子，证明本实施例中开发的测定试验(包括寡核苷酸引物和探针)可以正确地行使功能，能够实现快速和灵敏的检测。用靶标T2和T3进行的反应没有显示出任何与阳性信号对应的碳信号，说明四个错配和四个碱基去除都会去除第二寡核苷酸与反应物中产生的前体检测物分子有效杂交的能力。在使用T4产生的侧流条上观察到非常微弱的信号，表明仅两个错配碱基的存在就可以导致第二寡核苷酸探针实质性地丧失与前体检测物分子成功杂交以产生能够结合到侧流条线上的检测物分子的能力。用重复反应物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认所有靶标的所有反应均正确进行，并产生了大量扩增产物。在用四碱基截短的靶标T3进行的反应中，可以看到预期的大小迁移。
本实施例展示了第一和第二寡核苷酸探针(作为本发明的一个必要特征)不仅可以提供快速和灵敏的扩增产物检测，而且超出由引物杂交带来的检测，还可以用于提供对扩增产物的进一步基于病原体序列的特异性检查。这种有力的技术克服了现有技术方法的已知问题，这些问题在某些测定试验中由从头合成或引物-引物结合引起的非靶标特异性背景扩增引起。与现有技术方法相比，证明了本发明的方法表现出增强的特异性，同时保持灵敏的检测和快速、低成本的结果显示。
实施例5
其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是抗原并且相应的抗体连接在硝酸纤维素侧流条固体表面的本发明所用方法的性能
在本发明所用的方法中，可以使用许多不同的部分作为用于将第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分。本实施例使用人造的检测物分子来证实方法可以实施，在该方法中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是抗原并且相应的抗体连接在硝酸纤维素侧流条固体表面。
第二寡核苷酸探针设计为包含32碱基序列，该序列包含与扩增产物中的至少一个分子同源的区域和在合成期间添加的3'地高辛NHS酯修饰。通过点样和空气干燥，将从绵羊纯化的Fab片段抗地高辛抗体(Sigma-Aldrich)固定到核酸侧流条上。
第二寡核苷酸探针的性能在实验中得到证明，其中将多个水平的靶标(+++＝1pmol；++＝0.1pmol；+＝10fmol；NTC＝无靶标对照)添加到60μl设计的反应缓冲液中，该缓冲液包含使用碳核酸侧流反应进行检测所需的试剂，包括吸附在生物素结合蛋白上的0.016mgml-1碳。在0.2μl含有2.5mM硼酸盐和0.5％吐温20的缓冲液中，将0.5μg抗地高辛Fab片段点到侧流条上，制备了侧流条。使溶液干燥2h进入侧流条的硝酸纤维素膜中。使反应在45℃下孵育2分钟以形成人造检测物分子，然后将每个反应的整个反应混合物施加到侧流条上。
图9显示了实验中产生的侧流条的照片。与侧流条上的碳沉积相对应的黑斑在每个靶标水平都可见，而在NTC中不可见，表明检测物分子的特异性检测。已经证明，可以实施如下组合：基于生物素的亲和相互作用来连接检测部分(碳)，并将基于抗体的亲和相互作用用于固体材料连接部分。通过本实施例证明，就用于将第二寡核苷酸探针连接到固体材料的不同方式而言，本发明方法具有通用性。
实施例6
其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是包含三碱基DNA序列基序的四个重复拷贝的单链寡核苷酸并且该单链寡核苷酸序列的反向互补序列连接在固体材料上的本发明所用方法的性能
此实施例展示方法的性能，其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是包含三碱基DNA序列基序的四个重复拷贝的单链寡核苷酸。如上所述，采用单链寡核苷酸作为第二寡核苷酸探针的检测部分的方法实施方案，是该方法的一个简单和通用方面，其有助于通过核酸侧流的检测，并且可以容易地检测同一样品中的多种不同靶核酸。此外，单链寡核苷酸检测部分可预先确定并优化，以实现有效的侧流条上杂交，从而增强检测的灵敏度，并可提供核酸侧流条的有效大规模生产。
在本发明的一个方面中，我们观察到，通过使用由DNA序列基序的多个重复拷贝组成的单链寡核苷酸检测部分，可以令人惊奇地改进侧流条上的杂交。本实施例呈现多个并排实验的结果，其中通过使用包含三碱基DNA序列基序的四个重复拷贝的单链检测部分且该单链寡核苷酸序列的反向互补序列连接到侧流条上，可以显著增强使用直接连接到侧流条上的第二寡核苷酸的测定试验的性能。
实施例6.1：利用该方法实施方案设计了测定试验，其中第一寡核苷酸探针在其杂交区域3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被所述限制酶在所述杂交区域中切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。第一寡核苷酸探针设计为总长度为25个碱基，在5'至3'方向上包含：5'生物素修饰；7碱基中性区域；5碱基不是切口酶的限制酶的识别位点；在限制酶切割位点处包含硫代磷酸酯键的能够与靶标中的第一杂交区域杂交的13碱基区域；以及3'磷酸修饰，其中生物素修饰允许第一寡核苷酸探针连接到比色染料碳纳米颗粒上，磷酸修饰阻断其通过链置换DNA聚合酶延伸。
设计了两个替代的第二寡核苷酸探针来检测同一靶分子(I和II)。第二寡核苷酸探针“I”设计为在5'至3'方向上包含：能够与靶标中的第二杂交序列的反向互补序列杂交的14碱基区域的3个重复；以及9个胸腺嘧啶核苷碱基间隔区。制备含有30pmol探针斑点的核酸侧流条。
替代的第二寡核苷酸探针“II”设计为在5'-3'方向上包含：能够与靶标中的第二杂交区域的反向互补序列杂交的14碱基区域；5个胸腺嘧啶核苷碱基的中性间隔区；以及包含3碱基序列基序的4个重复的12碱基单链寡核苷酸部分，其中所述序列基序作为允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分。
设计了另一单链寡核苷酸，其在5'至3'方向上包含：11个胸腺嘧啶核苷碱基间隔区；包含所述3碱基序列基序的反向互补序列的12个重复的36碱基区域，其中所述序列基序形成允许第二寡核苷酸II连接到固体材料的部分。对于第二寡核苷酸探针II，用30pmol的该另一单链寡核苷酸点斑点，制备核酸侧流条。
