CN107523630B - 一种基于信号放大dna逻辑门的基因突变多重检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于信号放大DNA逻辑门的基因突变多重检测方法，利用核酸侵入信号放大反应对检测靶标进行高特异性识别，同时利用一种可控的DNA聚合酶延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应，形成信号放大。本发明的方法对核酸靶标的检测灵敏度和检测特异性均很高。采用本发明所述的可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应进行DNA逻辑门构建，通过引入间隔序列抑制背景信号，同时存在两步信号放大反应，检测灵敏度提高，在采用微量的DNA输入和较短的反应时间条件下，即可实现高信噪比输出。且通过本发明所建立方法，可以实现对多个基因突变位点进行同时检测和结果的逻辑判断，简化了临床个体化用药过程中基因突变检测的分析流程。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测方法，具体地说，涉及利用信号放大反应构建DNA逻辑门同时对多种基因突变进行检测的方法。
背景技术
基因突变检测在疾病诊断、个体化治疗等临床医学领域已经有了多种应用。目前，已经发展了众多的基因突变检测方法，如突变阻滞扩增系统-聚合酶链式反应技术(Amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction,ARMS-PCR)、竞争性等位基因特异性
探针聚合酶链式反应技术(Competitive allele-specific TaqManpolymerase chain reaction,castPCR)、数字化聚合酶链式反应技术(Digital polymerase chain reaction,dPCR)、高分辨率熔解曲线(Highresolutionmelting,HRM)等方法。虽然这些方法中很多能够实现对多个基因突变位点进行同时检测，但却忽视了在实际应用中多个突变位点之间的逻辑关系。例如，表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)基因上的多个突变位点均与第一代酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)的临床疗效相关。其中EGFR基因L858R位点突变，19号外显子上的多种片段缺失等均预示患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感，适合用药；而EGFR基因T790M位点突变，则预示患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药，不适合用药。
DNA逻辑门是以DNA分子为基础构建基本逻辑单元实现逻辑运算的分子工程技术。利用DNA逻辑门可以实现对多种基因突变的临床意义进行智能逻辑判断和输出。然而目前，大多数的DNA逻辑门由于检测灵敏度和识别特异性上的不足，难以实现对低丰度基因突变的检测。
核酸侵入反应是一种是利用核酸5’外切酶或5’flap内切酶特异识别DNA链之间形成的单碱基侵入结构，并在侵入碱基的位置发挥酶切作用而建立的信号放大方法。通过将两步核酸侵入反应级联，可以产生107倍的放大效应。然而，在级联核酸侵入反应中，下游探针和荧光探针之间会形成非特异性杂交，产生背景信号。过高的背景信号影响级联核酸侵入反应对核酸靶标的检测灵敏度和检测特异性。同时，背景信号可能导致错误的结果输出，因而难以应用于DNA逻辑门的构建中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低背景信号的级联核酸侵入反应方法。该方法对核酸靶标的检测灵敏度和检测特异性很高。
本发明的另一目的在于提供一种基于信号放大DNA逻辑门的基因突变多重检测方法。该方法采用所述的低背景信号的级联核酸侵入反应进行DNA逻辑门构建，通过引入空缺序列抑制背景信号，同时存在两步信号放大反应，检测灵敏度提高，在采用微量的DNA输入和较短的反应时间条件下，即可实现高信噪比输出。且通过本发明所建立方法，可以实现对多个基因突变位点进行同时检测和结果的逻辑判断，简化了临床个体化用药过程中基因突变检测的分析流程。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种低背景信号的级联核酸侵入反应方法，其在于：
(1)在同一反应体系中发生两步核酸侵入反应，其中，第一步核酸侵入反应中的下游探针5’flap区域与第二步核酸侵入反应中的荧光探针之间存在空缺序列，使下游探针不会产生背景荧光信号；
(2)第一步核酸侵入反应切割产生的5’flap片段通过可控延伸反应触发第二步核酸侵入反应，形成级联核酸侵入反应；
(3)所述的核酸侵入反应是由核酸5’外切酶或5’flap内切酶所催化，能够特异识别双链核酸中上游寡核苷酸链3’末端与下游寡核苷酸链之间形成的侵入结构，并在侵入碱基的位置将下游寡核苷酸链进行切割，形成游离的5’flap片段(其原理如图1所示)。
所述的空缺序列为至少空缺1个碱基，优选为下游探针不会产生背景荧光信号的空缺碱基个数；进一步优选，所述空缺序列为1～50个碱基，更进一步优选为2～20个碱基。
