KR20220131925A - 바이러스 검출 - Google Patents

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KR20220131925A
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헨리 존 램블
데이비드 로이드
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센스 바이오디텍션 리미티드
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Abstract

본 발명은 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 및 선택적으로 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 식별하기 위한 키트 및 방법, 및 상기 키트를 포함하고 상기 방법에서 사용하기 위한 장치에 관한 것이다. 본 발명은 표적 병원체의 존재 하에 검출 종을 생성하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉되는 증폭 산물을 생성하기 위해 제한 효소, 중합효소 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한다.

Description

바이러스 검출
본 발명은 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 및 선택적으로 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)를 검출 및 식별(discriminating)하기 위한 키트(kit) 및 방법, 및 상기 키트를 포함하고, 상기 방법에 사용하기 위한 장치(device)에 관한 것이다.
인플루엔자는 호흡기의 전염성 바이러스 감염이다. 인플루엔자 A는 인간에게 가장 흔한 유형의 인플루엔자 바이러스이며 계절성 독감 유행과 때때로 에피데믹(epidemic)의 원인이 된다. 인플루엔자 B 바이러스는 에피데믹의 덜 빈번한 원인이다. 두 가지 균주(하위그룹 A 및 B)으로 구성된 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)가 또한 주로 유아와 노인에서 발병하는 에피데믹의 원인이다. 우세한 RSV 시기는 인플루엔자 시기와 겹친다. 인플루엔자 및 RSV에 감염된 환자를 확인하기 위한 분자 진단 방법의 사용은 효과적인 제어, 적절한 치료 선택 및 에피데믹 및 펜데믹(pandemic) 예방에 유리하다.
중합효소를 기반으로 한 핵산 서열 증폭 방법은 분자 진단 분야에서 널리 사용된다. 가장 확립된 방법인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 일반적으로 각 표적 서열에 대해 2개의 프라이머를 포함하고 온도 순환을 사용하여 프라이머 어닐링, DNA 중합효소에 의한 연장 및 순환 지수 증폭 과정에서 새로 합성된 DNA의 변성을 달성한다. 온도 순환에 대한 요건은 복합적인 기기가 필요하며, 이는 특정 적용 분야에서 PCR 기반 방법의 사용을 제한한다.
가닥 대체 증폭 (Strand Displacement Amplification; SDA) (EP0497272; US5455166; US5712124)은 중합효소 증폭 동안 이중 가닥 DNA의 어닐링 및 변성을 달성하기 위해 온도 순환이 필요하지 않고 대신 2개의 DNA 가닥을 분리하기 위해 가닥-대체 중합효소와 조합된 제한 효소를 사용하는 PCR의 등온 대안으로 개발되었다.
SDA에서, 각 프라이머의 5' 말단에 있는 제한 효소 부위는 하나 이상의 알파 티올 뉴클레오타이드의 존재하에 증폭 산물(amplification product)에 도입되고, 제한 효소는 인식 부위의 헤미포스포로티오에이트 형태의 변형되지 않은 가닥만을 절단하는 능력으로 인해 제한 부위에 닉을 형성하는데 사용된다. 가닥 대체 중합효소는 각 닉의 3' 말단을 연장하고 하류 DNA 가닥을 대체한다. 지수적 증폭은 센스 반응으로부터 대체된 가닥이 안티센스 반응의 표적 역할을 하고 이의 반대의 경우도 마찬가지인 센스 및 안티센스 반응을 결합한 결과이다. SDA는 일반적으로 수행하는데 1시간 이상이 걸리므로 임상 진단 분야에서 이의 가능성이 크게 제한된다. 또한 증폭 후 산물의 특이적 검출 및 반응 개시를 위한 별도의 과정에 대한 요건은 상기 방법에 상당한 복합성을 추가한다.
Maples 등 (WO2009/012246)은 이후에 특이적 이중 가닥 인식 서열에 결합한 후 2 가닥의 DNA 중 하나만을 절단할 수 있는 제한 효소의 하위 부류인 닉형성 효소(nicking enzyme)를 사용하여 SDA를 수행하였다. 그들은 상기 방법을 닉형성 및 연장 증폭 반응 (NEAR)이라고 지칭하였다. 제한 효소 대신 닉형성 효소를 사용하는 NEAR는 소프트웨어 최적화 프라이머 (WO2014/164479)를 사용하고 가온 시작 또는 제어된 온도 감소 (WO2018/002649)를 통해 상기 방법을 개선하려고 시도한 다른 이들에 의해서도 적용되었다. 그러나 매우 적은 수의 닉형성 효소만이 이용 가능하므로 특정 적용 분야에 적절한 특성을 가진 효소를 찾는 것은 더 어렵다.
제한 효소 또는 닉형성 효소 (NEAR)를 사용하는 SDA의 결정적인 단점은 이중 가닥 핵산 산물을 생성하므로 증폭 신호의 효율적인 검출을 위한 고유 과정을 제공하지 않는다는 것이다. 이는 예를 들어 저가의 진단 장치에서 이의 유용성을 크게 제한하였다. 생성된 증폭된 산물의 이중 가닥 특성은 2 가닥을 먼저 분리하지 않고는 혼성화 기반 검출을 수행할 수 없기 때문에 증폭 방법을 신호 검출에 결합하는데 문제가 있다. 따라서 분자 비콘 (molecular beacon) 및 형광단/소광제 프로브와 같은 보다 복합적인 검출 방법이 필요하며, 이는 별도의 과정 단계가 필요하여 분석 프로토콜을 복합적이 되게 하고 다중 분석을 개발할 가능성을 크게 감소시킬 수 있다.
SDA의 한계를 극복하고 인플루엔자 및 RSV의 효율적인 검출을 가능하게 하기 위해 신속하고 감응성 특이적 핵산 서열 검출을 위한 향상된 증폭 방법을 이용하는 분자 진단 분석에 대한 중대한 요구가 있다. 본 발명은 핵산 증폭을 포함하고 5' 제한 부위가 있는 프라이머의 쌍에 추가하여 효율적인 신호 검출을 가능하게 하는 검출 종(species)을 생성하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 쌍을 이용하는 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 및 선택적으로 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 식별하기 위한 키트 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자(target pathogens influenza) A 및 인플루엔자 B를 검출 및 식별하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 각각의 병원체에 대해
a) 하기를 포함하는 프라이머 쌍(primer pair)으로서:
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열(first hybridisation sequence)에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
ii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열의 상류(upstream)의 제2 혼성화 서열의 역보체(reverse complement)에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
b) 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소; 및
c) 하기를 포함하는 프로브 쌍(probe pair)으로서:
i. 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티(moiety)에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
ii. 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍을 포함하고;
표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없고;
상기 키트는 또한
d) 역전사효소;
e) 가닥 대체 DNA 중합효소;
f) dNTP; 및
g) 하나 이상의 변형된 dNTP
를 포함한다.
본 발명의 키트는 표적 병원체 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 식별하기 위한 것일 수 있으며, 이 경우 이는 병원체 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 성분 a), b) 및 c)를 추가로 포함할 것이다. 상기 키트는 또한 반응 완충액, 염, 예를 들어, 2가 금속 이온, 첨가제 및 부형제와 같은 시약을 포함할 수 있다.
상기 키트는 표적 병원체의 존재 하에 생성된 검출 종의 존재를 검출하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 핵산 측방 유동(lateral flow) 스트립, 전기화학적 프로브, 및/또는 비색 또는 형광 염료 및/또는 전기 신호, 및/또는 탄소 또는 금의 변화를 검출하기 위한 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 사용 방법의 수행에 대한 지침과 함께 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 표적 병원체의 검출 및 식별을 위한 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스를 검출 및 식별하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 각각의 병원체에 대해
a) 샘플을
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
ii. 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소;
iii. 역전사효소;
iv. 가닥 대체 DNA 중합효소;
v. dNTP; 및
vi. 하나 이상의 변형된 dNTP
와 접촉시켜, 병원체 유래 RNA의 존재 하에 증폭 산물을 생성하는 단계;
b) 단계 a)의 증폭 산물을
i. 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍과 접촉시키는 단계로서;
표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되고;
증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종과 제1 및 제2 프로브의 혼성화는 병원체 검출 종을 생성하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생성되는 병원체 검출 종의 존재를 검출하는 단계로서, 병원체 검출 종의 존재는 샘플에서 표적 병원체의 존재를 나타내는 단계
를 포함한다.
본 발명의 방법은 표적 병원체 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 식별하기 위한 것일 수 있으며, 이 경우 이는 병원체 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 단계 a), b) 및 c)를 추가로 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 키트 및 방법은 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 호흡기 세포융합 바이러스 B를 모두 검출한다. 상기 키트 및 방법은 또한 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 호흡기 세포융합 바이러스 B에 대해 동일한 프로브 쌍을 이용할 수 있다.
상기 키트는 공정 대조군(process control)을 수행하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있고 또한 대조군 핵산을 포함할 수 있다. 상기 방법은 공정 대조군을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 실시양태는 단일 표적 병원체와 관련하여 도 1에 예시되어 있다.
다양한 실시양태에서, 표적 병원체의 존재 하에, 상기 키트 및 방법은 감응성 검출에 이상적으로 적합한 병원체 검출 종의 많은 카피를 신속하게 생성한다.
본 발명은 증폭된 산물 및 이에 따른 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 선택적으로 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 효율적인 검출을 위한 고유 과정을 제공하는 것 외에도 신속한 증폭을 포함하기 때문에 공지된 키트 및 방법보다 유리하다.
본 발명은 닉형성 효소(NEAR)가 있는 SDA를 포함하는 SDA를 이용하는 키트 및 방법의 주요 단점을 극복하는데, 이는 SDA가 증폭 산물의 이중 가닥 특성으로 인해 증폭 신호의 효율적인 검출을 위한 고유 과정를 제공하지 못한다는 점이다. 본 발명은 증폭 산물의 적어도 하나의 종에 혼성화하여 이의 신속한 특이적 검출을 용이하게 하는 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써 이러한 한계를 극복한다. 첫 번째는 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되고 두 번째는 고체 물질에 부착되거나 고체 물질에 부착되도록 하는 모이어티에 부착된 이러한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용은 많은 추가 이점을 제공한다. 예를 들어, DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 차단되고, 제한 효소에 의해 절단될 수 없는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용은 놀랍게도 증폭의 현저한 해로운 억제를 초래하지 않고, 단일 가닥 영역을 포함하는 병원체 사전-검출 종이 효율적으로 생성된다. 본 발명의 이러한 양상은 차단된 프로브가 사전-검출 종에 포함된 것과 반대되는 증폭 산물 가닥으로 편향된 비대칭 증폭을 유도할 것이라고 가정할 수 있기 때문에 반직관적이다. 사실, 상기 사전-검출 종은 노출된 단일 가닥 영역이 다른 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화에 쉽게 이용가능하기 때문에 효율적으로 생성되고 효율적인 검출에 이상적으로 적합하다. 바람직하게는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없다.
본 발명의 고유 샘플 검출 접근법은 예를 들어 하나의 앰플리콘 가닥을 다른 하나에 비해 과량으로 생성하기 위해, 동일하지 않은 프라이머 비율을 사용한 "비대칭" 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 SDA의 중요한 한계를 극복하려는 이전 시도와 근본적으로 다르다. 본 발명은 비대칭 증폭이 필요하지 않고 하나의 앰플리콘 가닥을 다른 하나에 비해 과량으로 생성할 필요가 없으며 대신 증폭 산물 내의 종의 동일한 가닥에의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 후 검출 종의 생성에 초점을 맞추고 있다. 검출 종의 생성을 포함하는 본 발명의 고유 샘플 검출 접근법은 예를 들어, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 측방 유동 스트립에 프린팅함으로써 검출을 수행하는 간단하고 저가의 고속 수단을 제공하는 것으로, 다른 검출 방법 중에서 핵산 측방 유동과의 결합에 이상적으로 적합하다. 핵산 측방 유동에 결합될 때, 본 발명은 또한 각각 샘플 내의 다른 표적 병원체를 위해 설계된 다른 서열에 의해 측방 유동 스트립의 개별 위치에 부착된 다수의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 차별적 혼성화에 기반한 효율적인 다중화를 가능하게 한다. 추가 실시양태에서, 측방 유동 검출의 효율은 고체 물질에 대한 이의 부착을 가능하게 하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 내의 모이어티로서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하고, 상기 모이어티에 대한 역보체 서열은 스트립 상에 프린팅함으로써 향상된다. 후자의 접근법에 의해 또한 측방 유동 스트립에 부착된 서열을 규정할 수 있고 병원체 유래 RNA의 서열에 해당할 필요가 없기 때문에 측방 유동 스트립을 최적화하고 다중 표적 적용 분야에서 단일 "범용" 검출 시스템으로 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍에 대한 필수 요건은 닉형성 효소 (NEAR)에 의한 SDA를 포함하여, SDA에 비해 많은 이점을 제공한다.
본 발명은 닉형성 효소가 아닌 제한 효소(들) 및 하나 이상의 변형된 dNTP의 사용이 필요하기 때문에, 닉형성 효소 (NEAR)를 사용하여 수행되는 SDA와 근본적으로 다르며 이러한 닉형성 효소 의존적 방법에 비해 많은 추가 이점이 있다. 예를 들어, 닉형성 효소보다 훨씬 더 많은 수의 닉형성 효소가 아닌 제한 효소가 이용 가능하며, 이는 본 발명에 사용하기 위한 제한 효소(들)가 예를 들어 반응 온도, 완충액 상용성, 안정성 및 반응 속도 (감응성)와 같이 소정의 적용을 위해 월등한 특성을 가진 것을 확인하기 위해 다수의 가능한 효소로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 이러한 주요 이점으로 인해, 본 발명자들은 닉형성 효소로 달성할 수 있는 것보다 더 낮은 최적 온도와 더 고속의 속도에 의한 제한 효소를 선택할 수 있었다. 이러한 제한 효소는 저가의 진단 장치로 개발하는데 훨씬 더 적합한다. 또한, 하나 이상의 변형된 dNTP를 사용하기 위한 요건은 제한 효소가 제한 부위의 한 가닥만을 절단하도록 제공되는 것 외에도 중요한 이점을 제공하는 본 발명의 필수 특성이다. 예를 들어, 알파 티올 dNTP와 같은 특정 변형된 dNTP는 이들이 포함되는 DNA의 용융 온도 (Tm)를 감소시켜 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브가 증폭 동안 생성된 변형된 dNTP를 포함하는 임의의 경쟁적인 보체 가닥보다 증폭 산물 내의 종에 대한 혼성화에 대해 더 큰 친화도를 가짐을 의미한다. 또한, 변형된 dNTP 염기 삽입으로 인한 증폭 산물의 Tm 감소는 이중 가닥 DNA 종의 분리를 용이하게 하여 증폭 속도를 향상시키고 최적의 온도를 감소시키며 감응성을 향상시킨다.
제한 효소 또는 닉형성 효소 (NEAR)를 사용하는 SDA에 비해 본 발명의 수많은 이점은 함께, 공지된 방법으로는 불가능한 증폭 신호의 증폭의 간단한 시각화 및 개선된 증폭 속도로 인해 저가의 단일 사용 진단 장치에서 본 발명의 유용성을 제공한다.
본 발명의 상기 언급된 양상 및 추가 양상의 다양한 실시양태가 하기에 더 상세히 설명된다.
도 1. 본 발명에 사용되는 상기 방법의 개략도.
도 2. 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)에서 샘플과 접촉되는 상기 방법의 개략도.
도 3. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 고체 물질로의 부착을 가능하게 하는 모이어티는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드인 상기 방법의 단계 b) 및 c)의 개략도.
도 4. 샘플이 단계 a)에서 제3 및 제4 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 추가로 접촉되는 상기 방법의 단계 a)의 일부의 개략도.
도 5. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 고체 물질, 니트로셀룰로스 측방 유동 스트립에 부착되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 1 참조).
도 6a 및 도 6b. 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)에서 샘플과 접촉되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 2 참조).
도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d. 2개 이상의 상이한 표적 핵산의 존재는 동일한 샘플에서 검출되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 3 참조).
도 8. 표적 핵산 내의 제1 및 제2 혼성화 서열은 5개의 염기에 의해 분리되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 4 참조).
도 9. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티는 항원이고, 해당 항체는 고체 표면 니트로셀룰로스 측방 유동 스트립에 부착되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 5 참조).
도 10a 및 도 10b. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티는 3개의 염기 DNA 서열 모티프(motif)의 4개의 반복 카피(repeat copy)를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열의 역보체는 고체 물질에 부착되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 6 참조).
도 11. 임상 표본 중 RNA 바이러스의 검출을 위한 본 발명에 사용되는 방법의 사용 (실시예 7 참조).
도 12a 및 도 12b. 상이한 온도에서의 본 발명에 사용되는 방법의 수행 (실시예 8 참조).
도 13a 및 도 13b. 인플루엔자 A의 검출을 위해 본 발명에 사용된 방법 대 공지된 방법의 비교 수행(실시예 9 참조).
도 14a 및 도 14b. 본 발명을 사용한 표적 병원체 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기 세포융합 바이러스의 검출 및 식별(실시예 10 참조).
본 발명은 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 및 선택적으로 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 식별하기 위한 키트 및 방법을 제공한다.
병원체 유래 RNA는 바이러스 게놈 RNA를 포함하는 단일 가닥 RNA, 전사에 의한 단일 가닥 RNA로부터 유래된 단일 가닥 RNA, 자발적인 해리 또는 효소 분해 또는 열 변성과 같은 두 가닥의 해리 후 샘플에서 이중 가닥 RNA로부터 유래된 단일 가닥 RNA, 또는 예를 들어, 전사에 의한 이중 가닥 DNA에서 유래한 단일 가닥 RNA일 수 있다.
존재하는 경우, 대조군 핵산은 RNA, DNA, RNA 및 DNA 염기 둘 모두를 포함하는 키메라, 또는 RNA/DNA 혼성체일 수 있다. 일 실시양태에서, 대조군 핵산은 공정 대조군이 역전사효소의 활성을 포함하도록 RNA를 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 병원체 유래 RNA와 함께 RNA와 DNA의 양 가닥을 포함하는 혼성체 이중체를 형성하는 DNA 프라이머이다. 그러나, 비 천연 염기 및/또는 대안적 백본 구조와 같은 다른 핵산을 포함하는 프라이머가 또한 사용될 수 있다.
병원체 유래 RNA의 존재하에 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 병원체 유래 RNA의 제1 혼성화 서열에 혼성화한다. 혼성화 후, 제1 프라이머의 3' 하이드록실기는 역전사효소 (예를 들어, M-MuLV)에 의해 연장되어 연장된 제1 프라이머 및 병원체 유래 RNA를 포함하는 이중 가닥 종을 생성한다 (도 1 참조, 병원체 유래 RNA는 "표적"으로 지칭됨). 역전사효소는 상기 연장에서 dNTP 및 하나 이상의 변형된 dNTP를 사용한다. 동일한 과정은 이것이 DNA이고, 상기 연장에서 dNTP 및 하나 이상의 변형된 dNTP를 사용하는 DNA 중합효소에 의해 제1 프라이머가 연장되는 것을 제외하고 대조군 핵산의 존재 하에 이루어진다. 제한 효소 인식 서열과 제1 프라이머의 5' 말단의 절단 부위는 일반적으로 그에 대한 역보체 서열이 표적 병원체 유래 RNA 또는 대조군 핵산 서열에 존재하지 않기 때문에 일반적으로 혼성화하지 않는다. 따라서, 제1 프라이머는 일반적으로 제한 효소 인식 서열의 하나의 가닥 및 절단 부위를 후속 증폭 산물 종에 도입하는데 사용된다. 제1 프라이머의 연장 후 "표적 제거"가 이루어진다. 표적 제거는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 제2 혼성화 서열의 역보체의 혼성화를 위해 연장된 제1 프라이머 종에 접근할 수 있게 한다. 병원체 유래 RNA의 경우, "표적" 제거는 예를 들어 RNA의 RNase H 분해에 의해 달성될 수 있으며, 존재하는 경우 역전사효소의 RNase H 활성을 통해 또는 이 효소의 별도 첨가를 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, 대조군 핵산에서와 같이 이중 가닥 DNA 내의 단일 가닥 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA의 경우, 이는 추가 상류 프라이머 또는 범프 프라이머를 사용하여 가닥 대체에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 특히 소정의 병원체 유래 RNA로부터 짧은 연장 산물만이 생성되는 경우 "표적" 제거는 자발적인 해리 후에 이루어질 수 있거나, 이중 가닥 내에서 하나 이상의 DNA 또는 RNA 염기 쌍의 일시적인 개방이 충분히 이루어져 가닥 대체에 의한 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3' 하이드록실의 혼성화 및 연장을 가능하게 하는 가닥 침투를 통해 이루어질 수 있다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 제2 혼성화 서열의 역보체의 혼성화 후, 가닥 대체 DNA 중합효소는 상기 프라이머의 3' 하이드록실을 dNTP 및 하나 이상의 변형된 dNTP를 사용하여 연장한다. 제한 효소의 이중 가닥 제한 인식 서열 및 절단 부위는 역보체 가닥에 혼입된 하나 이상의 변형된 dNTP 염기(들)에 의해 형성되어, 상기 제한 효소의 상기 가닥의 절단을 차단하는 작용을 한다. 제한 효소는 그의 인식 서열을 인식하고, 단지 절단 부위의 제1 프라이머 가닥만을 절단하여, dNTP 및 하나 이상의 변형된 dNTP를 사용하여 가닥 대체 DNA 중합효소에 의해 연장된 3' 하이드록실을 생성하고, 제1 프라이머 가닥을 대체한다. 제한 효소의 이중 가닥 제한 인식 서열 및 절단 부위는 역보체 가닥에 혼입된 하나 이상의 변형된 dNTP 염기(들)에 의해 형성되고, 상기 제한 효소의 상기 가닥의 절단을 차단하는 작용을 한다. 2개의 프라이머 서열이 나란이 위치하고, 제한 효소의 일부 차단된 제한 부위가 존재하는 이중 가닥 종이 따라서 생성된다. 제1 프라이머 가닥 및 제2 프라이머 가닥의 제한 효소의 절단이 이의 후에 이루어지고, 하나는 제1 프라이머 서열을 포함하고, 다른 하나는 제2 프라이머 서열을 포함하는 2개의 이중 가닥 종이 생성된다. 제1 프라이머 가닥 및 제2 프라이머 가닥의 후속 절단 및 대체가 이후의 임상 증폭 과정에서 이루어지고, 대체된 제1 프라이머 가닥은 제2 프라이머의 표적으로 작용하고, 대체된 제2 프라이머 가닥은 제1 프라이머의 표적으로 작용한다.
병원체 유래 RNA의 존재 하에, 예를 들어, 온도 순환에 대한 임의의 요건 없이 증폭 산물이 생성된다.