进行测试寡核苷酸探针I和II的性能的反应，其在60μl含有0.016mgml-1吸附到生物素结合蛋白上的碳的适当缓冲液中包含0.5pmol的第一寡核苷酸探针。用于II的反应以相同的方式组装，但添加0.5pmol的第二寡核苷酸探针II。以多个水平(+++＝1pmol，++＝0.1pmol，NTC＝无靶标对照)加入核酸靶标(单链DNA靶标，代表由所设计的测定试剂产生的扩增产物中的至少一个分子)。组装的反应物在45℃下孵育2分钟，然后将整个反应混合物上样到适当的核酸侧流条上。
图10A显示了在实验中获得的侧流条的照片，左图显示第二寡核苷酸探针I的结果，右图显示第二寡核苷酸探针II的结果。在有靶标存在的情况下，观察到与碳连接的检测物分子沉积相对应的黑斑。对于包含重复序列基序的第二寡核苷酸探针II，在所有靶标水平都观察到更强的信号。
实施例6.2：接下来针对完全不同的靶核酸设计了单独的测定试验，来证明该方法实施方案的通用性及其广泛的适用性。以实施例6.1中所述类似的方式，为相关靶核酸(单链DNA)设计了寡核苷酸探针；同样有称为“I”和“II”的两种版本的第二寡核苷酸探针和多个靶标水平(+++＝1pmol，++＝0.1pmol，
+＝0.001pmol)。如图10B中所产生的侧流条的照片中所示，观察到了甚至更显著的效果。在较低的两个靶标水平，第二寡核苷酸探针I未产生任何信号，而相应的重复序列寡核苷酸探针II产生了由沉积碳的黑斑所指示的清晰阳性信号。
本实施例说明，利用包含DNA序列基序的重复拷贝的第二寡核苷酸检测部分，可以显著地改善基于侧流杂交的检测。结果表明，检测物分子基于核酸侧流检测的灵敏度可以获得100倍提高。信号的强度得到增强，并且信号产生得更快，证明了本发明的该实施方案可容易地适用于(例如通过核酸侧流)涉及快速检测的应用。此外，举例说明了可以使用单链寡核苷酸作为连接到第二寡核苷酸探针的检测部分。
实施例7
本发明所用方法在检测临床样本中的RNA病毒中的用途
此实施例展示了方法用于检测临床样本中的RNA病毒的性能，其中使用如下方法实施方案，其中第一寡核苷酸探针在扩增步骤a)进行的同时与样品接触，并且允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是包含三碱基DNA序列基序的四个重复拷贝的单链寡核苷酸，并且该单链寡核苷酸序列的反向互补序列连接在固体材料上。在多个研究中，我们已经常规地检测了非常低拷贝的RNA靶标，如病毒基因组提取物。例如，使用经过定量的病毒基因组提取物，我们采用本发明的方法在总共10分钟的出结果时间中检测到少于100个病毒基因组当量拷贝的病毒，扩增步骤a)小于5分钟。这种显著的速率和灵敏度证明了该方法在诊断领域的应用中的潜力。因此，在本实施例中，我们开发了检测致病性单链RNA病毒的测定试验，并用感染病毒的临床样品证明了该测定试验的性能。
设计了总长度为25个核苷酸碱基的第一寡核苷酸引物，其在5'至3'方向上包含：合成为在各碱基之间包含硫代磷酸酯键的8碱基稳定化区域；不是切口酶的限制酶的5碱基识别位点；以及12碱基杂交区域，其包含靶核酸中的第一杂交序列的反向互补序列，设计用于靶向单链RNA病毒基因组的区域。第二寡核苷酸引物设计为包含相同的稳定化区域但不含硫代磷酸酯键，以及包含相同的限制酶识别序列，具有能够与第二杂交序列的反向互补序列杂交的12碱基杂交区域。在本实施例中，第一限制酶和第二限制酶是相同的限制酶。靶核酸中的第一和第二杂交序列相隔0个碱基。
使用靶核酸设计了寡核苷酸引物，在引物的反向互补序列中位于切割位点下游的核苷酸碱基是腺苷，由此将α-巯基dATP用作该方法中的修饰dNTP。通过链置换DNA聚合酶或逆转录酶插入硫代磷酸酯修饰，以阻断对该反向互补链的切割。
设计了总长度为24个碱基的第一寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包括：在合成期间添加的5'生物素修饰，其中所述生物素修饰允许第一寡核苷酸探针连接到比色染料碳纳米颗粒上；8碱基稳定化区域；不是切口酶的限制酶的5碱基识别序列，其中第一寡核苷酸探针中该限制酶的切割位点由合成期间添加的硫代磷酸酯核苷酸间键保护；能够与扩增产物中的至少一个分子杂交的11碱基区域；以及阻止通过链置换DNA聚合酶延伸的3'磷酸修饰。
设计了总长度为31个碱基的第二寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包含：能够与扩增产物中的该至少一个分子中位于第一单链检测序列下游的第二单链检测序列杂交的14碱基区域；包含5个胸腺嘧啶核苷碱基的间隔区；三碱基DNA序列基序的4个重复，其反向互补序列固定在侧流条上。设计了总长度为47个碱基的侧流打印的固定化寡核苷酸，其包含：包含11个胸腺嘧啶核苷碱基的中性间隔区；与第二寡核苷酸探针的3碱基序列基序互补的3碱基序列基序的12个重复。设计了长度为20个碱基的侧流对照寡核苷酸，其在5'至3'方向上包含：与第二寡核苷酸探针上不同的5个三联体重复；包含5个胸腺嘧啶核苷碱基的中性间隔区；及在合成过程中添加的3'生物素分子。通过对照寡核苷酸与侧流条上的其反向互补序列结合，来验证碳侧流程序是否成功。
制备包含以下的反应：1.8pmol第一引物；9.6pmol第二引物；3.6pmol第一探针；1pmol第二探针；300μM来自Enzo Life Sciences的Sp-dATP-α-S；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；28U限制酶；14U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶；35U病毒逆转录酶；3.5U RNaseH；及3μg吸附到生物素结合蛋白上的碳。临床环境中从患者采集的5μl鼻咽拭子样品(源自DiscoveryLife Sciences)，包括7份病毒阳性样品和6份病毒阴性临床样品(通过PCR测定法验证)。在70μl体积的适当反应缓冲液中进行反应。反应在45℃下孵育4分30秒，然后将整个反应物上样到核酸侧流条上，其上打印有约50pmol的第二寡核苷酸探针的3碱基三联体重复部分的反向互补序列(底部)和对照寡核苷酸的反向互补序列(顶行)。