所述的可控延伸反应为将延伸序列部分设计为仅含有1种至3种特定碱基类型，DNA聚合酶延切割产生的flap片段3’-OH延伸时，仅加入与设计的1-3种碱基互补的延伸底物，使延伸后的flap片段3’端与第二步核酸侵入反应中的荧光探针5’部分再次形成侵入结构，从而能引发第二步核酸侵入反应。
上述低背景信号的级联核酸侵入反应方法，具体包括以下步骤(其原理如附图2所示)：
(1)第一步核酸侵入反应：针对待测核酸靶标设计一组特异性的上游探针和下游探针，要求与靶标核酸杂交后，上游探针与下游探针形成单个碱基的侵入结构，并且侵入位点位于待测的靶标位点处，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap片段，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别这种特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与靶标配对的第一个碱基切下；由于反应温度接近下游探针与靶标互补部分的熔解温度，被切割后的下游探针会与靶标解离，新的完整的下游探针会再次和靶标杂交，形成侵入结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累，形成第一步核酸侵入信号放大阶段；
在同一反应体系中发生两步核酸侵入反应的过程中，第一步核酸侵入反应的完整下游探针会以flap片段部分与第二步核酸侵入反应的荧光探针进行杂交，形成一种被称为“X型”结构的特殊结构，同样会被核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别和切割，产生背景信号。这种背景信号严重干扰了对低拷贝靶标分子的检测，使得阳性信号与背景信号无法明显区分。为了降低“X型”结构所引起的背景信号，为消除背景信号，第一步核酸侵入反应中的下游探针5’flap区域与第二步核酸侵入反应中的荧光探针之间存在空缺序列，使得下游探针与荧光探针杂交时不能够形成“X型”结构，使下游探针不会产生背景荧光信号(如附图3所示)。
(2)可控的DNA聚合酶延伸反应：利用所述的flap片段含有切割产生的3’端-OH活性基团的特性，采用DNA聚合酶延伸反应，使其延长到与第二步核酸侵入反应中的荧光探针再次形成侵入结构，引发第二步核酸侵入反应产生荧光信号；为了保证延伸后的flap片段恰好和荧光探针形成单碱基侵入结构，将延伸序列部分设计为仅含有特定碱基类型，延伸反应采用对应的底物脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)进行，当延伸至设计位置处，后续延伸反应由于缺少相应的底物脱氧核糖核苷三磷酸而停止，实现延伸反应的可控；且为提高延伸反应的效率，使所述flap片段的3’末端进行分子内折叠，形成可被DNA聚合酶识别的发卡结构；
(3)第二步核酸侵入反应：经过步骤(2)可控延伸后的flap片段与荧光探针形成单个碱基的侵入结构，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别这种特异性结构，并于侵入位点处将荧光探针切割成两段，所述的荧光探针在切割位点两侧分别修饰荧光基团和淬灭基团；切割反应前，荧光基团和淬灭基团发生荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)效应，没有荧光信号产生；切割反应后，荧光基团和淬灭基团分离，荧光共振能量转移效应消失，产生荧光信号；由于反应温度接近荧光探针与flap片段互补部分的熔解温度，被切割后的荧光探针与flap片段解离，新的完整的荧光探针会再次和flap片段杂交，形成侵入结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成荧光信号的积累，形成第二步核酸侵入信号放大阶段。
一种基于信号放大DNA逻辑门的基因突变多重检测方法，利用上所述的低背景信号的级联核酸侵入反应方法，通过调整反应体系组成，实现“AND”、“OR”以及“INHIBIT”基本逻辑门的单独或组合运算。
上述的基于信号放大DNA逻辑门的基因突变多重检测方法：
本发明所述的核酸侵入反应中，核酸靶标需要和所对应的探针形成单个碱基的侵入结构，才能够被核酸5’外切酶或5’flap内切酶所识别，触发信号扩增反应。因此，在所述核酸侵入反应的反应体系中核酸靶标和相应的探针必须同时存在，才能够产生荧光信号，符合“AND”逻辑原理；
在本发明所述方法中，延伸反应作为桥联两步核酸侵入反应的关键步骤，必须实现延伸反应的可控，使延伸后的flap片段与荧光探针恰好形成单碱基侵入结构，以保证第二步核酸侵入反应的发生，产生荧光信号。可控的DNA聚合酶延伸反应中，为了保证延伸后的flap片段恰好和荧光探针形成单碱基侵入结构，将延伸序列部分设计为仅含有特定碱基类型，延伸反应采用对应的底物脱氧核糖核苷三磷酸进行，当延伸至设计位置处，后续延伸反应由于缺少相应的底物脱氧核糖核苷三磷酸而停止，实现延伸反应的可控；缺少的相应底物脱氧核糖核苷三磷酸的加入将导致flap片段被完全延伸，使其无法与荧光探针杂交，抑制信号放大反应的发生，符合“INHIBIT”逻辑原理；例如，本发明通过设计flap序列和使用dATP、dCTP和dTTP三种dNTP来确保延伸反应在遇到模板链上的第一个“C”碱基时由于缺少对应的互补底物而停止。因此，dGTP的加入将导致flap片段被完全延伸，使其无法与荧光探针杂交，抑制信号放大反应的发生，符合“INHIBIT”逻辑原理。