본 발명의 필수적인 양상은 증폭 산물을 직접 검출하는 것이 아니라, 검출 종은 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 둘 모두와 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 특이적 혼성화 후 생성되는 것이다. 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착된 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 상기 적어도 하나의 종에서 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화한다. 고체 물질 또는 고체 물질에 대한 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 상기 적어도 하나의 종에서 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화한다. 따라서, 검출 종은 상기 적어도 하나의 종 내의 동일한 가닥에 혼성화되는 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함한다.
도 1을 참조하면, 임의의 표적 병원체의 경우, 증폭 산물은 제1 프라이머 및 제2 프라이머 둘 모두의 전체 또는 일부 서열 또는 역보체 서열로 이루어진 단일 가닥 검출 서열을 포함하는 종과 같은 다수의 상이한 종을 포함하고, 병원체 유래 RNA에서 제1 및 제2 혼성화 서열에 결합하는 프라이머가 하나 이상의 염기에 의해 분리되는 경우 서열은 병원체 유래 RNA 유래 서열에 의해 분리될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 검출 종을 형성하기 위해 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 혼성화하도록 임의의 상기 종이 선택될 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.
검출 종이 검출되는 경우, 검출 종의 존재는 샘플에서 표적 병원체의 존재를 나타낸다.
하나의 프로브는 검출을 위한 것이고, 다른 하나의 프로브는 고체 물질에의 부착을 위한 것인 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍을 이용함으로써, 본 발명은 보다 복합적인 제2 검출 방법에 대한 요건을 극복하고, 예컨대 핵산 측방 유동에 의해 표적 병원체의 존재 하에 생성되는 신호의 효율적인 시각화를 제공하는 고속의 효율적인 신호 검출을 제공한다.
본 발명에서, 표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없다. 제한 효소에 의해 절단될 수 없다는 용어는 올리고뉴클레오타이드 프로브가 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 경우, 이는 가닥 대체 중합효소에 의한 대체 후 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역의 차단된 3' 말단을 제거하기 때문에 증폭 산물의 적어도 하나의 종에 대한 혼성화 영역의 혼성화 후에 제한 효소가 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브를 절단할 수 없음을 의미한다. 하나 초과의 제한 효소가 상기 키트 또는 방법에 사용되는 경우 차단된 프로브가 상기 키트 또는 방법에 사용된 제한 효소에 의해 절단될 수 없는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 포스포로티오에이트 연결과 같은 하나 이상의 서열 미스매치(mismatch) 및/또는 하나 이상의 변형의 존재로 인해 제한 효소에 의해 절단될 수 없게 된다. 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위는 증폭 산물에서 적어도 하나의 종에 대한 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역의 혼성화 후에 선택적으로 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브로부터 생략되거나, 기능적이지 않게 될 수 있다. 본 발명의 키트의 추가 실시양태에서 표적 병원체에 대한 차단된 프로브는 해당 병원체에 대한 프라이머 쌍 및/또는 제한 효소와 혼합하여 제공될 수 있다. 추가 실시양태에서 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 상기 방법의 단계 a)의 수행과 동시에, 즉 단계 a)의 수행 동안 샘플과 접촉되어, 병원체 유래 RNA 존재하에 생성된 증폭 산물의 생성 동안 존재한다.
유사하게, 차단된 프로브가 대조군 핵산에 사용될 수 있다.
예를 들어, 도 2에 도시된 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 차단되고, 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화되어, 단일 가닥 영역을 포함하는 사전-검출 종을 형성한다. 상기 적어도 하나의 종은 그의 3' 하이드록실기를 연장하는 가닥 대체 DNA 중합효소에 의해 연장되어, 따라서 상기 사전-검출 종을 추가로 안정화시킬 수 있다. 따라서, 상기 실시양태에서 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 혼성화하는 증폭 산물 내의 상기 종의 3' 말단이 가닥 대체 DNA 중합효소에 의해 연장될 수 있도록 하는 추가 영역(사전-검출 종 안정화 영역)을 포함한다. "안정화된 사전-검출 종"은 따라서 도 2에 예시된 바와 같이 생성된다. 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브에서 이러한 추가 사전-검출 종 안정화 영역이 증폭 산물 내의 제1 또는 제2 단일 가닥 검출 서열의 적어도 하나의 종에 혼성화하는 영역의 상류에 존재할 것이다. 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역의 서열 및 적절한 농도의 프라이머는 각 주기에서 증폭 산물에 생성되는 특정 비율의 관련 종이 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브에 혼성화되고 이러한 종의 나머지 카피는 주기적 증폭 과정에 관여할 수 있는 상태로 유지되도록 최적화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 예를 들어 3' 포스페이트 변형의 사용에 의해 연장으로부터 차단되고, 예시된 실시양태에서 또한 5' 비오틴 변형과 같은 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착된다. 대안적으로 단일 3' 변형은 연장을 차단하고 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티로서 사용될 수 있다. C-3 스페이서와 같은 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단을 차단하기 위해 다양한 다른 변형이 이용 가능하고; 대안적으로 미스매칭 염기(들) 및/또는 변형된 염기(들)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종에 대해 변형된 염기이거나 미스매칭된 혼성화 영역의 하류의 하나 이상의 염기를 포함함에 따라, DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 혼성화 영역의 3' 말단에서 차단될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 이의 3' 말단에서 차단되지 않은 하이드록실을 포함할 수 있고, 또한 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 혼성화 영역의 3' 말단에서 여전히 차단된다. 상기 사전-검출 종은 노출된 단일 가닥 영역이 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대한 혼성화에 용이하게 이용 가능하기 때문에 효율적인 검출에 이상적으로 적합하다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 핵산 측방 유동 스트립의 니트로셀룰로스 표면에 부착될 수 있어서, 사전-검출 종이 상기 위로 유입되는 경우 서열 특이적 혼성화가 쉽게 일어나고 검출 종이 스트립 상의 소정의 위치에 위치하게 된다. 증폭 반응 중에 또는 핵산 측방 유동 스트립의 접합체 패드에 존재할 수 있 스트렙타비딘이 부착된 탄소, 금 또는 폴리스티렌 입자와 같은 검출 모이어티에 부착되는 염료는 표적 병원체의 존재 하에 생성된 검출 종의 존재의 고속 색상 기반 시각화를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 이는 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 혼성화 영역의 3' 말단에서 차단되고 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브이다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 샘플과 접촉되기 전에 전기화학적 프로브의 표면, 96-웰 플레이트, 비드 또는 어레이 표면과 같은 고체 물질에 부착되거나 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착될 수 있다. 증폭 동안 생성된 특정 비율의 적어도 하나의 종은 관련 프라이머에 혼성화하여 순환 증폭 과정에 추가로 관여하는 대신, 생성 후 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 혼성화된다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 혼성화한 후, 상기 적어도 하나의 종은 중합 효소에 의해 올리고뉴클레오타이드 프로브 상으로 연장되어 안정화된 사전-검출 종을 생성한다. 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 검출 모이어티는 또한 상기 방법의 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉될 수 있고 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부위에서 상기 표면에 위치화될 것이다. 증폭 과정 동안 상기 부위에서 검출 모이어티의 축적을 검출함으로써 샘플에 존재하는 표적 병원체의 카피 수의 정량화를 제공하는 실시간 신호가 획득될 것이다. 따라서, 본 발명의 방법의 실시양태에 따르면, 단계 a), b) 및 c) 중 2개 이상이 동시에 수행된다.
차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여, 본 발명자들은 증폭 속도의 임의의 유의한 억제를 관찰하지 못했는데, 이는 사전-검출 종이 최적의 순환 증폭 과정을 방해하지 않고 실시간으로 축적됨을 나타낸다. 이는 하나의 앰플리콘 가닥을 다른 가닥보다 과량으로 생성하기 위해 동일하지 않은 프라이머 비율을 이용하여 비대칭 SDA를 조작하려는 시도와 상이하다. 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 반응으로부터 하나의 앰플리콘 가닥을 제거하여 다른 가닥의 비율을 증가시키는 대신, 본 발명은 차단된 프로브를 이용하는 검출 종의 생성 및 검출에 초점을 맞추어 증폭 과정 동안 단일 가닥 영역의 노출을 용이하게 한다. 따라서 본 발명자들은 상기 실시양태에서 증폭 과정에 대한 어떠한 억제 효과도 관찰하지 못했을뿐만 아니라, 본 발명자들은 특정 실시양태에서 증가된 양의 검출 종에 상응하는 신호가 생성되는 놀라운 향상을 관찰하였으며, 실시예 2를 참조한다 (도 6).
추가로, 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용은 차단된 프로브없이 다단계 과정에서 핵산 측방 유동에 의해 NEAR를 혼입하려는 보고된 시도에 비해 근본적인 이점을 나타낸다. 예를 들어, WO2014/164479에서는 핵산 측방 유동을 사용하여 증폭 산물을 시각화하기 위해 48℃에서 30분의 긴 인큐베이션이 필요했으며, 이는 현장 진단 진단 장치, 특히 저가 또는 단일 사용 장치에서 상기 방법을 사용하는데 주요 장애로 나타난다. 이와 완전히 달리, 본 발명은 5분 미만 및 더 낮은 온도, 예를 들어 40 내지 45℃의 인큐베이션에서 균등한 증폭을 쉽게 수행한다. 추가 직접 비교 연구 (실시예 9 참조)에서, 본 발명에 사용되는 방법은 닉형성 효소가 아닌 제한 효소의 사용, 변형된 dNTP 염기의 사용 및 상기 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용의 조합으로 인한 공지된 방법 (WO2014/164479)에 비해 놀랍도록 매우 우수한 비율을 보여준다.
일 실시양태에서, 각각의 병원체에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 선택적으로 대조군 핵산이 존재할 때 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없다.
또한, 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 다른 하나(즉, 올리고뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 모두)는 상기 기재된 바와 같이, 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단될 수 있으며, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없음이 이해될 것이다. 따라서 추가 실시양태에서, 병원체에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 둘 모두는 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 차단되고 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없다. 이 추가 실시양태에서, 본 발명의 키트에서 표적 병원체에 대한 차단된 프로브가 해당 병원체에 대한 프라이머 쌍 및/또는 제한 효소와 혼합되어 제공될 때 차단된 프로브 둘 모두가 혼합물로 제공될 필요는 없으며, 본 발명의 방법에서 단계 a)의 수행과 동시에 차단된 두 프로브가 샘플과 접촉될 필요는 없다.
본 발명의 필수적인 양상은 닉형성 효소가 아니지만, 상기 인식 서열 및 절단 부위가 이중 가닥인 경우 그의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위의 단지 하나의 가닥만을 절단할 수 있고, 역보체의 가닥의 절단은 중합 효소에 의한 그의 혼입 후 뉴클레아제 내성을 부여하는 하나 이상의 변형된 dNTP, 예를 들어 dNTP를 사용하여 가닥 대체 DNA 중합효소에 의해 상기 역보체 가닥에 혼입된 하나 이상의 변형의 존재로 인해 차단되는 제한 효소의 사용이다.
"제한 효소" [또는 "제한 엔도뉴클레아제"]는 특이적 인식 서열에 결합한 후 특이적 절단 부위에서 이중 가닥 핵산 분자의 하나 또는 두 가닥에서 하나 이상의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 광범위한 효소 종류이다. 다양한 물리화학적 특성 및 인식 서열 특이성을 포함하는 보고된 3,000개 이상 및 시중에서 구입 가능한 600개 이상의 많은 제한 효소를 사용할 수 있다.
"닉형성 효소" [또는 "닉형성 엔도뉴클레아제"]는 특이적 인식 서열에 결합한 후 특이적 절단 부위에서 이중 가닥 핵산 분자의 한 가닥만을 절단하여 다른 하나의 가닥은 절단하지 않을 수 있는 제한 효소의 특정 하위종류이다. 천연 발생 효소와 조작된 효소 둘 모두를 포함하여 매우 적은 수 (c.10)의 닉형성 효소만이 사용 가능하다. 닉형성 효소는 하부 가닥 절단 Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI 및 Nb.BtsI 및 상부 가닥 절단 Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI 및 Nt.CviPII를 포함한다.
본 발명에서 배타적으로 사용되는 닉형성 효소가 아닌 제한 효소는 또한 이중 가닥 핵산의 두 가닥을 모두 절단할 수 있음에도 불구하고 특정 상황에서 그의 인식 서열에 결합한 후 그의 이중 가닥 DNA 절단 부위 중 단지 하나의 가닥만을 절단하거나 닉을 형성할 수 있다. 이는 다수의 방법으로 수행할 수 있다. 특히 본 발명과 관련하여, 이는 뉴클레아제 내성 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 (PTO), 보라노포스페이트, 메틸포스페이트 또는 펩타이드 뉴클레오타이드간 연결을 사용하여 하나의 가닥 상의 절단 부위의 포스포디에스테르 결합이 보호되도록 이중 가닥 핵산 표적 부위의 한 가닥을 변형시켜 절단 부위에서 이중 가닥 핵산 내의 가닥 중 하나가 절단될 수 없게 되는 경우 달성될 수 있다. 특정 변형된 뉴클레오타이드간 연결, 예를 들어, PTO 연결은 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 프라이머 내에서 화학적으로 합성되거나 하나 이상의 알파 티올 변형(alpha thiol modified) 데옥시뉴클레오타이드의 사용에 의한 것과 같이 중합효소에 의해 이중 가닥 핵산으로 혼입될 수 있다. 따라서, 실시양태에서 하나 이상의 변형된 dNTP는 알파 티올 변형된 dNTP이다. 통상적으로 S 이성질체를 사용하며, 이는 혼입되어 더 효과적으로 뉴클레아제 내성을 부여한다.
닉형성 효소가 아닌 매우 많은 수의 이용 가능한 제한 효소에 의해, 소정의 적용 분야에 본 발명을 사용하기 위해, 적절한 수행 특성, 예를 들어 온도 특성, 속도, 완충액 상용성, 중합효소 교차 상용성, 인식 서열, 열안정성, 제조 가능성 등에 대해 스크리닝하기 위해 상이한 특성을 갖는 광범위한 효소가 이용 가능하다. 이와 달리, 단지 적은 수의 닉형성 효소만이 이용 가능하다는 사실은 닉형성 효소를 사용하는 공지된 키트 및 방법의 가능성을 제한하고, 예를 들어 더 낮은 반응 속도 (감응성, 결과까지의 시간) 및 더 높은 반응 온도로 이어질 수 있다. 본 발명에 사용하기 위해 선택되는 닉형성 효소가 아닌 제한 효소는 천연 발생 또는 조작된 효소일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 닉형성 효소가 아닌 제한 효소를 선택함에 있어서 당업자는 다른 가닥이 아닌 관련 가닥의 절단을 차단하기 위해 변형이 정확한 위치에 포함되도록 하기 위해 적절한 절단 부위를 갖는 효소를 확인하는 것이 필요함을 인식할 것이다. 예를 들어, 알파 티올 dNTP와 같은 변형된 dNTP가 사용되는 실시양태에서, 병원체 유래 RNA가 혼입 후 관련 가닥의 절단을 차단하기 위해 적절한 위치에 변형된 뉴클레오타이드 염기 위치를 포함하도록 프라이머를 배치하는데 충분한 유연성을 제공하기 위해 비-회문 인식 서열을 갖는 비대칭 제한 효소와 같은 인식 서열을 벗어난 절단 부위를 갖는 제한 효소를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 알파 티올 dATP가 사용되는 경우 프라이머가 적절하게 절단되도록 하기 위해 관련 올리고뉴클레오타이드 프라이머에서 제한 효소 절단 부위의 역보체 서열은 상기 역보체 가닥에서 절단 위치의 하류에 아데노신 염기를 포함하지만 프라이머 서열에서 절단 부위의 하류에 아데노신 염기를 포함하지 않는다. 따라서, 인식 서열 외부에서 절단되는 비-회문 인식 서열을 갖는 비대칭 제한 효소는 본 발명에 사용하기에 이상적으로 적합하다. 인식 부위 내에서 절단되는 제한 효소를 인식하는 부분적 또는 축퇴성 회문 서열이 또한 사용될 수 있다. 뉴클레아제 내성 뉴클레오타이드 연결 변형, 예를 들어 PTO는 본 발명의 방법에서 그의 사용을 가능하게 하기 위해 부분적 또는 축퇴성 회문 및 비대칭 제한 인식 서열을 모두 갖는 IIS형 및 IIG형 제한 효소를 포함하는 다양한 상이한 부류의 광범위한 시중에서 입수 가능한 이중 가닥 절단제에 의해 어느 한 가닥의 절단을 차단하는데 사용될 수 있다.
제한 효소(들)는 일반적으로 0.1 내지 100 단위의 양으로 본 발명에 사용되며, 1 단위는 50 μl의 총 반응 부피에서 소정의 온도 (예를 들어, 37℃)에서 1 μg T7 DNA를 1시간 내에 분해하는데 필요한 제제의 양으로 규정된다. 그러나 상기 양은 선택한 효소의 활성, 효소의 농도 및 형태, 예상되는 병원체 유래 RNA 농도, 반응 부피, 프라이머 농도 및 반응 온도와 같은 여러 인자에 따라 달라지며, 어떤 식으로든 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 당업자는 본 발명에 사용되는 제한 효소가 적합한 완충액 및 염, 예를 들어, 2가 금속 이온, 효과적이고 효율적인 기능, pH 제어 및 효소 안정화가 필요하다는 것을 이해할 것이다.
실시양태에서 하나 초과의, 예를 들어 각각의 병원체 및 선택적으로 존재하는 경우 대조군 핵산에 대한 제한 효소는 동일한 제한 효소이다. 단일 제한 효소만을 사용함으로써 본 발명은 다수의 방법으로 단순화된다. 예를 들어, 다른 반응 성분과 상용성인 단일 효소만을 확인하고, 본 발명의 수행을 위해 최적화하고, 제조 및 안정화시키면 된다. 또한 단일 제한 효소를 이용하면 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 설계를 단순화하고 증폭 과정의 대칭을 지원한다.
본 발명에서 제한 효소는 핵산 이중체의 한 가닥만을 절단하므로 절단 후에 중합효소에 대한 효율적인 프라이밍 부위로 작용할 수 있는 노출된 3' 하이드록실기를 제공한다. 중합효소는 프라이머를 연장하고 염기쌍 상호작용을 사용하여 DNA 또는 RNA 주형 가닥의 역보체 "카피"를 생성하여 핵산의 사슬 또는 중합체를 합성하는 효소이다. 가닥 대체 능력이 있는 중합효소는 가닥을 적절하게 대체하여 증폭 과정에 영향을 미치도록 하기 위해 본 발명에 사용된다. 용어 "가닥 대체"는 합성 중에 대면하는 하류 DNA를 대체하는 중합효소의 능력을 지칭한다. 다양한 온도에서 작동하는 가닥 대체 능력을 가진 다양한 중합효소가 특성화되었으며 시판 중이다. 예를 들어, Phi29 중합효소는 가닥 대체 능력이 매우 강한다. Bst DNA 중합효소 대형 단편과 같은 바실루스 종의 중합효소는 일반적으로 높은 가닥 대체 활성을 나타내며 본 발명에 사용하기에 적합한다. E. 콜라이 (E. coli) Klenow 단편 (엑소-)은 널리 사용되는 또 다른 가닥 대체 중합효소이다. 예를 들어, 내인성 효소의 관련 활성 중합효소 도메인만을 클로닝하고 임의의 엑소뉴클레아제 활성을 녹아웃 (knock-out)시킴으로써 KlenTaq과 같은 가닥 대체 중합효소를 쉽게 조작할 수 있다. 본 발명에서, RNA 의존성 DNA 합성 (역전사효소) 활성이 또한 필요하며, 이 활성은 가닥 대체 DNA 중합효소 및/또는 단계 a)에서 별도의 추가 역전사효소, 예를 들어 M-MuLV 또는 AMV에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법에서 역전사효소 및 가닥 대체 DNA 중합효소는 동일한 효소일 수 있다.
중합효소(들)는 일반적으로 효소, 시약의 농도 및 적절한 반응 온도에 따라 최적화되는 적절한 양으로 본 발명에서 사용된다. 예를 들어, 0.1 내지 100 단위의 바실루스 중합효소가 사용될 수 있으며, 1 단위는 65℃에서 30분 내에 산 불용성 물질에 25 nmol의 dNTP를 혼입시키는 효소의 양으로 규정된다. 그러나 상기 양은 중합효소의 활성, 농도 및 형태, 예상되는 병원체 유래 RNA 농도, 반응 부피, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 수와 농도 및 반응 온도와 같은 여러 인자에 따라 달라지며, 어떤 식으로든 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
당업자는 중합효소가 중합효소 활성을 갖기 위해 dNTP 단량체가 필요하고 또한 완충 염, 2가 이온 및 안정화제와 같은 성분과 함께 적절한 완충액이 필요하다는 것을 알 것이다. 또한, 가닥 대체 중합효소에 의한 혼입 후 프라이머의 역보체 가닥의 절단을 차단하기 위해 하나 이상의 변형된 dNTP가 본 발명에 사용된다. 일반적으로 단일 변형된 dNTP를 사용하는 경우 본 발명에 사용되는 dNTP는 해당 염기가 누락되어야 한다. 예를 들어, 변형된 dNTP가 알파 티올 dATP인 실시양태에서, dNTP는 dTTP, dCTP 및 dGTP만을 포함하고 dATP를 포함하지 않아야 한다. 해당 천연 dNTP 염기를 제거하면 프라이머의 역보체 서열 내에서 필요한 모든 하부 가닥 절단 부위가 차단되며, 이는 변형된 염기만이 중합효소에 의한 혼입에 이용 가능하지만 해당 천연 dNTP의 전체 또는 일부 제거가 반드시 이루어지지는 않기 때문이다. dNTP는 10 마이크로몰 내지 1 밀리몰 범위의 농도와 같이 다른 중합효소 방법에 사용된 것과 유사한 농도로 본 발명에 일반적으로 사용될 수 있지만, 활성을 최대화하고 초기 합성을 최소화하여 백그라운드 신호 생성을 방지하기 위해 본 발명에 사용하기 위한 dNTP의 농도는 임의의 소정의 효소 및 시약에 대해 최적화될 수 있다. 특정 중합효소가 하나 이상의 변형된 dNTP 염기와 더 낮은 혼입 속도를 나타낼 수 있다는 점을 감안할 때, 하나 이상의 변형된 염기는 변형되지 않은 dNTP보다 더 높은 상대 농도, 예를 들어 5배 더 높은 농도에서 본 발명에 사용될 수 있지만, 이는 비 제한적인 것으로 고려되어야 한다.