图11显示了在进行该实施例时获得的侧流条的照片。箭头指示打印第二寡核苷酸探针的三联体重复部分的反向互补序列(+)并因此出现阳性信号的位置，以及用于验证侧流操作成功并因此在阳性和阴性测定中均出现的对照寡核苷酸(CTL)的反向互补序列的位置。上图(+ve)显示用病毒阳性临床样品获得的结果，下图(-ve)显示用病毒阴性样品获得的结果。在每个阳性样品中都存在指示靶核酸存在的清晰黑线，表明通过本发明的方法可以快速检测临床样品。未观察到假阳性，表明完全没有(例如通过从头合成或引物结合导致的)非特异性检测物分子产生。未观察到假阴性，证明了该方法的稳健性及其在不同临床样品的不同靶核酸拷贝数水平上的灵敏度。
实施例8
不同温度下本发明所用方法的性能
本发明所用方法可以在广泛的温度范围内有效地进行，并且不需要温度循环，也不需要任何热启动或温启动、预热或受控降温。此实施例展示了典型测定试验在一系列不同温度下的性能。通过选择具有所希望的最适温度的酶，并使用硫代磷酸酯碱基在其掺入后降低杂交的熔解温度，已经容易地开发了测定试验，其中扩增可以在令人惊讶的宽温度范围(包括通常低的温度范围)进行。单独实验进一步证明，使用本发明所用方法开发的测定试验在步骤a)开始之前无需预热样品，并且在步骤a)的扩增进行期间升高温度时未观察到性能损失。
实施例8.1：设计了测定试验，其中第一寡核苷酸探针在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。第一引物设计为在5'至3'方向上包含：7碱基中性区域；限制酶识别位点；以及能够与靶核酸(DNA靶标)中的第一杂交序列杂交的11碱基区域。第二引物设计为5'至3'方向上包含：7碱基中性区域；与第一引物相同的限制酶的识别位点；以及能够与靶核酸中的第二杂交序列的反向互补序列杂交的12碱基区域。
设计了总长度为21个碱基的第一寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包含：5'生物素修饰；6碱基中性区域；在第2位置含有错配的限制酶识别位点碱基；在第6位置包含G-钳修饰的能够与靶标中的第一杂交区域杂交的10碱基区域；以及3'磷酸修饰，其中生物素修饰允许第一寡核苷酸探针连接到比色染料碳纳米颗粒上，并且磷酸修饰阻断了其通过链置换DNA聚合酶延伸。
第二寡核苷酸探针设计为在5'至3'方向上包含：能够与靶标中的第二杂交序列的反向互补序列杂交的11碱基区域；4个胸腺嘧啶核苷碱基的间隔区；以及包含3碱基序列基序的4个重复的12个碱基，所述3碱基序列基序作为允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分。设计了另一单链寡核苷酸，其在5'至3'方向上包含：11个胸腺嘧啶核苷碱基的间隔区；包含3碱基序列基序的反向互补序列的11个重复的33碱基区域，其中所述3碱基序列基序形成允许第二寡核苷酸连接到固体材料的部分。对于第二寡核苷酸探针，用30pmol的该另一单链寡核苷酸点斑点，制备核酸侧流条。
在适当缓冲液中制备包含以下的反应：1.5pmol第一引物；1.0pmol第二引物；1pmol第一寡核苷酸探针；60μM来自Enzo Life Sciences的Sp dATP-α-S；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；以及多个水平的靶DNA(++＝1amol，+＝10zmol，NTC＝无靶标对照)。组装的反应在目标温度(I＝37℃；II＝45℃、III＝50℃、IV＝55℃)下孵育2分钟，然后通过最终添加5U限制酶和5U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶来启动，最终反应体积为25μl。然后在相关目标温度下孵育反应5分钟(T1)或8分钟(T2)。孵育后，将每个反应物转移到75μl缓冲液中，该缓冲液含有1.5pmol第二寡核苷酸探针和8μg吸附到生物素结合蛋白上的碳，然后施加到核酸侧流条的样品垫上。
图12A显示了在每个靶标水平、温度和时间点在实验中获得的侧流条的照片。观察到的清晰黑线对应于在存在靶标的情况下产生的碳连接的检测物分子的沉积。在所有温度下，在靶标存在时，在8分钟内，在两个靶标水平都出现了非常强信号，证明了该方法可以在宽温度范围有效扩增。在NTC样品中未观察到非特异性扩增。在45℃和50℃下仅5分钟后也观察到强扩增，表明该测定的最适温度可能在40℃和50℃之间。
实施例8.2：设计了第二测定试验，其中第一寡核苷酸探针在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被第一或第二限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。第一和第二引物都设计为在5'到3'方向上包含：6碱基中性区域；限制酶识别位点；以及针对靶核酸的12碱基杂交区域。这样设计引物，使得靶标中的第一和第二杂交序列相隔10个碱基。
设计了总长度为23个碱基的第一寡核苷酸探针，其在5'至3'方向上包含：5'生物素修饰；6碱基中性区域；在第4位含有错配的限制酶识别位点碱基；能够与靶标中的第一杂交区域杂交的12碱基区域；以及3'磷酸修饰，其中生物素修饰允许第一寡核苷酸探针连接到比色染料碳纳米颗粒上，并且磷酸修饰阻断其通过链置换DNA聚合酶延伸。
第二寡核苷酸探针设计为在5’至3’方向上包含：能够与靶标中的第二杂交序列的反向互补序列的3个碱基以及第一和第二杂交序列之间的10碱基间隔区杂交的13碱基区域；3个胸腺嘧啶核苷碱基的间隔区；以及包含3碱基序列基序的4个重复的12个碱基，所述3碱基序列基序作为允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分。设计了另一单链寡核苷酸，其在5'至3'方向上包含：11个胸腺嘧啶核苷碱基的间隔区；以及包含3碱基序列基序的反向互补序列的12个重复的36碱基区域，所述3碱基序列基序形成允许第二寡核苷酸连接到固体材料的部分。对于第二寡核苷酸探针，用30pmol的该另一单链寡核苷酸点斑点，制备核酸侧流条。