在本发明所述的核酸侵入反应中，下游探针的flap片段部分与检测靶标序列无关，因此，不同的靶标可以产生相同的flap片段，触发同样的第二步信号放大反应。因此，在所述的核酸侵入反应中，通过将不同靶标下游探针的flap片段部分设计为相同序列，在体系中出现任一靶标时，均可触发级联信号放大反应的发生，符合“OR”逻辑原理。
本发明的有益效果：
本发明的方法对核酸靶标的检测灵敏度很高，且对核酸靶标的检测特异性很高。采用本发明所述的可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应进行DNA逻辑门构建，通过引入间隔序列抑制背景信号，同时存在两步信号放大反应，检测灵敏度提高，在采用微量的DNA输入和较短的反应时间条件下，即可实现高信噪比输出。且通过本发明所建立方法，可以实现对多个基因突变位点进行同时检测和结果的逻辑判断，简化了临床个体化用药过程中基因突变检测的分析流程。
附图说明
本发明的上述各个方面、特征和其它特点将通过如下附图更清楚地理解，其中：
附图1是关于核酸侵入反应中核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别结构的说明。
附图2是关于本发明的低背景信号的级联核酸侵入反应方法的基本原理的说明。
附图3是关于传统下游探针以及本发明设计的在第一步核酸侵入反应中的下游探针5’flap区域与第二步核酸侵入反应中的荧光探针之间存在空缺序列的下游探针分别与荧光探针之间形成的二级结构的说明。
附图4是关于本发明所建立方法对不同浓度DNA模板检测结果的说明。
附图5是关于本发明所建立方法对核酸靶标不同位置上存在单碱基突变时检测结果的说明，以及含有不同比例单碱基突变靶标时检测结果的说明。
附图6是关于利用本发明所建立方法构建“AND”DNA逻辑门的说明。
附图7是关于利用本发明所建立方法构建“INHIBIT”DNA逻辑门的说明。
附图8是关于利用本发明所建立方法构建“OR”DNA逻辑门的说明。
附图9是关于利用本发明所建立方法构建酪氨酸激酶抑制剂用药相关EGFR基团突变的多重检测分析DNA逻辑门的说明。
具体实施方式
如下实施例仅用来举例说明本发明的技术方案，并不构成对本发明范围的任何限制。本发明的范围由所附的权利要求书说明。
实施例1：利用可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应检测方法实现人工合成寡核苷酸片段的高灵敏检测
本实施例检测了人工合成的不同浓度的单链DNA靶标，用来验证本发明所陈述的核酸检测方法的可行性并考察了方法的灵敏度。
反应条件：
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，50nmol/L上游探针(序列为：5’-ATG TCA CTT CCC CTT GGT TCT CTC C-3’，即SEQ ID NO.1)，600nmol/L下游探针(序列为：5’-CAT AGT CCA GGA GGC TTG TTA AGT GTC TTA GCG TTT TCG CTA AGA TCTGGC CTG GTG C(Spacer C3)-3’，即SEQ ID NO.2)，600nmol/L荧光探针(序列为：5’-(VIC)AGC CT(BHQ1)C CTG GAC TAT G(Spacer C3)-3’，即SEQ ID NO.3)，0.005U的
DNA聚合酶，10μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，DNA靶标分别为5 pmol/L、1pmol/L、500fmol/L、100fmol/L、50fmol/L、10fmol/L、5fmol/L、1fmol/L以及0fmol/L浓度(序列为：5’-CTA TTGCAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA T-3’，即SEQ ID NO.4)，加水补充体积至20μL。
可控延伸反应和核酸侵入反应同步进行，反应条件为63℃反应240min。荧光信号由美国Applied Biosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
实施例1的结果示于附图4中。图4的结果显示，本发明所陈述的方法在靶标核酸不存在的条件下，体系自身的背景信号十分低。根据对不同浓度DNA靶标产生荧光信号的反应速率进行线性拟合，可以得到本发明所陈述的方法对所采用的人工合成寡核苷酸片段的检测限为0.07fmol/L，说明本发明对核酸靶标的检测灵敏度很高。
实施例2:利用可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应检测方法实现单碱基差异靶标的高特异性检测
本实施例检测了与靶标核酸序列在不同位置有单个碱基差异的六条人工合成突变靶标，各突变点位置如附图5中字母标注所示，各突变位点的碱基类型均与探针序列相应位点相同，用来考察本发明中的方法对单碱基差异靶标检测的特异性。
不同位置单碱基突变靶标检测反应条件：
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，50nmol/L上游探针(即SEQ ID NO.1)，600nmol/L下游探针(即SEQ ID NO.2)，600nmol/L荧光探针(即SEQ IDNO.3)，0.005U的