하나 이상의 변형된 dNTP의 사용은 제한 효소가 제한 부위의 한 가닥만을 절단하도록 제공되는 것 외에도 중요한 이점을 제공하는 본 발명의 필수 특성이다. 예를 들어, 알파 티올 dNTP와 같은 특정 변형된 dNTP는 이들이 혼입되는 DNA의 용융 온도 (Tm)를 감소시키며, 이는 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브가 증폭 동안 생성된 임의의 경쟁적인 변형된 dNTP 보체 가닥보다 증폭 산물 내의 종에의 혼성화에 대해 더 큰 친화도를 가짐을 의미한다. 예를 들어, 이러한 주요 특성은, 대체된 가닥 중 하나가 역보체에 혼성화하여 "비생성적인" 종점 종을 생성할 때, 이는 하나 이상의 변형된 염기의 존재로 인해 추가 프라이머에 대한 상기 대체된 가닥의 "생성적인" 혼성화보다 더 쉽게 해리되어 혼성화의 Tm이 감소되기 때문에, 증폭 속도를 향상시킨다. 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결은 이중체의 단일 가닥의 정확히 절반이 혼성화되는 온도인 Tm을 첨가당 1 내지 3℃ 감소시켜 물리화학적 특성에 상당한 변화를 줄 수 있다고 보고되었다. 본 발명자들은 또한 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 연결이 DNA 서열에 존재할 때 향상된 가닥 대체 속도를 관찰하였다. 또한, 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 예를 들어, 상기 방법의 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉하거나 후속하여 접촉하는지에 상관없이, 임의의 경쟁적인 변형된 종보다 증폭 산물 내 해당 종에 대해 더 높은 친화도를 보유하고 따라서 우선적으로 혼성화하거나 심지어 혼성화된 가닥을 대체하여 검출 종의 생성을 용이하게 할 수 있다. 이들이 포함하는 변형된 뉴클레오타이드간 연결의 결과로서 증폭 산물 종의 대체의 향상 및 Tm의 감소는 상기 방법의 속도를 근본적으로 향상시키고 고속 증폭이 이루어지는데 필요한 온도를 감소시키는 역할을 한다.
하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드의 사용으로 인한 속도 향상에 더하여, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브의 혼성화 특이성이 또한 향상된다. 일반적으로 하나의 특정 뉴클레오타이드의 모든 염기가 증폭 산물 내에서 치환된다는 점을 감안할 때, 프라이머 및 프로브의 혼성화 부위는 일반적으로 변형된 염기를 포함하고 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결로 인한 감소된 Tm은 예를 들어, 비특이적인 혼성화에 의한 서열 미스매칭이 거의 허용될 수 없음을 의미한다.
따라서, 하나 이상의 변형된 dNTP를 이용하는 본 발명의 필수적인 특성은 증폭의 감응성 및 특이성을 향상시키고, 소프트웨어 최적화 프라이머에 의한 NEAR 변이체 (WO2014/164479) 또는 가온 시작 또는 제어된 온도 감소 (WO2018/002649)를 포함하여, 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 NEAR (WO2009/012246)에 대한 요구 없이 공지된 키트 및 방법과 완전히 상이하다.
중합효소에 의한 혼입 후 뉴클레아제 내성을 부여하는 변형된 dNTP와 같은 다수의 상이한 변형된 dNTP가 존재하고 제한 효소에 의한 절단에 대한 내성 및 실시양태에서 소정의 적용에 대한 본 발명의 수행을 향상시키는 다른 특성을 달성하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 뉴클레아제 내성 및 Tm 감소를 제공하는 알파 티올 dNTP 외에도, 중합효소 혼입 가능성이 있고 뉴클레아제 내성을 부여하는 것으로보고된 변형된 dNTP에는 Borano 유도체, 2'-O-메틸 (2'OMe) 변형된 염기 및 2'-플루오로 염기와 같은 균등한 뉴클레오타이드 유도체가 포함된다. 중합효소에 의해 혼입될 수 있고 본 발명의 특정 양상을 향상시키기 위해 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있는 다른 변형된 dNTP 또는 균등한 화합물은 결합 친화도를 감소시키는 것, 예를 들어, 이노신-5'-트리포스페이트 또는 2'-데옥시제불라린-5'-트리포스페이트, 결합 특이성을 증가시키는 것, 예를 들어 5-메틸-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 또는 5-[(3-인돌릴)프로피온아미드-N-알릴]-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 및 GC 다함유 영역의 합성을 향상시키는 것, 예를 들어 7-데아자-dGTP를 포함한다. 특정 변형은 Tm을 증가시킬 수 있으며, 이는 본 발명의 실시양태에서 혼성화 사건의 제어에 대한 추가 가능성을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 a), b) 및 c)는 광범위한 온도에서 수행될 수 있다. 당업자는 각 단계의 최적 온도는 관련 중합효소 및 제한 효소의 최적 온도 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 혼성화 영역의 용융 온도에 의해 결정됨을 이해할 것이다. 특히 상기 방법은 단계 a)에서 온도 순환을 위한 요구 사항 없이 수행될 수 있다. 더욱이, 증폭 단계 a)는 임의의 제어된 온도 변화, 임의의 고온 또는 가온 시작, 예열 또는 제어된 온도 감소가 필요하지 않다. 본 발명을 사용하면 넓은 온도 범위, 예를 들어 15℃ 내지 60℃, 예컨대 20 내지 60℃ 또는 15 내지 45℃에서 단계를 수행할 수 있다. 일 실시양태에 따르면, 단계 a)는 50℃ 이하 또는 약 50℃의 온도에서 수행된다. 본 발명에서 사용할 수 있는 닉형성 효소가 아닌 다양한 제한 효소를 고려할 때 닉형성 효소를 사용하는 대안적 방법에 비해 상대적으로 낮은 온도에서 속도가 빠른 제한 효소를 선택할 수 있다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 사용하면 또한 필요한 증폭 온도가 감소한다. 공지된 방법에 비해 더 낮은 최적 온도 특성에 대한 가능성을 갖는 것 외에도, 본 발명의 방법은 비정상적으로 광범위한 온도에 걸쳐 수행될 수 있고 상기 키트는 광범위한 온도에 걸쳐 사용된다. 제어된 가열은 이러한 장치의 산물 비용을 단일 사용 또는 기기 불필요 장치가 상업적으로 실현 불가능한 지점으로 증가시키는 복합적인 물리적 제약을 부과하므로, 이러한 특성은 저가의 진단 장치에서 본 발명을 사용하는데 매우 매력적이다. 예를 들어, 주변 온도 또는 약 37℃에서 표적 병원체의 고속 검출을 수행할 수 있는 본 발명을 사용하여 많은 분석이 개발되었다. 이와 같이, 추가 실시양태에서 단계 a)는 45℃ 이하 또는 약 45℃의 온도에서 수행된다. 사용자 단계를 단순화하고 결과에 이르는 전체 시간을 줄이기 위해 표적 온도보다 낮은 온도에서 방법을 개시하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 방법의 추가 실시양태에서 이와 같이, 단계 a)의 온도는 증폭 동안 증가된다. 예를 들어, 상기 방법의 온도는 20℃와 같은 주변 온도에서 시작하여 약 45℃ 또는 50℃와 같은 최종 온도까지 일정 기간, 예컨대 2분에 걸쳐 증가할 수 있다. 실시양태에서 온도는 단계 a)의 수행 동안 증가되고, 예컨대 주변 시작 온도(ambient starting temperature)로부터, 예를 들어 15 내지 30℃의 범위, 최대 40 내지 50℃의 범위의 온도까지 증가한다.
본 발명의 저온 가능성 및 다목적성은 공지된 키트 및 방법과 달리, 이는 단백질 또는 소분자와 같은 다른 바이오마커의 검출을 위한 면역 분석 또는 효소 분석과 같은 다양한 다른 분석에 필요한 조건과 상용성일 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명은 예를 들어 샘플 내 대상 소분자 또는 핵산과 단백질을 포함하는 다중 종의 동시 검출에 사용될 수 있다. 닉형성 효소가 아닌 제한 효소, 가닥 대체 DNA 중합효소, 존재하는 경우 개별 역전사효소, 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 올리고뉴클레오타이드 프로브, dNTP 및 하나 이상의 변형된 dNTP를 포함하여, 본 발명에 필요한 성분은 안정한 저장을 위해 동결건조 또는 냉동 건조될 수 있으며, 그런 다음 샘플의 첨가시와 같이 재수화에 의해 반응을 유발시킬 수 있다. 안정한 저장을 위한 이러한 동결건조 또는 냉동 건조는 일반적으로 성분을 건조하기 전에 트레할로스와 같은 하나 이상의 부형제를 첨가해야 한다. 동결건조 또는 냉동 건조를 위한 매우 광범위한 이러한 부형제 및 안정화제가 공지되어 있으며 상기 방법의 수행에 필요한 성분에 적합한 조성을 확인하기 위해 시험에 사용될 수 있다.
중합효소 기반 증폭 방법을 이용하는 본 발명의 키트 및 방법은 PCR 또는 다른 중합효소 기반증폭 방법을 향상시키는 것으로 나타난 하나 이상의 첨가제를 첨가함으로써 향상될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 첨가제에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 테트라하이드로티오펜 1-옥사이드, L-리신 유리 염기, L-아르기닌, 글리신, 히스티딘, 5-아미노발레르산, 1,5-디아미노-2-메틸펜탄, N,N'-디이소프로필에틸렌디아민 (TEMED), 테트라메틸암모늄 클로라이드, 테트라메틸암모늄 옥실레이트, 메틸 술폰 아세트아미드, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 베타인 알데하이드, 테트라에틸암모늄클로라이드, (3-카복시프로필)트리메틸암모늄클로라이드, 테트라부틸암모늄클로라이드, 테트라프로필암모늄클로라이드, 포름아미드, 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸포름아미드, N-메틸아세트아미드, N,N-디메틸아세트아미드, L-트레오닌, N,N-디메틸에틸렌디아민, 2-피롤리돈, HEP (N-하이드록시에틸피롤리돈), NMP (N-메틸피롤리돈) 및 1-메틸, 1-사이클로헥실-2-피롤리돈(피롤리디논), δ-발레로락탐, N-메틸숙신이미드, 1-포르밀피롤리딘, 4-포밀모르폴린, DMSO, 술포란, 트레할로스, 글리세롤, Tween-20, 베타인 및 BSA를 포함한다.
본 발명자들의 연구는 본 발명이 매우 낮은, 심지어 단일 카피 수까지의 검출을 포함하는 광범위한 표적 병원체 수준에 걸쳐 효과적이라는 것을 밝혀냈다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 통상적으로 병원체 유래 RNA에 대해 과량으로 제공된다. 일반적으로 각 프라이머의 농도는 비 제한적인 것으로 고려되어야 하지만 10 내지 200 nM 범위이다. 더 높은 프라이머 농도는 혼성화의 효율성을 향상시키고 따라서 반응 속도를 증가시킬 수 있다. 그러나 프라이머 이량체와 같은 비특이적 백그라운드 효과가 또한 고농도에서 관찰될 수 있으므로 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 농도는 본 발명을 사용하는 모든 소정의 분석에 대한 최적화 과정의 일부를 형성한다. 일 실시양태에서 각 프라이머 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 동일한 농도로 제공된다. 대안적인 실시양태에서, 프라이머 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나는 다른 것보다 과량으로 제공된다. 반응 속도는 주기적 증폭 과정의 자연적 대칭으로 인해 프라이머 중 하나가 다른 것보다 과량으로 제공되는 실시양태에서 감소될 수 있지만, 특정 상황에서는 이는 본 발명에서 비특이적 백그라운드 신호를 감소시키고/거나, 검출 종을 생성하기 위해 혼성화하는 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 능력을 향상시키는데 사용될 수 있다. 선택된 검출 수단으로 검출하기 위해 충분한 검출 종을 생성하기 전에 두 프라이머가 제한되지 않는 수준으로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 설계에 대한 많은 고려 사항이 있다. 각각의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 하나의 가닥의 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위 및 혼성화 영역을 포함해야 하며, 상기 혼성화 영역은 제1 프라이머의 경우 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있고, 제2 프라이머의 경우 표적 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있다. 따라서 한 쌍의 프라이머는 병원체 유래 RNA의 영역을 증폭시키도록 설계된다. 프라이머의 제한 효소 인식 서열은 일반적으로 병원체 유래 RNA 서열 내에 존재하지 않으므로 앰플리콘에 도입되기 전에 초기 혼성화 사건 동안 오버행 (overhang)을 형성한다 (도 1 참조). 비대칭 제한 효소가 사용되는 경우 절단 부위는 일반적으로 인식 서열의 하류에 있으며, 따라서 선택적으로 프라이머의 혼성화 서열 내에 존재할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머는 절단 후, 절단 부위의 5' 서열이 적절한 반응 조건 하에서 역보체 가닥에 혼성화된 상태를 유지하기에 충분한 용융 온도 (Tm)를 갖는 상류 프라이머를 형성하고, 가닥 대체 DNA 중합효소에 의해 3' 하이드록실기의 연장에 따라 절단 부위의 하류 가닥을 대체하도록 설계된다. 따라서 추가적인 "안정화" 영역이 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5' 말단에 포함될 수 있으며, 이의 최적 길이는 관련 제한 효소에 대한 인식 서열에 대한 절단 부위의 위치 및 기타 인자, 예컨대 상기 방법의 단계 a)에서 증폭에 사용될 온도에 의해 결정된다. 따라서 실시양태에서 하나 이상의 프라이머 쌍, 예를 들어 프라이머 쌍 모두의 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위의 상류에 예컨대 5' 말단에서 예를 들어 5 또는 6개의 염기 길이의 안정화 서열을 포함한다.
프라이머 설계 동안, 최적의 서열 특이적 혼성화 및 가닥 대체을 가능하게 하기 위해 각 혼성화 영역의 서열 및 길이를 규정하여 특이적이고 감응성인 증폭을 보장하는 것이 필요하다. 검출할 병원체 유래 RNA의 서열 내 프라이머의 위치는 프라이머의 혼성화 영역의 서열을 규정하고 따라서 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 상용성 및 증폭을 위한 최적의 감응성 및 특이성을 가진 프라이머를 선택하기 위해 상이할 수 있다. 따라서 다른 프라이머 쌍을 스크리닝하여 본 발명의 수행을 위한 최적의 서열과 위치를 확인할 수 있다. 통상적으로 프라이머의 혼성화 영역의 길이는 이론적 Tm이 적절한 반응 온도에서 효율적인 혼성화를 가능하게 하지만 절단 후에 쉽게 대체되도록 설계된다. 프라이머 설계 중에, 혼성화 서열의 이론적 Tm 및 대체된 가닥의 서열은 가능한 반응 온도와 선택된 제한 효소와 관련하여 고려되며, 이는 서열 유래 결합 특이성에 대한 이론적 개선과 균형을 이루며, 이는 서열 길이가 증가함에 따라 이루어질 수 있다. 본 발명자들의 다양한 연구는 본 발명에서 효과적으로 사용될 프라이머의 설계에서 상당한 다양성을 보여주었다. 실시양태에서 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍의 혼성화 영역은 6 내지 30, 예를 들어 9 내지 16개의 염기 길이이다. 추가 실시양태에서, 비 천연 염기 및 대안적인 뉴클레오타이드간 연결 또는 무염기 부위와 같은 변형을 프라이머의 혼성화 영역에 사용하여 특성을 개선할 수 있다. 예를 들어, PNA, LNA 또는 G-클램프와 같은 Tm을 향상시키는 변형은 더 짧은 앰플리콘을 가능하게 하고 따라서 증폭 속도를 향상시키는 더 짧고 더 특이적인 프라이머 혼성화 영역을 가능하게 할 수 있다.
본 발명자들의 다양한 연구는 짧은 앰플리콘을 가짐으로써 본 발명을 사용하여 달성되는 속도와 이의 감응성이 향상될 수 있고, 따라서 특정 실시양태에서 이의 혼성화 서열을 포함하여, 프라이머의 전체 길이를 단축하고, 병원체 유래 RNA 내의 제1 및 제2 혼성화 서열 사이에 10 또는 15개 이하의 뉴클레오타이드 염기와 같은 짧은 갭만을 가진 프라이머를 배치하는 것이 바람직할 수 있음을 밝혀내었다. 실시양태에서 병원체 유래 RNA 내의 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개의 염기 이하, 예컨대 0 내지 15 또는 0 내지 6개의 염기에 의해 분리되고, 특정 실시양태에서 이는 3 내지 15 또는 3 내지 6개의 염기, 예를 들어 5, 7 또는 11개의 염기에 의해 분리된다. 추가의 실시양태에서, 혼성화 서열은 예컨대 1 내지 2개의 염기가 중첩된다.
본 발명에서 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 유래 RNA에 대한 제1 및 제2 혼성화 서열은 인플루엔자 게놈의 분절(segment) 1, 2, 3, 5, 7 또는 8 중 하나 내에 존재하거나 이로부터 유래될 수 있다. 인플루엔자 A 유래 RNA 및 인플루엔자 B 유래 RNA에 대한 서열은 동일하거나 상이한 분절 내에 존재하거나 유래될 수 있다. 호흡기 세포융합 바이러스 유래된 RNA에 대한 제1 및 제2 혼성화 서열은 호흡기 세포융합 바이러스 A 및/또는 B의 NS2 (비-구조 단백질 2), N (핵단백질), F (융합 당단백질), M (매트릭스) 또는 L (중합효소) 유전자 중 하나 내에 존재하거나 이로부터 유래될 수 있다. 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 호흡기 바이러스 B 유래 RNA 모두에 대한 제1 및 제2 혼성화 서열은 동일한 유전자로부터 유래할 수 있다. 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 호흡기 바이러스 B 유래 RNA에 대한 제1 및 제2 혼성화 서열은 바람직하게는 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 호흡기 바이러스 B 모두의 게놈에서 보존된다.
본 발명에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍의 서열 설계에 대한 많은 고려 사항이 있다. 첫째, 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역 및 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 일반적으로 이들이 중첩되지 않거나 최소한으로 중첩되어 두 올리고뉴클레오타이드 프로브가 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종에 동시에 결합하도록 설계된다. 이는 또한 일반적으로 증폭 산물 종의 하나의 가닥에서 절단 부위의 위치와 역보체 가닥에서 절단 부위의 맞은편 위치 사이에 존재하는 서열에 주로 혼성화하여, 증폭 산물 내에 하나 이상의 종이 효율적으로 표적화되도록 하고, 두 올리고뉴클레오타이드 프로브가 동일한 가닥에 결합하도록 설계된다. 임의의 소정의 프라이머 쌍에 대해, 올리고뉴클레오타이드 프로브에 의한 표적화를 위해 어느 한 가닥을 선택할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 일반적으로 상기 방법에서 중합효소에 의해 연장되지 않는다는 점을 고려할 때, 혼성화 영역의 서열은 증폭 산물 내 관련 종의 서열을 기반으로 설계되어 Tm,%GC 및 획득된 실험 수행 데이터를 결정한다. 실시양태에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 9 내지 20개 뉴클레오타이드 염기 길이이다. 표적 병원체 유래 RNA의 제1 및 제2 혼성화 서열이 0개의 염기로 분리된 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나의 혼성화 영역의 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나에 해당하고, 다른 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 다른 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 역보체에 해당할 수 있거나 해당할 것이다. 그러나, 본 발명의 적절한 실시양태에 대한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 특성을 최적화하고 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브가 병원체에 대한 제한 효소 및/또는 프라이머 쌍에 혼합하여 제공되고, 상기 방법의 단계 b)의 전부 또는 일부가 단계 a)에 동시에 수행되는 경우에 임의의 억제 효과를 방지하기 위해 혼성화 영역의 길이가 절단될 수 있다. 병원체에 대한 제1 또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브가 제한 효소에 대한 인식 서열 및 절단 부위를 포함하고 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브는 해당 병원체에 대한 제한 효소 및 프라이머 쌍에 혼합하여 제공되고, 상기 방법의 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 경우, 상기 프로브 내의 절단 부위는 예를 들어 상기 인식 서열을 제거하기 위한 미스매칭의 도입 동안 또는 프로브의 화학적 합성 동안 변형된 뉴클레오타이드간 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결의 포함에 의해 일반적으로 차단된다. 혼성화 영역 이외에, 올리고뉴클레오타이드 프로브의 서열 및 이들이 포함할 수 있는 임의의 변형된 뉴클레오타이드 염기, 뉴클레오타이드 연결 또는 기타 변형에 대해 상당한 다양성이 존재한다. 2-아미노-dA, 5-메틸-dC, Super T®, 2-플루오로 염기 및 G 클램프와 같이, 특성을 변경하기 위해 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 삽입될 수 있고, 본 발명의 실시양태에 사용될 수 있는 변형된 염기는 Tm의 증가를 제공하고, 이소-dC 및 이소-G와 같은 다른 것들은 Tm을 증가시키지 않고 결합 특이성을 향상시킬 수 있다. 이노신 또는 무염기 부위와 같은 다른 변형이 결합의 특이성을 감소시킬 수 있다. 뉴클레아제 내성을 부여하는 것으로 공지된 변형에는 역위 dT 및 ddT 및 C3 스페이서가 포함된다. 변형은 Tm을 증가 또는 감소시킬 수 있고 본 발명의 실시양태에서 혼성화 사건의 제어를 위한 가능성을 제공할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역 내에서 변형된 염기의 사용은 예를 들어 혼성화 영역의 길이를 증가시키지 않고 결합 친화도를 향상시킴으로써 올리고뉴클레오타이드 프로브의 수행을 향상시킬 수 있는 기회를 제공한다. 일 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나 또는 둘 모두 내의 변형된 염기는 이들이 관련 단일 가닥 검출 서열에 대한 상보성을 갖는 증폭 산물 내의 임의의 종보다 더 효과적으로 혼성화하고 이에 따라 경쟁할 수 있게 한다.
병원체에 대한 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나가 혼성화 영역의 3' 말단에서 연장으로부터 차단되어 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없는 경우, 통상적으로 상기 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 기재된 바와 같이 사전-검출 종의 안정화를 위한 기회를 제공하는 추가 5' 영역을 포함할 것이다 (도 2 참조). 실시양태에서, 상기 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나의 정확한 서열에 상동성인 서열을 포함하지만, 혼성화 영역의 3' 말단에 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 연장을 차단하는 변형 및 제한 효소 절단 부위를 차단하는 단일 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 이러한 실시양태는 분석 설계를 단순화하고 비특이적 백그라운드 증폭으로 이어질 수 있는 추가 서열 모티프가 도입되지 않도록 보장한다.