在适当缓冲液中制备包含以下的反应：6pmol第一寡核苷酸引物；8pmol第二寡核苷酸引物；6pmol第一寡核苷酸探针；60μM Sp-dATP-α-S(来自Enzo Life Sciences)；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；60μg吸附到生物素结合蛋白上的碳；以及(如适用)靶标。组装的反应物在起始温度(I＝15℃；II＝45℃)下孵育2分钟，然后通过最终添加20U限制酶、20U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶和40U逆转录酶至最终反应体积100μl来启动反应。添加酶后，立即将15℃起始温度的反应物连同其他反应转移到45℃。
然后将反应在45℃下孵育6分钟。孵育后，将每个反应物转移到核酸侧流条的样品垫上，该样品垫含有3pmol的第二寡核苷酸探针。图12B显示了在每个温度孵育条件下在实验中获得的侧流条的照片。观察到的清晰黑线对应于在存在靶标的情况下产生的碳连接的检测物分子的沉积。在扩增步骤a)期间温度从15℃升高到45℃的反应中未观察到任何差异。与在预热反应中一样，扩增速率同样显著，在NTC样品中没有观察到非特异性扩增。
此实施例8证明，与已知方法相比，本发明所用方法可用于容易地开发具有较低最适温度特征的测定试验，并且可用于在异常宽的温度范围内进行灵敏的检测。还证明，本发明所用方法可以在不预热的情况下进行，其中在步骤a)进行期间升高温度。此类特征对于在低成本诊断装置中使用该方法具有高度吸引力，在此装置中高温和精确控制的加热会造成复杂的物理约束性，从而将这种装置的商品成本增加到在商业上使用一次性或无仪器装置不可行的程度。此外，通过避免在启动扩增之前对样品进行预热的已知方法的要求，本发明所用方法可以有更少的用户步骤和更简单的操作顺序，由此提高了这种诊断装置的可用性并减少产生结果的总时间。
实施例9
本发明所用方法与已知方法在甲型流感病毒检测上的性能比较
本实施例描述，在甲型流感病毒靶标检测中，比较性评价本发明所用方法与WO2014/164479中公开的已知方法。已知方法与本发明所用方法的根本不同在于，它需要切口酶但不需要使用一种或多种修饰dNTP。本发明所用方法被证明具有非常优越的灵敏度和特异性。
对于此比较性评价，首先使用本发明所用方法针对甲型流感病毒靶病原体开发了测定试验。该测定试验利用如下方法实施方案设计，其中第一寡核苷酸探针在3'端封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触。寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的设计遵循与其他实施例中描述的方法相似的方法进行，病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列之间有6个碱基的间隔。
实施例9.1：在第一种情况下，每种方法的反应均使用相同的引物比率进行。对于本发明的方法，在适当缓冲液中制备包含以下的反应：2pmol第一寡核苷酸引物；2pmol第二寡核苷酸引物；1.6pmol第一寡核苷酸探针；60μM来自Enzo Life Sciences的Sp-dATP-α-S；各60μM的dTTP、dCTP和dGTP；以及作为靶标的多个水平(+++＝10zmol；++＝100拷贝；+＝10拷贝；NTC＝无靶标对照)的病毒基因组RNA提取物。组装的反应物在环境条件(c.20℃)下预孵育5分钟，然后通过在25μl的最终反应体积中添加5U限制酶、5U芽孢杆菌链置换DNA聚合酶和10U逆转录酶来启动反应。添加酶后，将反应在45℃下孵育8分钟(T1)或15分钟(T2)。孵育后，将75μl缓冲液中的60μg吸附到生物素结合蛋白上的碳添加到每个反应中，并将整个100μl体积转移到含有1.5pmol第二寡核苷酸探针的核酸侧流条的样品垫上。
对于已知方法，在适当缓冲液中制备包含以下的反应：6.25pmol第一寡核苷酸引物；6.25pmol第二寡核苷酸引物；各200μM的dATP、dTTP、dCTP和dGTP；以及作为靶标的多个水平(+++＝10zmol；++＝100拷贝；+＝10拷贝；NTC＝无靶标对照)的甲型流感病毒基因组RNA提取物。组装的反应物在环境条件(c.20℃)下预孵育5分钟，然后通过在25μl的最终反应体积中添加4U Nt.BbvCI、20U Bst大片段DNA聚合酶和10U M-MuLV逆转录酶来启动反应。添加酶后，将反应在45℃孵育8分钟(T1)和15分钟(T2)。孵育后，将含有60μg吸附到生物素结合蛋白上的碳和5pmol第一寡核苷酸探针的75μl缓冲液添加到每个反应中，并将整个100μl体积转移到含有5pmol第二寡核苷酸探针的核酸侧流条的样品垫上。
图13A显示了，在所示的多个靶标水平和时间点，在使用本发明的方法(I)和已知的方法(II)的实验中获得的侧流条的照片。观察到的黑线对应于在存在靶标的情况下产生的碳连接的检测物分子的沉积。在使用已知方法可观察到任何信号之前，需要进行多次尝试，并且有必要使用酶和缓冲液的特定组合以及显著更高水平的引物、dNTP和酶。对于本发明所用的方法(I)，即使在没有预热的情况下仅8分钟后的最短时间点，也可清楚地看到甚至在仅10个靶标拷贝的最低靶标水平下产生了检测物分子。即使在努力优化已知方法(这对技术人员而言并非显而易见)之后，在最高靶标水平(+++＝10zmol)和最长时间点(15分钟)也仅观察到微弱信号。
实施例9.2：在进行了广泛的进一步非显而易见的尝试之后，如本实施例9.2所述，已知方法的性能可以被提高，但仅在使用2:1比例的第一和第二寡核苷酸引物以及非常高浓度的第一引物时才被提高。如实施例9.1所述，再次实施本发明所用方法。对于已知方法，除了第一寡核苷酸引物的水平增加到12.5pmol之外，反应如实施例9.1所述进行。在每种情况下，使用以下靶标水平：+++＝1zmol；++＝100拷贝；+＝10拷贝；NTC＝无靶标对照。
图13B显示了，在所示的多个靶标水平和时间点，在使用本发明的方法(I)和已知的方法(II)的实验中获得的侧流条的照片。观察到的黑线对应于在存在靶标的情况下产生的碳连接的检测物分子的沉积。再次，本发明的方法(I)展示了显著的速率以及即使在最短的时间点和仅10个靶标拷贝的最低靶标水平下也可见的信号。对于已知方法，在最高靶标水平(+++＝1zmol)仅观察到微弱信号，在最长时间点(15分钟)在100拷贝样品中可见非常微弱的信号。然而，在NTC侧流条中也观察到微弱的信号，这可能相应于由该方法运行所需要的非常高的寡核苷酸引物水平和酶水平所导致的非特异性产物。这些数据与WO2014/164479中报道的孵育时间为30分钟的数据一致。为了加速使用这种已知方法进行的扩增，需要添加异常高的引物水平，这将极大地限制其应用于检测同一样品中的两种或更多种不同靶病原体的潜力，因为在不加剧非特异性产物问题的情况下，总引物水平可以进一步提高的范围非常有限。