DNA聚合酶，10μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，靶标核酸浓度为1pmol/L，加水补充体积至20μL。不同靶标序列如下：
完全互补靶标：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTGACA T-3’，即SEQ ID NO.4；
突变靶标-a：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA AGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.5；
突变靶标-b：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGT TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.6；
突变靶标-c：5’-CTA TTG CAC CAG GCG AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.7；
突变靶标-d：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TCA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.8；
突变靶标-e：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGT GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.9；
突变靶标-f：5’-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA CGG GAA GTG ACAT-3’，即SEQ ID NO.10；
可控延伸反应和核酸侵入反应同步进行，反应条件为63℃反应240min。荧光信号由美国Applied Biosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
不同比例单碱基突变靶标检测反应条件：
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，50nmol/L上游探针(即SEQ ID NO.1)，600nmol/L下游探针(即SEQ ID NO.2)，600nmol/L荧光探针(即SEQ IDNO.3)，0.005U的
DNA聚合酶，10μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，加入突变靶标-a(即SEQ ID NO.5)和完全互补靶标(即SEQ ID NO.4)的不同比例混合物，核酸总浓度为1pmol/L，其中完全互补靶标核酸浓度分别为500fmol/L、100fmol/L、50 fmol/L、10fmol/L、5fmol/L、1fmol/L以及0fmol/L。加水补充体积至20μL。
可控延伸反应和核酸侵入反应同步进行，反应条件为63℃反应240min。荧光信号由美国Applied Biosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
实施例2的结果示于附图5中。图5B的结果显示，本发明所陈述的方法能够高特异地检测侵入位点处的单碱基差异。在侵入位点处存在单碱基突变的靶标，其产生的荧光信号与无核酸靶标的空白对照一致。图5C的结果显示，本发明所陈述的方法能够从大量单碱基突变靶标的背景条件下，检测到微量的完全互补靶标，根据图5D的线性拟合结果，本发明所陈述的方法对所采用的侵入位点处单碱基差异靶标的检测限为0.02％，说明本发明对核酸靶标的检测特异性很高。
实施例3:利用可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应检测方法构建基本DNA逻辑门
本实施例通过调整可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应体系组成，构建DNA逻辑门，验证本发明所述方法进行逻辑运算时的情况。
(1)“AND”逻辑门反应条件
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，600nmol/L下游探针(即SEQ ID NO.2)，600nmol/L荧光探针(即SEQ ID NO.3)，0.005U的
DNA聚合酶，10μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，10pmol/L的DNA靶标(即SEQ ID NO.4)和50nmol/L的上游探针(即SEQ ID NO.1)分别作为输入(输入1和输入2)，加水补充体积至20μL。VIC荧光信号作为输出。反应条件为63℃反应15min。荧光信号由美国Applied Biosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
(2)“INHIBIT”逻辑门反应条件