검출 종을 생성하는 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍은 바람직하게는 생성된 검출 종의 카피 수가 상기 검출 종이 쉽게 검출될 수 있도록 사용되는 수단의 검출 한계를 충분히 초과하는 수준에서 제공된다. 더욱이 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브(들)에 의한 혼성화의 효율은 이의 농도에 의해 영향을 받는다. 통상적으로 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 농도는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 농도, 예를 들어, 10 내지 200 nM와 유사할 수 있지만, 제한이 없는 것으로 고려되어야 한다. 실시양태에서 하나 또는 두 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍의 농도는 해당 쌍 내의 하나 또는 두 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 농도보다 과량으로 제공되고, 또 다른 실시양태에서, 쌍 내의 하나 또는 두 올리고뉴클레오타이드 프로브의 농도는 해당 쌍 내의 하나 또는 두 올리고뉴클레오타이드 프라이머보다 더 낮은 농도로 제공된다. 증폭 단계 a)의 수행 후 쌍 내의 하나 또는 두 올리고뉴클레오타이드 프로브가 샘플에 접촉되는 경우, 증폭 단계 a)에 대한 임의의 억제가 초래될 수 있음을 고려함이 없이 가장 효율적인 혼성화를 달성하기 위해 필요에 따라 더 높은 농도를 가능하게 할 수 있다.
혼성화 서열은 본 발명에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 올리고뉴클레오타이드 프로브 모두의 핵심 특성이다. 혼성화는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브가 각 핵산의 서열에서 상보성 염기 사이의 수소결합 염기 쌍을 통해 증폭 산물 내 표적 핵산(병원체 유래 RNA 또는 대조군 핵산) 또는 종에 결합하는 능력인 서열 특이적 혼성화를 지칭한다. 일반적인 염기쌍은 아데닌-티민 (A-T) 또는 RNA 또는 RNA/DNA 혼성 이중체인 경우 아데닌-우라실(A-U), 및 시토신-구아닌 (C-G)이지만, 특정 결합 친화도를 갖는 핵산 염기의 광범위한 천연 및 비천연 유사체가 공지되어 있다. 또한, 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머의 상보성 영역은 증폭 산물 내 표적 핵산 또는 종에서 그의 혼성화 서열에 완전하고 정확한 상보성을 갖는 서열에 완전 천연 핵산 염기를 반드시 포함할 필요는 없으며; 오히려 본 발명의 수행을 위해 올리고뉴클레오타이드 프로브/프라이머는 제한 효소에 의한 절단 및 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 연장을 포함하여, 본 발명의 정확한 기능에 필요한 이중 가닥 서열을 형성하기에 충분하게 표적 혼성화 서열에 서열 특이적 혼성화할 수 있어야 한다. 따라서 이러한 혼성화는 정확한 상보성 없이 비 천연 염기 또는 무염기 부위를 사용하여 가능할 수 있다. 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 증폭 산물 내 병원체 유래 RNA, 대조군 핵산 또는 종의 관련 영역의 서열 또는 적절한 경우 이의 역보체 서열에 대한 완전한 상보성으로 구성될 수 있다. 다른 실시양태에서 하나 이상의 비 상보성 염기쌍이 존재한다. 일부 상황에서 상기 방법에서 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브의 혼합물을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 예로서, 2개의 다형성 위치를 갖는 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 부위를 포함하는 병원체 유래 RNA의 경우, 해당 위치에서 상이한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 올리고뉴클레오타이드 프로브의 1:1 혼합물 (각 성분은 SNP의 각 염기에 상보성임)을 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 동안 합성 과정에서 하나 이상의 염기를 무작위화하는 것은 통상적인 방법이다. 본 발명에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 프라이머 및 프로브의 길이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 비제한적인 예로서, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 최대 약 200, 예를 들어, 최대 약 100개 염기 길이일 수 있다.
당업자는 중합효소를 포함하는 증폭 과정에 초기 합성 및/또는 프라이머-프라이머 결합으로 인한 것과 같은 비특이적 백그라운드 증폭이 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 통상적으로 예를 들어, 소정의 반응 온도에서 기능을 여전히 유지하면서, 프라이머의 혼성화 서열, 병원체 유래 RNA 내의 제1 및 제2 혼성화 서열 사이의 갭 및 임의의 안정화 영역의 길이를 최소화함으로써, 앰플리콘의 길이를 가능한한 짧게 설계할 때 증폭이 더 고속으로 이루어지는 것으로 나타난다. 더 짧은 앰플리콘을 사용하면 증폭 산물 종을 생성하는데 필요한 모든 서열이 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 의해 제공된다는 사실로 인해 비특이적 백그라운드가 악화될 수 있다. 초기 합성 DNA 또는 프라이머-프라이머 결합을 통해 "연결되는" 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 모두 포함하는 비 표적 특이적 방식으로 앰플리콘이 생성되는 경우, 위양성 결과가 본 발명에서 발생할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍의 사용은 비 표적 특이적 백그라운드 신호의 임의의 가능성을 최소화하기 위해 추가 특성을 포함하는 본 발명의 다양한 실시양태를 가능하게 한다. 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍을 사용하여 가능하게 되는 이러한 실시양태는 이와 관련하여 공지된 키트 및 방법에 비해 실질적인 이점을 제공한다.
하나의 접근법은 병원체 유래 RNA 내의 제1 및 제2 혼성화 서열을 분리하여 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 표적 기반 서열 특이성 확인을 제공하는 것이다. 따라서 실시양태에서, 병원체 유래 RNA 내의 제1 및 제2 혼성화 서열은 3 내지 15 또는 3 내지 6개의 염기, 예를 들어 5, 7 또는 11개의 염기에 의해 분리된다. 프라이머 사이의 이 갭은 증폭 산물 내의 종에 대한 추가 특이성 확인을 제공하며, 짧은 앰플리콘의 향상된 속도를 유지하는 최적의 크기 갭을 제공한다. 따라서 실시양태에서, 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 또는 제2 단일 가닥 검출 서열은 상기 3 내지 15 또는 3 내지 6개의 염기에 해당하는 서열의 적어도 3개의 염기를 포함한다. 예를 들어, 본 발명자들은 실시예 4 (도 8)에 제시된 바와 같이 특이적 표적 병원체 의존적 증폭 산물과 비 표적 특이적 백그라운드 증폭 산물을 구별할 수 있는 가능성을 입증하였다.
일 실시양태에서, 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나의 혼성화 영역은 해당 병원체에 대한 제1 또는 제2 프라이머의 혼성화 영역 또는 혼성화 영역의 역보체에 대해 상보성인 5개 이상의 염기를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 이용된 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은, 예를 들어, 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나의 혼성화 영역에 대해 상보성인 5개 이상의 염기의 일부 상보성을 갖고/거나, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 예를 들어, 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 다른 하나의 혼성화 영역의 역보체에 대해 상보성인 5개 이상의 염기의 일부 상보성을 갖는다.
추가 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 상기 기재된 바와 같은 병원체 유래 RNA에서 제1 및 제2 혼성화 서열 사이의 갭에 대해 일부 상보성 또는 역상보성을 가질 수 있다.
대안적인 접근법에서 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍의 농도를 감소시켜 초기 증폭 및 프라이머-프라이머 결합으로 인한 백그라운드 확률을 감소시킨다. 증폭 속도를 유지하기 위해 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 3' 말단에서 차단되는 추가 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용할 수 있다. 이 실시양태에서, 차단되지 않은 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 병원체 유래 RNA로부터 앰플리콘을 생성하기 위한 초기 혼성화 및 연장 사건에 충분한 농도로 이용 가능하지만, 후속 증폭은 바람직하게는 더 높은 농도로 제공되는 차단된 프라이머(들)로 진행되며, 차단된 프라이머의 절단은 3' 차단 변형을 제거하고 증폭 과정이 손상없이 진행될 수 있도록 연장 및 가닥 대체 전에 이루어진다 (도 4 참조). 따라서 실시양태에서, 본 발명은 표적 병원체 중 적어도 하나에 대해 (A) 제3 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 제한 효소의 한 가닥의 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제3 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서, 상기 제3 프라이머는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되는 제3 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및/또는 (B) 제4 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 제한 효소의 한 가닥의 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제4 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서, 상기 제4 프라이머는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되는 제4 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 추가로 이용한다. 이러한 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법에서, 제3 및 제4 프라이머는 상기 방법의 단계 a)에서 샘플과 접촉된다. 추가의 실시양태에서, 제공되는 경우, 제3 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머보다 과량으로 제공되고, 제공되는 경우, 제4 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머보다 과량으로 제공된다. 제3 및 제4 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재에 의해 보충되는 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 농도를 실질적으로 감소시킴으로써, 비 표적 의존적 백그라운드 증폭의 제거와 관련하여 가능한 최대 이점이 획득된다. 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 프라이머 합성 동안 3' 포스페이트 또는 C-3 변형의 사용을 통해 쉽게 달성될 수 있는 중합효소 연장을 차단하기 위한 3' 변형의 존재 외에, 제1 및 제2 프라이머에 사용된 것과 동일한 설계 매개변수가 제3 및 제4 프라이머에 적용된다.
상기 기재된 바와 같이 향상된 특이성 및 백그라운드 증폭의 제거를 제공하는 본 발명의 방법의 실시양태는 개선된 서열 검증의 정확성을 제공하여, 다수의 표적의 동시 검출을 위해 다수의 반응을 수행하는 경우, 특이성의 손실없이 저온 반응을 수행할 수 있게하고/거나 증가된 다중화를 가능하게 한다. 이러한 정확한 특이성의 이점은 또한 상기 방법이 특이성의 손실없이 넓은 온도 범위와 준최적 조건 (예를 들어, 시약 농도)이 허용 가능할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본 발명자들은 모든 성분의 농도를 20% 증가 또는 감소시키는 본 발명을 수행했으며, 본 발명자들은 각 경우에 상기 방법에서 관찰되는 특이성의 임의의 손실없이 단계 a)에서 증폭 수행 후 주변 온도에서 상당한 시간 동안 상기 방법을 수행하였다. 따라서, 이러한 실시양태는 공지된 키트 및 방법에 비해 본 발명의 중요한 이점을 나타내며 이는 저가 및/또는 단일 사용 진단 장치에서의 이용에 이상적으로 적합함을 의미한다.
검출 종의 검출은 샘플에 존재하는 다른 시약 및 성분으로부터 검출 종의 존재를 차별적으로 검출하는 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 표적 병원체의 분화를 위해, 대조군 핵산이 존재하는 경우, 검출 방법은 각각의 병원체 검출 종 및 대조군 검출 종을 차등적으로 검출한다. 각각의 병원체 검출 종 및 선택적으로 대조군 검출 종을 검출하는 방법은 바람직하게는 동일하다. 검출 종의 검출에 사용할 수 있는 광범위한 물리화학적 기술에서 증폭 산물 내의 관련 종에 대한 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브와 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 후에만 존재하는 감응성 신호를 생성할 수 있는 기술이 상기 방법에의 사용을 위해 우선된다. 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브에 쉽게 부착될 수 있고 시각적으로 또는 흡광도 또는 형광 분광기와 같은 기기를 사용하여 검출의 기반을 형성할 수 있는 다양한 비색 또는 형광 염료가 존재한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 검출을 가능하게 하는 모이어티는 비색 또는 형광 염료, 또는 비오틴과 같은 비색 또는 형광 염료에 부착 가능한 모이어티이다. 비색 염료가 사용될 때 동일하거나 상이한 염료가 각각의 표적 병원체 및 선택적으로 대조군 핵산에 대해 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 모든 표적 병원체 및 존재하는 경우 대조군 핵산에 대해 동일한 염료가 사용된다.
비색 염료를 사용하는 본 발명의 실시양태는 형광 여기 및 검출을 수행하기 위해 기기가 필요하지 않고 가능하게는 표적 핵산의 존재가 육안으로 측정할 수 있게 하는 이점을 갖는다. 비색 검출은 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 본 발명에서 사용하기 전에 비색 염료에 부착할 수 있는 모이어티, 또는 비색 염료를 직접 부착하거나, 대안적으로 증폭 산물 내의 종에 대한 이의 결합 후 프로브에 염료 또는 모이어티를 특이적으로 부착 또는 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 후속 검출을 위해 스트렙타비딘 접합된 비색 염료에 대한 결합을 가능하게 하는 비오틴 모이어티를 포함할 수 있다. 검출에 사용될 수 있는 비색 염료의 하나의 예는 금 나노입자이다. 유사한 방법은 탄소 나노입자, 은 나노입자, 산화철 나노입자, 폴리스티렌 비드, 양자점 등과 같이 매우 많은 수의 것이 공지되어 있는 다양한 다른 본질적인 비색 모이어티와 함께 사용될 수 있다. 높은 흡광 계수 염료가 또한 상기 방법에서 감응성 실시간 정량화를 위해 가능성을 제공한다.
소정의 용도에 적합한 염료를 선택할 때 많은 고려 사항이 적용된다. 예를 들어, 용액에서 시각적인 비색 검출을 수행하기 위한 실시양태에서, 검출의 용이성을 위해 더 큰 크기의 입자 및/또는 더 높은 흡광 계수를 갖는 입자를 선택하는 것이 일반적으로 유리하며, 시각적 검출을 위한 측방 유동 막을 포함하는 실시양태는 더 작은 크기의 입자가 막을 따라 더 빠르게 확산되는 능력의 이점을 가질 수 있다. 다양한 크기와 모양의 금 나노입자를 사용할 수 있지만, 폴리스티렌 또는 라텍스 기반 마이크로스피어/나노입자를 포함하는 다수의 다른 대상 비색 모이어티가 또한 이용 가능하다. 이러한 특성의 입자는 또한 다수의 색상으로 제공되며, 이는 상기 방법을 수행하는 동안 다른 검출 종에 태그를 부착하고 차별적으로 검출하거나 검출 반응에서 생성되는 비색 신호를 "다중화"하는데 유용할 수 있다.
형광 검출은 적절한 여기 자극 하에서 형광 신호를 방출하여 후속하여 검출 종의 후속 검출을 가능하게 하는 임의의 염료를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 직접 형광 검출을 위한 염료에는 제한 없이 양자점, ALEXA 염료, 플루오레세인 (fluorescein), ATTO 염료, 로다민 (rhodamine) 및 텍사스 레드 (texas red)가 포함된다. 올리고뉴클레오타이드 프로브에 부착된 형광 염료 모이어티를 사용하는 상기 방법의 실시양태에서, 검출 종과 염료의 부착한 후 신호가 증가하거나 감소하는 핵산 검출을 위한 Taqman 정량 PCR 또는 분자 비콘 기반 전략에 사용되는 것과 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 기반으로 검출을 수행하는 것이 또한 가능한다. 일반적으로 형광 접근법이 사용되는 경우 CCD 카메라, 형광 스캐너, 형광 기반 마이크로플레이트 판독기 또는 형광 현미경과 같은 여러 다른 검출 장치를 사용하여 형광 신호 생성을 기록할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 검출을 가능하게 하는 모이어티는 기질과의 접촉 후 비색 또는 형광 신호와 같은 검출 가능한 신호를 생성하는 효소이다. ELISA 및 면역조직화학 검출과 같은 진단 분야에서 다수의 효소 기질 시스템이 이용 가능하고 통상적으로 사용된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 양고추냉이 과산화효소 (HRP)가 한 예이다. 검출 종의 검출을 위해 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브에 부착된 효소를 이용하면 기질 첨가를 포함하는 별도의 단계를 통해 검출 감응성 향상 및 신호 발생 제어 증가와 같은 많은 가능한 이점이 제공된다. 다른 적합한 비색 효소는 글리코실 가수분해 효소, 펩티다제 또는 아밀라제, 에스테라제 (예를 들어, 카복시에스테라제), 글리코시다제 (예를 들어, 갈락토시다제) 및 포스파타제 (예를 들어, 알칼리 포스파타제)를 포함할 수 있다. 이 목록은 어떤 식으로든 제한적으로 고려되어서는 안된다.
다른 접근법에서, 병원체 또는 대조군 검출 종의 존재는 검출 종의 존재하에, 예컨대 임피던스의 변화 또는 전도도, 전류, 전압 또는 전위차 신호의 변화에 의해 전기적으로 검출된다. 따라서 일 실시예에서 검출 종은 전기 신호의 변화에 의해 검출된다. 전기 신호 변화는 전기 신호의 향상된 변화를 유도하는 화학적 기와 같은 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 의해 촉진될 수 있다. 전기 신호 검출이 매우 감응성일 수 있기 때문에 상기 검출 모이어티는 단순히 올리고뉴클레오타이드 서열일 수 있지만, 특정 실시양태에서 신호는 예를 들어 금속, 예를 들어 금과 탄소와 같은 전기 신호를 향상시키는 것으로 공지된 화학적 기의 존재에 의해 향상된다.
일 실시양태에서 검출 종의 축적으로 인한 전기 신호 변화는 증폭 동안 수성 반응에서 검출될 수 있지만, 다른 실시양태에서, 전기 신호 검출은 검출을 위해 전기 화학적 프로브의 표면과 같은 특정 부위에 검출 종을 국소화함으로써 촉진되며, 상기 국소화는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 의해 매개된다.
일 실시양태에서, 검출 종의 존재의 검출은 탄소 또는 금, 바람직하게는 탄소를 사용하여 비색 또는 전기화학적 신호를 생성한다.
실시양태에서 검출 종은 핵산 측방 유동에 의해 검출된다. 핵산이 일반적으로 니트로셀룰로스로 제조된 막을 통한 확산에 의해 다른 반응 성분과 분리되는 핵산 측방 유동은 비색, 형광 및 전기 신호을 포함한 다양한 신호 결과와 결합할 수 있는 저가의 고속 검출 방법이다. 핵산 측방 유동은 본 발명에서 검출 종의 검출에 사용하기에 매우 적합하며 많은 이점을 제공한다. 실시양태에서, 검출 종 내의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 비색 또는 형광 염료를 부착하고 검출 종 내의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 상기 염료를 측방 유동 스트립 상의 소정의 위치에 국소화하는 핵산 측방 유동 검출을 수행한다. 이러한 방식으로 육안 또는 판독 기기로 결과를 관찰하는 고속 검출을 수행할 수 있다. 핵산 측방 유동은 측방 유동 스트립에 고정된 관련 항체와 함께 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에서 검출 모이어티로서 항원을 사용할 수 있다. 대안적으로, 개선된 다중화 가능성을 갖는 항체 기반 분석에 대한 간단하고 저가의 대안을 제공하여, 측방 유동 스트립으로의 사전-검출 종 또는 검출 종의 혼성화를 통한 서열 특이적 검출이 쉽게 수행될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍을 이용하지 않는 SDA와 같은 공지된 키트 및 방법은 통상적으로 서열 특이적 혼성화를 기반으로 한 검출에 사용할 수 없는 이중 가닥 DNA 산물을 생성한다. 본 발명과는 달리, 검출 종은 특히 위치 특이적 혼성화 기반 검출의 사용으로 인해 다중 검출이 가능하다. 탄소 또는 금 나노입자는 핵산 측방 유동에 쉽게 사용될 수 있다. 검출 종의 국소화는 탄소 또는 금의 국소 농축을 유발하여 각각 흑색 또는 적색으로 나타나게 된다. 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 서열 특이적 혼성화에 의해 스트립 상에 국소화되기 전에 비색 염료에 대한 결합을 가능하게 하는 모이어티, 예컨대 비오틴을 포함한다.
검출 종의 공간적 위치는 예를 들어 특정 위치에서 검출 종의 혼성화 기반 결합을 가능하게 하기 때문에 검출 종의 검출에 사용되는 기술과 밀접하게 관련된다. 고속의 특이적 검출을 용이하게 하는 것 외에도, 이러한 물리적 부착은 여러 다른 표적 병원체의 다중 검출에서 본 발명의 사용을 향상시킬 수 있다. 실시양태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 핵산 측방 유동 스트립 또는 전기화학적 프로브, 96-웰 플레이트, 비드 또는 어레이 표면에 부착된다. 따라서 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종은 해당 위치에서 검출 종의 형성 후에 쉽게 검출되는 해당하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 물리적 위치에 국소화된다. 대안적으로, 고체 물질에 대한 부착을 가능하게 하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 부착된 모이어티로서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 방식으로 고체상 부착 올리고뉴클레오타이드의 서열은 결합 효율을 향상시키기 위한 표적 핵산 서열로 독립적으로 규정될 수 있다. 따라서, 실시양태에서 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 수행을 향상시키기 위해 개선된 친화도 및 혼성화 효율을 갖도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 측방 유동 스트립에 직접 부착하는 것보다, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 내에 존재하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티에 효율적으로 혼성화할 수 있는 스트립 상 혼성화에 최적화된 서열을 갖는 별도의 포획 올리고뉴클레오타이드가 사용된다.
다양한 연구에서, 본 발명자들은 향상되는 스트립 상 혼성화 서열을 제공하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착 모이어티로 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 핵산 측방 유동에 의해 본 발명의 수행을 상당히 향상시켰다. 예를 들어, G-C 다함유 서열이 스트립 상 혼성화에 사용될 수 있거나, 더 높은 Tm을 갖는 더 긴 서열이 사용될 수 있으며, 이는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 길이를 보충한다. 대안적으로, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티는 PNA, LNA 또는 G-클램프와 같은 그의 친화도를 향상시키기 위해 하나 이상의 변형된 염기 또는 뉴클레오타이드간 연결을 포함할 수 있다. 반복 서열 모티프가 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티에 사용될 때 예측 Tm에 의해서는 예측되지 않는 놀라운 혼성화 효율의 향상이 관찰된다는 것을 관찰하였다. 따라서 실시양태에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티의 서열은 2 내지 4개의 염기 DNA 서열 모티프의 3개 이상의 반복 카피를 포함한다. 예를 들어, 이러한 서열 모티프를 사용하는 다양한 연구에서 본 발명자들은 핵산 측방 유동에 의한 검출 감응성의 상당한 향상을 관찰했으며, 종종 신호 향상이 100배 이상이었다.
따라서 검출 종의 존재가 핵산 측방 유동에 의해 검출되는 실시양태에서, 핵산 측방 유동은 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티에의 서열 특이적 혼성화를 가능하게 하는 하나 이상의 핵산을 이용한다.
추가 이점은 부착을 위해 고체 물질로부터 또는 검출 수단으로부터 병원체 유래 RNA을 분리함으로써 부여되며, 이는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브 내의 검출 모이어티 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와의 부착 모이어티로서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 가능하게 될 수 있다. 이러한 방식으로, 부착을 위한 관련 고체 물질 또는 핵산 측방 유동 스트립과 같은 상기 고체 물질을 포함하는 장치 및/또는 검출 수단은 병원체 유래 RNA의 서열에 관계없이 최적화되고 규정될 수 있다. 이러한 "범용" 검출 장치는 변경될 필요없이 표적에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 효율적인 스트립 상 혼성화 능력이 있고 의도하지 않은 누출 신호가 없는 상용성 올리고뉴클레오타이드 서열 세트에 해당하는 라인이 프린팅되는 핵산 측방 유동 스트립은 다중 표적 병원체의 검출을 위한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브의 개발과 독립적으로 규정, 최적화 및 효율적으로 제조될 수 있다.