此实施例9展示了本发明所用方法相对于WO2014/164479中公开的已知方法的显著优越性，其中扩增进行得快得多，具有更高的灵敏度，并且产生更清晰的结果信号。在没有预孵育的情况下仅8分钟内，本发明所用方法就以仅100拷贝的靶标产生了比已知方法在最高靶标水平(60倍靶标水平)下15分钟所能产生的信号更强的信号。本发明所用方法相对于该已知方法的优势源自其对不同种类的酶的需要，该酶是非切口酶的限制酶，并且源自其对一种或多种修饰dNTP如硫代磷酸酯碱基的使用要求，该修饰dNTP可以增强扩增的灵敏度和特异性。此外，封闭寡核苷酸探针的使用也促使了扩增与信号检测的有效偶联，有利于在检测物分子形成期间从有效的基于序列的杂交得到增强的特异性。这些优势使得本发明的方法理想地适合用于诊断领域，以及开发简单、超快速、以用户为中心、低成本的诊断装置，例如一次性或无仪器的分子诊断检测装置。
实施例10
靶病原体甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的检测与区分
本实施例描述了用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)的本发明试剂盒及其在检测每种病原体中的用途。在此实施例中，用于RSV的引物对和探针对靶向在RSVA和RSVB的基因组中保守的序列。该试剂盒还包含单链对照核酸和用于该对照核酸的组分a)引物对、b)限制酶和c)探针对，以进行过程控制。在该试剂盒中，用于每种病原体和对照的限制酶是相同的，并且用于每种病原体和对照的探针对的第一个寡核苷酸探针在3'端被封闭而不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶切割。此外，用于每种病原体的该封闭寡核苷酸探针与用于该病原体的引物对混合提供。
用于每种病原体的引物对按照与其他实施例中描述的方法类似的方法设计，并且在病原体来源的RNA中的第一和第二杂交序列之间有4-8个碱基的间隔区。每个引物在5'到3'方向包括：中性区(6-8个碱基)；5碱基的限制酶识别序列；和杂交区(11-14个碱基)。在每种情况下，探针对的第一个寡核苷酸探针被设计为在5'到3'方向上包括：5'生物素修饰；中性区(6-8个碱基)；限制酶识别位点碱基，含有第4位错配或含有硫代磷酸酯修饰以阻断限制酶的切割；能够与在相关病原体存在下产生的扩增产物中的第一单链检测序列杂交的区域(11-14个碱基)；和3'磷酸修饰，其中生物素修饰允许第一寡核苷酸探针与比色染料碳纳米颗粒连接，并且磷酸修饰阻断其通过链置换DNA聚合酶延伸。在每种情况下，探针对的第二寡核苷酸探针被设计为在5'到3'方向上包含：能够与扩增产物中第二杂交序列的反向互补序列的3个或更多个碱基以及第一和第二杂交序列之间的间隔区杂交的区域；3个胸苷碱基间隔区；和包含3或4个碱基序列基序的3或4个重复的12个碱基，其中所述序列基序用作允许第二寡核苷酸探针与固体材料连接的部分。还设计了一个额外的单链寡核苷酸，其在5'到3'方向上包括：10或11个胸苷碱基间隔区；，包含所述3或4个碱基序列基序的反向互补序列的重复序列的30至40个碱基区域，其中所述序列基序形成允许第二寡核苷酸与固体材料连接的部分。用30pmol的所述额外单链寡核苷酸点样制备侧流条。
对于对照引物对，按照与上述类似的方法设计引物以检测对照核酸，但对照核酸中的第一和第二杂交序列之间没有间隔区。按照与上述类似的方法设计探针对，但探针对的第二寡核苷酸具有11个胸苷碱基间隔区，不包含重复的3或4个碱基序列基序，并且直接印刷在侧流条上。该试剂盒还包含非切口酶的限制酶，该酶能够识别每种病原体的第一和第二引物的识别序列并切割其切割位点；逆转录酶；链置换DNA聚合酶；dNTP(dTTP、dCTP、dGTP)和一种修饰的dNTP(α巯基dATP)。
在本实施例中，试剂盒用于在测试样品中检测每种病原体的500个拷贝的病毒基因组提取物。使用浓度为1amol的对照核酸。扩增后，将两个反应组合并应用于侧流条。
反应在50μl的最终反应体积中进行，其中包含适当的缓冲液、盐和添加剂。除了测试样品、对照核酸和适量的引物(40-160fmol/μl)和第一寡核苷酸探针(40-140fmol/μl)，每个反应还包含：60μM Sp-dATP-α-S，来自Enzo life Sciences；dTTP、dCTP和dGTP各60μM；3μg缀合碳；10U限制酶；10U链置换DNA聚合酶和25U逆转录酶。添加所有必需的组分后，将反应物在从15℃升至48℃的温度温育2分钟，然后在48℃温育7分钟。温育后，将反应物加到核酸侧流条上，所述侧流条还具有沉积在样品/缀合物垫上的用于每种病原体的5pmol第二寡核苷酸探针。
图14A显示了从含有靶病原体FluA、FluB或RSV之一的样品获得的侧流条的照片。图14B显示了从类似实验中获得的侧流条的照片，在所述相似实验中样品各自包含靶病原体Flu A、Flu B和RSV中的两种。进行了不添加病原体的对照实验(Ctrl)、以及其中不添加病原体并且也省略了对照核酸的对照实验(NTC)。在试纸条上观察到的黑线对应于在相关靶病原体(一种或多种)和/或对照核酸存在下产生的碳连接的检测物分子的累积。与每种病原体相对应的线，仅在样品存在该病原体时才观察到，这证明，不仅在样品存在单一靶病原体时(这是最常见的临床情况)而且在存在多于一种靶病原体时，该试剂盒都具有特异性。该实施例10描述了本发明试剂盒的一个实施方案并举例说明了该试剂盒的用途。表明本发明的试剂盒能够在非常快速的多重测试中对低水平的FluA、FluB和RSV进行高度灵敏和特异性的检测和区分。因此，该试剂盒非常适合用于诊断领域、以及用于开发简单、超快速、以用户为中心、低成本的诊断装置，例如一次性或无仪器的分子诊断检测装置。
在整个说明书和后续权利要求书中，除非另有说明，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变型形式应理解为意味着包括所陈述的整数、步骤、整数组或步骤组，并且不排除任何其他整数、步骤、组整数或步骤组。