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，50nmol/L的上游探针(即SEQ ID NO.1)，600nmol/L下游探针(即SEQ ID NO.2)，600nmol/L荧光探针(即SEQ IDNO.3)，0.005U的
DNA聚合酶，10μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，10pmol/L的DNA靶标(即SEQ ID NO.4)和500μmol/L的dGTP分别作为输入(输入1和输入3)，加水补充体积至20μL。VIC荧光信号作为输出。反应条件为63℃反应15min。荧光信号由美国AppliedBiosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
(3)“OR”逻辑门反应条件
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，50nmol/L的上游探针-1(即SEQ ID NO.1)和50nmol/L的上游探针-2(序列为5’-CAT GTC AAG ATC ACA GAT TTTGGG CC-3’，即SEQ ID NO.11)，600nmol/L下游探针-1(即SEQ ID NO.2)和600nmol/L下游探针-2(序列为5’-CAT AGT CCA GGA GGC TTG TTA AGT GCC TTA GCG TTT TCG CTA AGG GGCCAA ACT GCT G-3’，即SEQ ID NO.12)，600nmol/L荧光探针(即SEQ ID NO.3)，0.005U的
DNA聚合酶，10μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，10 pmol/L的DNA靶标-1(即SEQ IDNO.4)和10pmol/L的DNA靶标-2(序列为5’-CAGCAGTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTGATCTTGACATG-3’，即SEQ ID NO.13)分别作为输入(输入1和输入4)，加水补充体积至20μL。VIC荧光信号作为输出。反应条件为63℃反应15min。荧光信号由美国Applied Biosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
实施例3的结果示于附图6-附图8中。
“AND”逻辑门的结果如附图6所示，靶标DNA和上游探针作为输入(输入1和输入2)，仅有当靶标DNA和上游探针同时输入时，才能够触发信号扩增反应，产生荧光信号，输出为“1”；而当靶标DNA或上游探针单独输入时，均不会发生信号放大反应，无荧光信号产生，此时输出为“0”。
“INHIBIT”逻辑门的结果如附图7所示，靶标DNA和dGTP作为输入(输入1和输入3)。当仅有靶标DNA输入时，级联信号放大反应被触发，产生荧光信号，输出为“1”；而当靶标DNA和dGTP同时输入时，flap片段被完全延伸，第二步核酸侵入反应无法发生，无荧光信号产生，此时输出为“0”。
“OR”逻辑门的结果如附图8所示，两种靶标DNA作为输入(输入1和输入4)，当有任意一种靶标DNA输入时，级联信号放大反应均可被触发，产生荧光信号，输出为“1”。仅当两种输入均为“0”时，核酸侵入反应无法发生，无荧光信号产生，此时输出为“0”。
上述结果显示，采用本发明所述的可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应进行DNA逻辑门构建，通过引入间隔序列抑制背景信号，同时存在两步信号放大反应，检测灵敏度提高，在采用微量的DNA输入和较短的反应时间条件下，即可实现高信噪比输出。
实施例4:利用可控延伸反应桥联两步核酸侵入信号放大反应检测方法构建DNA逻辑门实现多重突变检测和逻辑判断
本实施例以本发明所述方法构建同时检测多种基因突变的DNA逻辑门，并实现检测结果的逻辑判断。以与第一代酪氨酸激酶抑制剂临床疗效相关的四种EGFR基因突变为检测靶标，包括EGFR基因L858R位点突变(c.2573T>G)，19号外显子上两种类型的片段缺失(c.2235-2249del15和c.2236-2250del15)以及EGFR基因T790M位点突变(c.2369C>T)。
(1)样本DNA提取
取肿瘤组织样本25mg，采用德国QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取基因组DNA。实验用DNA模板均以紫外分光光度法测定其浓度及纯度，并调整终浓度为20-100ng/μL。
(2)待测靶标预扩增
PCR反应体系包括10mM的Tris-HCl(pH8.3)，50mM的KCl，2mmol/L的MgCl2，200μmol/L的dNTPs，三个位点的上游扩增引物和下游扩增引物各400nmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U，DNA模板20-100ng，加水补充至50μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环扩增。
扩增引物序列如下：
L858R位点上游扩增引物：5’-GGAACGTACTGGTGAAAACACCGC-3’，即SEQ ID NO.14