다수의 실시양태에서 검출은 정량적 방식으로 수행될 수 있다. 따라서 샘플 내 단일 가닥 표적 핵산의 수준은 상기 방법의 단계 c)에서 정량화될 수 있다. 정량화는 예를 들어 단일 종점 이외에 다수의 시점에서 반응의 시간 과정 동안 검출 종을 비색, 형광 또는 전기적으로 측정함으로써 수행될 수 있다. 정량화를 위한 대안적 전략에는 액적 디지털 PCR과 유사한 샘플의 순차적 희석이 포함된다. 추가 실시양태에서, 샘플 내 표적 병원체의 수준은 반 정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 측방 유동 스트립 상의 비색 신호의 강도가 샘플의 표적 병원체의 대략적인 수준에 해당하는 경우이다. 대안적으로, 억제제를 극복하고 검출 가능한 수의 검출 종의 카피를 생성하기 위해 표적 병원체의 카피 수가 소정의 특정 카피 수를 초과해야 하는 억제제가 사용될 수 있다.
본 발명에서 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에 대한 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착된다. 선택적으로, 실시양태에서, 하나 이상의 다른 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브는 또한 고체 물질 또는 고체 물질에 대한 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 고체 물질에 부착하는 것이 다양한 다른 방식으로 달성될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 적절하게 변형된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 부착 또는 반응시키는 목적에 유용하도록 충분한 밀도의 작용기를 갖거나 부착 또는 작용화할 수 있는 다수의 상이한 고체 물질이 이용 가능하다. 또한, 비드, 수지, 표면 코팅 플레이트, 슬라이드 및 모세관을 포함하여, 다양한 모양, 크기 및 형태의 이러한 고체 물질이 이용 가능하다. 올리고뉴클레오타이드의 공유 부착에 사용되는 이러한 고체 물질의 예에는 제한 없이 유리 슬라이드, 유리 비드, 페라이트 코어 중합체 (ferrite core polymer) 코팅 자기 마이크로비드, 실리카 마이크로 입자 또는 자성 실리카 마이크로 입자, 실리카 기반 모세관 마이크로 튜브, 3D 반응성 중합체 슬라이드, 마이크로플레이트 웰, 폴리스티렌 비드, 폴리(락트)산 (PLA) 입자, 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA) 마이크로 입자, 제어된 다공 유리 수지, 산화 그래핀 (graphen) 표면 및 작용화된 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 표면이 포함된다. 폴리아크릴아미드와 같은 중합체는 중합체를 생성하는데 사용되는 단량체 (예를 들어, 아크릴아미드 단량체) 사이의 중합 반응 동안 작용화된 올리고뉴클레오타이드가 공유 결합될 수 있다는 추가 이점을 갖는다. 작용화된 올리고뉴클레오타이드가 중합 반응에 포함되어 공유 결합된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 고체 중합체가 생성된다. 이러한 중합은 생성된 올리고뉴클레오타이드 부착 고체 물질의 크기, 모양 및 형태를 제어하여 올리고뉴클레오타이드를 고체 물질에 부착하는 매우 효율적인 수단을 나타낸다.
일반적으로 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이러한 고체 물질에 부착하기 위해, 3' 또는 5' 말단에서 작용기를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 합성되지만; 작용기는 또한 거의 모든 염기 위치에서 올리고뉴클레오타이드 생성 과정 중에 첨가될 수 있다. 이후에, 올리고뉴클레오타이드 내의 작용기(들)와 관련 고체 물질 상의 작용기 사이에 특이적 반응이 수행되어 안정한 공유 결합을 형성하여 고체 물질에 부착된 올리고뉴클레오타이드가 생성될 수 있다. 일반적으로 이러한 올리고뉴클레오타이드는 5' 또는 3' 말단에 의해 고체 물질에 부착된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 신뢰할 수 있는 2개의 부착 화학물질은 올리고뉴클레오타이드 내의 티올 (SH) 또는 아민 (NH3) 기 및 작용기를 이용한다. 티올 기는 고체 지지체상의 말레이미드 모이어티와 반응하여 티오에스테르 결합을 형성할 수 있으며, 아민은 숙신이미딜 에스테르 (NHS 에스테르) 변형된 카복실산과 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 다른 여러 화학물질이 또한 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브를 고체 물질에 화학적으로 접합시키는 것뿐만 아니라, 본 발명에 사용하기 위해 고체 물질 상에 올리고뉴클레오타이드 프로브를 직접 합성하는 것이 가능하고 유리할 수 있다.
다른 실시양태에서 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 고체 물질에 대한 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착된다. 하나의 전략은 특이적 결합을 가능하게 하는 모이어티가 올리고뉴클레오타이드 프로브에 부착되어 관련 친화도 리간드에 대한 이의 부착을 촉진할 수 있는 친화도 결합 방법을 사용하는 것이다. 이는 예를 들어 항체-항원 결합 또는 폴리-히스티딘 태그와 같은 친화도 태그를 사용하거나, 상보성 핵산이 고체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로스 핵산 측방 유동 스트립에 부착되는 핵산 기반 혼성화를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 이러한 모이어티에는 비오틴이 있으며, 이는 상기 자체가 비드 또는 다른 고체 표면에 부착되는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 높은 친화도 결합을 할 수 있다.
본 발명은 둘 이상의 표적 병원체를 검출 및 식별한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 모든 표적 병원체에 대해 동시에 수행된다. 둘 이상의 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성된 검출 종의 검출은 다중 검출을 가능하게 하기 위해, 상이한 비색 또는 형광 염료 또는 효소와 같은, 특정 신호에 각각 결합될 수 있다. 대안적으로 다중 검출은 고체 물질에 대한 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티를 통해 직접 또는 간접적으로 고체 물질에 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 부착함으로써 달성될 수 있다. 이러한 접근법은 다른 검출 수단에 의존하기보다는 병원체 및 존재하는 경우 대조군 검출 종의 물리적 분리를 이용한다. 따라서, 예를 들어, 단일 염료를 핵산 측방 유동에 사용하여 다수의 다른 병원체(및 대조군 핵산)을 검출할 수 있으며, 생성된 각각의 상이한 검출 종은 측방 유동 스트립의 특정 프린팅 라인에 국소화되고 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대한 직접 또는 간접 서열 기반 혼성화는 차별적 검출의 기반을 형성한다. 대안적으로, 다수의 상이한 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브가 어레이의 특정 영역에 부착되고 따라서 다수의 상이한 검출 종이 동시에 생성되는 다중 반응에서 각 검출 종이 혼성화를 통해 어레이의 개별 영역에 국소화되어 다중 검출을 가능하게 하는 전기 검출 어레이가 사용될 수 있다.
핵산 측방 유동 및 전기적 검출과 같은 전술한 검출 과정, 및 동일한 샘플 내에서 다수의 상이한 표적 병원체를 쉽게 검출할 수 있는 능력은 올리고뉴클레오타이드 프로브 쌍에 대한 본 발명의 본질적인 요건에 의해 가능해진다. 따라서 이는 공지된 키트 및 방법에 비해 본 발명의 장점을 강력하게 입증한다.
본 발명의 키트는 공정 대조군을 수행하기 위한 성분, 예컨대:
a) 하기를 포함하는 프라이머 쌍으로서:
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
ii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
b) 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소; 및
c) 하기를 포함하는 프로브 쌍으로서:
i. 대조군 핵산의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
ii. 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 공정 대조군, 예컨대:
a) 대조군 핵산을:
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
ii. 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소;
iii. 가닥 대체 DNA 중합효소;
iv. dNTP; 및
v. 하나 이상의 변형된 dNTP
와 접촉시켜서, 대조군 핵산의 존재 하에 대조군 증폭 산물을 생성하는 단계;
b) 단계 a)의 대조군 증폭 산물을
ii. 대조군 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
대조군 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍과 접촉시키는 단계로서;
제1 및 제2 프로브와 대조군 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 혼성화는 대조군 검출 종을 생성하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생성되는 대조군 검출 종의 존재를 검출하는 단계로서, 대조군 검출 종의 존재는 상기 방법의 공정 대조군으로서 작용하는 단계
를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법의 이 실시양태에서 대조군 핵산은 또한 역전사효소와 접촉될 수 있다.
공정 대조군은 표적 병원체의 검출과 동시에 수행되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 이는 본 발명의 방법과 동일한 용기/기기/장치 등에서 병렬로 수행되는 내부 대조군이다. 샘플에서 표적 병원체의 정성적 검출은 환자의 감염을 인식하기 위해 중요하며, 이는 위-음성 또는 위-양성 결과가 예를 들어 환자의 치료와 관련하여 결과를 초래할 수 있으므로 방지하는 것이 바람직하기 때문이다. 내부 공정 대조군은 시험 결과의 유효성을 확인하는데 도움이 될 수 있다. 대조군 검출 종의 존재 검출은 상기 방법, 예를 들어, 표적 병원체에서 유래한 증폭 산물/검출 종의 부재에서도 발생하는 증폭의 성공적인 수행을 나타낸다. 표적 병원체에 대한 음성 결과의 경우 정성적 내부 대조군을 검출해야 하며, 그렇지 않으면 상기 방법의 수행이 작동하지 않는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 표적 병원체에 대해 양성 결과의 경우 정성적 내부 대조군이 반드시 독립적으로 검출되어야 하는 것은 아니다.
존재하는 경우, 대조군 핵산은 RNA, DNA, RNA 및 DNA 염기 둘 모두를 포함하는 키메라, 또는 RNA/DNA 혼성체일 수 있다. 일 실시양태에서 대조군 핵산은 공정 대조군이 본 발명에서 사용될 수 있는 임의의 역전사효소 활성을 포함하도록 RNA를 포함한다. 대조군 핵산은 동일한 프라이머 및/또는 제한 효소 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 병원체 유래 RNA에 대해 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나 또는 둘 모두를 사용하도록 설계될 수 있다. 대조군 핵산에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 바람직하게는 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 것으로부터 대조군 핵산의 존재 하에 생성된 증폭 산물/검출 종의 차등 검출을 가능하게 하기 위해 병원체 유래 RNA에 사용되는 것과 상이하다. 대조군 핵산 및 병원체 유래 RNA에 대한 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나가 동일한 경우, 이는 바람직하게는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브이다. 비제한적인 예로서, 대조군 핵산은 최대 500개 염기 길이, 예를 들어, 최대 200 또는 100개 염기 길이일 수 있다.
달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 병원체 유래 RNA와 관련된 키트 및 방법의 특징에 대한 이전 설명은 적절한 경우 대조군 핵산 및 대조군 핵산 프라이머, 프로브, 제한 효소, 증폭 산물, 검출 종 등에도 적용됨을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어 대조군 핵산에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나, 바람직하게는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없고 또한 바람직하게는 상기 방법의 단계 a)의 수행과 동시에 대조군 핵산과 접촉된다.
본 발명의 키트, 장치 및 방법은 인플루엔자 및 RSV 감염의 진단, 예후 또는 모니터링에 사용될 수 있다. 본 발명의 키트, 장치 및 방법은 또한 하나 이상의 다른 질병, 예를 들어 호흡기 감염과 같은 다른 감염성 질병, 예를 들어, 리노바이러스, 아데노바이러스, 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2) 또는 파라인플루엔자 바이러스를 추가로 검출하도록 구성될 수 있다.
본 발명은 광범위한 샘플 유형 어레이에 사용할 수 있다. 적합하게는 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플, 예를 들어 인간 샘플, 예를 들어, 비강 도말물(swab) 또는 흡인물(aspirate), 비인두 도말물 또는 흡인물, 인후 도말물 또는 흡인물, 구인두 도말물 또는 흡인물, 또는 가래 또는 전술한 조직 생검 또는 체액의 임의의 형태에서 유래한 인간 또는 동물 샘플 중 임의의 것으로부터 유래된 샘플이다. 본 발명자들은 또한 다음 임상 표본, VTM의 비강 도말물, VTM의 비인두 도말물, 얇은 준비 배지, 액체 Amies의 인후 도말물, 2M NaOH/이소프로판올 다음에 DNA 포획 비드를 통해 처리된 가래, 액체 Amies의 구강 도말물의 적어도 10 내지 20%를 포함하는 광범위한 샘플에서 이 방법을 수행했다. 이들 실험은 상이한 임상 적용에 대한 본 발명의 현저한 다양성 및 관련 샘플에서 관찰된 억제의 부재를 입증하였다. 이는 PCR을 억제하는 생물학적 표본에 존재하는 억제제에 의해 억제되는 다른 방법과 완전히 대조되며, 따라서 복합 샘플 준비 절차에 대한 임의의 요구 사항 없이 저비용 또는 단일 사용 장치에서 상기 키트 및 방법을 사용할 가능성을 보여준다. 샘플은 본 발명의 방법에 사용되기 전에 처리될 수도 있고 처리되지 않을 수도 있다. 적합한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 샘플은 본 발명의 방법에 사용하기 전에 오염 물질의 처리, 정제, 여과, 화학적 또는 물리적 용해에의 적용, 완충액 교체에의 적용, 엑솜 포획에의 적용 또는 고갈, 예를 들어 일부 고갈될 수 있다.
표적 병원체 게놈이 -ve 가닥 단일 가닥 RNA 바이러스인 본 발명에서, +ve 가닥 전사체는 또한 샘플에 존재할 수 있고, 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용하여 본 발명에서 한 가닥 또는 두 가닥 모두가 증폭되어 단일 가닥 표적 핵산으로서 검출될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 키트 및 방법은 단일 사용(또는 원샷(one-shot)) 진단 장치와 같은 장치에서 사용하기에 이상적으로 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 전술한 바와 같은 키트, 특히 핵산 측방 유동 스트립과 같은 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성된 검출 종의 존재를 검출하기 위한 수단을 포함하는 키트를 포함하는 장치를 제공한다. 본 장치는 전원 장치, 예를 들어, 전기적으로 구동되는 장치일 수 있고, 상기 장치는 또한 가열 수단을 포함할 수 있고 자급식 장치, 즉 보조 시험 도구가 필요하지 않은 장치일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 병원체 유래 RNA 신호를 증폭하기 위한 검출 단계 c)와 독립적으로 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 예를 들어 증폭된 신호가 미래 날짜 및/또는 필요한 경우 대체 위치에서 표적 병원체의 검출 및 식별을 위해 분류되어야 하고/거나 운반되어야 하는 경우 사용될 수 있다. 증폭된 신호는 상기 방법의 수행을 통해 생성된 사전-검출 종 또는 검출 종을 포함한다. 따라서, 추가 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 방법의 단계 a) 및 단계 b)의 전부 또는 일부를 포함하는, 샘플에서 상기 정의된 바와 같은 병원체 유래 RNA의 신호를 증폭하는 방법을 제공한다. 본 발명의 키트와 관련하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 모든 선택적 및/또는 바람직한 실시양태는 또한 본 발명의 방법 및 장치 및 이의 용도와 관련하여 적용되며, 이의 반대도 마찬가지임을 이해해야 한다.
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명(실시예 10) 및 본 발명에 사용된 방법(실시예 1 내지 9)의 다양한 양상 및 실시양태를 추가로 예시하는 역할을 한다. 이러한 실시예는 어떤 식으로든 제한적인 것으로 고려되어서는 안 된다.
실시예
재료 및 방법
달리 지시되지 않는 한, 하기 재료 및 방법이 하기 실시예에 사용된다.
올리고뉴클레오타이드: 달리 지시된 경우를 제외하고, 사용자 지정 올리고뉴클레오타이드는 혼입된 DNA 기술의 포스포라미다이트 방법을 사용하여 제조되었다.
핵산 측방 유동: 탄소 나노입자를 비-공유 흡착을 통해 다양한 비오틴-결합 단백질, 예를 들어 스트렙타비딘에 접합시켰다. 일반적으로 콜로이드 탄소 현탁액을 보레이트 완충액에서 제조한 다음 프로브 초음파 처리기를 사용하여 초음파 처리하였다. 이어서 탄소를 실온에서 인큐베이션하여 비오틴 결합 단백질에 흡착시켰다. 탄소를 반응 혼합물에 직접 사용하거나 유리 섬유 접합체 패드에 적용하였다. 제조업체의 지침에 따라 샘플 패드, 니트로셀룰로스 막 및 흡착제 패드 (Merck Millipore)와 함께 동결건조된 당 및 시각적 외형을 개선하기 위해 사용되는 첨가제가 포함된 접합 패드를 조합하여 측방 유동 스트립을 작제하였다. 측방 유동 스트립에 사용하기 전에, 상기 방법에서 검출할 검출 종의 서열의 역보체를 포함하는 관련 올리고뉴클레오타이드(들)를 소정의 위치에서 니트로셀룰로스 막에 프린팅하고 UV 교차연결를 통해 막에 부착하였다.
실시예 1
제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 고체 물질인 니트로셀룰로스 측방 유동 스트립에 부착시키는 본 발명에 사용되는 방법의 수행
이 실시예는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 고체 물질, 니트로셀룰로스 측방 유동 스트립에 부착시키고, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 증폭 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉시키지 않는 본 발명에 사용되는 방법의 수행을 나타낸다.
5'에서 3' 방향으로 7개의 염기의 안정화 영역; 닉형성 효소가 아닌 제한 효소에 대한 인식 서열의 5개 염기; 및 표적 핵산에서 제1 혼성화 서열의 역보체 서열을 포함하는 12개 염기 혼성화 영역을 포함하는 총 24개의 염기 길이의 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다. 동일한 안정화 영역 및 제한 효소 인식 서열을 포함하지만 표적 핵산에서 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 12개 염기 혼성화 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다. 이 실시예에서 제1 제한 효소와 제2 제한 효소는 동일한 제한 효소이다. 제한 효소는 5개 염기 인식 서열의 하류에 상부 가닥 절단 부위를 갖는 비대칭 이중 가닥 절단 제한 효소이다. 표적 핵산의 제1 및 제2 혼성화 서열은 1개의 염기로 분리된다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머를 프라이머의 역보체에서 절단 부위의 하류의 뉴클레오타이드 염기가 아데노신이고, 알파 티올 dATP가 상기 방법에서 변형된 dNTP로 사용되도록 표적 핵산을 사용하여 설계하였다. 포스포로티오에이트 변형을 상기 역보체 가닥의 절단을 차단하기 위해 가닥 대체 중합효소에 의해 삽입한다.
5'에서 3' 방향으로 증폭 산물에서 적어도 하나의 종에 상보성인 12개의 염기 영역; 6개의 염기의 중성 스페이서 영역; 및 합성 동안 첨가된 3' 비오틴 변형을 포함하며, 상기 비오틴 변형은 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브와 비색 염료 탄소 나노입자의 부착을 가능하게 하는 총 20개의 염기 길이의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소를 제조하고 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브로 포화시켰다. 5'에서 3' 방향으로 10 X 티미딘 염기를 포함하는 중성 스페이서; 증폭 산물에서 상기 적어도 하나의 종에서 제1 단일 가닥 검출 서열의 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 13개 염기 영역의 3X 반복을 포함하는 총 49개 염기 길이의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 약 30 pmol의 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 핵산 유동 스트립 상에 프린팅하였다.
1.6pmol의 제1 프라이머; 0.1 pmol의 제2 프라이머; Enzo Life Sciences으로부터의 250 μM 2'-데옥시아데노신-5'-O-(1-티오트리포스페이트) Sp-이성질체 (Sp-dATP-α-S); 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 2U의 제한 효소; 및 2U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소를 포함하는 반응을 제조하였다. 핵산 표적 (단일 가닥 DNA 표적)을 다양한 수준으로 (++ = 1 amol, + = 10 zmol, NTC = 무 표적 대조군) 적절한 반응 완충액 중 10 μl의 총 반응 부피로 첨가하였다. 반응을 45℃에서 7분 또는 10분 동안 인큐베이션하였다. 6.5 μl의 종결 반응 혼합물을 이후에 0.056 mgml-1의 접합 탄소를 포함하는 60μl 측방 유동 구동 완충액을 첨가한 후, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브가 프린팅된 라인에 부착된 핵산 측방 유동 스트립에 로딩하였다.
도 5는 실시예의 수행에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 화살표는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브가 니트로셀룰로스 스트립에 프린팅되어 양성 신호가 나타나는 위치를 나타낸다. 상기 방법에 의한 표적 핵산 서열의 신속하고 감응성인 검출을 나타내는 두 표적 수준 및 두 시점 모두에서 표적 핵산의 존재 하에서만 탄소 신호의 존재에 해당하는 명확한 흑색 라인이 관찰되었다.
실시예 2
제1 올리고뉴클레오타이드 프로브가 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)에서 샘플과 접촉되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행
이 실시예는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행을 나타낸다. 이러한 실시양태에서, 본 발명자들은 증폭 속도의 어떠한 유의한 억제도 관찰하지 못했는데, 이는 사전-검출 종이 최적의 순환 증폭 과정을 방해하지 않고 실시간으로 축적됨을 나타낸다. 상기 실시양태에서 증폭 과정에 대한 어떠한 억제 효과도 관찰되지 않았을뿐만 아니라, 본 발명자들은 적어도 100배의 검출 종의 증가된 양에 해당하는 생성된 신호의 놀라운 향상을 관찰하였다.
실시예 2.1: 실시예 1에서 사용된 분석의 변형을 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 방법의 실시양태를 이용하여 설계하였다. 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 제한 효소, dNTP, 변형된 dNTP 및 중합효소가 사용되었지만, 5'에서 3' 방향으로 5' 비오틴 변형; 8개의 염기의 중성 영역; 증폭 산물에서 적어도 하나의 종에 혼성화할 수 있는 13개 염기 영역; 및 3' 포스페이트 변형을 포함하고, 비오틴 변형은 비색 염료, 탄소 나노입자와 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하고, 포스페이트 변형은 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 그의 연장을 차단하는 총 21개의 염기 길이의 대안적인 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소를 제조하고 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브로 포화시켰다.
5'에서 3' 방향으로 증폭 산물에서 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 14개의 염기 영역; 6개의 염기 중성 스페이서 서열; 14개의 염기 혼성화 영역의 반복; 제2의 6개의 염기 중성 스페이서 서열; 및 10 X 티미딘 염기 스페이서를 포함하는 대안적인 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 약 30 pmol의 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 핵산 유동 스트립 상에 프린팅하였다.
0.8pmol의 제1 프라이머; 0.8pmol의 제2 프라이머; 0.6pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 300μM Sp-dATP-α-S; 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 2U의 제한 효소; 및 2U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소를 포함하는 반응을 제조하였다. 핵산 표적 (이 경우, 단일 가닥 DNA 표적)을 다양한 수준으로 (++ = 1 amol, + = 10 zmol, NTC = 무 표적 대조군) 적절한 반응 완충액 중 10 μl의 총 반응 부피로 첨가하였다. 반응을 45℃에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 5 μl의 종결 반응 혼합물을 이후에 0.03 mgml-1의 접합 탄소를 포함하는 60μl 측방 유동 구동 완충액을 첨가한 후, 핵산 측방 유동 스트립에 로딩하였다. 반응 동안 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브가 존재하지 않는 대조군 반응을 검출 종이 생성되지 않음을 입증하기 위해 수행하였다. 측방 유동 스트립 검출 동안 프로브 존재의 임의의 의도되지 않은 영향을 제어하기 위해 단계 a) 후에 프로브의 균등한 수준 (0.6pmol)을 상기 대조군에 첨가하였다.