本发明还包括以下其他方面，本文描述的本发明所有可选和/或优选的实施方案也适用于这些其他方面：
1.用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其中，分别针对每种病原体，所述试剂盒包含以下组分(a)、(b)和(c)：
a)引物对，所述引物对包含：
i.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和
ii.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
b)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
c)探针对，所述探针对包含：
i.第一寡核苷酸探针，其能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
ii.第二寡核苷酸探针，其能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中位于第一单链检测序列的上游或下游的第二单链检测序列杂交，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶切割；且
所述试剂盒还包含：
d)逆转录酶；
e)链置换DNA聚合酶；
f)dNTP；和
g)一种或多种修饰的dNTP。
2.根据方面1的试剂盒，其中，每种病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一都在3'端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶切割。
3.根据前述方面中任一项的试剂盒，其中用于病原体的探针对的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针都在3'端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被限制酶切割。
4.根据前述方面中任一项的试剂盒，其中，至少一种病原体的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针之一具有与用于该病原体的第一或第二引物之一的杂交区域或该杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。
5.根据方面5的试剂盒，其中第一寡核苷酸探针具有与第一和第二寡核苷酸引物之一的杂交区域互补的5个或更多个碱基，并且第二寡核苷酸探针具有与第一和第二寡核苷酸引物之一的杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。
6.根据前述方面中任一项所述的试剂盒，其还包含用于实施过程控制的组分，例如：
a)引物对，所述引物对包含：
i.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域，和
ii.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
b)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
c)探针对，所述探针对包含：
i.第一寡核苷酸探针，其能够与对照核酸存在时产生的扩增产物中的至少一个分子的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许所述探针检测的部分上；和
ii.第二寡核苷酸探针，其能够与扩增产物中的该至少一个分子中的第一单链检测序列上游或下游的第二单链检测序列杂交，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接于固体材料的部分上。
7.用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其中，分别针对每种病原体，所述方法包括以下步骤：
a)使样品与以下组分接触：
i.引物对，所述引物对包含：
第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和
第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
ii.限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
iii.逆转录酶；
iv.链置换DNA聚合酶；
v.dNTP；和
vi.一种或多种修饰的dNTP，
以在病原体来源RNA存在的情况下产生扩增产物；
b)使步骤a)的扩增产物与如下组分接触：
i.探针对，所述探针对包含：
第一寡核苷酸探针，其能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
第二寡核苷酸探针，其能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触；
其中该第一和第二探针与所述扩增产物中的该至少一个分子的杂交产生病毒体检测物分子；和
c)检测在步骤b)中产生的病原体检测物分子的存在，其中病原体检测物分子的存在指示该样品中存在靶病原体。
8.根据方面7的方法，还包括实施过程控制，例如：
a)使对照核酸与以下组分接触：
i.引物对，所述引物对包含：
第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域，和
第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
ii.限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
iii.链置换DNA聚合酶；
iv.dNTP；和
v.一种或多种修饰的dNTP，
以在对照核酸存在的情况下产生对照扩增产物；
b)使步骤a)的对照扩增产物与如下组分接触：
i.探针对，所述探针对包含：
第一寡核苷酸探针，其能够与对照扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