L858R位点下游扩增引物：5’-TGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCACC-3’，即SEQ IDNO.15
19Del位点上游扩增引物：5’-TGT CAT AGG GAC TCT GGA TCC CAG A-3’，即SEQID NO.16
19Del位点下游扩增引物：5’-GCA GAA ACT CAC ATC GAG GAT TTC CTT GT-3’，即SEQ ID NO.17
T790M位点上游扩增引物：5’-GGC ATC TGC CTC ACC TCC AC-3’，即SEQ ID NO.18
T790M位点下游扩增引物：5’-CCG GAC ATA GTC CAG GAG GCA-3’，即SEQ IDNO.19
(3)逻辑门反应
反应体系包括10mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.05％(v/v)NP-40，0.05％(v/v)Tween-20，12μg/mL BSA，7.5mmol/L MgCl2，6.675ng/μL Afu核酸内切酶，50nmol/L的上游探针，600nmol/L下游探针，600nmol/L荧光探针，0.005U的
DNA聚合酶，10 μmol/L的dATP、dCTP和dTTP，适量的DNA预扩增产物作为输入，加水补充体积至20μL。VIC和FAM荧光信号作为输出。反应条件为63℃反应15min。荧光信号由美国Applied Biosystems公司StepOne实时荧光定量PCR仪采集。
核酸侵入反应探针序列如下：
L858R位点上游探针：5’-CAT GTC AAG ATC ACA GAT TTT GGG CC-3’，即SEQ IDNO.20
L858R位点下游探针：5’-CAT AGT CCA GGA GGC TTG TTA AGT GCC TTA GCG TTTTCG CTA AGG GGC CAA ACT GCT G-3’，即SEQ ID NO.21
19Del位点上游探针：5’-GAA AGT TAA AAT TCC CGT CGC TAT CAT-3’，即SEQ IDNO.22
19Del位点下游探针-1：5’-CAT AGT CCA GGA GGC TTG TTA AGT GTC TTA GCGTTT TCG CTA AGA AAC ATC TCC GAA AGC C-3’，即SEQ ID NO.23
19Del位点下游探针-2：5’-CAT AGT CCA GGA GGC TTG TTA AGT GTC TTA GCGTTT TCG CTA AGA GAC ATC TCC GAA AGC-3’，即SEQ ID NO.24
T790M位点上游探针：5’-CCG AAG GGC ATG AGC TGC T-3’，即SEQ ID NO.25
T790M位点下游探针：5’-CGT CCG TGG ACC TTG TTA AGT GTC TTA GCG TTT TCGCTA AGA TGA TGA GCT GCA CG-3’，即SEQ ID NO.26
VIC荧光探针：5’-VIC-AGC CT(BHQ1)C CTG GAC TAT G-Spacer C3-3’，即SEQ IDNO.27
FAM荧光探针：5’-FAM-AGG T(BHQ1)CC ACG GAC G-Spacer C3-3’，即SEQ IDNO.28
实施例4的结果示于附图9中，如附图9A所示，EGFR基因L858R位点突变(c.2573T>G)和19号外显子上两种类型的片段缺失(c.2235-2249del15和c.2236-2250del15)均是酪氨酸激酶抑制剂的敏感型突变，三种突变中，任意一种突变存在时，均建议使用酪氨酸激酶抑制剂治疗，三中突变之间为“OR”逻辑关系；而EGFR基因T790M位点突变(c.2369C>T)为酪氨酸激酶抑制剂的耐药型突变，当该位点突变时，不论是否存在敏感型突变，均不建议使用酪氨酸激酶抑制剂治疗，与敏感型突变之间为“INHIBIT”关系。
附图9B和9C是对9例临床样本的检测结果，样本S1至S4各位点均为野生型，不建议使用酪氨酸激酶抑制剂治疗；样本S5至S8各位点均存在敏感型突变，建议使用酪氨酸激酶抑制剂治疗；而样本S9，同时存在敏感型突变和耐药型突变，因此不建议使用酪氨酸激酶抑制剂治疗。本实施例表明，通过本发明所建立方法，可以实现对酪氨酸激酶抑制剂用药相关的多个基因突变位点进行同时检测和结果的逻辑判断，简化了临床个体化用药过程中基因突变检测的分析流程。
序列表
<110> 周国华
<120> 一种基于信号放大DNA逻辑门的基因突变多重检测方法
<141> 2017-09-26
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcacttc cccttggttc tctcc 25
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catagtccag gaggcttgtt aagtgtctta gcgttttcgc taagatctgg cctggtgc 58
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctcctgg actatg 16