도 6a는 전개 후 핵산 측방 유동 스트립의 사진을 제공한다. 탄소 나노입자의 침착에 해당하는 명확한 신호는 반응 중에 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브가 제공되었을 때 두 표적 수준 모두에서 관찰되었다. 예상대로 제1 올리고뉴클레오타이드가 반응 중에 제공되지 않았을 때 표적 수준에서 신호가 검출되지 않았다. 이 실험은 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제1 또는 제2 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 방법의 실시양태에서 검출 종의 생성을 실질적으로 향상시킬 수 있는 가능성을 명확하게 나타낸다. 실시예 1과 달리 동일한 농도의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 제공되어 보다 신속한 증폭이 가능하다는 점에 주목할 필요가 있다.
실시예 2.2: 완전히 상이한 표적 핵산을 사용하는 방법의 상기 실시양태의 다양성을 입증하기 위해 별도의 분석을 다음에 설계하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 올리고뉴클레오타이드 프로브를 실시예 1 및 2.1에 기재된 것과 유사한 방식으로 관련 표적 핵산, 단일 가닥 DNA에 대해 설계하였다.
0.8pmol의 제1 프라이머; 0.4pmol의 제2 프라이머; 0.6pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 300μM Sp-dATP-α-S; 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 2U의 제한 효소; 및 2U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소를 포함하는 반응을 제조하였다. 핵산 표적 (단일 가닥 DNA 표적)을 다양한 수준으로 (+ = 1 amol, NTC = 무 표적 대조군) 적절한 반응 완충액 중 10 μl의 총 반응 부피로 첨가하였다. 반응을 45℃에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 5 μl의 종결 반응 혼합물을 이후에 0.08 mgml-1의 접합 탄소를 포함하는 60μl 측방 유동 구동 완충액을 첨가한 후, 핵산 측방 유동 스트립에 로딩하였다. 단계 a)의 수행에 동시에 샘플과 접촉되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 절단된 변이체를 포함하는 대조군 반응을 수행하였다.
도 6b는 전개 후 핵산 측방 유동 스트립의 사진을 제공한다. 명확한 양성 신호는 표적 핵산의 존재 하에 관찰 가능하고, 표적이 부재하는 대조군에서는 관찰되지 않았으며, 이는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제1 또는 제2 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 방법의 실시양태의 강력한 가능성 및 분석의 올바른 설계 및 기능을 나타낸다. 예상대로 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 절단된 형태를 사용하는 대조군 분석에서 매우 최소한의 신호만이 관찰되었으며, 이는 효율적인 검출 종의 생성을 위해 단계 a)에서 증폭 수행과 동시에 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 정확한 혼성화에 대한 요건을 보여준다.
실시예 3
2개 이상의 상이한 표적 핵산의 존재가 동일한 샘플에서 검출되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행
이 실시예는 샘플에서 2개 이상의 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법의 가능성을 나타낸다. 상기 방법의 프라이머 외에 2개의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하면 동일한 샘플에서 2개 이상의 서로 다른 표적 핵산의 검출에 이상적으로 적합한 방법에서 증폭 산물의 검출을 위한 혼입 접근법을 제공한다. 이 실시예에서 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 서열 특이적 혼성화를 기반으로 하여 대안적 검출 종을 차별적으로 검출하는 능력이 입증되었다.
첫째, 2개 이상의 상이한 표적 핵산의 검출에 사용되는 방법의 능력을 입증하기 위해, 본 발명자들은 2개의 별개 표적 (A 및 B) 검출을 위해 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브 세트를 개발하였다. 각 경우에 5'에서 3' 방향으로 5' 비오틴 변형, 7개의 염기 안정화 영역, 5개의 염기의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 11 내지 13개의 염기의 제한 효소의 절단 부위에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 표적 A 또는 B의 3' 말단에 상보성인 영역 및 3' 포스페이트 변형의 특성을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 표적 A 또는 B의 5' 말단에 상보성인 12 내지 14개의 염기 영역, 5 X 티미딘 염기의 중성 스페이서 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티로서 12개 염기의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 측방 유동 스트립 상의 상이한 위치에의 각 검출 종의 부착을 가능하게 하기 위해 상이한 서열을 사용하여 각 표적에 대한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 부착 모이어티의 서열을 설계하였다. 분리된 위치에서 각각의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 검출 모이어티에 대한 역보체 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 30 pmol의 개별 스폿을 포함하는 핵산 측방 유동 스트립을 제조하였다.
비오틴 결합 단백질에 흡착된 0.032mgml-1 탄소를 포함하는 적절한 완충액 65μl 중 표적 A 및 표적 B에 대한 0.5pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 표적 A 및 B에 대한 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 0.5pmol을 포함하는 반응을 제조하였다. 각 표적의 다른 수준 (+ = 0.1pmol; ++ = 1pmol)을 개별 반응에 개별적으로 첨가하고 두 표적을 함께 첨가하였다. 무 표적 대조군 (NTC)을 또한 수행하였다.
도 7a는 실험에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 검출 종을 포함하는 탄소의 침착에 해당하는 명확한 흑색 스폿이 두 표적 수준 및 두 분석 모두에서 관찰되었다. 또한 두 반응을 동시에 수행했을 때 두 표적 A와 B에 해당하는 신호가 관찰되었다. 다른 분석 사이의 백그라운드 신호 또는 누설 신호는 관찰되지 않았다.
상기 방법의 강건성을 입증하기 위해, 샘플에서 소정의 서열의 3개의 상이한 표적 핵산의 검출을 위한 방법의 가능성을 입증하기 위해 3개의 개별 분석을 개발하기 위한 추가 실험을 계속하였다. 위에서 설명한 것과 유사한 방법론을 사용하였다. 도 7b는 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 표적 P1, P2 및 P3을 표시된대로 개별적으로 그리고 다양한 조합으로 첨가하였다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 검출 모이어티에 대한 역보체를 핵산 측방 유동 스트립에 별도의 라인으로 프린팅하였다. 흑색 신호는 분석과 백그라운드 신호 사이에 의도하지 않은 누설 신호없는 신속하고 감응성인 검출을 위해 모든 경우에 예상 위치에 국한된 탄소 부착 검출 종의 침착을 나타낸다. 4개의 개별 분석을 포함하는 균등한 실험은 샘플에서 소정의 서열의 4개의 다른 표적 핵산 (P1, P2, P3 및 P4)을 검출하는 방법의 가능성을 나타내며, 결과는 도 7c에 표시되어 있다. 이 4개의 표적 실험에서 P4는 모든 반응에 양성 대조군으로 존재했으며 다른 표적은 개별 반응에 개별적으로 첨가하였다. 표시된 측방 유동 스트립의 사진은 예상 위치에 명확한 흑색 밴드를 나타내며, 이는 탄소에 결합된 관련 검출 종의 존재에 해당한다. 이러한 다중 분석은 다양한 병원체에 의해 유발되는 질병에 대한 진단 시험에 사용되는 방법의 가능성을 보여주고, 대조군 분석의 검출 종의 존재가 검출되면 상기 방법이 성공적으로 수행되었고 측방 유동 스트립 상의 다른 검출 종 중 하나 이상의 시각화는 적절한 임상 표본의 관련 원인 병원체(들)의 존재를 나타낸다. 하나 초과의 병원체가 동일한 표본에 존재하는 공동 감염을 관찰하는 감염성 질환 분야와 같은 진단 응용 분야에서는 드물지만, 본 발명의 방법은 검출되는 다중복합 반응에서 표적의 임의의 조합에 대해 매우 다양하다. 도 7d는 4개의 타겟 (P1, P2, P3 및 P4)의 서로 다른 조합이 첨가된 실험의 결과를 보여준다. 비특이적 배경없이 각 표적이 누락될 때 각 표적을 개별적으로 검출하고 다른 3개의 표적을 검출하는 능력은 본 발명의 방법의 현저한 검출 특이성을 나타낸다.
상기 기재된 다양한 다른 실험에서, 본 발명자들은 또한 매우 낮은 표적 농도, 예를 들어, 예를 들어 1zmol (600 카피) 또는 17ymol (10 카피)에서 3 내지 5개의 표적의 검출을 위한 다중 분석을 수행하였다. 이 실시예에서 본 발명자들은 샘플에서 소정의 서열의 2개 이상의 서로 다른 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법의 가능성과 예를 들어, 핵산 측방 유동에 의한 신속하고 저가의 신호 검출 가능성을 명백하게 입증하였다. 2개 이상의 상이한 표적 핵산이 동일한 샘플에서 쉽게 검출될 수 있다는 것은 상기 방법의 특이하고 유리한 특성이다. 검출되는 각각의 추가 표적 핵산에 대해, 추가적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트가 필요하며, 이는 공지된 방법에서 2개 이상의 상이한 표적 핵산의 존재를 검출하는데 상당한 문제를 제시하는데, 이는 추가적인 프라이머가 비특이적 증폭 산물을 형성하는 경향의 증가로 이어지기 때문이다. 상기 방법에서, 이러한 문제는 변형된 염기의 사용, 개선된 효소 선택 및 추가적인 서열 특이적 혼성화 사건을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 검출 종의 형성으로 인한 것과 같은 특이성 향상에 의해 극복된다.
실시예 4
표적 핵산의 제1 및 제2 혼성화 서열이 5개의 염기로 분리되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행
이 실시예는 표적 핵산에서 제1 및 제2 혼성화 서열이 5개의 염기로 분리되는 방법의 수행을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 존재하지 않고 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 제1 및 제2 혼성화 서열 사이에 갭이 존재하도록 설계될 때 병원체 증폭 산물에서만 병원체 의존 방식으로 생성되는 병원체 유래 서열을 사용하는 능력은 초기 합성 또는 프라이머-프라이머 결합으로부터 발생하는 임의의 백그라운드 신호를 극복할 수 있는 방법의 실시양태에서 강화된 특이성에 대한 가능성을 제공한다. 상기 실시양태에서, 증폭 산물이 정확한 병원체 유래 서열을 포함할 때 병원체 검출 종만이 생성되도록 두 혼성화 영역 사이의 갭을 이용하여 제1 또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 서열 특이적 혼성화를 설계한다.
이 실시예에서 본 발명자들은 병원체 유래 RNA 내에서 제1 및 제2 혼성화 서열 사이의 갭의 서열만이 상이한 다양한 상이한 증폭 산물에 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화를 입증하기 위한 다양한 분석을 설계하였다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 증폭 산물에 5' 말단에 적어도 하나의 종에 대한 11 염기 혼성화 영역을 포함하도록 설계하였다. 상기 영역은 두 프라이머 사이의 갭으로부터 유래된 증폭 산물 내의 추가 병원체 유래 서열에 대한 역보체 서열의 5개의 염기 서열 및 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 역보체 서열의 7개의 염기 서열로 구성되었다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 또한 5'에서 3' 방향으로 5X 티미딘 염기의 중성 스페이서 및 고체 물질에 대한 이의 부착을 위한 12개의 염기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 상기 모이어티의 역보체 서열의 30pmol의 올리고뉴클레오타이드로 프린팅된 니트로셀룰로스 핵산 유동 스트립을 제조하였다. 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 동일한 서열을 포함하지만 5' 비오틴 변형, 3' 포스페이트 변형 및 제한 효소 절단 부위의 위치의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하도록 설계하였다.
각각은 제1 및 제2 혼성화 서열에 해당하는 정확한 서열을 갖지만 제1 및 제2 혼성화 서열 사이에 5개의 염기가 상이한 4개의 상이한 인공 표적 핵산 서열 (T1, T2, T3 및 T4)을 설계하였다: T1은 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 11개 염기 혼성화 영역에 대해 완전히 상보성인 검출을 위한 정확한 염기를 포함하고; T2는 갭의 5개의 염기 중 4개의 미스매칭을 포함하고; T3는 갭의 5개 염기 중 4개 염기가 제거되어 증폭 산물의 종이 4개의 염기만큼 더 짧도록 설계하였다. T4는 갭의 5개의 염기 중 2개의 미스매칭을 포함한다.
적절한 반응 완충액 중 총 60μl의 반응 부피로 3.6pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 1.8pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 2.4pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 300μM Sp-dATP-α-S, 60μM dTTP, dCTP, dGTP; 12U 제한 효소; 12U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소를 포함하는 반응을 제조하였다. 1amol 표적 (T1, T2, T3 또는 T4)을 각 반응에 첨가한 후 45℃에서 6.5분 동안 인큐베이션한 다음 60μl 반응 중 53.5μl를 측방 유동 스트립에서 구동시켰다. 측방 유동 스트립에 반응을 적용하기 전에 1.5pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 비오틴 결합 단백질에 흡착된 2μg의 탄소를 접합체 패드에 침착시키고 5분 동안 건조되도록 하였다.
도 8은 실험에서 획득된 핵산 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 표적 T1로 획득된 스트립은 니트로셀룰로스의 고체 물질에 부착된 탄소 부착 검출 종에 해당하는 명확한 흑색 라인을 보여주며, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 포함하는, 이 실시예에서 개발된 분석이 올바르게 기능하고, 신속하고 감응성인 검출 가능성이 있음을 나타낸다. 표적 T2 및 T3으로 수행된 반응에서는 양성 신호에 해당하는 임의의 탄소가 나타나지 않았으며, 이는 4개의 미스매칭 및 4개의 염기의 제거 둘 모두가 반응에서 생성된 사전-검출 종에 효과적으로 혼성화하는 제2 올리고뉴클레오타이드의 능력을 제거한다는 것을 나타낸다. T4를 사용하여 생성된 스트립에서 매우 희미한 신호가 관찰되었는데, 이는 2개의 미스매칭 염기만이 존재하면 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브가 사전-검출 종에 성공적으로 혼성화하여 스트립 상의 라인에 결합할 수 있는 검출 종을 생성하는 능력에 상당한 손실이 초래됨을 나타낸다. 반복 반응을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여, 모든 표적과의 모든 반응이 올바르게 기능하고 유의한 양의 증폭 산물이 생성되었는지를 확인하였다. 예상되는 크기 변화는 4개의 염기가 절단된 표적 T3으로 수행한 반응에서 관찰 가능하였다.
이 실시예는 본 발명의 필수 특성인 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브가 증폭 산물의 신속하고 감응성인 검출을 제공할뿐만 아니라, 프라이머 혼성화 단독으로 인한 것 이상의 증폭 산물에 대한 추가 병원체 서열 기반 특이성 검사를 제공하는데 사용될 수 있는 방법을 보여준다. 이 강력한 기술은 초기 합성 또는 프라이머-프라이머 결합으로 인한 특정 분석에서 비 표적 특이적 백그라운드 증폭으로 인한 종래 기술 방법의 공지된 문제를 극복한다. 이는 상기 방법이 종래 기술 방법에 비해 향상된 특이성을 나타내고, 감응성인 검출 및 신속하고 저가의 결과 시각화를 유지함을 나타낸다.
실시예 5
제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 고체 물질에 대한 부착을 가능하게 하는 모이어티가 항원이고 해당하는 항체가 고체 표면, 니트로셀룰로스 측방 유동 스트립에 부착되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행
본 발명에 사용되는 방법에서, 다수의 상이한 모이어티가 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 위한 모이어티로서 사용될 수 있다. 이 실시예는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티가 항원이고 해당하는 항체가 고체 표면 니트로셀룰로스 측방 유동 스트립에 부착되는 방법이 수행될 수 있음을 나타내는 인공 검출 종을 사용한다.
제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성 동안 첨가된 3' 디곡시게닌 NHS 에스테르 변형 및 증폭 산물 중 적어도 하나의 종에 대한 상동성 영역을 포함하는 32개의 염기 서열을 포함하도록 설계하였다. 양으로부터 정제된 Fab 단편 항-디곡시게닌 항체 (Sigma-Aldrich)를 스폿팅 (spotting) 및 공기 건조에 의해 핵산 측방 유동 스트립에 고정시켰다.
다양한 수준의 표적 (+++ = 1 pmol; ++ = 0.1 pmol; + = 10fmol; NTC = 무 표적 대조군)이 비오틴 결합 단백질에 흡착된 0.016 mgml-1의 탄소를 포함하는 탄소 핵산 측방 유동 반응을 사용하여 검출에 필요한 시약을 포함하는 고안된 반응 완충액 60μl에 첨가된 실험에서 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 수행을 입증하였다. 2.5mM 보레이트 및 0.5% Tween 20을 포함하는 0.2μl 완충액에서 스트립 상에 스폿팅된 0.5μg의 항-디곡시게닌 Fab 단편으로 스트립을 제조하였다. 용액을 2시간 동안 측방 유동 스트립의 니트로셀룰로스 막으로 건조되도록 두었다. 반응을 45℃에서 2분 동안 인큐베이션하여 고안된 검출 종을 형성시킨 후, 각 반응의 전체 반응 혼합물을 측방 유동 스트립에 적용하였다.
도 9는 실험에서 생성된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 측방 유동 스트립의 탄소 침착에 해당하는 흑색 스폿이 각 표적 수준에서 관찰 가능하고, NTC에서는 관찰 불가능하며, 이는 검출 종의 특이적 검출을 나타낸다. 검출 모이어티 (탄소)의 부착을 위한 비오틴 기반 친화도 상호작용과 고체 물질 부착 모이어티에 대한 항체 기반 친화도 상호작용의 조합을 입증하였다. 이 실시예는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착에 사용할 수 있는 다양한 접근법의 관점에서 방법의 다양성을 나타내는 것이다.
실시예 6
제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 고체 물질에 대한 부착을 가능하게 하는 모이어티가 3개 염기 DNA 서열 모티프의 4개의 반복 카피를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열의 역보체가 고체 물질에 부착되는 본 발명에 사용되는 방법의 수행
이 실시예는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티가 3개 염기 DNA 서열 모티프의 4개의 반복 카피를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드인 방법의 수행을 나타낸다. 전술한 바와 같이, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 검출 모이어티로서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법의 실시양태는 상기 방법의 간단하고 다양한 양상을 제시하며, 이는 핵산 측방 유동에 의한 검출을 용이하게 하고 동일한 샘플에서 다수의 상이한 표적 핵산의 검출을 용이하게 가능하게 한다. 또한, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 검출 모이어티를 사전에 규정하고 효율적인 스트립 상 혼성화를 위해 최적화하여 검출 감응성을 향상시키고 핵산 측방 유동 스트립의 효율적인 규모 확대 제조를 제공할 수 있다.
상기 방법의 일 양상에서, 본 발명자들은 DNA 서열 모티프의 다중 반복 카피로 구성된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 검출 모이어티를 사용함으로써 스트립 상 혼성화에 대한 놀라운 개선을 관찰하였다. 이 실시예는 측방 유동 스트립에 직접 부착된 제2 올리고뉴클레오타이드를 사용한 분석의 수행이 3개 염기의 DNA 서열 모티프의 4개의 반복 카피를 포함하는 단일 가닥 검출 모이어티의 사용에 의해 실질적으로 향상되고, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열의 역보체가 측방 유동 스트립에 부착되는 다중 병렬 실험의 결과를 제시한다.
실시예 6.1: 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 방법의 실시양태를 사용한 분석을 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 5' 비오틴 변형; 7개의 염기의 중성 영역; 닉형성 효소가 아닌 제한 효소 인식 부위의 5개 염기; 제한 효소에 대한 절단 부위에 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 표적의 제1 혼성화 영역에 혼성화할 수 있는 13개 염기 영역; 및 3' 포스페이트 변형을 포함하고, 비오틴 변형은 비색 염료, 탄소 나노입자와 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하고, 포스페이트 변형은 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 그의 연장을 차단하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 총 25개 염기 길이로 설계하였다.
동일한 표적 종 (I 및 II)을 검출하기 위해 2개의 대안적인 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 표적에서 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 14개 염기 영역의 3X 반복; 및 9X 티미딘 염기 스페이서를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 'I'를 설계하였다. 30pmol의 프로브를 포함하는 스폿으로 핵산 측방 유동 스트립을 제조하였다.
5'에서 3' 방향으로 표적에서 제2 혼성화 영역의 역보체에 혼성화할 수 있는 14개의 염기 영역; 5 X 티미딘 염기의 중성 스페이서; 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 고체 물질에 대한 부착을 가능하게 하는 모이어티로서 작용하는 3개 염기 서열 모티프의 4X 반복을 포함하는 12개 염기의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 대안적인 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 'II'를 설계하였다.
5'에서 3' 방향으로 11 X 티미딘 염기 스페이서; 고체 물질과 제2 올리고뉴클레오타이드 II의 부착을 가능하게 하는 모이어티를 형성하는 3개 염기 서열 모티프에 대한 역보체의 12X 반복을 포함하는 36개 염기 영역을 포함하는 추가의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 II의 경우, 상기 추가 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 30pmol로 스폿팅된 핵산 측방 유동 스트립을 제조하였다.
비오틴 결합 단백질에 흡착된 0.016mgml-1 탄소를 포함하는 적절한 완충액 60μl에 0.5pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브 I 및 II의 수행을 시험하기 위한 반응을 수행하였다. 동일한 방식이지만 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 II의 0.5pmol을 첨가하여 II에 대한 반응을 제조하였다. 핵산 표적 (설계된 분석 시약에서 생성된 증폭 산물 내 적어도 하나의 종을 나타내는 단일 가닥 DNA 표적)을 다양한 수준으로 첨가하였다 (+++ = 1pmol, ++ = 0.1pmol, NTC = 무 표적 대조군). 제조된 반응을 45℃에서 2분 동안 인큐베이션한 후, 전체 반응 혼합물을 적절한 핵산 측방 유동 스트립에 로딩하였다.
도 10a는 실험에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 보여주며, 좌측 패널은 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 I의 결과를 표시하고 우측 패널은 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 II의 결과를 표시한다. 탄소 부착 검출 종의 침착에 해당하는 흑색 스폿을 표적의 존재하에 시각화하였다. 반복 서열 모티프를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 II의 경우 모든 표적 수준에서 더 강한 신호를 관찰하였다.