第二寡核苷酸探针，其能够与所述对照扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中该第一和第二探针与所述对照扩增产物中的该至少一个分子的杂交产生对照检测物分子；和
c)检测在步骤b)中产生的对照检测物分子的存在，其中对照检测物分子的存在作为方法的过程控制。

Claims (40)

1.用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的试剂盒，其中，分别针对每种病原体，所述试剂盒包含以下组分：
h)引物对，所述引物对包含：
iii.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和
iv.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
i)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
j)探针对，所述探针对包含：
iii.具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
iv.具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中位于第一单链检测序列的上游或下游的第二单链检测序列杂交，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割；且
所述试剂盒还包含：
k)逆转录酶；
l)链置换DNA聚合酶；
m)dNTP；和
n)一种或多种修饰的dNTP。
2.权利要求1的试剂盒，其中甲型流感和/或乙型流感病毒来源RNA中的第一和第二杂交序列位于或源自所述流感病毒基因组的区段1、2、3、5、7或8之一中。
3.权利要求1或2的试剂盒，用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒，所述试剂盒还包含用于病原体呼吸道合胞病毒的组分a)、b)和c)。
4.权利要求3的试剂盒，其使用相同的引物对和探针对，检测呼吸道合胞病毒A和呼吸道合胞病毒B。
5.权利要求4的试剂盒，其中呼吸道合胞病毒来源RNA中的第一和第二杂交序列位于或源自呼吸道合胞病毒A和B的NS2(非结构蛋白2)、N(核蛋白)、F(融合糖蛋白)、M(基质蛋白)或L(聚合酶)基因之一中。
6.前述权利要求任一的试剂盒，其中每种病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一都在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被该限制酶在所述杂交区域中切割。
7.前述权利要求任一的试剂盒，其中由于存在一个或多个序列错配和/或一个或多个修饰如硫代磷酸酯键，使得该封闭的寡核苷酸探针不能被限制酶切割。
8.前述权利要求任一的试剂盒，其中该封闭的寡核苷酸探针包含附加区域，使得与该封闭寡核苷酸探针杂交的扩增产物内的该分子的3'端可通过链置换DNA聚合酶延伸。
9.前述权利要求任一的试剂盒，其中病原体的(一种或多种)封闭寡核苷酸探针与用于该病原体的引物对和/或限制酶混合提供。
10.前述权利要求任一的试剂盒，其中用于病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针都在其杂交区域的3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割。
11.前述权利要求任一的试剂盒，其中至少一种病原体的第一和第二寡核苷酸探针之一的杂交区域具有与该病原体的第一或第二引物之一的杂交区域或该杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。
12.权利要求11的试剂盒，其中第一寡核苷酸探针的杂交区域具有与第一和第二寡核苷酸引物之一的杂交区域互补的5个或更多个碱基，且第二寡核苷酸探针的杂交区域具有与第一和第二寡核苷酸引物之另一的杂交区域的反向互补序列互补的5个或更多个碱基。
13.前述权利要求任一的试剂盒，其中一种或多种修饰的dNTP是α-巯基修饰的dNTP。
14.前述权利要求任一的试剂盒，其中用于每种病原体的限制酶是相同的。
15.前述权利要求任一的试剂盒，其中允许第一寡核苷酸探针检测的部分是比色或荧光染料、或能够连接到比色或荧光染料的部分，例如生物素。
16.前述权利要求任一的试剂盒，其中允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分是单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸对于每种病原体是不同的。
17.权利要求16的试剂盒，其中单链寡核苷酸部分的序列包含2至4个碱基DNA序列基序的三个或更多个重复拷贝。
18.前述权利要求任一的试剂盒，其中第一和/或第二寡核苷酸引物包含位于限制酶识别序列和切割位点上游的稳定化序列，所述稳定化序列的长度为例如5或6个碱基。
19.前述权利要求任一的试剂盒，其中寡核苷酸引物的杂交区域长度为9-16个碱基。
20.前述权利要求任一的试剂盒，其中病原体来源RNA中的第一和第二杂交序列相隔0至15个碱基或3至20个碱基，例如3至15个碱基。
21.前述权利要求任一的试剂盒，其中扩增产物中的该至少一个分子中的第一或第二单链检测序列包括与权利要求20中所定义碱基相应的序列中的至少3个碱基。
22.前述权利要求任一的试剂盒，还包括用于实施过程控制的组分，例如：
b)引物对，所述引物对包含：
iii.第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域，和
iv.第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
d)限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
e)探针对，所述探针对包含：
iii.第一寡核苷酸探针，其能够与对照核酸存在时产生的扩增产物中的至少一个分子的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许所述探针检测的部分上；和