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctattgcacc aggccagatg agagaaccaa ggggaagtga cat 43
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctattgcacc aggccagaag agagaaccaa ggggaagtga cat 43
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctattgcacc aggccagttg agagaaccaa ggggaagtga cat 43
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctattgcacc aggcgagatg agagaaccaa ggggaagtga cat 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctattgcacc aggccagatc agagaaccaa ggggaagtga cat 43
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctattgcacc aggccagatg tgagaaccaa ggggaagtga cat 43
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctattgcacc aggccagatg agagaaccaa cgggaagtga cat 43
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgtcaaga tcacagattt tgggcc 26
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catagtccag gaggcttgtt aagtgcctta gcgttttcgc taaggggcca aactgctg 58
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagcagtttg gcccgcccaa aatctgtgat cttgacatg 39
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaacgtact ggtgaaaaca ccgc 24
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgcatggtat tctttctctt ccgcacc 27
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtcataggg actctggatc ccaga 25
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcagaaactc acatcgagga tttccttgt 29
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcatctgcc tcacctccac 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccggacatag tccaggaggc a 21
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgtcaaga tcacagattt tgggcc 26
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<212> DNA
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<400> 21
catagtccag gaggcttgtt aagtgcctta gcgttttcgc taaggggcca aactgctg 58
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaagttaaa attcccgtcg ctatcat 27
<210> 23
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
catagtccag gaggcttgtt aagtgtctta gcgttttcgc taagaaacat ctccgaaagc 60
c 61
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
catagtccag gaggcttgtt aagtgtctta gcgttttcgc taagagacat ctccgaaagc 60
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccgaagggca tgagctgct 19
<210> 26
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgtccgtgga ccttgttaag tgtcttagcg ttttcgctaa gatgatgagc tgcacg 56