실시예 6.2: 상기 방법의 상기 실시양태의 다양성 및 그의 광범위한 적용성을 입증하기 위해 완전히 상이한 표적 핵산에 대해 별도의 분석을 다음에 설계하였다. 다시 'I' 및 'II'로 지칭되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 2개의 버전 및 다양한 표적 수준 (+++ = 1pmol, ++ = 0.1pmol, + = 0.001pmol)에 의해 올리고뉴클레오타이드 프로브를 실시예 6.1에 기재된 것과 유사한 방식으로 단일 가닥 DNA인 관련 표적 핵산에 대해 설계하였다. 도 10b에 표시된 생성된 측방 유동 스트립의 사진에 표시된 바와 같이 훨씬 더 놀라운 효과를 관찰하였다. 더 낮은 2개의 표적 수준에서 시험된 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 I는 어떤 신호도 생성하지 않았으며, 해당하는 반복 서열 올리고뉴클레오타이드 프로브 II는 침착된 탄소의 흑색 스폿으로 표시되는 명확한 양성 신호를 생성하였다.
이 실시예는 DNA 서열 모티프의 반복 카피를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 검출 모이어티를 사용하는 측방 유동 혼성화 기반 검출에 대한 현저한 개선을 보여준다. 이는 100배의 검출 종의 핵산 측방 유동 기반 검출의 감응성의 개선이 획득될 수 있음을 보여준다. 신호의 강도가 향상되고 신호가 더 빠르게 발생하고 이는 본 발명의 상기 실시양태가 핵산 측방 유동과 같은 신속한 검출을 포함하는 적용에 쉽게 적용될 수 있는 가능성을 나타낸다. 또한 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브에 부착된 검출 모이어티로서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있는 가능성이 예시된다.
실시예 7
임상 표본에서 RNA 바이러스 검출을 위해 본 발명에 사용되는 방법의 사용
이 실시예는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 증폭 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되고, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티는 3개 염기 DNA 서열 모티프의 4개의 반복 카피를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열의 역보체가 고체 물질에 부착되는 방법의 실시양태를 사용하여 임상 표본에서 RNA 바이러스를 검출하는 방법의 수행을 보여준다. 다양한 조사에서 본 발명자들은 바이러스 게놈 추출물과 같은 RNA 표적의 매우 낮은 카피를 통상적으로 검출하였다. 예를 들어, 정량화된 바이러스 게놈 추출물을 사용하여 본 발명자들은 본 발명의 방법을 사용하여 5분 미만의 증폭 단계 a)에 의해 총 10분 이내에 바이러스의 100개 미만의 게놈 균등 카피를 검출하였다. 이 놀라운 속도와 감응성은 상기 방법을 진단 분야에 적용할 수 있는 가능성을 보여준다. 따라서 이 실시예에서 본 발명자들은 병원체 단일 가닥 RNA 바이러스를 검출하기 위한 분석을 개발했으며 바이러스에 감염된 임상 표본을 사용하여 분석의 수행을 입증하였다.
5'에서 3' 방향으로 각 염기 사이에 포스포로티오에이트 결합을 포함하도록 합성된 8개 염기의 안정화 영역; 닉형성 효소가 아닌 제한 효소에 대한 인식 부위의 5개 염기; 및 단일 가닥 RNA 바이러스 게놈 내의 영역을 표적화하도록 설계된 표적 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 역보체 서열을 포함하는 12개 염기 혼성화 영역을 포함하는 총 25개 뉴클레오타이드 염기 길이의 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다. 동일하지만 포스포로티오에이트 결합이 부재하는 안정화 영역 및 동일하지만 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 12개 염기 혼성화 영역을 포함하는 제한 효소 인식 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였다. 이 실시예에서 제1 제한 효소와 제2 제한 효소는 동일한 제한 효소이다. 표적 핵산의 제1 및 제2 혼성화 서열은 0개의 염기로 분리된다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머를 프라이머의 역보체에서 절단 부위의 하류의 뉴클레오타이드 염기가 아데노신이고, 알파 티올 dATP가 상기 방법에 사용하기 위한 변형된 dNTP로 사용되도록 표적 핵산을 사용하여 설계하였다. 포스포로티오에이트 변형을 상기 역보체 가닥의 절단을 차단하기 위해 가닥 대체 DNA 중합효소 또는 역전사효소에 의해 삽입한다.
5'에서 3' 방향으로 합성 중에 첨가된 5' 비오틴 변형으로서, 상기 비오틴 변형은 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브와 비색 염료 탄소 나노입자의 부착을 가능하게 하는 5' 비오틴 변형, 8개 염기의 안정화 영역; 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브에서 상기 제한 효소에 대한 절단 부위가 합성 동안 첨가된 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 보호되는 닉형성 효소가 아닌 제한 효소에 대한 인식 서열의 5개 염기; 증폭 산물에서 적어도 하나의 종에 혼성화할 수 있는 11개의 염기 영역; 및 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 연장을 방지하는 3' 포스페이트 변형을 포함하는 총 24개 염기 길이의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다.
5'에서 3' 방향으로 증폭 산물에서 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 14개 염기 영역; 5 X 티미딘 염기를 포함하는 스페이서; 3개의 염기 DNA 서열 모티프의 4 X 반복, 측방 유동 스트립에 고정된 역보체를 포함하는 총 31개 염기 길이의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 11 X 티미딘 염기를 포함하는 중성 스페이서; 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 3개의 염기 서열 모티프에 상보성인 3개의 염기 서열 모티프의 12 X 반복을 포함하는 총 47개 염기 길이의 고정된 측방 유동 프린팅된 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 다른 5X 삼중체 반복; 5 X 티미딘 염기를 포함하는 중성 스페이서 및 합성 중에 첨가된 3' 비오틴 분자를 포함하는 20개의 염기 길이의 측방 유동 대조군 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 대조군 올리고뉴클레오타이드를 측방 유동 스트립의 역보체에 결합시켜, 성공적인 탄소 측방 유동 절차를 확인한다.
1.8pmol의 제1 프라이머; 9.6pmol의 제2 프라이머; 3.6pmol의 제1 프로브; 1pmol의 제2 프로브; Enzo Life Sciences으로부터의 300μM Sp-dATP-α-S; 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 28U의 제한 효소; 14U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소; 35U의 바이러스 역전사효소; 3.5U RNaseH 및 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소 3μg을 포함하는 반응을 제조하였다. 7개의 바이러스 양성 샘플 및 6개의 바이러스 음성 임상 샘플 (PCR 분석으로 검증)을 포함하는 임상 환경에서 환자로부터 수집한 5μl의 비인두 도말물 샘플 (Discovery Life Sciences에서 공급). 적절한 반응 완충액에서 70μl 부피로 반응을 수행하였다. 반응을 45℃에서 4분 30초 동안 인큐베이션한 후 대조군 올리고뉴클레오타이드에 대한 역보체 (상부 라인) 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 3개의 염기 삼중체 반복 모이어티에 대한 역보체 약 50pmol (하부)로 프린팅된 핵산 측방 유동 스트립에 전체 반응을 로딩하였다.
도 11은 이 실시예의 수행에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 화살표는 성공적인 측방 유동 구동을 확인시키고, 따라서 양성 및 음성 분석 모두에서 나타나는 대조군 올리고뉴클레오타이드에 대한 역보체 (CTL)의 위치 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 삼중체 반복 모이어티에 대한 역보체가 프린팅되어 (+), 이에 따라 양성 신호가 나타나는 위치를 나타낸다. 상부 패널 (+ve)은 바이러스 양성 임상 샘플로 획득된 결과를 보여주고 하단 패널 (-ve)은 바이러스 음성 샘플로 획득된 결과를 보여준다. 표적 핵산의 존재를 나타내는 명확한 흑색 라인이 각각의 양성 샘플에 존재하며, 이는 본 발명의 방법에 의한 임상 표본의 신속한 검출을 보여준다. 위양성은 관찰되지 않았으며, 이는 초기 합성 또는 프라이머-프라이머 결합을 통한 것과 같이 검출 종의 비특이적 생성이 완전히 부재함을 나타낸다. 상이한 임상 표본 내에 존재하는 상이한 표적 핵산 카피 수 수준에 걸친 상기 방법의 견고성과 감응성을 나타내는 위음성은 관찰되지 않았다.
실시예 8
다른 온도에서의 본 발명에 사용되는 방법의 수행
본 발명에 사용되는 방법은 광범위한 온도에 걸쳐 효율적으로 수행될 수 있으며 온도 순환, 임의의 고온 또는 가온 시작, 예열 또는 제어된 온도 감소가 필요하지 않다. 이 실시예는 다양한 온도 범위에서 일반적인 분석의 수행을 보여준다. 적절한 온도가 최적인 효소를 선택하고, 이의 혼입 후 혼성화의 용융 온도를 감소시키는 포스포로티오에이트 염기를 사용하여 증폭이 놀랍도록 광범위한 온도에서 수행되고 일반적으로 낮은 온도 범위를 포함하는 분석이 쉽게 개발되었다. 또한 별도의 실험에 의해 본 발명에 사용되는 방법을 사용하여 수행된 분석이 단계 a)의 개시 전에 샘플을 예열할 필요 없이 수행될 수 있고, 온도가 단계 a)에서 증폭 수행 동안 증가될 때 수행 손실이 관찰되지 않는 것으로 나타난다.
실시예 8.1: 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 분석을 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 7개의 염기의 중성 영역; 제한 효소의 인식 부위; 및 표적 핵산에서 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 11개 염기 영역, DNA 표적을 포함하는 제1 프라이머를 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 7개의 염기의 중성 영역; 제1 프라이머와 동일한 제한 효소에 대한 인식 부위; 및 표적 핵산에서 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 12개 염기 영역을 포함하는 제2 프라이머를 설계하였다.
5'에서 3' 방향으로 5' 비오틴 변형; 6개의 염기의 중성 영역; 제2 위치에 미스매칭을 포함하는 제한 효소의 인식 부위의 염기; 제6 위치에서 G-클램프 변형을 포함하는 표적의 제1 혼성화 영역에 혼성화할 수 있는 10개의 염기 영역; 및 3' 포스페이트 변형을 포함하고, 비오틴 변형은 비색 염료, 탄소 나노입자와 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하고, 포스페이트 변형은 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 그의 연장을 차단하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 총 21개의 염기로 설계하였다.
5'에서 3' 방향으로 표적에서 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 11개 염기 영역; 4 X 티미딘 염기 스페이서 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티로서 작용하는 3개의 염기 서열 모티프의 4 X 반복을 포함하는 12개의 염기를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 11 X 티미딘 염기 스페이서; 제2 올리고뉴클레오타이드와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티를 형성하는 3개의 염기 서열 모티프에 대한 역보체의 11 X 반복을 포함하는 33개의 염기 영역을 포함하는 추가 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 경우 상기 추가 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 30pmol로 스폿팅하여 핵산 측방 유동 스트립을 제조하였다.
적절한 완충액 중 1.5pmol의 제1 프라이머; 1.0pmol의 제2 프라이머; 1pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; Enzo Life Sciences으로부터의 60μM Sp-dATP-α-S; 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 및, 다양한 수준의 표적 DNA (++ = 1amol, + = 10zmol, NTC = 무 표적 대조군)를 포함하는 반응을 제조하였다. 제조된 반응을 표적 온도 (I = 37oC; II = 45℃, III = 50℃ 및 IV = 55℃)에서 2분 동안 인큐베이션한 후 5U의 제한 효소 및 5U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소를 25μl의 최종 반응 부피로 마지막에 첨가하여 개시시킨다. 그런 다음 반응을 관련 표적 온도에서 5분 (T1) 또는 8분 (T2) 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 반응을 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 1.5pmol과 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소 8μg을 포함하는 75μl의 완충액으로 옮긴 후 핵산 측방 유동 스트립의 샘플 패드에 적용하였다.
도 12a는 각 표적 수준, 온도 및 시점에서 실험에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 관찰된 명확한 흑색 라인은 표적의 존재 하에 생성된 탄소 부착 검출 종의 침착에 해당한다. 모든 온도에서 매우 강력한 신호가 표적의 존재 하에 두 표적 수준 모두에서 8분 이내에 나타났으며 이는 상기 방법의 효율적인 증폭의 광범위한 온도 범위를 보여준다. NTC 샘플에서는 비특이적 증폭이 관찰되지 않았다. 45℃ 및 50℃에서 단 5분 후에 강력한 증폭이 관찰되어 이 분석의 최적 온도가 45℃ 내지 50℃일 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예 8.2: 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제1 또는 제2 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 제2 분석을 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 6개 염기의 중성 영역; 제한 효소의 인식 부위; 및 표적 핵산에 대한 12개 염기 혼성화 영역을 포함하는 제1 및 제2 프라이머를 모두 설계하였다. 표적의 제1 및 제2 혼성화 서열이 10개의 염기로 분리되도록 프라이머를 설계하였다.
5'에서 3' 방향으로 5' 비오틴 변형; 6개의 염기의 중성 영역; 제4 위치에 미스매칭을 포함하는 제한 효소의 인식 부위의 염기; 표적에서 제1 혼성화 영역에 혼성화할 수 있는 12개 염기 영역; 및 3' 포스페이트 변형을 포함하고, 비오틴 변형은 비색 염료, 탄소 나노입자와 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하고, 포스페이트 변형은 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 그의 연장을 차단하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 총 23개 염기 길이로 설계하였다.
5'에서 3' 방향으로 표적에서 제2 혼성화 서열의 역보체의 3개 염기에 혼성화할 수 있는 13개 염기 영역 및 제1 및 제2 혼성화 서열 사이의 10개의 염기 갭; 3 X 티미딘 염기 스페이서 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티로서 작용하는 3개의 염기 서열 모티프의 4 X 반복을 포함하는 12개 염기를 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하였다. 5'에서 3' 방향으로 11 X 티미딘 염기 스페이서; 및 제2 올리고뉴클레오타이드와 고체 물질의 부착을 가능하게 하는 모이어티를 형성하는 3개 염기 서열 모티프에 대한 역보체의 12X 반복을 포함하는 36개 염기 영역을 포함하는 추가 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다. 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 경우 핵산 측방 유동 스트립을 상기 추가 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 30pmol로 스폿팅하여 제조하였다.
적절한 완충액 중에 6pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 8pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 6pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; Enzo Life Sciences으로부터의 60μM Sp-dATP-α-S; 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소 60μg; 및, 적용 가능한 경우, 표적을 포함하는 반응을 제조하였다. 제조된 반응을 시작 온도 (I = 15℃; II = 45℃)에서 2분 동안 인큐베이션한 후 20U의 제한 효소, 20U의 바실루스 가닥 대체 DNA 중합효소 및 40U의 역전사효소를 100μl의 최종 반응 부피로 마지막에 첨가하여 반응을 개시시켰다. 효소 첨가 후, 시작 온도가 15℃인 반응은 다른 반응과 함께 즉시 45℃로 전환되었다.
이어서 반응을 45℃에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 반응을 핵산 측방 유동 스트립의 샘플 패드로 옮겼으며, 샘플 패드는 3pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하였다. 도 12b는 각 온도 인큐베이션 조건에서 실험에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 관찰된 명확한 흑색 라인은 표적의 존재 하에 생성된 탄소 부착 검출 종의 침착에 해당한다. 증폭 단계 a) 동안 온도가 15℃에서 45℃로 증가한 반응에서는 차이가 관찰되지 않았다. 예열 반응에서와 동일한 현저한 증폭 속도가 발생했으며 NTC 샘플에서는 비특이적 증폭이 관찰되지 않았다.
이 실시예 8은 본 발명에 사용되는 방법이 공지된 방법에 비해 더 낮은 최적 온도 특성에 의해 분석을 용이하게 수행하는데 사용될 수 있고, 매우 광범위한 온도에 걸쳐 감응성인 검출에 이용될 수 있음을 나타낸다. 이는 또한 상기 방법이 예열없이 수행될 수 있고, 단계 a)의 수행 동안 온도가 증가함을 나타낸다. 저가의 진단 장치에서 상기 방법을 사용하는 경우 이러한 특성은 매우 매력적이고, 고온 및 정밀 제어 가열은 1회 사용 또는 기기 불필요 장치를 시중에서 구입할 수 없는 경우, 이러한 장치의 산물 비용을 증가시키는 복합적인 물리적 제약을 부가한다. 더욱이, 증폭 개시 전에 샘플을 예열하기 위한 공지된 방법의 요건을 회피함으로써, 상기 방법은 더 적은 사용자 단계 및 더 간단한 작동 순서로 수행될 수 있고, 따라서 이러한 진단 장치의 유용성을 증가시키고 결과에 이르는 전체 시간을 단축한다.
실시예 9
인플루엔자 A의 검출을 위해 본 발명에 사용되는 방법 대 공지된 방법의 비교 수행
이 실시예는 인플루엔자 A 표적의 검출을 위해 이 경우 WO2014/164479에 개시된 공지된 방법에 대한 본 발명에 사용되는 방법의 비교 평가를 제공한다. 공지된 방법은 닉형성 효소가 필요하고 하나 이상의 변형된 dNTP의 사용이 필요하지 않다는 점에서 본 발명에 사용되는 방법과 근본적으로 다르다. 본 발명에 사용되는 방법은 매우 우수한 감응성 및 특이성을 갖는 것으로 입증되었다.
이 비교 평가를 위해 본 발명에 사용되는 방법을 사용하여 표적 병원체 인플루엔자 A에 대한 분석을 먼저 수행하였다. 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제한 효소에 의해 절단되지 않고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되는 상기 방법의 실시양태를 이용하여 상기 분석을 설계하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 올리고뉴클레오타이드 프로브의 설계를 병원체 유래 RNA에서 제1 및 제2 혼성화 서열 사이에 6개 염기의 간격을 두고 다른 실시예에 설명된 것과 유사한 접근법에 따라 수행하였다.
실시예 9.1: 제1의 경우, 각 방법에 대한 반응을 동일한 프라이머 비율을 사용하여 수행하였다. 본 발명의 방법을 위해, 적절한 완충액 중에 2pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 2pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 1.6pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; Enzo Life Sciences으로부터의 60μM Sp-dATP-α-S; 60 μM의 각각의 dTTP, dCTP 및 dGTP; 및 표적으로서 다양한 수준의 인플루엔자 A 게놈 RNA (+++ = 10zmol; ++ = 100 카피; + = 10 카피; NTC = 무 표적 대조군)을 포함하는 반응을 제조하였다. 제조된 반응을 주변 조건 (c.20℃)에서 5분 동안 사전 인큐베이션한 후, 25μl의 최종 반응 부피에서 5U의 제한 효소, 5U의 바실러스 가닥 대체 DNA 중합효소 및 10U의 역전사효소를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 효소 첨가 후, 반응을 45℃에서 8분 (T1) 또는 15분 (T2) 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 75μl 완충액에서 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소 60μg을 각 반응에 첨가하고 전체 100μl 부피를 1.5pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 핵산 측방 유동 스트립으로 샘플 패드에 옮겼다.
공지된 방법의 경우, 적절한 완충액 중에 6.25pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 6.25pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 200 μM의 각각의 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP; 및 표적으로서 다양한 수준의 바이러스 게놈 RNA (+++ = 10zmol; ++ = 100 카피; + = 10 카피; NTC = 무 표적 대조군)을 포함하는 반응을 제조하였다. 제조된 반응을 주변 조건 (c.20℃)에서 5분 동안 사전 인큐베이션한 후, 25μl의 최종 반응 부피에서 4U의 Nt.BbvCI, 20U의 Bst 대형 단편 DNA 중합효소 및 10U의 M-MuLV 역전사효소를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 효소 첨가 후, 반응을 45℃에서 8분 (T1) 또는 15분 (T2) 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 75μl 완충액에서 비오틴 결합 단백질에 흡착된 탄소 60μg 및 5pmol의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 각 반응에 첨가하고 전체 100μl 부피를 5pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 핵산 측방 유동 스트립으로 샘플 패드에 옮겼다.
도 13a는 표시된 다양한 표적 수준 및 시점에서 본 발명에 사용되는 방법 (I) 및 공지된 방법 (II)을 사용한 실험에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 나타낸다. 관찰된 흑색 라인은 표적의 존재하에 생성된 탄소 부착 검출 종의 침착에 해당한다. 공지된 방법을 사용하여 임의의 신호를 관찰하기 위해서는 다회의 시도가 필요했으며 효소와 완충액의 특정 조합 및 유의하게 더 높은 수준의 프라이머, dNTP 및 효소를 사용해야 했다. 본 발명에 사용되는 방법(I)을 사용하면, 예열없이 단 8분 후 가장 짧은 시점에서도 단 10개의 카피의 가장 낮은 표적 수준에서도 생성된 검출 종을 명확하게 관찰할 수 있었다. 당업자에게 분명하지 않았던 공지된 방법을 최적화하려는 노력 후에도 가장 높은 표적 수준 (+++ = 10zmol) 및 가장 긴 시점 (15분)에서 희미한 신호만이 관찰되었다.
실시예 9.2: 더 광범위하고 명백하지 않은 시도 후에, 공지된 방법의 수행을 증가시키는 것이 가능했지만, 실시예 9.2에에 기재된 바와 같이, 매우 높은 농도의 제1 프라이머와 2:1 비율의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용해야만 가능하였다. 본 발명에 사용되는 방법은 실시예 9.1에 기재된 바와 같이 다시 수행하였다. 공지된 방법의 경우, 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 수준을 12.5pmol로 증가시킨 것을 제외하고는 실시예 9.1에서 기재한대로 반응을 수행하였다. 각 경우에 다음 표적 수준이 사용하였다: +++ = 1zmol; ++ = 100 카피; + = 10 카피; NTC = 무 표적 대조군.
도 13b는 표시된 다양한 표적 수준 및 시점에서 본 발명에 사용되는 방법 (I) 및 공지된 방법 (II)을 사용한 실험에서 획득된 측방 유동 스트립의 사진을 나타낸다. 관찰된 흑색 라인은 표적의 존재하에 생성된 탄소 부착 검출 종의 침착에 해당한다. 다시 말하지만, 본 발명에 사용되는 방법 (I)은 가장 짧은 시점 및 단 10개의 표적 카피의 가장 낮은 표적 수준에서도 신호가 관찰 가능한 놀라운 속도를 보여주었다. 공지된 방법을 사용하면 가장 높은 표적 수준 (+++ = 1zmol)에서 희미한 신호만 관찰되었으며 가장 긴 시점 (15분)에서 100개의 카피 샘플에서 매우 희미한 신호가 관찰되었다. 그러나 NTC 스트립에서도 희미한 신호가 관찰되었는데, 이는 매우 높은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 수준 및 방법이 작동하는데 필요한 효소 수준의 결과로 비특이적 산물에 해당할 수 있다. 이러한 데이터는 30분의 인큐베이션 시간이 보고된 WO2014/164479의 데이터와 일치한다. 이 공지된 방법을 사용하여 수행되는 증폭 속도를 높이기 위해 비정상적으로 높은 프라이머 수준을 첨가해야 한다는 요건은 비특이적 산물의 문제를 악화시키지 않고 총 프라이머 수준을 추가로 증가시키기 위해 추가 증가 범위가 매우 제한되어 있으므로 동일한 샘플에서 2개 이상의 다른 표적 병원체의 검출에의 적용 가능성을 크게 제한할 것이다.