iv.第二寡核苷酸探针，其能够与扩增产物中的该至少一个分子中的第一单链检测序列上游或下游的第二单链检测序列杂交，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接于固体材料的部分上。
23.权利要求22的试剂盒，还包括对照核酸。
24.前述权利要求任一的试剂盒，还包括用于检测病原体来源RNA存在时产生的病原体检测物分子是否存在和/或对照核酸存在时产生的对照检测物分子是否存在的工具。
25.权利要求24的试剂盒，其中所述用于检测病原体检测物分子和/或对照检测物分子是否存在的工具是核酸侧流。
26.权利要求25的试剂盒，其中核酸侧流利用固定化核酸，所述固定化核酸能够序列特异性地与允许第二寡核苷酸探针连接到固体材料的部分杂交。
27.权利要求24-26任一的试剂盒，其中用于检测病原体检测物分子和/或对照检测物分子是否存在的工具，使用例如碳或金，优选碳，产生比色或电化学信号。
28.包含权利要求1-27任一的试剂盒的装置。
29.权利要求28的试剂盒，其是电力装置。
30.权利要求28或29的装置，其包含加热工具。
31.权利要求28-30任一的装置，其是一次性诊断装置。
32.用于检测和区分样品中的靶病原体甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法，其中，分别针对每种病原体，所述方法包括以下步骤：
d)使样品与以下组分接触：
vii.引物对，所述引物对包含：
第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中的第一杂交序列杂交的区域，和
第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与病原体来源RNA中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
viii.限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
ix.逆转录酶；
x.链置换DNA聚合酶；
xi.dNTP；和
xii.一种或多种修饰的dNTP，
以在病原体来源RNA存在的情况下产生扩增产物；
e)使步骤a)的扩增产物与如下组分接触：
ii.探针对，所述探针对包含：
具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与病原体来源RNA存在时产生的扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中，至少一种靶病原体的探针对的第一和第二寡核苷酸探针之一在3’端被封闭以不能通过DNA聚合酶延伸，且不能被限制酶在所述杂交区域中切割，并且在步骤a)进行的同时与样品接触；
其中该第一和第二探针与所述扩增产物中的该至少一个分子的杂交产生病毒体检测物分子；和
f)检测在步骤b)中产生的病原体检测物分子的存在，其中病原体检测物分子的存在指示该样品中存在靶病原体。
33.权利要求32的方法，用于检测和区分靶病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒，所述方法还包括针对病原体呼吸道合胞病毒的步骤a)、b)和c)。
34.根据权利要求32或33的方法，还包括实施过程控制，例如：
d)使对照核酸与以下组分接触：
iii.引物对，所述引物对包含：
第一寡核苷酸引物，其中该第一寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中的第一杂交序列杂交的区域，和
第二寡核苷酸引物，其中该第二寡核苷酸引物在5'至3'方向上包含限制酶识别序列和切割位点以及能够与对照核酸中位于第一杂交序列上游的第二杂交序列的反向互补序列杂交的区域；其中所述第一和第二杂交序列相隔不超过20个碱基；
iv.限制酶，所述限制酶不是切口酶，其能够识别第一和第二引物中的所述识别序列并切割所述切割位点；
vi.链置换DNA聚合酶；
vii.dNTP；和
viii.一种或多种修饰的dNTP，
以在对照核酸存在的情况下产生对照扩增产物；
e)使步骤a)的对照扩增产物与如下组分接触：
ii.探针对，所述探针对包含：
具有杂交区域的第一寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与对照扩增产物中的至少一个分子中的第一单链检测序列杂交，并且所述探针连接在允许实现所述探针检测的部分上；和
具有杂交区域的第二寡核苷酸探针，其中所述杂交区域能够与所述对照扩增产物中的该至少一个分子中的第二单链检测序列杂交，其中所述第二单链检测序列位于第一单链检测序列的上游或下游，并且所述探针连接在固体材料上或允许其连接到固体材料的部分上；
其中该第一和第二探针与所述对照扩增产物中的该至少一个分子的杂交产生对照检测物分子；和
f)检测在步骤b)中产生的对照检测物分子的存在，其中对照检测物分子的存在作为方法的过程控制。
35.权利要求32-34任一的方法，其针对所有的靶病原体和，如果对照核酸存在的话，对照核酸同时进行。
36.权利要求32-35任一的方法，其中，当所述识别序列和切割位点为双链时，限制酶仅切割其切割位点的引物链，反向互补链的切割由于引入所述反向互补链中的一种或多种修饰而被阻断，其中所述一种或多种修饰在所述反向互补链中的引入是通过使用一种或多种修饰的dNTP由DNA聚合物引入的。
37.权利要求32-36任一的方法，其中步骤(a)在不超过50℃的温度进行。
38.权利要求32-37任一项的方法，其中在进行步骤a)的过程中提高温度，如从例如15-30℃范围内的环境起始温度提高至40-50℃范围内的温度。
39.权利要求32-38任一项的方法，其中样品是鼻或鼻咽拭子或抽吸物。
40.权利要求32-39任一的方法，其中病原体来源RNA、和/或寡核苷酸引物和/或限制酶和/或DNA聚合酶和/或dNTP和/或一种或多种修饰的dNTP和/或寡核苷酸探针和/或用于检测病原体检测物分子和/或对照检测物分子的工具如权利要求2或4-27任一项中所定义。
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