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agcctcctgg actatg 16
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aggtccacgg acg 13
Claims (4)
1.一种低背景信号的级联核酸侵入反应方法，其特征在于：
（1）在同一反应体系中发生两步核酸侵入反应，其中，第一步核酸侵入反应中的下游探针5’ flap区域与第二步核酸侵入反应中的荧光探针之间存在空缺序列，使下游探针不会产生背景荧光信号；
（2）第一步核酸侵入反应切割产生的5’ flap片段通过可控延伸反应触发第二步核酸侵入反应，形成级联核酸侵入反应；
（3）所述的核酸侵入反应是由核酸5’外切酶或5’flap内切酶所催化，能够特异识别双链核酸中上游寡核苷酸链3’末端与下游寡核苷酸链之间形成的侵入结构，并在侵入碱基的位置将下游寡核苷酸链进行切割，形成游离的5’flap片段；
具体包括以下步骤：
（1）第一步核酸侵入反应：针对待测核酸靶标设计一组特异性的上游探针和下游探针，要求与靶标核酸杂交后，上游探针与下游探针形成单个碱基的侵入结构，并且侵入位点位于待测的靶标位点处，下游探针5’端有一段翘起片段，称为5’flap片段，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别这种特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与靶标配对的第一个碱基切下；由于反应温度接近下游探针与靶标互补部分的熔解温度，被切割后的下游探针会与靶标解离，新的完整的下游探针会再次和靶标杂交，形成侵入结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累，形成第一步核酸侵入信号放大阶段；为消除背景信号，第一步核酸侵入反应中的下游探针5’ flap区域与第二步核酸侵入反应中的荧光探针之间存在空缺序列，使下游探针不会产生背景荧光信号；
（2）可控的DNA聚合酶延伸反应：利用所述的flap片段含有切割产生的3’端-OH活性基团的特性，采用DNA聚合酶延伸反应，使其延长到与第二步核酸侵入反应中的荧光探针再次形成侵入结构，引发第二步核酸侵入反应产生荧光信号；为了保证延伸后的flap片段恰好和荧光探针形成单碱基侵入结构，将延伸序列部分设计为仅含有特定碱基类型，延伸反应采用对应的底物脱氧核糖核苷三磷酸进行，当延伸至设计位置处，后续延伸反应由于缺少相应的底物脱氧核糖核苷三磷酸而停止，实现延伸反应的可控；且为提高延伸反应的效率，使所述flap片段的3’末端进行分子内折叠，形成可被DNA聚合酶识别的发卡结构；
（3）第二步核酸侵入反应：经过步骤（2）可控延伸后的flap片段与荧光探针形成单个碱基的侵入结构，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别这种特异性结构，并于侵入位点处将荧光探针切割成两段，所述的荧光探针在切割位点两侧分别修饰荧光基团和淬灭基团；切割反应前，荧光基团和淬灭基团发生荧光共振能量转移效应，没有荧光信号产生；切割反应后，荧光基团和淬灭基团分离，荧光共振能量转移效应消失，产生荧光信号；由于反应温度接近荧光探针与flap片段互补部分的熔解温度，被切割后的荧光探针与flap片段解离，新的完整的荧光探针会再次和flap片段杂交，形成侵入结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成荧光信号的积累，形成第二步核酸侵入信号放大阶段。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述的空缺序列为至少空缺1个碱基。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述的可控延伸反应为将延伸序列部分设计为仅含有1种至3种特定碱基类型，DNA聚合酶延切割产生的flap片段3’-OH延伸时，仅加入与设计的1-3种碱基互补的延伸底物，使延伸后的flap片段3’端与第二步核酸侵入反应中的荧光探针5’部分再次形成侵入结构，从而能引发第二步核酸侵入反应。
4.一种非诊疗目的的基于信号放大DNA逻辑门的基因突变多重检测方法，其特征在于：利用权利要求1~3中任一所述的低背景信号的级联核酸侵入反应方法，通过调整反应体系组成，实现“AND”、“OR”以及“INHIBIT”基本逻辑门的单独或组合运算；
在所述核酸侵入反应的反应体系中核酸靶标和相应的探针必须同时存在，才能够产生荧光信号，符合“AND”逻辑原理；
可控的DNA聚合酶延伸反应中，为了保证延伸后的flap片段恰好和荧光探针形成单碱基侵入结构，将延伸序列部分设计为仅含有特定碱基类型，延伸反应采用对应的底物脱氧核糖核苷三磷酸进行，当延伸至设计位置处，后续延伸反应由于缺少相应的底物脱氧核糖核苷三磷酸而停止，实现延伸反应的可控；缺少的相应底物脱氧核糖核苷三磷酸的加入将导致flap片段被完全延伸，使其无法与荧光探针杂交，抑制信号放大反应的发生，符合“INHIBIT”逻辑原理；
在所述的核酸侵入反应中，通过将不同靶标下游探针的flap片段部分设计为相同序列，在体系中出现任一靶标时，均可触发级联信号放大反应的发生，符合“OR”逻辑原理。
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