이 실시예 9는 WO2014/164479에 개시된 공지된 방법에 비해 증폭이 훨씬 더 고속으로 수행되고, 더 큰 감응성 및 더 명확한 결과 신호가 생성되는 본 발명에 사용되는 방법의 현저한 우수성을 입증한다. 사전 인큐베이션없이 단 8분만에 본 발명의 방법은 공지된 방법이 표적 수준의 60X에 의한 가장 높은 표적 수준에서 15분 내에 가능했던 것보다 단 100개의 표적 카피로 더 강한 신호를 생성하였다. 이 공지된 방법에 비해 본 발명에 사용되는 방법의 장점은 닉형성 효소가 아닌 제한 효소인 다른 종류의 효소에 대한 요구 및 포스포로티오에이트 염기와 같은 하나 이상의 변형된 dNTP의 사용에 대한 요구에서 발생하며, 이는 증폭의 감응성 및 특이성을 향상시킨다. 또한, 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 사용은 신호 검출에 대한 증폭의 효율적인 연결을 가능하게 하고 검출 종의 형성 동안 효율적인 서열 기반 혼성화로부터 유도된 향상된 특이성을 용이하게 한다. 이러한 장점으로 인해 본 발명에 사용되는 방법은 진단 분야에서의 활용 및 단일 사용 또는 기기 불필요 분자 진단 시험 장치와 같은 단순한 초고속 사용자 중심의 저가의 진단 장치 개발에 이상적으로 적합하다.
실시예 10
표적 병원체 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기 세포융합 바이러스의 검출 및 식별
이 실시예는 표적 병원체 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)를 검출 및 식별하기 위한 본 발명의 키트 및 각 병원체의 검출에서의 이의 용도를 기재한다. 이 실시예에서 RSV에 대한 프라이머 쌍 및 프로브 쌍은 RSVA 및 RSVB 모두의 게놈에 보존된 서열을 표적화했다. 상기 키트는 또한 공정 대조군을 수행하기 위한 단일 가닥 대조군 핵산 및 대조군 핵산에 대한 성분 a) 프라이머 쌍, b) 제한 효소 및 c) 프로브 쌍을 포함한다. 상기 키트에서 각 병원체 및 대조군에 대한 제한효소는 동일하며, 각각의 병원체 및 대조군에 대한 프로브 쌍의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 3' 말단에서 차단되어 제한 효소에 의해 절단될 수 없다. 또한, 각 병원체에 대한 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 해당 병원체에 대한 프라이머 쌍과 혼합하여 제공된다.
각각의 병원체에 대한 프라이머 쌍을 병원체 유래 RNA에서 제1 및 제2 혼성화 서열 사이에 4 내지 8개 염기의 갭을 갖는 다른 실시예에 기재된 것과 유사한 접근법에 따라 설계하였다. 각 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 중성 영역(6 내지 8개 염기); 제한 효소에 대한 인식 서열의 5개 염기; 및 혼성화 영역(11 내지 14개 염기)을 포함한다. 각각의 경우에 프로브 쌍의 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브를 5'에서 3' 방향으로: 5' 비오틴 변형; 중성 영역(6 내지 8개 염기); 제4 위치에 미스매치를 포함하거나 제한효소에 의한 절단을 차단하는 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 제한효소 인식부위의 염기; 관련 병원체의 존재 하에 생성된 증폭 산물의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 영역(11 내지 14개 염기); 및 3' 포스페이트 변형을 포함하도록 설계하였으며, 비오틴 변형은 비색 염료, 탄소 나노입자에 대한 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하고, 포스페이트 변형은 가닥 대체 DNA 중합효소에 의한 이의 연장을 차단한다. 각각의 경우에 프로브 쌍의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 5'에서 3' 방향으로 제1 및 제2 혼성화 서열 사이의 갭 및 증폭 산물에서 제2 혼성화 서열의 역보체의 3개 이상의 염기에 혼성화할 수 있는 영역; 3 X 티미딘 염기 스페이서 및 고체 물질에 대한 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하는 모이어티로서 작용하는 3 또는 4개 염기 서열 모티프의 3 또는 4개 반복을 포함하는 12개 염기를 포함하도록 설계하였다. 추가의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 5'에서 3' 방향으로 10 또는 11 X 티미딘 염기 스페이서; 및 고체 물질에 대한 제2 올리고뉴클레오타이드의 부착을 가능하게 하는 모이어티를 형성하는 3 또는 4개 염기 서열 모티프에 대한 역보체의 반복을 포함하는 30 내지 40개 염기 영역을 포함하도록 설계하였다. 30 pmol의 상기 추가의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 스포팅된 측방 유동 스트립을 제조하였다.
대조군 프라이머 쌍의 경우, 상기 기재된 것과 유사한 접근법을 따르지만 대조군 핵산에서 제1 및 제2 혼성화 서열 사이에 갭이 없는 대조군 핵산을 검출하도록 프라이머를 설계하였다. 프로브 쌍을 전술한 것과 유사한 접근 방식을 따라 설계하였지만 프로브 쌍의 제2 올리고뉴클레오타이드에는 11 X 티미딘 염기 스페이서가 있고 반복되는 3 또는 4개 염기 서열 모티프를 포함하지 않으며 측방 유동 스트립에 직접 프린팅되었다. 상기 키트는 또한 각 병원체에 대한 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하고 절단 부위를 절단할 수 있는 닉형성 효소가 아닌 제한 효소; 역전사효소; 가닥 대체 DNA 중합효소; dNTP(dTTP, dCTP, dGTP) 및 하나의 변형된 dNTP(알파 티올 dATP)를 포함한다.
이 실시예에서 상기 키트를 시험 샘플에서 각 병원체의 바이러스 게놈 추출물의 500개 카피를 검출하는데 사용하였다. 대조군 핵산을 1 amol의 농도로 사용하였다. 증폭 후 두 반응을 조합하고 측방 유동 시험 스트립에 적용했다.
적절한 완충액, 염 및 첨가제를 포함하는 50 μl의 최종 반응 부피에서 반응을 수행하였다. 시험 샘플 대조군 핵산 및 적절한 양의 프라이머(40 내지 160 fmol/μl) 및 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브(40 내지 140 fmol/μl) 외에, 각 반응에는 Enzo Life Sciences의 60 μM Sp-dATP-α-S; dTTP, dCTP 및 dGTP 각각 60 μM; 3 μg 공액 탄소; 10U 제한 효소; 10U의 가닥 대체 DNA 중합효소 및 25U의 역전사효소가 포함되었다. 필요한 모든 성분을 첨가한 후, 반응물을 2분에 걸쳐 15℃에서 48℃로 증가하는 온도에서 인큐베이션한 후 48℃에서 7분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 반응 후, 샘플/접합체 패드 상에 침착된 각각의 병원체에 대한 5 pmol의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브를 또한 갖는 핵산 측방 유동 스트립 상에 침착시켰다.
도 14a는 표적 병원체 Flu A, Flu B 또는 RSV 중 하나를 포함하는 샘플에 대해 얻은 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 도 14b는 샘플 각각이 표적 병원체 Flu A, Flu B 또는 RSV 중 2개를 포함하는 유사한 실험에서 얻은 측방 유동 스트립의 사진을 표시한다. 병원체가 첨가되지 않은 경우(Ctrl), 및 병원체가 첨가되지 않고 대조군 핵산도 생략된 경우(NTC)의 대조군 실험을 수행하였다. 시험 스트립에서 관찰된 흑색 선은 관련 표적 병원체(들) 및/또는 대조군 핵산의 존재 하에 생성된 탄소 부착 검출 종의 축적에 해당한다. 각 병원체에 해당하는 선은 샘플에 해당 병원체가 존재할 때만 관찰되었으며, 이는 가장 흔하게 접하는 임상 상황인 샘플에 단일 표적 병원체가 존재할 때뿐만 아니라 하나 초과의 표적 병원체가 존재할 때 상기 키트의 특이성을 나타낸다. 이 실시예 10은 본 발명의 키트의 실시양태를 기재하고 해당 키트의 사용을 예시한다. 이는 본 발명의 키트가 현저하게 신속한 다중 검사에서 낮은 수준의 Flu A, Flu B 및 RSV를 매우 감응성이고 특이적으로 검출 및 식별할 수 있음을 나타낸다. 이러한 키트는 진단 분야의 활용과 단일 사용 또는 기기가 필요 없는 분자 진단 시험 장치와 같은 단순 초고속 사용자 중심의 저비용 진단 장치의 개발에 이상적으로 적합하다.
명세서 및 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "~를 포함하다" 및 "~를 포괄하는"이라는 단어, 및 "~를 포함한다" 및 "~를 포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수, 단계, 정수 그룹 또는 단계 그룹을 포함하지만, 다른 정수, 단계, 정수 그룹 또는 단계 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 특허 출원은 이의 전문이 참조로 포함된다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 모든 선택적 및/또는 바람직한 실시양태가 또한 적용되는 본 발명의 추가 양상은 다음을 포함한다:
1. 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 검출 및 식별하기 위한 키트로서, 상기 키트는 각각의 병원체에 대해:
a) 하기를 포함하는 프라이머 쌍으로서:
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
ii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
b) 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소; 및
c) 하기를 포함하는 프로브 쌍으로서:
i. 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
ii. 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍
을 포함하고;
표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 3' 말단에서 차단되고, 제한 효소에 의해 절단될 수 없고;
상기 키트는 또한
d) 역전사효소;
e) 가닥 대체 DNA 중합효소;
f) dNTP; 및
g) 하나 이상의 변형된 dNTP
를 포함하는, 키트.
2. 제1 양상에 있어서, 각각의 병원체에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 3' 말단에서 차단되고, 제한 효소에 의해 절단될 수 없는, 키트.
3. 제1 양상 내지 제 양상 중 어느 한 양상에 있어서, 병원체에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 둘 모두는 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 3' 말단에서 차단되고, 제한 효소에 의해 절단될 수 없는, 키트.
4. 제1 양상 내지 제 양상 중 어느 한 양상에 있어서, 병원체 중 적어도 하나에 대한 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 해당 병원체에 대한 제1 또는 제2 프라이머 중 하나의 혼성화 영역 또는 혼성화 영역의 역보체에 대해 5개 이상의 상보성 염기를 갖는, 키트.
5. 제5 양상에 있어서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브는 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나의 혼성화 영역에 대해 5개 이상의 상보성 염기를 갖고, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브는 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 다른 하나의 혼성화 영역의 역보체에 대해 5개 이상의 상보성 염기를 갖는, 키트.
6. 제1 양상 내지 제 양상 중 어느 한 양상에 있어서, 공정 대조군을 수행하기 위한 성분, 예컨대:
a) 하기를 포함하는 프라이머 쌍으로서:
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
ii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
b) 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소; 및
c) 하기를 포함하는 프로브 쌍으로서:
i. 대조군 핵산의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
ii. 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍
을 추가로 포함하는, 키트.
7. 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스를 검출 및 식별하는 방법으로서, 상기 방법은 각각의 병원체에 대해
a) 샘플을
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
ii. 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소;
iii. 역전사효소;
iv. 가닥 대체 DNA 중합효소;
v. dNTP; 및
vi. 하나 이상의 변형된 dNTP
와 접촉시켜, 병원체 유래 RNA의 존재 하에 증폭 산물을 생성하는 단계;
b) 단계 a)의 증폭 산물을
i. 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍과 접촉시키는 단계로서;
표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 제한 효소에 의해 절단될 수 없고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되고;
증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종과 제1 및 제2 프로브의 혼성화는 병원체 검출 종을 생성하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생성되는 병원체 검출 종의 존재를 검출하는 단계로서, 병원체 검출 종의 존재는 샘플에서 표적 병원체의 존재를 나타내는 단계
를 포함하는, 키트.
8. 제7 양상에 있어서,
a) 대조군 핵산을
i. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
를 포함하는 프라이머 쌍;
ii. 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소;
iii. 가닥 대체 DNA 중합효소;
iv. dNTP; 및
v. 하나 이상의 변형된 dNTP
와 접촉시켜서, 대조군 핵산의 존재 하에 대조군 증폭 산물을 생성하는 단계;
b) 단계 a)의 대조군 증폭 산물을
i. 대조군 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있고, 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
를 포함하는 프로브 쌍과 접촉시키는 단계로서;
제1 및 제2 프로브와 대조군 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 혼성화는 대조군 검출 종을 생성하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생성되는 대조군 검출 종의 존재를 검출하는 단계로서, 대조군 검출 종의 존재는 상기 방법의 공정 대조군으로서 작용하는 단계
와 같은 공정 대조군을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

Claims (40)

  1. 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자(Target pathogens Influenza) A 및 인플루엔자 B를 검출 및 식별(discriminating)하기 위한 키트(kit)로서, 상기 키트는 각각의 병원체에 대해
    h) 하기를 포함하는 프라이머 쌍(primer pair)으로서:
    iii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열(first hybridisation sequence)에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
    iv. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열의 상류(upstream)의 제2 혼성화 서열의 역보체(reverse complement)에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
    를 포함하는 프라이머 쌍;
    i) 닉형성 효소(nicking enzyme)는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소; 및
    j) 하기를 포함하는 프로브 쌍(probe pair)으로서:
    iii. 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 증폭 산물(amplification product) 내의 적어도 하나의 종(species)의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티(moiety)에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
    iv. 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
    를 포함하는 프로브 쌍
    을 포함하고;
    표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없고;
    상기 키트는 또한
    k) 역전사효소;
    l) 가닥 대체(strand displacement) DNA 중합효소;
    m) dNTP; 및
    n) 하나 이상의 변형된 dNTP
    를 포함하는, 키트.
  2. 제1항에 있어서, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 유래 RNA에 대한 제1 및 제2 혼성화 서열은 인플루엔자 게놈의 분절(segment) 1, 2, 3, 5, 7 또는 8 중 하나 내에 존재하거나 이로부터 유래되는, 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 병원체 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)를 검출 및 식별하기 위한 키트로서, 병원체 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 성분 a), b) 및 c)를 추가로 포함하는, 키트.
  4. 제3항에 있어서, 동일한 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 사용하여 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 호흡기 세포융합 바이러스 B 둘 모두를 검출하는, 키트.
  5. 제4항에 있어서, 호흡기 세포융합 바이러스 유래된 RNA에 대한 제1 및 제2 혼성화 서열은 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 B의 NS2 (비-구조 단백질 2), N (핵단백질), F (융합 당단백질), M (매트릭스) 또는 L (중합효소) 유전자 중 하나 내에 존재하거나 이로부터 유래되는, 키트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 병원체에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없는, 키트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 포스포로티오에이트 연결과 같은 하나 이상의 서열 미스매치(mismatch) 및/또는 하나 이상의 변형의 존재로 인해 제한 효소에 의해 절단될 수 없게 되는, 키트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 추가 영역을 포함하여, 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 혼성화하는 증폭 산물 내의 종의 3' 말단이 가닥 대체 DNA 중합효소에 의해 연장될 수 있는, 키트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체에 대한 차단된 올리고뉴클레오타이드 프로브(들)는 해당 병원체에 대한 프라이머 쌍 및/또는 제한 효소와의 혼합물로 제공되는, 키트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 둘 모두는 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 차단되고 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없는, 키트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체 중 적어도 하나에 대한 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나의 혼성화 영역은 해당 병원체에 대한 제1 또는 제2 프라이머 중 하나의 혼성화 영역 또는 혼성화 영역의 역보체에 대해 5개 이상의 상보성 염기를 갖는, 키트.
  12. 제11항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 하나의 혼성화 영역에 대해 5개 이상의 상보성 염기를 갖고, 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 영역은 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 다른 하나의 혼성화 영역의 역보체에 대해 5개 이상의 상보성 염기를 갖는, 키트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형된 dNTP는 알파 티올 변형된(alpha thiol modified) dNTP인, 키트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 병원체에 대한 제한 효소는 동일한 것인, 키트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브의 검출을 가능하게 하는 모이어티는 비색 또는 형광 염료, 또는 비오틴과 같은 비색 또는 형광 염료에 부착 가능한 모이어티인, 키트.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 물질에의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하는 모이어티는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 각각의 병원체에 대해 상이한, 키트.
  17. 제16항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 모이어티의 서열은 2 내지 4개의 염기 DNA 서열 모티프(motif)의 3개 이상의 반복 카피(repeat copy)를 포함하는, 키트.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위의 상류에 예를 들어, 5 또는 6개 염기 길이의 안정화 서열을 포함하는, 키트.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 혼성화 영역은 9 내지 16개 염기 길이인, 키트.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체 유래 RNA에서의 제1 및 제2 혼성화 서열은 0 내지 15개 염기 또는 3 내지 20개 염기, 예를 들어, 3 내지 15개 염기에 의해 분리되는, 키트.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종에서의 제1 또는 제2 단일 가닥 검출 서열은 제20항에 정의된 염기에 상응하는 서열의 적어도 3개 염기를 포함하는, 키트.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 대조군(process control)을 수행하기 위한 성분, 예컨대:
    b) 하기를 포함하는 프라이머 쌍으로서:
    iii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및
    iv. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
    를 포함하는 프라이머 쌍;
    d) 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소; 및
    e) 하기를 포함하는 프로브 쌍으로서:
    iii. 대조군 핵산의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
    iv. 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
    를 포함하는 프로브 쌍
    을 추가로 포함하는, 키트.
  23. 제22항에 있어서, 대조군 핵산을 추가로 포함하는, 키트.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 병원체 검출 종 및/또는 대조군 핵산의 존재 하에 생성되는 대조군 검출 종의 존재를 검출하는 수단을 추가로 포함하는, 키트.
  25. 제24항에 있어서, 병원체 검출 종 및/또는 대조군 검출 종의 존재를 검출하는 수단은 핵산 측방 유동(lateral flow)인, 키트.
  26. 제25항에 있어서, 핵산 측방 유동은 고체 물질에의 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 서열 특이적 혼성화할 수 있는 고정된 핵산을 이용하는, 키트.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체 검출 종 및/또는 대조군 검출 종의 존재를 검출하는 수단은 예를 들어, 탄소 또는 금, 바람직하게는 탄소를 사용하여 비색 또는 전기화학적 신호를 생성하는, 키트.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 키트를 포함하는 장치(device).
  29. 제28항에 있어서, 전원 장치인, 장치.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 가열 수단을 포함하는, 장치.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 사용 진단 장치인, 장치.
  32. 샘플에서 표적 병원체 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스를 검출 및 식별하는 방법으로서, 상기 방법은 각각의 병원체에 대해
    d) 샘플을
    vii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 병원체 유래 RNA 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
    를 포함하는 프라이머 쌍;
    viii. 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소;
    ix. 역전사효소;
    x. 가닥 대체 DNA 중합효소;
    xi. dNTP; 및
    xii. 하나 이상의 변형된 dNTP
    와 접촉시켜, 병원체 유래 RNA의 존재 하에 증폭 산물을 생성하는 단계;
    e) 단계 a)의 증폭 산물을
    ii. 병원체 유래 RNA의 존재 하에 생성되는 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
    증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
    를 포함하는 프로브 쌍과 접촉시키는 단계로서;
    표적 병원체 중 적어도 하나에 대한 프로브 쌍의 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나는 이의 혼성화 영역의 3' 말단에서 DNA 중합효소에 의한 연장으로부터 차단되고, 상기 혼성화 영역 내에서 제한 효소에 의해 절단될 수 없고, 단계 a)의 수행과 동시에 샘플과 접촉되고;
    증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종과 제1 및 제2 프로브의 혼성화는 병원체 검출 종을 생성하는 단계; 및
    f) 단계 b)에서 생성되는 병원체 검출 종의 존재를 검출하는 단계로서, 병원체 검출 종의 존재는 샘플에서 표적 병원체의 존재를 나타내는 단계
    를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 표적 병원체 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스를 검출 및 식별하기 위해, 병원체 호흡기 세포융합 바이러스에 대해 단계 a), b) 및 c)를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    d) 대조군 핵산을:
    iii. 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 및 5'에서 3' 방향으로 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위, 및 대조군 핵산 내의 제1 혼성화 서열의 상류의 제2 혼성화 서열의 역보체에 혼성화할 수 있는 영역을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서; 상기 제1 및 제2 혼성화 서열은 20개 이하의 염기로 분리된 제2 올리고뉴클레오타이드 프라이머
    를 포함하는 프라이머 쌍;
    iv. 닉형성 효소는 아니지만, 제1 및 제2 프라이머의 인식 서열을 인식하여, 이의 절단 부위를 절단할 수 있는 제한 효소;
    vi. 가닥 대체 DNA 중합효소;
    vii. dNTP; 및
    viii. 하나 이상의 변형된 dNTP
    와 접촉시켜서, 대조군 핵산의 존재 하에 대조군 증폭 산물을 생성하는 단계;
    e) 단계 a)의 대조군 증폭 산물을
    ii. 대조군 증폭 산물 내의 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 이의 검출을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; 및
    대조군 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 제1 단일 가닥 검출 서열의 상류 또는 하류의 제2 단일 가닥 검출 서열에 혼성화할 수 있는 혼성화 영역을 갖고, 프로브는 고체 물질 또는 고체 물질에의 이의 부착을 가능하게 하는 모이어티에 부착되는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브
    를 포함하는 프로브 쌍과 접촉시키는 단계로서;
    제1 및 제2 프로브와 대조군 증폭 산물 내의 상기 적어도 하나의 종의 혼성화는 대조군 검출 종을 생성하는 단계; 및
    f) 단계 b)에서 생성되는 대조군 검출 종의 존재를 검출하는 단계로서, 대조군 검출 종의 존재는 상기 방법의 공정 대조군으로서 작용하는 단계
    와 같은 공정 대조군을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 병원체 및 존재하는 경우, 대조군 핵산 모두에 대해 동시에 수행되는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형된 dNTP를 사용하여 DNA 중합효소에 의해 역상보적 가닥으로 혼입되는 하나 이상의 변형으로 인해 상기 역상보적 가닥의 절단이 차단되기 때문에, 상기 인식 서열 및 절단 부위가 이중 가닥인 경우, 제한 효소는 이의 절단 부위의 프라이머 가닥만을 절단하는, 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)는 50℃ 이하의 온도에서 수행되는, 방법.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 온도는 단계 a)의 수행 동안 증가되고, 예컨대 15 내지 30℃의 범위의 주변 출발 온도(ambient starting temperature)로부터 최대 40 내지 50℃의 범위의 온도까지 증가되는, 방법.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 비강 또는 비인두 도말물(swab) 또는 흡인물(aspirate)인, 방법.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체 유래 RNA, 및/또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 제한 효소 및/또는 DNA 중합효소 및/또는 dNTP 및/또는 하나 이상의 변형된 dNTP 및/또는 올리고뉴클레오타이드 프로브 및/또는 병원체 검출 종 및/또는 대조군 검출 종을 검출하기 위한 수단은 제2항 또는 제4항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 방법.
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